Proč a jak analyzovat minimální reziduální nemoc (MRN) u mnohočetného myelomu

Transkript

1 Setkání uživatelů Průtokové cytometrie Beckman Coulter v Mikulově, Proč a jak analyzovat minimální reziduální nemoc (MRN) u mnohočetného myelomu Říhová L, Všianská P, Bezděková R Oddělení klinické hematologie, FN Brno, Brno Babákova myelomová skupina, UPF, LF MU, Brno

2 Mnohočetný myelom 2. nejčastější hematologická malignita přítomnost klonu plazmocytů (PC) v kostní dřeni (KD) produkujících monoklonální Ig (MIG) kombinace nových léčiv s autologní transplantací periferních kmenových buněk zásadní prodloužení přežívání pacientů nízce rizikoví pacienti chronické on. dřeňový relaps je stále častý kratší trvání remise Hajek 2013, Pour 2014

3 Proč stanovovat MRN u MM I. Detekce minimální reziduální nemoci (MRN) - standardní procedura u potenciálně vyléčitelných hematologických malignit (ALL) Mnohočetný myelom (MM) - nevyléčitelné onemocnění, relaps navzdory dosažení CR Pokroky v léčbě MM - nová léčiva a léčebné strategie zvýšily počet dosažených remisí Paiva 2015; Brando 2015; Munshi and Anderson 2013; Oldaker 2015

4 Proč stanovovat MRN u MM II. Citlivý přístup pro porovnání efektivity rozdílných léčebných strategií Individualizované monitorování léčby s cílem zabránění pře- či nedo-léčenosti Biomarker nezbytný pro včasnou a spolehlivou předpověď přežívání pacientů, který může urychlit uvolnění nových léčiv na trh (OS, PFS) Paiva 2015; Brando 2015; Munshi and Anderson 2013; Oldaker 2015

5 Vývoj definice CR u MM Historicky - snížení MIG až o 75% (menšina pac.) Nepřítomnost měkkotkáňového plasmocytomu, < 5% PC, negativní imunofixace v moči a séru (až 30% pac.) Přísná (stringent) CR = CR + normalizace sflc + absence fenotypově aberantních PC pacienti v CR (jejíž kvalita se velmi liší) přesto relabují, tedy výše uvedené parametry neodrážejí klinický význam MRN Munshi and Anderson 2013

6 Dosažení CR Nedávné studie s novými léčivy (s/bez ASCT) vysoký počet CR u pac. starších 65 let, vysoce rizikových a relabujících/refrakterních MM Dosažení nejhlubší remise je předpokladem k prodloužení OS a k vyléčení 10% suboptimálních odpovědí (blízká CR, VGPR) je bez relapsu 10 let (MGUS-like základní profil) 12% neudržitelných CR (přetrvávající FC-MRD + vysoce-rizikový cytogenetický základní profil) Paiva 2012 and 2015a, b; Barlogie 2014

7 Hloubka léčebné odpovědi Celkový počet nádorových buněk MRN nedetek. MRN operační léčba A. MGUS-like pacienti B. neudržitelná vs. udržitelná CR C. kontrolovaná hladina detekovatelné MRN D. pozdní relaps při nedetekovatelné MRN E. dlouhodobá kontrola nemoci při nedetekovatelné MRN stanovení dg konec léčby doba do progrese onemocnění (TTP) Paiva 2015

8 Citlivost MRN Počet nádorových buněk 10% 1% 0.1% 0.01% 0.001% % Rezistence (Morfologie ) Kompletní remise (FISH) Imunologická CR (MFC) Molekulární CR (PCR) Detekční limit Terapie

9 Techniky dostupné pro MRN MFC ( 8colours) ASO-PCR NGS PET/CT aplikovatelnost ~100% 60-70% ~90% ~100% reprodukovatelnost vysoká vysoká? střední dostupnost vysoká střední omezená střední diag. vzorek není nezbytný nezbytný nezbytný není nezbytný doba analýzy 2-3h 5dní 7dní 2h cena analýzy ~350 USD ~500 USD ~700 USD ~2000 USD citlivost vysoká standardizace Euroflow EuroMRD? ne Paiva 2015

10 Vývoj FC-MRN Standardní multiparametrová FC (MFC) <1 MM PC mezi 10 4 PC v 3x10 5 buněk, 3x4 znaky Imunophenotypová odpověď (icr = scr+) absence myelomových PC mezi 2x10 6 dřeňových buněk analyzovaných MFC ( 4 znaky = 3x4) Pokročilá MFC (kvantifikace MRN) Log deplece (<0.01% MRN), 5x10 5 buněk, 6 znaků Euroflow přístup - 2x8 znaky, Infinicyt SW Next Generation Flow - 2 Euroflow zkumavky spoj. Paiva 2008, 2011; Rawstron 2015

11 Vysoce citlivá FC-MRD Pro potřebnou přesnost je vyžadován mnohabarevný přístup ( 8 barev) a pro potřebnou citlivost je požadován vysoký počet analyzovaných bb (10 6 ) Kvantitativní analýza MRD se senzitivitou 10-5 je více informativní než stanovení CR poz/neg a zlepšuje předpověď chování on. u pacientů s MM Vnitřní QC k odhadu kvality vzorku, interní kontroly pro hodnoty cut-off Brando 2015; Arroz 2015; Rawstron 2015

12 Kvalita FC-MRN u MM Kvalita FC-MRD testování je vztažena a dramaticky ovlivněna mnoha důležitými faktory: množství a kvalita vzorku KD proces zpracování (barvení) použitá kombinace reagencií proces získání vlastních dat vč. počtu analyzovaných buněk standardizace/harmonizace nezbytná! Stetler-Stevenson 2011

13 Kvalita vzorku pro MRN Nevhodný/nereprezentativní vzorek KD: převaha kontaminace periferní krví přítomnost bazofilů, plazmablastů chybění HSC vč. B progenitorů, žírných buněk starý vzorek (48 hodin od odběru) viditelné sraženiny Arroz 2015; Brando 2015

14 Detekční/kvantifikační limity celkový počet analyzovaných leukocytů počet událostí neoplastických buněk nejnižší počet událostí nezbytný k opakovatelné detekci populace neoplastických PC: 25 events = LOD nejnižší počet událostí nezbytný k opakovatelné kvantifikaci populace neoplastických PC: 50 events = LOQ Arroz 2015

15 LOD, LOQ a senzitivita Leukocyty % LOD % LOQ Senzitivity ,05 0, ,025 0, ,005 0, ,0025 0, ,001 0, ,0005 0,

16 PC fenotyp Normální CD19 CD27 CD45 CD81 CD cκ/λ /λ ratio 3 Neoplastické CD56 CD28 CD117 CD20 CD cκ/λ ratio 3 CD38 (+++ vs. ++) CD138

17 Detekce PC událostí ve 140ul plné KD leukocytů (70% events) PC (0,4%)

18 Detekce PC vs událostí vs leukocytů vs. 200 PC

19 Negativní MRN událostí ve 320 ul plné KD leukocytů (74 %) a PC (0,39 %) apcs = 0; senzitivita: 6,97x10-6

20 Pozitivní MRN událostí v 500 ul plné KD leukocytů (74 %) a PC (0,36 %) a-pcs = 40; % a-pc = 2,96x10exp -5 = 0,00296 %; senzitivita: 3,68x10-5 = 0,0037 %

21 Euroflow Standardizace 8-barevná FC - Euroflow MoAb kombinace Euroflow nestavení min. 3x10 6 leukocytů a 500 PC detekce aberrantního fenotypu PC + analýza klonality - v kalkulovaných datech horší identifikace PC, proto proběhla výměna fluorochromů a znaků zejména pro detekci MRN - 2. generace panelu Euroflow

22 Vývoj panelu pro FC-MRN PB PO FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD45 CD138 CD38 CD28 CD27 CD19 CD117 CD81 CD45 CD138 CD38 CD56 β 2 m CD19 cigκ cigλ BV421 BV510 FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-C750 CD138 CD27 CD38 CD56 CD45 CD19 CD117 CD81 CD138 CD27 CD38 CD56 CD45 CD19 cigκ cigλ BV421 BV510 BV605 FITC PE PCP-Cy5.5 PC7 APC APCA700 APCC750 CD138 CD27 CD117 CD38 CD56 CD45 CD19 cigλ cigκ CD81 Flores-Montero 2015

23 Problémy v detekci MRN léčba MoAb anti-cd38 (Daratumumab) obsazení vazebných epitopů CD38 terapeutickou MoAb - nedostupné pro vizualizační MoAb využití multiepitopové CD38 v kombinaci s cycd38 využití CD229 - slabá denzita exprese

24 Problémy v detekci MRN

25 Problémy s FC-MRN vysoká finanční nákladnost nutno používat vyšší objemy MoAb - pracuje se s 10x10 6 buněk (nestačí titrace na 1x10 6 bb) časová náročnost vlastní příprava vzorku - předlyzační krok (bulk lysis) + intracelulární analýza analýza vzorku na cytometru min sběr vyhodnocení vzorku - hledání klonu PC

26 Závěr Polychromatická FC je validním nástrojem pro kvantifikaci MRN, standardizace zatím v procesu příprav Senzitivita - při analýze dostatečného počtu bb - vzrostla na 10-6 a je srovnatelná s molekulárními přístupy Kvantifikace MRN by měla být využita jako nový biomarker umožňující predikovat přežívání pacientů

27 Poděkování Prof. MUDr. Roman Hájek, CSc. FC Lab, OKH, FN Brno a LF MU, Brno BMG, ÚPF, LF MU, Brno IHOK, FN Brno a LF MU, Brno

28 Děkuji za pozornost!