Role sacharidů v živých organismech

Transkript

1 Role sacharidů v živých organismech Jitka Moravcová Ústav chemie přírodních látek, VŠCHT Praha, Jitka.Moravcova@vscht.cz Úvod Sacharidy jsou v přírodě nejzastoupenější přírodní látky; jejich roční produkce v biomase je vyšší než 100 biliónů tun. Z chemického hlediska jsou polyhydroxyaldehydy (aldosy) nebo polyhydroxyketony (ketosy) a podle počtu jednotek v molekule se dělí na monosacharidy (např. dglukosa, dfruktosa), oligosacharidy (do 10 jednotek, např. H H H H H H * H H H (II) βanomer (III) H H H H CH H H H H H H H H H H H CH 2 H H H (II) Dglukosa (II) αanomer (I) αanomer H H H H H H celulosa H H H brázek 1 Způsoby br. kreslení 1 Způsoby vzorců kreslení sacharidů, vzorců sacharidů, mutarotace mutarotace (IV) H H H H H n H H H H (II) βanomer H H H H sacharosa (II) H sacharosa, maltosa) a polysacharidy (desítky, spíše tisíce jednotek, např. celulosa nebo škrob). Pro znázornění struktury sacharidů se používá několik druhů vzorců (br. 1) 1: Fischerovy (I), Harworthovy (II), Milsovy (III) a vzorce vyjadřující skutečnost, že atomy pyranosového kruhu neleží v jedné rovině (IV). V roztoku podléhají sacharidy tzv. mutarotaci, což je ustavení rovnováhy mezi formou acyklickou a pětičlenným (furanosa) a šestičlenným kruhem (pyranosa) (br. 1, dglukosa). Tím, že hydroxylová skupina 63

2 v poloze 4 nebo 5 atakuje karbonylovou skupinu v poloze 1, uzavírá se kruh a v poloze 1 vzniká nové stereogenní centrum; takové diastereoisomery se nazývají anomery a označují se α nebo βanomery. V přírodě včetně biologických systémů se nacházejí jak sacharidy volné, tak jejich nejrůznější deriváty, jichž je ohromné množství. Z fyzikálněchemických vlastností volných sacharidů je nutné zmínit, že jsou vysoce polární, chirální sloučeniny, enantiomerně čisté, dobře se rozpouštějí ve vodě a jsou prakticky nerozpustné v organických rozpouštědlech. Jsou biodegradabilní a z obnovitelných zdrojů, ale bohužel obsahují příliš mnoho funkčních skupin podobné reaktivity, takže jejich chemická modifikace je značně obtížná. tom, že sacharidy jsou mimořádně důležitou skupinou přírodních látek svědčí i ta skutečnost, že za jejich výzkum byly uděleny tři Nobelovy ceny: Hermanu Emilu Fischerovi (1912, za synthesu sacharidů a purinů), Walteru Normanu Harworthovi (1937, za synthesu sacharidů a vitaminu C) a Luisu Frederiku Leloirovi (1970, za objevení nukleotidů a jejich významu pro biosynthesu sacharidů). Historie využití sacharidů lidskou populací je stará jako lidstvo samo. První vlastností sacharidů, která byla a stále je pro člověka důležitá, je jejich nutriční hodnota. Sacharidy tvoří nedílnou a podstatnou součást naší potravy. Pravidelně konzumujeme polysacharidy (škrob, celulosa, pektin, inulin), disacharidy (sacharosa, trehalosa, laktosa) i monosacharidy (dglukosa, dfruktosa, dmannosa) a jejich deriváty (např. glykosidy). Za zmínku stojí výjimečné postavení sacharosy, která je důležitou komoditou. Její celosvětová produkce je vyšší než 115 miliónů tun, přičemž asi 70 % se stále vyrábí z cukrové třtiny, zbytek je získáván z řepy cukrové, a pro potravinářské účely se používá až 95 % produkce. Technologie její výroby je perfektně vypracovaná a na sacharosu se tak můžeme dívat i jako na chemickou sloučeninu, které se vyrábí nejvíce. Dalším masivně vyráběným produktem jsou fruktosové sirupy, jejichž vstupní surovinou je škrob. Řada potravních doplňků obsahuje sacharidy jako základní složku, např. glukosamin, chondroitin a další. Sacharidy jsou důležitou průmyslovou surovinou i mimo oblast zpracování potravin a opět to je obnovitelnost jejich zdrojů, která je jejich nespornou výhodou. Sem lze zařadit výrobu celulosy z dřevní hmoty a následné zpracování na papír. Celulosa a kafr byly dvě základní suroviny pro celuloid, z něhož se sice filmy už nevyrábějí, ale stále je potřebný pro míčky na stolní tenis. Alkylovaná celulosa pak tvoří základní materiál pro kryty počítačů a pro další podobné výrobky. Je často používaná jako adsorpční materiál filtrů a pro chromatografie. Zájem chemického průmyslu o sacharidy roste tak, jak klesá zásoba fosilních surovin. V některých státech (Brazílie) je již sacharosa zpracovávána na 64

3 bioethanol, intenzivně se zkoumá možnost výroby polymerů odvozených od sacharosy a dalších produktů. Zatím většímu průlomu v technologiích brání i některé vlastnosti samotných sacharidů, které nejsou zrovna příliš výhodné pro velkotonážní produkci. Dobře lze tuto situaci dokumentovat právě na sacharose: Výhody nízká cena Nevýhody je polyfunkční 100% čistota je nerozpustná v běžných organických rozpouštědlech je krystalická a není hygroskopická není stabilní v kyselém prostředí je chirální a enantiomerně čistá je z obnovitelných zdrojů Dále je nutno zvažovat i další kriteria související s vlastnostmi produktů a meziproduktů ze sacharosy a s dostupností technologií. Lze je formulovat například do následujících obecných zásad: i) produkty musejí mít lepší aplikační nebo ekologické vlastnosti, a nebo musejí být levnější než ty původní, ii) meziprodukty by měly být zpracovatelné běžnou průmyslovou chemií (např. polymerizací), iii) technologie by měly zahrnovat minimum reakčních kroků s využitím levných činidel za environmentálně bezpečných podmínek, iv) reakce by měly probíhat buď ve vodném roztoku nebo bez rozpouštědla, v) v žádném stupni nelze použít kyselé prostředí nebo kyselé katalyzátory, vi) isolace a separace produktů musí být co nejjednodušší a snadno převoditelná z laboratorního do provozního měřítka. Právě zřejmé výhody sacharosy podnítily obrovský zájem chemiků o její využití jako průmyslové suroviny. Zatímco v období do roku 1965 bylo publikováno jen 15 plně identifikovaných derivátů sacharosy, v současné době je popsáno více než 300 těchto sloučenin2, což je přičítáno zájmu vyvolaném ropnou krizí v sedmdesátých letech minulého století. Fakt, že sacharidy jsou součástí biologicky aktivních přírodních látek rostlinného i živočišného původu, je znám už dlouho. Například sekundární metabolity rostlin se vyskytují převážne ve formě glykosidů, které jsou ve vodě rozpustné a umožňují tak rostlině transportovat biologicky aktivní ale ve vodě nerozpustný aglykon na místo poškození. Tyto glykosidy se řadí mezi tzv. fytoalexiny, což jsou látky, která rostlina 65

4 synthetisuje, jeli vystavena stresu vyvolaným např. suchým počasím, mechanickým poškozením nebo požerem či útokem plísní (br. 2). Tvorba glykosidů je využívána CH 2 H H H H CH 2 H aglykon H + Haglykon H glukosid H H CH 2 H silybin, aglykon ostropestřece marijánského HCH 2 H H H salicin, glukosid vrby bílé H H H H H H CH 2 H Me H H kumestrol, aglykon vojtěšky seté H genistein, aglykon sóji luštinné brázek 2 Struktury některých fytoalexinů br. 2 Struktury některých fytoalexinů rostlinami i k detoxifikaci. Člověk se z chování přírody poučil a vyrábí preparáty, ve kterých je léčivo navázáno na např. dglukosu glykosidovou nebo esterovou vazbou, což mu dodá rozpustnost ve vodě. Enzymy střevní mikroflóry nebo kyselé ph v žaludku pak účinnou složku z preparátu uvolní. Sacharidy jsou rovněž důležitými stavebními jednotkami (celulosa) nebo zdrojem energie (škrob). Rovněž nikdy nebyla zpochybňována důležitost sacharidů jako složek např. pojivových tkání (glykogen), a nebo jako součást jiných pro život nezbytných látek (ribonukleové a deoxyribonukleové kyseliny či proteiny). V těchto případech bylo ale na sacharidy pohlíženo jako na kostru těchto mnohem důležitějších molekul a nebo jako na sloučeniny, které jsou schopny modifikovat některé jejich fyzikálněchemické vlastnosti. S rozvojem biochemie a zejména buněčné biologie byly objeveny nové funkce sacharidů v živých organismech a za posledních 20 let tak prožívá chemie sacharidů obrovský rozmach. Byl objeven tzv. sacharidový kód, který je využíván ke hledání selektivních, cíleně působících therapeutik s minimálními vedlejšími účinky a který je pravděpodobně hlavním motivem základního i aplikovaného výzkumu sacharidů v současné době. 66

5 Sacharidový kód buňka toxin protilátka buňka V živém organismu je neustálá potřeba dorozumívání se na buněčné úrovni (br. 3). Buněčné rozpoznávání je základem imunitní odpovědi, uplatňuje se při ataku baktérií a virů, kde právě zachycení pathogenu na povrchu hostitelské buňky tvoří první fázi onemocnění; jeho role v rozšiřování nádorových buněk v organismu je rovněž důležitá. Aby tyto procesy vůbec probíhaly, musí být splněny dvě základní podmínky: organismus musí mít k dispozici receptor ( čtecí zařízení ), což jsou často proteiny buněčných povrchů, které obvykle postrádají katalytickou aktivitu enzymů (tzv. lektiny), a nějakou část biopolymeru nesoucí zašifrovanou informaci. K tomu, aby skupina látek mohla plnit funkci informačního systému, musí splňovat několik požadavků: a) specifické kódování (informace musí být jednoznačná a musí být i dešifrovatelná s nízkou pravděpodobností špatné interpretace); b) šifrovací sekce biomolekuly musí být malá, aby její synthesa nebyla energeticky náročná, a musí být prostorově snadno přístupná; d) kódovací sloučeniny musejí mít dostatečný potenciál pro rychlé strukturální změny. baktérie virus Všechny tyto požadavky splňují sacharidy v míře více než dostatečné. Sacharidy jsou prakticky nevyčerpatelnou zásobárnou rozmanitých struktur, neboť kupříkladu každá hexosa nabízí pět hydroxylových skupin jiné molekule sacharidu ke tvorbě glykosidové vazby. Kromě lineárních oligomerů mohou tvořit i rozvětvené struktury, což je vlastnost v biologickém systému zcela unikátní. Tak by 20 hexos mohlo teoreticky poskytnout 6, hexamerů, zatímco 20 aminokyselin pouze 1, Sacharidy jsou dále konformačně flexibilní, důležitá je zejména volná rotace kolem glykosidové vazby, přitom ale jednotlivé konformery mohou mít různou afinitu k vazebnému místu receptorudekodéru. Sacharidy jsou tedy téměř ideální sloučeniny pro generování kompaktních jednotek s explicitními informačními vlastnostmi. Za tímto účelem jsou oligosacharidy v organismu vázány kovalentní vazbou na lipidy a proteiny nebo peptidy a často se označují jako sacharidový epitop. 67

6 Sacharidy tvoří jen asi 1 % hmotnosti člověka, zatímco proteiny zhruba 15 % stejně H H H H H H H Dglukosa (Glc) NHAc H H NacetylDglukosamin (GlcNAc) H H H H H H H Dgalaktosa (Gal) NHAc H H NacetylDgalaktosamin (GalNAc) H H H Dxylosa (Xyl) H CH H H H H Dglukuronová kyselina (GluA) H H H Lfukosa (Fuc) CH H H H H H Didouronová kyselina (IdoA) R8 R R5 NH 5 3 R4 R7 H CH 1 brázek 4 Struktury základních monosacharidů lidského těla br. 4 Struktury základních monosacharidů lidského těla jako lipidy, 5 % je anorganických solí a zbytek je voda. Nepočítámeli dribosu a 2deoxydribosu (součást RNA a DNA), je základních monosacharidů v lidském těle deset (br. 4), z nichž kyselina neuraminová, dglukosamin a dgalaktosamin se vyskytují ve formě svých Nacetylderivátů. Kyselina neuraminová tvoří celou řadu dalších derivátů, které se nazývají společným názvem kyseliny sialové. 2 sialové kyseliny 7acetyl 4acetyl Nglykolyl 8acetyl 9laktyl 8methyl 9acetyl 9fosfát 8sulfát R4,R5,R7,R8,R9 = H kyselina neuraminová Nacetyl kyselina Nacetylneuraminová (NeuAc, Neu5Ac, NANA) Biosynthesa glykokonjugátů probíhá krok za krokem v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Exogenní monosacharidy penetrují do buňky a jsou přeměněny do stavebních bloků, typicky do podoby glykosylnukleotidů, které jsou dále transformovány na oligosacharidy a navázány na lipidickou nebo proteinovou kostru. Těchto transformací se účastní celá řada glykosidas a glykosyltransferas. Jakmile se glykokonjugáty dostanou na povrch buňky, slouží jako ligandy pro receptory jiných buněk nebo pathogenů. Typy interakcí sacharidů s proteiny Jako receptory se pro interakce se sacharidy uplatňují především proteiny (lektiny), a to prostřednictvím nevazebných interakcí, které mohou být typu vodíková vazba, 68

7 asociace s kovy, nepolární a iontová interakce. Důležité je, že při těchto interakcích nedochází k žádné chemické transformaci sacharidu, a proto se obecně netýkají enzymů. Jedna isolovaná interakce proteinu se sacharidem je slabá, a proto nepostačuje k předání informace. Naštěstí jak receptor tak oligosacharid jsou multifunkční sloučeniny schopné mnohonásobných interakcí ( glycoside cluster effect ). Vodíkové můstky. Jsou typickým příkladem interakce, která prakticky nikdy není osamocená, ale vždy se jedná o celou síť interakcí bidentálního charakteru s obecným brázek 5 br. Příklady 5 Příklady interakcí interakcí monosacharidů monosacharidů s proteiny: s proteiny: a) vodíkové můstky, b) asociace s kovem, c) hydrofobní interakce a) vodíkové můstky, b) asociace s kovem, c) hydrofobní interakce motivem NH H =C, kterých se účastní pobočné řetězce aminokyselin, jako jsou Asn, Asp, Glu, Gln, Arg nebo His, a sacharidové hydroxylové skupiny i kyslík pyranosové kruhu (br. 5a). Účast molekul vody je zcela obvyklá. Asociace s kovy. Interakci nejčastěji zprostředkovává vápník a dále mangan (br. 5b). Komplementární kontakt nepolárních ploch. I když jsou sacharidy především polárními sloučeninami, jsou schopny i nepolárních interakcí, neboť jedna ze stran molekuly sacharidu bývá více hydrofobní než druhá; v případě dgalaktosy je to strana B H H strana A H H H strana B Dgalaktopyranosa (jako strana A se označuje ta strana, kde se atomy uhlíku počítají od nižšího k vyššímu ve směru pohybu hodinových ručiček), která je například hydrofobnější než odpovídající B strana dglukosy nebo dmannosy, protože konfigurace na atomu C4 je l a hydroxylová skupina směřuje nahoru do strany A (br. 5c). Z toho důvodu je dgalaktosa skoro vždycky v nepolární interakci s aromatickým kruhem vhodné aminokyseliny. V případě oligosacharidů může nastat dokonce interakce se dvěma pyranosovými kruhy a molekula disacharidu je tak uzavřen mezi dvě nepolární plochy. 69

8 Iontová interakce. Uplatňuje se u nabitých sacharidů, tj. těch, které obsahují aminoskupinu, glukuronovou nebo idouronovou kyselinu či kyseliny sialové, přičemž karboxylová skupina je skoro vždy asociována s argininem. Tento typ interakce zodpovídá za afinitu aminoglykosidových antibiotik. Glykolipidy Glykolipidy jsou součástí buněčných membrán a vyskytují se ve všech organismech. Po chemické stránce jsou heterogenní skupinou amfifilních molekul, které mají jednu nebo více molekul monosacharidů vázaných jako glykosidy na hydrofobní kostru acylglycerolu nebo ceramidu. Přispívají ke stabilizaci a vyšší pevnosti membrán a rovněž se uplatňují v buněčné komunikaci, při modulaci receptorů a nebo signální transdukci, diferenciaci, proliferaci a onkogenezi. brázek 6 Struktura hopanoidů a lipoteichových kyselin H H H H H R H R = CH 2 H, CH 2 NH 2, CH H X X X P( P ) n P X = H, glykosyl H H H H H H Mezi glykolipidy prokaryotů se řadí hopanoidy, mykoláty, lipoteichové kyseliny, lipoglykany, lipopolysacharidy a sfingoglykolipidy. Hopanoidy jsou glykosidy s rigidními pentacyklickými aglykony a v membráně pravděpodobně vážou cholesterol, a tím ji zpevňují (br. 6). Mykoláty jsou součástí obálky mykobakterií, kde fungují jako efektivní bariéra proti pronikání antibiotik a chemotherapeutik. Lipoteichové kyseliny (br. 6) a jim podobné lipoglykany se nevyskytují současně v cytoplasmatické membráně jedné a téže grampozitivní bakterii, a proto se předpokládá, že jejich funkce jsou zaměnitelné. Lipopolysacharidy (LPS) jsou sloučeniny specifické pro gramnegativní bakterie, kde tvoří vnější povrch vnější membrány (br. 7). bsahují lipidickou část (lipid A), která je v poloze 6 glykosylována polysacharidem, který se skládá z tzv. jádra a antigenu. Zatímco struktura jádra je víceméně rigidní, je struktura antigenu variabilní a specifická, v některých případech antigen i chybí. LPS jsou endotoxiny, které vyvolávají u lidí a vyšších organismů septický šok. V USA se ročně vyskytne případů sepse ročně, z nich 20 50% je smrtelných; pokud se ovšem rozvine R 1 R 2 70

9 septický šok, je úmrtnost 90 %. Nositelem toxicity je lipid A, který stimuluje hostitelskou buňku k nadprodukci endogenních mediátorů, např. cytokinů, které v malém množství aktivují imunitní systém hostitele, ale ve velkém vyvolají horečku, tachykardii, vysoký tlak a následně smrt díky nefunkčnosti všech orgánů spojených s krevním oběhem. Některé lipidy A jsou toxické méně a slouží jako inspirativní matrice pro návrh nových léčiv. AbeAc Glc GlcNAc Man( Rha Gal Glc Gal) Gal n Glc 2 Hep HepP 3 Hep KD P KD NH H H H HN P H H H H H H CH KD H H H H H H Hep H H H Abe brázek br. 7 Struktura 7 Struktura LPS baktérie LPS baktérie Sallmonela Sallmonela typhimurium typhimurium brázek 8 Struktura glykosfingolipidu Sphyngomonas paucimobilis H H GluA H H H H N H Glykosfingolipidy gramnegativních bakterií jsou složeny z ceramidu (sfinganin acylovaný mastnou kyselinou) αglykosylovaného molekulou GluA (br. 8). Tři molekuly glykosfingolipidů představují strukturální jednotku odpovídající lipidu A. Glykosfingolipidy vykazují i podobnou biologickou aktivitu jako lipid A, ačkoliv jejich monomery jsou biologicky neaktivní. Ukazuje se, že pravděpodobně existuje jakási 71

10 supramolekulární struktura glykosfingolipidů, která je zodpovědná za jejich biologické a fyzikálněchemické vlastnosti. Živočišné glykosfingolipidy jsou rovněž odvozeny od ceramidu a jsou buď neutrální nebo kyselé, kterým negativní náboj dodávají sialové nebo uronové kyseliny a dále sulfáty, fosfáty a fosfonáty mono a oligosacharidů. Nacházejí se v nervovém systému a mozku. Více glykosylované glykosfingolipidy jsou ve všech tkáních a nazývají se podle oligosacharidového řetězce, např.: ganglio (DGal(13)DGalNAc(14)DGal (14)DGlc), neolakto (DGal(14)DGalNAc(13)DGal(14)DGlc), isoglobo (DGalNAc(13)DGal(13)DGal(14)DGlc) a další. Gangliosidy jsou kyselé glykosfingolipidy, které obsahují jednu nebo více sialových kyselin (br. 9). Řada z nich jsou antigeny krevních skupin, mohou vyvolat autoimunitní poruchu, modifikují aktivitu funkčně naprosto rozdílných receptorů, např. gangliosid GM1 aktivuje nervový růstový faktor. Gangliosidy se účastní adhezních procesů, kde představují vazebná místa pro toxiny, viry a bakterie, kdy se cukerná část glykosfingolipidu váže na lektinový receptor pathogenu. Sfingolipidy jsou nezbytné pro správnou funkci lidské kůže, kde přispívají ke vzniku permeační bariéry pro přenos vody. Mezi intenzivně studované glykolipidy patří glykosfingolipidy parazitů. Zdá se, že tyto brázek 97 Struktura gangliosidu GMI, který je receptorem toxinu střevní cholery gangliosid GM2 H H H H gangliosid GM3 H H NHAc H H HC H H H H HN H 12 H ( ) ( ) 16 H AcNH H ceramid NeuAc glukosylceramid konjugáty jako integrální součást povrchu parazita hrají důležitou roli v různých mechanismech nutných pro jeho přežití. Hlísty využívají molekulární mimikry, aby zabránily imunogennímu rozpoznání, a jsouli poznány, snaží se obejít svoje zničení tím, že se aktivně účastní imunoregulačního mechanismu. V prvé řadě napodobují strukturu glykosfingolipidů hostitelského organismu, protože ty odpovídají za adhezi buněk. 72

11 Glykoproteiny, proteoglykany a peptidoglykan Glykoproteiny jsou přítomny ve všech organismech a to jak v intracelulárním tak extracelulárním prostoru i v buněčných membránách (enzymy, antibody, receptory, hormony, cytokiny, strukturální proteiny). bsah sacharidů je v nich různý; pohybuje se od 1 hm% v kolagenu až po 99 hm% v glykogenu. Nejčastěji jsou sacharidy vázány jako a Nglykosidy, ojediněle rovněž jako Cglykosidy, a nebo přes ethanolaminfosfát. Vazebným místem pro tvorbu Nglykosidů je asparagin a z jednoduchých sacharidů se váže nejčastěji Glu, Rha nebo GalNAc. Pro vznik glykosidů jsou využívány H 2 N protein NH P Man H H H ethanolaminfosfát H H ethanolaminfosfát H H H GalNAc H H mastné kyseliny GalGalGal H H H 2 N H Gal H diacylglyceroly ceramid R2 P alkylacylglyceroly R1 brázek br Minimální struktura struktura GPI GPI kotvy kotvy a některé a některé strukturální strukturální variace variace hydroxylové skupiny zejména serinu a threoninu, dále pak tyrosinu, hydroxyprolinu nebo hydroxylysinu. Z jednoduchých sacharidů jsou obvykle navázány GalNAc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Glu, Gal, Man nebo Ara. Vazba přes ethanolaminfosfát využívá Ckoncové aminokyseliny proteinu a dává stabilní, orientované připojení sacharidů na membránu obvykle na extracelulárním povrchu buňky. Toto spojení se nazývá glykosylfosfatidylinositolová (GPI) kotva (br. 10). NGlykany Základem struktury všech Nglykanů je stejný pentasacharid jádra, který je připojen na asparagin (br. 11). K němu jsou připojeny tykadlové ( antennae ) oligosacharidy, které mohou být lineární i rozvětvené. Podle jejich struktury a způsobu připojení se 73

12 rozeznávají čtyři základní skupiny tykadel: oligomannosa, komplexní, hybridní a nejnovější typ obsahující Dxylosu. Man(α16)[Man(α13)]Man(β14)GlcNAc(β14)GlcNAc(β1N) Asn pentasacharid jádra tykadlové oligosacharidy pentasacharid jádra Asn brázek 11 Schematická struktura Nglykanů br. 11 Schematická struktura Nglykanů Struktura Nglykanového cukerného epitopu je specifická pro buňku a je označována jako antigenní determinant. Tvoří např. antigeny krevních skupin H, A a B, které jsou složkami sfingolipidů na povrchu erythrocytů. Mají jen velmi malé rozdíly v určující struktuře tykadel, které ale mají dalekosáhlé důsledky. Sérum jedinců s krevní skupinou A obsahuje protilátky antib, zatímco krevní skupina B má protilátky antia. Skupina AB nemá protilátky žádné, neboť její erythrocyty nesou oba antigeny A i B. Lidé s krevní skupinou mají obě protilátky a jejich buňky neobsahují antigeny žádné. Antigen H je prekurzorem oligosacharidů A a B a je přítomen na povrchu buněk krevní skupiny. Struktura sacharidových epitopů jednotlivých krevních skupin je následující: H: Fuc(α12)Gal(β13 nebo 4)GlcNAc; A: GalNAc(α13)[Fuc(α12)]Gal(β13 nebo 4)GlcNAc; B: Gal(α13)[Fuc(α12)]Gal(β13 nebo 4)GlcNAc. Glykany Tvoří rovněž velmi pestrou škálu cukerných motivů, které jsou navázány na hydroxylovou skupinu serinu nebo threoninu. Dělí se na dvě základní skupiny: glykany mucinového a nemucinového typu. První typ se nazývá mucinový proto, že byl poprvé identifikován v hlenu, a obsahuje až dvacet monosacharidů vázaných prostřednictvím N acetylgalaktosaminu. Formálně se glykany mucinového typu dělí na osm skupin podle monosacharidů jádra (Gal, GalNAc, GlcNAc), na kterých jsou připojeny další tykadlové sacharidy (nejčastěji Fuc a NeuNAc). Základní struktura, GalNAc(α1)Ser/Thr, se nazývá Tn antigen. bvykle tvoří klastry na krátkém úseku peptidové sekvence SerThr Pro, které se taká říká mucinová doména. Glykany nemucinového typu zahrnují větší 74

13 výběr sacharidů jádra a místem glykosylace proteinu je opět hydroxylová skupina serinu nebo threoninu. Rovněž glykany jsou pro organismus a jeho zdravotní stav velice důležité, neboť nesou antigeny rakovinných buněk a jsou rozpoznávací doménou pro buněčné interakce.proteoglykany Proteoglykan je protein, ve kterém jsou vázány tzv. mukopolysacharidy, což jsou lineární glykosaminoglykanové polymery, které mají v řetězci 15 až několik set základních disacharidových jednotek. Vždy nesou záporný náboj a jejich základními jednotkami jsou Nsulfátovaný Dglukosamin (GlcNS), GlcNAc a GalNAc, které se střídají s Gal, D glukuronovou (GluA) nebo Lidouronovou (IdoA) kyselinou. Jsou zejména v pojivových tkáních, neboť to jsou vysoce hydratované molekuly. Asi nejznámější je heparin, který se používá více než 60 let proti srážení krve, dále kyselina hyaluronová, která je součástí synoviální tekutiny očního sklivce nebo dermatansulfát přítomný v kůži (br. 12). Řada onemocnění jako je atherosklerosa, některé druhy rakoviny či Alzheimerova choroba se GlcA(β13)GlcNAc(β14) H C H * H H NHAc n* hyaluronová kyselina IdoA(α13)GalNAc(β14) 3 S H * H H NHAc n* C dermatansulfát * H R H C R HN S 3 dávají do souvislosti s abnormalitami v biosynthese a opracování proteoglykanu. n IdoA(α14)GlcNAc(α14) heparin (R = H) a heparinsulfát (R = S 3 ) brázek 12 pakující se disacharidová jednotka některých mukopolysacharidů br. 12 pakující se disacharidová jednotka některých mukopolysacharidů Peptidoglykan Peptidoglykan (dříve označovaný jako murein) je základním polymerem buněčných stěn gramnegativních i grampozitivních bakterií. Jeho struktura má tři základní charakteristické složky: polysacharidovou matrici, pentapeptidový pobočný řetězec a mezipeptidové můstky (br. 13). Všechny peptidoglykany obsahují střídavě (β14) vázaný GlucNAc a Nacetylmuramovou kyselinu (MurNAc) a to v počtu 5 45 jednotek. Struktura pentapeptidu je částečně proměnlivá, má obecnou sekvenci AlaγDGluXaaD AlaDAla, kde Xaa je Lys pro grampozitivní nebo mesodiaminopimelová kyselina pro gramnegativní bakterie. * 75

14 H H NHAc C H 3 Ala GlcNAc H H NHAc NHAc H DGlu Xaa DAla DAla DAla DAla Xaa DGlu Ala CH 3 C H 3 MurNAc H NHAc Ala DGlu DAla Xaa DAla DAla Xaa DAla DGlu Ala CH 3 brázek br. 13 Struktura 13 Struktura peptidoglykanu Interakce sacharidových epitopů s lektiny Lektiny jsou proteiny, které vážou mono a oligosacharidy reverzibilně a s vysokou specifitou, ale současně nevykazují žádnou katalytickou aktivitu a narozdíl od antibodů nejsou ani produktem imunitní reakce organismu. Každý lektin obsahuje typicky dvě nebo více domén rozpoznávající sacharidy (tzv. carbohydrate recognition domain, CRD), jinými slovy jsou di až polyvalentní. Proto také, když reagují s buňkami, např. erythrocyty, nejenže vážou sacharidy na jejich povrchu, ale vyvolávají i zesíťování buněk jejich následné srážení, které se nazývá aglutinace. Tato vlastnost je charakteristická a základní pro všechny lektiny. Lektiny mohou stejným způsobem srážet polysacharidy nebo proteiny. ba děje, aglutinace a srážení, jsou inhibovány sacharidovými ligandy, pro které jsou lektiny specifické. Lektiny, resp. receptory lektinového typu, jsou ve všech organismech, od virů a bakterií přes rostliny až k živočichům a savcům. Tvoří heterogenní skupinu oligomerních proteinů, které se liší velikostí, strukturou i stereochemií svých CRD domén, ale lze vystopovat jisté podobnosti v sekvencích aminokyselin. Lektiny byly poprvé isolovány z rostlin, a to v roce 1919 z fazolí a dnes známe v luštěninách již více než 100 zástupců. Velice známý a klasický je konkavalin A z Canavalia ensiformis nebo toxin ricin z Ricinus communis. Je prakticky neuvěřitelné, že role lektinů v rostlinách je dodnes prakticky 76

15 neznámá. V dalším textu bude uveden základní přehled o lektinech z hlediska jejich specifity k sacharidovým epitopům a funkce v živém organismu. Lektiny se formálně člení na jednoduché a mozaikové. Jednoduché mají molekulovou hmotnost pod 40 kda a vedle CRD mohou obsahovat další domény. Patří sem všechny rostlinné a z živočišných lektinů jen galektiny (dříve zvané Slektiny). Mozaikové lektiny obsahují několik druhů vazebných míst, z nichž jenom jedno má vlastnosti SRD. Patří sem virové hemoaglutininy na jedné straně a živočišné C, P a I lektiny na straně druhé. Galektiny Tato rodina lektinů specifická pro βdgalaktosidy se obvykle nachází uvnitř buňky v cytoplasmě a buněčném jádru, někdy ale jsou přítomny i na buněčném povrchu a v extracelulárním prostoru. Galektiny mají afinitu i vůči βdglukosidům a laktose. Předpokládá se, že mají rozhodující roli při normálním rozvoji a dělení buněk. Zvýšená koncentrace galektinu3 přítomného na povrchu rakovinných buněk může být odpovědná za adhezi těchto buněk v cílových orgánech, kroku nezbytném pro tvorbu metastáz. Inhibitory tohoto procesu mohou mít účinky protimetastázové. Byly objeveny i protilátky proti galalektinům; např. sérum pacientů s Hodgkinsovým sarkomem obsahovalo v 50 % případů protilátku proti galektinu9, zatímco sérum zdravých osob či osob postižených jiným nádorovým onemocněním žádné takové protilátky neobsahovalo. Zdá se, že se otevírají nové therapeutické a diagnostické cesty i pro galektiny. CLektiny Tato rodina lektinů vyžaduje pro interakci se sacharidy přítomnost vápenatého kationtu. Dělí se na několik dalších podskupin. Endocytické lektiny jsou receptory vázané v buněčné membráně např. v játrech, a mají různou specifitu (Gal, GalNAc, Man, Fuc). Např. povrch makrofágů obsahuje lektinový receptor specifický pro Dmannosu a na něj se váže na Dmannosu bohatý glykan z povrchu bakterie, kterou makrofág usmrtí tzv. lektinofagocytosou. Tento typ obrany, která není závislá na tvorbě protilátek, je znám jako součást vrozené imunity. Selektiny zprostředkovávají adhezi cirkulujících leukocytů na výstelku cévních stěn, což je první krok pro přenos leukocytů z cirkulačního systému a pro jejich další migraci do x tkáně. Rozpoznávacím epitopem je terminální tetrasacharid, sialyllewisx (slep P). Lselektin je pověstný jako naváděcí receptor, je přítomen na všech leukocytech 77

16 a zabezpečuje recirkulaci lymfocytů tím, že je směruje do obvodových lymfatických uzlin. E a Pselektiny jsou vytvářeny na povrchu výstelky cévních stěn jen tehdy, jsouli tyto buňky aktivovány mediátory (např. interleukin2) uvolňovanými ze tkáně jako odpověď na x poranění, ischémii nebo infekci. Afinita slep Pje k různým selektinům různá, jak vyjadřují následující disociační konstanty (mm): Eselektin, 0,7; Pselektin, 8; Lselektin, 4. PLektiny Tyto lektiny jsou specifické pro rozpoznávání Dmannosa6fosfátu a slouží pro nasměrování lysosomálních enzymů na místo určení. Pokud nemá enzym tento sacharidový epitop, pak není Plektiny rozpoznán a je vyloučen do mimobuněčného prostoru. ILektiny Rodina Ilektinů je poměrně úzká a rozpoznává sialovou kyselinu při nejrůznějších interakcích buněk. Sialoadhesin a lektin CD22 jsou součástí imunitního systému. Jiné lektiny V poslední době byl objeveno několik intracelulárních lektinů, které se účastní biosynthesy glykoproteinů, jejich roztřídění a transportu na povrch buňky. Z nich lektin zvaný kalnexin je v endoplasmatickém retikulu, kde se váže na terminální Dglukosu nově tvořeného glykoproteinu a kontroluje tak správnost sestavení glykanu. Jeho úlohou je být jakousi gardedámou glykoproteinu. Taktika hledání potenciálních therapeutik Nejdůležitější funkcí oligosacharidů v glykokonjugátech je jejich účast v řadě fyziologických a pathologických procesů, kde slouží jako rozpoznávací markery. Tak se účastní adheze infekčních buněk na buňku hostitelskou, zrání a směrování leukocytů, interakcí imunitního systému nebo tvorby a diferenciace rakovinných buněk a jejich metastáz a dalších životně důležitých pochodů. Porozumění tomu, jakými mechanismy sacharidy do těchto dějích vystupují, je velice důležité, protože rozpoznávání je vždy první fázi onemocnění a cíleně zasáhnout v tomto okamžiku je samozřejmě žádoucí. Hledání inhibitorů tohoto děje sleduje principiálně dva základní motivy: aktivitu proti biosynthese glykokonjugátů a nebo interferenci s glykokonjugáty v procesu rozpoznávání. Přes obrovské úsilí vědců jsou zatím pokroky v hledání léčiv a vakcín na bázi sacharidů 78

17 poněkud problematické. Důvodů je několik, některé z nich byly již zmíněny v úvodu. Prozatím chybí metodika porovnatelná se synthesou peptidů na pevném nosiči, modifikace polyfunkčních molekul jsou vždy obtížné a drahé a sacharidy obecně mají dosti nevhodné vlastnosti pro použití jako léčiva: jejich afinita k proteinům je nízká a podávané orálně jsou inaktivní, protože jsou snadno hydrolyzovány enzymy in vivo. Mohou být proto podávány pouze injekčně pro léčbu akutních symptomů, ale i tak mohou podléhat ataku glykosidas např. v séru. Afinitu k proteinům zvyšují do jisté míry polyfunkční interakce. Z uvedených důvodů je často výhodné nahradit sacharidy látkami, které napodobují jejich strukturu a funkci v procesu rozpoznávání, ale které mají lepší stabilitu, specificitu, afinitu a synthetickou dostupnost. Porozumění procesu rozpoznávání a definování role sacharidů je proto velice důležité. Postup při hledání potenciálních therapeutik lze rozdělit do několika základních procesů, jejichž pořadí není až tak důležité, protože se většinou jedná o vedle sebe probíhající děje. Studium interakcí sacharidů s proteiny. Výjimečné místo patří v tomto směru interakcím s lektiny. Sem patří studium struktury proteinu a stereochemie jeho aktivního místa pomocí molekulárního modelování, instrumentálních technik (NMR, MS, SPR) a rentgenostrukturní analýza proteinu samotného či jeho komplexu se sacharidy. Stejnými metodikami a dále ještě mikrokalorimetrií se studují i interakce sacharidu s proteinem. Výsledkem potom je teorie formulující základní požadavky na strukturu sacharidu, t.j. definují se ty funkční skupiny, které jsou pro interakce nezbytné. Modifikace struktury sacharidu. bvykle se odstraňují ty funkční skupiny, které se na interakcích nepodílejí, čímž se zjednoduší synthesa a zvýší se hydrofobicita molekuly. Poté se naopak zavádějí skupiny nové, které např. přinášejí do molekuly náboj nebo zvyšují stabilitu vůči hydrolyse. Biologické testy. Interakce nově připravené sloučeniny s lektinem se studují pomocí metod uvedených v prvním bodě a vyvozují se další závěry týkající se nároků na strukturu sacharidu. Tyto tři kroky se neustále opakují. Často studovaným případem pro therapeutickou x x intervenci je interakce oligosacharidu sialyllep P (slep P, br. 14) s Eselektinem a lze na něm dobře demonstrovat zásady uvedené výše. Interakce nastává hned zpočátku reakce 79

18 P a organismu na poškození a představuje jeden z iniciačních kroků tvorby a směrování bílých x krvinek, jehož sacharidovým epitopem je právě slep P. Chyba v tvorbě a nadprodukce leukocytů mohou mít pro organismus fatální následky. Mnohá zánětlivá onemocnění a to jak akutní (septický šok) tak chronická (asthma, arthritida) by mohla být léčena antagonisty této interakce. Dalším polem působnosti je chemotherapie nádorových onemocnění, protože je známo, že právě brázek 14 Struktura oligosacharidu slep Fuc H H H 3 C H Gal H H NHAc HC H H H H H GlcNAc H AcNH H NeuAc tato interakce je odpovědná za vysokou tendenci některých tumorů vytvářet metastáze. Na x základě známé konformace slep Pvázané na E a Pselektiny odvozené z NMR měření doplněné výsledky krystalografických studií lektinových vazebných domén byly definovány důležité funkční skupiny v molekule, které jsou nezbytné pro vznik vazby na lektiny (br. 14, vyznačeny tučně). Pro rozpoznání Eselektinem jsou rozhodující všechny tři hydroxylové skupiny na Fuc, z nichž ty v poloze C3 a C4 koordinují vápenatý kation. Stejně důležitá je přítomnost volných hydroxylových skupin v poloze C4 a C6 Gal a karboxylová skupina sialové kyseliny. Molekula GlcNAc nepřispívá k interakcím žádnou svojí funkční skupinou a může být principiálně nahrazena řadou bifunkčních spojovacích členů. Strana B Dgalaktosy i sialové kyseliny jsou pravděpodobně v kontaktu s nepolárními plochami vazebné domény Eselektinu a skutečně částečné nahrazení H 3 C C C 10x CH 3 H H H H H H H 5x x H H H N C ( ) 3 H H Aktivita sle x = 1 H H H H CNH CEt C Bn H H H 10x 1,1x H H H H H 20x C ( ) 3 CNH CN CNH(CH2 ) 13 CH 3 brázek 15 Analogy slep jejich relativní aktivity vůči E selektinu br. 15 Analogy sle x a jejich relativní aktivity vůči Eselektinu x 80

19 P P sacharidů aromatickými či jinými hydrofóbními jednotkami vedlo ke zvýšení afinity x k Eselektinu. Takovým způsobem byly připraveny antagonisté slep P s velice dobrou aktivitou k Eselektinu (br. 15). Literatura: 1 2 PPacák J., Drašar P.: Chemické Listy 95(10), 6659 (2001). PMoravcová J.: Chemické Listy 95(4), (2001). 81

20 82