Moderní analytické metody v analýze potravin Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a technologie potravin Moderní analytické metody v analýze potravin Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Bořivoj Klejdus Ph.D. Vypracovala: Eva Vosynková Brno 2011

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Moderní analytické metody v analýze potravin vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendlovy univerzity v Brně. Dne: Podpis autora:

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji svému vedoucímu práce, panu prof. RNDr. Bořivoji Klejdusovi Ph.D. za cenné rady a uvedení do problematiky týkající se mé bakalářské práce. Děkuji také svým nejbliţším, kteří mě podporovali během studia.

4 ABSTRAKT Analytickými metodami se rozumí postupy, slouţící k získávání informací o chemickém sloţení látek, coţ je většinou podmíněno rozkladem produktu na jednotlivé sloţky. Bakalářská práce je zaměřena na poznatky o moderních analytických metodách v analýze potravin. Práce se dále zabývá přehledem současných analytických metod, které se pouţívají v potravinářských laboratořích a pouţitím nových separačních a extrakčních technik v analýze potravin. Klíčová slova: chromatografie, HPLC, extrakce, separační metody ABSTRACT Analytical methods means procedures used to gather information about the chemical composition of substances, which is often subject to degradation product of the individual components. The thesis is focused on the knowledge of modern analytical methods in food analysis. The paper also deals with an overview of current analytical methods used in food laboratories and the use of new separation and extraction techniques in food analysis Key words: chromatography, HPLC, extraction, separation methods

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Princip chromatografie Rozdělení separačních metod CHROMATOGRAFICKÉ METODY V PLOŠNÉM USPOŘÁDÁNÍ Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Papírová chromatografie (PC) Vyvíjení chromatogramu Kvalitativní vyhodnocování chromatogramu Kvantitativní vyhodnocení chromatogramu Vyuţití chromatografie na tenké vrstvě (TLC) VYSOKOÚČINNÁ TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE (HPTLC) VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) Princip separace látek Kolony pro HPLC Detektory pro HPLC Optické detektory Fotometrický detektor Detektor s proměnnou vlnovou délkou PDA detektor (Photodiode Array) Fluorimetrický detektor Refraktometrické detektory Deflekční (výchylkový) detektor Fresnelův detektor Interferometrický detektor Evaporative light scattering detector (ELSD) Elektrochemické detektory Ampérometrické detektory Kulometrické detektory Systémy fází pro HPLC... 32

6 6.5 Vyuţití HPLC PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE Princip separace látek Mobilní fáze - nosný plyn Regulační systém Kolona Detektor Vyuţití plynové chromatografie EXTRAKČNÍ TECHNIKY Extrakce z kapaliny do kapaliny Provedení extrakce Extrakce pevná látka kapalina SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE SFE Výběr podmínek pro SFC Oxid uhličitý Srovnání SFE s GC a HPLC MIKROVLNNÁ EXTRAKCE SOXHLETOVA EXTRAKCE EXTRAKCE URYCHLENÝM TOKEM ROZPOUŠTĚDLA ZÁVĚR SEZNAM DŮLEŢITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY... 52

7 1 ÚVOD Analytickými metodami se rozumí postupy, slouţící k získávání informací o chemickém sloţení látek, coţ je většinou podmíněno rozkladem produktu na jednotlivé sloţky. Znalost analytických metod čerpá z mnoha jiných oborů, jako např. obecné, anorganické, organické a fyzikální chemie a jiných přírodních věd. Pouţití analytických metod nachází uplatnění kontrole a řízení různých výrobních procesů, v monitorování ţivotního a pracovního prostředí, v nesčetných aplikacích v klinické praxi, v chemickém a fyzikálním výzkumu a dalších oblastech lidského snaţení. Analytické metody slouţí ke zjišťování buď druhu přítomných látek (prvků, iontů, atd.), coţ je tzv. kvalitativní určení, kdy jde o důkaz, zda je látka přítomna nebo nepřítomna ve vzorku; nebo kvantitativní určení, kde zjišťujeme obsah těchto sloţek a stanovení určujeme číselným údajem. Na základě způsobu rozboru analytických vlastností můţeme metody pouţívající se v analytické chemii dělit na: Klasické Instrumentální Klasické metody, označované někdy jako chemické metody, jsou metody, které nepracují se sloţitými fyzikálními přístroji. Patří sem např. vizuální pozorování změn analytických vlastností nebo odměrná či váţková analýza. Instrumentální metody vyuţívají další analytické vlastnosti vzorku, které nelze spolehlivě hodnotit subjektivním pozorováním nebo váţením či měřením objemu. Dělíme je podle fyzikálně chemické podstaty měření nebo postupu na metody: Separační Optické Elektrochemické Radiochemické Termické 8

8 2 CÍL PRÁCE Cílem mé práce s názvem Moderní analytické metody v analýze potravin bylo: Zpracovat literární rešerši, v níţ budou shrnuty poznatky o moderních analytických metodách v analýze potravin. Přehled současných analytických metod pouţívaných v potravinářských laboratořích. Nové trendy v analytických metodách při analýze potravin. Moderní extrakční a separační metody. Pouţití nových separačních a extrakčních technik v analýze potravin. 9

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Princip chromatografie Analytické chromatografické metody jsou vysoce účinné separační metody, které slouţí k oddělování jednotlivých analyzovaných sloţek ve směsi a tím i k jejich kvalitativní a kvantitativní analýze. Principem separace těchto sloţek je zvýšení koncentrace jedné nebo i více sloţek vzhledem k ostatním látkám přítomným v analyzovaném vzorku (Klouda P., 2003). Jejich vyuţití je především při analýzách směsí látek, kdy ostatní analytické metody, jako např. spektrofotometrické, nelze plně pouţít. Jelikoţ je velká většina jak technických produktů, tak přírodních látek, sloţité směsi, mají v současné době chromatografické metody prvořadý význam v analytickém testování. Separační metody se vyznačují selektivitou, rozsahem pouţitelnosti a frakcionační kapacitou (Holzbecher Z., Churáček J., 1987). Selektivita vyjadřuje schopnost separační metody dělit látky na základě jedné nebo více vlastností. Vlastnosti mohou být: Fyzikální příklad separace na základě rozdílu molekulové hmotnosti Chemická příklady separace na základě: odlišných funkčních skupin vysoce specifických biochemických vlastnosti látek strukturních odlišností dělení podle tvaru molekuly (cis a trans izomery), chorální - separace, atd. Rozsah pouţitelnosti vyjadřuje schopnost separační metody dělit určitý typ vzorku vzhledem k fyzikálně chemickým vlastnostem sloţek. Separační technika můţe být vhodná pro dělení molekul, iontů, makromolekul, atomů, těkavých látek apod. Frakcionační kapacita uvádí maximální počet sloţek, které mohou být rozděleny v jedné operaci, např. jednoduchá extrakce rozdělí vzorek na dvě části, GC naproti tomu poskytne několik set sloţek (Karlíček R. a kol., 1997). 10

10 3.2 Rozdělení separačních metod U všech chromatografických metod se ustanovuje rovnováha analyzované směsi mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi (Karlíček R. a kol., 1997). Nepohyblivá, stacionární fáze má schopnost různou mírou zadrţovat jednotlivé součásti analyzované směsi. Pohyblivá, mobilní fáze pak vymývá (tzv. eluuje) jednotlivé součásti směsi ze stacionární fáze a odnáší je ve směru toku definovanou rychlostí, čímţ dojde k jejich oddělení (separaci). Stacionární fáze můţe mít tuhé skupenství (sorbent) nebo kapalné skupenství, mobilní fáze kapalná (eluent, eluční činidlo) nebo plynná (nosný plyn). V chromatografickém systému je tok hybnou silou mobilní fáze, která unáší ionty nebo molekuly. Vlastní separace jednotlivých látek v systému závisí na brzdící síle (tzv. retenci), která působí selektivně: některá látka je brzděna více, jiná méně. V průběhu chromatografického procesu se ustavuje dynamická rovnováha mezi vratnou sorpcí na nepohyblivé fázi a desorpci do pohyblivé fáze. Rychlost postupu látky závisí na sorpční rovnováze, látka v chromatografickém systému postupuje tím pomaleji, čím pevněji se sorbuje na nepohyblivé fázi (Klouda P., 2003, Holzbecher Z., Churáček J., 1987). V dnešní době se pouţívá mnoho typů chromatografických metod, které rozdělujeme: Dle separačního děje na: Rozdělovací chromatografii kde o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost sloţek vzorku ve stacionární (nepohyblivé) fázi Adsorpční chromatografii kde o separaci rozhoduje různá schopnost jednotlivých sloţek poutat se (adsorbovat se) na povrch stacionární (nepohyblivé) fáze Iontově - výměnná chromatografii - kde o separaci rozhodují různě velké elektrostatické přitaţlivé síly mezi funkčními skupinami stacionární fáze a ionty vzorku Gelová chromatografii kde se sloţky separují podle velikosti na pórovitě stacionární fázi (gelu), menší molekuly vzorku se v pórech gelu zdrţují déle Afinitní chromatografii kde je stacionární fáze schopna vázat ve vzorku právě určité sloţky, ke kterým má úzce selektivní vztah (afinitu) 11

11 Dle pouţité techniky (uspořádání stacionární fáze) na: Kolonovou chromatografii stacionární fáze je umístěna v koloně (trubici) o různé délce Papírová chromatografii (Paper Chromatography PC), kde stacionární fázi tvoří papír Tenkovrstvá chromatografii (Thin Layer Chromatography TLC), kde je stacionární fází tenká vrstva (tzv. TLC deska) Dle způsobu vyvíjení na: Eluční chromatografii je nejrozšířenější formou chromatografie, vzorek je nanesen (nastříknut) do proudu mobilní fáze. Při průchodu kolonou dochází k dělení sloţek podle síly interakce mezi sloţkami a sorbentem. Sloţky jsou zředěny mobilní fází a mohou být rozděleny do vzájemně zcela oddělených zón. Vytěsňovací chromatografii mobilní fáze se velmi silně adsorbuje na sorbentu, a to silněji neţ kterákoli sloţka vzorku. Mobilní fáze je tedy vytěsňovací činidlo. Sloţky vzorku naneseného na kolonu jsou tlačeny před zónou mobilní fáze a nemusí být plně rozděleny. Frontální chromatografii na kolonu je kontinuálně vnášen vzorek v roztoku, který slouţí současně jako mobilní fáze. Na koloně dochází k dělení jednotlivých sloţek vzorku, ale pouze ta nejméně zadrţovaná sloţka je získána v čisté podobě (Karlíček R. a kol., 1997). Dle skupenství mobilní fáze na: Kapalinovou chromatografii (Liquid Chromatography LC) Plynovou chromatografii (Gas Chromatography GC) 12

12 4 CHROMATOGRAFICKÉ METODY V PLOŠNÉM USPOŘÁDÁNÍ a) papírová chromatografie (PC) rozdělovací - mobilní fáze je kapalná, stacionární fáze je kapalina zachycená na papíře b) tenkovrstvá chromatografie (TLC) rozdělovací - mobilní fáze je kapalná, stacionární fáze je kapalina zachycená v tenké vrstvě adsorpční - mobilní fáze je kapalná, stacionární fáze je tuhý adsorbent, který je součástí tenké vrstvy Papírová chromatografie (Paper Chromatography, PC) je starší a jednodušší metoda neţ tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography, TLC), která ji postupně nahradila. Princip TLC je znám velmi dlouho, cca více neţ 100 let, ale její analytické vyuţití začalo aţ před 30 lety zásluhou E. Stahla a v té době se stala jednou z nejuţívanějších chromatografických technik (Stahl E., 1988). PC a TLC mají společný systém uloţení stacionární fáze, která je umístěna na ploše, na rozdíl od technik kolonových chromatografií. V papírové chromatografii je však tvořena speciálním papírem, v tenkovrstvé chromatografii je pak stacionární fáze v tuhém skupenství nanesená v tenké vrstvě na vhodné desce. Mobilní fáze se skláda většinou ze směsí rozpouštědel, v některých případech s přídavky kyselin bází nebo tlumivých roztoků (Popl M., Kubát J., 1986). PC i TLC metody zahrnují následující základní kroky: příprava vzorků dávkování (neboli aplikaci) vzorku vzorky jsou dávkovány ve formě úzkých zón, aby se omezilo jejich rozmývání během analýzy. Obvykle se vzorky nanášejí na papír nebo tenkou vrstvu pomocí mikrokapilár. vyvíjení chromatogramu (separační techniky) vyhodnocení chromatogramu: vizualizace (detekce) separovaných látek, kvalitativní a kvantitativní stanovení 13

13 4.1 Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Pouţívají se téměř všechny stacionární fáze jako pro kolonovou chromatografii se zrnitostí 5 aţ 40 μm. Stacionární fáze jsou naneseny na skleněných deskách nebo hliníkových fóliích. Tenké vrstvy mohou obsahovat fluorescenční indikátor UV254 k usnadnění detekce analyzovaných látek (Popl M., Kubát J., 1986). Stacionární fáze: oxid hlinitý, silikagel, celulóza, iontoměniče, polyamid a silikagel s - C18, -NH2 nebo -CN skupinami Mobilní fáze: cyklohexan, toluen, chloroform, dichlormetan, aceton, ethanol, methanol, voda, amoniak, kyselina octová a jejich směsi. 4.2 Papírová chromatografie (PC) Stacionární fází bývá v papírové chromatografii většinou voda poutaná celulózou (celulózový filtrační papír 99 % α-celulózy) zachycená na papíře. Mobilní fází bývají organická rozpouštědla nebo jejich směsi, které se s vodou vůbec nemísí nebo mísí jen omezeně (Popl M., Kubát J., 1986, Klouda P., 2003). Princip dělení analytů v PC a TLC Vzorek se nanáší ve formě malé kulaté skvrnky na papír nebo tenkou vrstvu, poté se mobilní fáze nechává vzlínat póry papíru nebo tenké vrstvy. Mobilní fáze unáší dělené sloţky ze vzorku, které se více či méně zpoţďují interakcí (rozpouštění nebo adsorpce) se stacionární fází, a tím se vzájemně dělí (viz Obr. 1). Obr. 1: Princip dělení analytu (Anonym 1) 14

14 Vzorky rozpuštěné v těkavém rozpouštědle se nanáší na start. Nanáší se 0,1% aţ 5% roztoky v mnoţství 200 nl aţ 20 μl do skvrn o průměru 2 aţ 6 mm Vyvíjení chromatogramu Nejčastěji se pouţívá vyvíjení vzestupné (tzv. lineární vyvíjení standardní metoda), v PC se pouţívá téţ vyvíjení sestupné (viz Obr. 2). U dvojrozměrného vyvíjení se postupuje tak, ţe po vyvíjení v jednom směru se deska vysuší, otočí se o 90 a vyvíjí se znovu za pouţití jiného (jiných) rozpouštědel. Při kruhovém (tzv. radiálním) vyvíjení se eluent přivádí do středu desky a sloţky migrují k jejímu obvodu (Klouda P., 2003). Pro vztah mezi R F, lineární a R F, kruhový platí: R F, lineární = R 2 F, kruhový Obr. 2: Vyvíjení chromatogramu (Anonym 2) Kdyţ čelo mobilní fáze dosáhne téměř protilehlého okraje papíru či tenké vrstvy, vyvíjení se ukončí a chromatogram se vybere z vyvíjecí komory. Čelo mobilní fáze se označí měkkou tuţkou. Chromatogram se vysuší a skvrny nebarevných analytů je třeba před vyhodnocováním chromatogramu detegovat za pouţití vhodné detekční metody (Klouda P., 2003, Karlíček a kol., 1997, Anonym 1) Pouţívané detekční metody 15

15 a) ponoření nebo postřik chromatogramu vhodným činidlem H 2 SO 4 (pouze TLC), KMnO 4, I 2 b) fluorescence luminoforů v UV záření c) zhášení fluorescence tenkovrstvé desky nadopované fluorescenčním indikátorem Kvalitativní vyhodnocování chromatogramu Jednotlivé separované analyty jsou charakterizovány tzv. retardačním faktorem (R F ). Obr. 3: Vyhodnocování chromatogramu (Anonym3) u i rychlost skvrny i-tého analytu u m rychlost (čela) mobilní fáze d i vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu (viz Obr. 3) d m vzdálenost čela mobilní fáze od startu (viz Obr. 3) Analyty identifikujeme a) porovnáním poloh skvrn analytů a standardů chromatografovaných na témţe chromatogramu b) porovnáním hodnot retardačních faktorů ( R F ) analytů s publikovanými hodnotami změřenými za stejných experimentálních podmínek 16

16 c) porovnáním R M hodnot R M na rozdíl od R F závisí aditivně na strukturních prvcích chromatografované látky. d) porovnáním hodnot relativních retardačních faktorů R F,rel,i je relativní retardační faktor tj. retardační faktor chromatografované látky vztaţený k retardačnímu faktoru standardu (Klouda P., 2003, Štulík a kol., 2003) Kvantitativní vyhodnocení chromatogramu Kvantitativní vyhodnocení dělíme na přímé nebo nepřímé. U nepřímé semikvantitativní metody se skvrna z papíru vystřihne nebo vyškrábe z tenké vrstvy a dále se extrahuje vhodným rozpouštědlem. Koncentrace látky v extraktu se pak určuje např. spektrofotometricky nebo jinou analytickou metodou. K přímým metodám patří měření plochy skvrny (logaritmus plochy skvrny je přímo úměrný koncentraci), radiochemická metoda ( jde li o radioaktivně značené látky) a denzitometrie. Pouţití skenovacích fotodenzitometrů (viz schéma na Obr.4) je nejvíce rozšířené a poskytuje nejpřesnější výsledky. 17

17 Obr. 4: Pouţití skenovacích fotodensitometrů (Anonym 4) Vyuţití chromatografie na tenké vrstvě (TLC) Pouţití tenkovrstvé chromatografie v analýze organických látek je dnes naprosto běţné. Tato metoda je nepostradatelná v kaţdé laboratoři zabývající se syntézou či analýzou organických látek. TLC metoda umoţňuje kromě identifikace samotných látek nebo látek ve směsích určit také jejich čistotu, tj. zjistit přítomnost aktivních látek, rozkladných produktů, produktů vedlejších reakcí, atd. (Popl M., Kubát J., 1986). Výhodou je pouţívání koncentrované kyseliny sírové jako detekčního činidla pro organické látky (způsobuje vznik tmavých skvrn). Výše uvedený způsob chromatografie má největší význam při identifikaci a stanovení látek ve sloţitých směsích. Slouţí např. k analýze alkaloidů, glykosidů, steroidů, vitamínů, apod. Tenkovrstvou chromatografii je moţno pouţít v klasické (TLC) nebo vysokoúčinné (HPTLC) experimentální podobě (Klouda P., 2003). 18

18 5 VYSOKOÚČINNÁ TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE (HPTLC) HPTLC vyuţívá stejné druhy stacionární fáze jako v klasické TLC metodě, avšak s velmi malou zrnitostí a velkou homogenitou zrnitosti (Štulík a kol., 2003). Výhodou je, ţe HPTLC dovoluje zpracovávat i 20 vzorků na jedné desce současně. K vyvíjení chromatogramu dochází ve vyvíjecích komorách s moţností regulace sloţení plynné fáze, neboť průtok eluentu tenkou vrstvou závisí na tlaku a sloţení páry (plynné fáze) nad vrstvou. K dávkování a vyhodnocování se vyuţívají instrumentální metody. Mobilní fáze se dodávají na vrstvu pomocí mikročerpadel (F m 1 μl/s) tak, aby byl zajištěn rovnoměrný tok eluentu tenkou vrstvou. Vzorek se nanáší pomocí kapiláry nebo mikropipety na start, který je blízko jednomu konci plochy. U vysoce účinných tenkých vrstev se můţe nanášení provádět pomocí automatických dávkovačů. Po vyschnutí rozpouštědla se tímto koncem ponoří papír nebo podloţka s tenkou vrstvou do mobilní fáze a umístí se v prostoru nasyceném parami mobilní fáze. Mobilní fáze vzlíná papírem nebo tenkou vrstvou pomocí kapilární síly, pokračuje se přes start a nese s sebou sloţky vzorku. Rychlost unášení sloţek vzorku je tím větší, čím méně se poutají na stacionární fázi a čím jsou lépe rozpustné v mobilní fázi. Proto se vzorek rozděluje na části obsahující jednotlivé sloţky. Vyvíjení se ukončí před dosaţením druhého konce dané plochy (Poole C., Poole S., 1995). Čelo se ihned označí (po odpaření rozpouštědla jiţ nemusí být rozeznatelné). V případě, ţe sloţky nejsou tvořeny barevnými látkami, provede se jejich zviditelnění tzv. detekce. K detekci lze pouţít postřik aerosolem činidla, které se sloţkami reaguje na barevné sloučeniny nebo se provede pozorování pod ultrafialovou lampou, kdy se fluoreskující látky jeví jako světlé skvrny na tmavém pozadí. 19

19 Obr. 5: Schéma HPTLC (Anonym 5) 6 VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) HPLC metoda byla vyvinuta z plynové chromatografie v počátcích 70. let. Účinnost separace kapalinové chromatografie závisí na velikosti částic stacionární fáze. V klasické kapalinové chromatografii protéká mobilní fáze samospádem stacionární fází, kterou tvoří kolona. Menší velikost a stejnoměrnost jednotlivých částic stacionární fáze, zvyšuje velikost účinné plochy a separační činnost. Aby byl zajištěn dostatečně rychlý průtok mobilní fáze, je třeba ji protlačit kolonou za pomocí čerpadla pod vysokým tlakem. Nevýhodou HPLC metody ve srovnání s GC metodou je náročnější instrumentace a sloţitější mechanismus separace (Fowlis I. and coll., 1995, Poole C., Poole S., 1995) 6.1 Princip separace látek Dělení látek probíhá mezi stacionární fází, která je obsaţena v koloně a mobilní fází protékající kolonou za vysokého tlaku. Vzhledem k tomu, ţe k dělení látek lze vyuţít všech vratných dvoufázových separačních mechanismů (tj. adsorpce, rozdělování, iontová výměna, síťový efekt gelu), je moţné pouţít selektivní a účinný chromatografický systém k dělení směsi v podstatě všech organických látek rozpustných ve vodě, zředěných kyselinách nebo organických rozpouštědlech. 20

20 Kapalinový chromatograf V kapalinové chromatografii je mobilní fáze čerpána vysokotlakým čerpadlem, které umoţňuje konstantní tok mobilní fáze o malé rychlosti (0,1-10 ml/min.) za vysokého tlaku (aţ 40 Mpa). Pro dělení směsi látek, jejichţ eluční parametry se příliš neliší, se pouţívá tzv. izokratická eluce mobilní fází, jejíţ sloţení je konstantní v celém průběhu chromatografie. U některých směsí látek však nelze tímto způsobem dosáhnout optimálního dělení, zejména v případě, kdy se jednotlivé sloţky směsi svými elučními parametry významně liší. V takovém případě se vyuţívá tzv. gradientová eluce, při které se k jedné mobilní fázi plynule přimíchává vzrůstající mnoţství druhé mobilní fáze s větším elučním účinkem. Tím se vytváří plynulý koncentrační gradient mobilní fáze (Braithwaite A. and coll., 1996, Popl M., Kubát J., 1981). Dávkování roztoku vzorku je moţné provádět speciální injekční mikrostříkačkou pomocí dávkovacího kohoutu. Jehlou stříkačky se probodne septum ze speciální pryţe a dávkují se různé objemy. Kohoutem lze dávkovat pevně daný objem roztoku, avšak daleko přesněji. 6.2 Kolony pro HPLC Kolony pro HPLC tvoří ocelové nebo skleněné trubice o délce 5-30 cm, s vnitřním průměrem 2-8 mm, naplněné stacionární fází. Náplň kolony musí být naprosto homogenní a rovnoměrná, proto se většinou pouţívají kolony plněné a testované přímo výrobcem. Spoje mezi kolonou, dávkovacím zařízením a detektorem jsou kapilární (vnitřní průměr 0,5mm), materiál je nejčastěji z nerez oceli (Braithwaite A. and coll., 1996). Typy HPLC kolon: Kapilární kolony Mikrokolony Narrow bore kolony Analytické kolony Semipreparitivní kolony Preparativní kolony ID vnitřní průměr ~ stovky, desítky mikrometrů 1 mm 2 mm ~ 2 mm do ~ 10 mm ~ 10 mm do ~ 25 mm nad 25 mm 21

21 6.3 Detektory pro HPLC Poţadavky kladené na HPLC detektory: Vysoká citlivost - detekce látek v roztoku v koncentracích ng aţ μg/ml Reprodukovatelnost a linearita odezvy Nezávislost odezvy na změně sloţení mobilní fáze při gradientové eluci Univerzálnost - detekce všech oddělených sloţek vzorku V HPLC se především pouţívají následující typy detektorů: Optické Elektrochemické Hmotnostní Optické detektory Patří mezi nejpouţívanější detektory. Zdroje záření jsou: Nízkotlaká rtuťová lampa s maximem 254 nm pro měření na 254 nm, případně na 280 nm + filtry Deuterinová lampa pro měření v oblasti od nm Wolframová lampa pro měření v oblasti od 400 nm do 700 nm Xenonová lampa pro měření v oblasti od 190 nm 800 nm Odezva detektoru závisí na sloţce a na pouţité vlnové délce (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995) 22

22 6.3.2 Fotometrický detektor Mezi vlastnosti detektoru patří: Měření na jedné vlnové délce, detekce aromátů a látek majících dvojné vazby. Také ho lze pouţít pro gradientové separace. Má dobrý dynamický rozsah , malá citlivost na nestabilitu průtoku a teploty. Podle konstrukce detektoru je zde malá nebo relativně velká citlivost k indexu lomu solventu (konstrukce měrné cely je velmi podstatná). Komerčně jsou vyráběny detektory umoţňující programování měřící vlnové délky v čase, coţ vede ke zvýšení citlivosti a selektivity detekce (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Obr. 6: Fotometrický detektor (Braithwaite A. and coll., 1996) Detektor s proměnnou vlnovou délkou Některé detektory umoţňují současné měření při dvou vlnových délkách coţ umoţňuje ověření čistoty píku PDA detektor (Photodiode Array) Umoţňuje kontinuální skenování celého spektra eluátu po dobu analýzy bez zastavení toku. Detektor neobsahuje ţádné pohyblivé díly, coţ vede k vysoké spolehlivosti a přesnosti. Celé spektrum záření z cely je rozkládáno holgrafickou mříţkou na záření o jednotlivých vlnových délkách. Záření o vymezených vlnových délkách dopadá na lineární pole aţ 1056 fotodiod na křemíkovém čipu, kde kaţdá fotodioda má spektrální rozlišení ~ 1,2 nm. Spektra jsou vynesena např. jako funkce vlnové délky a času. 3D mapa je nastavitelná podle všech os, to umoţňuje prohlíţení v různých úhlech, ale existuje ještě mnoho různých 2D způsobů prohlíţení dat. Absorpční spektra jsou produkována velkou rychlostí 0,01 sec na 1 spektrum (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). 23

23 Obr. 7: PDA detektor (Braithwaite A. and coll., 1996) Fluorimetrický detektor Konstrukčně je velmi podobný fotometrickým detektorům. Měří se fluorescenční záření, tzn. ţe látka je excitována zářením o určité vlnové délce a emituje záření s vyšší vlnovou délkou. Zdrojem záření je xenonová lampa nebo deuteriová výbojka. Detektor je vybaven filtry v excitační a emisní části (monochromátory nebo kombinací filtru a monochromátoru). Existuje moţnost snímání excitačního a emisního spektra. Obvyklé je pravoúhlé uspořádání s parabolickým zrcadlem pro zlepšení citlivosti. Látky vykazující fluorescenci mají obvykle konjugovanou cyklickou strukturu např. PAH. Mnoho nefloreskujících látek je moţno vhodně derivatizovat (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Výhody: Vysoká citlivost x lepší neţ fotometrický detektor Malá citlivost na změny teploty a průtoku Linearita ~ 10 3 Vysoká selektivita 24

24 Nevýhody: Pokud je při pouţité vlnové délce absorbance eluentu větší neţ 0,005 můţe dojít ke koncentračnímu zhášení, proto se pouţívají rozpouštědla neabsorbující v UV oblasti, alifatické uhlovodíky, alifatické alkoholy, některé ethery Refraktometrické detektory Refraktometrický diferenciační detektor registrující změny indexu lomu eluátu je sice univerzální, ale málo citlivý a vyţaduje oproti ostatním detektorům velmi pečlivé termostatování. Výhody refraktometrických detektorů: Linearita 10 4 Univerzálnost, široké aplikační moţnosti Nevýhody: Citlivost ~ 10 3 x niţší neţ fotometrické detektory, není vhodný pro stopovou analýzu Citlivost na stabilitu tlaku a průtoku Nekompatibilní s gradientovým uspořádáním Detektory jsou tří typů: Deflekční Fresnelova typu Interferenční 25

25 6.3.6 Deflekční (výchylkový) detektor Záření ze zdroje je kolimováno čočkou a dopadá na detekční celu, která je sloţena z referenční a měrné části jenţ jsou odděleny diagonální skleněnou přepáţkou. Při změně sloţení kapaliny v měrné cele dojde ke změně úhlu vychýlení světelného paprsku, který detekční celou prochází. Podle vychýlení paprsku dopadajícího na fotonásobič je produkován odpovídající signál (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995) Fresnelův detektor Je zaloţen na Fresnelově zákonu, podle kterého je frakce odraţeného světla na rozhraní sklo kapalina úměrná úhlu dopadu světla a indexu lomu kapaliny. Světlo zdroje je kolimováno čočkou a fokusováno na referenční a měrné rozhraní hranol kapalina. Světlo se odráţí na rozhraní skrz kapalinu do cely, a potom se odráţí zpět od povrchu za celou. Nakonec projde přes rozhraní kapalina hranol do detekčního systému. Jestliţe je v měrné cele kapalina odlišného sloţení neţ v referenční cele, výsledné mnoţství světla dopadajícího na duální detektor se různí. Pokud je v měrné i referenční cele stejná kapalina, je mnoţství odraţeného světla v obou celách stejné a na duální detektor dopadá stejné mnoţství záření (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Obr. 8: Fresnelův detektor (Braithwaite A. and coll., 1996) 26

26 6.3.8 Interferometrický detektor Záření určité vlnové délky (často 546 nm) je rozděleno do dvou svazků stejné intenzity. Svazky jsou fokusovány do referenční a měrné cely a pak fokusovány do druhého děliče svazku, kde dojde ke konstruktivní interferenci (záření jsou ve fázi) v případě stejných kapalin v obou celách nebo destruktivní interferenci (záření jsou fázově posunuta), pokud jsou kapaliny v celách různé. Intereferometrický detektor je nejcitlivější ze všech RI detektorů (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Obr. 9: Interferometrický detektor (Braithwaite A. and coll., 1996) Evaporative light scattering detector (ELSD) (Odpařovací rozptylový detektor) Odpařovací rozptylový detektor má poměrně jednoduchou konstrukce a vlastnosti univerzálního detektoru. Je vhodný i pro gradientovou separaci. Odezva detektoru je jen málo ovlivňována změnou vnější teploty. Vhodný pro látky nemající chromofor (nelze detekovat fotometricky) kam patří: sacharidy, tuky, polymery, nederivatizované aminokyseliny a mastné kyseliny, detergenty, atd. V praxi jsou pouţívány dva typy ELSD: Typ A Vhodný pro detekci netěkavých látek dělených chromatografií na reverzních fázích s pouţitím nejlépe těkavých organických rozpouštědel nebo na normálních fázích. Průtok mobilní fáze do 1,5 ml/min (Braithwaite A. and coll., 1996) 27

27 Typ B Ideální je především pro detekci středně těkavých solutů ve vodné mobilní fázi. Průtoky jsou akceptovatelné do 1,5 ml/min (Braithwaite A. and coll., 1996) Obr. 10: Evaporative light scattering detector (ELSD) 28

28 Elektrochemické detektory Řada funkčních skupin separovaných látek podléhá za vhodných podmínek oxidaci nebo redukci. Jednou znejdůleţitějších vlastností je půlvlnový potenciál látky. Platí zde pravidlo, ţe látky oxidovatelné/redukovatelné chemicky jsou také obtíţně oxidovatelné nebo redukovatelné elektrochemicky. V HPLC se vyuţívá jak elektrochemické oxidace tak redukce. Snadnější je vyuţití oxidačních dějů, protoţe v případě redukce je detekce znesnadňována vysokým signálem (proudem) pozadí, který je vyvolán redukcí rozpuštěného kyslíku v mobilní fázi na vodu. Jestliţe je detekce zaloţena na redukčním ději, musí být mobilní fáze velmi pečlivě odplyněna. Princip elektrochemických detektoru je zaloţen na aplikaci konstantního napětí mezi pracovní a referentní elektrodu. Pokud je napětí vyšší neţ půlvlnový potenciál dané látky, dojde k redoxnímu ději, jenţ je doprovázen zvýšeným průchodem proudu, který je registrován. Obvykle se pouţívá tříelektrodové zapojení (třetí pomocná elektroda zabezpečuje konstantní stabilní napětí mezi pracovní a referentní elektrodou). Pro detekci se vyuţívá selektivity dané příslušným půlvlnovým potenciálem registrované látky. Běţně se pracuje při jednom vhodně zvoleném napětí. Detekční limity bývají aţ o 4 řády lepší neţ s uţitím spektrofotometrické detekce. Selektivita detekce umoţňuje měření i ve sloţitých směsích a komplikovaných matricích (Štulík a kol., 2003). Tab 1: Vybrané látky stanovitelné elektrochemickým detektorem (Štulík a kol., 2003) Oxidace Redukce Amidy Olefiny Aminy Estery Fenoly Ketony Chinoliny Aldehydy Katecholaminy Ethery Thioly Diazo - látky Peroxidy Nitro - látky 29

29 Pracovní elektroda je zhotovena z různých materiálů např.: skelný, porézní, pyrolytický, uhlík, nebo kovů: platina, zlato, stříbro, amalgám zlata, slitiny kovů, apod. Volba materiálu elektrody je ovlivněna řadou faktorů, jako jsou: účast elektrody na redoxním ději, pouţitelný rozsah napětí, kinetika procesu přenosu elektronů atd. Uhlíkové elektrody jsou obyčejně jen inertním zdrojem elektronů, kovové elektrody se účastní redoxních dějů přímo a dochází tak k jejich přeměně. Elektroda je tak postupně znehodnocována, jedním z moţných postupů omezujících uvedený negativní jev je aplikace pulzní ampérometrické detekce (PAD). Uhlíkové elektrody jsou spíše pro obecné pouţití, naproti tomu kovové elektrody pro cílené vybrané analyty, kde většinou umoţňují dosaţení lepší meze detekce neţ obecně pouţitelné elektrody uhlíkové (Štulík a kol., 2003). Referentní elektroda byla v minulosti nejčastěji argentchloridová: stříbro/chlorid stříbrná nebo kalomelová: rtuť/chlorid rtuťný. V současné době se prosazuje palladiová referentní elektroda (na bázi poločlánku vodík/palladium). Posledně jmenovaná elektroda je velmi malá, umístitelná do těsné blízkosti pracovní elektrody. Je také tlakově odolná, nevyţaduje údrţbu a její potenciál je za daných podmínek velmi stabilní. Potenciál elektrody ovšem závisí na ph (protoţe řada látek má redoxní potenciály podobně závislé na ph, je tato vlastnost referentní elektrody výhodná). Lze aplikovat gradient ph při chromatografické analýze (Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Elektrochemické detektory se často dělí do dvou skupin: Ampérometrické Kulometrické Ampérometrické detektory Oxidují nebo redukují jen část (do ~ 10%) analytu, jsou tedy koncentračně závislé. Vlivem elektrolytických dějů se povrch elektrod poměrně snadno, dochází ke změnám odezvy a je nutná častá kalibrace a pravidelné ošetřování elektrody. Pomocná elektroda je obyčejně z nerezové oceli, vnitřní objem detektoru je velmi malý ~ 1μl 30

30 Kulometrické detektory U kulometrických detektorů dochází k redoxnímu ději pro 100% analytu, všechna látka je kompletně přeměněna na elektrodě. Pracovní elektroda je sloţena z porézního gradientu a eluent protéká skrze elektrodu. Díky uvedenému uspořádání je účinnost elektrolytické reakce velmi vysoká. Poměr signál/šum je příznivější (ve srovnání s amepérometrickými detektory). Detektor nevyţaduje téměř ţádnou údrţbu, při kontaminaci 90% povrchu pracovní elektrody poskytuje stabilní signál, ţivotnost je běţně 1-2 roky. Systém je stabilní vzhledem k teplotním změnám (Štulík a kol., 2003, Braithwaite A. and coll., 1996, Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Graf 1: Srovnání elektrodové účinnosti ampérometrického kulometrického detektoru na rychlosti průtoku mobilní fáze (Štulík a kol., 2003) Nejvíce vyuţívané jsou detektory spektrofotometrické, které registrují absorbanci eluátu protékajícího kyvetou o vnitřním objemu 10 μl a menším. Jednodušší detektory umoţňují měřit pouze při daných vlnových délkách 220, 254, 436, 546nm, dokonalejší jsou spektrometrické detektory s volitelnou vlnovou délkou v oblasti nm. Nejvíce informací lze získat spektrofotometrem s diodovým polem řízeným počítačem a snímajícím celé absorpční spektrum eluátu kaţdou sekundu. Výsledkem je třírozměrný (3D) chromatogram jako závislost absorbance na vlnové délce a na čase, ze kterého lze rychle identifikovat eluované látky a posoudit jejich čistotu. 31

31 6.4 Systémy fází pro HPLC Náplň kolony (tj. kvalita sorbentu, jeho velikost a stejnoměrnost částic, ale i tvar, porozita, struktura) hraje rozhodující roli pro účinné dělení látek. Pro většinu HPLC aplikací se pouţívají nemodifikované nebo chemicky modifikované mikročástice silikagelu (velikosti 3, 5 nebo 10 μm) nebo oxid hlinitý. Nemodifikovaný silikagel se vyuţívá pro separaci látek na základě adsorpce, na jehoţ volně přístupné skupiny Si- OH na povrchu se polární látky adsorbují prostřednictvím vodíkových vazeb. Silikagel se dehydratuje sušením při zvýšené teplotě a lze tak získat asorbent s poţadovanou aktivitou. Oxid hlinitý je vhodnějším adsorbentem, zejména pro méně polární látky (Klouda P., 2003). U rozdělovací chromatografie je kapalná stacionární fáze zakotvena na vhodném nosiči. Takto zakotvená kapalná fáze není pro HPLC příliš vhodná, protoţe při vysokém tlaku dochází k jejímu narušení. Pro tento účel se osvědčily chemicky modifikované stacionární fáze, u nichţ se na bázi silikagelu silylací připravují fáze s různými skupinami (Braithwaite A. and coll., 1996) Podle vázané skupiny mají chemicky modifikované fáze různou polaritu od nepolárních, vysoce hydrofobních, pouţívaných pro obrácený systém fází aţ po polární. K dělení výšemolekulárních sloučenin jako např. bílkovin a polysacharidů jsou vhodné polymerní gely jako např. dextran. V současné době se dostávají do popředí tzv. chirální stacionární fáze umoţňující separaci a stanovení optických izomerů. Mobilní fáze pouţívané při HPLC musí být velmi čisté a zbavené rozpuštěných plynů, coţ se provádí probubláváním heliem nebo působením ultrazvuku za vakua. K získání přiměřených elučních parametrů je nutný výběr vhodné mobilní fáze. Podle rostoucí eluční účinnosti jsou rozpouštědla seřazena do eluotropní řady: heptan < cyklohexan < tetrachlormethan < toluen < ether < chloroform < aceton < acetonitril < ethanol < methanol < octová kyselina. Do organického rozpouštědla se pro zlepšení dělení kyselých a bazických látek přidává malé mnoţství kyseliny, alkálie nebo pufru. 32

32 6.5 Vyuţití HPLC HPLC je velice účinná separační metoda, která vhodně doplňuje plynovou chromatografii. Mezi hlavní výhody HPLC patří zejména široká oblast pouţitelnosti: umoţňuje analyzovat anorganické ionty, polymerní sloučeniny a také termolabilní a netěkavé sloučeniny, její vyuţití v praxi je velmi široké, zejména pro takové sloučeniny, jako jsou steroidy, cukry, vitamíny, pesticidy a barviva. 7 PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE Plynová chromatografie je jednou z nejdůleţitějších a nejpouţívanějších chromatografických metod. Mezi hlavní výhody této metody patří vysoká citlivost a velmi vysoká separační účinnost. Plynovou chromatografií je moţné identifikovat a stanovit nejen plyny, ale i látky kapalné a pevné, které je moţné převést bez rozkladu do plynného stavu (asi do 400 C). Plynová chromatografie se od jiných druhů chromatografie liší pouze v tom, ţe mobilní fází je plyn a látky se dělí v plynném stavu. Pro nutnost přeměny analytů v plyny můţeme separovat takové látky, které mají dostatečný tlak syté páry, jsou tepelně stálé a mají relativní molekulovou hmotnost menší neţ Plynová chromatografie můţe být pouţita k separaci plynů, většiny nedisociovatelných kapalin a pevných organických molekul a mnoha organokovových látek. Není pouţitelná pro separaci makromolekul, organických a anorganických solí (Fowlis I. and coll., 1995). 7.1 Princip separace látek Roztok vzorku, který obsahuje dělené látky, se vstříkne do vyhřívaného prostoru dávkovače, kde se ihned vypaří a je unášen proudem nosného plynu do chromatografické kolony, umístěné v termostatu. Dělené látky se na počátku kolony sorbují ve stacionární fázi, tj. rozpouštějí se v zakotvené fázi (GLC) nebo se adsorbují na pevný adsorbent (GSC) a poté se desorbují čistým nosným plynem. Proces probíhá vícenásobně, nosný plyn unáší dělené látky a z kolony nakonec vystupuje jedna látka po druhé v poměru svých sorpčních sil (Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). 33

33 Látky, které se sorbují málo, vstupují do kolony jako první, mají kratší eluční časy, látky silně sorbované vystupují z kolony později. Z kolony vystupují látky do detektoru, kde se registruje signál odpovídající změnám koncentrace v nosném plynu vstupujícím z kolony Mobilní fáze - nosný plyn Jako nosné plyny se nejčastěji pouţívají vodík, dusík, helium a argon. Při volbě nosného plynu jsou rozhodující následující faktory: viskozita, účinnost, čistota, reaktivita, typ pouţívaného detektoru a cena plynu. Často vyuţívaný vodík má následující nevýhodu je hořlavý a explozivní, případně schopný hydrogenace některých látek, které pak detekujeme navíc. Volba nosného plynu je často určena druhem kolony a detektoru. Nosný plyn z tlakové láhve (dusík, helium, argon, vodík) se před vstupem čistí, suší a reguluje se u něho průtok a tlak (Klouda P., 2003) Aby se dosáhlo co nejlepšího rozdělení látek, musí být průtok mobilní fáze optimalizován na koloně, tj. dosáhnout co nejmenšího rozšíření zón separovaných látek. Čtyři hlavní děje, které se podílejí na rozšiřování zón během průchodu kolonou jsou : a) Vířivá difúze různé molekuly musí urazit různé vzdálenosti b) Podélná molekulární difúze molekuly putují z místa o vyšší koncentraci do místa o niţší koncentraci, po i proti směru proudění mobilní fáze c) Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi různé molekuly difundují různě hluboko do stacionární fáze d) Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi rychlostní profil mobilní fáze je parabolický Regulační systém Jedná se o elektronické regulační zařízení, které slouţí k ovládání průtoku a tlaku nosného plynu. Regulátor průtoku slouţí k udrţování konstantního průtoku plynu kolonou a detektorem bez ohledu na typ nosného plynu, teplotu a rozměry kolony. Dalšími typy regulátorů průtoku v plynové chromatografii jsou tzv. 34

34 regulátory konstantního hmotnostního průtoku jsou zaloţeny na zpětné vazbě regulující tlak v děliči průtoku za regulátorem. Vzroste li tlak za regulátorem, dojde k většímu otevření membrány, a tedy zvýšení vstupního tlaku a zachování nastaveného průtoku. mechanické regulátory konstantního hmotnostního průtoku vyţadují na vstupu regulovaný tlak zpravidla o 100 k Pa vyšší, neţ je výstupní tlak regulátoru. Membrány regulátorů jsou zhotovovány z plastů nebo kovu. Vzhledem k tomu, ţe je membrána z obou stran obklopena nosným plynem, můţe být potenciálním zdrojem znečistění pouze vypařování samotného materiálu membrány. elektronické regulátory konstantního hmotnostního průtoku jsou zaloţeny na proporcionálním ventilu řízeném měřením teploty vlákna, která je funkcí tepelné kapacity nosného plynu. Při změně průtoku nosného plynu, např. při teplotním programu, vzniká rozdíl mezi nastavenou a měřenou hodnotou teploty vlákna. Tento rozdíl je však regulačně korigován dalším otevřením ventilu a tak dosaţením poţadovaného průtoku. 7.2 Kolona V plynové chromatografii se pouţívají náplňové nebo kapilární kolony. Náplňové kolony - jsou trubice o průměru 2 aţ 5 mm, délka 1 aţ 3 m naplněné sorbenty nebo nosiči pokrytými kapalnou fází. Kolony se vyrábějí ze skla nebo nerezové oceli. Typy náplní adsorbentů pro adsorpční chromatografii jsou silikagel, grafitizované saze a oxid hlinitý. Jako molekulová síta se pouţívají hlinitokřemičitany. Nosiče kapalné fáze pro rozdělovací chromatografii bývají např. na bázi křemeliny. Vyrábějí se tím způsobem, aby se při separaci neuplatňovaly jejich adsorpční schopnosti, protoţe separace sloţek mezi nosným plynem a zakotvenou kapalnou stacionární fází má probíhat pouze na principu rozdělování (Poole C., Poole S., 1995) 35

35 Kapilární kolony se vyrábějí z křemenného skla a kvůli pevnosti jsou potaţeny filmem polyimidu. Vnitřní průměr kolon je v intervalu 0,1 0,6 mm, tloušťka filmu stacionární fáze 0,25 5 μm, délka 15 60m. Pro většinu aplikací postačuje délka kapiláry 30 m. Uţší kolony nemohou být tak dlouhé, protoţe by byl prodlouţen čas separace. Obecně tedy platí, ţe roste li vnitřní průměr a tloušťka stacionární fáze, účinnost separace se sniţuje (Klouda P., 2003) Dávkovací zařízení by mělo umoţnit rychlé vpravení vzorku do kolony a dobrou reprodukovatelnost dávkování 0,1-0,5 μl vzorku. Běţně se uţívá injekčních mikrostříkaček, kterými se propíchne pryţové těsnění a vzorek se vpraví do vyhřátého prostoru dávkovacího zařízení. Teplota dávkovacího zařízení musí být o 50 C vyšší neţ je teplota varu nejvýše vroucí sloţky obsaţené ve vzorku. Zplyněný vzorek je pak nosným plynem unášen do kolony. Chromatografické kolony jsou s náplní, zhotovené z nerezové oceli nebo skla o průměru 3-8 mm a délce 1-5 m. Kolony bez náplní jsou kapilární o vnitřním průměru 0,05-0,15mm a dlouhé m, jejichţ vnitřní povrch je smočen zakotvenou fází. Plynová chromatografie na rozdělovacím principu se zakotvenou kapalnou stacionární fází (GLC) je v praxi více vyuţívána neţ s pevným sorbentem. Hlavní význam pro správnou funkci kolony má udrţování vhodné pracovní teploty thermostatem. Při izothermické plynové chromatografii se po celou dobu chromatografie udrţuje konstantní teplota, která se volí v souladu s teplotami varu sloţek. Při dělení sloţek s velmi rozdílnou těkavostí je vhodnější teplotu postupně programově zvyšovat. (Štulík a kol., 2003). 7.3 Detektor Detektor převádí výsledky dělení v chromatografické koloně na registrovatelnou formu. Detektory jsou konstrukční částí měřících zařízení, hlavním poţadavkem je univerzálnost detekce pro všechny látky a vysoká citlivost. 36

36 Aby se zabránilo kondenzaci látek na stěnách detektoru, teplota detektoru by měla být vyšší neţ je teplota plynu vycházejících z kolony. V plynové chromatografii se uţívá několik typu detektoru (viz. Tab. 2): Tab 2: Výčet detektorů pouţívaných v analytické metodě plynové chromatografie, k udává hodnotu kolizní energie (v ev) pro ionizační detektory nebo emisní vlnovou délku (v nm) pro emisní detektory (Štulík a kol., 2003) Tepelně vodivostní detektor (Thermal Conductivity Detector - TCD) měří změny tepelné vodivosti mobilní fáze, které jsou způsobené přítomností eluované látky. Průchod látky detektorem se projeví změnou tepelné kapacity proudícího plynu a také změnou vodivosti odporového vlákna. V praxi se vedle sebe zapojují dva TCD detektory, do jedné z měrných cel se přivádí čistý nosný plyn, do druhé plyn vycházející z kolony. Tento typ detektoru je preferován pro svou univerzalitu a široké rozmezí linearity odezvy detektoru (Štulík a kol., 2003). 37

37 Detektor elektronového záchytu (ECD): Selektivní ionizační detektor je citlivý na elektronegativní atomy, a to zejména na halogeny. Nosný plyn (dusík) je vlivem záření v detektoru ionizován, a tím vzniká konstantní proud. Atomy halogenu (elektronegativní atomy) zachytávají pomalé elektrony, čímţ dochází ke sníţení ionizačního proudu. Hmotnostně spektrometrický detektor (MS): Umoţňuje detekci přítomnosti analytu, ale také jeho identifikaci na základě hmotnostního spektra (Poole C., Poole S., 1995, Fowlis I. and coll., 1995). Signál z detektoru je po příslušném zesílení registrován zapisovačem. Tím získáme chromatografický záznam, (chromatogram ve formě píků pro kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení analýzy). Zařízení pro plynovou chromatografii se skládá z následujících nejdůleţitějších částí: 1. Regulace tlaku nosného plynu 2. Regulace průtoku nosného plynu 3. Dávkovač s vyhříváním 4. Chromatografická kolona 5. Detektor s vyhříváním 6. Termostat 7. Zesilovač signálu detektoru 8. a 9. Integrátor a zapisovač (datastanice) 38

38 Obr. 11: Zjednodušené schéma plynového chromatografu (Klouda P., 2003) 7.4 Vyuţití plynové chromatografie Plynová chromatografie se uplatňuje při dělení, identifikaci a stanovení všech látek, které lze převést bez rozkladu v plynnou fázi do teploty 400 C. Je tedy moţné analyzovat látky plynné a zplynitelné látky kapalné a pevné o relativní molekulové hmotnosti do 400. U málo těkavých látek se vyuţívá tzv. derivatizace před plynovou chromatografií tj. převedení sloţek na těkavé deriváty (Fowlis I. and coll., 1995). Plynová chromatografie, je velmi citlivá a účinná separační metoda pracující s malým mnoţstvím vzorku, nachází velmi široké uplatnění jak ve výzkumných tak i provozních laboratořích v nejrůznějších odvětví chemického, potravinářského průmyslu, elektroprůmyslu a v neposlední řadě ve zdravotnictví a ve farmaceutickém průmyslu. Ve farmacii slouţí k rychlé a jednoduché identifikaci, kontrole čistoty, stanovení obsahu např. éterických olejů, monitorování obsahu léčiv, při analýzách stopových mnoţství halogenu obsahujících látek jako např. reziduí pesticidů (DDT, PCB, dioxin) v potravinách, půdě, vodě, biologickém materiálu (Poole C., Poole S., 1995). 39

39 8 EXTRAKČNÍ TECHNIKY Tato metoda je zaloţena na dělení sloţky mezi dvě fáze, a to: pevnou a kapalnou dvě kapalné (kapaliny jsou prakticky nemísitelné). Část sloţky (obvykle organická fáze), která přejde do druhé, je označena jako extrakt. Část sloţky, která setrvá v první, obvykle vodné fázi se nazývá rafinát. Důleţitým parametrem je rozpustnost látek ve fázích. Hlavní jsou interakce mezi solutem a solventem (Kortison G., Freiser H., 1962, Braithwaite A. and coll., 1996). Při rozpouštění se uplatňují tyto následující typy interakcí: 1) Disperzní interakce - jsou velmi slabé, uplatňují se při rozpouštění nepolárních látek v nepolárních kapalinách. Jejich zdrojem je rychlá změna okamţitých dipólů, které vznikají při pohybu elektronů v kterékoli molekule. 2) Dipól dipól interakce - jsou silnější a uplatňují se mezi molekulami s permanentním dipólem (voda). Tato interakce vede k určité vzájemné orientaci molekul solventu a solut musí tyto síly překonat. 3) Indukční interakce - uplatňují se mezi nepolárními molekulami s π elektrony a také molekulami nesoucími permanentní dipól. Důsledkem je solvatace, např. hydratace. 4) Vodíkové můstky - jsou příkladem relativně velmi silné interakce. Rozlišujeme intramolekulární a intermolekulární vodíkové můstky. 40

40 8.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny Částice, která má přejít přes fázové rozhraní z vodné do organické fáze, musí být elektroneutrální. Tato podmínka platí odlišným postupem pro organické a anorganické látky. Extrakce organických látek Pokud sloţka není protolyt a nedochází li k sekundárním rovnováhám, splňuje podmínku elektroneutrality. Pro dosaţení dobrého výtěţku extrakce je důleţité najít rozpouštědlo, ve kterém se daná látka snadno rozpouští a zároveň je rozpouštědlo téměř nemísitelné s vodnou fází. Na základě srovnání rozpustnosti látky v obou fázích, se provede odhad distribuční konstanty. Situace je sloţitější pokud dochází k sekundárním rovnováhám a můţe dojít např. k disociaci ve vodné fázi nebo polymeraci v organické fázi (Kortison G., Freiser H., 1962). Extrakce anorganických látek Anorganické látky jsou obvykle iontové povahy. Pro převedení přes fázové rozhraní do organické fáze je potřeba odstranit náboj. Odstranění náboje je umoţněno tvorbou elektroneutrálního chelátu nebo iontového asociátu Provedení extrakce 1) Jednorázová extrakce statická, v děličce Extrakce je vhodná v případě vysoké hodnoty rozdělovacího poměru a také případně separačního poměru (Klouda P., 2003, Kortison G., Freiser H., 1962). 2) Opakovaná extrakce - diskontinuální nebo kontinuální. Sloţky, které mají nízkou hodnotu rozdělovacích poměrů, je obtíţné převést do organické fáze i při vysoké hodnotě separačního poměru (vzrostly by nároky na mnoţství organického solventu). Sloţky, které mají nízkou hodnotu separačního poměru nelze dělit pomocí jednorázové extrakce. K dosaţení separace je nutné pouţít protiproudnou extrakci, ve které se pohybuje pouze organická fáze nebo i vodná fáze proti sobě (Klouda P., 2003). 41

41 8.2 Extrakce pevná látka kapalina Tato extrakce se často pouţívá pro izolaci jedné nebo více sloţek z přírodního materiálu nebo z technických produktů. Aby se maximalizoval výtěţek, extrahuje se v přístroji s kontinuálním chodem. Materiál, který je extrahován je obvykle desintegrován. Rozpouštědlo má selektivně rozpouštět získanou sloţku. Aby se destilací dala izolovat zvolená sloţka, je výhodné pouţít rozpouštědlo s nízkým bodem varu (Klouda P., 2003, Kortison G., Freiser H., 1962). 9 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE SFE (SUPERCRITICAL FLUID EXTRACTION SFE) Při zahřívání a stlačování kapaliny nebo plynu nad jejich kritické hodnoty (kritickou teplotu a tlak), vede ke vzniku superkritické tekutiny, tekutiny v nadkritickém stavu. Přechod z kapalné/ plynné formy je plynulý, bez prudkých fázových změn. V závislosti na teplotě a tlaku má superkritická tekutina vlastnosti podobné kapalině nebo plynu. Nejdůleţitějšími vlastnostmi jsou hustota, viskozita a difuzivita. Nejběţnější mobilní fází v SFC je CO 2. Superkritická fluidní chromatografie umoţňuje dělení látek, které mají nízkou těkavost nebo jsou termostabilní, tj. nevhodné pro GC (Braithwaite A. and coll., 1996). Hustoty superkritických tekutin mají hodnoty mezi hodnotami typickými pro kapaliny a plyny, ale jsou bliţší kapalinám. V důsledku této skutečnosti mají superkritické tekutiny daleko vyšší rozpouštěcí schopnost neţ plyny a mohou být vhodně uţity pro separace netěkavých vysokomolekulárních látek nevhodných pro GC. Rozpouštěcí schopnost je přímo úměrná hustotě při dané teplotě. Změnou hustoty lze ovlivňovat rozpouštěcí schopnost. Viskozita superkritické tekutiny je mezi kapalinou a plynem, spíše blíţe k plynu. Lze uţít dlouhé kolony ve srovnání s LC (tlakový spád je menší), (Braithwaite A. and coll., 1996). 42

42 9.1 Výběr podmínek pro SFC Vliv hustoty je nejdůleţitější parametr pro optimalizaci SFC. Velmi často se pouţívá programování hustoty pro SFC separace. Separační účinnost je závislá na hustotě, coţ je důsledek změn difuzního koeficientu. Můţeme pracovat při vysokých lineárních rychlostech s vysokou účinností, pokud jsou hustoty nízké. Vliv tlaku - tlak a hustota jsou ve vzájemném sloţitém vztahu závislém na teplotě. V oblasti kritické teploty a tlaku malá změna tlaku vyvolá velký posun hustoty. Lineární změna hustoty poţaduje nelineární programování tlaku. Pokud jsou teploty významně vyšší neţ kritická teplota, můţe mít zvýšení tlaku podobný vliv na separaci jako zvýšení hustoty (Poole C., Poole S., 1995, Braithwaite A. and coll., 1996). 9.2 Oxid uhličitý Výhody jsou relativně nízká hodnota kritické teploty a součastně poměrně vysoký kritický tlak a hustota. Oxid uhličitý je nejedovatý, nehořlavý a neexplozivní. Více neţ 90% všech separací SFC je prováděno v oxidu uhličitém. Nevýhody - polarita CO 2 je nízká, coţ můţe být nevýhodou pro některé aplikace. Jenom látky středně polární mohou být separovány pomocí CO 2, proto je k oxidu uhličitému někdy přidáván polární modifikátor (např. isopropanol, methanol, dioxin) pro zvýšení polarity. Superkritický amoniak je také moţným alternativním řešením (Poole C., Poole S., 1995). 9.3 Srovnání SFE s GC a HPLC Výhody SFE ve srovnání s GC: Niţší teplota během separace, obvykle kolem C, umoţňuje dělení termolabilních látek. Moţnost separovat látky netěkavé, analysy jsou rozpuštěny v superkritické tekutině, nemusí být odpařeny, je tak dosahováno dělení oligomerů. Výhody SFE ve srovnání s HPLC Molekuly, které nemají chromofor mohou být detekovány pomocí FID nebo IR. 43

43 Vzhledem k výhodnějšímu difuznímu koeficientu v superkritické tekutině jsou separace rychlejší. Obr. 12: Helix SFE systém (Anonym 6) 10 MIKROVLNNÁ EXTRAKCE Mikrovlnnou extrakcí (Microwave-Assisted Extraction-MAE) se dosáhne významné redukce doby extrakce (obvykle méně neţ 30 minut). Další výhodnou je vedle zkrácení doby extrakce také malé mnoţství organického rozpouštědla (30-50 ml). K dosaţení vysoké extrakční účinnosti MAE je podmíněno optimalizací následujících parametrů: výkon aplikovaného záření, povaha a objem solventu, teplota, doba ozáření a typ matrice (Flotron V. and coll., 2003). Mikrovlnná extrakce našla uplatnění především v oblasti enviromentální chemie, ale byla také úspěšně pouţita pro stanovení biologicky aktivních látek Vlnovým délkám v rozmezí 1m 1 mm odpovídají mikrovlny, které spadají do frekvenčního pásma asi 300 MHz 300 GHz. Celosvětově se nejvíce vyuţívá frekvence okolo 2450 MHz (vlnová délka λ = 12,24 cm). U dielektrického ohřevu dochází k přeměně energie střídavého elektrického pole o velmi vysoké frekvenci na tepelnou energii. Dipóly molekul se nepřetrţitě natáčejí dle okamţitého směru elektromagnetického pole a mění tak svoji orientaci aţ několik miliardkrát za sekundu. Vyuţívá se přitom dvou procesů, jednak mezimolekulárního tření a hystereze, která vzniká mezi působícím polem a indukovanou elektrickou odezvou vlivem setrvačnosti, 44

44 která závisí na elektrickém náboji, hmotě a tvaru molekul. Díky těmto jevům je ohřev produktu velmi rychlý a probíhá v celém objemu, ve kterém působí elektromagnetické pole na polární materiál. Mikrovlnná extrakce můţe být prováděna v otevřených nádobách nebo uzavřených celách (Sporring S. and coll., 2005, Martens D. and coll., 2002) 1. Uzavřené systémy (pressurized MAE) solvent můţe být zahříván na vyšší teplotu neţ je jeho bod varu za atmosférického tlaku, to vede ke zvýšení rychlosti a účinnosti extrakce. Obr.13: Integrovaný mikrovlnný extraktor Milestone (Anonym 7) 45

45 Otevřené systémy (atmospheric MAE) extrakce je prováděna za normálního tlaku (maximální dosaţitelná teplota je dána bodem varu rozpouštědla). Vyuţívá se zde fokusovaného záření, proto je zahřívání vzorků homogenní a velmi efektivní (Martens D. and coll., 2002, Shu Y. and coll., 2003, Hennion M. and coll., 2003) 11 SOXHLETOVA EXTRAKCE Principem při extrakci je získání jedné nebo více látek ze směsi, velmi často jde o izolace z pevných látek. Extrakce na soxhletově přístroji je poměrně dokonalá a také pohodlná metoda. Aparatura je sloţena z baňky, soxhletova přístroje a chladiče. U plně automatizovaných extraktorů je doba extrakce 2-4 hodiny a spotřeba rozpouštědel ml (Morrison G. and coll., 1962, Štulík a kol.,2003). Typy Soxhletova extraktoru jsou: Soxtec metoda je jednodušší, výsledky jsou blízké nebo vyšší ve srovnání se Soxhletovou extrakcí. Celková doba extrakce se pohybuje okolo 3 hodin (1-2 hodiny pro extrakci horkým a 1 hodina pro extrakci chladným rozpouštědlem). Soxterm šestimístný automatický systém s externím mikroprocesorovým ovladačem teploty. Teplota je ovládána ve dvou rozsazích do 200 C nebo do 300 C. Práce je asi pětkrát rychlejší neţ u klasické extrakce. Díky přístroji Soxterm lze snadno stanovit tuky a také vysokou uţitnou hodnotu ve zbytkové analýze pesticidů, PCB a PAU. 46

46 Büchi přístroj pracuje na podobném principu jako Soxtec a vyuţívá se pro extrakci horkým rozpouštědlem Obr.15: Soxhletův extraktor (Anonym 8) 12 EXTRAKCE URYCHLENÝM TOKEM ROZPOUŠTĚDLA Extrakce urychleným tokem rozpouštědla (Accelerated Solvent Extraction ASE nebo také Pressurized Liquid Extraction PLE) je nová technika, jejíţ pouţití je především v oblasti enviromentální chemie. Jedná se o techniku extrakce v systému tuhá látka-kapalina prováděný po krátký časový interval (5-15 minut) za zvýšené teploty ( C) a zvýšeného tlaku (10-15MPa). Zvýšený tlak je při ASE nezbytný, aby rozpouštědlo zůstalo i při vysoké teplotě v kapalném stavu. Tímto způsobem je umoţněna extrakce rozpouštědlem za teplot vyšších neţ bod varu rozpouštědla. Extrakce urychleným tokem rozpouštědla se provádí v extraktoru PSE v několika následujících krocích. 47

47 Pevný vzorek je aplikován do nerez extrakční cely a extrahován organickým rozpouštědlem. Následně je extrakt vytlačen do sběrné nádoby pomocí stlačeného plynu, nejčastěji dusíku. Extrakční teplota je významným faktorem pro rychlou extrakci analytu z pevné matrice a vede k významnému zlepšení rozpouštěcí kapacity rozpouštědla vůči analytům, sníţením viskozity rozpouštědla, zvýšení rychlosti difúze, rychlejší přechod přes fázové rozhraní způsobený rozrušením pevných interakcí mezi matricí a analytem a sníţení povrchového napětí analytu, rozpouštědla a matrice. Extrakce urychleným tokem rozpouštědla umoţňuje extrakci mnoha různých vzorků, jako je např. extrakce tuků z masa, olejnatých semen, krmiv, mlékárenských produktů, drobného pečiva a mnoha jiných potravinářských produktů (Miege C. and coll., 2003, Helaleh M. and coll., 2005, Gfrerer M. and coll., 2005, Štulík a kol., 2003). Obr.16: Extraktor ASE 300 (Anonym 9) 48