1 ÚVOD CÍLE PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10

Transkript

1 Obsah 1 ÚVOD CÍLE PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED CHARAKTERISTIKA BIOGENNÍCH AMINŮ Vznik biogenních aminů Biologické účinky BA Toxikologický význam BA Hygienický význam BA VÝSKYT BIOGENNÍCH AMINŮ V POTRAVINÁCH Nefermentované potraviny Fermentované potraviny Fermentované sýry Fermentované masné výrobky Fermentované alkoholické nápoje Fermentovaná zelenina FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ TVORBU BIOGENNÍCH AMINŮ PŘEMĚNY BIOGENNÍCH AMINŮ MOŽNOSTI ODSTRANĚNÍ A PREVENCE TVORBY BA MIKROORGANISMY S DEKARBOXYLÁZOVOU AKTIVITU Rod Escherichia Rod Bacillus ZJIŠTĚNÍ PŘÍTOMNOSTI BA Metoda průkazu dekarboxylázové aktivity mikroorganismů Přímé metody stanovení biogenních aminů LEGISLATIVNÍ POŽADAVKY MATERIÁL A METODIKA METODA PRŮKAZU DEKARBOXYLÁZOVÉ AKTIVITY MIKROORGANISMŮ TESTOVANÉ MIKROORGANISMY NA DEKARBOXYLÁZOVOU AKTIVITU POUŽITÉ AMINOKYSELINY PRO ZJIŠTĚNÍ DEKARBOXYLÁZOVÉ AKTIVITY TESTOVANÉ PODMÍNKY KULTIVACE VÝSLEDKY A DISKUSE TESTOVÁNÍ DEKARBOXYLÁZOVÉ AKTIVITY MIKROORGANISMŮ V ZÁVISLOSTI NA TEPLOTĚ Dekarboxylázová aktivita B. licheniformis v závislosti na teplotě Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli v závislosti na teplotě

2 5.1.3 Srovnání DA E. coli a B. licheniformis v závislosti na teplotě INTENZITA DEKARBOXYLOVANÝCH AMINOKYSELIN V ZÁVISLOSTI NA TEPLOTĚ SPEKTRUM DEKARBOXYLOVANÝCH AMINOKYSELIN V ZÁVISLOSTI NA TEPLOTĚ ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA PŘÍLOHY I. SEZNAM ZKRATEK II. SEZNAM GRAFŮ III. SEZNAM TABULEK IV. TABULKY ZÁPISŮ DA PRO JEDNOTLIVÉ ZKUMAVKY

3 1 ÚVOD V současné době je kladen vysoký důraz na zdravotní nezávadnost potravin. Při jejím hodnocení se sledují především cizorodé kontaminující látky. Existují však také látky přirozeně škodlivé, běţně přítomné v potravinách nebo vznikající během skladování a zpracování potravin. Právě biogenní aminy (BA) jsou v různém mnoţství přirozenou sloţkou řady potravin. Vyskytují se zejména v rybách, mase, sýrech, pivu, kysaném zelí, apod. Zatímco u fermentovaných potravin jsou biogenní aminy pravidelnou a očekávanou součástí, v nefermentovaných potravinách je jejich přítomnost indikátorem neţádoucí mikrobiální činnosti. Stanovení BA v těchto potravinách můţe být vyuţito k posouzení míry rozkladu sledovaného materiálu. V případě skladování potravin můţe být obsah BA ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny výrobního procesu a skladování. I v případě fermentovaných výrobků lze mnoţství BA ovlivnit zacházením se surovinou, výběrem startovacích kultur, hygienou zpracování daného výrobku a teplotou či dobou zrání. BA vznikají převáţně dekarboxylací volných aminokyselin působením mikrobiálních dekarboxyláz. Schopnost vytvářet BA byla popsána pro mikroorganismy z čeledi Enterobacteriaceae, rody Pseudomonas, Clostridium a bakterie mléčného kvašení. Tyto mikroorganismy se do potravin mohou přidávat z technologických důvodů, zejména jako startovací kultury. Jejich vlivem dochází jednak ke změnám fyzikálně-chemickým, ale uplatňují se i senzorické změny výrobků, hlavně pak tvorba chuťových a aromatických látek. Vzhledem k tomu, ţe jednotlivé kmeny téhoţ druhu mikroorganismu se mohou lišit v produkci BA aţ o několik řádů, je obtíţné stanovit vzájemné korelace mezi počtem mikroorganismů a obsahem BA v potravině. Výskyt BA v potravinách dále ovlivňuje celá řada faktorů, proto je nutné pečlivě vybírat bakteriální kmeny, které se jako startovací či probiotické kultury pouţívají. Současně musíme vědět, které druhy mikroorganismů biogenní aminy produkují a za jakých podmínek, abychom se mohli jejich nadměrné produkci vyvarovat. Některé druhy BA člověk potřebuje k zajištění vybraných fyziologických pochodů, např. působí jako hormony, podílejí se na syntéze nukleových kyselin a bílkovin. Důleţitým faktorem je spektrum přijímaných BA a jejich mnoţství. Příjem BA v nadměrném mnoţství, můţe u citlivých osob vyvolat alimentární intoxikaci. 8

4 2 CÍLE PRÁCE 1. Zpracovat literární rešerši, v níţ budou shrnuty poznatky o biogenních aminech a jejich tvorbě. 2. Charakterizovat mikroorganismy podílející se na vzniku biogenních aminů. 3. Charakterizovat faktory prostředí ovlivňující mikroorganismy a tvorbu biogenních aminů. 4. Popsat moţnosti a způsoby zabránění vzniku biogenních aminů. 9

5 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika biogenních aminů Biogenní aminy jsou nízkomolekulární organické báze, které vznikají odbouráváním aminokyselin. BA jsou v ţivých organismech zodpovědné za mnoho fyziologických a farmakologických funkcí, avšak ve vysoké koncentraci mohou mít toxické účinky na organismus (Saccani et al., 2005). Na vzniku BA se mohou kromě exogenních mikrobiálních dekarboxyláz podílet i endogenní dekarboxylázy. Jedná se o enzymy vlastní dané potravině nebo surovině. Dekarboxylázy, které se účastní vzniku BA, se označují podle příslušné aminokyseliny, kterou dekarboxylují. Z histidinu vzniká dekarboxylací histidindekarboxylázou histamin. Zvlášť významně se endogenní dekarboxylace uplatňuje u potravin rostlinného původu (Velíšek, 2002). Endogenní produkce diaminů však není ve srovnání s exogenní cestou příliš významná. Dekarboxylace aminokyselin nastává odloučením alfa-karboxylové skupiny a vede ke vzniku odpovídajícího aminu (Ruiz-Capillas and Jiménez-Colmenero, 2004). Biogenní aminy rovněţ vznikají z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transamináz. Při jejich transformaci na další biologicky aktivní produkty se uplatňují některé oxygenázy a methyltransferázy (Velíšek, 2002). Silla-Santos (1996) rozdělil na základě chemické struktury biologicky aktivní aminy na skupiny: aromatické (tyramin, 2-fenylethylamin), heterocyklické (histamin, tryptamin), alifatické diaminy (putrescin, kadaverin, spermin, spermidin) polyaminy (spermidin, spermin, putrescin) Některé publikace řadí diaminy zjednodušeně mezi polyaminy a heterocyklické aminy řadí do skupiny aromatických (Kříţek a Kalač, 1998). Putrescin je na rozdíl od kadaverinu rovněţ zařazen do skupiny polyaminů, neboť je přímým meziproduktem syntézy spermidinu a sperminu (Komprda, 2005). 10

6 3.1.1 Vznik biogenních aminů Biogenní aminy a polyaminy vznikají z aminokyselin působením dekarboxyláz obsahujících jako kofaktor pyridoxalfosfát nebo z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transamináz. Dekarboxylace je běţná obzvláště v ţivočišných materiálech. Vznik aminů z aldehydů se uplatňuje hlavně v rostlinných materiálech (Velíšek, 2002). Naprostá většina BA v potravinách vzniká dekarboxylací volných aminokyselin působením bakteriálních dekarboxyláz jak uvádí schéma 1 a 2. Polyaminy nevznikají bakteriální činností, ale biochemickou syntézou v ţivých organismech od bakterií aţ po člověka (Kalač a Kříţek, 2005). R - CH - COOH dekarboxyláza NH 2 NH 2 R - CH 2 + CO 2 Schéma 1: Vznik biogenních aminů z aminokyselin dle Kříţka a Kalače (1998). histidin histamin tyrosin tyramin tryptofan tryptamin fenylalanin 2-fenylethylamin lysin kadaverin ornithin putrescin spermidin spermin arginin agmatin putrescin arginin ornithin Schéma 2: Vznik biogenních aminů v potravinách z prekurzorů (Kříţek a Kalač, 1998). Gardini et al. (2005) formuluje 3 nutné podmínky, které musí být splněny pro vznik BA: 1. V potravině musí být k dispozici dostupné volné aminokyseliny. 2. Musí být přítomny mikroorganismy vykazující dekarboxylázovou aktivitu. 3. Musí být navozeny podmínky vhodné pro růst mikroorganismů, syntézu dekarboxyláz a jejich aktivitu. 11

7 Zvláštní postavení dnes zaujímají polyaminy (PA). Jedná se o skupinu polykationických aminů, které se řadí k BA kvůli jejich specifické biologické roli v eukaryotické buňce. Kalač a Krausová (2005), řadí mezi PA putrescin (PUT), který je výchozí látkou pro biosyntézu spermidinu (SPD) a sperminu (SPM). Rovněţ uvádějí, ţe se putrescin vyskytuje v jakési dvojroli. Svým vznikem patří mezi BA, ale tím ţe z něj vznikají SPD a SPM, tak se řadí rovněţ mezi polyaminy. Biosyntéza PA je regulována působením enzymů ornithindekarboxylázou a S adenosylmethionindekarboxylázou. Schéma 3: Biosyntéza polyaminů (Önal, 2007) 12

8 Jak vyplývá ze schématu 3, tak hlavními aminokyselinami pro tvorbu PA jsou methionin a arginin. Methionin poskytuje aminopropylovou skupinu, která je potřebná pro tvorbu SPD a SPM z PUT. Většina mikroorganismů a vyšších rostlin syntetizují PUT z agmatinu (AGM), který vzniká dekarboxylací argininu. Tato dekarboxylace je moţná pouze za účasti arginindekarboxylázy. Buňky savců a niţší eukaryota tento enzym nemají, proto PUT syntetizují z ornithinu za účasti ornithindekarboxylázy (Kalač a Krausová, 2005) Biologické účinky BA BA v přijatelném mnoţství mají významné biologické vlastnosti, neboť jsou např. tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) či stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů ţivočichů (fenylethylamin), auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin (Velíšek, 2002). Komprda (2004) uvádí, ţe polyaminy a také kadaverin jsou nepostradatelnými sloţkami ţivých buněk. Důleţité jsou při regulaci buněčného růstu, při regulaci funkce nukleových kyselin, syntéze bílkovin a pravděpodobně i při stabilizaci membrán. Biologické účinky polyaminů však nejsou zcela probádány. Kalač a Kříţek (2005) uvádějí, ţe rovněţ hrají roli při hojení ran a rozvoji karcinomů. Jejich nadbytek je u zdravých jedinců účinně enzymaticky odstraněn. Proto SPM a SPD nejsou pokládány za zdravotně rizikové. Z výše uvedeného je zřejmé, ţe BA jsou pro lidský organismus nepostradatelné, avšak ve vysokých koncentracích se mohou projevovat jako látky: psychoaktivní - působí jako neurotransmitery v centrálním nervovém systému vasoaktivní - působí přímo nebo nepřímo na vaskulární systém - vasokontraktibilní (tyramin) - vasodilatační (histamin) Jak uvádí Kalač a Kříţek (2005) potřebu polyaminů kryje lidský organismus biosyntézou v buňkách z aminokyselin, produkcí střevními bakteriemi a příjmem potravou. Vyšší mnoţství BA v těle je odbouráváno enzymy, z nichţ hlavní jsou monoaminoxidáza (MAO) a diaminooxidáza (DAO). Toxický účinek BA je silně ovlivněn mnoţstvím a aktivitou právě těchto enzymů. Ta můţe být u kaţdého jedince odlišná a závisí na řadě 13

9 faktorů. Příkladem můţe být například přítomnost inhibitorů nebo potenciátorů (některá léčiva). Symptomy konzumace vysokých dávek BA jsou zvracení, dýchací potíţe, pocení, bušení srdce, hypotenze nebo hypertenze (histamin), migrény (tyramin) či anafylaktický šok (histamin). Přehled biogenních aminů vyskytujících se v potravinách, a jejich biologický význam je uveden v tabulce 1. Tabulka 1: Biologický význam nejdůleţitějších BA (Velíšek, 2002). Biogenní amin histamin kadaverin, agmatin, putrescin dopamin tyramin fenylethylamin tryptamin Biologický význam lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak, sekreci ţaludečních šťáv, účast na anafylaktickém šoku a alergických reakcích stabilizace makromolekul (nukleové kyseliny), subcelulárních struktur (ribozomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon mediátor sympatických nervů prekurzor dopaminu, lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak a kontrakce hladkého svalstva prekurzor tyraminu lokální tkáňový a rostlinný hormon (katecholamin), vliv na krevní tlak, peristaltiku střev, psychické funkce 14

10 3.1.3 Toxikologický význam BA Původně se biogenním aminům přisuzovala značná toxicita, putrescin a kadaverin byly dokonce označovány za mrtvolné jedy. V současné době se za toxické povaţují histamin a tyramin. Některé polyaminy mohou v přítomnosti dusitanů přispívat k tvorbě karcinogenních nitrosaminů. Jiné však za určitých podmínek mohou mít na organismy příznivé účinky. Bardócz (1993) uvádí, ţe z výzkumů vedených v posledních letech se ukazuje, ţe obsah polyaminů ve tkáních vzrůstá se zvýšenou intenzitou dělení buněk (např. v hojících se ranách nebo v rostoucích nádorech). Komprda (2004) uvádí, ţe z hygienického hlediska slouţí BA jako indikátory stupně kaţení a pokud jde o toxikologický význam, mohou být prekurzory karcinogenních N-nitrososloučenin. Především jde o sekundární aminy (R-NH 2 -R), které tvoří na rozdíl od primárních aminů (NH 2 -R) nebezpečné stabilní produkty. Některé BA (putrescin a kadaverin) mohou saturovat enzymy metabolizující histamin. Jiné aminy mohou sniţovat detoxikační systém organismu. Tímto způsobem například tyrosin (TYR) můţe saturovat MAO a tryptofan (TRP) můţe saturovat DAO. Škodlivé účinky histaminu (HI) a tyraminu (TY) mohou být zesíleny ostatními současně přijímanými BA, zejména putrescinem a kadaverinem, které vyčerpávají část detoxikační kapacity aminooxidáz. Detoxikační schopnost celého organismu je zcela individuální záleţitost a zhoršuje se např. při některých onemocněních, při některých alergiích či při soustavném vysokém příjmu BA v potravě (Silla-Santos, 1996). Při hodnocení toxického účinku je nutné zvaţovat nejen přítomnost konkrétního BA, ale i ostatních faktorů, kterými můţe být například mnoţství spotřebované potraviny či přítomnost jiných toxických látek. Z těchto důvodu je velmi obtíţné stanovit hranici toxicity BA. Koncentrace histaminu v lidském těle vyšší neţ mg. kg -1 se jiţ povaţuje za nebezpečnou (Velíšek, 2002). Murray et al. (1998) uvádí, ţe právě histamin má centrální úlohu v mnoha alergických reakcích. 15

11 3.1.4 Hygienický význam BA Z hygienického hlediska mohou BA slouţit jako ukazatelé nejen stupně čerstvosti potravin, ale i stupně jejich kaţení. Tímto způsobem vznikl tzv. index biogenních aminů (BAI). Tento index vychází z předpokladu, ţe obsah histaminu, putrescinu a kadaverinu se v průběhu skladování potravin zvyšuje, a naproti tomu mnoţství polyaminů zůstává stejné nebo stagnuje. SPM a SPD primárně nevznikají činností mikrobiálních dekarboxyláz v potravině, ale vstupují do ní jako preformované látky jiţ z dané suroviny (Komprda, 2005). Dle výsledné hodnoty BAI poté můţeme usuzovat hygienickou kvalitu potraviny, kdy výborné jakosti odpovídá BAI < 1 a naopak BAI > 10 vypovídá o nízké jakosti potraviny (Kříţek a Kalač, 1998). Index biogenních aminů se lze vypočítat dle vzorce: HI + PUT + CAD BAI = [ mg / kg ] 1 + SPD + SPM 3.2 Výskyt biogenních aminů v potravinách Výskyt biogenních aminů (BA) lze očekávat ve všech potravinách, které obsahují proteiny nebo volné aminokyseliny a jsou vystaveny vhodným podmínkám umoţňujícím mikrobiální aktivitu (Silla-Santos, 1996). Vysoké koncentrace biogenních aminů se vyskytují u potravin v pokročilém stupni kaţení. Ke zvýšení tvorby BA můţe vést i nedostatečná hygienická úroveň v provozech. Z hlediska tvorby biogenních aminů můţeme potraviny rozdělit na fermentované a nefermentované. Více BA se nachází ve fermentovaných výrobcích, kde vznikají mikrobiální činností záměrně přidávaných mikroorganismů. U nefermentovaných potravin se na jejich vzniku podílí hlavně kontaminující mikroflóra (Velíšek, 2002). Obsahy hlavních biogenních aminů v některých potravinách jsou uvedeny v tabulce 2. 16

12 Tabulka 2: Obsahy hlavních biogenních aminů v potravinách (Velíšek, 2002). potravina Obsah v mg. kg -1 (nebo v mg. dm -3 ); s = stopové množství HI CAD PUT SPD SPM AGM FEA TY TR maso vepřové s-702 s hovězí s-26 s s-61 - kuřecí s 23 - masné výrobky šunka s-97 s s s-215 s slanina 15 s-1 s uzeniny s-550 s s ryby tuňák s-8000 s-447 s s-19 - s-45 s makrela s-3000 s-226 s s-48 - s-126 s-75 - slaneček s-1300 s s-92 - s sýry Cheddar Emmental s Gouda Eidam 0-88 s s - s Roquefort s další potraviny kys.zelí pivo bílé víno s čokoláda s s-1 17

13 3.2.1 Nefermentované potraviny V této skupině jsou BA nejvíce rozšířeny v rybím mase, zvláště u ryb čeledi Scombridae. Největší riziko představuje histamin, jehoţ výskyt v rybí svalovině je podmíněn koncentrací volného histidinu. Nejsou-li ryby po vylovení dostatečně rychle zchlazeny a optimálně skladovány, histidin se rychle dekarboxyluje na histamin (Kalač a Kříţek, 2005). U čerstvě ulovených ryb se obsah histaminu pohybuje do 10 mg. kg -1 (tyramin do 2 mg. kg -1 ) a ve výrobcích do 50 mg. kg -1. Při špatné úpravě, se ale jeho obsah můţe zvýšit aţ na tisíce mg. kg -1 (Kříţek a Kalač, 1998). Na vzniku BA se u nefermentovaných potravin nejvíce podílí kontaminující mikroflóra, proto je důleţité dodrţování chladírenského řetězce. Chlazení musí probíhat pečlivě, protoţe kontaminující mikroflóra je převáţně mezofilního původu. U ryb se nejčastěji tvoří BA ihned po vylovení. Proto je ryby nutné ihned po vylovení patřičně zchladit na teplotu kolem 1 C. Další rizikovou operací je tepelné opracování. Důleţitá je zde délka časové prodlevy mezi přípravou na uzení a vlastním uzením. Pokud je tato doba dlouhá a ryby jsou ponechány při vyšší teplotě, dochází k pomnoţení mikroorganismů produkujících převáţně histamin (Steihauserová, 2004). Makrely mohou obsahovat aţ 3000 mg. kg -1 histaminu, tuňák pak aţ 8000 mg. kg -1 (Velíšek, 2002). Také TY, CAD, PUT a i další BA vznikají v relativně vysokém mnoţství. Nejméně zastoupeným BA v rybím mase je agmatin (1-3 mg. kg -1 ). Ten se ale nachází ve vyšších koncentracích u korýšů (např. Haliotis sieboldii) a sušených ryb (Velíšek, 2002). Z dalších technologických úprav ryb například pečením část BA vytěká, ale sterilací v konzervách se jiţ obsah BA nemění (Kříţek a Kalač, 1998). Jak uvádí Kalač a Kříţek (2005), tak u mořských ryb a ţivočichů se můţe rizikový obsah histaminu vyskytovat v mase a výrobcích dříve, neţ u nich můţeme pozorovat smyslové příznaky kaţení. Naopak v případě sladkovodních ryb dojde dříve ke zřetelnému rozkladu bílkovin neţ k nahromadění zdravotně závaţného mnoţství histaminu. V mase jsou hlavními biogenními aminy HI, CAD, PUT a TY. Krausová et al., (2006) uvádí, ţe u hovězích, vepřových a drůbeţích jater je výrazně zastoupen SPD a SPM. Starka a Malota (2006) uvádějí, ţe obsah BA v čerstvém vepřovém mase bývá do 7 mg. kg -1, zatímco ve zkaţeném mase můţe být jejich obsah i více neţ 60 mg. kg -1. Je to způsobeno činností přítomné mikroflóry, a proto lze podle obsahu BA posuzovat čerstvost masa (BAI). Významný je zde rovněţ vliv skladování. Zatímco při teplotě 0 C nastanou negativní senzorické změny dříve, neţ hodnoty obsahu biogenních aminů 18

14 dosáhnou toxických dávek, při teplotě 10 C je tomu naopak. Obsah BA v mase se dá mírně sníţit vařením, kdy ale dochází jen k částečnému rozkladu. Úbytek je znatelnější u masa vepřového neţ u hovězího. Nesmíme také zapomenout, ţe některé druhy bakterií (Pseudomonas spp., Serratia mercescens) jsou naopak schopny vytvořené BA ve skladované potravině rozkládat (Velíšek, 2002). V mléce a nefermentovaných mléčných výrobcích je koncentrace BA nepatrná, zpravidla pod 1 mg. kg -1, naopak v některých sýrech se uvádí obsah aţ stovek mg. kg -1 (Kříţek a Kalač, 1998). Nachází se zde HI, TY, PUT, CAD, SPD a SPM. Jejich obsah nejvíce záleţí na úrovní mikrobiální kontaminace mléka. V ovoci a zelenině bývá hlavním BA tyramin, např. obsah v pomerančích se pohybuje do 10 mg. kg -1. Často se vyskytují i konjugáty BA se skořicovými kyselinami či mastnými kyselinami. V některých rostlinách se nachází ve významném mnoţství různé deriváty BA, které se běţně řadí mezi protoalkaloidy (Velíšek, 2002). Mnoţství BA se můţe zvýšit během mechanického zpracování díky bakteriální kontaminaci. Vyšší obsah tyraminu byl zjištěn v rajčatech, banánech a švestkách (Kříţek a Kalač, 1998). Endogenní BA, které se přirozeně vyskytují v rostlinných surovinách, nepředstavují výrazné toxikologické nebezpečí. BA se vyskytují i v ovocných šťávách vyrobených z pomerančů, citronů, grapefruitů, mandarinek, vinné révy, malin, jahod a rybízu. Nejdůleţitějším a nejčastěji zastoupeným je PUT. Vysoké obsahy BA se také nacházejí v pomerančovém dţusu. Nejvýrazněji jsou zde zastoupeny noradrenalin a tryptamin. Dále fenylethylamin je přirozenou součástí kakaových bobů a z nich následně přechází do čokolády, čokoládových výrobků či cukrářských výrobků čokoládu obsahujících. Rovněţ některé druhy hub mohou obsahovat vysoká mnoţství fenylethylaminu. V bílém a černém pepři či v sojové omáčce mohou být zastoupena vysoká mnoţství pyrolidinu. V karagenanu z řas můţe být přítomen ve vyšším mnoţství histamin a kadaverin (Silla-Santos, 2006). 19

15 3.2.2 Fermentované potraviny Z pohledu tvorby BA jsou fermentované potraviny mnohem významnější neţ nefermentované. Fermentací označujeme procesy, při nichţ dochází k mikrobiálnímu rozkladu organických hmot, mezi nimiţ převládají aerobní či anaerobní přeměny bezdusíkatých látek, nejčastěji sacharidů nebo organických kyselin (Kyzlink, 1988). Jedná se o tradiční konzervační techniku, která poskytuje relativně stabilní výrobky s typickými senzorickými vlastnostmi (Latorre-Moratella, 2008). Za fermentovanou potravinu se povaţuje taková potravina, ve které vlivem mikroorganismů nebo enzymů dochází k ţádoucím biochemickým reakcím, vedoucím k její úpravě (Lücke, 1994). Mezi nejvýznamnější fermentované potraviny patří fermentované mléčné výrobky (jogurty, jogurtové nápoje, zakysané smetany a sýry), fermentovaná zelenina (kysané zelí) a fermentované masné výrobky (herkules, čabajské klobásy a poličan). Velíšek (2002) uvádí, ţe obsah BA se u fermentovaných výrobků pohybuje v rozmezí jednotek aţ stovek mg. kg -1, avšak při nedodrţení hygienických podmínek můţe dosáhnout stovek aţ tisíců mg. kg -1 potraviny. Dle Komprdy (2005) má na mnoţství BA u fermentovaných výrobků nejvýraznější vliv dodrţování hygieny při manipulaci s výchozí surovinou. Dále mají výrazný vliv startovací kultury a technologie zpracování. Menší význam přikládá velikosti výrobku, kde byla zjištěna korelace mezi průměrem výrobku, ph, rozsahem proteolýzy a obsahem BA. Také na okraji výrobku byl obsah BA niţší neţ v centrální části. U výrobků spontánně fermentovaných bez přídavku cukru bylo zjištěno vyšší mnoţství BA neţ u výrobků fermentovaných s jeho přídavkem Fermentované sýry Nejvýznamnější skupinou fermentovaných potravin z hlediska obsahu BA jsou sýry. Na obsah BA v sýrech se v posledních letech zaměřuje celá řada publikací zabývajících se buď BA jako celou skupinou, nebo pouze tyraminem, jakoţto dominantním BA. Kalač a Kříţek (2005) uvádějí, ţe největší obsah histaminu a tyraminu mají sýry zrající pod mazem (romadur) a poloměkké sýry (viz. tabulka 3). Standarová et al. (2008) zjišťovali obsah biogenních aminů v sýrech z obchodní sítě v České republice. Pro vyhodnocení rizika alimentární intoxikace, vlivem příjmu velkého mnoţství potravin s vysokým obsahem BA, analyzovali 215 vzorků sýrů pořízených mezi roky Koncentrace sledovaných BA se pohybovaly v rozmezí jednotek 20

16 aţ několika set mg/kg. Nejčastěji byly zastoupeny a nejvyšších koncentrací dosahovaly TY, PUT a CAD, následovány HIS. Nejvyšší celkové koncentrace BA byly stanoveny u měkkých zrajících sýrů a sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou, přičemţ hodnoty BA dosáhly hodnot aţ 3 mg. kg -1. Dle Görnera a Valíka (2004) je pro vznik BA během výroby nejvýznamnější fází zrání sýrů. Jak je uvedeno v tabulce 3, tak u sýrů vyráběných z nepasterovaného mléka (brynza) byl zaznamenán vyšší obsah BA, neţ u sýru vyrobených z mléka pasterovaného. Schneller et al. (1997) se zabývali testováním vlivu pasterace mléka na obsah biogenních aminů v sýrech. Rovněţ testovali i koncentraci BA v tvrdém, poloměkkém a měkkém sýru, přičemţ nejvyšší koncentrace celkových biogenních aminů byla zjištěna u poloměkkého sýru. Koncentrace jednotlivých BA byly většinou taktéţ nejvyšší u sýru poloměkkého. Jak uvádějí Novella-Rodríguez et al. (2004) tvorbu BA je moţné ovlivnit zavedením vhodných hygienických opatření při výrobě sýrů a vyloučit tak postpasterační kontaminaci (hlavně kmeny čeledí Enterobacteriaceae a Enterococcaceae). Tabulka 3: Koncentrace BA u různých typů sýrů (Schneller et al., 1997). Vzorek FEA (mg. kg -1 ) PUT (mg. kg -1 ) CAD (mg. kg -1 ) HI (mg. kg -1 ) TY (mg. kg -1 ) Celkový obsah BA (mg. kg -1 ) Pasterované mléko 9, ,4 131,9 345,9 Nepasterované mléko 24,6 52,1 87,2 243,3 294,9 702,1 Tvrdý sýr 1,5 7,08 27,5 136,2 47,2 220,2 Poloměkký sýr 12,3 21,6 111,4 96, ,8 Měkký sýr 0,05 2,7 11,7 0 1,

17 Fermentované masné výrobky Dle vyhlášky 264/2003 Sb. rozumíme fermentovaným trvanlivým masným výrobkem výrobek, který je tepelně neopracovaný, je určen k přímé spotřebě a u kterého v průběhu fermentace, zrání, sušení popřípadě uzení za definovaných podmínek došlo ke sníţení vodní aktivity na hodnotu maximálně 0,93. Minimální doba trvanlivosti tohoto výrobku je 21 dní při teplotě plus 20 C. Nejčastěji se vyskytujícím BA ve fermentovaných masných výrobcích bývá TY a jeho mnoţství se během fermentačního procesu zvyšuje. Stejně tomu je i v případě mnoţstevně méně zastoupeného HI (Silla-Santos, 1996). V mase totiţ nejsou bakterie s histidindekarboxylázou příliš běţné (Gonzáles-Fernándes, 2003). Kalač a Kříţek (2005) uvádějí, ţe existují kmeny bakterií, které jsou součástí charakteristické mikroflóry masa a ty jsou schopné odbourávat část vytvořeného TY. Jak uvádí Masson et al., (1999) BA ve fermentovaných masných výrobcích mohou byt produkovány kmeny pouţívanými jako startovací kultury (L. curvatus) nebo přirozenou mikroflórou (Carnobacterium, Enterococcus). Standara et al. (1995) sledovali obsah biogenních aminů u šesti různých fermentovaných masných výrobků (Paprikový salám, Poličan, Herkules, Gombasecká klobása, Dunajská klobása a Prim) a téměř ve všech jmenovaných výrobcích byl nalezen TY a PUT v koncentracích přes 100 mg. kg -1. HI byl zjištěn v menších koncentracích, tryptamin (TR), SPD a SPM pak byly zaznamenány v desítkách mg. kg -1, přičemţ celkový obsah BA se pohyboval od mg. kg -1. Suzzi and Gardini (2003) se zabývali rozborem některých fermentovaných masných výrobků a detekovali vysoké mnoţství HI ve vzorcích, v nichţ byla jejich tvorba spojena s nízkou kvalitou výchozích výrobních surovin. U některých výrobků např. Chorizo, Fuet, Sobrasada a Salsichon hodnoty TY překračovaly 600 mg. kg -1, přičemţ střední hodnoty se pohybovaly okolo 200 mg. kg -1, u některých vzorků byl obsah PUT aţ 450 mg. kg -1. Navzdory variabilitě ve výskytu, byl CAD u některých výrobků naměřen ve významném mnoţství (nad 600 mg. kg -1, ale s průměrnou hodnotou niţší neţ 20 mg. kg -1 ). FEA a TR byl nalezen jen v několika málo výrobcích a v koncentracích niţších neţ 50 mg. kg -1. Histamin nebyl detekován u všech výrobků, avšak zejména u výrobků Fuet a Chorizo jeho mnoţství dosahovalo zdraví znepokojujících hodnot (300 mg. kg -1 ). Suzzi and Gardini (2003) dále zjistili, ţe existuje vztah mezi obsahem BA a velikostí fermentovaného výrobku. Průměr výrobku ovlivňuje prostředí, ve kterém rostou 22

18 mikroorganismy (u výrobků s širším průměrem je vţdy koncentrace soli niţší a vodní aktivita vyšší). Větší průměr tak můţe být důvodem k vyšší tvorbě BA, jako je TY a PUT. Gonzales-Fernandez et al. (2003) zjistili v rámci prováděného testu salámu Chorizo nejvyšší obsah BA u vzorku vyrobeného bez startovací kultury a to nezávisle na výši přídavku sacharidů. Nejniţší hodnoty byly dosaţeny při pouţití startovacích kultur a aplikaci sacharidů 0,5-1,0 %. Suzzi and Gardini (2003) uvádějí, ţe přídavek sacharidů do fermentovaných masných výrobků má vliv na růstovou rychlost mikroorganismů a tedy i na tvorbu BA, protoţe podporuje růst startovací kultury. Absence sacharidů navíc přispívá k tvorbě BA během skladování, a to značným zvýšením obsahu TY, CAD, PUT a TR. Nemalá pozornost se věnuje vlivu glukono-delta laktonu (GdL) na produkci BA. GdL se přidává do rychle zrajících masných výrobků na začátku fermentace za účelem sníţení ph. GdL se ve vodě hydrolyzuje na kyselinu glukonovou, coţ má za následek vyšší dekarboxylázovou aktivitu bakterií (Maijala, 1993). V takovýchto podmínkách bakterie produkují více enzymů, jako svůj obranný mechanizmus (Bunčič, 1993). Tímto způsobem se stále zvyšuje produkce HI, TY a PUT. Produkce BA ve výrobcích s GdL je vyšší neţ u výrobků bez přidání GdL (Maijala, 1993). V tabulce 4 jsou uvedeny hodnoty nárůstu mnoţství BA u fermentovaných masných výrobků ve vztahu k aktivitě dekarboxyláz u startovací kultury. Tabulka 4: Změny koncentrace BA během fermentace trvanlivých salámů (Velíšek, 2002) Startovací kultura Doba [dny] Obsah [mg. kg -1 ] HI CAD PUT FEA TY S vysokou aktivitou dekarboxyláz S nízkou aktivitou dekarboxyláz

19 Fermentované alkoholické nápoje Hygienická významnost BA u piva a vína je zvýrazněna synergickým zesílením účinku aminů a alkoholu. Obsah BA je sice nízký, ale často dochází ke konzumaci vysokého mnoţství těchto nápojů. Pro dynamiku tvorby aminů během výroby piva je typické, ţe obsah aminů vzrůstá během hlavního kvašení, kde je příčinou jejich vzniku kontaminace mléčnými bakteriemi. Během kvašení vznikají hlavně CAD, PUT, TY, HI a AGM (Silla-Santos, 1996). Nejvíce BA u piva vzniká během hlavního kvašení, suroviny jich vnášejí jen málo. V pivech plzeňského typu se obsah HI pohybuje kolem 1 mg. l -1 a TY 5-8 mg. l -1. To platí i pro nealkoholická piva. Zvýšené obsahy TY a CAD se povaţují za indikátory kontaminace především mléčnými bakteriemi (Kříţek a Kalač, 1998). V dalších fázích výroby se obsah BA jiţ příliš nemění. Koncentrace aminů v českých pivech jsou srovnatelné s výsledky piv zahraničních. Nejvyšší obsahy BA byly zjištěny u spontánně kvašených belgických piv. Piva spodně kvašená patří mezi typy piv s niţším obsahem BA. Ke zvýšení obsahu BA můţe dojít i během skladování piva, obzvláště pokud nebylo dostatečně pasterováno (Kalač a Kříţek, 2005). Vína obvykle obsahují HI a TY do 10 mg. l -1. Vyšší hodnoty jsou jen ojedinělé (Kříţek a Kalač, 1998). BA ve víně vznikají hlavně při jablečno-mléčné fermentaci (Kříţek a Hlavatá, 1995) Fermentovaná zelenina Jak uvádí Komprda (2004), tak v rámci fermentovaných zelenin je v podmínkách střední Evropy relativně nejrizikovější potravinou kysané zelí, zvláště spontánně fermentované. Mikroflóra při spontánním kvašení produkuje různé BA. Leuconostoc mesenteroides produkuje PUT, laktobacily PUT a TY, pediokoky HI. Obsah HI a TY se pohybuje v desítkách mg. kg -1 pro zelí a pro lák i mezi hodnotami mg. kg -1 (Kříţek a Kalač, 1998). Dále také uvádějí, ţe část BA vytěkává při tepelných úpravách. Obsah všech BA lze sníţit přídavkem vhodných startovacích kultur při nakládání zelí. Silla-Santos (1996) poukazuje, ţe vysoké hladiny TY a HI obsahují rovněţ fermentované výrobky ze sóji jako tempeh, miso či sojová omáčka. Tyto výrobky se však v našich podmínkách konzumují jen v malém mnoţství. 24

20 3.3 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů Tvorbu BA v potravinách ovlivňuje mnoho různých faktorů. Nejvýznamnějšími faktory ovlivňujícími dekarboxylační aktivitu bakterií jsou ph a teplota. Jak uvádí Komprda (2004) optimální hodnota ph se nachází v kyselé oblasti, v rozmezí 4,0 5,5. Halász et al. (1994) uvádí, ţe optimální ph pro dekarboxylaci aminokyselin je v rozmezí 2,5 6,5, a ţe růst bakterií v kyselém prostředí stimuluje tvorbu dekarboxyláz. Silla-Santos (1996) uvádí, ţe podmínky prostředí povzbuzují silněji bakterie k produkci těchto enzymů jako obranného mechanismu proti aciditě. Například laktobacily, enterokoky aj. si adaptivně zvyšují suboptimální ph prostředí dekarboxylací aminokyselin histidinu a fenylalaninu na histamin a tyramin (Jičínská a Havlová, 1995). Teplotní rozmezí pro růst bakterií produkujících BA je značně individuální a odvíjí se od výskytu konkrétních mikroorganismů v potravinách. Suzzi a Gardini (2003) uvádějí obecné pravidlo, ţe sníţením ph a teploty lze úspěšně bránit růstu neţádoucích mikroorganismů a potaţmo nastolení jejich případné dekarboxylázové aktivity. Jak uvádí Komprda (2004) skladovací teplotu je z hlediska BA nutno dodrţovat pokud moţno co nejniţší. Při teplotě kolem 0 C nastanou negativní senzorické změny dříve, neţ hodnoty obsahu BA dosáhnou toxických dávek, při teplotě 10 C je tomu naopak. Některé bakterie jsou naopak schopny vytvořené biogenní aminy ve skladované potravině rozkládat. Silla-Santos (1996) prokázali, ţe produkce CAD je při 10 C niţší neţ při 20 C. Při teplotě 1 C se tvořil HI jen omezeně, ale výrazně vyšší produkce byla při teplotě C. Dále při pokusech na rybách zjistili, ţe BA se při teplotě 10 C nacházely ve 20x větších mnoţstvích neţ při teplotě 2 C. Koncentrace jiţ vytvořených aminů jsou stálé a nejsou ovlivnitelné vařením, s výjimkou SPM, jehoţ obsah během tepelné úpravy mírně klesá (Silla-Santos, 1996). Jakmile se jednou aminy vytvoří, tak je velmi obtíţné je zničit. Jiţ vytvořené BA nelze zničit ani tepelnou úpravou při 200 C, proto je velmi důleţitá hygiena vstupních surovin a pečlivý výběr startovacích kultur. V délce skladování výrobku se názory autorů rozcházejí, coţ je způsobeno jednak různými podmínkami pokusů a jednak různými druhy skladovaných potravin. Mnoho autorů uvádí, ţe obsah BA vzrůstá s časem a teplotou skladování (Suzzi and Gardini, 2003). Silla-Santos (1996) rovněţ uvádí vzrůstající koncentraci TY a HI s časem a skladovací teplotou v sýrech. Tabulka 5 udává vliv teploty a délky skladování vepřového masa na mnoţství BA (Halász et al., 1994). Komprda et al. (2001) zjistili vyšší tvorbu BA 25

21 u salámů skladovaných při pokojové teplotě (22 C) ve srovnání se salámem skladovaným při chladírenské teplotě (4 C). Stejně tak i Bover-Cid et al. (2000) uvádějí u fermentovaných salámů skladovaných při teplotě 4 C niţší koncentraci BA, neţ u salámů skladovaných při 22 C. Tabulka 5: Vliv teploty a délky skladování vepřového masa na obsah BA (mg/kg). Skladování při 5 C Skladování při 20 C BA čerstvé maso po 8 dnech po 15 dnech po 8 dnech po 15 dnech putrescin 7,8 16,9 18,9 9,4 11,2 histamin 4,7 4,0 9,9 0,5 0,5 kadaverin 13,3 38,6 43,0 27,5 41,2 spermidin 7,0 2,3 3,1 4,6 4,3 spermin 67,1 42,2 31,2 58,6 42,8 Jedním z nejvýznamnějších faktorů výsledného mnoţství BA je jiţ zmiňovaný výběr startovací kultury. Komprda (2005) uvádí, ţe pro výrobu fermentovaných potravin je vhodné nejprve otestovat dekarboxylázovou aktivitu startovacích kultur. Startovací kultury jsou cíleně vybrané kmeny mikroorganismů, které jsou aplikovány do potravin v průběhu výroby za účelem vyvolání poţadovaných změn (správné či rychlejší zrání, sníţení ph, redukce dusičnanů a dusitanů, štěpení bílkovin a lipidů či vytváření senzoricky aktivních látek). Startovací kultury nesmějí být patogenní a musí vykazovat poţadovanou biochemickou aktivitu. Rovněţ inhibují růst kontaminující mikroflóry a tím nepřímo také tvorbu BA (Suzzi and Gardini, 2003). Neméně důleţitým faktorem, který ovlivňuje aktivitu mikrobiálních dekarboxylačních enzymů, je dostupnost substrátu. Tedy přítomnost volných aminokyselin a vyuţitelných sacharidů. V případě nepřítomnosti sacharidů dochází ke zvýšené tvorbě BA. Proto je v této souvislosti uváděna optimální koncentrace glukózy 0,5-2 % (Komprda, 2005). Jak uvádí Bover-Cid et al. (2000) absence cukru ovlivňuje tvorbu biogenních aminů během skladování tak, ţe výrazně stoupá TY, CAD, PUT a TR. Dalším faktorem ovlivňujícím mnoţství BA v potravině je solení. Solením potravin je tvorba BA inhibována. Na druhé straně však má HI a TY osmoprotektivní vliv na ně- 26

22 které bakterie. Z tohoto důvodu můţe docházet při vzrůstu koncentrace soli v substrátu k aktivaci dekarboxyláz, a tedy k růstu koncentrace příslušných BA (Komprda, 1997). Niţší vliv na mnoţství BA má rovněţ aktivita vody. Mezi vodní aktivitou a tvorbou BA byla zjištěna přímá úměra na základě velikosti výrobku (Bover-Cid and Holzapfel, 1999). Jak uvádí Komprda (2004) posouzení vlivu přístupu vzduchu je problematické a nejednoznačné, neboť mikroorganismy mají schopnost syntetizovat některé BA za aerobních podmínek a jiné za anaerobních. Například Enterobacter cloaceae tvoří asi polovinu mnoţství putrescinu v anaerobních podmínkách ve srovnání s aerobními podmínkami a například Klebsiella pneumoniae syntetizuje výrazně méně kadaverinu (Halász et al., 1994). Stručný přehled základních faktorů ovlivňujících mnoţství BA ve finálním výrobku je uveden v tabulce číslo 6. Tabulka 6: Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů (Kalač a Kříţek, 1998). Faktory Vliv na dekarboxylázovou aktivitu ph Dekarboxylázová aktivita je silnější v kyselém prostředí (ph 4-5,5). Rovněţ bakterie produkují dekarboxylázy jako část jejich ochranného mechanizmu proti kyselému prostředí (Komprda, 2004). přítomnost a obsah 0,5-2 % glukózy jsou optimální pro růst mikroorganizmů vybavených glukózy (substrátu) dekarboxylázami, 3 % inhibují syntézu dekarboxyláz. Dále je nutné mít dostupné volné aminokyseliny a pyridoxal-fosfát. Teplota a délka C je optimální pro růst většiny mikroorganizmů vybavených zrání a uchovávání dekarboxylázami. Nízké teploty zastavují metabolismus mikroorganismů, a proto jsou vhodné pro skladování. a w přítomnost NaCl přítomnost NaNO 2 přítomnost O 2 mnoţství jiţ přítomných aminů mikroorganismy Vysoké hodnoty vodní aktivity podporují dekarboxylázovou (Gonzáles- Fernándes, 2003). Aktivuje tyrosindekarboxylázu, inhibuje histidindekarboxylázu Aktivuje tyrosindekarboxylázu Na tvorbě BA se mohou podílet mikroorganizmy aerobní, anaerobní i fakultativně anaerobní (Silla-Santos, 1996). Histamin, agmatin a putrescin inhibují histidindekarboxylázu. Výběr vhodné startovací kultury pří výrobě fermentovaných výrobků (bez dekarboxylázové aktivity) a mnoţství konkurenční mikroflóry (sekundární kontaminace či synergický efekt mezi mikroorganismy). 27

23 Činitelem, který můţe významně ovlivnit sloţení a aktivitu mikroorganismů v potravinách je také koření a v něm obsaţené účinné látky. Ačkoliv jsou primárně pouţívány jako kořenící a chuťové agens v potravinách, mnoho koření má významnou antimikrobiální aktivitu (Jay et al., 2005). 3.4 Přeměny biogenních aminů Biogenní aminy patří mezi poměrně reaktivní látky. Kromě jiţ zmiňovaných enzymových reakcí mohou například oxidativní deaminací poskytovat aldehydy. Dlouhodobým skladováním nebo za zvýšené teploty mohou reagovat s triacylglyceroly za vzniku amidů mastných kyselin. Amidy dále vstupují do reakcí neenzymového hnědnutí, kdy z nich mohou vznikat iminy (Velíšek, 2002). Při pouţití dusitanových nebo dusičnanových solících směsí během vybarvovacích procesů při solení masa, mohou sekundární aminy schopné nitrosace (SPM, SPD) v kyselém prostředí reagovat s dusitany a tvořit stabilní kancerogenní N-nitrososloučeniny. Rovněţ činností některých mikroorganismů během časných fází fermentace se mohou dusičnany přeměňovat v dusitany a tyto pak v kyselém prostředí reagují se sekundárními nebo terciárními aminy či s amidy opět za vzniku nitrosaminů. Reakce nitrosačních činidel s primárními aminy vede k vytvoření netoxických látek (Komprda, 2000). Při záhřevu například PUT můţe vznikat pyrrolidin a zahříváním CAD piperidin (Shalaby, 1996). 3.5 Možnosti odstranění a prevence tvorby BA Brink et al. (1990) uvádí, ţe většina vytvořených aminů je teplotně stabilních, proto jakmile se biogenní aminy v potravině vytvoří je obtíţné je zničit. Jak uvádí Velíšek (2002), tak nejvhodnějším opatřením, které vede k výrobě potravin s nízkým mnoţstvím BA, je vhodná technologie výroby z kvalitních surovin a dodrţování hygienických podmínek při výrobě. Výrazné sníţení obsahu BA fermentovaných výrobků lze docílit pouţitím vhodných bakteriálních startovacích kultur, které nevykazují dekarboxylázovou aktivitu. Velíšek (2002) zmiňuje i moţnost sníţení mnoţství BA ve fermentovaných výrobcích pomocí rozkladných produktů Maillardovy reakce z přidaných redukujících cukrů. 28

24 Některé dekarboxylázy si uchovávají aktivitu i po pasteraci, takţe obsah BA můţe vzrůstat i během skladování potravin, proto je jedním z nejdůleţitějších opatření vhodná teplota a přiměřená doba skladování. Jak ale uvádí Dabrovski and Sikorski (2005) tepelným zpracováním můţe docházet k inaktivaci pyridoxalfosfátu, tedy kofaktoru pro dekarboxylázovou aktivitu, a tím k následnému niţšímu výskytu BA. Doporučení pro prevenci rizika z BA v potravinách (Komprda, 2004) 1. hygienické zacházení se surovinami 1. pečlivý výběr startovacích kultur 2. volit kratší doby fermentace 3. skladovat suroviny i finální výrobky ve vyhovujících hygienických podmínkách 4. vydat doporučení pro rizikové skupiny konzumentů 5. zavést adekvátní hygienické limity Davídek et al. (1995) uvádí jako moţnosti sníţení obsahu aminů v potravinách přídavek diaminooxidázy (oxidace BA za přítomnosti kyslíku na aldehydy), přídavek sacharidů (reakce s aminy vedoucí k neenzymovému hnědnutí) nebo vyluhování části aminů do varné lázně (jen pokud se následně nekonzumuje). 3.6 Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitu Dekarboxylázová aktivita u baktérií není běţná vlastnost mikroorganismů, ale vyskytuje se u mnoha druhů. Zejména se týká rodů Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus (Kříţek a Kalač, 1998; Silla-Santos, 1996). Nejčastější druhy mikroorganismů tvořících BA na jednotlivých druzích potravin jsou uvedeny v tabulce 7. Mnoţství jejich dekarboxyláz je různé. Dokonce i různé kmeny jednoho druhu se mohou lišit produkcí BA aţ o 3 řády (Kříţek a Kalač, 1998). Z potravinářského hlediska jsou nejvýznamnější psychrotrofní mikroorganismy. Jedná se o mikroorganismy rozmnoţující se při teplotách 0 C aţ + 10 C bez ohledu na jejich optimální teplotu. V podstatě jde o mikroorganismy s růstovým optimem v mezofilní oblasti. Patří sem zejména zástupci rodu Pseudomonas, Micrococcus, 29

25 Flavobacterium, Enterococcus, Serratia a dále například Bacillus cereus, Listeria monocytogenes či Clostridium botulinum (Šilhánková, 2002). Tabulka 7: Významné mikroorganismy produkující BA (Velíšek, 2002). Potraviny Mikroorganismy Produkované aminy ryby sýry maso a masné výrobky Fermentovaná zelenina Fermentované produkty ze sóji Morganella morganii, Klebsiela pneumonia, Hafni alvei, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Bacillus sp., Staphylococcus xylosus Lactobacillus buchneri, Lbc. bulgaricus, Lbc. plantarum, Lbc. casei, Lbc. acidophilus, Lbc. arabinosae, Streptococcus faecium, Bacillus macerans, Propionibacterium sp. Pediococcus sp., Lactobacillus sp., Pseudomonas sp., Streptococcus sp., Micrococcus sp., čeleď Enterobacteriaceae Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus sp. Rhizopus oligosporus, Trichosporon beigllii, Lactobacillus plantarum HI, TY, CAD, PUT, AGM, SPM, SPD HI, CAD, PUT, TY, TR HI, CAD, PUT, TY, FEA, TR HI, CAD, PUT, TY, FEA, TR HI, CAD, PUT, TY, TR Důleţité je zmínit, ţe dekarboxylázová aktivita kmenů běţně obsahujících dekarboxylázy, můţe být ve vzorcích ovlivněna nejen enzymatickým vybavením inokulovaných MO, ale také jejich vitalitou. Marcobal et al. (2006) uvádějí, ţe ztráta dekarboxylázové aktivity jednotlivých bakterií můţe být také způsobena dlouhotrvajícím skladováním nebo kultivací izolovaných kmenů na syntetických médiích. 30

26 3.6.1 Rod Escherichia Jedná se o gramnegativní, nesporulující, fakultativně anaerobní tyčinky z čeledi Enterobacteriaceae. E. coli, která je hlavním zástupcem tohoto rodu, je přirozeným obyvatelem lidského a zvířecího trávicího traktu. Sekundárně se nachází ve vnějším prostředí. Ve většině potravin přeţívá, roste a způsobuje jejich fermentaci. Patří mezi fakultativní patogeny či indikátory fekálního znečištění nebo špatné hygieny (Görner a Valík, 2004). Görner a Valík (2004) rovněţ uvádějí, ţe například při výrobě sýrů vyvolává jejich časné duření. E. coli je rovněţ mikrobiálním indikátorem sanitace a dodrţování hygienických poţadavků při získávání, zpracování, skladování, distribuci a spotřebě vody (Corry et al., 2003). Kmeny E. coli mohou způsobovat různá onemocnění, podle kterých je můţeme rozdělit do skupin. Do první skupiny patří enteropatogenní E. coli (EPEC), které způsobují průjmová onemocnění kojenců. Ve druhé skupině jsou enteroinvazivní kmeny (EIEC), které poškozují sliznici tlustého střeva. Třetí skupinu tvoří enterotoxické kmeny (ETEC) vyskytující se hlavně v tropických a rozvojových oblastech. Čtvrtá skupina zahrnuje verotoxinogenní E. coli (VTEC) produkující verotoxin, který způsobuje závaţná střevní onemocnění u malých dětí. Protoţe patogenní kmeny E. coli produkují často tzv. shigatoxin, označují se jako E. coli produkující toxin podobný shigatoxinu (STEC). Nejzávaţnější onemocnění způsobují enterohemoragická E. coli (EHEC) (Burdychová a Sládková, 2007). Z hlediska potravin je nejzávaţnější E. coli O157:H7. Jeho hlavním rezervoárem je skot. Moţné cesty nakaţení člověka jsou fekálně-orální přenos přímým kontaktem s infikovaným zvířetem; fekální kontaminace zemědělských plodin (hnojení); fekální kontaminace vodních zdrojů; fekální kontaminace těl poraţených zvířat během poráţení a eviscerace; konzumace fekálně kontaminovaného syrového mléka nebo produktů z něj vyrobených. Escherichia coli dobře roste při teplotách C. Rovněţ snáší kyselé i zásadité ph a je schopná růst i při 5% koncentraci NaCl. Jak uvádí Komprda (2004) prevence patogenních E. coli musí vycházet z předpokladu výrazného rozšíření v prostředí a jejich dobré schopnosti přeţívat nepříznivé podmínky. Proto je nutné předpokládat jejich přítomnost v potravinách, kde se vyskytují v relativně nízkých koncentracích, které ovšem často stačí k vyvolání onemocnění. 31

27 3.6.2 Rod Bacillus Tento rod bakterií z čeledi Bacillaceae zahrnuje grampozitivní, chemoorganotrofní, aerobní nebo fakultativně anaerobní peritrichní tyčinky se schopností tvořit endospory. Rod Bacillus je rozsáhlý a značně rozšířený v prostředí (půda, voda). Odsud se zejména spory mohou dostávat i do ovzduší. Jak uvádí Komprda (2004) některé druhy vytvářejí amylolytické, pektinolytické a proteolytické enzymy, které pomáhají rozkládat různé organické zbytky rostlin a ţivočichů. Z hlediska optimální teploty se nejedná o jednotné poţadavky. Například B. insolitus nebo B. weihenstephanensis jsou psychrofilní. B. cereus, B. licheniformis a B. anthracis patří mezi mezofilní druhy s optimem růstu mezi 30 aţ 37 o C. B. stearothermophilus, B. licheniformis či B. badius řadíme mezi druhy termotolerantní aţ termofilní druhy s růstem i při 45 aţ 55 C. Z potravin lze očekávat hlavně B. cereus, který se můţe vyskytovat především v koření, kořenovitých rostlinách, v tepelně upravených a nedostatečně vychlazených jídlech a v dlouho uchovávaném pasterovaném mléce. V konzervárenském průmyslu mají význam termorezistentní spóry, které přeţívají sterilační reţim (Görner a Valík, 2004). U kmene Bacillus licheniformis je známa jeho schopnost tvořit diarrhoealní toxin. Díky schopnosti tvorby spor přeţívá nejen vysoké pasterační, ale i UHT teploty. Je rovněţ spojován s otravami z potravin (Salkinoja-Salonen et al., 1999). Jak uvádí Vyletělová et al. (2001) ze syrového kravského mléka se můţeme setkat s kmeny B. cereus, B. licheniformis, B. subtilis, B. weihenstephanensis, B. pumilus, B. luteus, B. lentus, B. fusiformis, B. badius, B. sphaericus, Paenobacillus pabuli, P. glukanolyticus. Ve finálních mléčných výrobcích pak lze očekávat hlavně B. cereus a B. licheniformis (Vyletělová a Hanuš, 2005). 32

28 3.7 Zjištění přítomnosti BA Dekarboxylázová aktivita a potaţmo schopnost mikroorganismů tvořit biogenní aminy lze posuzovat: přímo - stanovením vytvořených BA v kultivačních médiích či v potravinách nepřímo - stanovením dekarboxylázové aktivity mikroorganismů Metoda průkazu dekarboxylázové aktivity mikroorganismů Jedná se o nepřímou metodu proveditelnou různými způsoby. Jde o poměrně jednoduché metody, které vyuţívají ke stanovení tvorby biogenních aminů média obsahující ph indikátor např. bromkresol purpur (Maijala, 1993). Při dekarboxylaci aminokyselin odštěpí příslušná dekarboxyláza z karboxylové skupiny aminokyseliny CO 2 za vzniku alkalického aminu a pozitivní výsledek reakce se projeví změnou zbarvení indikátoru, coţ je způsobeno změnou ph (Brooks and Sodeman, 1974). Tyto screeningové metody jsou rychlé, avšak omezené citlivostí v detekci produkce BA. Rovněţ je známá přítomnost falešně pozitivních a falešně negativních kmenů. Tuto reakci popisovali Bover-Cid and Holzapfel (1999). Uvedli, ţe k ní můţe docházet vlivem fermentační aktivity bakterií, které produkují spolu s BA i kyseliny. Jak uvádí Kalhotka (2007) vizuální hodnocení barevných změn můţe být zatíţeno i osobní chybou. Proto se testují další metody (kolorimetrické hodnocení), jak přesněji určit aktivitu dekarboxyláz. Z těchto důvodů by měla být produkce BA pro kvantifikaci výsledků potvrzena analytickými kvantitativními metodami (HPLC, ELISA). I přes zmíněné nevýhody screeningových metod jsou metody testování dekarboxylázové aktivity pomocí barevných změn vhodné pro relativně rychlé a levné zjištění schopnosti mikroorganismů tvořit BA. 33

29 3.7.2 Přímé metody stanovení biogenních aminů Pro stanovení BA byla v minulosti vyvinuta řada analytických postupů. Tyto metody jsou obvykle účelově zpracovány pro typ materiálu, v němţ mají být aminy stanoveny (Kříţek a Kalač, 1998). Mezi současné metody stanovení obsahu BA patří zejména tenkovrstvá chromatografie, plynová chromatografie, kapalinová chromatografie a kapilární zónová elektroforéza (BA se přeměňují na deriváty detekované UV detektorem). Podle Smělé et al. (2004) se v praxi nejčastěji pouţívá vysoce citlivé chromatografické metody RP-HPLC (vysokoúčinná chromatografie s obrácenými fázemi) s fluorescenční nebo UV detekcí. Dle Silla-Santose (1996) je nejjednodušší a i často pouţívanou metodou iontově-výměnná chromatografie za pouţití automatického analyzátoru aminokyselin. Nevýhodou všech výše zmíněných metod je vysoká časová náročnost a tudíţ je nelze uţívat pro rutinní měření. Před pouţitím některé z metod pro vlastní stanovení BA v potravinách je nutná izolace těchto látek ze zkoumaného vzorku. V případě rozboru nápojů připravujeme vzorek jen filtrací. U ostatních potravin se pro extrakci BA pouţívají extrakční činidla (kyselina chloristá, kyselina chlorovodíková, kyselina trichloroctová, metanol, petroleter aj.). Po homogenizaci vzorku s vybraným činidlem je nutné odstranit vysráţené sloţky odstředěním, filtrací či oběma metodami (Lange et al., 2002; Önal, 2007; Smělá et al., 2004). Jak uvádí Marcobal et al. (1993) schopnost tvořit dekarboxylační enzymy je kódována v DNA mikroorganismů. Právě tato skutečnost umoţňuje pouţití metody PCR pro zjištění dekarboxylázové aktivity mikroorganismů. Lze také pouţít imunochemické metody. Ve srovnání s chromatografickými metodami je jejich výhodou rychlost a niţší náročnost na zařízení (Silla-Santos, 1996; Stratton et al. 1991). Tyto imunochemické techniky jsou zaloţeny na principu tzv. saturační analýzy. Vyznačují se zvýšenou citlivostí a přesností stanovení koncentrace antigenu. Vysoké citlivosti se dosahuje tím, ţe antigen přítomný v analyzovaném vzorku soutěţí ve vazbě na protilátku vţdy se stejným mnoţstvím téhoţ antigenu vhodně označeného radionuklidem (radioimunostanovení = RIA), enzymem (enzymoimunostanovení = EIA a ELISA) nebo jinou značkou (Vodráţka, 1992). V USA se jako oficiální metoda pro stanovení histaminu v potravinách pouţívá měření fluorescence AOAC. Vzorek zkoumané potraviny je nejprve homogenizován, dále derivatizován a poté aplikován na iontově výměnnou kolonu (Stratton et al., 1991). 34

30 3.8 Legislativní požadavky V řadě zemí se můţeme setkat s předepsaným nejvyšším povoleným mnoţstvím pro histamin a tyramin. Česká legislativa do roku 2004 obsahovala legislativní limity na vybrané BA v rybách, sýrech, pivu a vínu, ale dnes v ČR platí jen hygienický limit pro histamin v rybách a výrobcích z nich uváděný v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005. Tento limit se týká produktů rybolovu z druhů ryb spojovaných s vysokým mnoţstvím histidinu (ryby čeledi Engraulidae, Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatoidae a Scombresosidae) a u produktů rybolovu, které byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku a byly vyrobeny z těchto druhů ryb. Konkrétně u ryb při odběru devíti vzorků musí být u sedmi z nich dodrţen limit 100 mg. kg -1 a dva vzorky mohou obsahovat 200 mg. kg -1 histaminu. V případě rybích produktů, ošetřených enzymatickým zráním v láku, platí limit 200 mg. kg -1 u sedmi z devíti vzorků a dva mohou obsahovat 400 mg. kg -1. Limity platí pro výše uvedené produkty během celé doby údrţnosti. Legislativa neurčuje výrobcům deklarovat obsahy BA na obalech výrobků. 35

31 4. Materiál a metodika 4.1 Metoda průkazu dekarboxylázové aktivity mikroorganismů Princip: Při dekarboxylaci aminokyseliny obsaţené v diagnostickém médiu odštěpí příslušná dekarboxyláza z karboxylové skupiny aminokyseliny CO 2 za vzniku alkalického aminu. Pozitivní výsledek se pak projeví změnou zbarvení indikátoru způsobenou změnou ph. Postup: Sterilní zkumavky 80 x 10 mm byly rozplněny 1 ml diagnostické půdy. Jako diagnostické médium byla ke stanovení dekarboxylázových aktivit mikroorganismů pouţita tekutá ţivná půda dle Brookse a Sodemana (1974). Složení diagnostické půdy: Pepton Yeast extract Bromkresolpurpur (0,2% roztok v 50% ethanolu) L-aminokyselina Destilovaná voda 0,5 g 0,3 g 1 ml 1 g 100 ml Jednotlivé sloţky půdy rozpustíme v uvedeném pořadí v destilované vodě. Následně přidáme aminokyselinu (lysin, arginin, histidin, tryptofan, tyrosin, ornithin a fenylalanin) a upravíme ph na 5,0 5,3. Nakonec přidáme indikátor bromkresolpurpur 0,2% roztok. Ten připravíme v porcelánové misce tak, ţe bromkresolpurpur rozetřeme, přidáme postupně 0,05 mol/l NaOH, aţ se vytvoří homogenní suspenze. Tu potom doplníme do 100 ml 50% ethanolem. Složení 100 ml 0,2% roztoku bromkresolpurpuru: Bromkresolpurpur (BKP) NaOH 0,05 mol/l Ethanol 50% 0,2 g 7,4 ml doplnit do 100 ml Následně byly zkumavky zality přibliţně 0,5 ml parafinového oleje pro dosaţení anaerobních podmínek a sterilovány 15 minut při 121 C. Do takto připravených zkumavek byla ve flowboxu zaočkována mikrobiální kultura. 36

32 Takto připravené zkumavky byly vloţeny do termostatů a kultivovány při 37 C respektive 30 C, 25 C a 6 C po dobu 8 dnů. Během této doby byly pravidelně po 24 hodinách zkumavky kontrolovány a byl hodnocen průběh biochemických reakcí vedoucích k odbarvení původní ţluté barvy přes světle ţlutou aţ nafialovělou po sytě fialovou barvu. Princip vyhodnocení barevné reakce ukazuje tabulka 8 a obrázek 1. Na něm vidíme škálu zabarvení zkumavek, kterou tvoří různé fáze dekarboxylázové aktivity mikroorganismů při dekarboxylaci fenylalaninu. U ostatních aminokyselin vypadá průběh obdobně. Tabulka 8: Vizuální hodnocení barevných reakcí Zabarvení reakce Intenzita reakce Aktivita dekarboxyláz Hodnocení intenzity reakce ţlutá bez reakce dekarboxylázy jsou neaktivní - ţlutavě fialová slabá reakce nízká aktivita dekarboxyláz + slabě fialová středně silná reakce středně vysoká aktivita dekarboxyláz ++ sytě fialová silná reakce vysoká aktivita dekarboxyláz +++ Obrázek 1: Škála zabarvení zkumavek dle průběhu dekarboxylázové aktivity. 37