Kmenové buňky nový nástroj pro hodnocení toxicity?

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ Kmenové buňky nový nástroj pro hodnocení toxicity? Bakalářská práce Sabina Váňová Vedoucí práce: RNDr. Pavel Babica, Ph.D. Brno 2013

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Sabina Váňová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Kmenové buňky nový nástroj pro hodnocení toxicity? Experimentální biologie Speciální biologie, směr Ekotoxikologie RNDr. Pavel Babica, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 84 Klíčová slova: Kmenové buňky; pluripotentní buňky, princip 3R, alternativní testování toxicity; in vitro; hepatotoxicita, kardiotoxicita; neurotoxicita

3 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Sabina Váňová Faculty of Science, Masaryk University Research centre for toxic compounds in the environment Stem cells: a new tool for toxicity testing? Experimental Biology Special Biology, orientation Ecotoxicology RNDr. Pavel Babica, Ph.D. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 84 Keyword: Stem cells; pluripotent cells; 3Rs principle; alternative toxicity testing; in vitro; hepatotoxicity; cardiotoxicity; neurotoxicity

4 Abstrakt Cílem této bakalářské práce bylo shrnutí aktuálního stavu poznání o možnostech využití kmenových buněk pro hodnocení toxických účinků chemických látek. Tradiční testy toxicity prováděné na pokusných zvířatech jsou nejen eticky problematické, ale často také zdlouhavé, ekonomicky nákladné a s omezenou relevancí vzhledem k člověku. Existuje proto snaha o hledání a využívání alternativních metod a postupů pro hodnocení toxicity, mezi které patří také in vitro experimenty s využitím savčích tkáňových kultur. Stále dostupnějším zdrojem buněk pro mnoho oblastí výzkumu se dnes stávají linie kmenových buněk různých typů izolované z různých organismů, včetně člověka. Vzhledem ke svým unikátním vlastnostem (vysoký replikační potenciál, schopnost sebeobnovy, schopnost diferencovat do specializovaných typů buněk) představují kmenové buňky perspektivní nástroj využitelný pro in vitro hodnocení toxicity látek, který by mohl překonat některé nedostatky dosavadních in vitro metod založených na primárních buňkách a permanentních buněčných liniích, a poskytovat relevantnější výsledky než doposud využívané in vitro a in vivo testy. Práce přináší základní informace o kmenových buňkách a literární přehled studií popisujících využití embryonálních, "dospělých" (tkáňově-specifických) nebo indukovaných pluripotentních buněk pro hodnocení toxicity, především pak ke studiu hepatotoxických, kardiotoxických nebo neurotoxických účinků xenobiotik, a diskutuje možnosti uplatnění kmenových buněk v kontextu požadavků a trendů moderní toxikologie a farmakologie. V praktické části se pak práce zabývá kultivací a využitím linie lidských dospělých kmenových buněk HLhT1 pro hodnocení toxicity.

5 Abstract The aim of this thesis was to present the state-of-the-art knowledge on the use of stem cells for toxicological evaluation of chemicals. Traditional toxicity tests based on experimental animals are not only ethically controversial, but quite often also timeconsuming, expensive and with limited human relevancy. There is a continuing effort to develop and employ alternative approaches and methods for toxicity testing, which include also in vitro experiments using mammalian cell cultures. Cell lines of stem cells of different types isolated from various organisms including human have recently become more available source of cells for many research fields. Because of their unique properties (high proliferative potential, self-renewal, ability to differentiate into specialized cell types), stem cells represent a perspective tool suitable for in vitro toxicological evaluation of chemicals, and they could prove more efficient than currently used in vitro methods based on primary explanted cells or permanent cell lines, and provide more relevant results than traditional in vitro or in vivo models. This thesis provides basic information on stem cells and a literature review of studies utilizing embryonic, adult (tissue-specific) or induced pluripotent stem cells for toxicity assessment, especially for evaluation of hepatotoxic, cardiotoxic or neurotoxic effects of xenobiotics, and further discusses potential of stem cell-based models in the context of current needs and recent trends in toxicology. Experimental part focuses on cell culture of human adult liver stem cell line HLhT1 and its use for toxicity testing.

6

7

8

9 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu své bakalářské práce panu RNDr. Pavlu Babicovi, Ph.D. za čas, odborné vedení, trpělivost a pomoc při realizaci a zpracování praktické části. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 27. května 2013 Sabina Váňová

10 Obsah Teoretická část: 1 Úvod Toxikologie Definice a cíl Historie Legislativní opatření Princip 3R Metody v toxikologii Epidemiologické studie In silico metody Metody experimentální toxikologie In vivo metody In vitro metody Kmenové buňky Pluripotentní kmenové buňky Embryonální rakovinné buňky Embryonální zárodečné buňky Embryonální kmenové buňky Dospělé kmenové buňky Indukované pluripotentní kmenové buňky Využití kmenových buněk pro testování toxicity Hepatotoxicita Modely pro testování hepatotoxicity Klíčové enzymy metabolismu xenobiotik - cytochromy P Kardiotoxicita

11 5.2.1 Modely pro testování kardiotoxicity Syndrom dlouhého QT intervalu Využití souborů miniaturních elektrod při testování kardiotoxicity In vitro test embryotoxicity Neurotoxicita Modely pro testování neurotoxicity Neurotoxické účinky alkoholu Neurotoxické účinky methylrtuti Strategie pro hodnocení neurotoxicity Cíle praktické části Materiál a metody Buněčná linie Kultivace buněčné linie Pasážování buněčné linie Experimentální design Vliv želatiny na růst buněk HLhT1 v E-Plate (I. Pokus) Titrační křivka (II. Pokus) Účinky TPA a DMSO na HLhT1 buňky (III. Pokus) Stanovení metabolické aktivity MTT testem Měření impedance v buněčné kultuře systémem xcelligence Výsledky Kultivace HLhT1 buněk Vliv želatiny na růst buněk HLhT1 v E-Plate (I. pokus) Titrační křivka (II. pokus) Analýza buněk v reálném čase - systém xcelligence MTT test Účinky modelových toxikantů na HLhT1 buňky (III. pokus)

12 O-tetradekanoylforbol-13-acetát (TPA) Dimethylsulfoxid (DMSO) Diskuze Závěr Literatura

13 Seznam použitých zkratek 2D 3R AF-MSCs ASCs AT-MSCs ATP BM-HSCs BM-MSCs Ca 2+ CCD CI CYP450 DIC DMEM DMSO DNA EC ECVAM EDTA EG ESCs EtOH EU FAS dvourozměrný prostor nahrazení, omezení, zdokonalení (replacement, reduction, refinement) mezenchymální kmenové buňky z plodové vody získané amniocentézou (amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells) dospělé kmenové buňky (adult stem cells) mezenchymální kmenové buňky z tukové tkáně (adipose tissue-derived mesenchymal stem cells) adenosintrifosfát hematopoetické kmenové buňky v kostní dřeni (bone marrow hematopoietic stem cells) mezenchymální kmenové buňky v kostní dřeni (bone marrow-derived stromal mesenchymal stem cells) vápenatý kationt charge coupled device buněčný index (Cell Index) cytochrom P450 Nomarského diferenciální interferenční kontrast Dulbecco s Modified Eagle s médium dimethylsulfoxid deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) embryonální rakovinné (buňky) (embryonic carcinoma) Evropské centrum pro ověřování alternativních metod (European Centre for the Validation of Alternative Methods) kyselina ethylendiamintetraoctová (ethylendiaminetetraacetic acid) embryonální zárodečné (buňky) (embryonic germ) embryonální kmenové buňky (embryonic stem cells) ethanol Evropská unie (European Union) fetální alkoholový syndrom 13

14 FBS FICAM HCl hescs hipscs htert HTS ICCVAM ipscs JaCVAM MEA MEF MeHg mrna MTT NMDA NSCs OECD PBS PCB PD-MSCs POPs REACH fetální hovězí sérum (fetal bovine serum) Finské centrum pro alternativní metody (The Finnish Centre for Alternative Methods) kyselina chlorovodíková lidské embryonální kmenové buňky (human embryonic stem cells) lidské indukované pluripotentní kmenové buňky (human induced pluripotent stem cells) lidská telomerázová reverzní transkriptáza screening s vysokou propustností (high-throughput screening) Meziagenturní koordinační výbor pro validaci alternativních metod (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) indukované pluripotentní kmenové buňky (induced pluripotent stem cells) Japonské středisko pro validaci alternativních metod (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods) soubory miniaturních elektrod (microelectrode arrays) myší embryonální fibroblasty (mouse embryonic fibroblasts) methylrtuť mediátorová ribonukleová kyselina (messenger ribonucleic acid) 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid N-methyl-D-aspartátový receptor nervové kmenové buňky (neural stem cells) Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (Organisation for Economic Co-operation and Development) fosfátový pufr (phosphate buffered saline) polychlorovaný bifenyl (polychlorinated biphenyl) mezenchymální kmenové buňky pocházející z placenty (placenta-derived mesenchymal stem cells) persistentní organické polutanty (peristent organic pollutants) registrace, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (registration, evaluation, authorisation and restriction of chemicals) 14

15 SCNT TCDD TPA UCB-HSCs UCB-MSCs UCB-SCs US EPA US FDA ZEBET transfer jádra somatické buňky (Somatic Cell Nuclear Transfer) 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát hematopoetické kmenové buňky v pupečníkové krvi (umbilical cord blood hematopoietic stem cells) mezenchymální kmenové buňky v pupečníkové krvi (umbilical cord blood mesenchymal stem cells) kmenové buňky v pupečníkové krvi (umbilical cord blood stem cells) Agentura pro ochranu životního prostředí (United States Environmental Protection Agency) Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (United States Food and Drug Administration) Centrum pro dokumentaci a vývoj alternativních metod k pokusům na zvířatech (Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch) 15

16 Teoretická část 1 Úvod Pro testování toxicity chemických látek jsou po desítky let používána především laboratorní zvířata. V současné době, kdy každoročně narůstá počet nově syntetizovaných chemikálií s neznámými vlastnostmi, však laboratorní zvířata nepředstavují dostatečně účinný a spolehlivý model vhodný pro zjišťování toxických vlastností velkého množství látek. Vědecký výzkum zabývající se hodnocením nebezpečných účinků chemikálií se proto zaměřuje na nalezení a zdokonalení nástrojů, které by byly relevantním, rychlým a méně nákladným zdrojem informací o toxických účincích látek. In vitro buněčné modely v kombinaci s moderními metodami biologického výzkumu představují jeden z takových nástrojů, jehož využití pro hodnocení toxicity by umožnilo snížit počty pokusných zvířat. Nicméně i doposud aplikované in vitro modely založené na primárních buňkách nebo permanentních buněčných liniích vykazují určité nedostatky, které souvisejí s jejich omezenou dostupností a nízkým proliferačním potenciálem v in vitro podmínkách či s jejich genetickými a epigenetickými abnormalitami. Tyto limitace by však mohly být překonány při použití kmenových buněk, které disponují řadou unikátních vlastností. Především je to existence reprodukovatelných postupů pro jejich izolaci a přípravu přímo z lidských tkání a orgánů, jejich vysoký až neomezený in vitro replikační potenciál, schopnost sebeobnovy a schopnost diferencovat v optimálních in vitro podmínkách do různých typů buněk a tkání, které se nacházejí v organismu. Na těchto laboratorně vytvořených složkách těla savců nebo lidí v případě použití lidských kmenových buněk může být následně testován účinek chemické látky. Informace získané pomocí studií na lidských kmenových buňkách by měly přesněji a relevantněji vystihovat reakce lidského organismu na toxikant v porovnání s laboratorními zvířaty i permanentními buněčnými liniemi. V této bakalářské práci jsem se snažila shrnout dostupné informace o in vitro modelech využívajících kmenové buňky pro testování toxicity, v souvislosti s aktuálními trendy v toxikologii a současnými požadavky na hodnocení toxicity látek, a používané metody. V první kapitole se věnuji toxikologii, jejímu historickému vývoji a související legislativě. V následující kapitole popisuji toxikologické metody používané v současné době pro hodnocení toxicity. Následuje kapitola, ve které zmiňuji jednotlivé typy kmenových 16

17 buněk a jejich vlastnosti. Poslední kapitola teoretické části přináší literární přehled studií využívajících kmenové buňky pro testování hepatotoxicity, kardiotoxicity, embryotoxicity a neurotoxicity. V praktické části popisuji experimenty s kultivací lidských dospělých jaterních kmenových buněk HLhT1, hodnocení jejich proliferace a toxických účinků modelových látek pomocí tradiční MTT metody a pomocí měření buněčné impedance v reálném čase systémem xcelligence. 17

18 2 Toxikologie 2.1 Definice a cíl Toxikologie je věda zabývající se jedy, přičemž největší pozornost je věnována jejich chemickým a fyzikálním vlastnostem, účinkům, kterými ovlivňují fyziologii nebo chování živých organismů, kvalitativním a kvantitativním metodám stanovení a predikce těchto účinků a postupům při léčení následků otravy (Langman & Kapur, 2006). Jed je označení pro jakoukoliv látku, které je živý organismus vystaven buď náhodně, nebo plánovaně a která jej poškozuje. Existuje řada způsobů, jak může být člověk a další organismy jedem exponovány záměrné požití, expozice v pracovním prostředí, expozice v životním prostředí nebo náhodná či zamýšlená otrava. Úkolem toxikologie je chránit lidské zdraví a životní prostředí před škodlivými účinky toxikantů, a dále napomáhat při vývoji chemických látek se selektivnějším účinkem, jako jsou například léky proti rakovině nebo pesticidy. Kromě výše zmíněného toxikologie zahrnuje také studium škodlivých účinků způsobených fyzikálními jevy, jako jsou různé druhy radiace a hluk (Hodgson, 2004). 2.2 Historie Na základě současných poznatků lze říct, že toxikologie je stará téměř jako lidstvo samo (Tabulka 1). Již v pravěku si lidé byli vědomi účinků přírodních toxických látek a využívali je pro nejrůznější účely. Řada významných osobností starověku byla zavražděna nebo dobrovolně ukončila svůj život otravou jedem. Tento fenomén kulminoval v období středověku, které je považováno za zlatou éru záměrných otrav. V novověku vzhledem ke vzrůstajícímu zájmu o toxikologii, počínajícímu využívání anestetik a desinfekčních prostředků a s pokrokem experimentální farmakologie se tento vědní obor pomalu formoval do podoby, v jaké ho známe dnes (Tabulka 2). Dnešní doba je charakteristická rapidním vývojem stále dokonalejších technologií umožňujících porozumění nejen následkům působení toxikantu, ale zejména jeho mechanismu působení (Casarett & Doull, 2008). 18

19 Tabulka 1: Stručný historický vývoj toxikologie od pravěku až do novověku. Sestaveno podle: Casarett & Doull, 2008; Hodgson, období pravěk starověk středověk novověk dokument / osobnost Eberský papyrus (cca 1500 př. n. l.) Hippokrates (cca 400 př. n. l.) Maimonides ( ) Paracelsus ( ) Kateřina Medicejská ( ) Bernardino Ramazzini ( ), Percival Pott ( ) Orfila ( ) význam zvířecí jedy a extrakty z rostlin pro účely lovu, válčení, vražd nejstarší dochovaný záznam o toxikologii vybraných látek (bolehlav, opium, olovo, měď) principy klinické toxikologie týkající se biodostupnosti rozšíření Hippokratovy teorie o biodostupnosti pozorováním, že mléko, máslo a smetana mohou zdržet absorpci toxikantů střevy formulace vztahu dávka odpověď, což je dnes považováno za základní pojem toxikologie testování toxických směsí na chudých a nemocných pod záminkou nabízení jídla a pomoci toxikologie související se zaměstnáním, Ramazzini studoval zdravotní potíže horníků, kovářů, hrnčířů; Pott obtíže kominíků otec moderní toxikologie, ustanovil toxikologii jako samostatnou vědu 19

20 Tabulka 2: Stručný historický vývoj toxikologie ve 20. století. Sestaveno podle: Aardema & MacGregor, 2002; Casarett & Doull, 2008; Lehman et al., 1949; Russel & Burch, 1959; období význam 20. století 20. léta 40. léta 50. léta 60. a 70. léta 80. léta 90. léta - první systematické používání zvířat pro hodnocení a srovnání akutní toxicity chemických látek pomocí parametru LD50 (J. W. Trevan) - in vivo testy pro iritaci kůže a očí (J. H. Draize) - první směrnice s metodami pro testování látek na zvířatech: akutní, subakutní, chronická toxicita (1949, US FDA Black Book ) - rozvoj metod molekulární biologie, pomocí nichž byly rozšířeny poznatky o toxických účincích na buňky a orgány - in vivo testy karcinogenity na hlodavcích - formulace principu 3R, který usiluje o odpovědné a rozumné užívání pokusných zvířat při testování toxicity látek, z něhož vycházejí snahy nahradit in vivo testy na zvířatech alternativními in vitro a in silico metodami - vývoj in vivo testů pro reprodukční a vývojovou toxicitu - zakládání dalších institucí, jejichž úkolem je ochrana lidského zdraví a životního prostředí před škodlivými účinky chemických látek, např. Agentura pro ochranu životního prostředí (US EPA) - směrnice OECD pro testování chemických látek, sekce 4 (OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Section 4 Health Effects) se týká testování účinků na zdraví, které je založeno převážně na in vivo testech toxicity na laboratorních zvířatech - validace alternativních metod včetně in vitro modelů a postupná modifikace směrnic pro testování chemických látek v souladu s principem 3R - rozmach omics technologií, což je souhrnné označení pro genomiku (studium genomu), transkriptomiku (studium mrna exprimované v buňce nebo tkáni), proteomiku (studium proteinů a peptidů exprimovaných v buňce nebo tkáni) a metabolomiku (studium buněčných metabolitů) 2.3 Legislativní opatření Pro zajištění vysoké úrovně ochrany lidského zdraví a životního prostředí před nežádoucími důsledky expozice chemickým látkám bylo přijato nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 týkající se registrace, hodnocení, povolování (autorizace) a omezování chemických látek, které je označováno zkratkou REACH. Nařízení 20

21 REACH požaduje, aby byly uváděny fyzikálně-chemické vlastnosti a toxikologická a ekotoxikologická data pro každou chemickou látku (Hulzebos et al., 2010) vyráběnou v EU nebo do ní dováženou v množství větším než 1 tuna ročně. Z dalších soudobých evropských legislativních opatření týkajících se ochrany lidského zdraví a životního prostředí před nežádoucími účinky chemických látek a s tím souvisejících požadavků na jejich toxikologické hodnocení lze zmínit nařízení 1223/2009 (o kosmetických přípravcích), směrnici 98/8/EC (o uvádění biocidních přípravků na trh) nebo nařízení EC 1107/2009 (o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh). Pro zajištění kvality, porovnatelnosti a celosvětového přijetí toxikologických dat získaných různými laboratořemi v různých zemích vydala OECD pokyny pro stanovení účinků na zdraví (OECD Health Effects Test Guidelines) ( ), které se týkají metod používaných pro určení a charakterizaci nebezpečí, jehož původcem jsou chemické látky. Testovací směrnice OECD představují soubor nejrelevantnějších mezinárodně uznávaných validovaných metod používaných vládními institucemi, v průmyslu i v nezávislých laboratořích pro hodnocení účinků chemických látek a přípravků na lidské zdraví. Testovací směrnice OECD byly od svého vzniku založeny především na testech prováděných na laboratorních zvířatech, které jsou používány už desítky let a poskytují informace o různých typech toxicity (Arts et al., 2008). Ukazuje se však, že tyto testy jsou v řadě ohledů nevhodné pro testování velkého množství chemických látek požadovaného nařízením REACH (Combes et al., 2004) a jsou kritizovány jak ze strany politiků a široké veřejnosti především z etických důvodů, tak s ohledem na námitky odborníků a vědců týkající se relevance získaných toxikologických dat (Arts et al., 2008). Při laboratorních pokusech jsou homogenní skupiny zvířat exponovány zpravidla vysokým dávkám testované látky za účelem sledování jejich nepříznivých vlivů na biologickou odpověď. Heterogenní lidská populace je však v prostředí dlouhodobě vystavena nízkým dávkám polutantů. V tomto ohledu tedy nejsou zvířecí modely příliš vhodné pro testování toxicity, jak ukazuje praxe z farmaceutického průmyslu a hodnocení nežádoucích účinků nově vyvíjených léčiv (Anson et al., 2011; Pampaloni et al., 2009). Mezi další problematické aspekty mnoha validovaných in vivo testů na zvířatech patří také jejich velká časová a ekonomická náročnost, která představuje významnou komplikaci pro realizaci toxikologického hodnocení chemických látek v rozsahu požadovaném například nařízením 21

22 REACH (Rovida & Hartung, 2009). K podobným závěrům dospěla také kritická analýza metod používaných pro testování toxicity vypracovaná Národní radou pro výzkum (National Research Council), která byla ve Spojených státech amerických publikována v roce 2007 pod názvem Testování toxicity ve 21. století (Toxicity testing in the 21 st century). V tomto dokumentu je konstatována nedostatečnost dosavadních přístupů v toxikologii založených na in vivo testování látek a nastíněna vize nového systému testování toxicity in vitro, který by se soustředil na mechanistické porozumění odpovědím buněčných procesů a signálních drah na působení toxikantu, využití screeningu s vysokou propustností (HTS highthroughput screening ), omics technologií, bioinformatických metod a moderních postupů systémové a výpočetní biologie (National Research Council, 2007). Evropská legislativa usilující o postupnou minimalizaci in vivo testů na laboratorních zvířatech se objevuje již v 70. a 80. letech 20. století. Ochrana zvířat využívaných pro experimenty a další vědecké účely je zajištěna směrnicí 2010/63/EU (nahrazující směrnici 86/609/EEC), která vyžaduje aktivní podporu vývoje, validace a přijetí metod založených na principu 3R (Vojnits & Bremer, 2010), o kterém je více pojednáváno v podkapitole Na základě požadavků směrnice 86/609/EEC, resp. 2010/63/EU, začaly být zřizovány instituce, jejichž úkolem byla validace alternativních metod pro testování toxicity využívajících in vitro postupy. První státní organizace, která respektovala princip 3R a byla zaměřena na validaci in vitro testů toxicity, byla založena v Německu roku 1989 pod názvem Centrum pro dokumentaci a vývoj alternativních metod k pokusům na zvířatech (ZEBET). O dva roky později následovalo ustavení Evropského centra pro ověřování alternativních metod (ECVAM). Úspěch, kterého dosáhla činnost ZEBET a ECVAM, vedl k založení podobných organizací po celém světě ICCVAM se sídlem v USA, JaCVAM působící v Japonsku a FICAM založený ve Finsku (Spielmann, 2009). Úspěšně validované in vitro testy, které již byly zařazeny mezi standardní postupy testování toxicity (např. do směrnic OECD pro testování účinků na zdraví), zahrnují např. in vitro testy pro: podráždění kůže, poleptání kůže, absorpci kůží, in vitro test fototoxicity založený na 3T3 buňkách nebo in vitro test chromozomové aberace u savců ( ) Princip 3R Za zakladatele konceptu principu 3R jsou považováni W. M. S. Russell a R. L. Burch, kteří roku 1959 publikovali dílo The Principles of Humane Experimental Technique, ve 22

23 kterém jsou poprvé zmíněny zásady principu 3R (Russel & Burch, 1959). Zkratka 3R je odvozena z anglických slov Replacement, Reduction a Refinement, které lze přeložit jako nahrazení, omezení a zdokonalení. Nahrazení spočívá v realizaci metod s použitím nevnímavého materiálu, který by kompenzoval modely využívající živé obratlovce. Tyto metody zahrnují například matematické a počítačové modely, používání tkáňových kultur, nižších organismů s omezenou vnímavostí nebo časných vývojových stadií obratlovců. Omezení je definováno jako způsoby snižování počtu pokusných zvířat potřebných k získání dostatečného množství přesných vědeckých dat. Jedná se například o harmonizaci mezinárodních regulačních testovacích směrnic, což by zabránilo zbytečnému opakování a provádění nadbytečných testů. Zdokonalením se rozumí vývoj vedoucí k poklesu četnosti nebo bolestivosti postupů užívaných na zvířatech. Cílem je minimalizovat utrpení zvířat a maximalizovat jejich blahobyt. Metody, které byly v tomto smyslu zdokonaleny, zahrnují užívání nejméně invazivních postupů, zlepšení prostředí chovaných zvířat, uplatnění anestezie a analgezie (pokud je to vhodné) a zacházení se zvířaty soucitně a s péčí (Combes et al., 2004). Přijetí principu 3R i ve vědecké praxi vedlo ke zlepšení experimentálních postupů a omezení množství použitých laboratorních zvířat, což vedlo ke zmírnění jejich bolesti, utrpení a strachu (Combes et al., 2004). V souladu s principem 3R stanovuje nařízení 1223/2009 (nahrazující Kosmetickou směrnici 76/768/EEC) postupné zrušení testování kosmetických přísad a výrobků na zvířatech a následný zákaz jejich prodeje v Evropském společenství. Rovněž v rámci nařízení 1907/2006 REACH bylo za účelem minimalizování počtu laboratorních zvířat nutných pro implementaci požadavků tohoto nařízení umožněno využít alternativních metod a přístupů pro hodnocení chemických látek (Vojnits & Bremer, 2010). 23

24 3 Metody v toxikologii Metody využívané pro testování toxických účinků chemických látek zahrnují epidemiologické studie, in silico modely a metody experimentální toxikologie. 3.1 Epidemiologické studie Epidemiologické studie jsou zaměřeny na sledování osob v jejich přirozeném prostředí, ve kterém jsou vystaveny vnějším vlivům (pití alkoholu, kouření), biologickým činitelům, stresu, chemikáliím a polutantům přítomným v ovzduší, nejčastěji prachovým částicím. Studie se rozdělují na retrospektivní a prospektivní. Retrospektivní výzkum začíná výsledkem a zpětně prošetřuje expozici (Lewallen & Courtright, 1998), zatímco prospektivní studie v průběhu času sleduje skupinu podobných jedinců, kteří se ale liší v konkrétních vlastnostech (např. skupina kuřáků a nekuřáků) a zjišťuje se, jak tyto vlastnosti ovlivňují výsledek (např. vznik rakoviny plic). Další hodnocené ukazatele zahrnují například úmrtnost, morbiditu, hospitalizaci kvůli kardiovaskulárním a respiračním onemocněním, funkci plic a variabilitu srdečního rytmu (Englert, 2004). Epidemiologické studie jsou vhodné pro studium akutní i chronické toxicity, jejich nedostatkem je však obtížná průkaznost kauzality, nemožnost vyloučení působení dalších přítomných polutantů, které mohou zkreslovat výsledek, a časová a finanční náročnost (Devlin et al., 2005). 3.2 In silico metody In silico toxikologie je označení pro studie prováděné na počítači nebo pomocí počítačové simulace (Raunio, 2011). In silico metody umožňují získat informace o fyzikálněchemických vlastnostech chemikálií, jejich osudu v prostředí a účincích na lidské zdraví. Jednou z nejpoužívanějších in silico technik je kvantitativní vztah struktura-aktivita (QSAR) (Kar & Roy, 2010). Principem modelu QSAR je získání souboru dat o vztahu mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou známých chemických látek. Z těchto poznatků jsou následně odvozeny předpovědi biologické aktivity neznámých chemikálií. Při aplikaci in silico metod nejsou přímo používána žádná laboratorní zvířata ani chemikálie. Výsledky jsou však závislé na vstupních datech získaných zmíněnými in vivo nebo in vitro metodami. Pokud jsou tato data nepřesná, výsledek získaný pomocí in silico technik bude také nepřesný. Finanční náročnost in silico metod se odvíjí od dostupnosti počítačové techniky, softwaru (některé jsou volně dostupné, například modely US EPA) a pracovní síly. Limitujícím 24

25 faktorem je dostupnost experimentálních dat, které jsou potřebné pro konstrukci modelu (Benfenati et al., 2010). 3.3 Metody experimentální toxikologie Ačkoli se některé metody experimentální toxikologie objevují již před stovkami let, až ve 20. století s rozvojem chemických látek a vzrůstajícím zájmem o jejich bezpečnost však dospěla experimentální toxikologie do podoby, v jaké ji známe dnes. Byly zavedeny vědecké metody křížení a chovu pokusných zvířat (in vivo metody), postupy pro pěstování buněčných kultur (in vitro metody) a analytické metody pro zjišťování malých množství chemických látek (Purchase, 2004) In vivo metody In vivo se používá pro označení testování a pokusů na laboratorních zvířatech. In vivo metody se postupně staly hlavním zdrojem toxikologických dat (Benfenati et al., 2010) a mnohé z nich byly standardizovány např. pomocí harmonizovaných pokynů OECD pro testování toxicity ( ). Zavedením principů správné laboratorní praxe byla zajištěna kvalita a reprodukovatelnost výsledků testů a došlo ke snížení možnosti podvodů (Barlow et al., 2002). Na druhou stranu existuje řada nevýhod in vivo metod, z nichž některé již byly nastíněny výše. Významným omezením je mezidruhová variabilita - rozdílné potravní zvyky, rozdíly v délce života (Devlin et al., 2005) a odlišné fyziologické a biochemické procesy zvířat a lidí (Blaauboer, 2002) velmi komplikují extrapolaci výsledků získaných testováním na zvířatech na člověka (Devlin et al., 2005). Někteří toxikologové poukazují na to, že testování na zvířatech podává nedostatečnou odpověď na toxikologické problémy, protože umožňuje hodnotit pouze konečné důsledky expozice, ale neposkytuje porozumění mechanismu působení. V těchto souvislostech postupně dále narůstá tlak nejen na omezení nebo dokonce zastavení pokusů na zvířatech, ale i na rozvíjení a schválení alternativních testovacích postupů, které berou ohled na vědecké, ekonomické, logistické, etické a zákonné aspekty a nevyžadují použití zvířat pro testování toxicity (Bhanushali et al., 2010). 25

26 3.3.2 In vitro metody Studie prováděné na funkčních orgánech a složkách organismu, které byly vyjmuty z jejich přirozeného prostředí, se nazývají in vitro. Testy se provádějí na mnohobuněčných kulturách, epitelech, izolovaných buněčných organelách (např. mitochondriích), či izolovaných biomakromolekulách (DNA, RNA, proteinech). In vitro metody umožňují porozumět základním buněčným drahám a biochemickým procesům, které řídí odpověď buňky na toxikant (Devlin et al., 2005), jsou proto neocenitelným zdrojem informací o mechanismu účinku toxických látek v těle pokusných zvířat i člověka (Eisenbrand et al., 2002). In vitro metody jsou relativně levné a díky možnosti jejich adaptace pro HTS jsou vhodné pro rychlé testování mnoha polutantů nebo jednotlivých složek tvořících směs chemikálií (Devlin et al., 2005). Obecně lze za limitaci in vitro studií považovat skutečnost, že buňky nebo jiné složky živých organismů jsou vyjmuty z jejich přirozeného prostředí. Absence sousedících buněk nebo epitelů, nepřítomnost krevního zásobení (Devlin et al., 2005), růst na plastových nebo skleněných miskách v prostředí obsahujícím většinou nefyziologické koncentrace kyslíku, umělé médium, logaritmická fáze růstu buněčných kultur a dvourozměrný prostor (2D) (Kang & Trosko, 2011) ztěžují simulaci expozice a procesů probíhajících in vivo, protože buňky nemohou interagovat se svým okolím nebo mezi sebou jako ve fyziologických podmínkách a nemají přísun živin a dalších potenciálně důležitých faktorů (Devlin et al., 2005). V současnosti využívané in vitro modely pro testování toxicity zahrnují izolované lidské nebo zvířecí primární buňky a permanentní buněčné linie, které mají charakter nádorových buněk. Oba modely však vykazují určité nedostatky. Primární buňky mají konečnou délku života, tvoří heterogenní populace a brzy dochází k jejich dediferenciaci a tím i ke ztrátě fenotypu. Zejména v případě primárních lidských buněk je problémem jejich omezená dostupnost. Pro permanentní buněčné linie je charakteristická vysoká variabilita růstu, abnormální genotyp, fenotyp a fyziologické reakce (signalizace, metabolické a transportní dráhy). Studie prováděné na těchto buňkách tedy nemusejí být vždy relevantní, což může vést k jejich zpochybňování (Baxter et al., 2010; Scott et al., 2013). Využití lidských buněk při in vitro testování účinků chemických látek nicméně umožňuje překonat existující limitace in vivo experimentů na zvířatech 26

27 způsobené mezidruhovými rozdíly. Testy toxicity založené na lidských buňkách vyžadují však jejich pohotový zdroj, který by přesně vykazoval požadovaný in vivo fenotyp, stabilně udržoval tento fenotyp během kultivace a poskytoval by dostatečné množství buněk za přijatelné náklady. Pokrok v oblasti biologie kmenových buněk probíhající v posledních letech, kdy bylo dosaženo jejich úspěšné izolace a kultivace, naznačuje, že lidské kmenové buňky (embryonální, dospělé i indukované pluripotentní) by mohly splňovat zmíněná kritéria, mohly by být zdrojem normálních nekarcinogenních buněk a najít tak uplatnění při testování toxicity (Scott et al., 2013). 27

28 4 Kmenové buňky Potten a Loeffler (1990) definovali kmenové buňky jako nediferencované buňky schopné proliferace, sebeobnovy, tvorby velkého množství diferencovaného funkčního potomstva, regenerace tkáně poškozené zraněním a flexibility při vykonávání těchto možností. Kmenové buňky se rozdělují na několik typů: pluripotentní kmenové buňky (např. embryonální kmenové buňky), dospělé kmenové buňky a indukované pluripotentní kmenové buňky (Stein et al., 2011). 4.1 Pluripotentní kmenové buňky Pluripotence je schopnost kmenových buněk diferencovat do všech buněčných typů nacházejících se v organismu (Stein et al., 2011). Z lidských tkání byly úspěšně izolovány tři pluripotentní buněčné typy: embryonální rakovinné (EC - embryonic carcinoma) buňky, embryonální zárodečné (EG - embryonic germ) buňky a embryonální kmenové buňky (ESCs - embryonic stem cells) (Gepstein, 2002) Embryonální rakovinné buňky Prvními popsanými pluripotentními kmenovými buňkami byly kmenové buňky testikulárního germinálního nádoru u myší, tzv. teratokarcinomy. Několik linií lidských EC buněk bylo stanoveno in vitro během 70. let 20. století, kdy sloužily jako model pro studium diferenciace pluripotentních buněk do dospělých buněčných typů (Andrews, 2002). Zásadním přínosem výzkumu myších a lidských EC buněk bylo vyvinutí technik, které umožňovaly odvození pluripotentních ESCs z blastocysty myši, což následně vedlo k úspěšnému provedení izolace lidských ESCs z blastocysty (Przyborski et al., 2004). EC buňky jsou schopné proliferace a diferenciace do různých buněčných typů in vitro. Po působení chemických induktorů v podmínkách in vitro dochází k expresi tkáňově specifických genů a tvoří se specializované buňky, např. srdeční a kosterní svaloviny, chrupavky nebo nervové buňky. EC buňky jsou však často příčinou tvorby nádorů v potomstvu (Wobus & Loser, 2011) a obvykle jsou aneuploidní (Gepstein, 2002), což omezuje jejich použití ve výzkumu vývojové biologie, přesto jsou stále používány jako buněčný in vitro model. Například lidské EC buňky izolované z testikulárních nebo ovariálních teratokarcinomů byly použity k vytvoření specifických lidských antigenů přítomných na povrchu buněk (Wobus & Loser, 2011). 28

29 4.1.2 Embryonální zárodečné buňky Lidské embryonální zárodečné buňky byly izolovány z pěti- až sedmitýdenního potraceného lidského plodu (Shamblott et al., 1998). Jsou způsobilé k diferenciaci do několika linií, ale mají omezenou schopnost proliferace (Wobus & Loser, 2011). Jejich regenerační potenciál byl prokázán při pokusu o neuroreparaci, kdy do pokusného zvířete byly transplantovány nervové deriváty získané diferenciací lidských EG buněk (Kerr et al., 2003). Lidské EG buňky by tak mohly sloužit pro terapeutické účely jako alternativa k lidským embryonálním kmenovým buňkám. Nicméně jejich obtížná izolace z lidských plodů a limitovaná proliferační schopnost omezují použitelnost lidských EG buněk pro experimentální účely (Wobus & Loser, 2011) Embryonální kmenové buňky Lidské embryonální kmenové buňky (hescs - human embryonic stem cells) pocházejí z vnitřní masy buněk nacházející se v raném embryu blastocystě (Obr. 1). Jejich první úspěšnou izolaci provedl James Thompson roku Blastocysty jsou získávány procesem in vitro fertilizace nebo nedávno u lidských buněk poprvé úspěšně provedenou technikou transferu jádra somatické buňky (SCNT - Somatic Cell Nuclear Transfer), kdy je haploidní jádro v oocytu nahrazeno in vitro diploidním jádrem somatické buňky (fibroblastu), které je následováno rýhováním a tvorbou blastocysty (Tachibana et al., 2013). HESCs jsou schopné sebeobnovy, exprimují velké množství telomerázy, mají normální karyotyp a neomezenou schopnost proliferace na živné vrstvě z myších embryonálních fibroblastů (MEF), na rozdíl od ostatních kmenových buněk si zachovávají potenciál vytvořit tkáně všech tří zárodečných vrstev (s výjimkou placenty; Stein et al., 2011) a po in vivo transplantaci do imunodeficientní myši jsou schopné vytvářet nádory. Klony odvozené od hescs si zachovávají všechny výše uvedené vlastnosti rodičovské linie, úspěšnost klonování je však relativně nízká (Gepstein, 2002). Navzdory optimalizovaným podmínkám kultivace a použití standardizovaného média přetrvává v kulturách hescs heterogenita, proto by měly být pravidelně testovány na přítomnost známek pluripotence, mezi něž patří aktivita alkalické fosfatázy, přítomnost specifických molekul buněčného povrchu (SSEA3, SSEA4, TRA1-60, TRA1-81, E-cadherin) a exprese charakteristických transkripčních faktorů, např. Nanog, Oct3/4, Sox2. Možnosti uplatnění hescs ve výzkumu zahrnují zdokonalení znalostí o lidském vývoji a biologii, použití v regenerativní medicíně, pomoc při objevování nových léčiv a testování 29

30 toxicity (Liu et al., 2013). Nedávno publikovaný postup získání hescs metodou SCNT nyní nově umožňuje také přípravu hescs specifických pro libovolného konkrétního jedince. Takto odvozené hescs budou odrážet konkrétní genetické pozadí, což otevírá nové možnosti využití hescs nejen v personalizované medicíně, ale také při studiu vlivu genetických faktorů na působení toxických látek a léčiv. Studie, ve kterých byly linie hescs využity pro testování toxicity, jsou uvedeny v Tabulce 3; Tabulka 4 znázorňuje přehled některých pesticidů a environmentálních toxikantů, jejichž účinky byly testovány na myších ESCs. Nevýhodou použití linií hescs jsou však kontroverze související s jejich přípravou a izolací, která zahrnuje destrukci in vitro vytvořených časných lidských embryí ve stadiu blastocysty. Zpravidla se k přípravě hescs používají přebytky oplozených vajíček z procesů reprodukční in vitro fertilizace, případně jsou blastocysty záměrně vytvořeny pro účely výzkumu in vitro fertilizací nebo technikou SCNT. Jejich ničení je však podle některých názorů morálně a eticky nepřijatelné. Zatímco indukované pluripotentní a dospělé kmenové buňky jsou považovány za klinický materiál a takové kontroverze nevyvolávají, etické znepokojení související s používáním hescs v některých zemích zpomalilo nebo dokonce zastavilo jejich výzkum (Brock, 2006; Brock, 2010; Chervenak & McCullough, 2008; Robertson, 2001). Obrázek 1: Zdroje kmenových buněk a jejich diferenciační potenciál (Hook, 2012; upraveno). 30

31 Tabulka 3: Přehled vybraných studií toxicity návykových látek, léčiv a environmentálních polutantů provedených na hescs Linie SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference SA002 kardiomyocyt doxorubicin uvolnění srdečního troponinu T, protein 3 vázající mastné kyseliny Andersson et al. (2010) H9-10 vzorků náplní elektronických cigaret, propylenglykol, rostlinný glycerin cytotoxicita (křivka dávka odpověď) Behar et al. (2012) HES3 kardiomyocyt chinidin, D,L-sotalol trvání potenciálu elektrického pole v závislosti na dávce Braam et al. (2010) - neuron (hn2 TM ) methylrtuť, kyselina retinová, bisindolylmaleimid, octan olovnatý, U0126, dexametazon, sodná sůl sacharinu, paracetamol, glyfosát, dimethylftalát, amoxicilin, D-sorbitol cytotoxicita (počet neuronů), počet a délka neuritů Harrill et al. (2011) KhES-3 neurální diferenciace methylrtuť hladina mrna genů kódujících markery nervových prekurzorů (PAX6, EMX2, HOXB4, MAP2, NODAL, NANOG), životaschopnost buněk, délka a hustota neuritů v diferencujících buňkách He et al. (2012) H9 - kouř z tradičních cigaret a z cigaret se sníženou škodlivostí morfologie hescs, apoptóza Lin et al. (2010) H1, H9 neurální diferenciace ethanol proliferace, apoptóza, exprese a funkce GABA receptoru, výskyt neuronů, astrocytů a oligodendrocytů po následné diferenciaci bez přítomnosti ethanolu Nash et al. (2012) HUES-7, HUES-9 - penicilin-g, kofein, hydroxymočovina adheze buněk, morfologie a životaschopnost embryoidních tělísek, změny proliferace a apoptózy v průběhu buněčného cyklu, exprese genů kódujících specifické markery kmenovosti a zárodečných vrstev, diferenciace, hladina hormonů v diferencujících buňkách (choriový gonadotropin-β, progesteron, estradiol) Pal et al. (2011) 31

32 Tabulka 3 pokračování: Přehled vybraných studií toxicity návykových látek, léčiv a environmentálních polutantů provedených na hescs Linie SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference HUES-7, HUES-9 hepatocyt ethanol životaschopnost buněk, hladina mrna genů kódujících markery jednotlivých stadií diferenciace (Rex1, Oct-4, Nanog, HNF-3β, SOX-17, GATA-6, GATA-4, HNF-4α, CK-18, TDO, albumin, G6P, CYP3A4), hladina sekretovaných proteinů spojených s normálním vývojem a funkcí jater (AFP, SGOT, SGPT, GGT), morfologie buněk, změny cytoskeletu Pal et al. (2012) H1 neurální diferenciace methylrtuť hladina mrna genů kódujících markery nervových prekurzorů (NCAM1, NEUROD1, MAP2) v diferencujících buňkách Stummann et al. (2009) H9 neuroprogenitorová buňka ethanol proliferace, přežití buněk, hladina mrna genů kódujících markery jednotlivých stadií diferenciace (AFP, NANOG, PAX6, SOX2, nestin, Tuj1, MAP2, GFAP, Olig1, GalC), morfologie buněk, změny cytoskeletu Talens-Visconti et al. (2011) SA002 hepatocyt 2-nitrofluoren, benzo[a]pyren, 4- (methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1- butanon, aflatoxin B1, monohydrát cyklofosfamidu, hydrochlorid methapyrilenu, piperonylbutoxid, sodná sůl fenobarbitalu, pirinixová kyselina, tetradekanoyl forbol acetát, sodná sůl diklofenaku, D-mannitol, nifedipin, hydrochlorid klonidinu, tolbutamid změny exprese 592 genů vlivem karcinogenního působení chemických látek, odpověď 37 biochemických drah na karcinogenní působení látek vedoucí ke změně signální dráhy proteinu p53, poškození DNA a indukci apoptózy Yildirimman et al. (2011) 32

33 Tabulka 3 pokračování: Přehled vybraných studií toxicity návykových látek, léčiv a environmentálních polutantů provedených na hescs Linie SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference KhES-1 kardiomyocyt isoprenalin, adrenalin, propranolol, prokainamid, mexiletin, flekainid, verapamil, amiodaron tepová frekvence, kontrakce buněk Yokoo et al. (2009) H7, H9 - nikotin buněčná adheze, morfologie kolonií, apoptóza, exprese integrinu a markerů pluripotence Zdravkovic et al. (2008) Tabulka 4: Přehled vybraných studií toxicity environmentálních polutantů, pesticidů a léčiv provedených na myších ESCs Linie SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference D3 neurální diferenciace chlorpyrifos, chlorpyrifos-oxon, 3,5,6-trichloro-2-pyridinol životaschopnost buněk, enzymatická aktivita acetylcholinesterázy a neurotoxické esterázy, exprese genů kódujících markery jednotlivých stadií diferenciace Estevan et al. (2013) B6G-2 neurální diferenciace methylrtuť hladina mrna genů kódujících markery nervových prekurzorů (PAX6, EMX2, HOXB4, MAP2, NODAL, NANOG), životaschopnost buněk, délka a hustota neuritů v diferencujících buňkách He et al. (2012) R1 kardiomyocyt TCDD exprese genů kódujících markery diferenciace a detoxifikačních enzymů fáze I i II, celková genová exprese, ultrastruktura kardiomyocytů, produkce ATP, imunolokalizace sarkomerových proteinů (α-aktinin, těžký řetězec β-myozinu, srdeční troponin T) Neri et al. (2011) 33

34 Tabulka 4 pokračování: Přehled vybraných studií toxicity environmentálních polutantů, pesticidů a léčiv provedených na myších ESCs Linie SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference D3 kardiomyocyt, osteoblast metotrexát exprese genů kódujících markery diferenciace (Oct-4; Brachyury; Nkx2.5; těžký řetězec α myozinu; Cbfa1; Osteocalcin), růst embryoidních tělísek Pellizzer et al. (2004) D3 - paraquat proliferace, životaschopnost, aktivita alkalické fosfatázy, množství reaktivních forem kyslíku Perla et al. (2008) D3 neuron methylrtuť morfologie buněk, exprese genů kódujících markery jednotlivých stadií diferenciace (SSEA1, nestin, βiii-tubulin) Theunissen et al. (2010) WD44, J1 - TCDD exprese 75 homeoboxových genů; změny exprese genů kódujících: proteiny a cytokiny; růstové faktory regulující buněčný cyklus; vývoj hematopoetických, mezenchymálních, kardiovaskulárních a neurálních buněčných linií; genů pro Notch a Wnt signální dráhy a genů potřebných pro sebeobnovu; diferenciace do kardiomyocytů Wang et al. (2010) 34

35 Izolace myších ESCs, která byla provedena již roku 1981 (Stein et al., 2011), umožnila pokrok v buněčné a vývojové biologii (Wobus & Boheler, 2005). Tyto se od hescs liší v několika vlastnostech: (1) doba zdvojení populace myších ESCs (12 hodin) je podstatně kratší než u hescs (36 hodin); (2) živnou vrstvu z MEF lze nahradit leukemickým inhibičním faktorem; (3) v myších ESCs nedochází k expresi subtypů etapově specifických embryonálních antigenů (SSEA-3, SSEA-4), které jsou přítomny v hescs. Tyto odchylky mohou představovat rozdíly mezi druhy, rozdíly mezi buněčnými liniemi nebo rozdíly v metodách in vitro kultivace (Gepstein, 2002). 4.2 Dospělé kmenové buňky Dospělé kmenové buňky (ASCs adult stem cells) nebo také tkáňově specifické kmenové buňky byly prvním typem kmenových buněk, které byly objeveny pro použití v klinické terapii. Ačkoli existuje mnoho typů ASCs, nebyly nalezeny ve všech lidských tkáních a orgánech. Nacházejí se například v kostní dřeni, kůži, svalovině, tukové tkáni a mozku (Obr. 1). V těchto tkáních a orgánech slouží k tvorbě nových, zdravých buněk, které nahrazují poškozené buňky (Stein et al., 2011) a k udržení homeostázy (Davila et al., 2004). Z dospělých jedinců lze nejsnáze izolovat mezenchymální kmenové buňky nacházející se v kostní dřeni (BM-MSCs - bone marrow-derived stromal mesenchymal stem cells) nebo v tukové tkáni (AT-MSCs - adipose tissue-derived mesenchymal stem cells), případně hematopoetické kmenové buňky z kostní dřeně (BM-HSCs - bone marrow hematopoietic stem cells). Unikátním zdrojem ASCs je pupečníková krev, jejíž kmenové buňky bývají označovány jako UCB-SCs (umbilical cord blood stem cells). Rovněž v pupečníkové krvi existují jak hematopoetické (UCB-HSCs - UCB-hematopoietic stem cells), tak mezenchymální (UCB-MSCs - UCB-mesenchymal stem cells) kmenové buňky (Ghaderi et al., 2011). Dalšími perspektivními zdroji mezenchymálních kmenových buněk jsou placenta (PD-MSCs - placenta-derived mesenchymal stem cells; Lee et al., 2012) nebo amniocentézou získaná plodová voda (AF-MSCs - amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells). Zatímco hematopoetické kmenové buňky jsou využívány v klinické terapii pro účely transplantace a regenerativní medicíny, mezenchymální kmenové buňky mají větší schopnost proliferace a diferenciace a po indukci specifickými diferenciačními faktory slouží jako zdroj hepatocytů, osteoblastů, adipocytů, chondrocytů a nervových buněk, které mohou být dále využity 35

36 v toxikologii a ve výzkumu léčiv (Ali & Bahbahani, 2010). Diferenciační potenciál ASCs je však v porovnání s hescs většinou omezený na tvorbu buněčných typů tkáně, ze které pocházejí (Hook, 2012). Spíše než jako pluripotentní jsou tedy klasifikovány jako multipotentní (Stein et al., 2011). Přesto existují důkazy, že ASCs pocházející z mezenchymálních tkání mohou po specifické in vitro indukci překonat hranice svého původu a diferencovat do buněk endodermu (např. hepatocytů) nebo ektodermu (např. nervových buněk). Nevýhodou je však dosud nízká reprodukovatelnost a účinnost této technologie. Pouze nízké procento mezenchymálních ASCs je dostatečně plastické, aby si osvojilo fenotyp jaterní nebo nervové buňky (Snykers et al., 2009). Snykers et al. (2009) ve svém článku uvedli přehled úspěšně diferencovaných ASCs, získaných ze zvířat i od dárců, do hepatocytů. Nervové buňky byly úspěšně diferencovány ze stromálních buněk kostní dřeně lidí a hlodavců, rešerši provedených studií zpracovali Chen et al. (2006), zatímco Kokai et al. (2005) a Lambert et al. (2009) ve svých pracích uvedli shrnutí provedených studií týkajících se úspěšného odvození nervových buněk od ASCs získaných z adipocytů. Přestože v in vitro podmínkách je obtížné ASCs udržovat (Stein et al., 2011) a jejich schopnost sebeobnovy je omezená (Hook, 2012), jsou ASCs i od nich odvozené diferencované buňky často využívány pro hodnocení toxicity environmentálních polutantů (např. pesticidy, těžké kovy, POPs) a léčiv (např. paracetamol, salinomycin). Vybrané příklady linií, které se podařilo izolovat z ASCs a využít pro účely testování, jsou zmíněny v Tabulce 5, která uvádí studie na myších ASCs, zatímco Tabulka 6 předkládá výsledky testování látek na lidských ASCs. Tabulka 5: Přehled vybraných studií toxicity environmentálních polutantů provedených na myších ASCs Původ SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference mezenchymální kmenové buňky z kostní dřeně neurální diferenciace olovo proliferace, neuronální diferenciace Kermani et al. (2008) jaterní buňky WB-F344 - TCDD modulace růstu buněk Munzel et al. (1996) 36

37 Tabulka 6: Přehled vybraných studií toxicity environmentálních polutantů, pesticidů, léčiv a mykotoxinu provedených na lidských ASCs Původ SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference pupečníková krev neuroprogenitorová buňka teluričitan sodný, methylrtuť, chlorid kademnatý, chlorpyrifos, D,L-glutamát, paracetamol, theofylin proliferace, přežití buněk, apoptóza, diferenciace do neuronů a glií Buzanska et al. (2009) CD34+ buňky z pupečníkové krve - šestimocný chrom, kadmium přežití buněk, tvorba buněčných shluků, změny subbuněčných struktur (autofagozomy, Golgiho komplex, drsné endoplazmatické retikulum, mitochondrie, lipidové kapénky, jádro) Di Gioacchino et al. (2008) nervové kmenové buňky - PCB-118, PCB-126 endokrinní disrupce homeostázy thyroidního hormonu - výskyt oligodendrocytů v průběhu diferenciace, který je ovlivněn expresí genů kódujících thyroidní a retinoidní (RAR, RXR) receptory Fritsch et al. (2005) mezenchymální kmenové buňky a CD34+ buňky z pupečníkové krve hepatocyt aflatoxin B1 rozsah poškození DNA Ghaderi et al. (2011) kmenové buňky z plodové vody - methylrtuť, octan olovnatý proliferace, velikost buněk, apoptóza, exprese cyklinu A a inhibitoru p27 cyklin-dependentní kinázy Gundacker et al. (2012) mezenchymální kmenové buňky z kostní dřeně stehenní kosti diferenciace do osteoblastů a adipocytů chlorpyrifos, karbofuran morfologie, přežití, proliferace buněk a jejich diferenciace do osteoblastů a adipocytů Hoogduijn et al. (2006) 37

38 Tabulka 6 pokračování: Přehled vybraných studií toxicity environmentálních polutantů, pesticidů, léčiv a mykotoxinu provedených na lidských ASCs Původ SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference kmenové buňky z epitelu prostaty - kombinace testosteronu a 17βestradiolu patologie prostaty (epiteliální hyperplazie, intraepiteliální neoplazie, rakovina) vedoucí k postupné hormonální karcinogenezi Hu et al. (2011) HL1-1 linie kmenových buněk z jater - TCDD změny exprese 6995 genů v závislosti na času a dávce Kim et al. (2009) kmenové buňky z tukové tkáně progenitorová buňka, dospělý adipocyt TCDD, PCB-126, PCB-153 změny exprese genů kódujících buněčné dráhy souvisejích s rakovinou, metabolismem a zánětlivou (imunitní) odpovědí Kim et al. (2012) mezenchymální kmenové buňky z kostní dřeně adipocyt TCDD hladina mrna genů kódujících vybrané markery zánětu a diferenciace adipocytů, množství lipidů akumulovaných v diferencovaných adipocytech Li et. al. (2008) mezenchymální kmenové buňky z kostní dřeně diferenciace do osteoblastů a adipocytů salinomycin životaschopnost buněk, změny markerů buněčného povrchu (CD90, CD73, CD44, CD31), migrace buněk, tvorba sféroidů, diferenciace do adipocytů a osteocytů Scherzed et al. (2013) mezenchymální kmenové buňky z aspirátů kostní dřeně hřebene kosti kyčelní - benzen, hydrochinon, p- benzochinon životaschopnost buněk, apoptóza, změny exprese genů ovlivňujících diferenciaci, navádění a udržování kmenových buněk krvetvorby (CXCL12, WNT5A, KITLG, RUNX2, DKK1, JAG1), aktivita kaspázy3/7 Zolghadr et al. (2012) 38

39 4.3 Indukované pluripotentní kmenové buňky Indukované pluripotentní kmenové buňky (ipscs induced pluripotent stem cells) vznikají přeprogramováním somatických (dospělých kmenových) buněk do nediferencovaného pluripotentního stavu pomocí transdukce několika transkripčními faktory (Obr. 1) (Chapin & Stedman, 2009), např. Oct4, Sox2, c-myc, Klf4 a Nanog (Vojnits & Bremer, 2010). Myší ipscs byly poprvé vytvořeny přeprogramováním myších fibroblastů retrovirální transdukcí v roce 2006 (Takahashi & Yamanaka, 2006), o rok později následovalo úspěšné vytvoření lidských ipscs (Takahashi et al., 2007). Za objev, že dospělé buňky mohou být přeprogramovány zpět do pluripotentního stavu, obdržel Shinya Yamanaka roku 2012 Nobelovu cenu za fyziologii nebo lékařství. Existuje však několik problémů, které omezují rutinní používání lidských ipscs. Genetické (bodové mutace, delece a duplikace; Hook, 2012) a epigenetické změny (změny v methylaci DNA, abnormální změny histonů, inaktivní stav chromozomu X a paměť buňky, kterou byla ipsc v dřívějším životě, např. fibroblastem, uchovaná v jejím epigenomu; Liu et al., 2013) vyvolané různými virovými a molekulárními vektory se podařilo eliminovat používáním technik, které nevyžadují stálé začlenění cizorodého genetického materiálu do genomu hostitelské buňky při procesu přeprogramování. Nízká účinnost a pouze částečné přeprogramování, genetická nestabilita vytvořených buněk a tvorba nádorů po navrácení ipscs zpět do organismu (Wobus & Loser, 2011) způsobená indukovanou expresí pluripotentních faktorů vedoucí k abnormální regulaci proliferace (Stein et al., 2011) jsou však překážky, které se zatím nepodařilo odstranit. Přesto pluripotence vyvolaná přeprogramováním otvírá nové možnosti pro regenerativní medicínu, výzkum patogeneze, testování toxicity a vývoj léčiv (Wobus & Loser, 2011). Příprava hipscs navíc není eticky kontroverzní a použití hipscs tak není spojeno s etickými a legálními omezeními, které provázejí toxikologické testy založené na hescs (Vojnits & Bremer, 2010). Přehled některých linií hipscs, které byly využity pro testování toxicity léčiv a návykových látek, je uveden v Tabulce 7. 39

40 Tabulka 7: Přehled vybraných studií toxicity léčiv a návykových látek provedených na hipscs Linie / původ SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference - kardiomyocyt ouabain, digoxin změny potenciálu elektrického pole, změny tepové frekvence Guo et al. (2011) - (fibroblasty pacienta trpícího geneticky podmíněným syndromem dlouhého QT intervalu - typ 2) kardiomyocyt E4031, cisaprid, nifedipin, pinacidil, ranolazin, isoprenalin doba trvání akčního potenciálu, elektrofyziologické vlastnosti kardiomyocytů, amplituda rychle se aktivující složky draslíkového proudu v kardiomyocytech Itzhaki et al. (2011) - (fibroblasty pacienta trpícího geneticky podmíněným syndromem dlouhého QT intervalu - typ 2) kardiomyocyt D,L-sotalol, E4031, cisaprid, erythromycin, isoprenalin doba trvání akčního potenciálu Lahti et al. (2012) - neuron ethanol aktivita receptoru NMDA Lieberman et al. (2012) - (fibroblasty pacienta trpícího geneticky podmíněným syndromem dlouhého QT intervalu - typ 2) kardiomyocyt E4031, isoprenalin, nadolol, propranolol, nicorandil, PD doba trvání akčního potenciálu Matsa et al. (2011) - (fibroblasty pacienta trpícího geneticky podmíněným syndromem dlouhého QT intervalu - typ 1) kardiomyocyt isoprenalin, propranolol doba trvání akčního potenciálu Moretti et al. (2010) - (somatické buňky pacienta trpícího geneticky podmíněným Timothyho syndromem) neuron roscovitin exprese tyrosin hydroxylázy a MAP2 v neuronech Pasca et al. (2011) 40

41 Tabulka 7 pokračování: Přehled vybraných studií toxicity léčiv a návykových látek provedených na hipscs Linie / původ SCs Cílový typ buňky Testovaná látka Hodnocený parametr Reference - kardiomyocyt isoprenalin, adrenalin, verapamil, Bay K 8644, propranolol, doxazosin, digoxin, tetrodotoxin, lidokain, chinidin, astemizol, cisaprid, terfenadin, pentamidin, pimozid, nifedipin, isradipin, dopamin, acetylcholin, doxorubicin, imatinib, staurosporin tepová frekvence, kontrakce buněk, intracelulární tok vápníku Sirenko et al. (2013) - neuron methyl-β-cyklodextrin snížení hladiny cholesterolu v buňkách, životaschopnost buněk Swaroop et al. (2012) Dotcom hepatocyt allopurinol, amiodaron, benzbromaron, cyklizin, dantrolen, desipramin, disulfiram, erythromycin, felbamát, flutamid, isoniazid, klozapin, labetalol, leflunomid, maprotilin, nefazodon, nitrofurantion, paracetamol, sulindac, takrin, tebinafin, tolkapon, troglitazon, zafirlukast životaschopnost buněk Takayama et al. (2013) 201B7 kardiomyocyt E-4031, verapamil, chinidin, isoprenalin změny tvaru vlnové křivky potenciálu elektrického pole (field potential waveform) Tanaka et al. (2009) - (fibroblasty pacienta trpícího geneticky podmíněným Timothyho syndromem) kardiomyocyt roscovitin účinky na načasování a amplituda spontánních přechodových jevů Ca 2+ v kardiomyocytech, doba trvání akčního potenciálu Yazawa et al. (2011) 201B7 kardiomyocyt isoprenalin, adrenalin, propranolol, prokainamid, mexiletin, flekainid, verapamil, amiodaron tepová frekvence, kontrakce buněk Yokoo et al. (2009) hfib2 kardiomyocyt chinidin, E4031, chromanol 293B, verapamil doba trvání potenciálu elektrického pole v závislosti na dávce Zwi et al. (2009) 41

42 Jelikož hipscs mohou být vytvářeny přeprogramováním somatických buněk pocházejících přímo od konkrétního pacienta, mají tedy nejen potenciál překonat komplikace spojené s kompatibilitou transplantátů (Hook, 2012), ale otevírají také nové možnosti pro porozumění genetickým faktorům, které spolu s environmentálními faktory přispívají k odpovědi jednice na léčivo nebo chemikálii (Chapin & Stedman, 2009). Shrnutí typů kmenových buněk a jejich znaků je uvedeno v Tabulce 8. Tabulka 8: Typy kmenových buněk a jejich znaky (Stein et al., 2011) Typ kmenové buňky Etické problémy Odmítnutí imunitním systémem Tvorba nádorů Tvorba buněk / tkání Dostupnost hescs IVF Ano Ano Ano Všechny Mnoho linií hescs - SCNT Ano Ne Ano Všechny Dosud omezená hascs Ne Ne Ne Omezeně Mnoho linií (omezeně typů) hipscs Ne Ne Ano Všechny Mnoho linií hescs IVF: lidské embryonální kmenové buňky připravené metodou fertilizace in vitro; hescs SCNT: lidské embryonální kmenové buňky připravené metodou transferu jádra somatické buňky; hascs: lidské dospělé kmenové buňky; hipscs lidské indukované kmenové buňky 42

43 5 Využití kmenových buněk pro testování toxicity Při zkoumání účinků nových léčiv a škodlivého vlivu chemikálií na zdraví a vývoj savců jsou laboratorní zvířata neocenitelným zdrojem informací. Nicméně jejich schopnost předpovídat toxické důsledky v lidských bytostech je omezená. Některé chemikálie se na základě testování na zvířatech zdály být bezpečné, zatímco v člověku způsobovaly závažnou toxicitu a vrozené vady, pravděpodobně nejznámějším případem jsou dramatické následky thalidomidu (Kim & Scialli, 2011). Proto je stále naléhavěji vyžadováno vytvoření modelů majících větší prediktivní schopnost a umožňujících mechanistické pochopení účinku chemických látek. Při studiu nežádoucích účinků toxikantů a léčiv realizovaném na nediferencovaných embryonálních nebo dospělých kmenových buňkách se sleduje např. způsob dělení buněk, geny a signalizační dráhy, které jej ovlivňují, nebo mezerové spoje mezi buňkami (gap junctions). HESCs mohou být využity pro hodnocení chemických látek způsobujících úmrtí embrya nebo vznik a vývoj vrozených vad, zatímco ASCs nacházejí uplatnění při testování látek vyvolávajících zhoubné rakovinné bujení, protože jsou zřejmě cílovými buňkami v iniciační fázi procesu karcinogeneze (Kang & Trosko, 2011). Diferencované buňky nebo tkáně pocházející z multipotentních nebo pluripotentních kmenových buněk také otevírají nové možnosti pro farmakologické a toxikologické studie. Mohly by vylepšit testy účinnosti léčiv a nahradit mnoho laboratorních zvířat používaných pro testování toxicity. Proto jsou vyvíjeny diferenciační postupy pro buněčné typy nejvíce náchylné k toxickým účinkům léčiv, jako jsou hepatocyty, kardiomyocyty a nervové buňky. Ačkoli stále není jasné, do jaké míry jsou tyto postupy zdrojem zcela dospělých, funkčních buněk, které svými vlastnostmi reprezentují normální diferencované buňky organismu, některé základní in vitro testy už byly optimalizovány a jsou ve stále větší míře používány pro výzkum léčiv. Vedle farmakologického výzkumu a studia nežádoucích účinků vyvíjených léků by však in vitro modely založené na kmenových buňkách mohly být adaptovány a využity také pro účely studia a hodnocení toxicity chemických látek významných v životním prostředí (Liu et al., 2013). 43

44 5.1 Hepatotoxicita Játra, jejichž veškeré funkce vykonávají speciální buňky hepatocyty, jsou primárním orgánem metabolismu cizorodých látek a často jsou ovlivněna jejich toxicitou. Mezinárodní průzkum provedený mezi farmaceutickými společnostmi týkající se hodnocení toxicity léčiv odhalil jen malou (~55%) shodu mezi hepatotoxicitou pozorovanou u pokusných zvířat a u lidí (Olson et al., 2000). Proto farmaceutický průmysl usiluje o vývoj spolehlivějších a relevantnějších in vitro modelů pro studium jaterního metabolismu a testování toxicity nově vyvíjených léčiv. Uplatnění podobných konceptů a přístupů se předpokládá také v dalších odvětvích toxikologie (Baxter et al., 2010) Modely pro testování hepatotoxicity V současnosti často používaným jaterním in vitro modelem jsou izolované primární lidské hepatocyty, které exprimují všechny enzymy a transportéry metabolismu léčiv (Szebenyi et al., 2011). Jak již bylo zmíněno v podkapitole 3.3.2, jejich hlavním nedostatkem je limitovaná dostupnost, omezená proliferační schopnost, rychlá dediferenciace a značná variabilita (Scott et al., 2013). Primární lidské hepatocyty se mohou lišit od izolace k izolaci v závislosti na zdravotním stavu, stravovacích zvycích a prodělané léčbě dárce, genetickém polymorfismu mezi dárci a expresi genů kódujících proteiny cytochromu P450 (CYP450), což může ovlivnit reprodukovatelnost výsledků (Wobus & Loser, 2011). Buněčné linie odvozené od lidských hepatocelulárních karcinomů, používané pro výzkum metabolismu léčiv a toxicity, jsou alternativou k primárním hepatocytům. Projevují však pouze slabou expresi genů specifických pro hepatocyty a žádnou nebo slabou aktivitu enzymů rodiny CYP450, které jsou klíčové v první fázi biotransformace. Proto je jejich využití jen omezené (Wobus & Loser, 2011). Ideálním řešením se zdají být buňky podobné hepatocytům odvozené od kmenových buněk, které exprimují plazmové transportéry a enzymy první i druhé fáze biotransformace. Nejvyšší aktivita těchto enzymů byla zaznamenána u buněk podobných hepatocytům odvozených od ESCs, ve srovnání s primárními hepatocyty je ale stále velmi nízká (Guguen- Guillouzo et al., 2010). Většina diferenciačních strategií je založena na in vitro napodobení vývojových procesů a vyžaduje použití rozpustných růstových faktorů, společnou kultivaci s jaterními i nejaterními buněčnými typy, rekonstrukci extracelulární matrix a přítomnost butyrátu sodného. Odvození buněk podobných hepatocytům od hescs zahrnuje tři 44

45 významné kroky: (1) odvození definitivního endodermu z hescs, (2) specifikace do jaterních progenitorových buněk a (3) dozrávání do buněk podobných hepatocytům (Obr. 2) (Wobus & Loser, 2011). Obrázek 2: Schéma znázorňující vzájemnou souvislost mezi diferenciací lidských pluripotentních kmenových buněk do buněk jater v in vivo a in vitro podmínkách. In vitro diferenciace napodobuje vývojové procesy, které se odehrávají v průběhu embryogeneze. Tato skutečnost je znázorněna pomocí příkladů genů (markerů) exprimovaných v jednotlivých stadiích vývoje, resp. diferenciace (Baxter et al., 2010; upraveno). Funkčnost diferencovaných hepatocytů odvozených od kmenových buněk bývá potvrzena prokázáním exprese specifických proteinových markerů, jako jsou cytokeratiny, GATA vazebné proteiny, alfa-fetoprotein a albumin a funkčními testy, např. syntéza močoviny a aktivita cytochromu P450. Mezi další ukazatele zralých hepatocytů patří ukládání glykogenu, příjem lipoproteinů o nízké hustotě a příjem indocyaninové zeleně. Kvantitativní stanovení těchto ukazatelů souvisejících s vývojem jater může být využito při testování hepatotoxicity (Kang et al., 2013; Kia et al., 2013). Nicméně odvození buněk podobných hepatocytům od hescs stále není příliš účinné a je třeba vyvinout další strategie a postupy, které by zajistily tvorbu dostatečně homogenních kultur (Wobus & Loser, 2011). Dalším omezením využití hepatocytů diferencovaných z hescs je jejich neschopnost postihnout fenotypické variace klíčových metabolických enzymů nacházejících se v populaci 45

46 (Kia et al., 2013), ačkoli tento problém by mohl být překlenut pomocí přípravy hescs metodou SCNT. Stejný způsob, jakým byly získány buňky podobné hepatocytům z hescs, může být využit i pro jejich odvození od ipscs, které umožňují robustnější diferenciaci hepatocytů než je tomu v případě hescs. Toto zjištění lze přičíst způsobu, jakým jsou buňky přeprogramovány, vyžaduje však ještě podrobnější zkoumání (Greenhough et al., 2010). HiPSCs dovolují vznik buněk podobných hepatocytům získaných z různých etnických skupin, polymorfních variant či jedinců s poškozením jater (Wobus & Loser, 2011) Klíčové enzymy metabolismu xenobiotik - cytochromy P450 Aktivita enzymů rodiny CYP450 má nezanedbatelný význam při inaktivaci či bioaktivaci léčiv a xenobiotik a při tvorbě toxických metabolitů, přesto je indukce těchto enzymů v buňkách podobných hepatocytům odvozených od pluripotentních kmenových buněk nekompletní. Žádné studie provedené na hepatocytech odvozených od hescs dosud neukázaly dostatečnou indukci enzymů CYP450 jako odpověď na známé referenční sloučeniny. Skutečná koncentrace enzymů byla kvantifikována jen vzácně a jejich aktivita se často nemohla rovnat čerstvě izolovaným primárním lidským hepatocytům (Baxter et al., 2010). Mezi různými studiemi, ve kterých byla hodnocena exprese genů kódujících enzymy rodiny CYP450 v buňkách podobných hepatocytům, existují značné rozdíly (Cai et al., 2007; Ek et al., 2007; Moore & Moghe, 2009). Ty mohou být způsobeny použitím různých linií hescs, užitím odlišných protokolů pro in vitro diferenciaci a kvalitou primárních lidských hepatocytů, které slouží jako referenční buňky. Proto by měla být zavedena jednotná forma prezentace dat (nikoli např. μg / miska) umožňující porovnávání mezi studiemi a zároveň by výsledky měly zahrnovat informace o kvalitě referenčních buněk (Wobus & Loser, 2011). Dohodnuté a sjednocené ukazatele diferenciace a dozrávání hepatocytů jsou rovněž nezbytné pro zajištění porovnatelných výsledků (Kia et al., 2013). Ačkoli se hepatocyty odvozené od pluripotentních kmenových buněk jeví jako vhodný model pro toxikologické a farmakologické studie, provází je několik omezení, která dosud nebyla zcela vyřešena. Stejně jako v případě primárních hepatocytů i odvozené hepatocyty podléhají po delší době dediferenciaci, což omezuje jejich použití pouze na krátkodobé mechanistické studie, zatímco většina negativních účinků toxikantů a zejména 46

47 léčiv se projevuje po chronické expozici. Proto neustále probíhají další in vitro studie, které by umožnily porozumět diferenciačním mechanismům (Kia et al., 2013). Ačkoli nelze očekávat, že by buňky podobné hepatocytům odvozené od pluripotentních kmenových buněk v nejbližší době plně nahradily všechna současná testování v toxikologické a farmaceutické praxi, jejich zařazení mezi běžně používané testy by mohlo vést aspoň ke snížení počtu používaných pokusných zvířat (Baxter et al., 2010). 5.2 Kardiotoxicita Modely pro testování kardiotoxicity Strategie využívaná v současné době pro hodnocení negativních účinků na srdce způsobených novými chemickými entitami a jejich metabolity je založena na systému, který se skládá z několika úrovní. V první fázi jsou použity jednotlivé buňky in vitro, potom následují ex vivo tkáně a orgány, in vivo zvířecí modely a nakonec klinické studie (Mandenius et al., 2011). In vitro modely využívají izolovanou srdeční tkáň (např. papilární svaly nebo Purkyňova vlákna získaná z morčat nebo psů) a primární kardiomyocyty z krys nebo psů. Tyto systémy jsou však pracné, někdy vysoce variabilní a vzhledem k vysokému počtu požadovaných pokusných zvířat jsou zdrojem etických problémů. Další buněčné in vitro modely vycházejí z heterologní exprese genu kódujícího draslíkový kanál v nehumánních i humánních buněčných liniích. Přestože je tento systém citlivý a může být využit pro HTS, neumožňuje simulaci specifického prostředí lidského srdce, a proto může poskytovat falešné pozitivní výsledky. Ex vivo modely jsou založené na použití explantovaných srdcí malých obratlovců, jako jsou krysy nebo morčata. Přestože se tyto modely srdcí blíží skutečnosti více než jiné systémy a umožňují zjištění kardiotoxických účinků na úrovni celé tkáně, překážkou stále zůstává jejich zvířecí původ, variabilita mezi jednotlivými pokusy a vysoké finanční náklady (Wobus & Loser, 2011). Stejné nevýhody provázejí i in vivo studie. Alternativním in vitro systémem pro hodnocení kardiotoxicity jsou pluripotentní kmenové buňky schopné diferencovat do kardiomyocytů. V současné době jsou využívány tři různé způsoby diferenciace hescs do buněk srdce. Nejrozšířenější variantou je spontánní nahromadění nediferencovaných buněk v suspenzní kultuře do trojrozměrných souborů nazývaných embryoidní tělíska. Tento proces je podmíněn přítomností kyseliny askorbové v definovaném patentovaném médiu, hypoxickými podmínkami a striktně definovaným 47

48 souborem růstových faktorů. Předpokládá se, že embryoidní tělíska rekapitulují některé gradienty růstových faktorů a mezibuněčné interakce, které se běžně nacházejí v lidském embryu (Mordwinkin et al., 2013). Typ akčního potenciálu (síňový, komorový nebo nodální) generovaný embryoidním tělískem závisí na typu převládajících kardiomyocytů, které jej tvoří (Wobus & Loser, 2011). Druhý možný způsob odvození kardiomyocytů je společná kultivace buněk odvozených od hescs společně s myšími stromálními nebo viscerálními buňkami endodermu. Třetí metoda je založena na jednovrstevné kultivaci kolonií odvozených od hescs na definovaném médiu a bez přítomnosti živné vrstvy. Napodobení embryogeneze in vivo zajišťuje přidání růstových faktorů ve specifických časových bodech in vitro diferenciace, což je definováno v příslušných diferenciačních protokolech (Wobus & Loser, 2011). V případě všech tří metod lze v kultuře kontraktilní buňky pozorovat po 8 12 dnech. Obdobné metody mohou být využity i pro diferenciaci hipscs do kardiomyocytů (Obr. 3) (Mordwinkin et al., 2013). Obrázek 3: Typy diferenciace hipscs do kardiomyocytů a možnosti využití těchto odvozených srdečních buněk (Gnecchi & Schwartz, 2012; upraveno) 48

49 5.2.2 Syndrom dlouhého QT intervalu V posledních letech se začaly množit zprávy o neočekávaných komorových arytmiích vyvolaných působením léčiv, které vedly k náhlému srdečnímu selhání. Následkem toho bylo z prodeje staženo množství léčiv a mnoho dalších muselo být označeno bezpečnostními štítky, které varovaly před potenciálním nebezpečím (Redfern et al., 2003). Tyto události přinutily farmaceutické regulační orgány k rozšíření požadavků na testování kardiotoxicity, zejména účinků nových chemických entit na srdeční elektrofyziologii (Mandenius et al., 2011). Základem srdečního tepu a základních srdečních funkcí jsou akční potenciály rytmické elektrické oscilace membránového potenciálu kardiomyocytů. Akční potenciály, šířící se ve formě vln, jsou výsledkem přenosu iontů přes plazmatickou membránu pomocí rozmanitých iontových kanálů. Jejich nesprávné fungování může vést ke změnám srdečního rytmu. Syndrom dlouhého QT intervalu, který je způsoben léčivy působícími jako blokátory iontových kanálů myokardu, může zvyšovat riziko vzniku komorových arytmií, jako je torsade de pointes, vedoucích až k náhlé smrti (Mordwinkin et al., 2013). Nicméně ovlivnění srdeční elektrofyziologie není jediný projev kardiotoxicity. Některé medikamenty mohou představovat hrozbu, aniž by přímo interagovaly s iontovými kanály. Vedlejší účinky některých léčiv mohou vést k tvorbě reaktivních kyslíkových radikálů, apoptóze, nebo pozměnění molekulární signalizace v buňce (Andersson et al., 2010). Kromě výše zmíněné srdeční arytmie vyvolané léčivy patří mezi projevy kardiotoxických účinků také změny kontraktility, ischémie a změny krevního tlaku. Hlavním cílem srdeční bezpečnostní farmakologie je rozvoj strategií, které by odhalily neočekávané prodloužení QT intervalu způsobené medikamenty již během raných fází vývoje léčiv, čímž by se zabránilo jeho zbytečnému a finančně náročnému pokračování (Wobus & Loser, 2011) Využití souborů miniaturních elektrod při testování kardiotoxicity Pro studium srdečních arytmií při syndromu dlouhého QT intervalu vyvolaného léčivy jsou využívány neinvazivní biosenzory umožňující dlouhodobý monitoring soubory miniaturních elektrod (MEA - microelectrode arrays), na kterých jsou srdeční buňky přímo kultivovány a které hodnotí akční potenciály kardiomyocytů (Liu et al., 2011). MEA umožňují HTS 96 nebo dokonce 384 chemických sloučenin současně a dnes jsou již komerčně 49

50 dostupné (Mordwinkin et al., 2013). Záznamy pořízené MEA se získávají pomocí integrovaných kovových elektrod, které dokážou zachytit potenciál elektrického pole vytvářený spontánně tlukoucími nebo elektricky stimulovanými shluky kardiomyocytů odvozených od hescs. Na misce MEA mohou být buňky kultivovány až 2 týdny, dlouhodobé záznamy umožňují monitorovat proces diferenciace a zrání. V okamžiku, kdy je stanoven dostatečně zralý fenotyp, může být zahájen pokus týkající se vztahu kumulativní dávka odpověď s rostoucími koncentracemi farmakologicky významného léčiva (Mandenius et al., 2011). Z výše uvedeného vyplývá, že in vitro testování kardiotoxicity založené na pluripotentních kmenových buňkách nachází uplatnění spíše ve farmakologii při studiu kardiotoxických efektů léčiv, než v hodnocení nepříznivých účinků environmentálních polutantů. Testování bezpečnosti a účinnosti léčiv pomocí vhodných modelů je velmi důležité, protože 40 % léčiv selže již v průběhu klinického testování a 19 % medikamentů bylo staženo z trhu v důsledku jejich kardiotoxicity (Deshmukh et al., 2012). Podle všeho však dosud nebyl validován žádný in vitro test založený na hescs, protože nebyla splněna některá důležitá kritéria. Srdeční buňky odvozené od hescs nejsou zcela zralé, a proto postrádají důležité vlastnosti dospělých kardiomyocytů, jako je plně funkční sarkoplazmatické retikulum a dostupnost systému T-tubulů. Dalším přetrvávajícím omezením je diferenciace kardiomyocytů do heterogenní populace obsahující síňové, komorové i nodální buňky. Přestože pro některé studie je vhodná tato směs buněk, jiné vyžadují čisté kardiomyocyty. Diferenciační protokoly se stále vylepšují a mezi jednotlivými laboratořemi se mohou lišit v parametrech, jako je složení média nebo způsob kultivace. Před vstoupením testovacích systémů založených na kardiomyocytech odvozených od hescs do procesu validace musí být stanoven standardní operační postup, který umožní porovnání výsledků získaných v různých laboratořích. Neméně důležitá je také mezioborová spolupráce mezi biology, techniky a vývojáři softwaru, protože kombinace biologického materiálu (tj. buněk a tkání) s platformou hardwaru (tj. snímacími čipy a mikrodetektory) není jednoduše proveditelná záležitost (Mandenius et al., 2011). 50

51 5.3 In vitro test embryotoxicity In vitro test embryotoxicity schválený Evropským centrem pro ověřování alternativních metod je jednou ze zástupných metod pro in vivo postupy testování toxických účinků na zárodek (Genschow et al., 2004). Test je výsledkem práce Horsta Spielmanna a jeho spolupracovníků (Spielmann et al., 1997). Využívá permanentní linie myších ESCs, které jsou podněcovány k diferenciaci do kontraktilních kardiomyocytů pomocí tvorby embryoidních tělísek. Po deseti dnech kultivace je rozsah diferenciace zhodnocen pomocí mikroskopu (van Dartel et al., 2010). Test je založen na hodnocení třech toxikologických ukazatelů a srovnání dat získaných třemi nezávislými testy: (1) morfologická analýza tlukoucích kardiomyocytů ve výrůstcích embryoidních tělísek odvozených z myších ESCs a stanovení takové koncentrace chemické látky, která způsobí 50 % inhibici diferenciace srdečních buněk; (2) cytotoxické účinky na nediferencované ESCs a (3) cytotoxické účinky na 3T3 fibroblasty. U posledních dvou zmiňovaných se zjišťuje koncentrace látky, která způsobuje 50 % inhibici proliferace. Na základě získaných dat jsou poté vytvořeny křivky koncentrace odpověď a s pomocí biostatistických predikčních modelů jsou testované chemické látky rozděleny do tří tříd: látky nezpůsobující embryotoxické účinky, látky slabě embryotoxické a silně embryotoxické (Wobus & Loser, 2011). Nicméně i tento test má řadu nevýhod, mezi něž patří subjektivní vyhodnocení kontraktilních kardiomyocytů, délka trvání kultivace a omezený základ existujících predikčních modelů z hlediska testovaných sloučenin (van Dartel et al., 2010). Přestože se in vitro test embryotoxicity osvědčil jako spolehlivý, není zcela vhodný pro testování chemikálií, které ovlivňují diferenciaci jiných než srdečních tkání, protože hodnoceným ukazatelem je (kromě cytotoxicity) pouze inhibice diferenciace myších ESCs do kardiomyocytů. Methylrtuť a sloučeniny těžkých kovů, jako je kadmium a arsen, byly chybně klasifikovány jako látky nepůsobící embryotoxicky, přestože v in vivo podmínkách jsou velmi toxické (Genschow et al., 2004). Zařazení dalších toxikologických ukazatelů, jako je například neuronová a kosterní diferenciace, by umožnilo zdokonalit prediktivní sílu testu a rozšířit jeho oblast použitelnosti (Stummann et al., 2008). 51

52 5.4 Neurotoxicita Modely pro testování neurotoxicity In vitro modely pro studium vývoje nervové soustavy a chemických účinků na ni byly do nedávna omezené na transformované buněčné linie lidí nebo hlodavců, které byly získané z nádorů, a nepředstavovaly proto skutečný stav původních nervových buněk. Jiné studie využívaly primární buňky centrální nervové soustavy hlodavců, tyto kultury však zahrnovaly populace postmitotických (tj. po svém vzniku se již nedělících) neuronů, a proto se nehodily pro výzkum časných vývojových procesů. Navíc primární buňky, nemajíc schopnost sebeobnovy, musely být vždy připravovány z čerstvých zvířecích tkání. Z lidkých embryí a operací mozku lze získat pouze omezené množství nervové tkáně. Je zřejmé, že všechny výše uvedené modely vykazovaly značné nedostatky. Pro zajištění vysoké úrovně předvídání vývojové neurotoxicity je nutné, aby použité modely shrnovaly důležité procesy rozvoje nervového systému, jako je proliferace, migrace, diferenciace a synaptogeneze. Pro tyto účely jsou vhodné pluripotentní kmenové buňky (ESCs a ipscs) a dospělé nervové kmenové buňky (NSCs neural stem cells), někdy označované jako neuroprogenitorové buňky (Breier et al., 2010). Zkoumání vývojové neurotoxicity in vitro umožňuje rekapitulace neurogeneze pomocí hescs. Jednotlivé kroky neurogeneze hescs jsou: (1) diferenciace hescs do NSCs, které si zachovávají proliferační a diferenciační potenciál a (2) diferenciace NSCs do neuronů (Bosnjak, 2012). Terminálně diferencované neurony odvozené od ESCs vykazují podobné funkční vlastnosti jako primární buňky, jsou však životaschopnější a při kultivaci ve vhodných podmínkách vytvářejí složité sítě neuronů a glií (Rolletschek et al., 2004). IPSCs mohou dát vznik nervovým progenitorovým i terminálně diferencovaným buňkám a stejně jako v případě hodnocení hepatotoxicity a kardiotoxicity umožňují ipscs získané od různých dárců studovat vliv rozmanitých genetických pozadí na neurotoxicitu. Nicméně nevýhodou tohoto in vitro modelu je omezená schopnost napodobit složité extracelulární prostředí, rozmanitost a organizaci různých nervových a gliových buněčných typů a propojení a aktivitu nervových obvodů, které se nacházejí in vivo (Kumar et al., 2012). Multipotentní nervové kmenové buňky jsou přítomny ve vyvíjejícím se i dospělém mozku, z něhož mohou být izolovány a následně kultivovány. Jsou schopny diferencovat do neuronů, astrocytů a oligodendrocytů (Obr. 4). Za přítomnosti epidermálního růstového 52

53 faktoru se vytvářejí shluky vzájemně interagujících NSCs nazývané neurosféry trojrozměrné, heterogenní, samoregulační buněčné systémy (Breier et al., 2010). Tento model umožňuje různými způsoby studovat vliv chemických látek na časný i pokročilý vývoj lidské nervové soustavy, mezi hodnocené ukazatele patří například proliferace buněk, migrace buněk, exprese buněčně specifické mrna a proteinů a elektrofyziologické reakce (Coecke et al., 2007). Neurální diferenciace byla navozena u mezenchymálních kmenových buněk a rovněž využita ke studiu toxických účinků chemických látek (Tabulka 5 a 6). Nejčastější testovanou sloučeninou působící toxicky na neuroprogenitorové buňky je pravděpodobně ethanol, zkoumají se však i neurotoxické účinky methylrtuti, olova a polychlorovaných bifenylů (Breier et al., 2010). Obrázek 4: Zdroje nervových kmenových buněk a možnosti jejich diferenciace (Conti & Cattaneo, 2010; upraveno) 53

54 5.4.2 Neurotoxické účinky alkoholu Ethanol narušuje vyvíjející se mozek, způsobuje nevratné kognitivní, behaviorální, strukturní a fyzické odchylky a je jednou z hlavních odstranitelných příčin vrozených vad a neurobehaviorálních poruch. U dětí, jejichž matky pily alkohol v průběhu těhotenství, byl zaznamenán fetální alkoholový syndrom (FAS), jehož projevem jsou výše uvedené anomálie. Děti i zvířata, které byly před narozením exponovány alkoholu, měly menší mozek, tenčí mozkovou kůru a významně snížený celkový počet buněk. Experimentálně bylo dokázáno, že ethanol ovlivňuje klíčové procesy při vývoji mozku, jako je migrace neuronů, neurogeneze a gliogeneze (Talens-Visconti et al., 2011). Nash et al. (2012) ve své studii exponovali nediferencované hescs 20 mm (cca 0,1%) ethanolu (Tabulka 3), což je klinicky relevantní nízká dávka nacházející se v krvi těhotných žen, které požívaly alkohol v době, kdy ještě nerozpoznaly své těhotenství. Výsledky ukázaly, že přítomnost ethanolu vedla ke zvýšené apoptóze buněk, ale také k jejich intenzivnější proliferaci, která převažovala, což způsobilo zvětšení kolonie. Zvýšenou proliferaci ve srovnání s neošetřenými buňkami vykazovaly nejen týden exponované hescs, ale i od nich odvozené nervové kmenové buňky, jejichž diferenciace byla provedena později bez přítomnosti ethanolu. V této studii byla také zjištěna omezená tvorba astrocytů, což naznačuje, že expozice nediferencovaných buněk ethanolu může mít dopad na diferenciační procesy, které probíhají později již bez přítomnosti ethanolu. Talens-Visconti et al. (2011) zkoumali účinky alkoholu na neuroprogenitorové buňky odvozené od hescs (Tabulka 3). Bylo zjištěno, že ethanol snižuje množství proliferujících buněk, pozměňuje buněčný cyklus, poškozuje transformaci neuroprogenitorových buněk do neuronů a astrocytů, jeho nižší dávky (25 mm) vyvolávají apoptózu buněk, zatímco vyšší dávky (50 mm) vedou k buněčné smrti nekrózou. Vyvodit jednoznačný závěr, který by shrnoval účinky alkoholu na hescs a jejich deriváty, je však obtížné. Výsledky provedených studií se liší v závislosti na vývojovém stadiu a dávce ethanolu. Nicméně je zřejmé, že in vitro kultury kmenových buněk jsou vhodným doplňkem ke zvířecím modelům, které umožňují lepší porozumění neurotoxicitě ethanolu (Nash et al., 2012). Pilotní studii účinků ethanolu na nervové buňky odvozené od ipscs získaných od alkoholiků a osob požívajících alkohol pouze příležitostně provedli Lieberman et al. (2012) (Tabulka 7). Hodnoceným ukazatelem byla aktivita receptoru NMDA, který má významnou 54

55 úlohu při synaptických přenosech, synaptické plasticitě, která je důležitá pro učení a paměť, a excitotoxicitě, což je patologický proces vyvolaný nadměrnou stimulací nervových buněk neurotransmitery (např. glutamátem) způsobující jejich poškození a smrt. Výsledky studie ukázaly, že chronická expozice alkoholu zvyšuje expresi mrna v receptoru NMDA pouze v kulturách odvozených od buněk alkoholiků, nikoli však v kulturách získaných od osob nezávislých na alkoholu. IPSCs tak umožňují studovat vliv genetického pozadí na riziko vytvoření závislosti na alkoholu Neurotoxické účinky methylrtuti Methylrtuť (MeHg) je environmentální kontaminant extrémně toxický pro vyvíjející se nervový systém. Do prostředí se uvolňuje jednak z přírodních zdrojů, jako je zemská kůra a bakteriální činnost, ale také antropogenní činností, např. z důlního průmyslu, spalováním fosilních paliv a elektrolýzou alkalických chloridů (Tamm et al., 2006). Nejvážnější otravy methylrtutí se odehrály v 50. letech v Japonsku a v 70. letech v Iráku. Její neurotoxické účinky zahrnují mentální retardaci a neurologická postižení, jako je slepota, hluchota, nervosvalová slabost a poruchy neurobehaviorálního rozvoje. MeHg je také příčinou nitroděložních úmrtí a vzniku malformací, které se projevují jako kosterní změny, snížená osifikace, abnormální struktura mozku a snížení počtu mozkových buněk (Stummann et al., 2009). Několik studií naznačuje, že stejně jako v případě alkoholu i methylrtuť v nižších dávkách způsobuje apoptózu, zatímco její vyšší dávky jsou příčinou nekrózy nervových a gliových buněk (Tamm et al., 2006). Pro studium neurotoxických účinků MeHg byly původně uplatňovány pouze ESCs získané z myší. Tamm et al. (2006) použili myší NSCs, které exponovali velmi nízkým koncetracím MeHg (řádově tisíciny až desetiny μm), které odpovídají expozici člověka. Výzkum odhalil, že NSCs jsou k cytotoxicitě vyvolané MeHg mnohem citlivější než diferencované neurony nebo gliové buňky a brzy odumírají apoptózou. První studii, ve které byly použity hesc pro objasnění neurotoxicity během embryogeneze, uskutečnili Stummann et al. (2009), studie je zmíněna v Tabulce 3. Její výsledky ukazují, že diferenciace hescs do buněk podobných neuroprogenitorovým buňkám je citlivější k expozici MeHg než jejich zrání do buněk podobných neuronům a jsou tedy v souladu s předchozí studií provedenou na myších NSCs. Ačkoli jsou kmenové buňky lidského původu relevantnější model pro 55

56 testování neurotoxicity než buňky získané z hlodavců, jejich nedostatkem jsou vyšší finanční náklady (Breier et al., 2010) Strategie pro hodnocení neurotoxicity Součástí celkové strategie pro vývoj testovacích sad pro hodnocení neurotoxicity by měl být výzkum citlivosti modelů založených na embryonálních a nervových kmenových buňkách a jejich srovnání s existujícími modely, které využívají imortalizované buněčné linie. Cílem je vyvinout sadu testů, které by umožnily identifikovat agens ohrožující vývoj lidského mozku v jeho různých vývojových stadiích. Navržený in vitro model založený na kmenových buňkách by měl být vhodný pro HTS. Toto kritérium splňují imortalizované buněčné linie, neurosféry však dosud neumožňují rapidní testování chemických látek. Příčinou je nemožnost průběžně získávat jejich dostatečné množství a jejich velikost, která vyžaduje více kultivačního prostoru (Breier et al., 2010). Řešením by mohlo být využívání jednovrstevných (2D) kultur, které jsou vhodnější pro HTS (Betts, 2010). Stejně jako v případě kardiotoxicity, jsou i při studiu neurotoxicity využívány MEA umožňující hodnotit tvorbu a šíření akčních potenciálů, a tak odhalit poškození excitability neuronů, které může nastat i za nepřítomnosti morfologických změn. MEA jsou citlivé na sloučeniny, které ovlivňují jednotlivé buněčné typy, receptory, iontové kanály nebo synapse v rámci neuronové sítě a umožňují kvantifikaci spontánní elektrické aktivity mnoha neuronů uvnitř této sítě. MEA by také mohly být využity pro klasifikaci působení neznámých chemikálií pomocí změn zjištěné elektrické aktivity známých látek. Proto byly pro sloučeniny, u kterých je známý účinek na různé neurofyziologické dráhy, vytvořeny knihovny s charakteristickými MEA záznamy (fingerprints). Tyto záznamy obsahují multiparametrická data, např. pro ligandy receptorů, modulátory iontových kanálů nebo látky toxické pro mitochondrie, které mohou být porovnány se záznamy neznámých sloučenin, u nichž tak může být klasifikováno jejich pravděpodobné neurotoxické působení a mohou být dále hodnoceny v elektrofyziologických studiích. Vytvoření rozsáhlé databáze obsahující účinky sloučenin používaných jako pozitivní kontrola na různé typy odvozených neuronů vyžaduje hodně času a úsilí, ale bude velmi nápomocné při vývoji testování využívajícího MEA, které tak bude rychlejší a obsáhne více testovaných látek (Scott et al., 2013). 56

57 Praktická část 6 Cíle praktické části V teoretické části byla popsána řada výhod a možného využití kmenových buněk při testování toxicity chemických látek. V souvislosti s touto problematikou byla realizována praktická část, jejímž cílem bylo: (1) zvládnout a charakterizovat kultivaci dospělé linie jaterních kmenových buněk HLhT1, (2) použít dvě různé metody hodnocení proliferace a cytotoxicity tradiční kolorimetrickou metodu MTT a měření impedance v buněčné kultuře v reálném čase systémem xcelligence, a (3) využít tyto metody pro otestování účinků modelových chemických látek na tuto buněčnou linii. Praktická část byla realizována ve třech krocích, resp. pokusech. V prvním pokusu byla ověřována schopnost růstu buněk HLhT1 na 96ti-jamkové destičce E-Plate. Některé buněčné linie rostou jen obtížně přímo na povrchu elektrod pokrývajících dno jamek E-Plate a pro jejich kultivaci v těchto destičkách je proto nutná modifikace kultivačního povrchu biopolymery, např. vrstvou želatiny, fibronektinu nebo kolagenu. V tomto experimentu byl srovnáván růst buněk HLhT1 na nemodifikované E-Plate a na E-Plate s povrchem modifikovaným vrstvou želatiny. Proliferace buněk byla zhodnocena MTT testem. Druhý pokus, tzv. titrační křivka, byl realizován za účelem zjištění optimální počáteční hustoty buněk, při které by bylo dosaženo exponenciální fáze růstu a zároveň by se buňky nedostaly do stacionární fáze růstu (plató) během plánované doby expozice (72 96 h). Proliferace buněk byla hodnocena pomocí systému xcelligence umožňujícím analýzu buněk v reálném čase a MTT testem. Ve třetím pokusu byly studovány účinky modelového toxikantu, tj. 12-Otetradekanoylforbol-13-acetátu (TPA) a běžně využívaného rozpouštědla - dimethylsulfoxidu (DMSO) na linii buněk HLhT1 pomocí obou zmíněných metod. TPA se používá jako modelový tumor promoter, aktivuje PKC a MAPK a stimuluje buněčnou proliferaci. Pro pokus byl vybrán za účelem zjištění jeho vlivu na proliferaci kmenových buněk, protože její ovlivnění může hrát důležitou roli v karcinogenezi. DMSO je často využíván jako rozpouštědlo testovaných chemikálií a ve vysokých koncentracích působí na buňky toxicky. Při nízkých 57

58 koncentracích však ovlivňuje diferenciaci kmenových buněk do hepatocytů. Záměrem pokusu bylo prozkoumat jeho vliv na linii dospělých jaterních kmenových buněk HLhT1. 58

59 7 Materiál a metody 7.1 Buněčná linie Pokus byl proveden s využitím buněčné linie HLhT1. Jedná se o deriváty lidské jaterní kmenové buňky HL1-1 (Chang et al., 2004), imortalizované transfekcí genem pro lidskou telomerázovou reverzní transkriptázu (htert), což umožnilo překonat jejich omezenou životnost a stárnutí buněk. Imortalizace HL1-1 buněk byla uskutečněna transfekcí plazmidem (pbabe-hygro-htert) obsahujícího htert pomocí lipofekčního činidla Lipofectaminu. Stabilně transfekovaná klonální populace byla selektována kultivací v médiu obsahujícím 100 μg/ml hygromycinu (Kim, 2011). 7.2 Kultivace buněčné linie Pro kultivaci buněk byly použity kultivační nádoby s plochou dna 25 cm 2. Buňky byly kultivovány sterilně v médiu KNAC (Keratinocyte SFM medium obsahující 50 mg/l extraktu z bovinní hypofýzy a 5 μg/l rekombinantního lidského epidermálního růstového faktoru; dále obohacené 2 mm N-acetyl-L-cysteinu; 0,2 mm kyseliny L-askorbové-2-fosfát; 5 mm nikotinamidu) a 10% FBS. Kultivace probíhala v inkubátoru při 37 C ve zvlhčované atmosféře obsahující 5% CO 2 a 95% vzduchu. 7.3 Pasážování buněčné linie Pasážování je technika, která umožňuje pěstovat a uchovávat buňky naživu po delší čas za stanovených podmínek kultivace. Proces pasážování se uskutečňuje přenesením malého množství buněk z jejich původní kultivační nádoby do nové nádoby, ve které mohou dělením vytvářet nové buňky. Postup: Před procesem pasážování byly buňky v kultivační nádobě zkontrolovány pod inverzním mikroskopem, zda jsou dostatečně konfluentní, neobsahují nežádoucí mikroorganismy (bakterie, plísně) a nevykazují morfologické abnormality. Následující kroky byly prováděny asepticky v laminárním boxu. Z nádoby s buňkami s povrchem dna 25 cm 2 bylo odsáto staré kultivační médium. Buňky byly opláchnuty 5 ml sterilního PBS, které bylo následně odsáto, a tento krok byl ještě jednou zopakován. K buňkám byl přidán 1 ml trypsinu (0,25% trypsin- 0,02% EDTA v PBS). Buňky s trypsinem byly ponechány 5 minut v inkubátoru. Oddělení 59

60 přisedlých buněk od dna nádoby působením trypsinu bylo ověřeno mikroskopicky. K buňkám s trypsinem bylo přidáno růstové médium a suspenze byla několikrát promíchána nasátím do pipety a následným vypuštěním. Koncentrace buněk byla stanovena v alikvotu 20 μl suspenze v počítací komůrce systému Nexcelom Auto T4. Proces pasážování byl dokončen přenesením požadovaného množství buněk do nové kultivační nádoby s povrchem dna 25 cm 2 obsahující 5 ml čerstvého růstového média KNAC-10% FBS, a uložením nádoby do inkubátoru. Buňky byly pasážovány po dosažení konfluence %, zpravidla jedenkrát týdně v poměru 1: Experimentální design Vliv želatiny na růst buněk HLhT1 v E-Plate (I. Pokus) Část jamek 96ti-jamkové mikrodestičky E-Plate (ACEA Biosciences) byla modifikována inkubací s 200 μl sterilního roztoku 0,1% želatiny v PBS po dobu 24 h v CO 2 inkubátoru při 37 C. Před nasazením buněk byl roztok želatiny sterilně odsát. Do nemodifikovaných i modifikovaných jamek bylo nasazeno 200 µl suspenze HLhT1 buněk s počáteční hustotou 0,75 x x 10 3 buněk/jamka v koncentrační řadě s koeficientem ředění 2. Jednotlivé experimentální varianty byly pipetovány vždy v kvadruplikátu. Buňky byly inkubovány po dobu 72 h a jejich růst byl vyhodnocen pomocí MTT testu Titrační křivka (II. Pokus) Buňky byly nasazeny do nemodifikované 96ti-jamkové mikrodestičky E-Plate (ACEA Biosciences) v objemu suspenze 200 µl s počáteční hustotou 0,375 x x 10 3 buněk/jamka v koncentrační řadě s koeficientem ředění 2. Jednotlivé experimentální varianty byly pipetovány vždy v kvadruplikátu. Buňky byly inkubovány v CO 2 inkubátoru při 37 C po dobu 120 h a jejich růst byl monitorován v reálném čase pomocí systému xcelligence a po uplynutí 120 h pomocí MTT testu Účinky TPA a DMSO na HLhT1 buňky (III. Pokus) Buňky byly nasazeny do nemodifikované 96ti-jamkové mikrodestičky E-Plate (ACEA Biosciences) v objemu suspenze 200 µl s počáteční hustotou 22 x 10 3 buněk/jamka. Buňky byly inkubovány v CO 2 inkubátoru při 37 C po dobu 24 h. Poté bylo růstové médium sterilně odsáto a k buňkám byly přidány v objemu 200 µl na jamku zkoumané látky rozpuštěné 60

61 v růstovém médiu. TPA bylo testováno v rozsahu koncentrací 3, nm, DMSO pak v koncentračním rozsahu 0, %, pro obě látky byla připravena koncentrační řada s koeficientem ředění 2. Kontrolu rozpouštědla pro TPA tvořil 0,5% ethanol, pro DMSO bylo použito 10% PBS. Na desce byla přítomna rovněž naivní kontrola (negativní, neovlivněná) a blank (růstové médium bez buněk). Všechny experimentální varianty byly na desku pipetovány v triplikátech. Buňky byly exponovány v inkubátoru po dobu 96 h a změny impedance monitorovány pomocí systému xcelligence. Po ukončení expozice byla rovněž hodnocena metabolická aktivita pomocí MTT testu. 7.5 Stanovení metabolické aktivity MTT testem Principem testu je enzymatická redukce žluté rozpustné sloučeniny MTT (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) v dýchacím řetězci mitochondrií buněk na modrý nerozpustný formazan, který se hromadí uvnitř buněk ve formě krystalů hvězdicovitého tvaru. Po přidání lyzačního pufru se barvivo z buněk postupně uvolňuje a rozpouští a vzniká roztok vhodný ke spektrofotometrickému stanovení při vlnové délce 570 nm. Čím vyšší je hodnota absorbance roztoku, tím vyšší je procento živých buněk (Buch et al., 2012; Stockert et al., 2012). Test lze tedy použít k hodnocení proliferace nebo cytotoxického působení látek. Postup: Veškeré kroky postupu byly prováděny asepticky v laminárním boxu. Připravený roztok MTT zředěný v růstovém médiu DMEM (1 g/l glukóza, 1 g/l hydrogenuhličitan sodný, 1 mm pyruvát sodný, 2 mm glutamin, bez fenolové červeně a FBS) na požadovanou koncentraci 0,5 mg/ml byl v termostatu vytemperován na 37 C. Z jamek mikrotitrační destičky bylo odsáto veškeré médium. Odsáté buňky v jamkách byly opláchnuty 0,2 ml PBS vytemperovaným na 37 C, následně bylo PBS odsáto. K odsátým buňkám do všech jamek bylo přidáno 100 μl roztoku MTT a mikrotitrační destička byla ponechána 1 h v CO 2 inkubátoru při 37 C. Po uplynutí stanoveného času byla pod mikroskopem zkontrolována tvorba krystalů v buňkách. Poté bylo do každé jamky obsahující buňky a MTT přidáno 100 μl lyzačního pufru (10% Triton X-100-0,1M HCl-isopropanol) a destička byla zakryta alobalem a umístěna přes noc na třepačku. Druhý den byla změřena absorbance při 570 nm (MTT) a 690 nm (referenční hodnota). Hodnoty absorbance při 690 nm byly odečteny od absorbancí 61

62 při 570 nm. Pro srovnávání s kontrolní variantou byly průměrné hodnoty absorbancí z jednotlivých variant vyjádřeny jako jejich podíl vůči průměrné absorbanci v naivní kontrole. 7.6 Měření impedance v buněčné kultuře systémem xcelligence Prostřednictvím systému xcelligence byla měřena elektrická impedance buněk pomocí zlatých mikroelektrod umístěných na dně jamek mikrotitračních destiček E-Plate (ACEA Biosciences). Jedná se o neinvazivní metodu, která nevyžaduje značení buněk a dovoluje měření v reálném čase. Změny impedance byly softwarem zaznamenávány jako hodnoty Cell Index (buněčného indexu, CI), což je bezrozměrná veličina. CI je komplexní parametr, jehož hodnota je ovlivňována změnami v interakci buněk s povrchem elektrod a odráží změny počtu buněk v jamce, změny v buněčné adhezi, morfologii či životaschopnosti (Ke et al., 2011). Postup: Veškeré kroky postupu byly prováděny v laminárním boxu. Do připravených jamek E-Plate bylo napipetováno 100 μl růstového média KNAC-10% FBS a pomocí systému xcelligence byly načteny pozaďové hodnoty impedance. Následně bylo do jamek k médiu sterilně přidáno 100 μl buněčné suspenze v požadované počáteční hustotě buněk. Po 30 minutách ustálení byla destička E-Plate umístěna do inkubátoru do měřicího zařízení systému xcelligence a bylo zahájeno měření. Výsledky jsou prezentovány jako hodnoty CI (Cell Indexu) nebo CI normalizovaného na hodnoty CI při poslením měření před přidáním studovaných látek (Normalized CI). Pro srovnávání s kontrolní variantou byly průměrné hodnoty CI z jednotlivých variant vyjádřeny jako jejich podíl vůči průměrné hodnotě CI v naivní kontrole. 62

63 8 Výsledky 8.1 Kultivace HLhT1 buněk Buňky HLhT1 kultivované v KNAC-10% FBS médiu vytvářely jednoduchou monovrstvu buněk protáhlého tvaru, zejména při nižších hustotách buněk (Obr. 5). Obrázek 5: Fotografie dospělé linie jaterních kmenových buněk HLhT1. Fotografie byla pořízena pomocí objektivu DIC při zvětšení 20x pomocí invertovaného mikroskopu Zeiss Axio Observer Z1 spojeného s CCD kamerou AxioCam HRc a programem AxioVision Documentation. 8.2 Vliv želatiny na růst buněk HLhT1 v E-Plate (I. pokus) Při hodnocení růstu buněk HLhT1 nasazených s různou počáteční hustotou na E-Plate nemodifikovanou a modifikovanou 0,1% želatinou byl v obou variantách pozorován s rostoucí hustotou buněk nárůst metabolické aktivity měřené metodou MTT (Obr. 6). Tento nárůst byl lineární až do počáteční hustoty buněk 48 x 10 3 buněk/jamka, kdy docházelo k jeho zpomalení. Mezi oběma variantami (s a bez želatiny) nebyl pozorován žádný zásadní rozdíl. 63