MASARYKOVA UNIVERZITA LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ FAGOCYTÓZY PRO KLINICKOU PRAXI

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU a FN u sv. Anny v Brně LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ FAGOCYTÓZY PRO KLINICKOU PRAXI Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí práce : Autor : prof. MUDr. Jindřich Lokaj, CSc. Petra Blažková Brno, duben 2012

2 Jméno a příjmení autora : Petra Blažková Název bakalářské práce : Laboratorní vyšetřování fagocytózy pro klinickou praxi Anglický název bakalářské práce : Laboratory tests of phagocytosis for clinical practice Pracoviště : Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU a FN U sv. Anny v Brně Vedoucí bakalářské práce : prof. MUDr. Jindřich Lokaj, CSc. Rok obhajoby bakalářské práce : 2012 Souhrn : Bakalářská práce se zabývá procesem fagocytózy a možnostmi jejího laboratorního vyšetření. Fagocytóza je základem vrozené imunity člověka. Jedná se o proces, kdy specializované buňky imunitního systému označované jako profesionální fagocyty pohlcují, usmrcují a rozkládají mikroorganismy a jiné nežádoucí struktury. Mezi profesionální fagocyty patří neutrofilní granulocyty a mononukleární fagocyty. Laboratorní vyšetření fagocytózy má praktický význam při diagnostice chorob, které jsou způsobeny poruchou funkce těchto buněk. Poruchy fagocytózy mohou být vrozené i získané. Cílem této práce je popis a posouzení diagnostického přínosu metodik užívaných v laboratořích klinické imunologie. Hlavní pozornost je věnována chronické granulomatózní chorobě na příkladu pacienta dispenzarizovaného na ÚKIA LF MU a FN u sv. Anny.. Klíčová slova : fagocytóza, respirační vzplanutí, chemiluminiscence, průtoková cytometrie, chronická granulomatózní choroba Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením prof. MUDr. Jindřicha Lokaje, CSc. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne...

4 Ráda bych poděkovala panu prof. MUDr. Jindřichu Lokajovi, CSc. za odborné rady, ochotu a pomoc při zpracovávání bakalářské práce. Mé další poděkování patří paní laborantce Terezii Kamenické z Ústavu klinické imunologie a alergologie ve FN u sv. Anny za poskytnuté informace ohledně praktického provedení uvedených testů.

5 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST 2. FAGOCYTÓZA FAGOCYTY Základní rozdělení fagocytů Polymorfonukleární leukocyty / neutrofilní granulocyty Monocyty / makrofágy Rozpoznávací mechanismy fagocytů PRŮBĚH FAGOCYTÓZY Adheze Extravazace a diapedéza Chemotaxe Ingesce Digesce Mechanismy zabíjení na kyslíku závislé Mechanismy zabíjení na kyslíku nezávislé PŘEHLED PORUCH FAGOCYTÓZY PRIMÁRNÍ PORUCHY FAGOCYTÓZY Poruchy v počtu neutrofilů Poruchy ve funkcích fagocytů LAD I syndrom LAD II syndrom Defekty neutrofilních granulí Deficit myeloperoxidázy Nedostatek specifických granulí Chediak Higashiho syndrom SEKUNDÁRNÍ PORUCHY FAGOCYTÓZY Poruchy granulocytů v důsledku přítomnosti autoprotilátek Poruchy granulocytů v důsledku přítomnosti jiných sérových faktorů CHRONICKÁ GRANULOMATÓZNÍ CHOROBA GENETICKÝ PODKLAD

6 4.2. KLINICKÉ PŘÍZNAKY DIAGNOSTIKA ONEMOCNĚNÍ LÉČBA METODICKÁ ČÁST 5. DIAGNOSTIKA PORUCH FAGOCYTÓZY TESTY ADHEZE TESTY CHEMOTAXE Test chemotaxe pod agarózou Boydenova komora a její modifikace Rebuck skin window TESTY INGESCE TESTY RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ Testy redukce tetrazoliových solí Chemiluminiscenční test Burst test Průtoková cytometrie TESTY MIKROBICIDIE PŘÍNOS JEDNOTLIVÝCH METODIK V DIAGNOSTICE PORUCH... FAGOCYTÓZY KAZUISTIKA PACIENTA VYŠETŘENÉHO NA ÚKIA LF MU a FN u sv. Anny KAZUISTIKA PACINTA S PODEZŘENÍM NA CGD BURST TEST Použitý materiál a jeho příprava Biologický materiál Chemikálie Příprava reagencií Provedení burst testu Referenční hodnoty Výsledky vyšetření pacienta S.A Závěr laboratorního vyšetření CHEMILUMINISCENČNÍ TEST Použitý materiál a jeho příprava Biologický materiál Chemikálie

7 Příprava reagencií Provedení chemiluminiscenčního testu Výsledky vyšetření pacienta S.A Závěr laboratorního vyšetření ZÁVĚR BAKALÁŘSKÉ PRÁCE SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHA

8 POUŽITÉ SYMBOLY A ZKRATKY APC BPI CD CGD CHS DHR DNA ESID FACS fmlp G-CSF HIV HLA INT ICAM IL INF IMV IUIS JAM LAD LYST MBL MFS buňka předkládající antigen (antigen-presenting cell) baktericidní a permeabilitu zvyšující protein (bactericidal permeability increasing protein) diferenciační antigen (cluster of differentiation) chronická granulomatózní choroba (chronic granulomatous disease) Chediak Higashiho syndrom dihydrorhodamin deoxyribonukleová kyselina Evropská společnost pro primární imunodeficience průtoková cytometrie (fluorescence activated cell scanner) formyl methionyl leucyl-phenylalanin (chemotaktický peptid) faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyte colony stimulating factor) virus lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus) hlavní lidský histokompatibilní systém (human leukocyte antigens) iod-nitroblue-tetrazolium intercellular adhesion molekule (mezibuněčná adhezivní molekula) interleukin interferon index metabolického vzplanutí Mezinárodní unie imunologických společností junction adhesion molekule deficit leukocytárních adhezních molekul (leukocyte adhesion deficiency syndrom) cytosolický protein lektin vázající manózu (mannose binding lectin) mononukleární fagocytární systém

9 MPO myeloperoxidáza MHC hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility komplex) mrna informační ribonukleová kyselina (messenger ribonucleic acid) MSHP mikrosférické hydrofilní partikule NADP + nikotinamidadenindinukleotid fosfát (oxidovaná forma) NADPH nikotinamidadenindinukleotid fosfát (redukovaná forma) NBT nitroblue-tetrazolium PAMP pathogen associated molecular patterns PAF faktor aktivující krevní destičky (platelet activating factor) PBS fosfátový pufr (phosphate buffered saline) PECAM platelet-endothelial adhesion molekule (adhezivní molekula destiček a endotelií) PMA phorbol myristát-acetát PMN polymorfonukleární neutrofily PRR pathogen recognition receptors PHOX phagocyte oxidase RFLP restriction fragment lengh polymorphism SLeX sial-lewis X TNF tumor nekrotizující faktor (tumor necrosis factor) TLR toll-like receptor ÚKIA Ústav klinické imunologie a alergologie

10 1. ÚVOD Fagocytóza je základní mechanismus vrozené imunitní reaktivity a nedílnou součástí systému adaptivní imunity. Poruchy fagocytózy mohou být vrozené a získané. K posouzení jednotlivých fází fagocytárního procesu se používá řady laboratorních metodik, z nichž pro praktickou medicínu mají význam především ty, které odhalují funkční poruchy fagocytózy - chemotaxi, adhezivitu, ingesci a aktivaci metabolismu zejména respirační vzplanutí. Ve druhé kapitole se budu zabývat procesem fagocytózy, uvedu její jednotlivé fáze a buňky, které ji zprostředkovávají. Třetí kapitola se týká poruch fagocytózy a obecného popisu jednotlivých chorob. Následující kapitola se podrobněji zabývá chronickou granulomatózní chorobou, jejím vznikem, klinickými příznaky, diagnostikou a léčbou. Pátá kapitola bude zaměřena na diagnostiku poruch fagocytózy a přínos těchto metodik pro klinickou medicínu. V této kapitole se věnuji především testům posuzujícím respirační vzplanutí leukocytů. Cílem bakalářské práce je popis a posouzení diagnostického přínosu metodik užívaných v laboratořích klinické imunologie s uvedením vybrané kazuistiky pacienta vyšetřeného na ÚKIA LF MU a FN u sv. Anny

11 TEORETICKÁ ČÁST 2. FAGOCYTÓZA Slovo fagocytóza pochází z řeckých slov phagein (jíst) a cytos (buňka) a poprvé ho v roce 1883 použil Ilja Iljič Mečnikov (Ferenčík, Rovenský, 2005). Fagocytóza je proces pohlcení a degradace částic větších než 0,5 μm. Je to evolučně velmi starý děj, který je podobný pohlcování potravních částic amébami (Hořejší, Bartůňková, 2009). Profesionální fagocytující buňky (neutrofilní leukocyty, monocyty a makrofágy) mají schopnost vyhledat, pohltit, usmrtit, degradovat mikroorganismy, stárnoucí a poškozené buňky a jiný cizorodý materiál. Fagocytóza zahrnuje přilnutí fagocytů k endoteliím cév, průchod do tkáně, putování za škodlivinou, rozpoznání, pohlcení a zničení škodliviny. Má významnou úlohu v imunitním systému a to jak v přirozené, tak v adaptivní složce imunity FAGOCYTY Podstatnou část imunitního systému tvoří bílé krvinky, které vznikají z pluripotentních kmenových buněk přítomných v kostní dřeni. Charakteristickým znakem těchto buněk je adhezivní molekula CD34. V kostní dřeni se udržují v malém počtu po celý život a vlivem různých faktorů jsou diferencovány na různé typy leukocytárních buněk. Jejich úbytek je kompenzován dělením. Fagocyty vznikají z myeloidní linie. Mezi tyto buňky řadíme neutrofilní granulocyty a monocyty, které cirkulují v krvi a ve tkáních se diferencují na makrofágy (Hořejší, Bartůňková, 2009) ZÁKLADNÍ ROZDĚLENÍ FAGOCYTŮ Profesionální fagocyty dělíme na polymorfonukleární leukocyty, z nichž podstatnou část tvoří neutrofilní granulocyty a monocyty / makrofágy. Jedná se o základní buňky nespecifické imunity a ústřední buňky zánětlivé reakce (Hořejší, Bartůňková, 2009)

12 Polymorfonukleární leukocyty / neutrofilní granulocyty Mezi granulocyty patří neutrofilní granulocyty (neutrofily, PMN = polymorfonukleární neutrofily), eozinofilní granulocyty (eozinofily) a bazofilní granulocyty (bazofily). Největší zastoupení z těchto buněk zaujímají neutrofilní granulocyty, které jsou hlavními fagocytujícími buňkami. Tvoří asi 50 až 70 % všech leukocytů. Jak jsem se již zmínila, vznikají z myeloidní linie a jejich životnost je po terminální diferenciaci v kostní dřeni krátká. Průměrná doba života neutrofilního granulocytu po uvolnění z kostní dřeně činí po 4 až 8 hodinách cirkulace v krvi 4 až 5 dní ve tkáni. Cirkulující neutrofily jsou v rovnováze s poolem neutrofilů v tkáních. Neutrofilní granulocyty jsou velmi pohyblivé buňky, které mají laločnaté jádro, jehož členitost je dána stářím. Čím je starší granulocyt, tím má více jaderných segmentů a naopak. Jádro bývá členěno na 2-5 segmentů. Neutrofilní granulocyty se někdy podle Mečnikova označují jako mikrofágy. Jejich granula obsahují celou řadu biologicky aktivních látek, které slouží k likvidaci pohlcených částic. Rozlišujeme tří typy granul a dělíme je na primární (azurofilní), sekundární a terciární. Primární granula jsou větší, membránou ohraničené struktury, které obsahují různé degradační enzymy včetně kyselých hydroláz, myeloperoxidázy, kationty bílkovin včetně defenzinů. Sekundární (specifická) granula jsou menší a více početnější. Obsahují laktoferin a protein vázající vitamín B12. Třetí druh granulí označovaný jako terciární je podobný specifickým granulím, ale je více aktivní (Trojan a kol., 2003; Bartůňková, 2002; Kamani a Douglas, 1997). Neutrofilní granulocyty jsou primární linií obrany proti bakteriálním a plísňovým infekcím. Jsou to buňky, které se jako první dostanou na místo infekce. Tvoří podstatnou část fagocytárního systému a jsou nejdůležitějšími nástroji nespecifického obranného systému. Neexprimují na svém povrchu MHC proteiny II. třídy a nejsou tedy buňkami prezentující antigen (Kamani a Douglas, 1997; Hořejší, Bartůňková, 2009) Monocyty / makrofágy Monocyty, největší ze všech krvinek, jsou součástí mononukleárního fagocytárního systému (MFS = systém mononukleárních fagocytů). Základními funkcemi tohoto systému je fagocytóza mikroorganismů, eliminace a prezentace antigenů, účast na remodelaci tkání,

13 destrukce starých nebo poškozených erytrocytů s podílem na možnost ovlivnění metabolismu železa (Trojan a kol., 2003; Penka, Tesařová, 2011). Zralé monocyty mají nepravidelné většinou ledvinovité jádro bez nukleolů, cytoplazma je kouřově šedá s jemnou azurofilní granulací. Po dokončení posledního mitotického dělení jejich prekurzorů jsou vyplavovány z dřeně do krve. Poločas v krvi je na rozdíl od neutrofilů podstatně delší, uvádí se 1 až 3 dny (Bartůňková, 2002; Penka, Tesařová, 2011). Z krve migrují do tkání nebo tělních dutin, kde se metamorfují v tkáňové makrofágy. Při této přeměně se zvětšují a přibývají buněčné organely hlavně lyzosomy a mitochondrie. Makrofágy patří mezi ústřední buňky přirozené imunity, mají významnou regulační funkci. Plní zásadní roli v ochraně proti intracelulárním patogenům a v odstraňování vlastních poškozených buněk. Jsou přítomné ve všech tkáních a orgánech, kde přežívají několik měsíců i let. Konečná diferenciace je ovlivněna místními faktory a makrofágy. Existují v různých specializovaných podobách a funkcích - jako osteoklasty v kostní tkáni, mikroglie v mozku, Kuppferovy buňky v játrech a histiocyty v pojivu. I přes místní funkční specializaci mají makrofágy hlavní funkce společné. Makrofágy patří mezi buňky prezentující antigen (APC = antigen presenting cells). Mohou cizorodou látku (antigen) zpracovat a předložit ji lymfocytům. Zabezpečení složitého průběhu interakcí v imunitním systému je zajištěno jejich sekrečními funkcemi. Tvoří a uvolňují biologicky aktivní látky - cytokiny, složky komplementu, cytotoxické látky, chemokiny, deriváty kyseliny arachidonové, erytropoetin, kyslíkové a dusíkové radikály (Toman, 2009; Penka, Tesařová, 2011; Trojan a kol., 2003; Hořejší, Bartůňková, 2009) ROZPOZNÁVACÍ MECHANISMY FAGOCYTŮ Fagocyty rozpoznávají struktury na povrchu mikroorganismů na rozdíl od struktur tělu vlastních a nepoškozených. Označují se jako PAMP = pathogen associated molecular patterns. Mezi ně patří endotoxiny (lipopolysacharidy) typické pro gramnegativní bakterie, peptidoglykany pro bakterie grampozitivní, glukany a mannany pro kvasinky a plísně. Pro buňky vlastní, určené k apoptóze, jsou charakteristické negativně nabité fosfolipidy, které jsou u zdravých buněk přítomny na vnitřní straně membrány. Díky tomu je fagocyty nerozpoznají a nezničí. Pro všechny tyto struktury mají fagocyty na svém povrchu vlastní receptory označované jako PRR = pathogen recognition receptors (Hořejší, Bartůňková, 2009)

14 Fagocytóza je zprostředkovaná interakcemi mezi lektiny přítomnými na povrchu fagocytů a sacharidy, které jsou součástí mikrobiálních glykoproteinů a polysacharidů na povrchu mikroorganismů. Mezi nejvýznamnější lektiny patří mannosový receptor, který rozeznává polysacharidy obsahující D-mannosu. Dalším lektinem na povrchu fagocytů je galaktosový receptor pro galaktosylové zbytky z povrchu erytrocytů. Erytrocyty jsou tímto způsobem vychytávány z oběhu jaterními makrofágy. Lipopolysacharid na bakteriích je vázán granulocytárním a monocytárním receptorem CD14. Důležitá je i skupina 13 TLR receptorů (toll-like receptor), které jsou schopny rozpoznat celou řadu chemických struktur. Jsou považovány za nejvýznamnější rozpoznávací mechanismus fagocytózy lokalizovaný na membráně nebo uvnitř buňky. Membránové receptory jsou schopny rozpoznat lipidy mikrobiálního povrchu a intracelulární nukleové kyseliny virů a bakterií (Hořejší, Bartůňková, 2009; Toman, 2009). Svůj význam mají nitrobuněčné receptory Nod (nukleotide binding oligomerization domain) pro všechny mnohobuněčné organismy i rostliny. Mezi receptory, které jsou významné pro neopsonizované bakterie, patří scavengerové (uklízecí) receptory. Pomocí těchto receptorů je rozpoznávána stěna bakterií a kvasinek přesněji jejich polyaniontické struktury - lipoteichoová kyselina a lipopolysacharid (Toman, 2009). V těchto případech se jednalo o první mechanismus rozpoznávání cizorodých částic, tím druhým je opsonizace, pro kterou je důležité vzájemné působení protilátek, komplementových složek a dalších sérových proteinů. Protilátky a fragmenty komplementu působí jako opsoniny, které cizorodou částici označí. Mezi opsoniny patří již zmíněný sérový lektin vázající mannosu (MBL, mannose binding lectin), fibronektin, fibrinogen a pentraxiny, do nichž patří C-reaktivní protein a sérový amyloid P (Bartůňková, 2002). Pokud jsou na mikroorganismus navázané protilátky, rozeznávají je tzv. Fc receptory fagocytů. Na povrchu mikroorganismů dochází k aktivaci komplementu, jehož fragmenty (především C3b) se v těchto místech usazují a jsou rozpoznávány receptory pro komplement (Hořejší, Bartůňková, 2009) PRŮBĚH FAGOCYTÓZY Fagocytóza je speciálním druhem endocytózy a skládá se z několika kroků:

15 ADHEZE Adheze znamená přilnutí fagocytárních buněk (neutrofilů) především na stěnu cév. Fagocytující buňky, cirkulující v krevním oběhu, se k místu v poškozené či infikované tkáni dostanou tak, že se zachytí na povrchu endoteliálních buněk cév těchto tkání. Biochemické zprávy (tzv. chemotaxiny) generované z místa zánětu mají za následek aktivaci endoteliálních buněk i fagocytů. To vede k interakci mezi molekulami buněčného povrchu. K těmto interakcím dochází hlavně vlivem adhezivních molekul, které jsou umístěné na neutrofilech i na cévním endotelu. Pro neutrofily představují jeden z nejvýznamnějších podnětů, který je nezbytný pro diapedézu neutrofilů do tkání v průběhu zánětu. Mezi adhezivní molekuly patří skupina kadherinů, integrinů, selektinů a rod imunoglobulinů. Do nejúčinnějších aktivátorů fagocytů patří především interferony (INF-α, β a γ), nekrotizující faktory (TNF), faktory stimulující kolonie granulocytů i makrofágů. Další skupinu aktivátorů tvoří interleukiny (zejména IL-2, 3, 4 a další). Aktivace neutrofilů vede ke zvýšení metabolické aktivity. Adheze leukocytů na endoteliální buňky je prvním krokem v migraci leukocytů do míst extravaskulárního poškození tkání a infekce. Při neexistenci účinné přilnavosti k vaskulárním endoteliálním buňkám nejsou fagocytární buňky schopny úspěšně přejít do místa infekce a dochází ke zvýšené náchylnosti k bakteriálním a plísňovým infekcím. Poruchy přilnavosti leukocytů má za následek abnormální adhezi neutrofilů na povrch buněk a abnormality neutrofilní motility (Bartůňková, Hořejší, 2009; Kamani a Douglas, 1997; Šterzl, 1993) EXTRAVAZACE A DIAPEDÉZA Po aktivaci neutrofilů a endotelových buněk se neutrofily pevně přichytí na cévní endotel. Následně mezi těmito buňkami prostoupí do tkáně. Tento proces nazýváme diapedéza. V širším slova smyslu to znamená prostup aktivovaného neutrofilu do poškozené tkáně převážně v těch místech, kde jsou přerušeny pevné spoje mezi jednotlivými endotelovými buňkami. V těchto místech nacházíme zvýšené množství P-selektinů, které zesílují adhezi neutrofilů. Na prostupu neutrofilu do tkáně se podílejí dvě adhezivní molekuly - PECAM-1 a JAM (junction adhesion molecule). PECAM-1 je v zesílené míře vyjádřena na endotelových buňkách a v místě mezibuněčných spojů. JAM se selektivně vyskytuje na meziendotelových

16 spojích, ale nenachází se na neutrofilech. Neutrofily se při vstupu endotelovými strukturami dostanou do kontaktu s molekulami jejich mezibuněčné hmoty, u kterých dochází ke strukturním změnám a tím k zesílení aktivace, adheze a migrace neutrofilů. Migrující neutrofily zpětně modulují vlastnosti mezibuněčné hmoty tak, že produkují cytokiny, chemokiny a degradativní enzymy. Při extravazaci neutrofilů se uplatňují interakce mezi adhezivními proteiny endotelií tzv. selektiny a sacharidovými strukturami, zejména oligosacharidy, které jsou přítomné ve velkém množství na povrchu neutrofilů až dojde k úplnému zpomalení pohybu neutrofilů. Jsou-li v okolí přítomny zánětlivé cytokiny nebo chemokiny, dochází k dalším vazbám leukocytárních integrinů na povrchový glykoprotein endotelií tzv. ICAM-1 (intercellular adhesion molekule 1). Tato ireverzibilní vazba je umožněna konformační změnou struktury integrinů vlivem prozánětlivých cytokinů. Tím dochází k podnětu, kdy neutrofily vycestovávají štěrbinou mezi endoteliálními buňkami směrem k lokalitě zánětu (Bartůňková, Hořejší, 2009; Kamani a Douglas, 1997) CHEMOTAXE V tkáni se neutrofily aktivně pohybují do poškozeného místa. Je to pohyb fagocytů ve směru koncentračního gradientu chemotaktického faktoru. Tento usměrněný pohyb buněk je zajišťován látkami, které se označují jako chemotaktické (chemotaxiny, chemokiny) a jsou uvolňované v místě zánětu. Mohou být endogenního nebo exogenního původu. Z exogenních látek to jsou například některé bakteriální oligopeptidy obsahující chemotaktický tetrapeptid fmlp (formylmethionyl-leucyl-phenylalanin) produkovaný celou řadou mikroorganizmů. Mezi endogenní chemotaxiny patří aktivační produkty komplementového systému, jako jsou fragmenty C5a ac3a, leukotrien B 4, PAF-1 (plateled-activating factor, faktor aktivující krevní destičky) a rozsáhlá skupina cytokinů zejména interleukin 8 (IL-8). Všechny tyto látky vykazují funkční působení po vazbě na specifické membránové molekuly fagocytů. Pro každý chemokin je na povrchu neutrofilu přítomen receptor. Při jejich stimulaci dochází k chemotaxi a aktivaci fagocytózy. Vzniká komplex, který se dostává dovnitř buňky. Ve fagocytu dochází ke změně v uspořádání cytoplazmatických mikrofilament a tubulů. Při kontrakci vláken aktinu a myosinu v mikrofilamentech dojde ke změně tvaru fagocytu a k jeho posouvání směrem ke zdroji chemotaxinů (Bartůňková, Hořejší, 2009)

17 INGESCE Jakmile fagocyt doputuje ke zdroji chemotaxinů, naváže se na tuto látku a následuje pohlcení této částice. Při této fázi jsou pohlcovány pouze částice větší než 0,1 μm. Aby ingesce proběhla v pořádku, je důležitá pevná vazba neutrofilů na povrch pohlcované částice. K přichycení a rozpoznání cizorodé částice dochází prostřednictvím receptorů umístěných na povrchu neutrofilů. Receptory se váží na příslušný ligand cizorodé struktury nebo opsonizující látky. Nejvýznamnější opsonizující látky jsou specifické protilátky třídy IgG a IgM a složky komplementového systému C3b a C4b. Opsonizujícími látkami jsou taktéž sérový lektin vázající manózu (MBL, manose binding lectin), fibronektin, fibrinogen a proteiny ze skupiny tzv. pentraxinů C-reaktivní protein a sérový amyloid P. Po vazbě receptoru na příslušný ligand cizorodé částice dojde k postupnému obklopení cizorodé částice pseudopodiemi fagocytu. Částice je obklopena povrchovou membránou fagocytu a postupně vzniká vakuola zvaná fagosom, jehož tvorba závisí na intracelulárním přeskupení kontraktilních proteinů mikrofilamentového a mikrotubulového systému (Bartůňková, Hořejší, 2009) DIGESCE Vzniklý fagosom následně splyne s lyzosomy a vzniká tzv. fagolyzosom, ve kterém probíhá vlastní degradace cizorodé částice aktivací mikrobicidních systémů. Dochází k napadení pohlcených mikroorganismů a k jejich zničení. Fagocyty po odstranění mikroorganismů a dalších cizorodých částic po krátké době hynou; ve větším množství tvoří hnis - pus. Jejich zbytky jsou odstraňovány makrofágy. Životnost makrofágů je delší a jsou schopny fagocytózu několikrát opakovat (Bartůňková, Hořejší, 2009). Jsou k dispozici dva způsoby vlastního usmrcování mikroorganismů

18 Mechanismy zabíjení na kyslíku závislé Těmito reakcemi, které jsou spojeny se zvýšenou spotřebou kyslíku v buňce, vznikají biologicky velmi aktivní kyslíkové mediátory. Tyto látky mají značný redoxní potenciál. Vzájemné interakce mezi povrchovými receptory fagocytů a cizorodými částicemi vedou k aktivaci membránového enzymu NADPH-oxidázy, která katalyzuje reakci, při níž NADPH reaguje s kyslíkem a vzniká NADP + a tzv. superoxidový radikál O - 2. Je to molekula kyslíku s připojeným elektronem. Dalšími reakcemi postupně vzniká singletový kyslík, peroxid vodíku a hydroxylový radikál. Meziprodukty těchto reakcí se nazývají reaktivní kyslíkové intermediáty. Jsou to velmi reaktivní oxidační činidla narušující strukturu mikroorganismů, ničící aktivitu jejich enzymů a poškozující DNA. Peroxid vodíku reaguje reakcí katalyzovanou myeloperoxidázou s chloridovým aniontem a vznikají vysoce baktericidní chlornanové anionty. Tento děj nazýváme respirační (oxidační) vzplanutí. Uplatňuje se zejména v destrukci pohlcených extracelulárních patogenů (Bartůňková, Hořejší, 2009) Mechanismy zabíjení na kyslíku nezávislé Tento mechanismus je spojen s působením biologicky aktivních látek uložených v cytoplazmatických granulích neutrofilů. U fagocytů jsou to azurofilní granula obsahující tekutinu o ph 4-5, jejíchž součástí jsou baktericidní látky (př. defenziny) a hydrolytické enzymy (ze skupiny protéaz se jedná hlavně o kathepsiny, z glykosylhydroláz lysozym). Dále sem patří baktericidní permeabilitu zvyšující protein = BPI a serinové proteázy). Dalším účinným mikrobicidním prostředkem, ničícím především intracelulární parazity makrofágů, je oxid dusnatý (NO). Ten je tvořen NO-syntázou, která je aktivována v makrofázích vlivem cytokinu interferonu a tumor nekrotizujícího faktoru. Jestliže reaguje oxid dusnatý se superoxidovým aniontem tvořeným při respiračním vzplanutí, vznikají toxické reaktivní dusíkové metabolity, které zabíjí patogenní mikroby. Při některých zvláště chronických onemocněních dochází k uvolňování baktericidních látek do okolních tkání a k jejich degradaci (Bartůňková, Hořejší, 2009)

19 3. PŘEHLED PORUCH FAGOCYTÓZY Imunodeficientní stavy jsou charakterizované zvýšenou náchylností k infekcím. Podle příčiny vzniku je dělíme na primární a sekundární. Primární poruchy vznikají vrozenou poruchou genů kódujících proteiny, které plní důležitou funkci imunitního systému a jsou vzácné. Sekundární (získané) poruchy vznikají v důsledku působení vnějších nebo vnitřních faktorů v průběhu života a jsou velmi časté. Primární, ale i sekundární imunodeficience dělíme na poruchy protilátkové, poruchy T-lymfocytů nebo kombinované defekty, poruchy fagocytárního systému, poruchy komplementu a dalších nespecifických složek (Bartůňková, Hořejší, 2009). Primární imunodeficience jsou obecně charakterizovány opakujícími se nebo neobvyklými infekcemi a asociací s jinými patologickými stavy, včetně malignit, autoimunit a alergií. Infekce mají těžší průběh a málo reagují na antimikrobiální léčbu. V roce 1995 vznikl Český registr primárních imunodeficiencí pro cílené vyhledávání postižených pacientů v ambulancích klinických imunologů. Od stejného roku je propojen i s Evropským registrem. V současné době je u nás evidováno 602 pacientů (V. Thon, osobní sdělení). Evidence těchto pacientů a vznik národních a nadnárodních registrů má význam při výzkumu zaměřeném na analýzu mechanismů patogeneze, účinné terapii a konzultacích při diagnostice, léčbě a prevenci postižených osob (Lokaj, Litzman, 1999). V lednu roku 1994 byla zahájena činnost Evropského registru při koordinaci Evropskou společností primárních imunodeficiencí (ESID), jež má zastoupení poruch jednotlivých složek imunity v populaci klasifikované v databázi revidované v únoru roku 2011, kdy do ní byly zahrnuty poruchy vrozené imunity. Fagocytární imunodeficience v roce 2010 tvořily 10,22 % primárních imunodeficiencí a v roce ,10 %. Zastoupení ostatních poruch v roce 2010 a 2011 můžeme vidět graficky na obr. 1a, 1b a v tabulce č.1 (viz další strana) Obr. 1a Obr. 1b

20 Tabulka č. 1 : Zastoupení jednotlivých primárních imunudeficientních poruch v letech (podle ESID) Diagnosis: 2011: 2010: Predominantly antibody disorders 56.23% (n=8,464) 55.60% (n=7,238) Predominantly T-Cell deficiencies 7.71% (n=1,160) 7.62% (n=992) Phagocytic disorders 8.10% (n=1,219) 10.22% (n=1,330) Complement deficiencies 4.27% (n=643) 4.73% (n=616) Other well defined PIDs 15.46% (n=2,327) 16.83% (n=2,191) Autoimmune & immunedysregulation 3.77% (n=567) 1.39% (n=181) syndromes Autoinflammatory syndromes 1.93% (n=291) 1.88% (n=245) Defects in innate immunity 0.94% (n=141) 0.00% (n=0) Unclassified PIDs 1.59% (n=240) 1.72% (n=224) Total number of patients: % (n=15,052) % (n=13,017) Komise expertů Mezinárodní unie imunologických společností (IUIS) reviduje od roku 1973 v dvouletých intervalech klasifikaci primárních imunodeficientních chorob. Poslední revize byla provedena v roce 2011 (Al-Herz a spol., 2011) PRIMÁRNÍ PORUCHY FAGOCYTÓZY V této kapitole se budu dále podrobněji věnovat jednotlivým primárním imunodeficiencím fagocytárního systému. Spočívají hlavně v poruchách počtu nebo funkce neutrofilních granulocytů. Projevem těchto poruch jsou infekce způsobené stafylokoky, enterobakteriemi, mykobakteriemi a plísněmi (Candida albicans a Aspergillus). Infekce hnisavé lokalizované (lymfadenitidy, osteomyelitidy, aj.) se vyskytují při poruše mikrobicidních systémů, zatímco u poruch v počtu, adhezivitě a motilitě fagocytů jsou přítomny spíše flegmonózní, difúzní záněty sliznic i dermy a ty mohou vést až k septikémii (Bartůňková, 2002)

21 PORUCHY V POČTU NEUTROFILŮ Do těchto poruch patří Kostmannův syndrom (vrozená agranulocytóza) a cyklická neutropenie. Kostmannův syndrom, někdy též označován jako těžká kongenitální neutropenie, patří ke kvantitativním poruchám fagocytózy. Diagnóza je snadná, onemocnění lze zjistit z krevního obrazu. Již od dětství je charakterizován záněty sliznic a kůže. Molekulovou podstatou tohoto syndromu je mutace genu pro elastázu neutrofilů. Syndrom se vyznačuje zástavou vyzrávání neutrofilů ve stadiu promyelocytu nebo myelocytu. V periferii nacházíme méně než 200 neutrofilních granulocytů v 1 μl. V terapii se používá růstového faktoru pro granulocyty. Po zahájení léčby sice dochází ke zvýšení počtu neutrofilů, ale tyto buňky nejsou zcela funkčně kompetentní. Někdy bývá léčba doplněna antibiotiky. Léčba je doživotní, finančně náročná a je provázena vedlejšími účinky například trombocytopenií, splenomegalií nebo osteoporózou. Ojediněle může dojít k myeloidní leukemii a myelodysplastickému syndromu. Pokud léčba není účinná, je pacient indikován k transplantaci hemopoetických kmenových buněk (Bartůňková, Hořejší, 2009; Bartůňková, 2002). Cyklická neutropenie je dle posledních poznatků zřejmě variantou předešlého syndromu. Je charakterizovaná cyklickým poklesem granulocytů v intervalu asi 3 týdnů. V tomto období bývají pacienti náchylní k infekcím. Byla prokázána mutace genu pro elastázu neutrofilů, ale v jiné oblasti genu než u Kostmannova syndromu. Léčba je založena na podávání antibiotik ke zvládnutí infekcí a růstový faktor se na rozdíl od Kostmannova syndromu neužívá každý den. Slouží pouze pro překlenutí období neutropenie. Mezi příznaky patří nekrotizující a ulcerózní záněty sliznic a kůže, které jsou provázené horečkou (Bartůňková, Hořejší, 2009; Bartůňková, 2002) PORUCHY VE FUNKCÍCH FAGOCYTŮ Mezi tyto poruchy patří chronická granulomatózní choroba (CGD), LAD I + II syndrom. Chronické granulomatózní chorobě bude věnována samostatná kapitola. V této části se budu zabývat oběma typy syndromu nedostatečné přilnavosti leukocytů (LAD syndrom, leukocyte adhesion deficiency) a defekty neutrofilních granulí

22 LAD I syndrom Jedná se o onemocnění recesivně dědičné nebo o nové mutace nezděděné od rodičů. Příčinou tohoto vzácného syndromu je defekt leukocytárních integrinů. Může jít o kvantitativní nebo kvalitativní odchylku exprese β2 podjednotky integrinových molekul CD11/CD18 nacházející se na 21. chromozomu nebo je příčina na posttranskripční úrovni. Defektní je exprese všech tří heterodimerů CD11a/CD18, CD11b/CD18 a CD11c/CD18. Tím dochází k neschopnosti neutrofilů přilnout k endoteliím a k zabránění migrace do místa zánětu, oxidační metabolismus je normální. Z tohoto důvodu nacházíme v periferii vysoký počet neutrofilů i v nepřítomnosti infekce a jejich nedostatek v místě zánětu. Tato porucha se projeví pouze na neutrofilech, protože na ostatních fagocytech je adheze zajištěna jinými adhezivními molekulami a defekt se zde funkčně neprojeví (Bartůňková, 2002; Kamani a Douglas, 1997; Bartůňková, Hořejší, 2009). Závažnost dysfunkce fagocytujících buněk obvykle nepřímo koreluje se stupněm exprese adhezivních molekul. Těžká forma se projeví brzy po narození. Typicky se vyskytují infekce pupečníku, kožní a slizniční ulcerózní léze s možnou tvorbou hnisu. Mezi nejčastější původce patří stafylokoky, gramnegativní enterobakterie nebo pseudomonády. Mírnější forma bývá doprovázena častými otitidami a sinusitidami. Mohou být pneumonie. Jsou postiženy dásně (gingivitidy, paradontitidy). Těžké formy mají krevní obraz podobný agranulocytóze a objevuje se hyperleukocytóza. Pro diagnostiku onemocnění je důležitý průkaz absence nebo snížení glykoproteinů CD11/CD18 na membráně fagocytů. Léčba těžších forem je založena na transplantaci kmenových buněk krvetvorby, podáváním antibiotik a náplavů trombocytů pro zvládnutí infekce hlavně v období před transplantací nebo v případě nemožnosti provedení transplantace. Pacienti s mírnější formou onemocnění se mohou dožít dospělého věku. Lečí se pouze symptomy. V České republice žije jeden chlapec s deficiencí adheze leukocytů po úspěšné transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve (Bartůňková, 2002; Bartůňková, Hořejší, 2009; Kamani a Douglas, 1997; Lokaj, Litzman, 1999). Jsou známy onemocnění klinicky podobné tomuto syndromu, u kterých nebyl prokázán defekt β2 podjednotky. Tyto syndromy označujeme jako LAD like (Bartůňková, 2002)

23 LAD II syndrom LAD II syndrom je klinicky podobný LAD I syndromu. Molekulární podstata spočívá v defektní expresi ligandu pro selektiny, která je způsobena mutací genu kódujícího fukosyltransferázu. Jedná se o enzym podílející se na biosyntéze sialyl-le x a jiných komplexních sacharidů. Molekula sialyl Lewis X (SLeX, CD15) je exprimovaná na granulocytech, monocytech, erytrocytech a endotelu. Funguje jako kontrareceptor pro P a E selektiny. Mezi projevy onemocnění patří opakované bakteriální infekce a zánět gingivy. U pacientů je přítomná psychomotorická retardace v důsledku poruchy biosyntézy neuronálních gangliosidů. Laboratorně nacházíme neutrofílii. Pacienti mají krevní skupinu Bombay (hh), která odráží deficit na erytrocytech. Léčí se symptomy. Je-li včasná diagnóza, dochází ke zlepšení funkcí imunity i mentální retardace orálním podáváním L-fukosy. Tím se indukuje tvorba H-antigenu na erytrocytech a přítomnost anti-h protilátek s možným vznikem intravaskulární hemolýzy (Bartůňková, 2002; Bartůňková, Hořejší, 2009) Defekty neutrofilních granulí Existují nejméně tři poruchy neutrofilů projevující se defektem jejich granulí. Mezi tyto poruchy zařazujeme nedostatek myeloperoxidázy, nedostatek granulí a Chediak Higashiho syndrom. Mohou být asymptomatické nebo se projeví zvýšenou náchylností k plísňovým infekcím (Kamani a Douglas, 1997) Deficit myeloperoxidázy Je to autozomálně recesivní porucha charakterizovaná částečným nebo úplným chyběním proteinu obsahujícím železo myeloperoxidázy v azurofilních granulích neutrofilů a monocytů. Myeloperoxidáza má funkci mikrobicidní. S pomocí peroxidu vodíku katalyzuje reakci enzym substrát, při které dochází k oxidaci halogenidů a vznikají látky toxické pro celou řadu mikroorganismů. Frekvence tohoto onemocnění se odhaduje na 1 : 2000 až 1 : 4000 obyvatel. V nepřítomnosti myeloperoxidázy jiné mikrobicidní mechanismy kompenzují její nedostatek, takže se u většiny pacientů příznaky onemocnění vůbec neprojeví. Pacient je zvýšeně náchylný ke kandidovým a stafylokokovým infekcím (Kamani a Douglas, 1997; Bartůňková, 2002; Stites, Terr, 1991)

24 Nedostatek specifických granulí Pro tuto extrémně vzácnou poruchu neutrofilů a eozinofilů je charakteristické úplné chybění nebo nedostatečný počet konkrétních specifických granul. Tím dochází ke zvýšené náchylnosti k těžkým, opakujícím se infekcím kůže, plic a sliznic způsobených hlavně stafylokokem, pseudomonádou a kandidami. Defekt se projeví již v granulopoéze ve stadiu myelocytu metamyelocytu, kdy dochází k překryvu syntéz proteinů primárních a sekundárních granulí. Neutrofily pacienta ukazují řadu morfologických abnormalit jader. Lze nalézt dvou či vícečetná jádra a zářezy (Kamani a Douglas, 1997) Chediak Higashiho syndrom Chediak Higashiho syndrom (CHS) je vzácné autosomálně recesivně dědičné onemocnění charakterizované částečným okulokutánním albinismem, recidivujícími infekcemi, progresivními neurologickými změnami, krvácením a zvýšeným výskytem lymfoidních malignit. Typická je variabilní hypopigmentace kůže a přítomnost obrovských granul, které jsou vázané v cytoplazmatické membráně fagocytů ale i jiných buněk. Diagnóza je potvrzena nálezem těchto granul a mutací genu kódujícího cytosolický protein LYST. Vlasy mají stříbrnou barvu nebo kovový lesk. Asi u 85 % pacientů dojde k progresi do akcelerované fáze, kdy dochází k infiltraci orgánů. Léčba je založena na transplantaci kostní dřeně. Pacienti umírají většinou do 10 let svého věku (Fantinato GT, 2011; Bartůňková, 2002) SEKUNDÁRNÍ PORUCHY FAGOCYTÓZY Sekundární imunodeficience jsou poruchy vznikající v průběhu života vlivem působení vnějších a vnitřních faktorů. Poruchy v počtu granulocytů tzv. sekundární neutropenie jsou způsobeny defektní produkcí myeloidních buněk v kostní dřeni většinou v důsledku imunosuprese, léčby cytostatiky, ozáření nebo po působení toxických látek. Příčina může být i periferní v důsledku destrukce autoprotilátkami nebo zvýšeným vychytáváním slezinou, která se následně zvětšuje, nastává splenomegalie. Tyto získané poruchy jsou časté u metabolických onemocnění (diabetes, uremie) a u myeloproliferací (Hořejší, Bartůňková, 2009)

25 Není jasné, zda se jedná o vady klinicky relevantní nebo zda jsou opakované infekce v těchto podmínkách sekundární z dalších souvisejících faktorů; například podvýživy a nesouvisejících poruchy imunity (Kamani a Douglas, 1997). Funkční poruchy neutrofilů bez změny jejich koncentrace jsou způsobeny autoprotilátkami či jinými sérovými faktory PORUCHY GRANULOCYTŮ V DŮSLEDKU PŘÍTOMNOSTI AUTOPROTILÁTEK Vazbou autoprotilátek na neutrofily dojde k jejich destrukci a tím k neutropenii. Někdy může nastat porucha jejich funkce, aniž by došlo k početním změnám. Ovlivnění funkce je ve smyslu stimulace nebo inhibice. Pacienti s prokázanými autoprotilátkami proti neutrofilům jsou náchylnější ke kožním infekcím způsobených stafylokoky. Je-li koncentrace neutrofilů pod 500 buněk/μl, nastává ohrožení pacienta těžkými bakteriálními infekty a může dojít až k sepsi. Autoprotilátky se vyskytují buď v rámci autoimunitní idiopatické neutropenie nebo v důsledku jiných autoimunitních onemocnění, virových chorob, maligních onemocnění a vlivem léků (penicilamin, sulfonamidy, chinin aj.). Často jsou kromě granulocytů postiženy i lymfocyty. Mezi choroby asociované s výskytem autoprotilátek namířených proti granulocytům patří například revmatoidní artritida, Sjörgenova choroba, autoimunitní trombocytopenická purpura, Graves Basedowova choroba a Hashimotova thyreotitida. Autoprotilátky v případě těchto chorob reagují na více antigenních determinantách a to membrány, cytoplazmy a jádra. Postihují jak zralé granulocyty i jejich prekurzory. Z virových onemocnění se jedná především o infekce způsobené cytomegalovirem, parvovirem B19 a virem lidské imunodeficience (HIV). Z malignit jsou autoprotilátky asociovány s lymfoproliferacemi (lymfomy, Hodgkinova choroba). Autoprotilátky, které reagují s cytoplazmatickými antigeny resp. granulárními, se vyskytují například u pacientů s Wegenerovou granulomatózou a ulcerózní kolitidou (Bartůňková, 2002)

26 PORUCHY GRANULOCYTŮ V DŮSLEDKU PŘÍTOMNOSTI JINÝCH SÉROVÝCH FAKTORŮ Funkci granulocytů mohou kromě autoprotilátek ovlivňovat i jiné faktory přítomné v krevním séru. Mezi ně patří imunokomplexy, kryoglobuliny a paraprotein. Další ovlivnění je na straně aktivace komplementu, která je navozená imunokomplexy. Nejčastěji dochází k poruchám adherence, chemotaxe a fagocytární aktivity. Řada přechodných poruch bývá způsobena dysbalancí v produkci cytokinů působících právě na granulocyty (př. TNF, IL-8, 1, interferon γ, G CSF). K sekundární poruše dochází také v případě chybění sérových opsoninů. Stavy sekundární dysfunkce fagocytárních buněk jsou asociovány především s hypoimunoglobulinemií a dysimunoglobulinemií nebo s deficiencí složek komplementu. Léčba sekundárních imunodeficiencí je založena na léčbě základního onemocnění. Substituční terapie se používá u poruch způsobených nedostatkem extracelulárních faktorů. Supresi a imunosupresi (kortikoidy) lze uplatnit při výskytu autoprotilátek, kryoglobulinemie a monoklonální paraproteinemie (Bartůňková, 2002)

27 4. CHRONICKÁ GRANULOMATÓZNÍ CHOROBA Chronická granulomatózní choroba je typickým příkladem vrozené imunodeficience. Tato vzácná dědičná porucha oxidativního metabolismu fagocytů je charakterizovaná defekty v enzymatickém systému NADPH-oxidázy. Následkem toho nedochází k respiračnímu vzplanutí fagocytů. Tuto abnormalitu nacházíme u všech pacientů s CGD. Postihuje neutrofilní granulocyty, monocyty a makrofágy. Jejich počet je normální, ale je defektní jejich funkce. Tato choroba byla popsána koncem 50. let 20. století. Prevalence je asi 1 : Výskyt CGD vykazuje geografickou závislost. Například v USA připadá jeden případ CGD na porodů, ve Švédsku na porodů a v Japonsku na porodů. Klinické projevy a molekulární genetika jsou značně heterogenní. (Hořejší, Bartůňková, 2009; Goldblatt a Thrasher, 2000). Diagnostická kritéria CGD byla formulována v publkaci Conley, M.E., Notarangelo, L., Etzioni, A. representing PAGID (Pan-American Group for Primary Immunodeficiencies) and ESID (European Society for Immunodeficiencies). Clin Immunol 1999; 93(3) : Definitivní : Pacienti mužského nebo ženského pohlaví, u nichž byl prokázán abnormální NBT-test nebo respirační vzplanutí aktivovaných neutrofilů (méně než 5 %) a u nichž je jeden z následujících nálezů : 1) mutace gp91, p22, p47 nebo p67 phox 2) nepřítomnost mrna jednoho z výše uvedených genů (northern blot analýza) 3) abnormální NBT-test nebo test respiračního vzplanutí u rodinných příslušníků (matčini bratranci, strýcové, synovci) Pravděpodobná : Pacienti mužského nebo ženského pohlaví, u nichž byl prokázán abnormální NBT-test nebo respirační vzplanutí aktivovaných neutrofilů (méně než 5 %) a u nichž je jeden z následujících nálezů : 1) hluboké infekce (abscesy jater, plic, perirektální abscesy, adenitidy, osteomyelitidy) vyvolané stafylokoky, Serratia marcescens, kandidami nebo aspergily

28 2) difúzní granulomy v respiračním, gastrointestinálním nebo urogenitálním traktu 3) neprospívání, hepatosplenomegalie nebo lymfadenopatie 4.1. GENETICKÝ PODKLAD Molekulární příčinou této choroby je poškození v genech kódující složky enzymatického komplexu NADPH-oxidázy. Poškozeny jsou geny, které kódují obě podjednotky flavocytochromu b558 (podjednotky p22 phox či gp91 phox ) nebo cytosolové faktory p47 phox a p67 phox (phox = phagocyte oxidative). Defektní je vždy jen jeden gen. Podle typu deficitní složky NADPH oxidázového komplexu se jedná o chorobu vázanou na X chromozom nebo o onemocnění recesivně dědičné (Goldblatt a Thrasher, 2000). Přibližně u dvou třetin pacientů (60-65 %) s formou vázanou na chromozom X nacházíme mutaci v genu pro gp91 phox podjednotku cytochromu b558, která je součástí enzymu NADPHoxidázy. Zbývající pacienti mají autosomálně recesivní formu nemoci, kdy je mutace přítomná v genech, které kódují zbylé tři podjednotky uvedeného enzymu. Jedná se o defekt v lehké podjednotce p22 phox nebo v cytosolických komponentách p47 phox, p67 phox. Nejčastější mutací autosomálně recesivní formy CGD s frekvencí 23 % je defekt podjednotky p47 phox lokalizované na chromozomu 7q11.23 (Kamani a Douglas, 1997). Mutace jsou heterogenní a unikátní pro jednotlivé rodiny ve více než 90 % případů. Mutace s chybným smyslem (tzv.,,missense mutace) mají za následek značnou heterogenitu fenotypu (Goldblatt a Thrasher, 2000) KLINICKÉ PŘÍZNAKY Klinické příznaky tohoto onemocnění jsou výrazně heterogenní. Dostavují se již v raném dětství; diagnóza bývá stanovena nejčastěji do dvou let od narození. Pacienti s CGD vázanou na chromozom X mívají časnější a těžší manifestaci choroby než pacienti s formou autozomálně recesivní. Mezi nejčastější projevy patří infekce kůže, plic, zažívacího traktu a lymfoidních orgánů. U většiny pacientů s X vázanou formou CGD je porucha prospívání, těžké bakteriální adenitidy, abscesy a osteomyelitida již v prvním roce. Infekce jsou způsobeny kataláza pozitivními mikroorganismy mezi které patří Stafylokokus aureus, Salmonella, Klebsiella,

29 Aerobacter, Serratia, Kandidy, Aspergillus, Escherichia coli. a další (Kamani a Douglas, 1997; Goldblatt a Thrasher, 2000). Fagocyty nejsou schopny zničit cizorodé kataláza pozitivní mikroorganismy, z čehož vyplývá, že pacienti trpí opakujícími se bakteriálními a plísňovými infekcemi s rozvojem chronických granulomů, typických pro tuto poruchu. Jsou to ohraničená místa infekce kulovitého tvaru způsobující obstrukci trávícího nebo urogenitální traktu, kde je jejich přítomnost nejčastější. Tvorba granulomů je zapříčiněna defektem v tvorbě kyslíkových radikálů. To vede ke snížené baktericidní schopnosti vůči některým mikroorganismům, ale také k dysfunkci lyzosomálních degradačních enzymů, které nejsou schopny rozložit pohlcený materiál. Granulomy mohou být i neinfekční. Většina pacientů s X-vázanou formou onemocnění neprospívá. Ojediněle se první těžké symptomy u obou forem vyskytují až v dospělosti (Bartůňková, 2002) DIAGNOSTIKA ONEMOCNĚNÍ Onemocnění může být diagnostikováno prenatálně. Diagnostiku provádíme již na počátku gravidity v rodinách, kde je známá mutace či polymorfismus. Vyšetřuje se tkáň, která byla získána odběrem choriových klků v prvním trimestru. Používá se RFLP analýza nebo lze využít cdna sondu. Pomocí ní zjistíme přítomnost nebo nepřítomnost jednotlivých složek NADPH-oxidázy v makrofázích chorionu pomocí specifických protilátek. Fibroblasty získané odběrem plodové vody nejsou vhodné k diagnóze CGD. Prenatální diagnostika je založena na analýze fagocytů z krve plodu (Goldblatt a Thrasher, 2000; Kamani a Douglas, 1997). CGD je charakterizovaná absencí respiračního vzplanutí fagocytů, které lze prokázat řadou laboratorních testů. NBT-test je stále doporučován jako screeningový test. Přesná diagnostika se opírá o chemiluminiscenci a burst test. (Kamani a Douglas, 1997). Konkretizace bude uvedena v metodické části bakalářské práce. Abnormality v laboratorním vyšetření odhalí pacienty, ale i ženy přenašečky, které nemají žádné příznaky. Prognóza se zlepšuje s časnou diagnózou a razantní léčbou (Stites, Terr, 1991)

30 4.4. LÉČBA V terapii se uplatňuje antibiotická a chirurgická léčba. Profylaxe je zajištěna podáváním kotrimoxazolu a intrakonazolu. U těžkých případů a je-li k dispozici HLA identický dárce se indikuje transplantace kostní dřeně. Při závažných infekcích i jejich prevenci se indikuje interferon γ. Léčba granulomů, které způsobují mechanické obtíže a nereagují na léčbu antimykotiky, je založena na podávání kortikoidů. Pacienti se dožívají při úspěšné léčbě dospělého věku (Bartůňková, 2002). Pro pacienty bez HLA identického dárce je možností genová terapie, která se v současnosti stává dosažitelným cílem (Kamani a Douglas, 1997). Kvalita života pacientů s tímto onemocněním se výrazně zlepšila poté, co byla objevena podstata nemoci a zavedena rychlá diagnostika

31 METODICKÁ ČÁST 5. DIAGNOSTIKA PORUCH FAGOCYTÓZY Kvantitativní vyšetření fagocytů je založeno na stanovení počtu granulocytů a monocytů, které vychází z celkového počtu leukocytů v krevním obraze. Diferenciální krevní obraz umožní z relativního zastoupení buněk získat hodnotu jejich absolutního počtu. U zdravých dospělých osob se uvádí hodnota absolutního počtu granulocytů od 3,5 do 5,8 x 10 9 buněk/ 1 l. Mírný pokles počtu granulocytů probíhá bezpříznakově a absolutní hodnoty se pohybují v rozmezí od 1,0 do 1,5 x 10 9 buněk/1 l. Pokud je hodnota neutropenie mezi 0,5 až 1,0 x 10 9 buněk/1 l, pacient je ohrožen infekcemi kůže a sliznic. K sepsi dochází při poklesu pod 0,2 x 10 9 buněk/1 l. Funkčním vyšetřením analyzujeme jednotlivé fáze fagocytózy a to adhezi, chemotaxi, ingesci, respirační vzplanutí a konečnou fázi mikrobicidie. Laboratorní vyšetřování je zaměřeno hlavně na neutrofilní granulocyty získané z plné krve. Tyto testy nám odhalí poruchy fagocytózy (Litzman a spol., 2007; Lokaj, Procházková, 1986). Vyšetření jednotlivých stádií fagocytózy shrnuje následující tabulka. Tabulka č.2 : Funkční vyšetření neutrofilních granulocytů (Litzman a spol., 2007). FUNKCE TEST PORUCHA ADHEZE Exprese CD11/CD18 LAD1 syndrom CHEMOTAXE Migrace pod agarózou Poruchy jsou poměrně vzácné; transientní jsou u infekcí, popálenin, traumatu INGESCE Opsonizace a pohlcení částic (metakrylátové partikule, mikroorganismy) Projeví se u poruch opsonizace RESPIRAČNÍ VZPLANUTÍ NBT Chemiluminiscence Burst test Defektní u chronické granulomatózní choroby (CGD); transientní porucha u infekcí, traumatu, malnutrice CELÝ PROCES FAGOCYTÓZY- USMRCENÍ MIKROORGANISMŮ Mikrobicidní test Upozorní na poruchu některého z kroků fagocytózy

32 5.1. TESTY ADHEZE Existuje řada vyšetření používaných pro hodnocení adheze. Jedná se o posouzení in vitro přilnavosti granulocytů na umělé povrchy jako je nylon, sklo a umělá hmota. Tyto testy jsou však modely arteficiální. Prvním, kdo popsal první techniky stanovení adheze granulocytů na nylonových vláknech, byl v roce 1974 McGregor. Adheze neutrofilů k cévnímu endotelu je umožněna proteiny patřící k β 2 integrinům. Stanovení exprese povrchových antigenů CD11/CD18 vede k odhalení deficiencí leukocytárních adhezních molekul. Vyšetření je indikováno při podezření na LAD syndrom (leukocyte adhesion deficiency). Vyšetření provádíme pomocí průtokové cytometrie a monoklonálních protilátek namířených proti alfa nebo beta řetězci heterodimeru (Litzman a spol., 2007; Kamani a Douglas, 1997) TESTY CHEMOTAXE TEST CHEMOTAXE POD AGARÓZOU Fagocyty mají schopnost odpovídat na různé chemotaktické stimuly. Tuto schopnost lze měřit testem migrace pod agarózou. Principem je migrace leukocytů z prostřední jamky, která je vyražena v gelu z agarózy nalitém v Petriho misce. Ve zbylých dvou bočních jamkách je umístěn pufr a chemotaktická látka, kterou je nejčastěji fmlp. Následuje několikahodinová inkubace, kdy buňky putují směrem k chemotaktickému stimulu. Po inkubaci a odstranění agarózy se buňky fixují, obarví a změří se vzdálenost, jakou urazily od jamky, do níž byly naneseny. Vyhodnocujeme stimulovanou i spontánní pohyblivost granulocytů (Litzman a spol., 2007; Bartůňková, Paulík, 2005) BOYDENOVA KOMORA A JEJÍ MODIFIKACE Migrace membránovými filtry (Boydenova komora) je metoda poměrně pracná a nehodí se pro rutinní provoz laboratoří (Procházková, Lokaj, 1986)

33 Boydenova komora se skládá ze dvou komor oddělených mikroporézní membránou. Buňky nasadíme do horní komory a necháme je během inkubace migrovat směrem k chemotaktickým látkám přítomných v médiu dolní komory. Jakmile buňky projdou membránou, přilnou k ní, obarví se a kvantifikují (Wells, Parsons, 2011). Tento test byl modifikován s použitím radioaktivního značení. Označíme granulocyty 51 Cr a měříme radioaktivitu v té části, kam buňky přes filtr doputovaly nebo se filtr přímo obarví (Bartůňková, Paulík, 2005) REBUCK SKIN WINDOW Jedná se o starou techniku, při které je posuzována funkce granulocytů in vivo. Vyšetřuje se buněčný exsudát v místě skarifikované kůže na přiloženém sklíčku v časových intervalech. Při defektu přilnavosti a chemotaxe nebudou granulocyty v zánětlivém exsudátu prokazatelné po dobu delší než 3 hodiny po začátku testu. V současné době je již tato technika využívána méně i přes relativně jednoduché provedení a dobré výpovědní hodnoty. Nevýhodou je nedostatečná standardizace a reprodukovatelnost. Lze sledovat i migraci monocytů, která je maximální po 18 až 20 hodinách (Kamani a Douglas, 1997) TESTY INGESCE Ingesci a závislost ingesce na opsonizaci posoudíme testem s metakrylátovými částicemi nebo kvasinkami (Litzman a spol., 2007). K testování schopnosti pohlcení cizorodého materiálu lze použít řadu substrátů. V laboratořích se využívají 1 μm velké mikrosférické hydrofilní partikule (MSHP) nejčastěji hydroxyethylmetakrylátové částice. Mají nízký negativní náboj, který snižuje přilnutí k buněčným povrchům. Suspenze těchto částic se hodinu inkubuje za jemného třepání s určitým množstvím plné krve. Zhotoví se nátěr na podložní sklo, druhý den se fixuje, obarví Giemsou-Romanowski, usuší a odečítá ve světelném mikroskopu za použití imerzního objektivu. Hodnotí se 100 buněk a za fagocyty považujeme buňky obsahující tři a více částic (Bartůňková, Paulík, 2005). Dříve se využíval test s kadmium albuminovými částicemi, který využíval mikrokrystaly uhličitanu kademnatého. Na uhličitan byl navázán lidský sérový albumin. Mikrokrystaly,

34 které nebyly pohlceny odstraníme rozpuštěním v roztoku chelatonu III. Stejně jako u výše uvedeného testu zpracováváme nátěr, který zfixujeme metanolem, barvíme Giemsou a montujeme kanadským balzámem (Procházková, Lokaj, 1986). Nejpřirozenějším substrátem jsou však bakterie. Využívají se kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae nebo Candida albicans. V případě tohoto testu lze vypočítat tzv. fagocytární index vyjadřující počet pohlcených částic (bakterií) na jednu buňku (Bartůňková, Paulík, 2005) TESTY RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ V průběhu fagocytózy dochází k výrazné metabolické aktivitě fagocytujících buněk, tento děj se označuje jako respirační vzplanutí, které významně koreluje s mikrobicidní schopností fagocytů. Praktický význam mají testy redukce tetrazoliových solí, chemiluminiscence a oxidace dihydrorhodaminu na rhodamin měřená průtokovým cytometrem. Jedná se o tzv. burst test (Procházková, Lokaj, 1986; Litzman a spol., 2007). Při respiračním vzplanutí dochází ke stimulaci povrchové membrány fagocytů a k aktivaci enzymu NADPH-oxidázy, při této reakci se zvýšeně spotřebovává kyslík a ten se přeměňuje na reaktivní kyslíkové deriváty se silnými oxidačními vlastnostmi : 1. O 2 - superoxidový anion 2. H 2 O 2 peroxid vodíku 3. 1 O 2 singletový kyslík 4. HOCl... kyselina chlorná 5. OH.... hydroxylový radikál Ústřední úlohu v respiračním vzplanutí zaujímá již zmíněný enzym NADPH-oxidáza. Je to komplex několika složek, které se postupně aktivují a vážou na sebe další enzymatické systémy zejména myeloperoxidázu (MPO). Produkty vzniklé během respiračního vzplanutí mohou poškozovat tkáně při svém úniku z buňky

35 Z tohoto důvodu je na všech živých buňkách přítomen antioxidační systém. Na membránové úrovni je to vitamín E, A, C, N-acetylcystein a betakaroten. V buňkách je přítomný oxidovaný či redukovaný glutation GSH. (Bartůňková, 2002) TESTY REDUKCE TETRAZOLIOVÝCH SOLÍ K těmto testům patří NBT-test (nitro-blue-tetrazolium) a INT-test (iod-nitrotetrazolium). Oba testy jsou založeny na redukci rozpustné tetrazoliové soli na nerozpustný modrý formazan, který se ukládá v krystalové formě v cytoplazmě fagocytů. Do fagocytů se nejprve dostane rozpuštěný bezbarvý substrát, který se oxidačními pochody mění na nerozpustnou barevnou látku. Změnu zbarvení soli lze detegovat orientačně na podložním sklíčku pomocí mikroskopu, kdy určíme přítomnost barevných krystalů formazanu v buňkách nebo lze využít přesnější a technicky náročnější metodu fotometrie. Výsledkem mikroskopického hodnocení je určení procenta buněk s tmavě modrými skvrnami formazanu. Fotometrické vyhodnocení se provádí v mikrotitračních destičkách po provedení lýzy fagocytujících buněk. Vzniklý formazan se extrahuje a měří fotometricky. Fagocyty jsou stimulovány např. rýžovým škrobem nebo zymozanem. Nejrozšířenějším testem v zahraničí je test NBT. Používá se i jiná tetrazoliová sůl (iod-nitrotetrazolium) a v tomto případě se jedná o tzv. INT test (Bartůňková, Paulík, 2005; Litzman a spol., 2007; Procházková, Lokaj, 1986) CHEMILUMINISCENČNÍ TEST Chemiluminiscence je výrazem metabolické aktivity buněk a tvorby mikrobicidních látek. Jedná se o nejvýhodnější metodu pro kvantitativní sledování respiračního vzplanutí. V tomto testu se využívá schopnosti fagocytů emitovat malé množství světla, které lze detegovat na přístroji citlivou fotobuňkou. Chemiluminiscenci vyvoláme přidáním aktivátoru fagocytů především phorbol myristát-acetátu (PMA). Ten aktivuje prostřednictvím proteinkinázy C enzym NADPH-oxidázu. Lze použít i další stimuly - 1% rýžový škrob a zymozan. Dojde k respiračnímu vzplanutí a ke vzniku vysoce reaktivních látek. I přesto, že má singletový kyslík malou stabilitu, reaguje s bakteriemi nebo částicemi přítomnými v lysozomech za vzniku karboxylových sloučenin, které jsou elektronově nestabilní. K emisi světla dochází při návratu z těchto skupin do základního stavu. K indukci tvorby světla a k zesílení reakce

36 využíváme luminofory. Nejčastěji je využíván luminol, který přidáme k suspenzi granulocytů. Dalším používaným luminoforem je lucigenin (bis-n-methylacridiniumnitrát). Emise fotonů se měří pomocí přístroje chemiluminometru v impulsech za minutu (cpm jednotky). Je to metoda velmi citlivá, k vyšetření stačí malé množství krve a není nutno pracovat s izolovanými buňkami (Litzman a spol., 2007; Bartůňková, Paulík, 2005; Procházková, Lokaj, 1986) BURST TEST Užitím tohoto testu kvantitativně vyhodnotíme respirační vzplanutí u granulocytů a monocytů v heparinizované plné krvi měřením na průtokovém cytometru. Pro aktivaci buněk používáme opsonizované Escherichia coli, PMA (phorbol myristátacetát), fmlp (N-formyl Met Leu-Phe). Dojde k respiračnímu vzplanutí, kdy vznikají peroxidy, hydroxylové radikály a superoxidové anionty zajišťující oxidaci dihydrorhodaminu 123 (DHR 123) na zeleně fluoreskující rhodamin 123, který je lokalizován v mitochondriích. Po stimulaci buněk stanovujeme počet (procento) zeleně fluoreskujících fagocytů na průtokovém cytometru. Kromě stimulované aktivity vyhodnocujeme taktéž aktivitu spontánní tj. nestimulovanou Vyšetření provádíme z plné krve, a proto je test vhodný pro většinu klinických laboratoří, které využívají průtokovou cytometrii. Pomocí cytometrie je zajištěno citlivé a přesné měření počtu neutrofilů, které jsou schopné generovat reaktivní formy kyslíku (Litzman a spol., 2007) PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE Je to standardní metoda pro analýzu buněk nebo buněk v suspenzi. Suspenze se označí pomocí monoklonálních protilátek s navázanou fluorescenční barvou - fluorochromem. Monoklonální protilátky se specificky navážou na antigeny přítomné buď na povrchu nebo uvnitř vyšetřovaných buněk. Tuto vazbu detegujeme pomocí průtokového cytometru neboli FACS (fluorescence activated cell scanner). Tento přístroj umožňuje v krátkém časovém intervalu vyhodnotit až tisíce buněk, které laminárně proudí tryskou a vytváří tenký proud

37 suspenze buněk seřazených za sebou, který je vystaven působení laserového paprsku. Každá buňka způsobí na základě její velikosti, struktury buněčného povrchu, cytoplazmy a jádra vychýlení paprsku do různých směrů. Čím je buňka více granulovaná, tím větší je odraz a čím je větší velikost buňky, tím je větší rozptyl. Vyhodnocením rozptylu odlišíme jednotlivé populace buněk (lymfocyty, monocyty, granulocyty). Fluorochromy navázané na jednotlivých buňkách excitují a vyzařují fluorescenční světlo různé vlnové délky. Při použití více fluorochromů můžeme vyšetřit více antigenů na buňkách najednou. Tímto způsobem vyšetříme určité znaky na jednotlivých buňkách (Litzman a spol., 2007; Bartůňková, Paulík, 2005). K posouzení respiračního vzplanutí lze použít právě průtokovou cytometrii. Fagocyty přijmou barvivo dihydrorhodamin 123, které u klidových buněk nevydává fluorescenci. Při aktivaci NADPH-oxidázy dochází k aktivaci fagocytů a k emitaci fluorescence, která je detegována průtokovým cytometrem. Výhodou této metody je snadnější kvantifikace než u testu NBT (Gorczynski, Stanley, 2006) TESTY MIKROBICIDIE Při hodnocení mikrobicidní aktivity se fagocyty inkubují s indikátorovými živými mikroby (např. S. aureus, C. albicans, E. coli) a sérem jako zdrojem opsoninů. V různých časových intervalech vzorky následně vyočkujeme na živné půdy a stanovíme počet živých bakterií. Tento postup je velmi pracný. Používanější je kandidacidní test, kdy mikroskopicky hodnotíme mrtvé bakterie po vitálním obarvení metylenovou modří, která obarví usmrcené mikroby např. C. albicans (Litzman a spol., 2007; Procházková,Lokaj, 1986) Mikrobicidní test hodnotící nitrobuněčné usmrcení mikroorganismů je závislý na úspěšném dokončení všech předchozích dějů fagocytózy : migrace fagocytující buňky, rozpoznání a pohlcení mikroorganismu i degranulaci obsahu lysozomů do fagolysozomu. V podstatě se jedná o screeningový test, který upozorní na poruchu některého z jednotlivých kroků fagocytózy nebo na kombinovaný defekt. Test lze provést z plné krve i z izolovaných granulocytů (Litzman a spol., 2007; Bartůňková, Paulík, 2005). Cílem bylo zjednodušení těchto technik a zavedení různých modifikací těchto testů využívající bakterie, které jsou značeny izotopy. I bez značného rozšíření se zdají být výhodné pro možnosti automatizovaného vyhodnocování. Cennou informaci o schopnosti fagocytů ničit a degradovat pohlcený materiál nám podává enzymologické vyšetření. Mezi nejpoužívanější testy patří stanovení myeloperoxidázy,

38 elastázy, β D glukuronidázy. Pro rutinní praxi jsou příliš náročné a jejich uplatnění je především ve výzkumu (Procházková,Lokaj, 1986)

39 6. PŘÍNOS JEDNOTLIVÝCH METODIK V DIAGNOSTICE PORUCH FAGOCYTÓZY V klinické praxi se uplatňují testy pro určení aktivity fagocytárního systému v diagnostice vrozených i získaných poruch jednotlivých fází fagocytózy, jejímž projevem je zvýšený sklon k infekcím způsobených pyogenními bakteriemi a houbami (Procházková, Lokaj, 1986). Snížení adherence neutrofilů a monocytů in vitro testech bylo vidět u dvou již zmíněných syndromů charakterizovaných nedostatečnou přilnavostí leukocytů. Je to LAD I. a LAD II. syndrom. Sníženou adherenci lze nalézt u předčasně narozených, ale i donošených dětí. Souvisí to s částečným nedostatkem CD11b/CD18 na novorozeneckých neutrofilech. Sekundární abnormality přilnavosti byly hlášeny po požití etanolu a při terapii kortikosteroidy (Kamani a Douglas, 1997). Chemotaxe je snížena u primárních poruch (CHS, CGD), dále u cukrovky, progresivní artritidy, u opakovaných bakteriálních infekcí, u malignit a při léčbě antibiotiky. Ke zvýšení chemotaxe dochází v zátěžových situacích nejčastěji po chirurgickém výkonu (Procházková, Lokaj, 1986). Výpovědní hodnota testů ingesce v rutinní diagnostice je velmi malá. Hodnotí se snížení hodnot. K velkému snížení dochází až při velmi těžkých stavech při sepsi a u konečného stádia nádorových onemocnění. Větší uplatnění je ve výzkumu v toxikologii a farmakologii (Bartůňková, Paulík, 2005). Vyšetření respiračního vzplanutí má zásadní význam pro vyloučení nebo potvrzení nejčastější choroby způsobenou poruchou fagocytárních funkcí chronické granulomatózní choroby (CGD). INT-test nám posoudí funkční zdatnost granulocytů, slouží ke sledování rozvoje bakteriálních infekcí a ke kontrole antibiotické léčby. Test zachytí obě dvě formy CGD. Chemiluminiscence má širší uplatnění než NBT-test. Zachycuje poruchy v NADPH oxidázovém a myeloperoxidázovém systému. Klinický význam je při defektu myeloperoxidázy, kdy srovnáváme výsledek chemiluminiscence s použitím lucigeninu a luminolu. Výzkumný charakter má sledování ovlivnění metabolismu fagocytózy různými léky, chemikáliemi, antioxidanty a léčbou. Zvýšení hodnot u spontánního respiračního vzplanutí nacházíme u sepsí a jiných systémových zánětů (Bartůňková, Paulík, 2005; Litzman a spol., 2007)

40 Mikrobicidní test je náročnou a těžce standardizovanou metodou, jehož využití je v rutinní diagnostice velmi omezené Používá se stejně jako test ingesce pro výzkumné účely (Bartůňková, Paulík, 2005)

41 7. KAZUISTIKA PACIENTA VYŠETŘENÉHO NA ÚKIA LF MU a FN u sv. Anny V této kapitole uvedu poskytnutou kazuistiku pacienta, který byl vyšetřen na ÚKIA LF MU a FN u sv. Anny s podezřením na poruchu fagocytózy KAZUISTIKA PACINTA S PODEZŘENÍM NA CGD Pacient : S. A. Pohlaví : muž Rok narození : 1987 Příznaky : První klinické příznaky se objevily v půl roce života jako opakované průjmy, pararektální píštěl. Stav byl uzavřen jako Crohnova choroba. Ve 12 letech ložiskový plicní proces a kompletní vyšetření na ÚKIA FN u sv. Anny. Laboratorní vyšetření: U pacienta bylo provedeno chemiluminiscenční vyšetření a stanovena diagnóza CGD, která byla potvrzena burst testem jako X-vázaná forma onemocnění. Terapie: Léčba spočívá především v profylaktickém podávání antibiotik, antimykotik, glukokortikoidů a hepatoprotektivních látek. Ošetřující lékař : prof. MUDr. J. Litzman, CSc. Laboratorní vyšetření : FACS - Mgr. Marcela Vlková, Ph.D. Chemiluminiscence : RNDr. Martina Štouračová Zdravotní laborantka : Terezie Kamenická

42 7.2. BURST TEST Test byl proveden podle zavedených postupů na Ústavu klinické imunologie a alergologie LF FN u sv. Anny v Brně POUŽITÝ MATERIÁL A JEHO PŘÍPRAVA Biologický materiál Pro měření byla odebraná plná venózní krev do heparinu, nesmí být EDTA ani citrát sodný Chemikálie PBS E. coli PMA DHR 123 destilovaná voda fyziologický roztok (NaCl 0,9% w/v) dimethylsulfoxid dimethylformamid Příprava reagencií 1) PBS (phosphate buffered saline) fosfátový pufr složení : 0,2 g KH 2 PO 4, 2,16 g Na 2 HPO 4, 0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1 g NaN

43 Vše rozpustíme v 800 ml destilované vody, upravíme ph na 7,2-7,4 a doplníme destilovanou vodou do 1 litru. Skladujeme v lednici při teplotě 2 až 8 C. Exspirace je 6 měsíců. 2) E. coli ( Biologický ústav LF MU, kmen E. coli K12 ROW) Kmen je kultivován na agarovém mediu týden při 2 8 C. Narostlé E. coli opatrně opláchneme 10 ml fyziologického roztoku, promícháme, přeneseme do zkumavky a centrifugujeme při 2000 otáčkách 5 minut. Supernatant slejeme, přidáme k němu 10 ml fyziologického roztoku a dobře promícháme. K 1 ml takto připravené zásobní suspenze E. coli přidáme 4 ml fyziologického roztoku, promícháme a skladujeme po 25 μl zamražené při -20 C. Pro jednoho pacienta použijeme 20 μl E. coli. Zásobní suspenzi E. coli je možné skladovat v porcích po 1,2 ml zamraženou při -70 C po dobu 24 měsíců. 3) PMA (phorbol myristát-acetát, kat.č. P mg, firma Sigma) 10 mg rozpustíme v 10 ml dimethylsulfoxidu, c = 1 mg/ml. Skladujeme zamražené po 20 μl při -20 C. Exspirace je 24 měsíců. 4) DHR 123 (dihydrorhodamin 123, kat.č. D mg, firma Sigma) 10 mg rozpustíme v 26,2 ml dimethylformamidu, c = 1 mg/ml. Skladujeme zamražené po 45 μl při -20 C. Exspirace je 24 měsíců PROVEDENÍ BURST TESTU 100 μl heparinizované krve pacienta rozpipetujeme do 3 zkumavek a ty vložíme na 5 minut do ledové lázně. Během inkubace si připravíme roztok PMA. Příprava naředěného PMA : 16 μl rozmraženého PMA smícháme s 270 μl PBS a promícháme na vortexu

44 K vychlazené krvi ve třech zkumavkách napipetujeme : 1.zkumavka : 20 μl PBS = NEGATIVNÍ KONTROLA 2.zkumavka : 20 μl rozmraženého E. coli 3.zkumavka : 20 μl PMA Po napipetování promícháme na vortexu a inkubujeme ve vodní lázni při 37 C 10 minut. Příprava naředěného DHR : 45 μl rozmraženého DHR smícháme s 450 μl PBS a promícháme na vortexu Po ukončení inkubace ke všem zkumavkám přidáme 30 μl naředěného DHR. Promícháme a inkubujeme ve vodní lázni při 37 C 10 minut. Po inkubaci ke každé zkumavce přidáme 2 ml ledového PBS (nesmí být zmrzlý) a centrifugujeme 5 minut při 2000 otáčkách. Slejeme supernatant, sediment rozmícháme na vortexu. K odstranění červených krvinek použijeme automatický lyzátor COULTER TQ - Prep Workstatio. Následuje měření na průtokovém cytometru CYTOMICS FC 500 a odečtení výsledků. Kromě pacienta byl vyšetřen i kontrolní vzorek. Burst test vyhodnocujeme ze záznamu na displeji průtokového cytometru, výsledky vyjadřujeme jako relativní zastoupení (procento) buněk označených rhodaminem a buněk nestimulovaných a stimulovaných E. coli a PMA. Referenční hodnoty laboratoře ÚKIA jsou uvedeny v tab. č REFERENČNÍ HODNOTY Tabulka č. 3 : Referenční hodnoty granulocytů a monocytů po stimulaci E. coli a PMA granulocyty monocyty stimulace E. coli 80 % 40 % stimulace PMA více než 95 %

45 VÝSLEDKY VYŠETŘENÍ PACIENTA S.A. Přehled výsledků měření pacienta, jeho matky, sestry, babičky a adekvátních kontrolních zdravých osob je uveden v tab. 4 a 5. Tabulka č. 4 : Procentuální zastoupení fagocytujících buněk bez stimulace a se stimulací u vzorku pacienta a kontroly bez stimulace stimulace E. coli stimulace PMA pacient 0, 47 % 0, 55 % 1, 12 % kontrola 1, 41 % 78, 91 % 98, 23 % Tabulka č. 5 : Procentuální zastoupení fagocytujících buněk bez stimulace a se stimulací u vzorku matky, babičky a sestry pacienta ve srovnání s kontrolou uvedenou v tabulce č. 4 bez stimulace stimulace E. coli stimulace PMA matka pacienta 0, 10 % 49, 89 % 62, 29 % setra pacienta 0, 14 % 19,79 % 23, 07 % babička pacienta 0, 50 % 6, 74 % 13, 37 % kontrola 1, 41 % 78, 91 % 98, 23 % Grafická dokumentace výsledků měření průtokovou cytometrií včetně procentuálního zastoupení celkového počtu granulocytů (záznam protokolu byl poskytnut paní Mgr. Marcelou Vlkovou, Ph.D) je znázorněna v grafech 1, 2 a 3a, b, c

46 Graf č. 1 : Výsledky vyšetření průtokovou cytometrií u pacienta s CGD bez stimulace a se stimulací E. coli a PMA Data set 8 : 2BT2 PACIENT [Ungated] SS / FS Data set 8 : 2BT2 PACIENT [H] DHR Data set 8 : 2BT2 PACIENT [Ungated] SS / FS Data set 8 : 2BT2 PACIENT [H] E. coli Data set 5 : 2BT2 PACIENT [Ungated] SS / FS Data set 5 : 2BT2 PACIENT [H] PMA

47 Graf č. 2 : Výsledky vyšetření průtokovou cytometrií u kontrolního vzorku bez stimulace a se stimulací E. coli a PMA Data set 4 : 2BT5 KONTROLA [Ungated] SS / FS Data set 4 : 2BT5 KONTROLA [H] DHR Data set 4 : 2BT5 KONTROLA [Ungated] SS / FS Data set 4 : 2BT5 KONTROLA [H] E. coli Data set 4 : 2BT5 KONTROLA [Ungated] SS / FS Data set 4 : 2BT5 KONTROLA [H] PMA 47

48 Graf č. 3a : Výsledky vyšetření průtokovou cytometrií u ostatních rodinných příslušníků bez stimulace a se stimulací E. coli a PMA matka pacienta Data set 4 : BT3 MATKA [Ungated] SS / FS Data set 4 : BT3 MATKA [Granulocyty] DHR Data set 4 : BT3 MATKA [Ungated] SS / FS Data set 4 : BT3 MATKA E. coli Data set 1 : BT3 MATKA [Ungated] SS / FS Data set 1 : BT3 MATKA [Granulocyty] PMA 48

49 Graf č. 3b : Výsledky vyšetření průtokovou cytometrií u ostatních rodinných příslušníků bez stimulace a se stimulací E. coli a PMA sestra pacienta Data set 8: BT2 SESTRA [Ungated] SS / FS Data set 8: BT2 SESTRA [Granulocyty] DHR Data set 7: BT2 SESTRA [Ungated] SS / FS Data set 7: BT2 SESTRA E. coli Data set 5: BT2 SESTRA [Ungated] SS / FS Data set 5: BT2 SESTRA [Granulocyty] PMA 49

50 Graf č. 3c : Výsledky vyšetření průtokovou cytometrií u ostatních rodinných příslušníků bez stimulace a se stimulací E. coli a PMA babička pacienta Data set 1 : BT1 BABIČKA [Ungated] SS / FS Data set 1 : BT1 BABIČKA [A] DHR Data set 2 : BT1 BABIČKA [Ungated] SS / FS Data set 2 : BT1 BABIČKA [A] E. coli Data set 4 : BT1 BABIČKA [Ungated] SS / FS Data set 4 : BT1 BABIČKA [A] PMA 50