Metody vyšetření imunity

Transkript

1 Metody vyšetření imunity

2 Motto laboratorního vyšetření Cílem je nalézt abnormální funkci imunitního systému, která přináší vysvětlení příznaků/nemoci /nemocí Některé chybné funkce se nemusí projevovat onemocněním pacienta Některé příznaky/nemoc nemusí být provázeny zjistitelnou poruchou vždy je měřící metoda nedokonalá a málo přesná Technologie se intenzívně vyvíjejí a klinická věda má potíž se vyrovnat s jejich interpretací

3 Humorální složky imunity Imunoglobuliny, protilátky - specifické nespecifické proteiny akutní fáze systém komplemetu Autoprotilátky Komplement vyšetření séra (moč, mozkomíšní mok, patologické výpotky)

4 Oblasti vyšetření imunity Buněčná imunita Zastoupení imunokompetentních buněk Počty buněk, subpopulací, prekurzorů Funkční testy změna fenotypu (membránový znak) při změně funkce (aktivaci) in vivo, in vitro Tvorba produktů buňky - Ig, cytokiny Změny v jaderném materiálu

5 Základní principy testů imunity Téměř všechny testy jsou založeny na reakce Antigen protilátky Imunokomplexy jsou málokdy viditelné IK jsou konjugovány na enzym (substrát), či fluorochrom Imunokomplex je obvykle vázán na pevnou fázi zkumavka, destička apod. Ag může být exsprimován v tkáni (pak je tkáň nebo buňka viditelná)

6 METODY VYŠETŘOVÁNÍ HUMORÁLNÍ IMUNITY aglutinace turbidimetrie a nefelometrie enzymoimunoanalýza (ELISA) elektroforéza, imunofixace, imunoblotting nepřímá imunofluorescence

7 Aglutinace princip: reakce mezi Ag a Ab se projeví tvorbou sraženiny viditelné pouhým okem (aglutinát) korpuskulární Ag (bakterie, Ag na nosiči) + vyšetřované sérum průkaz spec. protilátek hodnocení: kvalitativní (ano/ne), kvantitativní (titrace séra)

8 Aglutinace kvantitativní ředění séra geometrickou řadou stanovení

9 Uplatnění aglutinace infekční sérologie (Salmonella typhi, Listeria monocytogenes, ) diagnostika autoimunitních onemocnění (autoimunitní hemolytická anémie - Coombsův test) stanovení krevních skupin (hemaglutinace)

10

11 Turbidimetrie a nefelometrie princip: měření množství imunitních komplexů Ag-Ab při nadbytku Ab reakce v tekutém prostředí v kyvetě hodnocení: koncentrace Ag přímo úměrná - rychlosti tvorby zákalu (kinetický systém) - hustotě zákalu ( end point )

12 Nefelometrie precipitace v roztoku měří se intenzita světla odraženého od precipitátu v šikmém směru kalibrační křivka

13 Uplatnění turbidimetrie a nefelometrie stanovení koncentrace sérových proteinů (imunoglobuliny, proteiny akutní fáze, složky komplementu C3, C4, transferin, albumin ) rychlé, plně automatizované metody pro velké série vzorků

14 Imunoreakce se značenými protilátkami RIA Ab značena radioizotopem EIA Ab značena enzymem detekce reakce dle povahy sbustrátu: fotometrie, fluorometrie, luminometrie, ELISA antigen vázán na pevnou fázi

15 Enzymová imunosorpční analýza (ELISA) protilátka konjugovaná s enzymem protilátky v testovaném vzorku substrát pro enzym barevný produkt

16 Stanovení optické density hodnocení: fotometricky čím intenzita barevné reakce, tím koncentrace stanovované látky OD koncentrace

17 Uplatnění ELISY stanovení sérové koncentrace specifických protilátek (borelióza, tetanus, hepatitída), autoprotilátek, cytokinů, antigenů (HIV) vysoká senzitivita (<1ng/l) vysoká specifita reprodukovatelnost

18 Uplatnění ELISY Stanovení IgG proti Clostridium tetani Indikace: nejasná anamnéza posledního očkování rozhodování o způsobu vakcinace u traumatizovaných pacientů s neznámým údajem o očkování vyšetření humorální imunity u imunodeficiencí

19 Elektroforéza séra

20 Imunofixace

21 Aplikace imunofixace detekce paraproteinu/monoklonálního Ig diagnostika monoklonálních gamapatií (mnohočetný myelom, makroglobulinémie, CLL, B-lymfom) paraprotein: syntetizovaný jedním klonem myelomových buněk (nádorově transformované B lymfocyty)

22 Imunoblotting (Western blot) 1) elektroforéza dělení dle velikosti 2) přenos proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli 3) imunodetekce: + vzorek séra + značená sekundární Ab (HRP) + substrát vznik barevné reakce

23 Uplatnění imunoblottingu průkaz přítomnosti Ab proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ) Borrelia burgdorferi detekce i několika Ab proti specifickým Ag najednou imunodot: komerční uměle čištěné nebo rekombinantní antigeny fixované na membráně

24 IMUNOBLOTová analýza Ab proti BORRELIA BURGDORFERI POZITIVNÍ KONTROLA patients specimens IgM IgG

25 Imunodot

26 Autoprotilátky reagují se složkami vlastního organizmu fyziologicky: v nízkých koncentracích, věkem využívají se v diagnostice autoimunitních nemocí orgánově nespecifické (např. proti buněčnému jádru, mitochondriím, ) revmatické choroby orgánově specifické (např. proti antigenům buněk slinivky břišní)

27 Nepřímá imunofluorescence

28 ANA protilátky (anti-nuclear) reagují s jadernými antigeny (ds-dna, histony, jadérko, mitotický aparát, ) substrát: Hep 2 buňky nukleolární typ fluorescence (autoprotilátky proti jadérku) homogenní typ fluorescence (autoprotilátky proti ds-dna a histonům)

29 METODY DETEKCE BUNĚČNÉ IMUNITY Fenotypizace imunitních buněk - průtoková cytometrie metody stanovení funkční aktivity lymfocytů testy fagocytárních funkcí

30 Průtoková cytometrie (FACS) analýza jednotlivých buněk v suspenzi současné měření řady parametrů chemické, fyzikální a biologické vlastnosti buňky (ph, membránový potenciál, velikost, granularita, viabilita) exprese povrchových membránových molekul obsah DNA a jiných intracelulárních molekul selekce požadované buněčné populace (sortování)

31 Průtokový cytometr PE PE-Cy7 FITC APC detektory fluorescence LASER FSC SSC označené buňky PC analýza

32 Prinicip průtokové cytometrie velikost FS Gr Fluidní část Optická část Elektronická část Mo Ly granularita SS

33 Izolace lymfocytů z krve gradientová centrifugace (oddělení buněk podle rozdílů v jejich hustotě)

34 Rozdělení leukocytů podle velikosti a granularity granulocyty scattergram monocyty lymfocyty

35 Značení buněk pro FACS PŘÍMÉ ZNAČENÍ NEPŘÍMÉ ZNAČENÍ excitace (laser) emise fluorescence emise fluorescence fluorochromem značená sekundární Ab/streptavidin fluorochromem značená mab membránový marker purifikovaná/biotinylovaná mab

36 Dvojbarevné značení CD8 PE dot plot CD4 FITC

37 Průtokoková cytometrie s užitím dvojitě značené protilátky anti -CD4, anti-cd8

38 Uplatnění FACS analýzy fenotypizace buněk (diagnostika primárních imunodeficitů, autoimunitních chorob, leukémií a lymfomů, monitorování pacientů po transplantaci) funkční testy leukocytů a trombocytů hodnocení spermatogeneze, detekce virů, bakterií a parazitů, vyšetření chromozomů, vyšetření aktivity enzymů, stanovení intracelulárního vápníku

39 Antigení profil u hematologické malignity

40 Funkční testy lymfocytů exprese aktivačních markerů proliferace cytotoxicita sekrece cytokinů tvorba protilátek

41 Sledování exprese aktivačních markerů časné aktivační markery (CD69) CD69 CD25, CD71 pozdní aktivační markery (VLA) CD4

42 Proliferace lymfocytů (opakování) rozeznání nativního antigenu (BCR) + kostimulační signál od Th2 lymfocytů (IL-4, 5, CD40L) rozeznání komplexů antigenních peptidů s MHC I/II na povrchu APC buněk (TCR) + kostimulační signál (IL-4/12, CD80/86)

43 Proliferační testy (1) 3 H- tymidinový test kultivace izolovaných lymfocytů v médiu se stimulačními látkami (3-7 dní/37 C) inkubace s radioaktivně značeným tymidinem ( 3 H) inkorporace 3 H- tymidinu do DNA proliferujících lymfocytů detekce -záření ( -counter) čím proliferace tím naměřená radioaktivita

44 Uplatnění funkčních testů lymfocytů diagnostika SCID diagnostika a prognostika zhoubných nádorů monitorování buněčné imunity (sekundární imunodeficity, traumata, sepse, pooperační stavy) monitorování rozvoje štěpu po transplantaci kostní dřeně testování nových léků (farmakologie, protinádorová imunoterapie)

45 Testy fagocytárních funkcí stanovení exprese adhezívních molekul testování chemotaxe fagocytóza baktericidní test testy oxidačního vzplanutí

46 Fagocytóza (1) vyšetření fáze ingesce substrát Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, polymerové partikule suspenze partikul nebo kvasinek + plná krev (inkubace 37 C/1hod) zhotovení krevního nátěru fixace a barvení odečítání ve světelném mikroskopu

47 Fagocytóza (2) hodnocení 100 buněk, pozitivní obsahují 3 a více pohlcených částic fagocytární aktivita % fagocytů s pohlcenými částicemi ze všech fagocytujících buněk fagocytární index průměrný počet částic pohlcených jednou buňkou

48 Testy oxidačního vzplanutí (1) vyšetření schopnosti fagocytů tvořit kyslíkové radikály (aktivace NADPH oxidázy) testy využívající průtokovou cytometrii plná krev + forbolové estery + dihydrorhodamin vznik rhodaminu (působení kyslíkových radikálů) měření intenzity fluorescence

49 Aktivace bazofilních leukocytů alergenem