Beličková 1, J Veselá 1, E Stará 1, Z Zemanová 2, A Jonášová 2, J Čermák 1

Transkript

1 Beličková 1, J Veselá 1, E Stará 1, Z Zemanová 2, A Jonášová 2, J Čermák 1 1 Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2 Všeobecná fakultní nemocnice, Praha

2 MDS Myelodysplastický syndrom (MDS) je heterogenní skupina klonálních onemocnění s neefektivní hematopoézou (porucha diferenciace a nekontrolovaná proliferace) a dysplastickými změnami buněk. neefektivní hematopoéza periferní cytopenie (postihující jednu či více vývojových linií) zvýšená buněčnost KD

3 MDS Incidence onemocnění : 2-5 na obyvatel u osob starších 70 let : na obyvatel 1/3 všech pacientů přechází neoplastickou transformací v akutní myeloidní leukemii. postupná malignizace mutované kmenové buňky vhodným in vivo modelem vzniku leukemie

4 MDS patogeneze MDS není doposud objasněna defekt hematopoetické buňky není dostatečně charakterizován nepravděpodobné, že by jediná odchylka způsobila poruchu postupné hromadění genetických a epigenetických změn spolu s alterovaným buněčným mikroprostředím vícestupňový proces

5 MDS LÉČBA 1. Transplantace kostní dřeně nebo hematopoetických kmenových buněk 2. Lenalidomid: imunomodulační lék, který může měnit či regulovat činnost imunitního systému pacienti s MDS s del (5q) 3. Demetylační léky: Vidaza, Decitabin inhibují DNA methyltransferázu a májí přímý cytotoxický účinek na abnormální hematopoietické buňky KD 4. Podpůrná léčba: růstové faktory, chelatační léčba

6 17p exonů (z nichž první se nepřekládá), 10 intronů Funkční molekula je tetramer Transkripční faktor řady genů ovlivňující proliferaci, apoptózu, reparaci DNA nebo angiogenezi FCE: TP53 monitoruje poškození DNA ANO spustí transkripci genu p21 zastaví dělení buňky, dokud není poškozené místo reparováno Pokud to nelze APOPTÓZA

7 TP53 Protein p53 se za normálních okolností v buňkách vyskytuje jen v nízké koncentraci, jeho hladina je kontrolována negativní autoregulační smyčkou skrz MDM2 Za stresových podmínek je aktivovaný a jeho koncentrace se zvyšuje TP53 často podléhá bodovým mutacím

8 TP53 MUTACE: nejčastěji v DNA-vazebné doméně (exony 5-8) nejčastější mutace jsou bodové substituce typu missense, méně časté frameshift či non-sense MDM2 není schopna degradovat mutantní TP53 zvyšování koncentrace Důsledek mutace: zkrácené a nefunkční formy proteinu nebo konformačně pozměněný protein MUTACE : Loss of function: ztráta tumor-supresorových vlastností (schopnosti vazby na promotor cílových genů a následnou regulaci) Gain of function bodové : získaná odolnost vůči chemoterapeutikům

9 MDS a TP53 10 % pacientů s MDS 17% MDS s del5q 72% MDS s komplexním karyotypem a -5/5q- Negativní prognostický faktor (detekce rizikových pacientů) Rezistence na léčbu, zvýšená progrese do AML BJH; 2013; Kulasekararaj

10 Běžně používanými laboratorními technologiemi ( Sangerovo sekvenování, Fassay analýza) nelze detekovat minoritní klony mutovaných buněk Ultra deep sekvenování pomocí 454 GS Junior od firmy Roche Amplikonové sekvenování, plata s primery pro 11 pacientů Studie v rámci ELN (The European LeukemiaNet ) Sekvenovali jsme nejčastěji mutovanou oblast (exony 4-11) K přípravě amplikovonové knihovny je nutno PCR produkt 3x přečistit: Biomek 3000 od firmy Beckman Coulter

11 PACIENTI + METODY: 47 low-risk MDS pacientů s del(5q) v době diagnózy nebo v počátcích choroby. Median věku pacientů: 69.5 let (48-82). 19 pacientů bylo léčeno lenalidomidem. TP53 byla analyzována z DNA izolované z CD34+ a CD34- buněk KD a CD3+ a CD14+ buněk z PK pomocí MACS separátoru. Průměrná coverage genu získané sekvence byla 900 čtení. > 20% mutantních klonů, mutace potvrzena Sangerovým sekvenováním

12 VÝSLEDKY : TP53 mutace byly zjištěny u 6 (z 47) pacientů (12,8%), 1 pacient měl dva mutované klony. Velikost mutovaného klonu byla v rozmezí 3.5 do 49.6%. 6 mutací typu missense, 1 typu nonsense. Zjistili jsme signifikantní rozdíly ve velikosti mutovaného klonu mezi buňkami KD a PK. Leukemické transformace byla pozorována u 4 (z 6) pacientů nesoucích mutaci TP53. Jeden pacient vykazoval značný pokles ve velikosti mutovaného klonu (23,9-2,3%) po léčbě lenalidomidem. Druhý pacient vykázal mírný nárůst mutantní klon (14,7-17,5%) v průběhu léčby. Nezjistili jsme signifikantní rozdíl v expresi mrna genů TP53, MDM2, MYC a CDKN1A mezi pacienty s mutací a pacientů bez mutace.

13 ZÁVĚRY: TP53 mutace byly spojeny s zvýšeným rizikem transformace MDS pacientů do AML. Identifikovaná velikost mutovaného klonu závisí na typu buněk. Analýzu provádět z buněk kostní dřeně. Uvažuje se zavést vyšetřování mutací v TP53 genu do mezinárodní prognostického skórovacího systému MDS.