Biochemie krevních elementů II leukocyty a trombocyty, koagulace. Josef Fontana

Transkript

1 Biochemie krevních elementů II leukocyty a trombocyty, koagulace Josef Fontana

2 Obsah přednášky 1) Biochemie trombocytů a koagulace definice základních pojmů trombocyty přehled koagulačních faktorů tvorba trombu antikoagulační mechanismy fibrinolýza koagulační testy 2) Biochemie leukocytů (využití glukózy, tvorba reaktivních forem kyslíku a dusíku, proteolytické enzymy)

3 Hemostáza Fluidita (tekutost) krve a neporušený (a nesmáčivý) povrch endotelií jsou předpoklady plynulé cirkulace Poškození integrity cévního systému nastartuje hemostázu - zástavu krvácení Negativní efekt hemostázy: 1) na povrchu ateromových plátů se mohou tvořit krevní sraženiny tromby infarkt 2) dysbalance hemostázy u sepse, nádorů

4 Hemostáza x hemokoagulace Hemostáza je širší pojem zahrnuje všechny fáze zástavy krvácení: 1) reflexní vazokonstrikce 2) aktivace a agregace destiček tvorba primární zátky (překrytí rány) 3) vlastní hemokoagulace vytvoření fibrinové sítě (fixace krytí rány obvazem) 4) trombolýza (odstranění obvazu)

5 Hemostáza x hemokoagulace Hemokoagulace (srážení krve) je proces přeměny rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin Katalyzuje trombin Kaskáda koagulačních faktorů Vzájemná aktivace faktorů parciální proteolýzou

6 Destičky - trombocyty Bezjaderné fragmenty megakaryocytů x 103 / µl Centrální zona s granuly granulomera a periferní světlejší hyalomera Hyalomera: invaginace membrány tvoří systém kanálků význam pro sekreci (obsahuje enzymy pro tvorbu eikosanoidů)

7 Destičky - trombocyty 3 typy granul: δ densní tělíska ATP, ADP, Ca2+ a serotonin α fibrinogen, PDGF, FGF, vwf, destičkový faktor 4 (fosfolipidy) λ lyzosomy Obsažené látky se uplatní při vazokonstrikci v místě poranění, hemokoagulaci a následné reparaci

8 Metabolismus trombocytů Bezjaderné žádná proteosyntéza Organely (MIT, GA) - intenzivní metabolismus Zdroj energie je glukóza - aerobní glykolýza Cytoplazma obsahuje mikrotubuly, aktin a myosin kontrakce destiček uvolnění obsahu granul, retrakce trombu Fosfolipidy nezbytné pro aktivaci některých koagulačních faktorů

9 Trombocyty a hemostáza Zodpovídají za primární hemostázu 1) Adheze: vazba na poraněním obnažený subendoteliální kolagen von Willebrandův faktor (vwf) váže kolagen a GP Ib (na destičkách) aktivace

10 Trombocyty a hemostáza 2) Aktivace destičky aktivuje obnažený kolagen, trombin, ADP, PAF, TXA2 exprese receptorů GP IIb/IIIa (až na jednom trombocytu) sekrece aktivních látek - TXA2 změna tvaru (kontraktilní bílkoviny a cytoskelet) z diskovitého na ameboidní agregace

11 klidový stav aktivace

12 Trombocyty a hemostáza 3) Agregace destiček vlivem trombinu a dalších látek propojení díky fibrinogenu (aktivace destiček vede k expresi receptorů GP IIb/IIIa) 3a) Primární (reverzibilní) agregace nutná pro stále se tvořící skuliny v endotelu a zacelování malých defektů 3b) Sekundární (irreverzibilní) agregace je spojena s uvolňovací reakcí degranulací

13 Trombocyty a hemostáza 4) Degranulace - uvolňovací reakce sekrece obsahu granul 5) Tvorba bílého (destičkového) trombu (provizorní hemostatická zátka) rozpad a splynutí destiček viskózní metamorfóza 6) Propojení s koagulací exprese destičkových fosfolipidů (DF 3) na povrchu 7) Hojení poranění látky s proliferativními účinky PDGF (Platelet Derived Growth Factor)

14 Trombocyty a hemostáza Obrázek převzat z:

15 Starý a nový model koagulace Starý model - porozumění in vitro měření kaskádovitá aktivace koagulačních faktorů vnitřní a vnější cesta, společná část zdůrazňuje význam vnitřního systému Nový (revidovaný) model - platí in vivo vychází ze starého modelu 3 fáze: iniciace, amplifikace a propagace klíčová role vnějšího systému a trombinu

16 Koagulační faktory Označované římskými číslicemi 1) serinové proteázy 2) bílkoviny sloužící jako kofaktory 3) Ca 2+ 4) fibrinogen 5) transglutamináza f. XIII

17 Koagulační faktory I fibrinogen VIII antihemofilický II protrombin*1) IX Christmasův*1) III tkáňový tromboplastin X Stuart-Prowerové*1) IV vápenaté ionty XI PTA1) V proakcelerin XII Hagemanův1) VII prokonvertin*1) XIII fibrin stabilizující * vitamin K dependentní faktory 1) proteázový zymogen

18 Vitamin K dependentní faktory Faktory II, VII, IX a X a antikoagulační faktory protein C a S Tvorba v játrech (neaktivní zymogeny) Karboxylace zbytků kyseliny glutamové na γ-uhlíku vzniká γkarboxyglutamát (Gla) Gla váže Ca2+ - připoutání faktorů k fosfolipidům membrány

19

20 Hemokoagulace má 2 fáze 1) Aktivace protrombinu na trombin a) vnitřní cestou b) zevní cestou Obě cesty se spojují v místě faktoru X 2) Společná fáze tvorba nerozpustného fibrinu a jeho stabilizace

21 The in vitro contact system (intrinsic pathway) The in vivo pathway (extrinsic pathway) Contact Tissue damage (e.g. with endoth) Tissue factor VIIa PL Ca2+ XIIa XIa IXa XI Platelets IX VIIIa, PL, Ca2+ X + + Xa Va, PL, Ca2+ II (Prothrombin XII + XIII Ca2+ IIa (Thrombin) XIIIa Fibrinogen Fibrin Stabilised fibrin

22 Zevní cesta (extrinsic pathway) Iniciována vyplavením tkáňového tromboplastinu (f. III, tkáňový faktor) Směs proteinů a fosfolipidů uvolněných z poškozených buněk, popř. ho exprimují aktivované endotelie a leukocyty Rychlý nástup hemokoagulace - za 12 sekund po přidání in vitro Tkáňový faktor aktivuje faktor VII na VIIa

23 Zevní cesta (extrinsic pathway) TF-VIIa s fosfolipidy a Ca2+ tvoří vnější tenázu aktivace f. X na Xa VIIa aktivuje i faktor IX z vnitřní cesty Zevní cesta je důležitá pro začátek krevního srážení Pro amplifikaci hemokoagulace je důležitá vnitřní cesta

24 Vnitřní cesta (intrinsic pathway) Zahájena kontaktní fází Negativně nabitý povrch poraněním obnažený kolagen a membrány trombocytů Vazba faktoru XII přeměna na XIIa XIIa přeměňuje prekalikrein na kalikrein (za přítomnosti vysokomolekulárního kininogenu HMWK) Kalikrein posiluje přeměnu f. XII na XIIa pozitivní zpětná vazba!

25 Vnitřní cesta (intrinsic pathway) XIIa aktivuje faktor XI XIa aktivuje faktor IX Faktor IX je aktivován i zevním systémem IXa je součástí vnitřního tenasového komplexu

26 Vnitřní tenasový komplex 1) substrát f. X 2) enzym f. IXa 3) kofaktory enzymu VIIIa, destičkové fosfolipidy a Ca2+ Faktor VIII se aktivuje trombinem Produktem tenasového komplexu je Xa Xa se stává součástí analogického protrombinasového komplexu

27 Protrombinasový komplex 1) substrát protrombin (f. II) 2) enzym f. Xa 3) kofaktory enzymu Va, destičkové fosfolipidy a Ca2+ Faktor V opět aktivován trombinem Produktem protrombinasového komplexu je trombin

28 Trombin Centrální postavení v celé hemostáze koagulaci, antikoagulaci, regulaci fibrinolýzy i aktivaci celulárních složek Štěpí fibrinogen na fibrin

29 Trombin aktivuje Destičky a endotelie Neutrofily i monocyty exprese TF Faktor XIII stabilizace fibrinové sítě Faktory V, VIII a XI amplifikace koagulace Protein C (předtím nutná vazba trombin trombomodulin) antikoagulace TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) (předtím nutná vazba trombin trombomodulin) inhibice fibrinolýzy

30 Jak je to ve skutečnosti Třífázový model hemokoagulace: Iniciace Amplifikace Propagace

31 Iniciace Koagulaci startuje tkáňový faktor (TF) a VIIa Malé množství VIIa stále přítomno v krvi setkání s TF (uvolněn při poranění, zánětu) VIIa autoaktivuje další molekuly f. VII Komplex TF-VIIa aktivuje f. IX a f. X Xa aktivuje další molekuly f. VII a generuje vznik malého množství trombinu nestačí k tvorbě fibrinového koagula přebírá ale vedení koagulace fáze amplifikace

32

33 Amplifikace Trombin aktivuje f. V, VIII, XI XIa aktivuje další molekuly f. IX IXa Trombin aktivuje trombocyty a leukocyty exprese negativně nabitých fosfolipidů na povrchu vazba IXa, VIIIa a Va Trombin aktivuje endotelie přeladění do prokoagulačního stavu

34

35 Amplifikace - výsledek vznik většího množství trombinu vytvoření reakčních povrchů s navázanými molekulami aktivovaných faktorů pro komplementaci komplexů vnitřní tenázy a protrombinázy

36 Propagace Vazba f. X na komplex vnitřní tenázy (IXa a VIIIa) Xa Xa vytvoří s Va komplex protrombinázy mohutná produkce trombinu trombin burst dostačuje k přeměně fibrinogenu na fibrin Nestabilní fibrin je stabilizován působením XIIIa

37

38 Fibrinogen Složen ze 3 globulárních domén (2 periferní - D a jedna centrální - E) Domény vzájemné spojeny 2 tyčinkami trojitými šroubovicemi (α, β, γ) 2 peptidové ocásky na centrální doméně fibrinopeptidy A a B (z α, β šroubovice) Trombin odštěpuje oba fibrinopeptidy vzniká fibrin-monomer spontánní polymerace fibrin-polymer

39

40

41 Zpevnění fibrinové sítě Nezpevněná síť není odolná pouze nekovalentní vazby riziko depolymerace Faktor XIII aktivován trombinem a Ca2+ XIIIa je transglutamináza - tvorba kovalentní příčné vazby mezi α a γ řetězci fibrinu Amidový zbytek glutaminu reaguje s NH2skupinou lysinu tvorba γ-glutamyl-ε-lysyl můstku a uvolnění amoniaku Zpevněná síť snese tlak krve

42 Zpevnění fibrinové sítě Obrázek převzat z

43 Koagulace je složitě regulována Rovnováha prokoagulačních a antikoagulačních dějů Hlavní antikoagulační faktory: 1) proud krve 2) produkty intaktního endotelu prostacyklin, NO a trombomodulin 3) antitrombin III 4) Protein C a protein S

44 Antithrombin III (AT III) α2-globulin, nejdůležitější inhibitor Patří mezi serpiny: inhibitory serinových proteáz Váže trombin, IXa, Xa, XIa a XIIa inaktivace faktorů Heparin (sulfatovaný glykosaminoglykan) zvyšuje schopnost AT III vázat faktory Vrozený deficit AT III trombofilní stav

45 Protein C a protein S Závislé na vitaminu K Protein S je kofaktorem proteinu C Protein C je aktivován komplexem endoteliálního trombomodulinu s trombinem aktivní protein C (APC) Po vazbě na fosfolipidy štěpí APC neenzymatické faktory Va a VIIIa Bez Va a VIIIa jsou nefunkční komplexy vnitřní tenasový i protrombinasový

46 Leidenská mutace faktoru V Mutací mizí jedno z důležitých štěpných míst pro APC Prodloužení poločasu Va Nejčastější vrozený trombofilní stav Pozor na kombinaci s dalšími prokoagulačními faktory hormonální antikoncepce, kouření

47 Antikoagulační látky v medicíně 1) Vyvázání Ca2+ - užití jen in vitro, odběr nesrážlivé krve citrát, EDTA (kys. Ethylendiaminotetraoctová) nebo oxalát 2) Heparin posiluje AT III vyvazuje trombin 3) Analoga vitaminu K - kumarinové preparáty (warfarin, pelentan) blok posttranslačních úprav závislých na vitaminu K (f. II, VII, IX, X, proteiny C a S)

48 Vrozené defekty koagulace Hemofilie A: XR, defektní syntéza f. VIII Podávání rekombinantního f. VIII Panovnické rody (potomci královny Viktorie, Romanovci) Hemofilie B: XR, defekt f. IX Hemofilie C: AR, nedostatek f. XI von Willebrandova nemoc: defekt vwf Nedostatečná adheze destiček a porucha funkce f. VIII

49 Fibrinolýza (trombolýza) Koagulum musí mít jen omezenou životnost Plasmin štěpí fibrin na rozpustné fibrin degradační produkty (Ddimery) Serinová proteáza specifická pro fibrin a fibrinogen Vzniká z plasminogenu

50 Fibrin degradační produkty (Ddimery)

51 Obrázek převzat z:

52 Měření hemokoagulace Vnitřní cesta: aptt (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) norma 26-50s Vnější cesta: 1) Quick test 14s = 100% 2) INR (International normalized ratio) = %

53 Leukocyty Granulocyty: neutrofily, eozinofily, bazofily Agranulocyty: monocyty makrofágy, lymfocyty (B, T) 4-9 x 103 / μl Leukocyty % Neutrofily 1-4 % Eozinofily 0-1 % Bazofily % Lymfocyty 2-11 % Monocyty

54 Reaktivní formy kyslíku (ROS) a dusíku (RNS) v krvinkách Erytrocyty: enzymy zajišťující deaktivaci ROS, vznikajících díky vysoké intracelulární koncentraci kyslíku Fagocyty: enzymy zajišťující produkci ROS a RNS, určených k ničení fagocytovaných částic

55 Neutrofily Vysoký obsah lyzosomů (hydrolázy) Málo mitochondrií Závislé na glukóze: produkce NADPH NADPH slouží k produkci reaktivních forem kyslíku zabíjení bakterií Po aktivaci: respirační vzplanutí zvýšená spotřeba O2 a glukózy

56 Produkce ROS v neutrofilech ClOObrázek převzat z (březen 2007)

57 Produkce NO v neutrofilech syntáza oxidu dusnatého NOS i Obrázek převzat z (březen 2007)

58 Proteázy a antiproteázy Proteolytické enzymy: elastáza, kolagenáza, katepsin G produkované fagocyty Inhibitory proteáz: α1-antitrypsin, α1antichymotrypsin, α2-makroglobulin plazmatické proteiny Poměr proteázy / antiproteázy má vliv na míru zánětu

59 Basofily obsahují heparin a histamin Negativně nabité funkční skupiny kyselý charakter Obrázky převzaty z a (březen 2007)