Koagulace a fibrinolysa

Transkript

1 [ Vítejte ] [ Učitelé a zaměstnanci ] [ Výuka ] [ Výzkum ] Koagulace a fibrinolysa Zabezpečení organismu proti ztrátě krve je organizováno na několika strukturních úrovních.. Prvním krokem je změna tekutosti krve, kdy se tekutá krevní plasma přemění na rosolovitou hmotu, která pomáhá ucpat vzniklou netěsnost potrubí. Řešení tohoto problému je zajímavé i z inženýrského hlediska. Připadá nám logické, že se ke změně tekutosti využije polymerace jedné ze složek plasmy, ale poněkud překvapivé je, že tato polymerace je iniciována proteolysou. Celý proces vytváření krevní sraženiny, koagulace, představuje soubor navzájem propojených a regulovaných proteolytických reakcí. Koagulace je komplexní pochod, na němž se podílejí kromě proteinů plasmy také v podstatě všechny krevní buňky i různé typy buněk tvořících poškozenou cévu. Z metabolického hlediska je koagulace zajímavá výskytem transcelulárního metabolismu. Většina biochemických drah, jako např. glykolysa, probíhá uvnitř jedné buňky od začátku do konce. Naproti tomu, při transcelulárním metabolismu je jedna biochemická dráha rozdělena mezi různé typy buněk, které si předávají intermediáty, takže konečný produkt vznikne třeba až po projití čtyřmi druhy buněk. Konkrétní příklady budou ukázány dále. Klíčovou molekulou, která umožňuje změnu fluidity krve, je fibrinogen. Normální koncentrace fibrinogenu v plasmě se pohybuje okolo 3 g/l, což samo o sobě dokládá jeho důležitost. Je to rozpustný glykoprotein (M r = ), sestávající ze tří párů polypeptidů. Jeho sumární vzorec můžeme schematicky napsat jako (Aα, Bβ, γ) 2, kde A a B reprezentují peptidy, které jsou odštěpeny při proteolytické aktivaci thrombinem. Tvar molekuly je protáhlý, s centrální globulární oblastí, z níž na každou stranu vybíhají dvě ramena, která jsou na koncích rozšířena. Geometrie molekuly fibrinogenu má esenciální význam pro vznik koagula. Pospojováním jednotlivých molekul fibrinogenu vznikne dvourozměrná síť. Mechanismus jejího vzniku si objasníme na jednoduchém názorném modelu. Obr. 1 nahoře ukazuje v řezu hypotetickou molekulu fibrinogenu, na níž jsou vyznačeny fibrinopeptidy A a B, které jsou odštěpeny při napadení fibrinogenu thrombinem. Jakmile se tak stane, proběhne velmi rychle (řádově v ns) změna konformace fibrinogenu, která vytvoří geometrické předpoklady pro jeho polymeraci. Jelikož je velmi obtížné, ne-li nemožné, zjistit exaktně tvar molekuly při tak rychlých změnách konformace, zvolil jsem schematický obraz netopýra, neboť ten se nám k danému účelu hodí nejvíce. Po odštěpení fibrinopeptidů A a B vzniknou dvě vazebná místa označená a a b (spodní část Obr. 1), která tvoří základ pro polymeraci fibrinogenu. Sestavení takto upravených molekul fibrinogenu do dvourozměrné sítě ukazuje Obr. 2.

2 Celý proces je samozřejmě mnohem složitější a probíhá ve více krocích. Další zpřesnění je schematicky znázorněno na Obr. 3. Zde je rovněž zdůrazněna centrální úloha thrombinu v tomto procesu. V prvním kroku se odštěpí fibrinopeptid A (FPA) a fibrinogen se přemění na tzv. fibrin I monomer. Ten polymeruje za vzniku fibrin I polymeru. Na něj opět působí thrombin a odštěpí fibrinopeptid B (FPB), čímž vznikne fibrin II. Thrombin paralelně aktivuje tzv. faktor XIII (F XIII), který ve své aktivní formě F XIII a propojí molekuly fibrinogenu kovalentní vazbou za vzniku zesíťovaného fibrinu (sešitá křídla netopýrů na Obr. 2). Faktor XIII a je enzym transglutaminasa, který katalyzuje reakci mezi koncovými zbytky lysinu a glutaminu. Přitom dojde k odštěpení amonného iontu a vznikne vazba podobná vazbě peptidové (isopeptidová vazba): Aktivním činitelem vyvolávajícím všechny popsané změny fibrinogenu je thrombin. Je to serinová proteinasa, která se nemůže za normálních okolností vyskytovat v plasmě ze zřejmých důvodů v aktivní formě. Na druhé straně musí být přítomna jako prekursor, aby v případě potřeby mohla být koagulace okamžitě iniciována. Tímto prekursorem je prothrombin - jednořetězcový glykoprotein o M r = Schéma uspořádání prothrombinu a mechanismus vzniku thrombinu je na Obr. 4.

3 Molekula prothrombinu je v zásadě tvořena dvěma částmi: první se nazývá fragment F 1+2, druhou část tvoří prethrombin. Účinkem další serinové proteinasy, faktorem X a, se molekula prothrombinu nejprve rozštěpí na rozhraní F 1+2 a prethrombinu, a potom se ještě rozštěpí prethrombin v oblasti propojené disulfidickou vazbou. Tak nám vznikne dvouřetězcová aktivní molekula thrombinu a F 1+2. Jak uvidíme dále, vzniklý thrombin je téměř okamžitě inaktivován, a proto nám cenný diagnostic ký nástroj poskytuje stanovení F 1+2. Jeho hladiny jsou zvýšeny při některých patologických stavech, jako je např. disseminovaná intravaskulární koagulace (DIC). Důležitou úlohu v molekule prothrombinu hraje první část fragmentu F 1+2, označená Gla. Tato zkratka znamená zvýšený výskyt g-karboxyglutamátu, který umožňuje vazbu vápenatých iontů. Zbytky Gla vznikají posttranslační karboxylací glutamátových zbytků za účasti vitaminu K: Vzniklá struktura se dvěma karboxyly představuje chelát pro vápenaté ionty a umožňuje potřebnou prostorovou organizaci i dalších koagulačních faktorů, jako jsou F II, F VII, F IX, F X, a proteinů C a S (viz dále). Viděli jsme, že výkonným prvkem při vzniku thrombinu je F X a. Ten se nachází na konci tzv. koagulační kaskády, sestávající z různých faktorů, která byla uspořádána do klasického schématu, kdy se dělí na dráhu vnitřní a vnější. Zde je užitečné si uvědomit historickou perspektivu. Teorie koagulace jako enzymatického děje byla formulována r v pracích Morawitze. Ve čtyřicátých letech se začaly objevovat jednotlivé koagulační faktory na základě studia pacientů, kterým příslušný faktor chyběl. Klasické schéma koagulační kaskády bylo navrženo v padesátých letech. Ještě na počátku osmdesátých let se pro účely laboratorních stanovení připravoval tzv. tkáňový thromboplastin (v současné době se označuje jako tkáňový faktor, TF) složitou preparací, která vyžadovala jako výchozí materiál mozek zdravého, asi čtyřicetiletého muže. Vyčerpání zdrojů v okolí velkých hematologických center podnítilo rozvoj genetického inženýrství, které poskytlo rekombinantní TF a tím nebezpečí selektivního vyhlazení mužů na čas oddálilo. V osmdesátých letech se také teprve došlo k pochopení, jak funguje koagulace in vivo. Tedy, biochemie koagulace je vcelku mladá věda. Přestože klasické schéma koagulace se svým rozdělením na vnitřní dráhu (spouštěnou vnějším podnětěm) a vnější dráhu (spouštěnou vnitrobuněčným proteinem) neodpovídá fysiologické skutečnosti, je to dobré schéma v tom smyslu, že nám umožní vysvětlit základní principy. Klasické schéma koagulačních kaskád je ukázáno na Obr. 5.

4 Všechny faktory, kromě F VIII, F V a TF, jsou zymogeny, které jsou ve své aktivní formě (značené indexem a) proteinasami. Kaskáda je uspořádána tak, že aktivní faktor z předcházejícího kroku proteolyticky aktivuje zymogen v následujícím kroku. Koagulační kaskáda přitom funguje na podobném principu jako fotonásobič: vstupní signál je v následujících stupních opakovaně zesilován. To umožňuje snížit koncentraci koagulačních faktorů v plasmě: tak zatímco výkonného činitele koagulace, fibrinogenu, je potřeba okolo 2 g/l, prvního členu koagulační kaskády, F XII, může být přítomno 70x méně. Tato skutečnost je mnohem důležitější, než se může na první pohled zdát. Jelikož rozpustnost proteinů ve vodě není neomezená (tj. rozpuštěné proteiny zabírají místo, takže za určité koncentrace se už další proteiny do roztoku nevejdou ), snížení koncentrace kterékoliv ze složek plasmy (při zachování funkce) poskytuje prostor pro další proteiny, které se mohou uplatnit jako regulační prvky, a tím zjemnit odpovědi celého koagulačního systému na měnící se vnější i vnitřní podmínky. To v konečných důsledcích umožňuje lepší přežití individua a přináší tak evoluční výhodu. Neenzymatické faktory V a VIII cirkulují v oběhu a jsou strukturně homologní (okolo 30% jejich sekvence je totožných) a liší se od intracelulárního TF, který je během aktivace zabudován v buněčné membráně. Po proteolytické aktivaci urychlují reakce proteinas, se kterými vytvářejí komplexy (F VIII a s F IX a, F V a s F X a ). Tkáňový faktor představuje vysoce afinitní membránový receptor pro F VII. Za normálních okolností je umístěn uvnitř buněk, jeho vystavení na povrchu buněčné membrány je iniciováno při poškození tkání. Důležitým principem uplatňujícím se při organizaci koagulační kaskády je pozitivní zpětná vazba. To znamená, že produkt reakce působí na svůj prekursor tak, že urychluje vlastní produkci. Tak F X a urychluje vznik F VII a a F VIII a, které urychlují jeho produkci. Podobně thrombin (F II a ) aktivuje oba akcelerační proteiny F V a F VIII. Tyto regulační smyčky explozivně urychlují vznik thrombinu. Jak se hromadila kasuistika hematologických pacientů, začínalo být zřejmé, že klasické schéma neodpovídá úplně realitě. Největší černý vtip spáchala příroda na panu Hagemanovi (kterému chyběl F XII a byl podle něj pojmenován), kterého nechala zemřít na plicní embolii a nikoli na vnitřní krvácení, jak by se slušelo. Někomu bylo také divné, že při virových infekcích, které masivně destruují naše buňky, neumíráme na nekontrolovanou koagulaci následkem uvolnění velkých množství tkáňového faktoru, ale na něco jiného. Velkým krokem vpřed bylo objevení inhibitoru koagulace asociovaného s lipoproteiny plasmy (lipoprotein-associated coagulation inhibitor - LACI). Obr. 6 nám schematicky ilustruje známé skutečnosti - F XII není pro koagulaci esenciální a máme v plasmě přítomný LACI.

5 Při poranění se v buněčné membráně vystaví TF, na který se okamžitě naváže F VII. (F VII se liší od ostatních koagulačních faktorů tím, že vykazuje aktivitu i bez předchozí proteolytické aktivace a v komplexu s TF může katalyzovat aktivaci F IX nebo F X. Proteolytická aktivace zvyšuje aktivitu F VII a jen stonásobně v porovnání s desetitisícinásobným zvýšením aktivity ostatních aktivovaných faktorů). Následuje aktivace F X a, zpětnovazebně vzniká F VII a a vtom se celá dráha zablokuje, neboť se okamžitě vytvoří kvarterní komplex LACI-TF-F VII a -F X a. Co zbývá, je komplex TF-F VII, který může aktivovat F IX. Odtud potom probíhá koagulace klasicky. Je také zřejmé, že dělení koagulace na vnější a vnitřní dráhu představuje laboratorní artefakt, a že fysiologická dráha kombinuje oba úseky do jednoho. Přítomnost LACI nás zřejmě chrání před embolií při virosách. Zbývá nám vyřešit úlohu F XII a F XI. Vzhledem k tomu, že se stále nacházejí v naší plasmě, nejsou tam asi zbytečně, byť jejich role při koagulaci není podstatná. Jisté vysvětlení nabízí schéma na Obr. 7. Odkrytí subendotheliálních vrstev při poranění aktivuje F XII. F XII a aktivuje F XI a štěpí prekalikrein na kalikrein. Následně F XI a a kalikrein štěpí kininogen o velké molekulové hmotnosti (high molecular weight kininogen - HMWK) na kininy, jako je např. bradykinin. To jsou vasoaktivní peptidy, které přispívají k hemostase vasokonstrikcí. Buňky v okolních tkáních pro ně mají receptory a odpovídají syntézou regulačních faktorů, jako jsou prostaglandiny a PAF (platelet-activating factor), ovlivňujících agregaci krevních destiček. Kalikrein kromě toho aktivuje ještě složku C5 komplementu (je zřejmé, že při poranění hrozí invaze mikroorganismů, a je proto vhodné učinit včasné kroky k aktivaci imunitního systému) a spouští fibrinolytické reakce. Vznik koagula je jen dočasné řešení problému netěsnosti a jeho včasné odstranění je stejně důležité jako jeho rychlý vznik. Z uvedeného schématu vyplývá, že úloha F XII je mnohem důležitější, než jak by vyplývalo z jeho role ve vnitřní dráze. F XII propojuje několik metabolických drah a integruje odpověď organismu na poranění. Při pokusech o rekonstrukci koagulační kaskády in vitro se zjistilo, že nezbytnou složku představují fosfolipidy. In vivo je poskytují membránové povrchy krevních buněk, zejména krevních destiček (thrombocytů). Na povrchu těchto membrán se vytvářejí struktury sestavené z jednotlivých faktorů. Obr. 8 představuje dva nejdůležitější komplexy:

6 Jak je patrné, oba komplexy jsou zakotveny v membráně prostřednictvím aktivovaných neproteinasových faktorů - F VIII a a F V a, což ukazuje na důležitost těchto faktorů pro průběh koagulační kaskády. Je vcelku zřejmé, že nedostatek F VIII (jako v případě hemofilie A) bude mít za následek závažnou poruchu koagulace. Z obrázku je patrná i úloha vápenatých iontů (znázorněné jako malé černé tečky) při koagulaci. Jejich kladný náboj se využívá k fixaci proteinových komplexů na povrchu membrány tvořeném záporně nabitými fosfátovými skupinami. Komplex vystavěný na F VIII a produkuje F X a, který přechází do komplexu založeném na F V a. Ten se podle své funkce nazývá prothrombinasový komplex a výsledkem jeho aktivity je thrombin. Zapojení pozitivních zpětných vazeb do regulace produkce thrombinu by dokázalo přeměnit veškerou krev ve sraženinu během velmi krátké doby. Proto musí být okamžitě aktivovány protisměrné regulační mechanismy, které udrží produkci thrombinu v požadovaných mezích a ve vhodném okamžiku ji zcela zastaví. K tomu je potřeba mít indikátor zvýšené produkce thrombinu. Nejúčinnějším způsobem bude zřejmě detekce samotného thrombinu. To dokážou okolní endotheliální buňky, které na přítomnost thrombinu reagují vystavením zvláštního proteinu, thrombomodulinu, na svém povrchu. Thrombomodulin funguje jako receptor thrombinu, který s ním vytváří komplex. Thrombin navázaný na thrombomodulin má změněnou substrátovou specificitu a začne modifikovat další plasmatický protein, označovaný jako protein C (viz schéma na Obr. 9). Takto aktivovaný protein C (APC) vytváří komplex s dalším plasmatickým proteinem, proteinem S, a tento komplex začne degradovat faktory V a a VIII a. Tím se rozpadnou oba membránové komplexy produkující thrombin a jeho produkce se zastaví. Z předešlého výkladu vyplývá, že nejdůležitějším regulačním prvkem určujícím hladinu thrombinu je sám thrombin: způsobuje akceleraci vlastní produkce aktivací faktorů VIII a

7 V. Současně, po vazbě na thrombomodulin, přispívá k zastavení vlastní produkce: Aktivita thrombinu je inhibována ještě speciálními inhibitory. Nejdůležitější je antithrombin III, který představuje 75% antithrombinové aktivity plasmy. Aktivita antithrombinu III je zesílena kyselými proteoglykany, jako je heparin, které se vážou na zvláštní kationtové místo v jeho molekule, čímž vyvolají konformační změnu, která usnadní jeho vazbu na prothrombin a další koagulační faktory. Tento pochod má uplatnění při terapeutickém využití heparinu k inhibici koagulace. Antikoagulační účinek heparinu může být zrušen aplikací kationtových polypetidů, jako je např. protamin, které s heparinem vytvářejí pevnější vazby, než je jeho vazba na antithrombin. Dalšími inhibitory thrombinu jsou obecné inhibitory proteinas v plasmě, jako jsou α 2 -makroglobulin a α 1 -antitrypsin. Thrombin má velmi význačné postavení v regulaci pochodů probíhajících v krvi a v cévách. Kromě své úlohy při koagulaci se účastní regulace celé řady biologických procesů. Jejich stručné shrnutí uvádí následující schéma: Na hemostase se podílí koagulační kaskáda spolu s krevními buňkami.největší úlohu zde mají krevní destičky. Mechanismus jejich účasti na vytvoření krevní zátky je znázorněn na Obr. 10.

8 Prvním krokem je adherence destiček na subendotheliální vrstvy odhalené při poranění. Prostřednictvím svého povrchového glykoproteinu GP1b se navážou na další protein plasmy, von Willebrandův faktor (vwf), který předtím adheroval v místě poranění. Za normálních okolností cirkuluje vwf v plasmě v komplexu s F VIII. Po proteolytické aktivaci F VIII thrombinem dojde k uvolnění F VIII a z komplexu a vwf se může navázat na obnaženou cévní stěnu. vwf se v plasmě vyskytuje jako multimer, jehož molekulová hmotnost může přesahovat 10 milionů. Dalšími substráty pro adherenci destiček jsou bazální membrána a vlákna kolagenu. Adherence spustí další fázi, uvolnění celé řady skladovaných látek. Za prvé je to ADP, které má několik funkcí. Jednak do místa adherence povolává další destičky, navozuje jejich aktivaci a v konečném důsledku jejich agregaci. Dále se uvolní do extracelulárního prostoru lysosomální enzymy, jako první linie obrany proti pronikajícím bakteriím. Současně se uvolňují serotonin, a thromboxan TXA 2, které přispívají k vasokonstrikci a k aktivaci destiček. Destičkový faktor 4 (platelet factor 4, PF4) je schopný vázat komplex heparinu s antithrombinem III, a tak brání předčasné inhibici koagulačních faktorů. Rovněž účinkuje jako chemotaktický faktor pro leukocyty. Aktivace destiček je komplexní proces, který zahrnuje změnu tvaru, expresi nových antigenů na povrchu a vytvoření prokoagulačního prostředí (mj. vystavením F V na povrchu membrány). Thrombin, který mezitím vznikl koagulační kaskádou, je mimo jiné rovněž aktivátorem destiček. Vznikající fibrinová síť zpevňuje agregované destičky a přispívá k zachycování dalších krevních buněk, erytrocytů i leukocytů. Plně vyvinutá hemostatická zátka je místem složitých metabolických interakcí. Zároveň představuje signál pro své okolí k tomu, aby se zahájily práce na jejím odstranění. Prvním krokem tímto směrem je uvolnění tkáňového aktivátoru plasminogenu (tissue plasminogen activator, t-pa) okolními endotheliálními buňkami. To už se ale spouští další fáze hemostatického procesu, fibrinolysa, o které pojednáme podrobně dále. Nyní se ještě zdržíme u metabolických vztahů probíhajících uvnitř hemostatické zátky. Jejich jednoduchý souhrn zobrazuje Obr. 11.

9 Po adhesi destiček na vwf se v nich aktivuje celá řada metabolických drah. Na počátku jsme zmínili transcelulární metabolismus. Jedna jeho dráha začíná v aktivovaných destičkách, kde fosfolipasa A 2 uvolňuje kyselinu arachidonovou z membránových fosfolipidů a transportuje ji extracelulárně. Je zachycena přítomnými granulocyty, které ji použijí pro metabolickou dráhu začínající lipoxidasou a syntetizují leukotrien A 4, který je dále exportován extracelulárně. Poslední stupeň syntézy probíhá v erytrocytech, které LTA 4 transformují na LTB 4. To je velice účinný chemotaktický faktor, který do místa tvorby zátky povolává další granulocyty, které jsou potřeba pro boj s pronikající infekcí. Už z tohoto příkladu je patrné, že erytrocyty nehrají pouze pasivní roli. Uvolňováním ADP přispívají na počátku k aktivaci destiček a k rychlejšímu nárůstu zátky. V pozdních stádiích, po vytvoření zátky, exportují fosfatasu, která z ADP vytvoří adenosin, který působí vasorelaxačně a ruší adhesi leukocytů, a tak přispívá k obnovení průtoku v opravené cévě. Aktivované destičky vystaví na povrchu nové antigeny. Mezi ně patří glykoproteiny IIb a IIIa, které mezi sebou vytvoří komplex schopný vázat fibrinogen. Fibrinogen tak rovněž přispívá k agregaci destiček. Destičky dále exportují vápenaté ionty, F V a F XIII a tím usnadňují tvorbu fibrinu. Konečným cílem všech reakcí je zahlazení poranění, ke kterému dojde obnovením cévní stěny nárůstem buněk hladkého svalu, fibroblastů, a obnovením extracelulární matrix. Tyto procesy iniciují už v období vytváření hemostatické zátky aktivované destičky, které uvolňují růstové faktory jako PDGF (platelet-derived growth factor). Bradykinin, který vzniká v důsledku aktivace koagulačního F XII, má svoje receptory také na povrchu destiček. Po jejich aktivaci destičky produkují různé prostaglandiny (PG x ) a faktor aktivující destičky (PAF, platelet activating factor). Ty mají kromě své úlohy při agregaci destiček také úlohu signální - interakcí s nervovými zakončeními podávají informaci o vzniklém zranění, kterou vnímáme jako bolest, což nás osobně zaangažuje v zastavení krvácení. Nemalou úlohu při hemostase mají rovněž endotheliální buňky. Podílejí se jak na prokolagulační fázi uvolněním vwf, F V a vystavením TF, tak na ukončení tvorby hemostatické zátky a obnovení průtoku cévou vystavením thrombomodulinu a uvolněním proteinů C a S spolu s heparinem. Prostacyklin PGI 2 a oxid dusnatý nakonec zruší účinek vasokonstriktorů vzniklých v počátečních fázích koagulace. Je dobré si uvědomit, že takto jsme popsali celý proces jen v hrubých rysech, a že situace in vivo je mnohem složitější. Jak jsme viděli už při aktivaci F XII, současně s koagulací se zahajují kroky k odstranění koagula - proces fibrinolysy. Hlavním činitelem v tomto pochodu je další serinová proteinasa - plasmin. Ta se zase nemůže v plasmě vyskytovat aktivní, protože by žádné koagulum nevzniklo. Jestliže čtenář nabývá dojmu, že problém je příliš komplikovaný, nechť se podívá na Obr. 12.

10 Ten vytvořil můj synek, když mu bylo 10 let a ještě se zajímal o přírodní vědy. Obrázek totiž zcela vystihuje podstatu problému: neaktivní Plasminogen se pustí do odstraňování závalu koagula až když se napije. Není to ale rum, nýbrž t-pa (tkáňový aktivátor plasminogenu), který potřebuje ke své aktivaci. Rozvášněného kopáče je možné zastavit tím, že mu zničíme jeho flašku. Na obr. je přichycen při činu jeden z agentů - PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1, tj. inhibitor 1 aktivátoru plasminogenu). Když jsme teď získali náhled, že fibrinolysa je dětská hračka, můžeme se věnovat jejím detailům. Hlavní regulační dráhy, které se při fibrinolyse uplatňují jsou shrnuty na Obr. 13. Zde jsou dráhy, které směřují k fibrinolyse vyznačeny plnou čarou, zatímco inhibiční dráhy jsou čárkované. Vycházíme z plasminogenu přítomného v plasmě. Už při výstavbě fibrinového koagula se počítá s jeho odstraněním, a proto se dovnitř zabudovává plasminogen. Vzhledem k důležitosti fibrinolysy je každý krok vybalancován, a tak i vazba plasminogenu na fibrin je inhibována glykoproteinem bohatým na cystein. Plasminogen je aktivován dvěma typy aktivátorů. Prvním je už zmíněný t-pa, produkovaný hlavně endotheliálními buňkami, druhým je tkáňový aktivátor podobný urokinase u-pa. Urokinasa je nízkomolekulární (M r = ) enzym zjištěný v moči, který má zachovanou funkci aktivace plasminogenu.

11 Jde o triviální název, takže tento enzym nemá kinasovou aktivitu. Vzniká při částečné degradaci u-pa plasminem. Zdrojem u-pa jsou nejrůznější typy buněk, jako jsou fibroblasty, epiteliální buňky, pneumocyty, buňky placenty, atd. Všeobecně se má za to, že hlavní úloha t-pa spočívá v regulaci intravaskulárních thrombů, zatímco u-pa se zřejmě podílí na regulaci celé řady dalších proteolytických pochodů, jako je remodelace tkání, invase tumorů, embryogenese, oplodnění vajíčka, zánětlivé pochody. Při biosyntéze vzniká nejdříve pre-pro-u-pa. Odštěpením signálního dvacetipeptidu vzniká jednořetězcový pro-u-pa, který je štěpen plasminem, nebo kalikreinem (vzniklým v důsledku kontaktní aktivace F XII) na dvouřetězcový aktivní u-pa. Plasmin tak vytváří smyčku s pozitivní zpětnou vazbou. Aktivaci u-pa kalikreinem je bráněno dalším proteinem plasmy, který účinkuje jako obecný inhibitor proteinas, tzv. C1 inhibitorem. Aby koagulum nebylo rozpuštěno předčasně, obsahuje navázaný inhibitor plasminu, α 2 -antiplasmin. Ten je navázán na vznikající fibrin faktorem F XIII a. Na druhé straně, vznik fibrinu spouští uvolňování aktivátorů plasminogenu buňkami. V tomto směru působí i komplex APC s proteinem S, který, jak jsme viděli výše, současně zastavuje produkci fibrinu. APC s proteinem S ještě podporují fibrinolysu inhibicí PAI-1 (viz dále). Plasmin vzniklý uvnitř koagula je téměř zcela inhibován přítomným α 2 -antiplasminem (α 2 AP). To téměř znamená, že fibrin se nicméně začne pomalu rozpouštět. V případě potřeby se může rozpouštění fibrinu urychlit neplasminovými proteinasami produkovanými destičkami a leukocyty. Aktivace fibrinolysy je pod kontrolou inhibitorů aktivátorů plasminogenu, kterých jsou čtyři typy - PAI-1, PAI-2, PAI-3, a proteinasa nexin. PAI-1 je glykoprotein o M r = , jehož gen je lokalizován na chromosomu 7. Je produkován endotheliálními buňkami, hepatocyty, buňkami hladkých svalů, fibroblasty a různými maligními buněčnými liniemi. Jeho kncentrace v plasmě je asi 1000x nižší než α 2 AP, ale 2-3x vyšší než koncentrace obou PA, které inhibuje. Tři čtvrtiny celkového PAI-1 se nacházejí v plasmě, ostatek je skladován v α granulích destiček. PAI-2 byl izolován z monocytárních buněk, granulocytů, placenty, atd. Existuje ve dvou formách - intracelulární, neglykosylované, a glykosylované extracelulární. V normální plasmě je neměřitelný, jeho koncentrace prudce vzrůstá na 250 mg/l v poslední třetině těhotenství. PAI-3 inhibuje u-pa a odstraňuje blokádu PAI-1 způsobenou APC a proteinem S. Spolu s nexinem mají poněkud nižší inhibiční konstanty než PAI-1, takže představují inhibitory druhé vlny. Hladiny inhibitorů i aktivátorů fibrinolysy jsou ještě dále regulovány játry, která je vychytávají z krevního oběhu. Fibrinolytické procesy jsou nejvýrazněji ovlivněny fibrinem. V nepřítomnosti fibrinu má t-pa na plasminogen jen malý efekt, vzhledem k nízké hodnotě katalytické konstanty. Malé množství plasminu je okamžitě eliminováno α 2 AP. Na povrchu fibrinu dochází ke vzniku ternárního komplexu mezi t-pa, plasminogenem a fibrinem. Aktivovaný plasmin je ale opět inhibován α 2 AP. K lysi koagula dochází proto po zvýšeném nachytání t-pa, uvolněného z endotelií proti proudu v důsledku stase okludované cévy. To vede k aktivaci malého množství plasminu, který naruší strukturu fibrinu a zvětší jeho povrch pro navázání dalšího plasminogenu. Tak postupně dojde k převážení inhibičního účinku α 2 AP a lysa koagula se začne zrychlovat. V nepřítomnosti kontaktní aktivace (kolem F XII) je fibrinolysa iniciovaná u-pa méně účinná, avšak při aktivované kontaktní fázi je u-pa účinnější než t-pa. Fibrinolysa závisí na poměru PA/PAI, který je ovlivněn celou řadou vnějších faktorů. Tak zvýšené uvolňování t-pa navozuje cvičení, citová hnutí jako strach či zlost, kouření, atd. Rovněž se uplatňují cirkadiánní rytmy - nejvyšší hladina PAI je časně ráno, kdy současně hladina t-pa je nejnižší. To je období, kdy nejčastěji dochází k infarktům (odtud vyplývá doporučení pro zdravý životní styl). PAI se chovají jako reaktanty akutní fáze - po operaci sledují průběh koncentrace C-reaktivního proteinu. Fibrinolytická aktivita je ještě modulována dalšími proteiny. Thrombospondin, glykoprotein o M r = , se nachází v a granulích destiček a je uvolněn po stimulaci thrombinem. V přítomnosti fibrinu účinkuje jako nekompetitivní inhibitor aktivace plasminogenu t-pa, naopak za nepřítomnosti fibrinu účinek t-pa potencuje asi 30x. Dalším proteinem ovlivňujícím fibrinolysu je tetranektin. Jeho koncentrace v plasmě je 15 mg/ml. Váže se na plasminogen a urychluje jeho konverzi na plasmin účinkem t-pa. Farmakologicky lze zasahovat do fibrinolysy podáním kyseliny ε - aminokapronové, která se váže na plasminogen a brání jeho adsorpci na fibrin.

12 Pacienti s deficitem α 2 AP mají tendence ke krvácení. Na druhé straně heterozygní deficience plasminogenu, nebo F XII či kalikreinu mohou vést k trombofilii. Molekulárně biologické mechanismy výstavby hemostatických proteinů Když organismus vytváří nový protein, nedějě se tak většinou úplně od počátku, náhodným výběrem, ale spíše pospojováním různých částí proteinů, jejichž funkce byla už evolucí prověřena. Proteiny se vyvíjejí výměnou částí genů, které kódují funkční domény proteinů. Tyto úseky genů se nazývají moduly. Modulární architektura genu (introny a exony) umožňuje poskládat proteiny z domén pocházejících z různých proteinů. Proteiny účastnící se na hemostase vytvářejí rozsáhlou nadrodinu příbuzných proteinů, které vznikly duplikací, přijetím, nebo ztrátou několika specifických modulů. Všechny tyto proteiny obsahují doménu homologickou trypsinu, což naznažuje, že se tyto proteiny a trypsin vyvinuly z nějakého společného ancestrálního proteinu. Rodokmen těchto proteinů můžeme vytvořit za použití 7 modulů (Obr. 14). Vycházíme z ancestrálního proteinu, kterým zřejmě byla trypsinu-podobná serinová proteinasa (P). Přidáním modulu, který kóduje strukturu označovanou jako kringle (K), protože svým tvarem připomíná dánský preclík tohoto jména, dostaneme "prarodiče" všech dalších proteinů. Když budeme sledovat nejdříve nejkrajnější levou větev, připojením modulu z epidermálního růstového faktoru - EGF (E) dostaneme základ struktury urokinasy. (Ukázané schema je samozřejmě silně zjednodušené a nezahrnuje např. substituce jednotlivých aminokyselin způsobených mutacemi). Po přidání jedné domény fibronektinu (F 2 ) dostaneme prekursor, u něhož vede duplikace kringlu ke vzniku struktury t-pa. Jestliže k uvedenému prekursoru přidáme další fibronektinovou doménu (F 1 ) a proběhne duplikace domény EGF, dostaneme strukturu F XII. Další větev rozvíjení prarodiče KP spočívá v připojení propeptidu (Pr) a domény vázající vápník (C) - dostaneme prekursor PrCKP, z něhož duplikací kringlu dostaneme strukturu prothrombinu. Jestliže naopak nastane delece kringlu, dostaneme mezistupeň PrCP, k němuž se opakovaně přidají domény EGF a dostaneme základ struktury faktorů VII, IX, X, a proteinu C. Relativně nejjednodušší způsob rozvoje prarodiče KP se dá uskutečnit opakovanou duplikací kringlu. Protein se čtyřmi kringly je růstový faktor hepatocytů, pět kringlů obsahuje plasminogen a okolo 40 kringlů obsahuje apolipoprotein (a). Podobná výstavba plasminogenu a apolipoproteinu (a), ev. růstového faktoru hepatocytů naznačuje účast těchto proteinů v hemostase. Apolipoprotein (a) je součástí lipoproteinů náležejících do skupiny LDL. Díky svým kringlům se může vázat na fibrin podobně jako plasminogen. Při vysokých koncentracích LDL v plasmě je tak inhibována fibrinolysa a podporuje se rozvoj atherogenese. To však zřejmě není fysiologická úloha apolipoproteinu (a). Při nízkých koncentracích LDL se příliš nesnižuje množství

13 plasminogenu navázaného na fibrin a LDL adsorbovaný v místě poranění slouží jako zásoba cholesterolu pro syntézu nových buněk v průběhu hojení rány. Podobně se může v místě poranění vázat růstový faktor hepatocytů, který stimuluje proliferaci i dalších typů buněk. Z výše uvedených příkladů regulace hemostasy je zřejmé, že naše koncepty, jako jsou koagulační kaskáda, fibrinolytický systém, nebo systém komplementu neexistují izolovaně jako takové, ale integrovány v homeostatickém supersystému. Pro porozumění fysiologickým mechanismům musíme být schopni po detailním prozkoumání jednotlivých částí složit zpět původní vysoce integrovaný obraz. Doporučená literatura: V. Jedlička: Hemokoagulace, fluidokoagulační rovnováha, fibrinolysa. SZN Praha K.G. Mann, R.J. Jenny, S. Krishnaswamy: Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Ann.Rev.Biochem. 1988, 57: R.M. Lawn: Lipoprotein (a) in heart disease. Scientific American June 1992,