Nespecifické složky buněčné imunity. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

Transkript

1 Nespecifické složky buněčné imunity RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

2

3 - Mechanizmy vrozené imunity fungují okamžitě - Ihned následuje časná indukovaná odpověď - Nevytvoří se imunologická paměť - Specifická reakce je zahájena jen v případě, že infekce překoná tyto nespecifické mechanizmy

4 Mechanizmy nespecifické imunity: Jsou založeny na rozpoznání chemických struktur (hlavně sacharidů), na povrchu mnoha různých mikroorganizmů, ale nepřítomných na povrchu vlastních buněk organizmu

5

6 Rozpoznávací mechanizmy fagocytů Struktury, které se nacházejí na povrchu mikroorganizmů, ale ne na vlastních nepoškozených buňkách Evolučně velmi konzervované antigeny nezbytné pro život mikroorganizmů PAMP (pathogen associated molecular patterns) Endotoxiny (LPS) gramnegativních bakterií Peptidoglykany grampozitivních bakterií Glukany a manany kvasinek a plísní Povrchové fosfolipidy apoptotických buněk Tyto struktury jsou rovněž rozpoznávány humorálními složkami nespecifické imunity

7 Rozpoznávací mechanizmy fagocytů Manózový receptor Galaktózový receptor CD14 TLR (Toll-like receptory) Scavangerové (uklízecí) receptory FC receptory

8 Nespecifické rozpoznávání pomocí Toll-like receptorů: každý z TLR receptorů rozpoznává jeden či více mikrobiálních antigenů přímou interakcí s molekulami na jejich povrchu

9 Bakteriální LPS poskytuje signál přes TLR -4 a aktivuje transkripční faktor NF B, který pak aktivuje geny kódující proteiny sloužící k obraně proti infekci (TNF )

10 Opsonizace Působení složek humorální imunity Fc receptory fagocytů Komplementové receptory Proteiny akutní fáze: Lektin vážící manózu (MBL) C reaktivní protein (CRP) Sérový amyloid P

11

12 Salmonella typhi její dlouhý bičík je rozpoznán Toll-like receptory

13 Možné cesty průniku infekce Naše tělo je neustále vystaveno mikroorganizmům přítomným v prostředí Kontakt na epiteliálních površích Na sliznicích dýchacích cest Na střevních sliznicích Na sliznicích genitálií Při poranění kůže (kousnutí hmyzem)

14 Antimikrobiální peptidy Lysozym, fosfolipáza A (sliny) Histatiny Trávící enzymy Lysolipidy a β-defensiny (intestinální) Surfaktanty SP-A, SP-D opsonizace

15 Odpověď na průnik mikroorganizmu je rozdělena na několik stádií: - Lokální nespecifická odpověď se pokusí infekci zlikvidovat - pokud se to nepodaří, je antigen transportován do lymfatických uzlin - aktivují se specifické mechanizmy

16 Fagocyty a fagocytóza Evolučně velmi starý proces Dva hlavní typy buněk - profesionální fagocyty: neutrofilní a eozinofilní granulocyty a monocyty (makrofágy)

17

18 Makrofágy jsou aktivované patogenními mikroorganizmy, pohltí je a zahájí zánětlivou odpověď Makrofágy exprimují řadu receptorů pro bakterální komponenty včetně receptorů pro karbohydráty (manózový a glukanový receptor), lipidy (LPS receptor) nebo jiné bakteriální komponenty (Toll-like receptory). Navázání bakterie na receptory stimuluje fagocytózu a pohlcení bakterie do intracelulárních váčků zvaných fagozómy, kde jsou zničeny. Signál přes některé receptory, jako např. TLR, způsobí sekreci prozánětlivých cytokinů jako IL-1β, IL-6 a TNF- a lipidové mediátory zánětu.

19 Proces fagocytózy

20 Likvidace pohlceného mikroorganizmu Baktericidní látky (bazické peptidy defensiny) Hydrolytické enzymy (proteázy katepsiny, lysozym, kyselé hydrolázy) Nízké ph (3,5-5) BPI (bactericidal permeability-increasing protein)

21 Likvidace pohlceného mikroorganizmu Aktivace enzymů: NADPH-oxidáza, myeloperoxidáza, superoxid dismutáza Reaktivní kyslíkové intermediáty (ROI): - superoxidový radikál O 2- (molekula kyslíku s připojeným elektronem) - Singletový kyslík, H 2 O 2, hydroxylový radikál a chlornanové anionty Cl - - ROI jsou používány hlavně pro likvidaci pohlcených extracelulárních patogenů

22 Likvidace pohlceného mikroorganizmu Oxid dusnatý (NO), produkovaný NO syntázou Je hlavním nástrojem zabíjení intracelulárních parazitů Baktericidní látky a ROI se mohou uvolňovat i do okolních tkání

23 Oxidační vzplanutí je způsobeno přechodným zvýšením spotřeby kyslíku během produkce mikrobicidních kyslíkových metabolitů

24 Neutrofily tvoří první vlnu buněk, které opouští cévy a vstupují do místa infekce V místě infekce jsou cévy rozšířené Leukocyty mohou být v kontaktu s endotelem Endotel v místě infekce exprimuje pod vlivem TNF- a IL-8 selektiny, molekuly ICAM-1 a ICAM-2 Dochází k extravazaci (diapedéze) neutrofilů

25

26

27

28

29 Infekce stimuluje makrofágy k produkci cytokinů a chemokinů, které spouštějí zánětlivou reakci

30 Bakteriální LPS poskytuje signál přes TLR -4 a aktivuje transkripční faktor NF B, který pak aktivuje geny kódující proteiny sloužící k obraně proti infekci (TNF )

31

32 Aktivace Toll-like receptorů spouští produkci prozánětlivých cytokinů a chemokinů a expresi kostimulačních molekul Toll signalizační dráha vede také k povrchové expresi kostimulačních molekul Tyto molekuly, nazývané B7.1 (CD80) a B7.2 (CD86), jsou povrchové proteiny exprimované makrofágy a DC v odpověď na signál z TLR-4. Tyto molekuly pak spolu s MHC II aktivují naivní T buňky

33 Bakteriální LPS přes Toll signální cestu indukuje změny v Langerhansových buňkách. - Stimuluje je k migraci do lymfatických uzlin - Působí změny v expresi povrchových molekul (CD80, CD86 a MHC ) Tím je zahájena specifická imunitní reakce (stimulace CD4 T-buněk).

34

35 Cytokiny uvolňované fagocyty aktivují akutní fázi odpovědi TNF-, IL-1β a IL-6: endogenní pyrogeny Zvýšení tělěsné teploty Syntéza proteinů akutní fáze C-reaktivní protein se váže na fosfocholin na bakterální stěně, opsonizuje a spouští komplementovou kaskádu Konečný efekt prozánětlivých cytokinů je leukocytóza

36 TNF- je důležitým cytokinem, který kontroluje lokální obranu proti infekci, ale pokud je uvolňován systémově, má destruktivní účinky.

37 Cytokiny TNF-, IL-1β a IL-6 mají široké spektrum biologických aktivit, které pomáhají koordinovat odpověď organizmu na infekci

38 Interferony jsou antivirové proteiny produkované buňkami jako odpověď na virovou infekci. Vážou se na interferonové receptory na buňkách a indukují syntézu proteinů inhibujících replikaci virů (oligoadenylát syntetáza, PKR kináza)

39 NK (Natural Killers) buňky Patří k T lymfocytům, ale jsou schopny bez předchozí stimulace zabíjet některé nádorové a virem infikované buňky Jsou součástí antigenně nespecifických obranných systémů Mají dva typy receptorů pozitivní (stimulační) a negativní (inhibiční)

40 NK (Natural Killers) buňky Stimulační receptory (rozeznávají struktury obecně přítomné na povrchu buněk), např. Fc receptor CD16 Inhibiční receptory rozeznávají MHC gp I. Hlavními cytotoxickými nástroji NK buněk jsou cytotoxické granule obsahující perforin a granzymy

41

42 Žírné buňky (mastocyty) Jsou morfologicky podobné bazofilům Jejich hlavní funkce je obrana proti parazitům Jedny z prvních buněk aktivovaných při zánětu Charakteristickým receptorem je vysokoafinní Fc-receptor pro IgE

43

44 Poruchy fagocytózy Chybějící nebo snížená tvorba oxidativních produktů fagocytujících buněk je příčinou závažného onemocnění chronické granulomatosy (chronic granulomatous disease, CGD). Onemocnění se projevuje opakujícími se těžkými infekcemi, které způsobují bakterie, kvasinky i plísně. Obyčejně probíhají formou zápalu plic nebo abscesů kůže, tkání a orgánů. Onemocnění je nejčastěji způsobené mutací genu kódujícího enzym fagocytární NADPH-oxidasu na chromozomu X, kdy tento enzym má sníženou nebo nulovou aktivitu. Aktivovaná NADPH-oxidasa zdravých jedinců katalyzuje reakci, při níž NADPH* reaguje s kyslíkem za vzniku NADP+ a superoxidového radikálu O2-, ze kterého následnými reakcemi vzniká singletový kyslík, peroxid vodíku, hydroxylový radikál a chlornan. Tyto reaktivní oxidační meziprodukty jsou zodpovědné za ničení patogenů uvnitř fagocytů po jejich ingesci

45 Testování fagocytózy Testy ingesce Baktericidní test Testy oxidačního metabolizmu Chemiluminiscence

46 Testy ingesce Testují schopnost fagocytů pohltit cizorodý materiál Používané substráty: bakterie nebo kvasinky, mikrosférické hydrofilní partikule (MSHP), velikost 1μM Suspenze částic se inkubuje s krví pacienta, pak se zhotoví nátěr na sklíčko Fagocytární aktivita = podíl fagocytujících neutrofilů ze 100 Fagocytární index = počet pohlcených částic na buňku

47

48

49 Testy ingesce Výpovědní hodnota testů ingesce v rutinní diagnostice je velmi malá primární porucha fagocytózy neexistuje K výraznému snížení fagocytózy dochází jen u velmi těžkých klinických stavů Použití spíše pro výzkumné účely Pokud se použijí inertní partikule, testuje se nereceptorově zprostředkovaná fagocytóza Nezralé neutrofily nejsou schopny partikule pohltit Stafylokoky vyžadují opsonizaci sérovými Ig Kvasinky vyžadují opsonizaci komplementem C3b Patologické výsledky mohou odrážet i poruchy opsonizace

50 Baktericidní test Testuje všechny fáze fagocytózy včetně usmrcení pohlceného mikroorganizmu Substrátem je živý mikroorganizmus: C. albicans, S. aureus, Pseudomonas Hodnocení se provádí různými způsoby: mikroskopicky, cytometricky

51 Testy oxidačního metabolizmu Nitroblue tetrazolium chlorid (NBT) iod nitroblue tetrazolium (INT) Testuje se kyslíkový metabolizmus granulocytů (schopnost tvořit kyslíkové radikály) pomocí schopnosti redukovat bezbarvé tetrazoliové soli na tmavě modré formazány Odečítá se na sklíčku (mikroskopicky) nebo na destičkách (fotometricky)

52

53 Chemiluminiscence Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí Fagocyty při oxidačním vzplanutí vytvářejí vysoce reaktivní kyslíkové metabolity. Během těchto procesů vznikají emise fotonů a to se projevuje chemiluminiscencí fagocytů. Toto chemické světlo se zesiluje luminolem a detekuje na chemiluminometru

54 Měření oxidačního vzplanutí průtokovou cytometrií (FagoFlow) Princip Test je založen na měření respiračního (oxidačního) vzplanutí granulocytů po jejich stimulaci inaktivovanými bakteriemi E. coli. Po ingesci bakterií je ve fagocytech aktivována NADP-oxidáza,která spustí respirační (oxidační) vzplanutí. Vznikající reaktivní meziprodukty uvnitř fagocytů oxidují dihydrorhodamin 123(DHR123) na fluorescenční produkt rhodamin 123, který je detekován průtokovým cytometrem.

55 Histogram populace kontrolních nestimulovaných granulocytů po inkubaci s DHR123. Histogram populace stimulovaných granulocytů. Vzorek byl inkubován s bakteriemi E. coli a DHR123.

56 O 2 NEZÁVISLÉ MECHANIZMY: imunochemické stanovení defensinů stanovení lysozymu deficience specifických granul

57 Další testy nespecifické imunity - adherence - chemotaxe: Rebuckovo kožní okénko (in vivo) agarózový test (formylmethionylleucylfenylalanin) Boydenova komůrka (nitrocelulózový filtr)

58 AKTIVACE A ADHERENCE FAGOCYTUJÍCÍCH BUNĚK: je testována schopnost adherovat k pevným povrchům je testována přítomnost a denzita exprese adhezivních molekul imunofluorescencí LAD-I syndrom: - absence řetězce (CD18) integrinového heterodimeru LFA-1

59 CHEMOTAXE: orientovaný pohyb granulocytů v chemoatraktivním gradientu migrace granulocytů pod agarózou poruchy chemotaxe: - primární defekty: syndrom líných leukocytů - sekundární defekty: diabetes, popáleniny

60 Další testy nespecifické imunity Test aktivace bazofilů: Bazofily společně s mastocyty jsou klíčovými buňkami časné fáze alergické reakce (vysokoafinitní receptor pro Fc fragment IgE) Dochází k degranulaci a k expresi CD63

61 Další testy nespecifické imunity Eozinofilní kationický protein (ECP) ECP patří mezi preformované granulární proteiny eozinofilů, uvolňují se při aktivaci Stanovujeme chemiluminiscencí