Cytogenetické vyšetřovací metody v onkohematologii Zuzana Zemanová

Transkript

1 Cytogenetické vyšetřovací metody v onkohematologii Zuzana Zemanová Centrum nádorové cytogenetiky Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK v Praze

2 Klinický význam cytogenetických nálezů v onkohematologii Analýza karyotypu nádorových buněk patří k základním laboratorním vyšetřením U pacientů s různými subtypy hematologických malignit přispívá ke: stanovení diagnózy upřesnění prognózy sledování úspěšnosti terapie Doporučené vyšetřovací postupy závisí na typu onemocnění a léčebném protokolu

3 CML Chronická myeloidní leukémie (CML) Konvenční cytogenetická analýza: KD 24h/48h kultivace alespoň 20 metafází normální karyotyp bez t(9;22) nebo nedostatek metafází FISH: BCR/ABL1 aberantní karyotyp cílená FISH nebo jiná molekulárně cytogenetická metoda (mfish/mband, array CGH) Popis karyotypu podle ISCN

4 CML Cytogenetika, FISH a RT-PCR při diagnose Cytogenetika FISH RT-PCR Při diagnóze Kostní dřeň Periferní krev X X Konvenční cytogenetická analýza - záchyt Ph chromosomu (fúzní gen BCR/ABL) a všech dalších aberací. FISH - záchyt Ph chromosomu (fúzní gen BCR/ABL1), delece 9q34, dalšího Ph chromosomu a případně dalších změn (trisomie 8); poskytuje informace o procentuálním zastoupení patologického klonu RT-PCR - umožňuje pouze detekci fúzního genu BCR/ABL1 (ale je nejcitlivější).

5 CML Cytogenetika, FISH a RT-PCR při monitorování účinku léčby Cytogenetika FISH RT-PCR Kostní dřeň (jestliže je negativní pak FISH / PCR) X Během terapie Periferní krev MRD (minimální residuální onemocnění) X Konvenční cytogenetická analýza - monitorování kompletní cytogenetické odpovědi (CCyR) FISH nebo PCR - monitorování velké molekulární odpovědi (Major Molecular Response) PCR - každé 3 měsíce (výsledky mohou kolísat!!) Cytogenetika + FISH - každých 6 měsíců až do dosažení CCyR, poté 1x ročně

6 CLL Chromosomové aberace u chronické lymfatické leukémie (CLL) Chromosomová aberace Frekvence Klinický význam del(13)(q14) 30-50% relativně dobrá prognóza trisomie % horší prognóza kratší celkové přežití del(11)(q22-q23) ATM del(17)(p13) TP53 5-8% 9-15% špatná prognóza progrese onemocnění velmi špatná prognóza rezistence na léčbu Konvenční cytogenetická analýza - většinou neinformativní (nalézány pouze buňky s normálním karyotypem). Cílená I-FISH s panelem specifických DNA sond záchyt klonálních aberací u ~ 90% nemocných s CLL. Stimulace pomocí B-buněčných mitogenů

7 CLL Chronická lymfatická leukémie (CLL) Periferní krev (PK) Přímé zpracování Kostní dřeň (KD) 24h kultivace (případně mitotická stimulace) FISH: FISH: cytogenetika Centromera 12 ATM (11q22) 13q14/13q34 TP53 (17p13) (14q32) Centromera 12 ATM (11q22) 13q14/13q34 TP53 (17p13) (14q32) Normální karyotyp Aberrantní karyotyp Popis karyotypu podle ISCN Cílená FISH Nebo jiné molekulárně cytogenetické techniky (mfish/mband, array CGH)

8 CLL Klonální vývoj u CLL Klonální vývoj zisk nových genomových aberací v průběhu onemocnění. Klonální vývoj je pozorován u ~26-30% nemocných s CLL del(13)(q14.3) (monoalelická a/nebo bialelická) del(11)(q22.3) ATM delece del(17)(p13.1) TP53 delece trisomie 12 Zisk delecí genů TP53 nebo ATM (tzv. high-risk delece) v průběhu onemocnění nepříznivě ovlivňuje celkové přežití nemocných s CLL. Doporučení: pravidelné sledování nemocných s CLL metodou I-FISH časná detekce high-risk delecí následná volba vhodné terapie. FISH analýza každých 6 měsíců (PK)

9 MM Chromosomové aberace u mnohočetného myelomu (MM) chromosomové aberace delece /monosomie 13 přestavby IgH genu t(11;14)(q13;q32) t(4;14)(p16;q32) delece genu p53 zisk 1q21 hyperdiploidie hypodiploidie prognóza střední/špatná špatná dobrá? velmi špatná velmi špatná velmi špatná dobrá velmi špatná

10 MM Detekce chromosomových aberací u MM Konvenční cytogenetika (KC) 30-40% pacientů U přibližně 60% nemocných je KC neinformativní nízká mitotická aktivita plasmocytů nízká infiltrace plasmocytů v KD Nalézány pouze buňky s normálním karyotypem Abnormální karyotyp je spojen se špatnou prognózou I-FISH chromosomové aberace až u 80-90% pacientů Kombinace imunocytochemického značení nádorových buněk a I-FISH Imunomagnetická separace plasmatických buněk

11 MM Mnohočetný myelom (MM) Vzorek KD 24h kultivace infiltrace KD 10 % 10 % cytogenetika cytogenetika cig-fish analýza LSI IGH Normální karyotyp Aberantní karyotyp Aberantní karyotyp Normální karyotyp zlom IGH LSI RB1/13q34 cílená FISH nebo jiná molekulárně cytogenetická metoda (mfish/mband, array CGH) Popis karyotypu podle ISCN LSI CCND1/IGH - LSI FGFR3/IGH - LSI IGH/MAF LSI 1q21/1p36 LSI TP53

12 AML Cytogenetické nálezy u akutní myeloidní leukémie (AML) Chromosomová aberace geny prognóza t(8;21)(q22;q22) RUNX1-RUNX1T1 dobrá inv(16)(p13.1q22) nebo t(16;16)(p13.1;q22) CBFB-MYH11 dobrá t(15;17)(q22;q12) PML-RARA dobrá t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL střední t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214 špatná inv(3)(q21q26.2) nebo t(3;3)(q21;q26.2) RPN1-EVI1 velmi špatná t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1 dobrá přestavby MLL genu MLL špatná monosomie 7 nebo delece 7q31? špatná delece 5q31? špatná komplexní chromosomové přestavby? velmi špatná

13 AML Akutní myeloidní leukémie (AML) Konvenční cytogenetická analýza: KD (PK pouze pokud jsou blasty) 24h/48h kultivace Alespoň 20 metafází normální karyotyp nebo málo metafází aberantní karyotyp subtyp-specifická FISH: MLL, 5q31/5p15, 7q31/7, 8/9 PML/RARA, AML1/ETO, CBFB, atd. cílená FISH nebo další molekulárně cytogenetické metody (mfish/mband, array CGH) Popis karyotypu podle ISCN

14 ALL Cytogenetické nálezy u akutní lymfoblastické leukémie (ALL) Riziková skupina Nízké riziko Střední riziko Vysoké riziko Cytogenetický nález vysoká hyperdiploidie (51-65 chromosomů) ETV6-RUNX1 t(1;19)(q23;p13) IGH-CEBP IGH-ID4 del(6)(q) aberace 9p aberace 11q dup(1q) -7 dic(9;20)(p13;q11) dic(9;12)(p11-21;p11-13) jakákoliv jiná změna normální karyotyp t(9;22)(q34;q11) iamp21 MLL translokace near haploidie ( 30 chromosomů) nízká hypodiploidie (30-39 chromosomů) t(17;19)(q23;p13) aberace 17p ztráta 13q Moorman et al., Lancet Oncol 2010

15 ALL Akutní lymfoblastická leukémie (ALL) I-FISH: Konvenční cytogenetická analýza: přímá/24h kultivace buněk KD G-pruhování aberantní karyotyp B-ALL: triple test ETV6/RUNX1 MLL Hyperdiploidie nebo T-ALL: TCR geny cílená FISH nebo další molekulárně cytogenetické metody (mfish/mband, array CGH) TCRαδ (14q11), TCRβ (7q34), TCRγ (7p14) TP16 (9p21) ABL1 (9q34) Popis karyotypu podle ISCN

16 Závěry: Cytogenetická a molekulárně cytogenetická analýza nádorových buněk Přispívá ke stanovení diagnózy onemocnění Přispívá k upřesnění prognózy onemocnění Umožňuje monitorování léčebné odpovědi Přispívá k časnému záchytu relapsu onemocnění Kombinace cytogenetických a molekulárně cytogenetických technik poskytuje komplexní informace o genomu nádorových buněk a umožňuje záchyt klonálních chromosomových aberací, které mohou významně ovlivnit průběh a prognózu onemocnění.