UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE Vývoj a validace HPLC metody pro stanovní kyseliny sorbové v topickém přípravku (diplomová práce) Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Ludmila Matysová Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Petr Solich, CSc. Hradec Králové 2006 Eva Rybenská

2 Velmi děkuji PharmDr. Ludmile Matysové za odborné vedení mé diplomové práce, za cenné rady a připomínky. Také bych chtěla poděkovat pracovníkům katedry analytické chemie za jejich vstřícnost a ochotu, zejména pak Mgr. Lucii Novákové za odbornou pomoc a trpělivost.

3 1. Úvod

4 Topické léčivé přípravky s obsahem močoviny jsou používány k prevenci a terapii onemocnění kůže projevujících se suchostí, vysokým nánosem šupin ( xerodermie, ichtyóza, atopická dermatitida, lupénka ). Lze jej použít k aplikaci při plenkové dermatitidě kojenců nebo při chronických dermatózách. Kyselina sorbová je využívána jako konzervační látka, která zabraňuje růstu mikroorganismů v léčivém přípravku. Močovina i kyselina sorbová se stanovují chemickými metodami ( podle ČL 2002 močovina acidimetrickou titrací kyselinou chlorovodíkovou, kyselina sorbová alkalimetrickou titrací hydroxidem sodným, obě s vizuální indikací ekvivalenčního bodu ). Takové stanovení je pro rutinní kontrolně-analytické hodnocení léčivých přípravků nepraktické a příliš časově náročné. Přednost samozřejmě mají rychlé, jednoduché a automatické metody. Pro stanovení látek v krému je vhodnou metodou vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Její výhodou je možnost současného stanovení několika látek najednou, selektivita, rychlost měření a v závislosti na použitém detektoru také nízký detekční limit.

5 2. Cíl práce

6 Diplomová práce je zaměřena na vývoj, optimalizaci a validaci podmínek stanovení kyseliny sorbové v hromadně vyráběném léčivém přípravku obsahujícím močovinu. Jako vhodná metoda byla vybrána HPLC s UV detekcí, neboť močovina v UV oblasti neabsorbuje, a proto není stanovení rušeno její přítomností. Jednou z mnoha výhod je také skutečnost, že další látky přítomné v krému jsou při chromatografii separovány a neovlivňují tak stanovení kyseliny sorbové. Nalezená metoda pro stanovení kyseliny sorbové bude používána v běžné kontrole léčivého přípravku, proto musí být co nejjednodušší a časově nenáročná. Součástí diplomové práce je také validace této metody podle doporučení Státního ústavu pro kontrolu léčiv a mezinárodních směrnic ICH. Literární rešerše je zaměřena na zmapování všech metod, které se používají pro stanovení kyseliny sorbové pomocí HPLC.

7 3. Teoretická část

8 3.1 Lipolotio HBF Složení: Urea 4,00 Arlacel 582 5,20 Arlacel 989 1,50 Alcoholes adipis lanae 0,80 Paraffinum perliquidum 15,00 Triglycerida saturanta media 12,00 Isostearylisostearát 5,00 Cera alba 0,50 Dimeticonum 0,50 Glycerolum 85% 2,00 Propylenglycolum 1,20 Magnesii sulfas 0,70 Parfem Johnsons baby 0,30 Acidum lacticum 0,05 Natrii laktas 50% 6,00 Acidum sorbicum 0,20 Aqua purificata ad 100, Močovina Močovina (urea) je chemickou strukturou karbamid s molekulovou hmotností 60,06, teplotou tání 132,7 C a hustotou 1,33 g/cm 3.

9 Vzorec: O H 2 N C NH 2 Jde o bílý krystalický prášek nebo průhledné krystaly. Je slabě hygroskopická, velmi snadno rozpustná ve vodě, dobře rozpustná v lihu 96% a prakticky nerozpustná v dichlormethanu [1]. Vyrábí se reakcí oxidu uhličitého s amoniakem pod vysokým tlakem a za zvýšené teploty. Poprvé byla připravena zahříváním roztoku kyanatanu amonného F. Wöhlerem v roce 1828 a po kyselině šťavelové se tak stala druhou organickou látkou připravenou laboratorně z látky anorganické. Ke kyselinám se chová jako jednosytná zásada, acylací vytváří ureidy. V organismu savců je urea přirozeným produktem bílkovinného metabolismu, vzniká při detoxikaci amoniaku. Získává se z moče jatečních zvířat nebo se připravuje synteticky. Je významnou surovinou k výrobě některých léčiv. Dále se používá k výrobě plastů, jako přísada do krmiva skotu či jako hnojivo [8]. V terapii se urea využívá k hydrataci a správné funkci kůže. Je přirozeným hydratačním faktorem rohové vrstvy epidermis, ovlivňuje vazbu vody na intracelulární proteiny. V nízkých koncentracích působí keratoplasticky (změkčuje kůži, napomáhá působení jiných léků), ve vyšších koncentracích má účinek keratolytický (rozpouští kůži). Kromě toho má efekt protisvědivý a antiseptický. Velkoplošně se používá k ochraně a ošetřování citlivé nebo mírně podrážděné kůže a též pro suchou až velmi suchou kůži. Vhodná je také k doplňkové místní léčbě kožních onemocnění silně účinnými kožními přípravky či k péči o pokožku při doléčování kožních onemocnění. Dalšími indikacemi jsou svědivé projevy, atopický ekzém, psoriáza, neurodermitida, gerodermie, léčba ichtyózy apod [6,9]. Po lokálním nanesení masti se močovina vstřebává do horní vrstvy kůže a asi 6% se jí během pěti dnů objeví v moči. Celkový účinek se po místní aplikaci nepředpokládá. Aplikuje se dospělým a dětem od jednoho roku obvykle ve formě krému 1-3krát denně v tenké vrstvě na postižená místa. Přípravky se nesmí užívat při přecitlivělosti na močovinu nebo na konzervační látky či emulgátory. Nesmí se aplikovat do očí.

10 Ojediněle se může vyskytnout pálení a zarudnutí v místě aplikace či alergická kožní reakce [6,9] Kyselina sorbová Kyselina sorbová (Acidum sorbicum) je kyselina (E,E) hexa 2,4 dienová o molekulové hmotnosti 112,13 a o teplotě tání 134,5 C. Vzorec: Jedná se o bílý nebo téměř bílý krystalický prášek těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v ethanolu 96% a v etheru [1]. Aktivní formou je nedisociovaná forma kyseliny, která je krát účinnější než anion a používá se řádově v množství mg/kg. Má fungicidní účinky, je inhibitorem plísní, kvasinek a bakterií a používá se ke konzervaci potravin, léčivých a kosmetických přípravků [7,8]. UV spektrum kyseliny sorbové má absorpční minimum při 210nm a absorpční maximum při 253 nm.

11 3.2 Chromatografie Principy chromatografie Chromatografie je jedna z nejvýznamnějších analytických metod, která umožňuje separaci, identifikaci s pomocí standardů a stanovení velkého počtu organických i anorganických látek. Chromatografické metody využívají dělení analyzovaných látek mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární nepohyblivá a druhá je mobilní pohyblivá. V průběhu chromatografického procesu dochází k postupnému, mnohonásobně opakovanému vytváření rovnovážných stavů dělených látek mezi stacionární fází, která je v koloně nebo plošné vrstvě, a mobilní fází, která unáší separované látky. Stacionární fázi tvoří částice tuhé látky nebo kapalina ukotvená na povrchu inertního nosiče. Mobilní fází může být plyn nebo kapalina. Při styku stacionární i mobilní fáze s dělenými látkami dochází k vzájemným interakcím, které jsou základním předpokladem pro jejich separaci. K separaci tedy dochází na základě různé afinity dělených látek ke stacionární a mobilní fázi. Chromatografické metody lze rozčlenit podle různých kritérií, nejčastěji podle charakteru mobilní fáze na chromatografii plynovou a kapalinovou, dále pak z hlediska uspořádání soustavy na chromatografii planární a kolonovou (sloupcovou). Následuje rozlišení chromatografie podle mechanismu separace. Podle podstaty separačního procesu lze chromatografii rozčlenit na: adsorpční rozdělovací iontově výmennou gelovou permeační afinitní chromatografii na molekulových sítech Plynová chromatografie se využívá především pro analýzu těkavých látek, které lze zahřátím převést na páry, aniž dochází k jejich rozkladu. S výhodou se tedy používá

12 pro analýzu plynů. Její předností je přítomnost vysoce citlivých univerzálních a selektivních detektorů, které umožňují detekci stopových množství látek. Kapalinová chromatografie je v analýze léčiv daleko častěji používanou metodou vzhledem k tomu, že asi 90 % léčiv jsou látky netěkavé nebo tepelně nestálé. Používá se v uspořádání kolonovém, kdy je pro analytické účely nejčastěji využívána vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), i v uspořádání plošném realizovaném především tenkovrstvou chromatografií (TLC). Sloupcovou chromatografií je možno detekovat sloučeniny od stotisícin procenta až po desítky procent, planární techniky dovolují stanovení velkých sérií řady látek Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je v současné době jedna z nejprogresivnějších analytických metod, která se stále více uplatňuje ve všech oblastech analýzy léčiv. Jde o separační metodu, která umožňuje současně kvalitativní i kvantitativní hodnocení separovaných složek směsi, a to s vysokou selektivitou, citlivostí a v relativně krátkém čase. Pro analýzu postačuje velmi malé množství vzorku a s využitím automatického dávkovače je možno celou metodu plně automatizovat. Z HPLC záznamu lze získat detailní informace o identitě, obsahu a čistotě analyzovaného léčiva. Pro své přednosti je HPLC široce využívána ve všech moderních lékopisech. HPLC chromatografické kolony pro analytické účely jsou 5 30 cm dlouhé o vnitřním průměru 2 8 mm a jsou zpravidla zhotoveny z nerezové oceli nebo ze skla. Kolony jsou naplněny vhodnými sorbenty. V HPLC se nejčastěji používají tzv. chemicky vázané stacionární fáze, kdy jsou na hydroxylové skupiny na povrchu silikagelových zrnek vhodnou chemickou reakcí navázány různé radikály. Nejčastěji jsou to uhlovodíkové řetězce s 18ti uhlíkovými atomy. Jde tedy o nepolární chemicky vázané fáze tzv. reverzní fáze. HPLC analýzu lze provádět za konstantního složení mobilní fáze v průběhu celé analýzy, jde o tzv. izokratickou eluci, která se pro analytické účely používá nejčastěji. Pokud je v průběhu analýzy programově měněno složení mobilní fáze, jedná se o tzv. gradientovou eluci.

13 Předpokladem úspěšné HPLC analýzy je optimalizace chromatografických podmínek tak, aby jednotlivé separované složky směsi poskytovaly ostré a symetrické chromatografické píky, rozdělené pokud možno až na základní linii. Sloučeniny se identifikují pomocí retenčního (elučního) času, což je doba od nástřiku vzorku na kolonu k maximu chromatografického píku. Obsah látek (kvantita) se určuje z velikosti plochy event. z výšky chromatografického píku. Pro správnou kvantifikaci je nejvýhodnější využití metody vnitřního standardu, která eliminuje možné rozdíly při dvou samostatných měřeních. Citlivost chromatografické analýzy závisí na použitém detektoru. Nejběžněji používanými detektory jsou spektrofotometry pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti, včetně detektorů s diodovým polem. Mohou být také použity fluorescenční spektrofotometry, diferenční refraktometry, elektrochemické detektory, hmotnostní spektrometry, detektory na bázi rozptylu světla, měření radioaktivity nebo jiné speciální detektory Kapalinový chromatograf Kapalinový chromatograf, jehož blokové schéma je znázorněno na Obr. 1, se skládá z částí, které zabezpečují transport mobilní fáze, separaci jednotlivých složek, jejich detekci a vyhodnocení výsledků analýzy. Mobilní fáze je při izokratické eluci vedena ze zásobníku přes odplyňovač do vysokotlakého čerpadla, při gradientové eluci se proudy přiváděné ze zásobníků mísí podle programu ve směšovači a potom postupují stejnou cestou do vysokotlakého čerpadla. Odtud postupují přes dávkovací zařízení do chromatografické kolony, která je spojena přímo s detektorem, z něhož bývá výstup do sběrače frakcí nebo do jímače mobilní fáze. Detektor je spojen s počítačem, kde dochází k záznamu dat a vyhodnocování chromatogramů.

14 Obr. 1: Schéma kapalinového chromatografu 1,2 - zásobníky mobilní fáze, 3 - vysokotlaká čerpadla, 4 - směšovač, 5 - manometr, 6 - předkolona, 7 - dávkovací zařízení, 8 - kolona, 9 - detektor, 10 - sběrač frakcí, 11 zapisovač, 12 - integrátor

15 3.3 Validace analytické metody Účelem validace analytické metody je prokázat vhodnost metody pro zamýšlené použití. Pravidla pro validaci metod ve farmacii se řídí platnými předpisy a doporučeními, zejména směrnicemi ICH (International Conference on Harmonization) Q2A (Validation of Analytical Methods: Definitions and Terminology) a Q2B (Validation of Analytical procedures: Methodology), předpisy americké FDA obecně zaměřenými na validaci chromatografických metod, platnými lékopisy ČL 2002, Ph. Eur. 4 a USP 28, dále pak vnitřními normami a předpisy podléhajícími pravidlům režimu SVP, SLP nebo akreditace, jim příslušejícími SOP (standardní operační postup) a také požadavky SÚKL uveřejňovanými v časopise Věstník SÚKL. Existuje tedy velké množství předpisů týkajících se problematiky validace a mezi jednotlivými autoritami jsou určité odlišnosti např. v parametrech vyžadovaných jako součást validace metody nebo limitech platných pro ověření vhodnosti systému. Je proto důležité uvědomit si a přesně definovat, pro jaký účel bude metoda vypracovávána a jakou autoritou bude poté schvalována. Postup validace je různý v závislosti na validované proceduře. Ty jsou podle ICH rozděleny do čtyř hlavních skupin, které se liší doporučovanými validačními parametry: Identifikační testy Kvantitativní stanovení nečistot Limitní zkoušky pro nečistoty Kvantitativní stanovení účinné látky v léčivé substanci případně v léčivém přípravku, stanovení vybrané složky v léčivém přípravku V průběhu validace se obvykle stanovují tyto validační charakteristiky: správnost, přesnost, selektivita, linearita a rozsah, limit detekce, limit kvantifikace a robustnost v závislosti na typu validované procedury podle Tab. 1. Jak již bylo uvedeno, existují některé rozpory a nepřesnosti. Americký lékopis USP 28 např. předepisuje parametr Ragidita (Rugedness), který je však ICH definován spíše jako reprodukovatelnost metody (reproducibility). Americký lékopis navíc uvádí SST jako zvláštní test mimo vlastní validaci, zatímco ICH jej považuje za součást validace.

16 Tab. 1: Typy analytických procedur a doporučení příslušných validačních parametrů Typ analytické metody Identifikační testy Kvantitativní stanovení nečistot Limitní zkoušky pro nečistoty Kvantitativní stanovení účinné látky Validační charakteristiky Správnost Přesnost - Opakovatelnost Intermediární přesnost Selektivita Limit detekce Limit kvantifikace Linearita Robustnost Validaci analytické metody je nutné provést při zavádění jakékoliv nové analytické metody v laboratoři. Metoda musí být revalidována došlo-li ke změně analytického postupu v jiných rozmezí, než je povoleno příslušnými lékopisy případně SOP, zahrnují-li tuto informaci a je-li schválena relevantní autoritou. V případě analýzy farmaceutických přípravků je nutné metodu znovu validovat došlo-li ke změně výrobního postupu, je-li možná přítomnost dalších nečistot dosud nepopsaných v Drug Master File dokumentaci nebo byla-li změněna jakákoliv účinná nebo pomocná látka Test vhodnosti systému System Suitability Test (SST) Nedílnou součástí vývoje analytické metody je ověření vhodnosti systému neboli System Suitability Test. Zde se zjišťují parametry vhodnosti analytického systému jako celku (zahrnuto je přístrojové vybavení, elektronika, analytické operace i analyzovaný vzorek) ověřením odpovídajících chromatografických parametrů: opakovatelnost nástřiku, rozlišení píků, asymetrie píku (podle USP 28, Ph. Eur. 4 nazývá tento parametr faktor symetrie píku), kapacitní faktor (charakteristika relativní retence), počet teoretických pater (charakteristika účinnosti systému). Pro hodnocení System Suitability Testu se používají roztoky standardních látek, obvykle o koncentraci blízké koncentracím očekávaným ve vzorku.

17 Ověření parametrů Testu vhodnosti systému by mělo být provedeno před započetím jakékoliv série analýz a výsledky by vždy měly vyhovovat požadavkům validační zprávy, lékopisných monografií případně dalších opodstatněných norem. Nevyhovují-li tyto hodnoty, předepisují lékopisy (Ph. Eur. 4 a ČL 2002) povolená rozmezí úprav parametrů analytické metody tak, aby požadavky byly splněny. Účinnost chromatografické kolony (počet teoretických pater) Účinnost kolony se vyjadřuje počtem teoretických pater N. Se zvyšujícím se počtem teoretických pater je kolona účinnější. Výpočet se provádí podle vzorce: N 5,54. (t R / W 0,05 ) 2 t R - retenční čas W 0,05 - šířka píku v polovině výšky (min) Požadavek na 10-cm kolonu je N Asymetrie chromatografických píků S rostoucí mírou asymetrie píku roste chyba při výpočtu plochy píku, a proto se snižuje přesnost měření. Vzorec pro výpočet asymetrie: T W 0,01 / 2.f W 0,01 šířka píku ve vzdálenosti 5% výšky píku f - menší část úsečky W 0,01, která vznikne protnutím úsečky kolmicí spuštěnou z vrcholu píku Pro HPLC je požadavek T 2,0. Rozlišení chromatografických píků Rozlišení R S (resolution) je mírou chromatografické separace. Udává, jak dalece jsou od sebe jednotlivé látky separovány. Hodnota rozlišení by měla být nejméně 1,5. Výpočet se provádí podle vzorce: R ij 2. t Ri - t Rj / (W i W j ) t R retenční čas W šířka píku na základně (min) Opakovatelnost analýzy Vyjadřuje blízkost výsledků získaných nezávislým měřením standardního roztoku. Také je definována jako přesnost za stejných operačních podmínek v krátkém časovém intervalu. Určuje se jako relativní směrodatná odchylka s R (%) nebo intervalem spolehlivosti získaným výpočtem nejméně ze šesti měření.

18 3.3.2 Validační parametry Selektivita (Specifity) Selektivita analytické metody je schopnost metody určit výhradně sledovaný analyt a to správně a specificky i v přítomnosti ostatních předpokládaných komponent jako jsou nečistoty, rozkladné produkty nebo látky pocházející z matrice. V případě HPLC analýzy farmaceutických přípravků se selektivita ověřuje nástřikem roztoku standardních látek obsahujícího všechny účinné látky, konzervancia, nečistoty i degradační produkty, poté nástřikem placeba testovaného přípravku připraveného uvedeným postupem a nástřikem vzorku připraveného stejným postupem. Nesmí docházet k žádným koelucím v místech retenčních časů sledovaných látek a rozlišení jednotlivých píků musí být minimálně 1,5. Linearita (Linearity) Linearita analytické metody je schopnost dávat výsledky měření přímo úměrné koncentraci analytu ve vzorku. Prokazuje se s použitím standardů účinných látek, mícháním a ředěním příslušných směsí. Linearita se obvykle stanovuje minimálně na pěti koncentračních hladinách. Popisuje se rovnicí přímky, korelačním koeficientem případně dalšími parametry lineární regrese. Rozsah (Range) Rozsah analytické metody je parametr odvozený od linearity. Je to interval mezi horní a dolní koncentrační hladinou analytu ve vzorku, pro které byla prokázána vhodná přesnost, správnost a linearita. SÚKL vyžaduje ověření rozsahu v rozmezí % očekávané hodnoty a řadí jej do linearity, zatímco ICH rozděluje požadavky na rozsah podle typu analytické procedury. Pro stanovení účinné látky by rozsah metody měl být v rozmezí %, pro ověření homogenity %, pro disoluční zkoušku ± 20% specifikovaného rozmezí atd. Přesnost (Precision) Přesnost analytické metody vyjadřuje těsnost shody mezi sérií měření mnohonásobného dávkování homogenního vzorku upraveného předepsaným postupem za předepsaných podmínek. Přesnost by měla být určována na třech úrovních: opakovatelnost, intermediární přesnost a reprodukovatelnost. Míra přesnosti je vyjádřena pomocí relativní směrodatné odchylky [% R. S. D.].

19 Opakovatelnost (Repeatability) Opakovatelnost je ověření přesnosti metody za stejných podmínek, během krátké časové doby, ve stejné laboratoři a stejným pracovníkem. Měla by být určována na třech koncentračních hladinách pokrývajících specifikované rozmezí, tedy minimálně devět měření (tři nástřiky při jednotlivých koncentracích). Druhou možností je ověření přesnosti na úrovni 100% zkoušené koncentrace šesti opakovanými měřeními. Intermediární přesnost (Intermediate precision) Intermediární přesnost (také intra-laboratorní přesnost) je ověření přesnosti metody jiným analytikem, na jiném přístroji a v jiný den, ale ve stejné laboratoři. Reprodukovatelnost (Reproducibility) Reprodukovatelnost (také inter-laboratorní přesnost) se testuje při standardizaci metody, počítá-li se s jejím přenosem mezi různými laboratořemi, na příklad v případě zavádění lékopisných metod. Není však obvyklou součástí validace metody. Správnost (Accuracy) Správnost analytické metody vyjadřuje těsnost shody mezi změřenou hodnotou analytického parametru a referenční hodnotou, která je považována za správnou. Jako správná hodnota se používá referenční látka známé čistoty (obsahu), přídavek přesně známého množství standardní látky k placebu (tzv. spikovaní ), standardní přídavek látky (např. u nečistot) nebo porovnání s dobře charakterizovanou metodou, u které už správnost byla definována. Správnost se hodnotí až po té, kdy byla stanovena přesnost, linearita a selektivita. Správnost se obvykle hodnotí na třech koncentračních hladinách pokrývajících celé specifikované rozmezí, tedy minimálně devět měření (tři nástřiky při jednotlivých koncentracích). SÚKL vyžaduje pouze stanovení šesti koncentrací na úrovni 100% obsahu látky. Je vyjádřena hodnotou výtěžnosti (% recovery) a relativní směrodatnou odchylkou [% R. S. D.], která se v tomto případě popisuje jako % rozdílu stanovovaných hodnot od akceptované správné hodnoty. Limit detekce (Limit of Detection, LOD) Limit detekce je nejnižší množství analytu ve vzorku, které může být detekováno, ne však nutně kvantifikováno. Patří mezi parametry citlivosti metody. Existují různé přístupy určování limitu detekce. Třemi hlavními jsou: vizuální stanovení limitu detekce, metoda využívající poměr signálu k šumu (limit detekce je pak trojnásobek tohoto poměru) a třetí metodou je složitější výpočet založený na směrodatné odchylce signálu odpovědi.

20 Limit kvantifikace (Limit of Quantification, LOQ) Limit kvantifikace je dalším parametrem citlivosti metody, zejména u metod hodnotících kvantitativně nečistoty nebo rozkladné produkty. Definuje nejnižší množství analytu ve vzorku, které lze kvantitativně stanovit s vhodnou přesností a správností. Existují opět různé přístupy určování limitu detekce. Třemi hlavními jsou podobně: vizuální stanovení limitu kvantifikace, metoda využívající poměr signálu k šumu (limit kvantifikace je pak desetinásobek tohoto poměru) a třetí metodou je složitější výpočet využívající určení směrodatné odchylky signálu odpovědi a rozsahu kalibrační křivky. Získané hodnoty je třeba ověřit analýzou vzorků o koncentraci blízké limitu kvantifikace. Robustnost (Robustness) Robustnost analytické metody je mírou kapacity zůstat neovlivněna malými záměrnými změnami parametrů metody. Její ověření a následná kontrola jsou důležité zejména je-li měření náchylné ke změnám analytických podmínek. K ověření použitelnosti metody slouží právě System Suitability Test, který by se měl provádět před započetím jakékoliv série analytických měření. Mezi parametry sledované a měněné při ověřování robustnosti metody v kapalinové chromatografii patří procentuální složení mobilní fáze, ph vodné složky mobilní fáze, změna analytické kolony (jak šarže, tak výrobce), teplota, průtoková rychlost, čas extrakce analytů z matrice atd. Důležité je získat také přehled o stabilitě standardních látek v roztoku a o stabilitě připravovaných vzorků při uchovávání za laboratorních podmínek a za snížené teploty. Vyhodnocení robustnosti tedy dává analytikovi představu o spolehlivosti metody při normálním praktickém používání. Jednotlivé validační parametry, jejich vyjádření a obvykle používané limity jsou uvedeny v tabulce Tab. 2. Tab. 2: Validační parametry a obvykle používané limity Validační parametry Jednotky/vyjádření Doporučené Limity přesnost (opakovatelnost) [% RSD] R.S.D.< 5% linearita korelační koeficient R > 0,9990 linearita rovnice přímky - správnost [% RSD] R.S.D.< 5% správnost [% recovery] 100 5% selektivita chromatogramy žádná interference LOD [g ml -1 ] - LOQ [g ml -1 ] - stabilita laboratorní teplota [%] změny 1% stabilita - 4ºC [%] změny 1%

21 3.4 Metody stanovení kyseliny sorbové Lékopisné stanovení kyseliny sorbové Český lékopis 2002 Kyselina sorbová se stanovuje alkalimetrickou titrací: 0,1000 g se rozpustí ve 20 ml lihu 96% R. Přidá se 0,2 ml fenolftaleinu RS jako indikátoru a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do vzniku růžového zbarvení. 1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 11,21 mg C 6 H 8 O Zahraniční lékopisy Stanovení kyseliny sorbové pomocí HPLC

22 4. Experimentální část

23 4.1 Přístroje, podmínky separace Kapalinový chromatograf: Sestava: 1.)Shimadzu LC 2010C, Shimadzu corp., JAP. Vyhodnocení: chromatografická stanice Class VP, verze 6.13, Shimadzu 2.)Shimadzu systém složený z autosampleru SIL-HTAVP, lineární pumpy LC-10ADVP, nízkotlaké pumpy FCV-10ALVP, kolonového termostatu CTO-10ACVP, DAD detektoru SPD-H10AVP, FD detektoru RF-10AXL. Vyhodnocení: chromatografická stanice Lab-Solution Kolona: ZORBAX Eclipse XDB C18, kondiciovaná mobilní fází; délka 75 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, velikost částic 3,5µm Dávkování: 5 µl Detekce:UV 253 nm Mobilní fáze: kyselina fosforečná 0,085% - acetonitril = 60:40, před použitím se filtruje pomocí filtračního zařízení na mobilní fáze, Millipore, filtr ze skleněných vláken o velikosti pórů 0,45 µm Průtok: F m = 1,0 ml/min Izokratický režim Teplota: 25 C Ultrazvuková lázeň: Tescon 1, Tesla, ČR Vodní lázeň: WB 10, Memmert GmbH+Co, Germany Centrifuga: EBA 21, Hettich Zentrifugen, Germany Analytické váhy: Sartorius 2004 MP, SRN UV spektrofotometr: Hewlett Packard 8453, USA

24 4.2 Chemikálie, standardy, vzorky Lipolotio HBF VV 273/04 š. č , Herbacos bofarma, Pardubice Lipolotio HBF VV 113/05 š. č , Herbacos bofarma, Pardubice Lipolotio HBF bez pufrace a bez konzervace VV 275/04 š. č , Herbacos bofarma, Pardubice Kyselina sorbová, Sigma-Aldrich GmbH, Německo, š.č. AU08109LF; čistota 99% Propylparaben, Sigma-Aldrich GmbH, Německo, š.č , čistota 99% Methylparaben, Sigma-Aldrich GmbH, Německo, š.č.so , čistota 99% Ethylparaben, Sigma-Aldrich GmbH, Německo, š.č. SO , čistota 99% Ethylester kyseliny octové, p.a., Lachema, a.s. Neratovice, č.š , 33, čistota 99,7% Isopropylalkohol p.a., Lachema o.p. Brno, závod Neratovice, čistota 99,7% Kyselina fosforečná 85%, p.a. Merk GmbH, Německo Methanol Chromasolv, HPLC gradient grade, Sigma-Aldrich GmbH, Německo Tetrahydrofuran Chromasolv, HPLC gradient grade, Sigma-Aldrich GmbH, Německo Acetonitril Chromasolv, HPLC gradient grade, Sigma-Aldrich GmbH, Německo Ultračistá voda, čištěná systémem Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA)

25 4.3 Příprava vzorku Do centrifugační zkumavky objemu 50 ml bylo odváženo množství krému odpovídající 1 mg kyseliny sorbové (asi 0,5 g), bylo přidáno 20,00 ml roztoku inertního interního standardu propylparabenu ve směsi kyseliny fosforečné 0,085% a tetrahydrofuranu (20:80) (IS) o koncentraci c = 5 mg/100 ml a zkumavka byla umístěna na vodní lázeň zahřátou na 70 C po dobu 15 minut. Poté byla směs vložena po dobu 10 minut do ultrazvukové lázně. Po uplynutí této doby byla směs centrifugována při rychlosti 3000 otáček/min. Supernatant byl filtrován přes membránový filtr a dávkován autosamplerem na kolonu.

26 5. Výsledky a diskuse

27 Absorbance (AU) Vývoj metody optimalizace chromatografických podmínek Cílem procesu optimalizace je nalézt vhodné chromatografické podmínky pro provádění analýzy kyseliny sorbové v přípravku Lipolotio HBF, které umožňují validaci metody Vlnová délka detektoru Vhodná vlnová délka byla vybrána podle změřeného UV spektra roztoku kyseliny sorbové v methanolu. Koncentrace roztoku není známa, neboť šlo hlavně o zjištění absorpčních maxim a minim. Obr. 2: UV spektrum kyseliny sorbové Wavelength (nm) Kyselina sorbová má absorpční maximum při 253 nm a absorpční minimum při 210 nm, proto se detekce stanovení prováděla při 253 nm.

28 k. sorbova 1,38 propylparaben 3,47 mau ethylparaben 2, Optimalizace složení mobilní fáze a výběr vnitřního standardu Při hledání optimálního složení mobilní fáze a optimální analytické kolony bylo využito poznatků rešerše. V těchto metodikách byla užívána kolona RP C18 a mobilní fáze obsahující methanol. Jako výchozí složení mobilní fáze byla vybrána směs 0,085 % kyseliny fosforečné a methanolu v poměru 60 : 40. Z důvodu změny složení extrakční směsi se přešlo na mobilní fázi obsahující 0,085 % kyselinu fosforečnou a acetonitril v poměru 60 : 40, která zkrátila dobu analýzy a byla používána po zbytek měření. Jako vnitřní standard byl nejprve používán ethylparaben, který měl blízký retenční čas s kyselinou sorbovou a přitom bylo mezi nimi dostatečné rozlišení. Vzhledem k tomu, že chromatogram placeba obsahoval pík v oblasti retenčního času ethylparabenu, byl jako vhodný vnitřní standard zvolen propylparaben, u něhož k žádné interferenci nedocházelo. Obr. 3: Chromatogram kyseliny sorbové v MF 0,085 % H 3 PO 4 : ACN = 60 : 40, IS = EP a chromatogram placeba ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Minutes

29 k. sorbova 1,33 mau propylparaben 3,23 Obr. 4: Chromatogram kyseliny sorbové v MF 0,085 % H 3 PO 4 : ACN = 60 : 40, IS = PP a chromatogram placeba Minutes Rychlost průtoku mobilní fáze Podle rešerše byla zvolena rychlost průtoku 1,0 ml min. Ta se ukázala jako optimální, a proto byla udržována po celou dobu měření Souhrn optimálních chromatografických podmínek Detekce: UV 253 nm Složení mobilní fáze: 0,085 % kyselina fosforečná a acetonitril v poměru 60 : 40 Vnitřní standard: propylparaben Rychlost průtoku mobilní fáze: 1,0 ml min Kolona: ZORBAX Eclipse XDB C18; 75 mm x 4,6 mm, velikost částic 3,5 µm Dávkovaný objem: 5 µl Teplota: 25 C

30 Obr. 5: Ukázka měření a zpracovávání dat v programu LC Postrum Analysis

31 5.2 Vývoj metody izolace kyseliny sorbové z krému Při izolaci látek z krému se vychází ze zkušeností s touto operací na katedře analytické chemie. Nejdříve se k naváženým vzorkům ( asi 0,50000g ) přidalo 20,00 ml roztoku vnitřního standardu ethylparabenu v methanolu a 10 minut se prováděla sonifikace pomocí ultrazvuku. Poté se směs 15 minut centrifugovala při 3000 ot /min. Zároveň se celá procedura prováděla s placebem krémem bez kyseliny sorbové. Výtěžnost (recovery) vzorku byla v tomto případě výrazně pod akceptovatelnou normou ( 100 ± 5 % ): R = 52,17 %. Celá operace se zkoušela stejným postupem s acetonitrilem jako extrakčním činidlem, ale ani tentokrát se nedosáhlo vyšší výtěžnosti. Další pokusy spočívaly v použití extrakční směsi, která vždy obsahovala 0,085% kyselinu fosforečnou, s níž se postupně kombinoval methanol, acetonitril a další rozpouštědla. Postupně se měnily poměry jednotlivých složek směsi. Extrakce se ukázala jako velmi složitá, bylo vyzkoušeno mnoho extrakčních směsí, všechny jsou uvedeny spolu s podmínkami extrakce v tabulce 1. Z dosud vyzkoušených směsí dosáhla nejvyšší výtěžnosti 0,085 % kyselina fosforečná s acetonitrilem v poměru 50 : 50 ( R = 93,66 % ), kdy se osvědčilo použití vodní lázně, ale ani změnou extrakčních podmínek ( prodloužení doby sonifikace, zvýšení počtu otáček při centrifugaci ), se nedosáhlo požadované výtěžnosti. Nakonec byla použita kombinace 0,085 % kyseliny fosforečné a tetrahydrofuranu, která se také zkoušela v různých poměrech, z nichž optimálních výsledků dosáhla směs 0,085 % kyseliny fosforečné a tetrahydrofuranu v poměru 20 : 80, která byla před sonifikací a centrifugací umístěna na 15 minut na vodní lázeň o teplotě 70 C. Vzhledem k tomu, že při retenčním času ethylparabenu docházelo k interferenci se složkami placeba, byl pro další stanovení používán jako vnitřní standard propylparaben. Hodnota recovery vzrostla na 102,11 %, což odpovídá povolenému rozmezí, a proto se pro izolaci vzorků využíval poslední zmíněný postup. ZÁVĚR: Při přípravě vzorku se postupuje takto: K naváženému krému se přidá 20,00 ml roztoku propylparabenu v extrakční směsi 0,085 % kyseliny fosforečné a tetrahydrofuranu v poměru 20 : 80, směs se umístí na 15 minut na vodní lázeň a poté se ponoří na 10 minut do ultrazvukové lázně. Následně

32 se 15 minut centrifuguje při 3000 ot /min. Supernatant se přefiltruje přes membránový filtr a dávkuje autosamplerem na kolonu. Stanovení se provádí s mobilní fází 0,085 % kyselina fosforečná : acetonitril = 60 : 40.

33 Tab. 3: Přehled extrakčních směsí Extrakční směs Vnitřní standard Vodní lázeň 70 C Ultrazvuková lázeň Centrifugace 15min. při rychlosti: Výtěžnost v % MeOH EP - 10 min 3000 ot. / min 99,82 41,30 MeOH EP - 10 min 3000 ot. / min 55,23 35,69 65,60 ACN EP - 10 min 3000 ot. / min 44,46 77,95 67,41 H 3 PO 4 0,085% / MeOH 50:50 EP - 10 min 3000 ot. / min 81,12 75,14 37,52 H 3 PO 4 0,085% / MeOH 50:50 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 62,69 48,58 42,18 H 3 PO 4 0,085% / MeOH 70:30 EP - 10 min 3000 ot. / min 35,68 61,24 41,08 H 3 PO 4 0,085% / MeOH 70:30 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 47,97 65,09 H 3 PO 4 0,085% / MeOH 30:70 EP - 10 min 3000 ot. / min 85,74 68,16 45,83 H 3 PO 4 0,085% / MeOH 30:70 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 54,23 60,37 Citrátový pufr / MeOH 70:30 EP - 10 min 3000 ot. / min 42,03 32,25 69,58 H 3 PO 4 0,085% / ACN 70:30 EP - 10 min 3000 ot. / min 34,70 86,85 67,12 H 3 PO 4 0,085% / ACN 70:30 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 90,18 92,43 92,43 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP - 10 min 3000 ot. / min 92,69 66,61 53,44 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP - 10 min 3000 ot. / min 76,78 89,44 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP - 15 min 3000 ot. / min 42,89 92,18 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 15 min 10 min 3000 ot. / min 92,40 93,73 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 20 min 10 min 3000 ot. / min 91,49 91,97 91,95 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 30 min 10 min 3000 ot. / min 91,30 90,86 92,50 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 10 min 15 min 3000 ot. / min 85,79 89,81 69,63 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 15 min 10 min 3000 ot. / min 91,23 91,96 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 15 min 15 min 3000 ot. / min 91,51 92,57 H 3 PO 4 0,085% / ACN 60:40 EP 15 min 20 min 3000 ot. / min 92,44 92,62 H 3 PO 4 0,085% / ACN 55:45 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 92,62 90,97 H 3 PO 4 0,085% / ACN 50:50 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 93,42 94,44 93,11 H 3 PO 4 0,085% / ACN 50:50 EP 15 min* 10 min 6000 ot. / min 92,82 95,21 H 3 PO 4 0,085% / ACN 40:60 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 91,77 90,71 92,05 H 3 PO 4 0,085% / ACN 30:70 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 88,66 87,49 88,32 H 3 PO 4 0,085% / ACN 10:90 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 88,61 85,85 90,45 * vodní lázeň při 80 C

34 Extrakční směs Vnitřní standard Vodní lázeň 70 C Ultrazvuková lázeň Centrifugace 15min. při rychlosti: Výtěžnost v % H 3 PO 4 0,085% / ethylacetát / ACN 40:10:50 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 83,88 82,39 H 3 PO 4 0,085% / isopropylalkohol 50:50 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 58,68 62,07 H 3 PO 4 0,085% / isopropylalkohol 70:30 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 65,67 65,38 H 3 PO 4 0,085% / THF 70:30 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 115,45 116,95 H 3 PO 4 0,085% / THF 60:40 EP 15 min 10 min 3000 ot. / min 117,65 119,23 119,89 H 3 PO 4 0,085% / THF 55:45 EP 15 min 10 min 3000 ot. / min 113,05 114,57 112,95 H 3 PO 4 0,085% / THF 50:50 EP 15 min 10 min 6000 ot. / min 92,95 96,97 H 3 PO 4 0,085% / THF 50:50 EP 15 min 10 min 3000 ot. / min 116,97 117,20 H 3 PO 4 0,085% / THF 50:50 PP 15 min 10 min 3000 ot. / min 120,88 133,85 123,75 H 3 PO 4 0,085% / THF 30:70 PP 15 min 10 min 3000 ot. / min 103,71 107,85 101,27 H 3 PO 4 0,085% / THF 30:70 PP - 10 min 3000 ot. / min 109,86 108,46 106,83 H 3 PO 4 0,085% / THF 10:90 PP - 10 min 3000 ot. / min 104,89 104,27 104,75 H 3 PO 4 0,085% / THF 20:80 PP 15 min 10 min 3000 ot. / min 102,29 103,49 104,25 H 3 PO 4 0,085% / THF 20:80 PP - 10 min 3000 ot. / min 105,08 103,26 104,56 H 3 PO 4 0,085% / THF 20:80 PP 15 min 10 min 3000 ot. / min H 3 PO 4 0,085% / THF 20:80 PP - 10 min 3000 ot. / min Vysvětlivky ke zkratkám: MeOH methanol ACN acetonitril THF tetrahydrofuran EP ethylparaben PP propylparaben 97,73 102,73 113,18 103,98 103,05 103,19 103,23 105,14 103,45 102,52 104,91 108,53

35 5.3 Stanovení obsahu kyseliny sorbové v krému Připraví se roztoky standardů ve směsi kyseliny fosforečné 0,085% a tetrahydrofuranu (20:80) s obsahem 5mg/100 ml propylparabenu (IS) a 5mg/100ml kyseliny sorbové ze 2 samostatných navážek. Každý roztok se změří třikrát. Provedou se 2 nezávislé analýzy vzorku podle kompletního postupu uvedeném v kap Supernatant odpovídající příslušné navážce vzorku se změří třikrát. Výpočet obsahu kyseliny sorbové (%) se provede podle vzorce: c i = A V / A IS m S F 100 A S / A IS m V Z c i = obsah stanovené složky v % A V, A S = plocha píku vzorku, standardu A IS = plocha píku vnitřního standardu propylparabenu m V, m S = navážka vzorku, standardu v g F = faktor korekce na obsah referenční látky Z = faktor zředění ( Z = 5 )

36 5.4 Validace metody Test vhodnosti chromatografického systému Účinnost chromatografické kolony ( počet pater ) N Účinnost kolony byla testována pomocí roztoku standardů pro kyselinu sorbovou a propylparaben. Pro výpočet byly brány údaje získané jako průměr z deseti měření testu na opakovatelnost podle vzorce uvedeného v kap Tab. 4 název látky t R (min) W 0,05 (min) N kyselina sorbová 1,33 0, Účinnost kolony při měření kyseliny sorbové vyhovuje požadavku, že parametr N má být větší než Asymetrie chromatografických píků Hodnoty pro výpočet asymetrie chromatografických píků byly odečteny z měření roztoku standardů při zkoušce opakovatelnosti. Výpočet se prováděl s průměrem z deseti měření podle vzorce uvedeného v kap Tab. 5 název látky W 0,01 (min) f (min) asymetrie (T) kyselina sorbová 0,13 0,0464 1,40 Hodnota 1,40 vyhovuje požadavku, aby asymetrie píků T byla menší než 2, Rozlišení chromatografických píků R Rozlišení se určovalo z deseti chromatogramů získaných měřením roztoku standardů v testu na opakovatelnost. Výsledkem je průměrná hodnota z deseti měření. Při výpočtu se využil vzorec uvedený v kap

37 propylparaben mau 3,24 k. sorbova 1,33 Tab. 6 název látky kyselina sorbová - propylparaben 1,79 R i Hodnota rozlišení chromatografických píků 1,79 vyhovuje požadavku, že R ij > 1,5. Obr. 6: Chromatogam standardů: kyselina sorbová s vnitřním standardem propylparabenem ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Minutes Opakovatelnost analýzy Byl opakovaně dávkován roztok analyzované látky ve směsi 0,085 % kyseliny fosforečné a tetrahydrofuranu v poměru 20 : 80 o koncentraci: kyselina sorbová propylparaben 5,035 mg/100 ml 5,089 mg/100 ml Výsledky jsou získány z deseti nástřiků roztoku.

38 Tab. 7: kyselina sorbová - opakovatelnost Vzorek t R A 1 1, , , , , , , , , , n průměr 1, s ,37 s R (%) - 0,08 Při testování opakovatelnosti analýzy se při desetinásobném opakování nástřiku roztoku standardu pohybovala směrodatná odchylka s R ploch píků i retenčních časů pod 1%, což je vyhovující Validace analytické metody Přesnost Byly analyzovány roztoky vzorku Lipolotio HBF, š. č , vzorek č. VV 113/05, které byly paralelně připravené samostatným postupem uvedeným v kap Plochy píku jsou přepočtené na navážku 0,5000 g přípravku Lipolotio HBF.

39 Tab. 8: kyselina sorbová - přesnost Roztok č. Plocha píku (m=0,5000 g) n 6 průměr s s R (%) 2,02 Požadavek, aby relativní směrodatná odchylka s R (%) byla menší než 5 %, je splněn Linearita Pro hodnocení linearity byla využita metoda vnitřního standardu. Jako vnitřní standard (IS) byl použit propylparaben. Bylo připraveno 6 kalibračních roztoků pracovního standardu kyseliny sorbové ( koncentrace jsou uvedeny v tabulce ), přídavek IS byl 5mg/100 ml. Plocha píku pro každou koncentraci je průměrem ze 3 měření a pro výpočty byl brán průměr z těchto tří hodnot. Závislost A VZOREK /A IS kalibračních roztoků na jejich koncentraci byla vyhodnocena metodou lineární regrese.

40 Obr. 7: Testování linearity kyseliny sorbové c(mg/100ml) poměr A 0,08 0,1937 0,1 0,243 0,15 0,357 0,2 0,4636 0,25 0,5911 0,3 0,7003 Regresní funkce : y = k x + q počet bodů n = 6 počet stupňů volnosti: 4 Parametry regresní přímky a odhady jejich směrodatných odchylek směrnice k = 2,302 ± 0,024 absolutní člen q = 0,0105 ± 0,0048 koeficient korelace R = 0,99978 reziduální odchylka s rez = 0,00468 hodnota F-statistiky F = 8,96E+3 Závislost y na x byla prokázána se spolehlivostí 99,9 %. U analyzované látky požadavek na linearitu korelační koeficient r > 0,9990 vyhovuje ( r = 0,99978 ). Kalibrační křivka kyseliny sorbové je lineární v rozsahu 0,08 0,3 mg/100 ml.

41 Správnost Byl šestkrát změřen roztok standardů: c 0 = 5,035 mg/100 ml ( kyselina sorbová ) a c IS = 5,089 mg/100 ml ( propylparaben ). Zároveň byly analyzovány modelové vzorky ( placebo + kyselina sorbová ), které byly paralelně připravené samostatným postupem uvedeným v kap. 4.3 s přídavkem roztoku standardu o koncentraci c 0. Výtěžnost (recovery ) R i byla vypočtena podle vzorce: R i (%) = 100. c i /c 0 c 0 = koncentrace vložená c i = koncentrace stanovená HPLC Tab. 9 Vzorek č. c 0 (mg/100ml) A i c i (mg/100ml) R i (%) , , ,975 98, , ,68 4 5,035 mg ,950 98,52 5 odpovídá A 0 = ,800 95, ,025 99,57 n = 6 průměr = 98,91 s = 1,90 s R = 1,92 % Výtěžnost R i musí být v rozmezí 100 ± 5 %, což je splněno. Relativní směrodatná odchylka s R musí být nižší než limit 5 %, čemuž měření dané látky vyhovuje.

42 -100 1,33 0 mau kyselina sorbová 3,24 propylparaben mau Selektivita Separace standardu kyseliny sorbové (c = 5,035 mg/100 ml) je dokumentována na chromatogramu standardních látek (obrázek 4). Jako vnitřní standard je použit propylparaben (c = 5,089 mg/100 ml). Placebo a přípravek Lipolotio HBF byly zpracovány dle postupu Na obrázku 5 je proložen chromatogram přípravku Lipolotio HBF (horní křivka) s chromatogramem placeba (spodní křivka) a je vidět, že v retenčních časech odpovídajících sledovaným látkám nejsou přítomny žádné píky interferujících látek. Zároveň je na chromatogramu přípravku Lipolotio HBF patrná dokonalá separace sledované látky i vnitřního standardu. Předložená HPLC metoda umožňuje selektivně změřit plochu píku odpovídající konzervační látce kyselině sorbové v přípravku Lipolotio HBF. Obr. 8: Chromatogam standardů: Kyselina sorbová s vnitřním standardem propylparabenem Detector A (253nm) st-sst SST-Rep10 Retention Time Name ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Minutes -100

43 1,33 0 kyselina sorbová mau ,24 propylparaben mau Obr. 9: Chromatogram placeba (spodní křivka) + chromatogram přípravku Lipolotio HBF s přídavkem vnitřního standardu propylpyrabenu (horní křivka) Detector A (253nm) st-sst SST-Rep10 Retention Time Name Detector A (253nm) placebo placebo001-rep ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Minutes Robustnost Testování míry vlivu proměnných experimentálních podmínek na stanovení obsahu analytů bylo testováno u roztoku o složení: kyselina sorbová ( c = 5, 035 mg/100 ml ) a propylparaben (c = 5,089 mg/100 ml ). 1.) Vliv složení mobilní fáze bylo testováno při poměru 0,085 % kyselina fosforečná ACN = 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50. a )Vliv na plochu chromatografického píku A R = 100. A i /A 60:40 A i plocha píku Byly získány výsledky uvedené v tabulce 8. Relativní plocha píků vztažená na plochu píku při optimálním složení mobilní fáze se pohybovala v rozmezí 97,23 % až 103,37 %, a proto v uvedeném rozmezí změny v poměru složek mobilní fáze neovlivňují stanovení kyseliny sorbové.

44 Tab. 10: Vliv složení mobilní fáze na plochu píku kyseliny sorbové 0,085%H 3 PO 4 : ACN A i A R 70: ,23 65: ,82 60: ,00 55: ,83 50: ,37 b) Vliv na retenční čas V celém testovacím rozmezí dochází k dokonalé separaci všech složek, ale změna složení mobilní fáze ovlivňuje dobu trvání analýzy. Z tohoto hlediska je nejvhodnější použití mobilní fáze 0,085 % kyselina fosforečná : acetonitril = 60 : 40. Obrázky 10 a 11 ukazují krajní hranice testovacího rozmezí. Na obr. 10 je znázorněn chromatogram při poměru 0,085 % kyselina fosforečná : acetonitril = 70 : 30, kdy separace kyseliny sorbové a vnitřního standardu propylparabenu je až k základní linii, pouze dochází k prodloužení analýzy. Při použití mobilní fáze 0,085 % kyselina fosforečná : acetonitril = 50 : 50 ( viz obr. 11 ) dochází v retenčních časech sledovaných látek k interferenci se složkami placeba, proto je toto složení mobilní fáze pro analýzu nevhodné. Tab. 11: Vliv složení mobilní fáze na retenční čas 0,085%H 3 PO 4 : ACN Kyselina sorbová t R (min) 70:30 2,067 65:35 1,617 60:40 1,350 55:45 1,192 50:50 1,072

45 kyselina sorbová mau 1,08 IS-propylparaben 1,89 IS-propylparaben 8,48 mau kyselina sorbová 2,07 Obr Minutes Obr ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Minutes

46 2.) Stabilita roztoku standardu kyseliny sorbové o koncentraci c = 5,035 mg/100 ml byla testována za uchovávání: A) Za snížené teploty ( 4 C ), chráněné před světlem B) Za laboratorní teploty a na světle Výsledky uspořádané v tabulce 8 jsou průměrem ze tří měření. Výpočet odchylky S T (%) se prováděl podle vzorce: S T (%) = 100. A i A 0 / A 0 t = čas od přípravy roztoku vzorku A = plocha píku Tab. 10: Stabilita kyseliny sorbové v roztoku v závislosti na době a způsobu uchovávání t A ( 4 C ) S T (%) A ( 20 C ) S T (%) , , ,7 0, ,7 0, ,7 0, ,3 0, ,3 0, ,0 0,09 Z tabulky 10 vyplývá, že roztok standardu kyseliny sorbové ve směsi 0,085 % kyseliny fosforečné a tetrahydrofuranu ( 20:80 ) je možné používat při uchovávání za snížené teploty nebo laboratorní teploty po dobu 72 hodin od jeho přípravy, protože je splněn požadavek S T (%) < 1 %.

47 Intermediární přesnost Stanovení obsahu kyseliny sorbové v přípravku Lipolotio HBF š. č , vzorek č. VV 113/05 bylo provedeno v jiný den a na jiném přístroji. Vzorek byl připraven paralelně 6 dle postupu v kap Nalezené výsledky byly porovnány s výsledky pro přesnost. Tab. 11 č. nalezený obsah v přípravku [%] Kyselina sorbová Shimadzu LC 2010 Shimadzu LC 10A 1 0,200 0, ,198 0, ,201 0, ,198 0, ,199 0, ,200 0,198 n 6 6 x 0,199 0,200 SD 0,001 0,001 RSD (%) 0,50 0,50 Požadavek na velikost relativní směrodatné odchylky ( s R 2,0% ) je splněn. Statistické testování: Byla zjišťována míra shody výsledků metodou porovnání dvou výběrů v programu QC.Expert 2.5. Test shody rozptylů Poměr rozptylů : 1, Počet stupňů volnosti : 5 Kritická hodnota : 5, Závěr : Rozptyly jsou SHODNÉ Pravděpodobnost : 0, Test shody průměrů pro SHODNÉ rozptyly t-statistika : 0, Počet stupňů volnosti : 10 Kritická hodnota : 2, Závěr : Průměry jsou SHODNÉ Pravděpodobnost : 0, Požadavek: statisticky nevýznamný rozdíl středních hodnot VYHOVUJE

48 6. Závěr

49 Byla provedena rešerše na stanovení obsahu kyseliny sorbové metodou HPLC v topických přípravcích. Byla vypracována a validována metoda pro stanovení kyseliny sorbové pomocí HPLC v přípravku Lipolotio HBF. Jako vhodná vlnová délka pro UV detekci byla určena hodnota 253 nm. Jako vhodná mobilní fáze byla vybrána směs 0,085% kyseliny fosforečné a acetonitrilu v poměru 60 : 40. Jako optimální rychlost průtoku mobilní fáze byla zvolena hodnota 1,0 ml/min. Vhodným vnitřním standardem je propylparaben. Bylo provedeno testování vhodnosti chromatografického systému. Účinnost kolony vyjádřená jako počet teoretických pater N byla Asymetrie chromatografických píků hodnocená faktorem T byla 1,40. Rozlišení píků bylo 1,79. Opakovatelnost analýzy vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka s R byla 0,08 %. Přesnost analýzy vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka s R byla 2,02 %. Linearita byla testována v rozmezí % předpokládaného obsahu kyseliny sorbové v krému. Korelační koeficient byl > 0,9990. Správnost stanovení se posuzovala pomocí výtěžnosti ( recovery ) R. Její hodnoty se pohybovaly v rozsahu od 95,47 do 100,68 %. Selektivita byla prokázána separací všech píků na základní linii a záporným výsledkem analýzy placeba, jehož příprava se prováděla stejným způsobem jako u vzorku, pouze k extrakci se použila směs 0,085 % kyseliny fosforečné a tetrahydrofuranu (20:80) bez vnitřního standardu.

50 Při separaci píků na základní linii není velikost jejich ploch ovlivněna změnami složení mobilní fáze. Zvýšením obsahu acetonitrilu v mobilní fázi může docházet k interferenci sledovaných látek se složkami placeba. Roztok standardu kyseliny sorbové je stabilní 72 hodin. Metoda bude používána při výstupní kontrole a hodnocení homogenity a stability léčivého přípravku Lipolotio HBF.

51 7. Použité zdroje

52

53

54