Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice

Transkript

1 Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice Mgr. Marcela Vlková, Ph.D. Ústav klinické imunologie a alergologie, FN u sv. Anny v Brně

2 Průtoková cytometrie v klinické laboratoři Relativní a absolutní počty leukocytárních subpopulací Pro správnou interpretaci je potřeba mít správně nastavené normální hodnoty ve vyšetřovaném materiálu: plná krev, kostní dřeň, bronchoalveolarní laváž Odchýlení od normálních hodnot pak může ukazovat na určitý typ onemocnění

3 Denní měření kontroly Slouží k ověření správné přípravy vzorku pro průtokový cytometr pipetování odpovídajícího množství kontrolního vzorku a monoklonálních protilátek lýza, promývání Správné nastavení cytometru: Fludika, optika, lasery.. Správné nastavení protokolu: voltáže, kompensace

4 Správné nastavení cytometru

5 FL3 FL6 FL10 Správné nastavení cytometru FL1 FL4 FL7 FL2 FL5 FL9

6 Vliv zpracování vzorku a výběru a titru monoklonálních protilátek, správný výběr fluorochromu

7 Měření jednobarevných kompenzačích zkumavek

8 Kompenzace

9 Denní měření kontrol před počátkem rutinního měření Měření Flow Check, Spherotecu... Měření kontrolního vzorku

10 Flow check

11 Denní měření Rainbows

12 Denní měření kontrolního vzorku

13 Měření základních lymfocytárních subpopulací

14 Nejčastěji vyšetřované lymfocytární subpopulace MARKER EXPRESION FUNCTION NORMAL VALUES IN WHOLE BLOOD CD3 T lymphocytes associated with TCR receptor, transmission signal CD4 T helper lymphocytes receptor for MHC II, activation CD8 T cytotoxic lymphocytes receptor for MHC I, activation 58-85% 30-60% 15-35% CD19 B lymphocytes the regulator activation 7-23% CD16/CD56 NK cells FcR for IgG mediator of adhesion HLA-DR B lymphocytes, monocytes, activated T-lymphocytes MHC II, presentation of Ag 6-20% 100% of B-lymphocytes 3-7% of T-lymphocytes

15 Srovnání zastoupení základních lymfocytárních populací v závislosti na věku ,5 10 9,5 13, , , , ,5 60 NK buňky 50 B lymfocyty ,5 61,5 63, ,5 66, T lymfoccyty měsíce 2-5 měsíců 5-9 měsíců 9-15 měsíců měsíců 2-5 let 5-10 let let let

16 Stanovení absolutních počtů leukocytárních a lymphocytárních subpopulací Počet leukocytů 3,6-10 x10 9 l Lymphocyty 20-55% Monocyty 0-10% Granulocyty neutrofily, eosinofily, basofily 37-75% Příklad: % absolutní počet Leukocyty: 5 x10 9 l lymphocyty: 20% 1,00 x10 9 l

17 Efekt infekce Bakteriální infekce Počet leukocytů: T pomocné lym.: CD3+ 4+: Lymfocytů: Monocyty: CD14+HLA DR+ : Granulocytů: Virová infekce Počet leukocytů: T cytotox. lym.: CD3+ 8+: Lymfocytů: Aktivace cytotoxických T lym.: Granulocytů: CD3+CD8+HLA DR+ : CD3+CD8+CD38+ :

18 Leukocytární subpopulace v plné krvi Monocytes Granulocytes Lymfocytes

19 Leukocytární subpopulace v plné krvi SSC CD45

20 Kontrola Pacient č.1 SK

21 EBV infekce

22 Kontrola Pacient č.2 EBV infekce

23 Pacient CLL Zdravá kontrola

24 Měření základních lymfocytárních subpopulací

25 Pacient

26 Pacient léčba Rituximabem

27 Pacient věk 3 měsíce Leu : 5,0x10 9 /l Ly: : 10% T LYMFOCYTES CD3+ : 17 (58-85)% CD3+ 4+: 4 (30-60)% CD3+ 8+: 9 (15-35)% 71% B LYMFOCYTES CD19+ : 62 (7-23) % 14% NK CELLS CD16,56+: 11 (6-20)%

28 Severe combined imunodeficiency (SCID) Leu : 5,0x10 9 /l Ly: : 10% T LYMFOCYTES CD3+ : 17 (58-85)% CD3+ 4+: 4 (30-60)% CD3+ 8+: 9 (15-35)% 71% B LYMFOCYTES CD19+ : 62 (7-23) % 14% NK CELLS CD16,56+: 11 (6-20)%

29 Pacient 1 rok T LYMFOCYTES CD3+ : 40 (58-85)% 22% 4% CD3+ 4+: 22 (30-60)% CD3+ 8+: 4 (15-35)% B LYMFOCYTES CD19+ : 22 (7-23) % 22% 36% 40% 40% NK CELLS CD16,56+ : 36 (6-20)%

30 DiGeorge s syndrome T LYMFOCYTES CD3+ : 40 (58-85)% 22% 4% CD3+ 4+: 22 (30-60)% CD3+ 8+: 4 (15-35)% B LYMFOCYTES CD19+ : 22 (7-23) % 22% 36% 40% 40% NK CELLS CD16,56+ : 36 (6-20)%

31 Burst test E.coli fmlp PMA

32 Chronic Granulomatous Disease Negative control (autosomal recessive) Mother Patient Stimulation PMA Father Stimulation PMA Stimulation PMA

33 Chronic Granulomatous Disease Negative control (X-linked) Mother Patient Stimulation PMA Father Stimulation PMA Stimulation PMA

34 Cytometrické stanovení myeloperoxidázy

35 Deficit myeloperoxidázy Exprese MPO na monocytech Healthy Control Patient Comparison patient healthy control

36 Deficit myeloperoxidázy Exprese MPO na granulocytech Healthy Control Patient Comparison 89% patient Healthy control

37 Deficit MPO Burst test - stimulace E. coli ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ pacientka zdravá kontrola Počet aktivovaných buněk: 95% Počet aktivovaných buněk: 89% Stimulační index: 163 Stimulační index: 22

38 Deficit MPO Burst test - stimulace PMA ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ pacientka zdravá kontrola Počet aktivovaných buněk: 97% Stimulační index: 281 Počet aktivovaných buněk: 92% a 6% Stimulační index: 23 a 201

39 Děkuji za pozornost!