Obecný metabolismus.

Transkript

1 mezioborová integrace výuky zaměřená na rostlinnou biochemii a fytopatologii CZ.1.07/2.2.00/ becný metabolismus. Metabolismus nukleotidů (13). Prof. RDr. Pavel Peč, CSc. Katedra biochemie Přírodovědecká fakulta UP v lomouci

2 snova. mezioborová integrace výuky zaměřená na rostlinnou biochemii a fytopatologii Funkce a struktura nukleotidů. CZ.1.07/2.2.00/ Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů. Katabolismus pyrimidinových nukleotidů. Recyklace bází. Biosyntéza a recyklace purinových nukleotidů. Biosyntéza deoxyribonukleotidů. Tvorba thymidylátu. Regulace biosyntézy nukleotidů. Katabolismus purinových nukleotidů. Xanthinoxidasa. Biosyntéza AD, FAD a CoA z ATP.

3 Funkce a význam nukleotidů. ukleotidy jsou klíčové molekuly vstupující do řady životních procesů. ukleotidy jsou aktivované prekurzory nukleových kyselin. Adeninový nukleotid, adenosintrifosfát (ATP) je univerzální energetické platidlo. Guaninový nukleotid, GTP, je také nositelem energie a součástí regulačních G proteinů. Deriváty nukleotidů jako je UDP-glukosa se podílí na biosyntéze, např. glykogenu. ukleotidy jsou součástí přenosu signálů v signálních drahách.

4 omenklatura bází, nukleosidů a nukleotidů. RA (ribonukleové kyseliny) Báze Ribonukleosid Ribonukleotid (5 -monofosfát) Adenin (A) Adenosin Adenylát (AMP) Guanin (G) Guanosin Guanylát (GMP) Uracil (U) Uridin Uridylát (UMP) Cytosin (C) Cytidin Cytidylát (CMP) DA (deoxyribonukleové kyseliny) Báze Deoxyribonukleosid Deoxyribonukleotid (5 -monofosfát) Adenin (A) Deoxyadenosin Deoxyadenylát(dAMP) Guanin (G) Deoxyguanosin Deoxyguanylát (dgmp) Thymin (T) Thymidin Thymidylát (TMP) Cytosin (C) Deoxycytidin Deoxycytidylát(dCMP)

5 Metabolické dráhy vedoucí k biosyntéze nukleotidů. Metabolické dráhy biosyntézy nukleotidů dělíme do dvou skupin: De novo dráhy biosyntéza z jednoduchých prekurzorů. Záchranné (salvage) dráhy recyklovaná báze se znovu spojuje s ribosou. PRPP = 5-fosforibosyl-1-difosfát (pyrofosfát). Záchranná dráha Aktiv ov aná ribosa (PRPP) báze De nov o biosyntéza Aktiv ov aná ribosa (PRPP) aminokyseliny ATP C 2... UKLETID UKLETID

6 Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů. Princip: První je syntetizován pyrimidinový kruh a posléze je připojena ribosafosfát za tvorby pyrimidinového nukleotidu. Pyrimidinový kruh je syntzetizován z hydrogenuhličitanu, aspartátu a amoniaku. Amoniak je produkován hydrolýzou glutaminu. Prví stupeň: Syntéza karbamoylfosfátu z hydrogenuhličitanu a amoniaku za současného štěpení dvou molekul ATP. Enzym: karbamoylfosfátsynthetasa (CPS). Reakce je dvoustupňová. V první stupni je fosforylovaný hydrogenuhličitan ATP za tvorby karboxyfosfátu a ADP. Amoniak poté reaguje s karboxyfosfátem za tvorby kyseliny karbamové a anorganického fosfátu. Druhý stupeň: katalýza karbamolyfosfátsynthetasa, vstupuje druhá molekula ATP za tvorby karbamoylfosfátu.

7 Tvorba karbamoylfosfátu. Enzym: Karbamoylfosfátsynthetasa - - ydrogenuhličitan - 2 ATP ADP - ATP ADP Karbamov á kyselina - P - Karboxyfosfát - 3 P i P - - Karbamoylfosfát Karbamov á kyselina

8 Tvorba orotátu a uridylátu. Karbamoylfosfát reaguje s aspartátem za tvorby karbamoylaspartátu v reakci katalyzované aspartáttrankarbamoylasou. Karbamoylfosfát se poté cyklizuje za tvorby dihydroorotátu, který je oxidován AD na orotát Asp P i P - - Karbamoylfosfát - 2 C C - Karbamoylaspartát 2 - C Dihydroorotát AD AD - C rotát

9 Tvorba orotátu a uridylátu. a tomto stupni se na orotát váže ribosa ve formě 5- fosforibosyl-1-difosfát (PRPP). Aktivní forma ribosy pro tvorbu nukleotidů. Ribosa-5-fosfát má původ v pentosafosfátové dráze PRPP je syntetisován za účasti synthetasy a ATP. rotát reaguje s PRPP za tvorby orotidylátu, pyrimidinového nukleotidu. Reakce je poháněna hydrolýzou difosfátu. Posledním stupněm je dekarboxylace orotidylátu za tvorby uridylátu enzymem orotidylátdekarboxylasou.

10 Tvorba orotátu a uridylátu. - P - - P - P P - C - - C rotát 5-Fosforibosyl-1-difosfát rotidylát - C - P C 2 - P - - rotidylát Uridylát

11 ukleotid mono-, di- a trifosfáty jsou vzájemně převoditelné. Uridylát (UMP) je základním nukleotidem pro syntézy ostatních pyrimidinových nukleotidů. V prvé řadě musí být převeden na uridintrifosfát (UTP). Děje se tak postupně. Enzym: UMPkinasa. UMP ATP UDP ADP Dále enzym: nukleosiddifosfátkinasa. XDP YTP XTP YDP Uridintrifosfát (UTP) je prekurzorem tvorby cytidintrifosfátu (CTP). Dochází k záměně oxoskupiny za aminoskupinu. Enzym: cytidintrifosfátsynthetasa. Reaktanty jsou ATP a glutamin jako zdroj aminoskupiny (obdoba syntézy karbamoylfosfátu).

12 Záchranná dráha recyklace bází. Důležitá je např. záchrana pyrimidinové báze thyminu, který je součástí nukleotidu v DA. Thymin uvolněný z DA je recyklován ve dvou stupních: Enzym: thymidinfosforylasa Thymin deoxyribosa-1-fosfát Enzym: thymidinkinasa Thymidin ATP TMP ADP thymidin P i Aktivita thymidinkinasy se mění s buněčným cyklem. Využívá se terapeuticky. apř. virální infekce herpex simplex se léčí acyclovirem, který převádí thymidinkinasu na sebevražedný inhibitor, který ukončuje DA syntézu.

13 Acyclovir. evytváří vazbu A T.

14 lavní dráhy katabolismu pyrimidinových nukleotidů u živočichů. (dbourávání TMP je v závorkách). 2 (C 3 ) 2 P i Ribosa - P CMP Cytidin ukleotidasa Cytidin deaminasa (d)ribosa - P UMP (TMP) 2 P i ukleotidasa Uridin (Thymidin) P Uridin i fosforylasa 2 4 ADP (d)ribosa - 1 P 2 ADP Uracil (Thymin) Dihydrouracildehydrogenasa (C 3 ) Dihydrouracil (Dihydrothymin) 2-2 C (C 3 ) C 2 ydropyrimidin -Ureidopropionát hydratasa -Ureidoisobutyrát)

15 lavní dráhy katabolismu pyrimidinů u živočichů. Malonyl-CoA je prekurzorem syntézy mastných kyselin a methylmalonyl-coa je převeden na sukcinyl-coa, viz CC. AD - (C 3 ) C C2 2-xoglutarát Glutamát 2 C ( 3 C) C C - CoA C 2 ( 3 C) C C 2 - Ureidopropionasa Aminotransferasa 2 C -Ureidopropionát -Ureidoisobutyr át) -Alanin ( -Aminoisobutyrát) Malonátsemialdehyd (Methylmalonátsemialdehyd) AD C - ( 3 C) C S-CoA Malonyl-CoA (Methylmalonyl-CoA)

16 Biosyntéza a záchrana purinových nukleotidů. Purinové nukleotidy mohou být syntetizovány de novo nebo recyklací zachráněny. Syntéza de novo. Princip: Purinový skelet je budován na ribose = PRPP postupně po malých molekulárních částech. Biosyntéza probíhá v devíti stupních. Většina těchto stupňů je katalyzována enzymy se záchytnou doménou pro ATP. ejdříve dochází k aktivaci na vazbě uhlík kyslík (typicky karbonyový kyslík) fosforylací a poté následuje náhrada fosforylové skupiny amoniakem nebo aminoskupinou, které působí jako nukleofil. R R ATP ADP Fosforylace Z R P - - u P i Výměna Z R u

17 Biosyntéza purinových nukleotidů. - P - - P - P - Gln 2 - Glu 3 - P Fosforibosyl-1-difosfát PP i 5-Fosforibosyl-1-amin.

18 Biosyntéza purinových nukleotidů. ATP Gly ADP P i P-ribosa P-ribosa- 2 3 Formyl-TF TF 2 C 2 Glycinamid ribonukleotid 2 C 2 ATP P-ribosa 3 Formylglycinamid ribonukleotid Glu ADP P i 2 C 2 P-ribosa 2 Formylglycinamidin Gln ribonukleotid ATP ATP Asp ADP P-ribosa 3 C C C 2 C C - P-ribosa 3 C ADP C C C C - ATP C 3 - P-ribosa 3 C C C C ADP P i 2 5-Aminoimidazol ribonukleotid P i

19 Biosyntéza purinových nukleotidů. ATP Asp ADP P-ribosa C 3 P i C C 2 C C C C - C 2 C - Fumarát P-ribosa C 3 C C C 2 TF-C C 2 TF C P-ribosa 3 C C C C 2 C TF-C = 10 -formyltetrahydrofol át 2 P-ribosa C 3 C C C C C Inosinát (IMP)

20 Biosyntéza AMP a GMP z inosinátu (IMP). C - ribosa-p Inosinát (IMP) Báze = hypoxanthin GTP Asp AD 2 GDP P i AD C - ribosa-p Adenylosukcinát Xanthylát ATP Fumarát AMP PP i 3 2 ribosa-p Gln 2 2 ribosa-p Adenylát (AMP) ribosa-p Guanylát (GMP)

21 Záchranná recyklace purinů. Do syntézy purinoviných nukleotidů de novo je třeba investovat mnoho energie ve formě ATP. Proto je velmi výhodné pro organismus recyklovat purinové báze z odbouraných nukleových kyselina z diety. Dva významné enzymy recyklace: Adeninfosforibosyltransferasa katalyzující tvorbu AMP: Adenin PRPP adenylát PP i Druhý enzym: ypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (GPRT) katalyzuje tvorbu guanylátu (GMP) a inosinátu (IMP). Prekurzory jsou guanylát a adenylát. Guanin PRPP guanylát PP i ypoxanthin PRPP inosinát PP i

22 Biosyntéza deoxyribonukleotidů redukcí ribonukleotidů (radikálový mechanismus). Jedná se specifickou redukci ribonukleotidu v poloze 2 hydroxylu na ribose. Substráty jsou ribonukleosiddifosfáty!! Enzym je ribonukleotidreduktasa. Ribonukleotidreduktasa E. coli je složena ze dvou podjednotek oba jsou dimery. Podjednotka R1 obsahuje aktivní místo a dvě allosterická kontrolní místa. Podjednotka obsahuje tři Cys a jeden Glu všechny čtyři participují na redukci ribosy na deoxyribosu. Rolí podjednotky R2 je produkce volných radikálů v obou svých řetězcích. Každý z řetězců R2 obsahuje stabilní tyrosylový radikál s nepárovým elektronemdelokalizovaným na aromatickém kruhu. Radikál je produkován v blízkém centru obsahujícím Fe 3 v můstku s iontem 2-.

23 Přenos elektronů z ADP na ribosu. (Ribonukletidreduktasa) Elektrony nutné k redukci pocházejí z ADP!! Přestup není přímý, ale přes thioredoxin (12 kd protein se dvěma Cys). ADP FAD TR S S Th S S RR S S Ribosov á j ednotka ADP S S S FAD 2 TR Th RR Deoxyribosov á j ednotka S S S Thioredoxinreduktasa(TR) Thioredoxin (Th) Ribonukletid reduktasa (RR)

24 Tvorba thymidylátu methylací deoxyuridylátu. Deoxyribonukleové kyseliny neobsahují uracil, ale thymin. Thymidylát je syntetizován za katalýzy thymidylátsynthasy : deoxyuridylát (dump) methyl = thymidylát (TMP). Donorem methylu je 5, 10 methylentetrahydrofolát. dump je aktivován vazbou thiolátu enzymu.

25 Syntéza thymidylátu (TMP). 2 2 C R 5, 10 -Methylentetrahydrofolát Enzym - S C 2 S - Enzym deoxyribosa-p R 2 5 C 2 deoxyribosa-p Dihydrofolát S - Enzym C 3 deoxyribosa-p Thymidylát (TMP)

26 Regenerace tetrahydrofolátu za katalýzy dihydrofolátreduktasy. Při syntéze thymidylátu se uvolňuje dihydrofolát, který je nutné regenerovat. Regeneraci katalyzuje dihydrofolátreduktasa a zdrojem elektronů je ADP. 2 Dihydrofolát ADP ADP C - 2 C - Tetrahydrofolát C - C -

27 Thymidykátsynthasa a dihydrofolátreduktasa jako místa působení chemoterapie rakoviny. Fluoruracil je převáděn in vivo na fluordeoxyuridylát (F-dUMP). F-dUMP je analog dump ireversibilně inhibující thymidylátsynthasu. Působí jako normální substrát a prochází celým katalytickým cyklem. Při tvorbě TMP je nutné odstranit proton z místa C-5 nukleotidu. Enzym nemůže odstranit F a proto je katalýza na tomto místě blokována. Příklad suicide inhibition (sebevražedné inhibice), na mechanismu enzymové reakce závislý inhibitor. Syntéza TMP je také blokována inhibicí regenerace tetrahydrofolátu. Analoga dihydrofolátu jako např. aminopterin a methotrexát (amethopterin) jsou silnými kompetitivními inhibitory (K i 1 nm) dihydrofolátreduktasy.

28 Místa působení protirakovinných léků. Fluoruracil Fluordeoxyuridylát (sebev ražedný inhibitor) dump - Thymidylát synthasa dtmp 5, 10 -Methylentetrahydrofolát Dihydrofolát Glycin Serin Tetrahydrofolát ADP ADP Dihydrofolátreduktasa - Aminopterin a methotrexát

29 Suicide inhibition (sebevražedná inhibice) thymidylátsynthasy 5-fluorUMP. 2 F C 3 deoxyribosa-p 2 C 2 R 5, 10 -Methylentetrahydrofolát Enzym ---- S F C 2 S ---- enzym deoxyribosa-p Stabilní adukt R

30 Regulace biosyntézy nukleotidů. Biosyntéza nukleotidů je regulována zpětnovazebnou inhibicí. bdoba regulace biosyntézy aminokyselin. Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů. Klíčový enzym je aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa). ATCasa je inhibována CTP konečným produktem biosyntézy. Stimulována je ATP. Aspartát karbamoylfosfát - ATCasa ATP karbamoylaspartát UMP UDP UTP CTP

31 Regulace biosyntézy purinových nukleotidů. Regulace biosyntézy purinových nukleotidů je komplexnější. Klíčovým krokem je konverze PRPP na fosforibosylamin. Reakci katalyzuje glutaminfosforibosylamidotransferasa. Reakce je zpětnovazebně inhibována mnoha purinovými ribonukleotidy. Inhibují GMp, AMP a IMP. Inosinát větvící bod syntézy AMP a GMP. AMP inhibuje konverzi inosinátu na adenylosukcinát vlastní prekurzor. bdobně, GMP inhibuje konverzi inosinátu na xanthylát bezprostřední prekurzor. GTP je substrátem při syntéze AMP a ATP je substrátem při syntéze GMP. Jedná se o reciprokou substrátovou závislost vedoucí k rovnováze syntézy adeninových a guaninových nukleotidů.

32 Kontrola a regulace biosyntézy purinových nukleotidů. is Pyrimidinov é nukleotidy Inhibov áno AMP Adenylosukcinát AMP Ribosa-5-fosfát PRPP Fosforibosylamin IMP Inhibov áno IMP, AMP, GMP Inhibov áno GMP Xanthylát GMP

33 Syntéza deoxyribonukleotidů je regulována na úrovni ribonukleotidreduktasy. Allosterická kontrola. Každý z polypeptidů R1 podjednotky reduktasy obsahuje dvě allosterická místa. Jedno reguluje celkovou aktivitu enzymu a druhé substrátovou specifitu. Celková aktivita reduktasy se snižuje po vazbě datp. Vazba ATP potlačuje tento efekt. Vazba datp nebo ATP do místa regulujícího substrátovou specifitu snižuje redukci UDP a CDP pyrimidiny. Vazba TTP (thymidintrifosfát) zvyšuje redukci GDP a inhibuje dále redukci pyrimidinových nukleotidů. Současné zvýšení hladiny dgtp stimuluje redukci ATP na datp. Regulace pyrimidiny a puriny vede k rovnováze obou typů nukleotidů pro syntézu DA.

34 Katabolismus purinových nukleotidů. 2 2 P i P i Ribosa-1-fosfát ribosa-5-p ukleotidasa ribosa Adenosin deaminasa ribosa AMP Adenosin Inosin ukleosid fosforylasa ypoxanthin 2 Xanthin oxidasa 2 - Urát Močov á kyselina Xanthin oxidasa 2 2 Xanthin Guanin 2

35 sud močové kyseliny u ostatních organismů. Močov á kyselina Urátoxidasa C Allantoinasa C Allantoin C C Allantoov á kyselina Vylučuj í Primáti Ptáci Plazi myz statní sav ci Kostnaté ryby 2 Vylučuj í 2 C C Kostnaté ryby Allantoov á kyselina Allantoikasa 2 C Glyoxylová kyselina C 2 2 x boj živ elníci Chrupav kov ité 2 ryby Močov ina 2 2 Ureasa C 2 Mořští bezobratlí

36 Adenosindeaminasa a důsledky její snížené aktivity. dbourání AMP zahrnuje jeden zvláštní stupeň. Adenosin není substrátem nukleosidfosforylasy. Fosfát je oddělen nukleotidasou za tvorby nukleosidu adenosinu. Zvláštní stupeň zahrnuje adenosindeaminasou katalyzovanou reakci za tvorby inosinu!!! Deficit adenosindeaminasové aktivity je spojen s řadou kombinovaných imunodeficitních (SCID = severe combined immunodeficiency) a imunologických onemocnění. apř. ztráta T buněk imunitního systému. Biochemickým důsledkem deficitu adenosindeaminasové aktivity je až 100násobné zvýšení hladiny datp, které inhibuje ribonukleotidreduktasu a tím i syntézu DA.

37 Dna je důsledkem zvýšené hladiny urátu v séru. Inosin tvořený adenosindeaminasou je metabolizován na hypoxanthin. Xanthinoxidasa za účasti flavoproteinu obsahujícího Mo a Fe oxiduje hypoxanthin na močovou kyselinu. Molekulární kyslík je přitom redukován na peroxid vodíku, který je rozkládán katalasou na kyslík a vodu. Močová kyselina uvolňuje při fyziologickém p proton za tvorby urátu. U lidí je urát konečným produktem degradace purinů. Vysoká hladina urátu v séru vede k onemocnění nazvaném dna (gout). Sodné soli urátu krystalují v kapalinách kloubů což vede k bolestivým zánětům. Také ledviny jsou uráty poškozovány. Jako terapie je podáván allopurinol, analog hypoxanthinu, který se chová nejdříve jako substrát a posléze jako inhibitor xanthinoxidasy. Suicide inhibitor!!

38 Krystalografická struktura (monomer) hovězí xanthinoxidasy (EC ). Vázany FAD (červeně), FeS klastr (oranžově), molobdenopterinový kofaktor s atomy Mo (žlutě) a salicylát (modře).

39 Allopurinol jako suicide inhibitor xanthinoxidasy. Allopurinol ypoxanthin Allopurinol Xanthin oxidasa Alloxanthin (xipurinol) Vazba do aktiv ního místa(x) edov oluje přev od Mo 4 na Mo 6

40 ladina urátů v evoluci. ladina urátů v séru u lidí je blízko limitu rozpustnosti. a rozdíl u poloopic jako např. lemuři, kteří mají 10x nižší hladinu. Jaká je selektivní výhoda vyšších hladin urátů u člověka? Uráty jsou efektivní zhášeče reakcí kyslíkatých radikálů Uráty jsou stejně efektivní jako askorbát ve funkci antioxidantů. Důsledkem je delší doba života člověka oproti nižším primátům a snížení rizika rakoviny. Další defekt purinového metabolismu spočívá v totální absenci hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasy. Vrozená vada Lesch-yhamův syndrom.

41 AD, FAD a koenzym A se tvoří z ATP. ukleotidy nejsou jen součástí nukleových kyselin. Tvoří početnou skupinu biomolekul. AD a ADP jsou koenzymy oxidoreduktas. Jejich prekurzorem je ATP. Prvím stupněm jejich biosyntézy je tvorba nikotinátribonukleotidu z nikotinátu a PRPP. ikotinát, také niacin vitamin B 6, je produktem degradace aminokyseliny Trp. edostatek Trp v potravě vede k onemocnění zvané pellagra. bdobně endokrinní tumor spotřebovávající Trp vede také k nedostatku neurotransmiteru serotoninu a ve svém důsledku k podobným symptomům jaké vykazuje pellagra. V dalším stupni syntéze je AMP přenášen z ATP na nikotinátribonukleotid za tvorby desamido-ad. Konečným stupněm je transfer amoniaku z amidoskupiny Gln na nikotinátový karboxyl za tvorby AD. ADP vzniká fosforylací AD ATP enzymem AD kinasa.

42 Biosyntéza AD z PRPP, ATP a nikotinátu. C - P - 2 C C - PRPP PP i ATP PP i C - ikotinát ikotinát ribonukleotid adenin ribosa - P- P - ribosa Desamido-AD Gln Glu 2 adenin ribosa - P- P - ribosa AD

43 Biosyntéza FAD. Flavinadenindinukleotid je syntetizován z riboflavinu a dvou molekul ATP. Riboflavin ATP riboflavin-5 -fosfát ADP Riboflavin-5 -fosfát ATP flavinadenindinukleotid (FAD) PP i 3 C 3 C C 2 adenin C 2 P- 2 P - ribosa Flav inadenindinukleotid (FAD)

44 Úloha difosfátu při biosyntézách. AMP, součást koenzymu A, má původ v ATP. Společným znakem biosyntéz AD, FAD a CoA je transfer AMP z ATP na fosforylovaný meziprodukt. Současně tvořený difosfát je bezprostředně hydrolyzován na dva orthofosfáty. Poznámka: Při mnoha biosyntézách se získává značná část potřebné termodynamické energie hydrolýzou uvolněného difosfátu!

45 lavní rozdíly v metabolismu purinových a pyrimidinových nukleotidů. ukleotidy Puriny Pyrimidiny Tvorba -glykosidové vazby V prvním kroku syntézy start na PRPP ejdříve syntéza pyrimidinového kruhu a poté napojení PRPP Lokalizace syntézy Cytoplasma Cytoplasma mitochondrie karbamoylfosfát- synthetasa Produkty degradace Močová kyselina (málo rozpustná ve vodě), 3 C 2, 3, Malonyl- CoA, sukcinyl-coa