Zhášení tripletních stavů chlorofylů karotenoidy v tylakoidních membránách

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE Petra Vahalová Zhášení tripletních stavů chlorofylů karotenoidy v tylakoidních membránách Katedra chemické fyziky a optiky Vedoucí diplomové práce: Studijní program: Studijní obor: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D. Fyzika Biofyzika a chemická fyzika Praha 2015

2 Ráda bych poděkovala vedoucímu mé diplomové práce doc. RNDr. Jakubu Pšenčíkovi, Ph.D. a Mgr. Petro Khoroshyy, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady, ochotu, trpělivost a přátelský přístup. Dále bych chtěla poděkovat Dr. Juan B. Arellano za poskytnutí vzorků a rady při interpretaci výsledků a Mgr. Janu Alsterovi, Ph.D. za poskytnutí programu ke zpracování dat a pomoc při řešení technických problémů. Na závěr bych také ráda poděkovala své rodině a přátelům za podporu.

3 Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracoval(a) samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů, literatury a dalších odborných zdrojů. Beru na vědomí, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorského zákona v platném znění, zejména skutečnost, že Univerzita Karlova v Praze má právo na uzavření licenční smlouvy o užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. V... dne... Podpis autora

4 Název práce: Zhášení tripletních stavů chlorofylů karotenoidy v tylakoidních membránách Autor: Petra Vahalová Katedra: Katedra chemické fyziky a optiky Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D., Katedra chemické fyziky a optiky Abstrakt: Mezi jeden z nejdůležitějších biologických procesů, zajímavých i z fyzikálního hlediska, patří fotosyntéza. Fotosyntetický aparát musí být chráněn před vznikem reaktivního singletního kyslíku a tuto funkci zajišťují karotenoidy. Hlavním cílem této práce bylo využít metody optické spektroskopie ke studiu důležitosti nepolárních karotenoidů (tzv. karotenů) pro tuto ochrannou funkci. Studovány byly thylakoidní membrány špenátu a z části vzorků byly karoteny vymyty hexanem. Kapalinová chromatografie ukázala, že se podařilo vymýt zhruba 90 % karotenů. Zbývající karoteny jsou nejspíše lokalizovány v okolí reakčních center, kde jsou pro hexan nepřístupné a zároveň z hlediska ochrany nejdůležitější. Vysoká účinnost zhášení tripletních stavů chlorofylů totiž zůstala po vymytí nezměněna. Zároveň byly pozorovány změny v optických spektrech, které zřejmě souvisí se strukturními změnami způsobenými vymytím karotenů z vnějších částí komplexů. Jejich vymytí pravděpodobně vede k funkčnímu oddělení vnějších světlosběrných částí. To vyplývá ze srovnání s experimenty s detergentem dodecyl-maltosidem, který při vyšší koncentraci způsobuje podobné změny v transientních spektrech jako vymytí karotenů. Klíčová slova: triplety chlorofylů, ochranná role karotenoidů, n-dodecyl-β,dmaltosid Title: Quenching of chlorophyll triplet states by carotenoids in thylakoid membranes Author: Petra Vahalová Department: Department of Chemical Physics and Optics Supervisor: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D., Department of Chemical Physics and Optics Abstract: Photosynthesis is one of the most important biological processes. The photosynthetic apparatus is protected against formation of reactive singlet oxygen by carotenoids. In this work, thylakoid membranes from spinach were studied, and the main aim was to explore the effect of a partial carotenoid removal on the protective function. Carotenes, which are nonpolar carotenoids, were removed from a part of the sample by hexane. About 90 % of carotenes were removed, as revealed by liquid chromatography. However, the high efficiency of chlorophyll triplet state quenching was not affected by the carotene removal. Therefore, it was concluded that the remaining carotenes are probably localized around reaction centres, where they are not accessible to hexane and where their protective function is the most important. At the same time, changes in optical spectra were observed, which were ascribed to structural modifications caused by the carotene removal from the outer parts of the complexes. The carotenoids removal probably caused detachment of outer light-harvesting complexes. This interpretation is supported by the fact that similar changes were observed in experiments with a detergent dodecyl maltoside. Keywords: chlorophyll triplets, protective role of carotenoids, n-dodecyl-β,dmaltoside

5 Obsah Předmluva 2 1 Teoretický úvod Fotosyntéza Fotosystémy a světlosběrné antény Pigmenty Singletní a tripletní stav molekuly Absorpční spektroskopie Chromatografie Použitý materiál a metody Materiál Vzorky Pufry n-dodecyl-β-d-maltosid (DM) Dithioničitan sodný (DT) Enzymy odstraňující kyslík ze vzorku Příprava vzorků Měřicí přístroje Absorpční spektroskopie Chromatografie Software Výsledky a diskuze Stacionární absorpční spektra HPLC Časově rozlišená absorpční spektroskopie Testovací měření Aerobní podmínky, 0,1 % DM Vliv koncentrace DM Redukce pomocí DT Anaerobní podmínky Závěr 49 Seznam použité literatury 50 Seznam použitých zkratek 55 1

6 Předmluva Člověk byl, je a bude tvor zvídavý. S nadšením prozkoumává nové a neprobádané oblasti, snaží se detailně porozumět procesům odehrávajícím se v jeho okolí i v něm samém a získané vědomosti zkouší využít ku svému prospěchu. Inspirací při vývoji nových technologií a postupů mu jsou i nejdůležitější biologické procesy odehrávající se na planetě Zemi fotosyntéza a buněčné dýchání. Pojmem fotosyntéza označujeme proces, během nějž je energie absorbovaného slunečního záření přeměněna na energii chemickou, která může být využita k pohánění buněčných procesů. Vedlejším produktem oxygenní fotosyntézy, vyskytující se u většiny fotosyntetických organismů, je kyslík, umožňující život v dnes známé podobě. Z fyzikálního hlediska jsou zajímavé především počáteční fáze fotosyntézy, při nichž lze studovat přenosy a přeměny energie, přenos elektronu v rámci fotosyntetického aparátu či projevy mezimolekulárních interakcí. Nedílnou součástí fotosyntetického aparátu, nacházejícího se v thylakoidní membráně, jsou různé druhy pigmentů. Mezi nejdůležitější patří chlorofyly, které mimo jiné zajišťují samotnou přeměnu sluneční energie na energii chemickou, a karotenoidy, jejichž nejvýznamnější rolí je ochrana fotosyntetického aparátu před vysoce reaktivním singletním kyslíkem. Nepolární karotenoidy, tzv. karoteny, lze z fotosyntetického aparátu odstranit pomocí nepolárního rozpouštědla. Hlavním cílem této práce je studium vlivu vymytí karotenů z thylakoidních membrán špenátu na ochrannou funkci karotenoidů spočívající ve zhášení tripletních stavů chlorofylů, z nichž by mohl být populován nežádoucí, velmi reaktivní singletní kyslík. Dále jsme také zkoumali změny ve vzorku způsobené přidáním detergentu dodecyl-maltosidu o různé finální koncentraci. 2

7 1. Teoretický úvod 1.1 Fotosyntéza Pojmem fotosyntéza označujeme proces, při kterém dochází k přeměně zachycené energie slunečního záření na energii chemickou, která je uložena v organismu a následně použita k pohánění buněčných procesů [1]. Fotosyntetický aparát je u eukaryotických organismů uložen ve speciálních buněčných organelách s dvojitou membránou a vlastní DNA (deoxyribonukleová kyselina), tzv. chloroplastech (obr. 1.1). Vnitřní membrána ohraničuje prostor nazývaný stroma, který je vyplněn cytoplazmě podobnou tekutinou obsahující velké množství rozpuštěných enzymů, vlastní chloroplastovou DNA, RNA (ribonukleová kyselina) a ribozomy [3]. Součástí stromatu jsou též speciální membránové struktury thylakoidy, které se shlukují do gran, navzájem propojených intergranálními (stromálními) thylakoidy, též nazývanými lamely. Vnitřní prostor thylakoidů se nazývá lumen. V thylakoidní membráně se nachází pigment-proteinové komplexy fotosystém I a II (PSI, resp. PSII), cytochromové komplexy, pohyblivé přenašeče elektronů a ATP syntáza (ATP = adenosintrifosfát) [4]. Hlavní funkční jednotkou fotosyntetického aparátu je fotosystém, který se sestává z reakčního centra a komplexu světlosběrných antén (1.2). V reakčním centru se odehrává samotná přeměna forem energie, zatímco antény zvyšují pravděpodobnost zachycení fotonu. Obrázek 1.1: Struktura chloroplastu [2]. Proces přeměny energie lze rozdělit do čtyř fází: (1) absorpce světelného záření a přenos excitační energie v anténním systému k reakčnímu centru, (2) separace náboje a primární přenos elektronu v reakčním centru, (3) stabilizace rozdělených nábojů pomocí sekundárních reakcí a (4) syntéza a export stabilních produktů z chloroplastu [1]. 3

8 Obrázek 1.2: Schéma fotosystému tvořeného reakčním centrem a světlosběrným komplexem [5]. Šipkami je naznačena absorpce světla, přenos excitační energie mezi molekulami pigmentů světlosběrného komplexu do reakčního centra na speciální pár molekul pigmentu chlorofylu a a následný přenos elektronu na primární elektronový akceptor. První tři fáze se označují jako světelná fáze fotosyntézy a probíhají v thylakoidní membráně. Pigment světlosběrného komplexu zachytí foton, přičemž přijatá energie je využita k excitaci pigmentu. Excitační energie je dále přenášena anténou směrem k reakčnímu centru, kde je excitován zvláštní pár chlorofylů, což je spojeno se silným poklesem jeho oxidačně-redukčního potenciálu a následnou separací nábojů. Tato reakce je následována rychlým přenosem elektronu přes několik akceptorů až na finální akceptor v podobně chinonového přenašeče u fotosystému II (PSII) nebo v případě fotosystému I (PSI) na komplex železa vázaného sírou, z nějž je následně přenesen na periferní protein ferredoxin, kde je využit k redukci NADP+ (nikotinamidadenindinukleotidfosfát) na NADPH1. Rychlý přenos elektronu na primární akceptor minimalizuje konkurenční rekombinační proces a vede ke stabilizaci systému pomocí prostorového oddělení oxidované a redukované formy na opačných stranách thylakoidní membrány. Kation chlorofylu v reakčním centru PSII je redukován elektronem pocházejícím z komplexu oxidujícího vodu nebo z pohyblivého přenašeče plastocyaninu u PSI. Vedlejším produktem fotolýzy vody 2H2 O O2 + 4H+ + 4e je molekulární kyslík, který se uvolňuje do atmosféry. Vzniklé protony (H+ ) spolu s dalšími protony přenesenými v průběhu transportu elektronů membránou ze stromatu do lumenu zapříčiňují vznik protonového gradientu, který je následně využit k tvorbě makroergní sloučeniny2 adenosintrifosfátu (ATP). Poslední, čtvrtá fáze fotosyntézy, též nazývaná temnostní fáze, se odehrává mimo thylakoidní 2 Makroergní sloučeniny obsahují vazby, při jejichž hydrolytickém štěpení se uvolňuje velké množství energie [6]. 4

9 membránu, ve stromatu, kde se za pomocí produktů předchozích fází (NADPH a ATP) redukuje oxid uhličitý na organické sloučeniny sacharidového typu [1]. Obrázek 1.3: Schéma přenosu elektronu thylakoidní membránou z vody na fotosystém II (PSII), plastochinon (PQ), cytochrom b 6 /f (cyt b 6 /f), plastocyanin (PC), fotosystém I (PSI) a ferredoxin. ATP syntáza využívá protonový gradient k syntéze ATP [7]. Obrázek 1.4: Model části thylakoidní membrány vyšších rostlin demonstrující zastoupení jednotlivých pigment-proteinových komplexů v různých částech thylakoidů. V granální části převažuje PSII (tmavě zeleně), kde se vyskytuje ve formě monomeru či dimerického superkomplexu s LHCII, samostatné trimery LHCII jsou znázorněny světle zeleně. V lamelách je naopak hojněji zastoupen PSI (modře). Oranžově je označen cyt b 6 /f, červeně ATP syntáza a světle modře kyselý lumen. Za určitých fyziologických podmínek může být počet cyt b 6 /f v granech výrazně vyšší než je ukázáno na obrázku [8]. Na obrázku 1.3 můžeme vidět schéma přenosu elektronu thylakoidní membránou přes jednotlivé pigment-proteinové komplexy (PSI, cytochrom b 6 /f (cyt b 6 /f), PSII) a za pomoci pohyblivých přenašečů (plastochinon (PQ), plastocyanin (PC)). 5

10 Vzniklý protonový gradient je využit ATP syntázou k tvorbě ATP. Jsou naznačeny i jednotlivé části komplexů, akceptory v reakčních centrech fotosystémů a také vnější světlosběrné antény (LHC). I když je funkce jednotlivých komplexů spřažena, není jejich výskyt v jednotlivých částech thylakoidů rovnoměrný (obr. 1.4). V granální části se nachází převážně PSII (tmavě zelená), zatímco v lamelách je hojněji zastoupen PSI (modrá). 1.2 Fotosystémy a světlosběrné antény Nejvýznamnějšími pigment-proteinovými komplexy fotosyntetického aparátu jsou fotosystémy (obr. 1.2), komplexy reakčních center obklopených systémem světlosběrných antén, které zvyšují množství zachycených fotonů, a tak i účinnost fotosyntetického aparátu. Bez antén by byly reakční centra a elektronové transportní řetězce po většinu času nevyužity [9]. Aby se excitační energie přesouvala směrem k reakčnímu centru a neputovala náhodně po anténě, jsou pigmenty ve světlosběrném komplexu většinou uspořádány tak, že směrem k reakčnímu centru dochází k prodlužování vlnových délek, na nichž pigmenty absorbují. Přenos excitační energie je tak spojen s disipací části energie ve formě tepla, což komplikuje zpětný přenos energie. [1] Kromě absorpce fotonů a přenosu excitační energie do reakčního centra plní pigmenty světlosběrných antén také ochrannou a strukturní funkci, kterou zastávají především karotenoidy. Anténní systémy může rozdělit podle umístění ve fotosyntetickém aparátu na vnitřní a vnější. Vnitřní antény jsou těsně spojeny s reakčním centrem, prostupují membránou a jejich stechiometrický poměr k reakčnímu centru je neměnný. Vnější světlosběrné komplexy se nacházejí na jedné straně membrány, k fotosystému jsou připojeny prostřednictvím vnitřních antén, jejich počet se může měnit v závislosti na míře osvětlení a v některých případech se mohou i přemisťovat (např. LHCII mezi PSII a PSI) [9, 1]. 1.3 Pigmenty Pojmem pigment (barvivo) označujeme molekulu, která v důsledku selektivní absorpce mění spektrum vlnových délek obsažených v odraženém nebo prošlém světle [10]. Takováto látka se vyznačuje strukturou se systémem konjugovaných dvojných vazeb, jenž umožňuje volný pohyb π-elektronů. Delokalizace π-elektronů vede ke snížení celkové energie molekuly, čímž dochází k její stabilizaci. Zároveň se také posouvají energetické hladiny jednotlivých stavů. Pokles energie excitovaných stavů umožňuje molekule absorbovat i záření o delších vlnových délkách, což vede k posunu absorpce do viditelné části spektra [11]. Ve fotosyntetickém aparátu mají pigmenty tři základní role: 1. Zachycení fotonu a přenos excitace světlosběrnou anténou k reakčnímu centru. Pigmentové zastoupení komplexu může být velmi rozmanité, ve většině případů se však jedná o zástupce (bakterio)chlorofylů, karotenoidů či fykobilinů [9]. 6

11 2. Vlastní přeměna energie slunečního záření na energii chemickou. Excitační energie je v reakčním centru využita molekulami (bakterio)chlorofylů k separaci náboje. Uvolněný elektron je velmi rychle přenesen na primární akceptor, přičemž prostorové oddělení nábojů vede ke stabilizaci systému. 3. Ochrana fotosyntetického aparátu karotenoidy při vysokých ozářenostech a před nežádoucí excitací tripletních stavů chlorofylů nebo v podobě přímého zhášení velmi reaktivního singletního kyslíku. Nejvýznamnějšími fotosyntetickými pigmenty vyšších rostlin jsou chlorofyly. Jejich chemická struktura je odvozena od molekuly porfinu (obr. 1.5). Uprostřed modifikovaného makrocyklu se nachází iont hořčíku, koordinačně vázaný ke čtyřem dusíkům (obr. 1.6). Většina chlorofylů se řadí mezi chloriny kvůli redukovanému kruhu D, na nějž je navázán fytolový ocas, jehož základ je tvořený ze čtyř izoprenových jednotek (obr. 1.7). V dnešní době je známo šest různých typů chlorofylů (a f) [13]. Obrázek 1.5: Struktura porfinu [12]. Obrázek 1.6: Strukturní vzorec chlorofylu a, b, d [13]. 7

12 Obrázek 1.7: Izoprenová jednotka [14]. Absorpční spektra chlorofylů se vyznačují především dvěma výraznými pásy v modré (Soretův pás) a v červené (Q y pás) oblasti spektra (obr. 1.8). Jejich pozice a tvar závisí na typu chlorofylu a také na použitém rozpouštědle. Charakteristická zelená barva chlorofylů je způsobena jejich téměř nulovou absorpcí vlnových délek příslušející zelené části spektra. Při ztrátě centrálního hořčíkového iontu, k němuž dochází např. v kyselém prostředí, se z chlorofylu stává feofytin. Obrázek 1.8: Normovaná absorpční spektra chlorofylu a a b ve směsi metanolu s hexanem v poměru 4:1. Další důležitou skupinou pigmentů, které se vyskytují i v nefotosyntetizujících organismech, jsou karotenoidy. Řadí se mezi tetraterpeny, jejichž uhlíková kostra je tvořena 8 izoprenovými jednotkami [9]. Čistě uhlovodíkové formy karotenoidů se nazývají karoteny, jejich kyslíkaté deriváty pak xantofyly. Karoteny jsou tedy na rozdíl od xantofylů a chlorofylů čistě nepolární látky, budou se tedy dobře rozpouštět v nepolárních rozpouštědlech (např. v hexanu). Této jejich vlastnosti lze využít k jejich odstranění z komplexnějších vzorků, přičemž ostatní (více polární) pigmenty zůstanou nedotčeny. Mezi nejznámější zástupce karotenů patří β-karoten (obr. 1.9), který se kromě fotosyntetického aparátu vyskytuje také v mnoha druzích ovoce a zeleniny. Absorpční spektra karotenoidů se vyznačují většinou třemi maximy v oblasti nm [16]. Ve fotosyntéze hrají tyto pigmenty hned několik rolí. Spolu s dalšími pigmenty se podílejí na zachycení fotonů a následném přenosu excitační energie do reakčního centra. Pomáhají udržovat strukturní integritu a pevnost vnějších i vnitřních světlosběrných antén [16]. Za jejich nejvýznamnější funkci je však považována 8

13 ochrana fotosyntetického aparátu před vysoce reaktivním singletním kyslíkem, ať už jeho přímým zhášením nebo zhášením tripletních stavů chlorofylů. V rámci tzv. xantofylového cyklu se také podílejí na regulaci množství energie přicházející do reakčního centra při nadměrném ozáření [1]. Obrázek 1.9: Strukturní vzorec β-karotenu [15]. V periferních anténách sinic, ruduch a glaukofyt, tzv. fykobilizomech, se vyskytují také fykobiliny [17]. Jedná se o lineární tetrapyroly, které se kovalentně váží na proteiny, což výrazně ovlivňuje jejich spektrální vlastnosti [9]. Absorpční spektra protein-pigmentových komplexů fykoerythrinu a fykocyaninu jsou spolu se spektry chlorofylu a a b a karotenoidů znázorněny na obr Struktura fykocyanobilinu, pigmentu ve fykocyaninu, je ukázána na obr Obrázek 1.10: Absorpční spektra fykoerythrinu a fykocyaninu spolu se spektry chlorofylu a, b a karotenoidů [18]. Obrázek 1.11: Struktura pigmentu fykocyanobilinu [19]. 9

14 Zastoupení pigmentů v RC a anténách vyšších rostlin Reakční centrum PS II se skládá z více než 25 odlišných proteinových podjednotek. Jádro reakčního centra tvoří heterodimer proteinů D 1 a D 2, které váží všechny kofaktory reakčního centra 6 chlorofylů a, 2 feofytiny a, 2 β-karoteny, 2 plastochinony a 1 železnatý iont [1]. Proteiny přidružené k reakčnímu centru z D 1 strany (CP43) a z D 2 strany (CP47) tvoří vnitřní antény PSII. Jejich označení vzniklo na základě jejich zdánlivé hmotnosti z SDS-PAGE, tj. elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS). Každý protein vnitřní antény je tvořen šesti transmembránovými helixy uspořádanými do tří skupin po dvou [1]. Množství pigmentů v jednotlivých anténách stanovené Alfonso a kol. [20] se pohybuje okolo chlorofylů a a 5 β-karotenů v CP43 a molekul chlorofylu a a 3 4 β-karotenů v CP47 v závislosti na použité metodě. Součástí PSII je také komplex oxidující vodu obsahující klastr čtyř manganových atomů. Vnější antény PSII jsou tvořeny pohyblivým světlosběrným komplexem LHCII a spojovacími anténními proteiny CP24, CP26, CP29. Monomer LHCII je tvořen třemi transmembránovými a dvěma menšími amfipatickými α-šroubovicemi [21] vážícími 8 molekul chlorofylu a, 6 chlorofylu b, 2 luteiny (organizované do tvaru písmene X a mající také strukturní roli [1]), 1 neoxantin a 1 violaxantin [22, 23, 24]. V thylakoidech se přirozeně vyskytuje ve formě trimerů. Vedlejší vnější antény CP24, CP26, CP29 se vyskytují ve formě monomerů a mají podobné složení pigmentů jako LHCII. Obsahují podobný počet molekul chlorofylu (9 13), avšak s odlišným poměrem chlorofylu a a b, a 2 xantofyly [25, 26]. Například anténa CP24 obsahuje 5 molekul chlorofylu a, 5 chlorofylu b, 2 luteiny, nebo 1 lutein a 1 další xantofyl (violaxantin, zeaxantin) [27]. PSI je tvořen 12 proteinovými podjednotkami vážícími přibližně 100 molekul chlorofylů a a β-karotenů [1, 28]. Jádro reakčního centra je tvořeno dvěma podjednotkami (PsaA a PsaB), které váží kofaktory elektronového přenosu 2 molekuly chlorofylu a tvořící speciální pár (P700), 4 další molekuly chlorofylu a, 2 fylochinony a 1 Fe-S klastr (F x ). Zbylé dva Fe-S klastry (F A, F B ), podílející se na transportu elektronu, se nacházejí na menší proteinové podjednotce (PsaC) [1, 28]. Velké množství pigmentů přímo navázaných na dvě hlavní podjednotky reakčního centra a zároveň na další proteiny tak slouží jako anténa [29]. Vnější světlosběrný komplex LHCI je tvořen 4 různými proteinovými podjednotkami vážícími především chlorofyl a, menší množství chlorofylu b a různé xantofyly, mezi nimiž hraje nejvýznamnější roli lutein [30]. Na jedno reakční centrum často připadá několik druhů světlosběrných antén. Schéma uspořádání superkomplexů PSII-LHCII a PSI-LHCI v zelených řasách a cévnatých rostlinách je ukázáno na obr

15 Obrázek 1.12: Schéma organizace superkomplexů PSII-LHCII a PSI-LHCI v zelených řasách a cévnatých rostlinách. Pohled shora na superkomplexy PSII-LHCII (A) a PSI-LHCI (B) řasy C. reinhardtii. Ve spodní části obrázku se pak nachází schéma superkomplexu PSI-LHCII ze špenátu (C) a PSI-LHCI superkomplexu získaného z hrachu (D) [31]. 1.4 Singletní a tripletní stav molekuly Elektrony v základním stavu molekuly obvykle obsazují orbitaly s nejnižší energií. V každém orbitalu se mohou nacházet maximálně dva elektrony, které musí mít dle Pauliho vylučovacího principu 3 opačný spin. Jelikož tohoto stavu lze docílit pouze jediným způsobem 4, označujeme tento stav molekuly jako singletní. Spiny se v daném případě navzájem kompenzují a celkové spinové číslo molekuly S je rovno 0 (v případě sudého počtu elektronů). Dodáme-li do systému určité množství energie, může dojít k excitaci jednoho elektronu na vyšší (dosud neobsazenou) energetickou hladinu. Pokud nedojde ke změně spinu daného elektronu, označujeme excitovaný stav jako singletní a energetické hladiny značíme jako S 1, S 2, atd. podle energie stavu. Jelikož však po excitaci nejsou již elektrony spáro- 3 Dva nerozlišitelné fermiony (částice s poločíselným spinem, např. elektrony, protony a neutrony) se nemohou nacházet ve stejném kvantovém stavu, tedy nemohou mít všechna čtyři kvantová čísla navzájem shodná 4 Projekce spinu do osy z: 1 2 ( )). 11

16 vány, může dojít s malou, avšak nezanedbatelnou pravděpodobností k převrácení spinu jednoho z nich, a tak ke změně celkového spinového čísla S na 1. Tento stav lze realizovat třemi způsoby 5, a proto se nazývá tripletní (značíme T 1, T 2 atd.). V důsledku energeticky výhodnější korelace pohybu záporných nábojů nespárovaných elektronů mají tripletní stavy molekul nižší energii než příslušné singletní stavy [11]. Po excitaci molekuly dochází k relaxaci zpět do základního stavu, tj. stavu s nejnižší energií. U většiny molekul je základní stav singletní, výjimku tvoří molekula kyslíku, která je v základním stavu tripletní. Návratu do základního stavu lze docílit několika způsoby přenosem excitační energie na jinou molekulu (časté např. v anténním komplexu fotosystémů) či uvolněním energie do okolí ve formě tepla nebo světla. Mezi nezářivé procesy relaxace z excitovaných stavů do základního stavu se řadí vnitřní konverze, mezisystémový přechod a vibrační relaxace. Přechody mezi základní vibrační hladinou vyšší energetické hladiny a vyšší vibrační hladinou nejbližší nižší energetické hladiny jsou následovány rychlou vibrační relaxací na základní vibrační hladinu nižší energetické hladiny. Přechod mezi energetickými hladinami se stejnou multiplicitou (obě singletní, nebo tripletní) je označován jako vnitřní konverze, zatímco přechod mezi stavy s rozdílnou multiplicitou se nazývá mezisystémový přechod a dochází k němu obvykle až z nejnižších excitovaných hladin, tedy nejčastěji z S 1. K zářivým přechodům dochází, podobně jako k mezisystémovému přechodu, až z nejnižších excitovaných stavů, kde přechod do základního stavu bývá pomalejší, a tak může být spojen s emisí fotonu [32]. Zářivý přechod mezi hladinami se stejnou multiplicitou se nazývá fluorescence, zatímco přechod mezi hladinami s odlišnou multiplicitou označujeme jako fosforescenci. Doba, potřebná pro přechod molekuly z excitovaného do základního stavu, je charakteristická pro jednotlivé energetické hladiny dané molekuly a nazývá se dobou života příslušného (excitovaného) stavu. Jelikož však k depopulaci vyšší energetické hladiny může dojít několik způsoby, je doba života daného stavu výsledkem složení dob života několika konkurenčních procesů. Pravděpodobnost přechodu mezi stavy s různou multiplicitou (mezisystémový přechod) je poměrně nízká, což plyne ze zakázanosti těchto přechodů spinovými výběrovými pravidly. Může k nim však docházet v důsledku spin-spinových a spin-orbitálních interakcí [11]. Proto je například kvantový výtěžek fosforescence (typicky 10 5 ) o několik řádů nižší než u fluorescence (10 2 ), zatímco doba života delší ( s) ve srovnání s fluorescencí ( s) [11]. Podobně je ovlivněna i tripletní excitace chlorofylů, která má oproti standardní singletní excitaci poměrně dlouhou dobu života (řádově s ve srovnání s 10 9 s příslušející singletní excitaci). Relativně dlouhá doba života tripletu chlorofylu umožňuje jeho srážku s molekulou kyslíku. Přenosem energie z tripletního excitovaného stavu chlorofylu na kyslík, který má v základním stavu tripletní konfiguraci elektronů, může dojít ke vzniku velmi reaktivního singletního kyslíku, který oxiduje bílkoviny i pigmenty fotosyntetického aparátu. Kvůli minimalizaci poškození fotosyntetického aparátu singletním kyslíkem se v blízkosti téměř ka- 5 Možné projekce spinu do osy z:, a 1 2 ( + ). 12

17 ždého chlorofylu vyskytuje molekula karotenoidu, která snímá tripletní excitaci chlorofylů a přeměňuje ji na teplo [9]. V důsledku jiných, např. orbitálních výběrových pravidel může však dojít i k zákazu přechodů mezi stavy o stejné multiplicitě [11]. Například u karotenoidů je zakázán přechod ze základního singletního stavu S 0 do prvního excitovaného singletního stavu S 1. Při jejich excitaci tedy nejčastěji dochází k absorpci z S 0 do S 2. Stav S 1 pak může být populován vnitřní konverzí ze stavu S 2, avšak kvůli účinné vnitřní relaxaci dochází během několika pikosekund k relaxaci do základního stavu. Vzhledem k velmi krátké době života stavu S 1 ( 10 ps pro β-karoten [28]) můžeme pozorovat jen velmi slabou fluorescenci z tohoto stavu 6. Krátká doba života S 1 stavu má také za následek, že tripletní stav T 1 karotenoidů nebývá populován přímo mezisystémovým přechodem, nýbrž pomocí přenosu energie z jiné molekuly v tripletním stavu (ve světlosběrných anténách nejčastěji z chlorofylů) tzv. triplet-tripletním přenosem energie. 1.5 Absorpční spektroskopie V závislosti na energii, obsazenosti energetických hladin a extinkčním koeficientu zkoumané látky v určitém rozpouštědle dochází k absorpci fotonů o určité energii (vlnové délce) s větší nebo menší pravděpodobností. Závislost množství světla pohlceného molekulou na vlnové délce záření se nazývá absorpční spektrum a liší se dle studované látky a použitého rozpouštědla. Ke kvantifikaci množství pohlceného, resp. prošlého záření o určité vlnové délce se používají bezrozměrné veličiny absorbance (neboli optická hustota (OD)) a transmitance. Transmitance T (λ) je definována jako podíl intenzity světla prošlého vzorkem ku intenzitě světla vstupujícího do vzorku: T = I(λ) I 0 (λ). (1.1) Absorbance A(λ) je definována jako záporně vzatá hodnota dekadického logaritmu transmitance nebo ji lze vyjádřit pomocí Lambert-Beerova zákona: ( ) I(λ) A(λ) = logt (λ) = log = ε(λ) c d, (1.2) I 0 (λ) kde c označuje koncentraci látky, d tloušťku absorbující vrstvy (optická délka kyvety) a molární absorpční (extinkční) koeficient ε(λ) charakterizuje schopnost dané látky absorbovat světlo na určité vlnové délce. Jedná se o aditivní veličina, což znamená, že množství světla pohlceného jednotlivými pigmenty se sčítá. Ze stacionárních absorpčních spekter můžeme určit pravděpodobnost přechodu mezi energetickými hladinami vzorku pro záření o určité vlnové délce (energii), a to z hodnoty OD na dané vlnové délce. Ke studiu změn v absorpčních spektrech v průběhu času lze využít metodu excitace a sondování, kdy je studovaný systém po krátkou dobu vystaven záření o vysoké intenzitě (nejčastěji laserovému 6 Ačkoliv ve většině případů dochází k zářivé relaxaci pouze z nejnižších excitovaných energetických hladin, u některých karotenoidů byla zaznamenána slabá fluorescence i z velmi krátce žijícího stavu S 2 (τ 100 fs) [28] 13

18 pulsu) a následně jsou způsobené změny studovány (sondovány) slabším měřicím světlem (způsobujícím zanedbatelné změny ve vzorku ve srovnání s excitačním pulsem) v různých časech po excitaci. Odečtením spektra naměřeného bez excitace (A 0 ) a v určitém čase t po excitačním pulsu (A t (λ)) získáme tzv. transientní spektrum ( A t (λ) = A t (λ) A 0 (λ)). Změříme-li větší počet transientních spekter pro určité zpoždění t, můžeme výsledná transientní spektra zprůměrovat a získat tak lepší poměr signálu k šumu. K potlačení vlivu nestability měřicího světla se využívá tzv. dvoupaprskové uspořádání, kdy je sondovací světlo rozděleno na dvě části a přivedeno ke vzorku i k referenci. Z intenzity světla prošlého vzorkem I S a referencí I R se následně vypočítává absorbance A = log ( IS (λ) I R (λ) Použijeme-li ve výpočtu absorbance intenzitu světla prošlého referenčním vzorkem namísto intenzity záření dopadajícího na vzorek, nemusíme se již zabývat nespecifickými ztrátami intenzity světla způsobenými např. absorpcí a odrazem světla na stěnách kyvety a v optice fotometru či absorpcí samotného pufru [33]. 1.6 Chromatografie Pojmem chromatografie bývá označován soubor separačních metod založených na různých fyzikálně-chemických principech, během nichž dochází k mnohonásobnému porušování a ustalování rovnovážných stavů rozdělovaných látek mezi dvěma fázemi, stacionární a mobilní [34]. Stacionární fáze je promývána určitou rychlostí mobilní fází, v níž je obsažena zkoumaná směs. V závislosti na afinitě jednotlivých složek směsi ke stacionární fázi, dochází k jejich postupnému oddělení, přičemž složky s nejnižší afinitou projdou systémem jako první. Jedním z typů chromatografie je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Jedná se o kapalinovou (mobilní fáze je kapalina), sloupcovou (stacionární fáze je umístěna v tzv. koloně), adsorpční (stacionární fáze je adsorbent 7 ) chromatografii. Kvůli použití vysoce účinných adsorbentů s velmi jemnými a vysoce homogenními částicemi se HPLC řadí mezi metody s vysokou účinností. Průtok mobilní fáze kolonou umožňuje výkonné vysokotlaké čerpadlo. Nízký detekční limit je dán použitím citlivých detektorů, které sledují určitou vlastnost vzorku, např. absorpci světla. Signál z detektoru je následně zesílen a přiveden do počítače. V dnešní době se nejvíce používá uspořádání s nepolárním adsorbentem a polární stacionární fází, tzv. chromatografie v obrácené fázi (reverzní chromatografie). K oddělení frakcí vzorku pak dochází primárně na základě hydrofobicity molekul, uplatňuje se však i jejich velikost a tvar [34]. HPLC tedy můžeme využít k oddělení jednotlivých složek ve vzorku, k jejich identifikaci na základě určité fyzikální vlastnosti (např. absorpční spektrum) a také k určení jejich koncentrace ve zkoumané směsi [37]. ). 7 Látka interagující se vzorkem rozpuštěným v mobilní fázi, přičemž na základě mezipovrchových přitažlivých sil dochází ke zvyšování koncentrace zkoumané látky na povrchu adsorbentu beze změny jeho fyzikálních vlastností [35, 36]. 14

19 2. Použitý materiál a metody 2.1 Materiál Vzorky Vliv vymytí β-karotenu jsme studovali na dvou různých typech vzorků pocházejících z thylakoidních membrán špenátu. V prvním případě byly izolovány části thylakoidů tvořící grana. Metodu přípravy těchto vzorků jako první publikovali autoři Berthold, Babcock a Yocum, na jejich počest se pak vzorky připravené touto metodou označují jako BBY částice (BBY) [1]. Druhou sadu vzorků pak tvořily větší části thylakoidů (Thy) obsahující grana i lamely. U obou typů vzorků jsme pak měli k dispozici kontrolní (cbby, cthy) a hexanem vymytý vzorek (hwbby, hwthy) Pufry Pro přípravu vzorku s BBY částicemi jsme používali pufr obsahující 20mM sodnou sůl kyseliny 2-(N-morfolino)ethan sulfonové (MES), 15mM chlorid sodný (NaCl) a 0,5M sacharózu. Pomocí 35% kyseliny chlorovodíkové (HCl) jsme pak upravili ph pufru na hodnotu 6,5. Pufr sloužící k přípravě thylakoidů obsahoval 20mM N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N -2-ethan sulfonovou kyselinu (HEPES), 5mM chlorid hořečnatý (MgCl 2 ) a 0,5M sacharózu. K úpravě ph na požadovanou hodnotu 7,5 byl použit hydroxid draselný (KOH). Sacharóza byla do pufrů přidána za účelem zvýšení hustoty roztoků, což při centrifugaci připravených vzorků umožnilo odstředit jen velké částice n-dodecyl-β-d-maltosid (DM) n-dodecyl-β-d-maltosid (DM) je neionogenní detergent, který se obvykle používá k solubilizaci membránových proteinů. Solubilizace je děj, při němž se po přidání vhodné amfifilní 1 látky nerozpustná nebo omezeně rozpustná látka (např. membránový protein) převádí do roztoku (např. vodný pufr). Při překročení kritické micelární koncentrace (CMC) dochází k včlenění nerozpustné látky (solubilizátu) do micel solubilizátoru [38]. CMC DM ve vodě za teplot mezi C činí 0,15 mm [39], což odpovídá 0,008 %, přičemž v přítomnosti solí a sacharózy tato hodnota klesá [40]. Přidáme-li tedy do směsi velmi omezeně rozpustného vzorku a pufru nadkritickou koncentraci DM, docílíme určitého stupně solubilizace vzorku, a tak i homogenizace směsi, což sníží rozptyl roztoku a usnadní měření absorpčních spekter. Jelikož jsou však námi studované vzorky poměrně komplexní (především thylakoidy), včleňování do micel detergentu se neobejde bez určitého stupně rozpadu vzorku na menší části. Přidanou koncentraci DM jsme se tedy snažili volit tak, abychom co nejvíce eliminovali rozptyl a získali transientní spektra s rozumným poměrem signálu k šumu, ale zároveň, aby DM nezpůsobil ve vzorku přílišné změny a mohli jsme pozorovat děje ve vzorku v co nejvíce nativním stavu. 1 Amfifilní látky mají hydrofobní i hydrofilní část. 15

20 2.1.4 Dithioničitan sodný (DT) Dithioničitan sodný (DT) se vyznačuje svými redukčními účinky. Nachází-li se DT ve vodném roztoku za přítomnosti kyslíku dochází k přeměně na hydrogensíran sodný (NaHSO 4 ) a hydrogensiřičitan sodný (NaHSO 3 ). Na 2 S 2 O 4 + O 2 + H 2 O NaHSO 4 + NaHSO 3 Produkty této reakce okyselují vzorek, a tím i urychlují reakci [41]. Kvůli redukci systému jsme do vzorků přidali 20mM DT ( Sigma- Aldrich), přičemž vedlejším účinkem bylo vytvoření anaerobních podmínek ve vzorku Enzymy odstraňující kyslík ze vzorku Poměrně rychlou a ke vzorku šetrnou metodou vedoucí k odstranění kyslíku ze vzorku je využití enzymů glukózoxidázy a katalázy [42]. Glukózooxidáza katalyzuje reakci přeměny glukózy v přítomnosti kyslíku na glukono-1,5-lakton a peroxid vodíku [43]. Kataláza pak zprostředkovává přeměnu dvou molekul peroxidu vodíku na dvě molekuly vody a jednu molekulu kyslíku [44]. 1. β-d-glukóza + O 2 glukózoxidáza D-glukono-1,5-lakton + H 2 O 2 2. H 2 O 2 + H 2 O 2 kataláza 2 H 2 O + O 2 Glukono-1,5-lakton je následně hydrolyzován na kyselinu glukonovou [43], čímž dochází k poklesu ph ve vzorku. Tento vliv může být částečně nebo zcela redukován vlivem pufru v závislosti na typu vzorku, použité koncentraci enzymů a síle pufru [42, 45]. Pro přípravu anaerobních podmínek jsme na 3 ml výsledného objemu vzorku použili 60 µl 150 u 2 / 100 µl glukózoxidázy (30 u/ml; G6125, Sigma-Aldrich), 30 µl 8750 u / 100 µl katalázy (875 u/ml; C30, Sigma-Aldrich) a 60 µl 1M glukózy (20 mm; G7528, Sigma-Aldrich). 2.2 Příprava vzorků Jelikož jsme nepracovali s jednotlivými izolovanými komplexy, ale s většími částmi thylakoidní membrány, docházelo ke vzniku poměrně velkých agregátů. Při pokusu připravit vzorek pro spektroskopická měření pouhým naředěním vzorku pufrem bez sacharózy na požadované OD v maximu absorpce vzorku na 680 nm jsme zaznamenali vysokou míru rozptylu, která značně komplikovala měření absorpčních spekter a téměř znemožňovala měření transientních spekter. Do přípravy vzorku jsme proto zahrnuli několik kroků vedoucích k zmenšení částic, a tak i ke snížení rozptylu vzorku. 2 Enzymová jednotka u odpovídá množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 µmol substrátu za jednu minutu za standardních podmínek (obvykle při 25 C a hodnotách ph a koncentraci substrátu, které vedou k maximální rychlosti přeměny substrátu) [46]. 16

21 Do pufru jsme přidali detergent DM, který pomohl solubilizovat thylakoidní membrány v pufru a zlepšil tak poměr signálu k šumu při měření časově rozlišených transientních absorpčních spekter. Velikost částic jsme se snažili zmenšit také mechanicky pomocí homogenizátoru s velikostí mezery mezi stěnou válce a pístem 0,05 mm. Ke zvýšení hustoty byla do pufru přidána 0,5 M sacharóza, což při závěrečném odstředění vzorku v centrifuze vedlo k usazení jen největších částic. Centrifugace probíhala 5 minut při 5000 otáčkách, následně byl supernatant přenesen pomocí pipety do čisté mikrozkumavky typu Eppendorf a znova odstředěn při 5000 otáčkách po dobu 5 minut. 2.3 Měřicí přístroje Absorpční spektroskopie Stacionární absorpční spektra byla měřena pomocí spektrometru Specord 250 (Analytik Jena) za využití reference tvořené příslušným pufrem ve stejném typu kyvety. Obrázek 2.1: Schéma aparatury k měření transientních spekter [11]. Nd:YAG - nanosekundový laser, OPO - optický parametrický oscilátor, S - vzorek, R - reference, Xe lamp - xenonová výbojka, iccd - signál zesilující CCD kamera, OS - osciloskop, PC - počítač, DG - generátor zpoždění, PTG - ovládací jednotka iccd kamery. Aparatura použitá pro měření transientních absorpčních spekter s časovým rozlišením v řádu ns µs je schematicky znázorněna na obr Vzorek (S) byl excitován na 678 nm optickým parametrickým oscilátorem (OPO) PG 122 (EKSP- LA) čerpaným nanosekundovým Nd:YAG laserem 3 NL303 (EKSPLA) s délkou pulsu 3 ns. Ke zjišťování změn ve vzorku způsobených excitací a měření reference (R), tvořené destilovanou vodou ve stejném typu kyvety jako měřený vzorek, byla využita xenonová výbojka (Xe lamp) LS FlashPac (PerkinElmer). 3 Aktivní prostředí tohoto pevnolátkového laseru je tvořeno izotropním krystalem Yttrium Aluminium Granátu (Y 3 Al 5 O 12 ) dopovaného ionty neodymu (Nd 3+ ) [47]. 17

22 V zobrazovacím spektrometru ihr 320 (Horiba Jobin Yvon) byly signály ze vzorku a z reference rozlišeny podle vlnových délek a následně detekovány zesilovanou CCD kamerou (ICCD) PI-MAX 512RB (Princeton Instuments). Minimální šířka měřicího okna (gate) činila 2 ns a byla použita při měřeních ve viditelné oblasti spektra, zatímco při detailnějším proměřování červené části spektra byla použitá šířka gate 100 ns. Časové rozlišení měřených transientních spekter bylo dáno délkou excitačního pulsu a rychlostí detektoru. Požadovaná zpoždění mezi excitačním pulsem, měřicím světlem a detekčním oknem CCD kamery zajišťoval generátor zpoždění DG 535 (Stanford Research). Součástí aparatury byla také ovládací jednotka iccd kamery (PTG) a osciloskop (OS) U2701A 100 MHz (Agilent) sloužící ke kontrole synchronizace. Nastavení jednotlivých prvků aparatury a výsledný výpočet transientních spekter ze získaných dat probíhaly za pomoci počítače (PC). [11, 48] Chromatografie K posouzení účinnosti vymytí β-karotenu ze vzorků hexanem jsme použili chromatografickou metodu HPLC. Pigmenty ze vzorků byly extrahovány ve směsi acetonu s metanolem v poměru 7:2. Vzorek byl 1 minutu centrifugován při otáčkách a po odebrání supernatantu byl sediment znovu rozpuštěn ve směsi acetonu s metanolem. Postup byl opakován do doby, než zůstal sediment bezbarvý. Supernatant sebraný při jednotlivých opakování postupu byl poté vysušen a rozpuštěn ve směsi metanolu s hexanem 4:1. Dvacet mikrolitrů vzorku bylo následně vstříknuto do mobilní fáze tvořené stejnou směsí metanolu s hexanem v poměru 4:1 protékající kolonou rychlostí 3 ml/min. Měření probíhalo na chromatografu Agilent Technologies 1200 Series za použití analytické kolony Agilent Eclipse XDB-C18 (5µm 9,4 x 250 mm, Agilent Technologies). Chromatogram byl pak snímán na 480 nm při 20 C Software Stacionární absorpční spektra byla měřena pomocí programu WinASPECT (Analytik Jena AG). K měření časově rozlišených transientních absorpčních spekter byl použit program WinSpec (Princeton Instruments), přičemž samotné měření bylo řízeno skriptem (Python) od Mgr. Petro Khoroshyy, Ph.D. Transientní spektra byla dále zpracována pomocí tzv. globální analýzy tvořící součást programu Mgr. Jana Alstera, Ph.D. [49]. Chromatogramy byly získány pomocí ChemStation (Agilent Technologies), stacionární absorpční spektra jednotlivých složek pak byla zobrazena pomocí programu WinASPECT (Analytik Jena AG). K finálnímu zpracování získaných dat a tvorbě grafů byl využit program OriginPro 9. Globální analýza Soubor získaných transientních absorpčních spekter pro různá zpoždění mezi excitačním pulsem a měřícím světlem lze fitovat na jednotlivých vlnových délkách sumou exponenciál n i=1 ) A i (λ) exp ( tτi. (2.1) 18

23 Jak bylo ukázáno v práci Mgr. Jana Alstera, Ph.D. [49], lze najít několik málo časových komponent, které dobře popisují chování vzorku na všech vlnových délkách. Pomocí globální analýzy lze určit těchto několik komponent (tj. příslušné doby života τ i ) a velikosti jejich amplitud na jednotlivých vlnových délkách A i (λ j ). Závislost velikosti amplitudy komponenty s určitou dobou života τ i na vlnové délce A i (λ) představuje spektrum této komponenty a označuje se DAS podle anglického Decay Associated Spectrum. K fitování transientních dat nám nejčastěji stačily dvě komponenty (n = 2), přičemž počet potřebných komponent byl určován především na základě nehomogenit v mapě residuí. Hodnocena byla také smysluplnost samotných DAS křivek a získaných dob života. Na obr. 2.2 a 2.3 je ukázána část vstupních dat - transientní spektra ve vybraných zpožděních mezi excitačním pulsem a měřicím světlem, příslušející vzorku cthy s 0,1 % DM za aerobních podmínek. Na obr. 2.2 jsou zobrazena vybraná spektra v krátkých časech po excitaci (do 30 ns), kde na 676 nm můžeme pozorovat intenzivní záporný pás patřící fluorescenci. Struktura dat s nižší intenzitou v širší oblasti zpoždění (od 1 do ns) je pak ilustrována na obr Jelikož po zlogaritmování naměřených dat za účelem výpočtu absorpčních spekter již nemá dohasínání fluorescence exponenciální charakter, nebylo možné uspokojivě fitovat data v této oblasti vlnových délek. Proto jsme při fitování transientních spekter z viditelné oblasti použili pouze jejich část - cca do 625 nm, kde se již fluorescence neuplatňovala. Pomalejší procesy v červené části spektra byly studovány samostatně v rámci měření s větším spektrálním rozlišením a pouze pro zpoždění od 100 ns (kvůli eliminaci fluorescence). Výsledné DAS křivky z výše ilustrovaných transientních spekter jsou na obr Časové údaje u jednotlivých komponent udávají jejich dobu života. Po excitaci dochází k přerozdělení elektronů mezi základní a vyššími energetickými hladinami. Energie absorbovaná vzorkem může být přenášena mezi jednotlivými pigmenty a přeměňována na jiné formy energie, které mohou být využity k pohánění buněčných procesů, nebo se přebytečná energie může uvolnit v podobně záření či tepla. V oblasti absorpce vzorku v základním stavu můžeme tedy po excitaci pozorovat pokles absorbance ze základního stavu v důsledku populace excitovaných stavů (tzv. vybělování). V transientním spektru se tato změna projeví záporným znaménkem. Se stejnou dobou života, jako dochází k vybělování (tj. poklesu absorpce ze základního stavu), bychom měli pozorovat i nárůst absorpce z excitovaných stavů (ESA), jenž se v transientním spektru projeví kladně. Na poklesu absorpce vzorku po excitaci (záporné znaménko v transientním spektru) se kromě vybělování mohou podílet také zářivé přechody elektronů mezi energetickými hladinami. V námi studovaném časovém rozlišení transientních spekter se uplatňuje především fluorescence. 19

24 Obrázek 2.2: Transientní spektra cthy (0,1 % DM) za aerobních podmínek ve viditelné oblasti pro několik vybraných zpoždění z prvních 30 ns. Záporný pás na 676 nm přísluší fluorescenci. Obrázek 2.3: Transientní spektra pro vybraná zpoždění (od 1 do ns) ve viditelné oblasti příslušející vzorku cthy s 0,1 % DM za aerobních podmínek. 20

25 Obrázek 2.4: DAS křivky cthy (0,1 % DM) za aerobních podmínek ve viditelné oblasti spolu se zmenšeným a převráceným stacionárním absorpčním spektrem (SAS) vzorku. Svislými čárkovanými liniemi jsou označeny hodnoty vlnových délek v maximech absorpce vzorku, tj. na 437 a 473 nm. Sledujeme-li průběh signálu daného procesu (vybělování, ESA, fluorescence) v čase, může docházet k jeho nárůstu nebo dohasínání. V prvním případě musí být amplituda exponenciály záporná, zatímco při dohasínání signálu bude amplituda kladná. V DAS se tedy např. dohasínání vybělování projeví záporně. Přehled znamének příslušejících nárůstu či dohasínání jednotlivých procesů je ukázán v tabulce 2.1. Výsledný tvar DAS křivky pak bude výsledkem složení všech příspěvků pozorovaných v dané části spektra a v daném čase. Vlnové délky, na nichž se projeví jednotlivé procesy, můžeme určit na základě znalosti absorpčních spekter pigmentů. Příslušnost ke komponentám pak stanovíme na základě dob života jejich excitovaných stavů. vybělování ( ) ESA (+) fluorescence ( ) nárůst ( ) + + dohasínání (+) + Tabulka 2.1: Přehled znamének signálů příslušejících nárůstu či dohasínání jednotlivých procesů odehrávajících se ve vzorku. 21

26 Ve většině případů stačily k fitování dat z oblasti vlnových délek v rozmezí přibližně nm, kterou budeme dále označovat jako viditelná oblast spektra, dvě komponenty s dobami života v řádech nanosekund, resp. mikrosekund (obr. 2.4). V červené oblasti pak byla data fitována jednou exponenciálou. Nyní zkusíme přiřadit jednotlivé části komponent z viditelné oblasti spektra k procesům probíhajícím ve vzorku. Doba života excitovaných stavů chlorofylů se pohybuje v řádu nanosekund v případě singletů, nebo dosahuje až několika milisekund u nezhášených tripletů. Typická doba života tripletních stavů karotenoidů je v řádu mikrosekund. Singletní excitované stavy karotenoidů vůbec nepozorujeme, jejich doba života je příliš krátká (ps fs) na to, abychom je mohli sledovat pomocí naší aparatury (rozlišení v řádu ns µs). Pomalejší (mikrosekundová) komponenta tedy bude náležet dohasínání tripletních stavů karotenoidů, jelikož se na dané časové škály jiné procesy neuplatňují. Na vlnových délkách, kde je signál záporný, bude převažovat dohasínání vybělování (záporný pás se dvěma minimy okolo 417 a 437 nm), zatímco v oblasti kladného signálu (kladné pásy okolo 473 nm a 507 nm) bude dominovat příspěvek dohasínání absorpce tripletních stavů karotenoidů. Mezi děje, které se mohou odehrávat na nanosekundové škále, řadíme dohasínání vybělování a ESA chlorofylů a nárůst vybělování a absorpce tripletních stavů karotenoidů. Na kratších vlnových délkách je tvar rychlejší (nanosekundové) komponenty výsledkem složení dohasínání vybělování chlorofylů (záporný signál) a nárůstu vybělování karotenoidů (kladný signál). Jelikož ve výsledku pozorujeme záporný pás se dvěma minimy na 417 a 437 nm, převládá v této oblasti dohasínání vybělování chlorofylů, které odráží dohasínání excitovaných stavů chlorofylů. V oblasti vlnových délek mezi 458 nm a 546 nm si můžeme povšimnout zrcadlové symetrie obou křivek. Protože pomalejší komponenta náleží dohasínání tripletních stavů karotenoidů, bude příslušná část rychlejší komponenty náležet procesům spojeným se stejnými energetickými hladinami, avšak s opačným časovým vývojem signálu, tj. bude se jednat o jeho nárůst. Tripletní stavy karotenoidů mohou být na této časové škále (jednotky nanosekund) populovány pouze triplet-tripletním přenosem energie, proto lze na základě stejné doby života nárůstu absorpce z tripletních stavů karotenoidů a dohasínáním excitovaných stavů chlorofylů usoudit, že triplety chlorofylů populované během života singletních stavů chlorofylů budou zhášeny karotenoidy. Jelikož po relaxaci singletních excitovaných stavů ( 5 ns) chlorofylů nepozorujeme žádný signál od tripletních stavů chlorofylů, kterému by příslušela nová komponenta s dobou života v řádu několika milisekund, je zhášení tripletů chlorofylů karotenoidy velmi rychlé a účinné. Dva široké kladné pásy na vlnových délkách delších než 550 nm, narušující symetrii obou komponent, jsou způsobeny dohasínáním absorpce ze singletních excitovaných stavů chlorofylu. Rychlejší komponenta tedy odráží především zhášení tripletních stavů chlorofylů karotenoidy, zatímco pomalejší ukazuje dohasínání tripletních stavů karotenoidů. 22

27 3. Výsledky a diskuze 3.1 Stacionární absorpční spektra Abychom si udělali prvotní představu o zkoumaných vzorcích, změřili jsme jejich stacionární absorpční spektra. Na obr. 3.1 a 3.2 jsou ukázána spektra normovaná na OD kontrolního vzorku v maximu pásu okolo 676 nm. Vzorky byly připraveny v pufru s 0,1 % DM. V grafech jsou také zobrazena absorpční spektra vybraných pigmentů ve směsi metanolu s hexanem v poměru 4:1, která byla získána z experimentů s HPLC. Vlivem odlišného prostředí pigmentů se však zakreslená spektra mírně liší od reálných spekter pigmentů ve zkoumaných vzorcích. Především může dojít k posuvu některých pásů, jak je dobře patrné například u pásu na 677 nm u cthy, jehož hlavní složkou je příspěvek od chlorofylu a, který má však v použité směsi metanolu s hexanem maximum na 666 nm (obr. 3.1). Obrázek 3.1: Stacionární absorpční spektra thylakoidů (0,1 % DM) normovaná na OD kontrolního vzorku v maximu pásu na 677 nm a spektra vybraných pigmentů (chlorofylu a a b (Chl a, resp. Chl b), β-karotenu (β-car) a blíže nespecifikovaného xantofylu nacházejícího se ve vzorcích (Xan)) ve směsi metanolu s hexanem v poměru 4:1, získaná pomocí HPLC. Pro snazší určení příspěvků jednotlivých pigmentů k výslednému spektru jsou svislými čárkovanými liniemi označeny vlnové délky 438 a 473 nm, na nichž se nachází vybraná maxima absorpce zkoumaných vzorků. 23

28 Obrázek 3.2: Stacionární absorpční spektra BBY částic (0,1 % DM) normovaná na OD kontrolního vzorku v maximu pásu na 675 nm a spektra vybraných pigmentů ve směsi metanolu s hexanem v poměru 4:1, získaná pomocí HPLC. Svislými čárkovanými liniemi jsou označeny vlnové délky 438 a 473 nm, na nichž se nachází vybraná maxima absorpce zkoumaných vzorků. Zkusili jsme také vypočítat rozdílová spektra kontrolních a hexanem vymytých vzorků, jejichž spektra byla normována na hodnotu OD v maximu pásu kontrolního vzorku okolo 676 nm. Výsledné rozdílové spektrum thylakoidů je zobrazeno spolu se zmenšenými (4,5krát) normovanými absorpčními spektry vzorků a spektrem β-karotenu na obr Porovnáme-li získané rozdílové spektrum se spektrem β-karotenu, můžeme pozorovat relativně dobrou shodu tvaru spekter v oblasti absorpce β-karotenu. Výkyvy hodnot okolo 676 nm jsou způsobeny drobným červeným posuvem pásu cthy oproti hwthy v důsledku interakce chlorofylů s karotenoidy. Na zvýšené absorpci v rozdílovém spektru u krátkých vlnových délek, na nichž β-karoten téměř neabsorbuje, se může podílet odlišná míra rozptylu vzorků či další změny v hexanem vymytém vzorku (kromě vymytí β-karotenu) způsobené při jeho přípravě. V rozdílovém spektru BBY částic (obr. 3.4) jsme v některých oblastech obdrželi záporné hodnoty signálu. Pravděpodobně se zde ve větší míře projevily různé odchylky mezi samotnými měřeními absorpčních spekter, například posun baseline mezi jednotlivými měřeními nebo odlišná míra rozptylu vzorků. Přesto můžeme pozorovat určitou shodu se spektrem β-karotenu - hlavní absorpční pás se nachází v podobné oblasti vlnových délek a má tři maxima (které se však liší poměrem svých intenzit). 24

29 Obrázek 3.3: Rozdílové spektrum cthy a hwthy spolu s jejich zmenšenými (4,5krát) normovanými (na 677 nm) stacionárními absorpčními spektry a spektrem β-karotenu (ve směsi metanolu s hexanem v poměru 4:1). Obrázek 3.4: Rozdílové spektrum cbby a hwbby spolu s jejich zmenšenými (12krát) normovanými (na 675 nm) stacionárními absorpčními spektry a spektrem β-karotenu (ve směsi metanolu s hexanem v poměru 4:1). 25

30 3.2 HPLC Ke zjištění účinnosti vymytí β-karotenu ze vzorků jsme využili metodu HPLC. Chromatogramy na 480 nm jsou ukázány na obr. 3.5, resp Chromatogramy příslušející hexanem vymytým vzorkům byly normovány tak, aby měly shodné OD v maximu pásu příslušejícího chlorofylu b (4 min 15 s, resp. 4 min 20 s) se svým kontrolním vzorkem (cthy, resp. cbby). Detail chromatogramů v kratších retenčních časech (od 2 do 5,5 min) je ukázán na obr Kromě chromatogramů thylakoidů byl do obr. 3.5 vynesen také chromatogram β-karotenu, který byl upraven tak, aby se shodovala jeho maximální hodnota OD s maximální hodnotou u cthy, tj. aby v maximu hlavního pásu (19 min 51 s) měl β-karoten stejnou hodnotu jako cthy v maximu pásu ve 2 min 49 s (xantofyly). Porovnáme-li absorbanci kontrolních a hexanem vymytých vzorků (Thy i BBY) v oblasti eluce β-karotenu, můžeme pozorovat výrazný pokles hodnot OD u hexanem vymytých vzorků. Srovnáme-li baseline u všech chromatogramů na nulu, při zachování normování vzorků na hodnotu OD v maximu pásu chlorofylu b, můžeme odečíst OD kontrolních a hexanem vymytých vzorků v pásu příslušejícímu β-karotenu. Jejich porovnáním zjistíme, že u hwthy došlo k poklesu na 7 % hodnoty OD kontrolního vzorku a u hwbby jsme zaznamenali snížení hodnoty na 10 %. Zjištěná procenta jsou však pouze orientační, pro získání přesnějších výsledků bychom museli uvažovat absorpci celého pásu, nejen hodnotu OD v jeho maximu. Obrázek 3.5: Chromatogramy thylakoidů (cthy, hwthy) a β-karotenu na 480 nm. Chromatogramy thylakoidů byly normovány na hodnotu OD v maximu pásu Chl b ve 4 min 15 s u cthy, zatímco chromatogram β-karotenu byl normován tak, aby se shodovaly maximální hodnoty OD u cthy a β-karotenu. 26

31 Obrázek 3.6: Chromatogramy BBY částic (cbby, hwbby) na 480 nm, normované na hodnotu OD v maximu pásu Chl b ve 4 min 20 s u kontrolního vzorku. Obrázek 3.7: Část chromatogramů thylakoidů a β-karotenu od 2 do 5,5 min na 480 nm. Chromatogramy thylakoidů byly normovány na hodnotu OD v maximu pásu Chl b ve 4 min 15 s u cthy. 27

32 Na základě výsledků získaných pomocí HPLC, podpořených rozdíly mezi stacionárními absorpčními spektry jednotlivých vzorků, můžeme říci, že lze pomocí hexanu poměrně účinně vymýt β-karoten z thylakoidních membrán. 3.3 Časově rozlišená absorpční spektroskopie Postup přípravy vzorku pro časově rozlišená měření byl vždy podobný, lišilo se však množství přidaného DM (0 0,5 %). Většina měření probíhala za aerobních podmínek, proběhlo však i několik měření za anaerobních podmínek, vytvořených buď pomocí glukózy a příslušných enzymů, nebo pomocí DT, který byl však do vzorku přidávám především kvůli svým redukčním vlastnostem. Vzorek byl v průběhu všech časově rozlišených měření chlazen na 4 C. Před a po měření bylo změřeno stacionární absorpční spektrum vzorku, abychom mohli posoudit stabilitu vzorku v průběhu měření Testovací měření Před samotným měřením jednotlivých vzorků jsme provedli sadu testovacích měření, pomocí nichž jsme chtěli zjistit, pro jaké OD vzorku ve stacionární absorpčním spektru v maximu okolo 678 nm, jakou excitační vlnovou délku a jakou energii excitačního pulsu získáme transientní spektra s nejlepším poměrem signálu k šumu. Jako testovací vzorek jsme si vybrali hwbby připravený v pufru s 0,01 % DM, přičemž OD v maximu pásu na 678 nm činilo po přípravě 1,05. Později byl vzorek ještě dvakrát naředěn, a to na OD 0,85 a 0,63. Pro všechny tři použité koncentrace byla změřena transientní spektra při třech různých energiích pulsu (okolo 300, 500 a 700 µj). Zpoždění mezi excitačním pulsem a měřicím světlem činilo 100 ns a použitá excitační vlnová délka byla 678 nm. Na závěr bylo také otestováno několik dalších excitačních vlnových délek - 438, 472, 650, 690 a 700 nm (obr. 3.8). Při testování různých koncentrací (OD 1,05, 0,85 a 0,63 v maximu pásu okolo 678 nm) jsme u vzorku s OD 1,05 pozorovali nepatrně větší intenzitu signálu v extrémech do 600 nm, avšak rozdíl byl velmi malý a poměr signálu k šumu byl u všech vzorků velmi podobný. Jelikož jsme tedy nepozorovali žádnou významnou korelaci mezi hodnotou OD vzorku a poměrem signálu k šumu, rozhodli jsme se u dalších měření použít ještě o trochu nižší koncentraci - OD 0,5. Ta byla volena především z důvodu umožnění přípravy podobně koncentrovaných vzorků při různém množství přidaného DM. V některých případech se dokonce nepodařilo připravit ani takto koncentrovaný vzorek bez použití většího množství DM. Na rozdíl od koncentrace vzorku jsme zaznamenali signifikantní vliv energie excitačního pulsu na poměr signálu k šumu ve spektrech (obr. 3.9). S rostoucí energií pulsu se zlepšoval i studovaný poměr. Hodnotu energie jsme tedy u dalších měření volili přibližně okolo 700 µj ( µj). Vyšší hodnoty nebyly použity z důvodu přílišné degradace vzorku v průběhu časově náročnějších měření. 28

33 Obrázek 3.8: Testované excitační vlnové délky vyznačené ve stacionárním absorpčním spektru vzorku hwbby (OD v maximu pásu na 678 nm 0,63; 0,01 % DM). Obrázek 3.9: Porovnání transientních spekter vzorku hwbby (0,01 % DM) s OD 0,85 při různých hodnotách energie excitačního pulsu. Zpoždění mezi excitačním a měřicím světlem bylo nastaveno na 100 ns. 29

34 Při porovnávání transientních spekter vzorku s OD 0,63 získaných pomocí různých excitačních vlnových délek (obr. 3.8) jsme nepozorovali žádnou změnu tvaru spektra nad rámec šumu. Lze tedy říci, že pozorovaný signál v rámci šumu nezávisí na výběru excitační vlnové délky. Nejlepší poměr signálu k šumu byl pozorován u transientních spekter získaných při excitaci na 438, 472, 650 a 678 nm, avšak nepatrně lepší výsledky ve srovnání se zbylými uvažovanými vlnovými délkami byly dosaženy při excitaci na 678 nm. Na rozdíl od testovacích měření, kdy byla porovnávána jednotlivá transientní spektra pro zpoždění 100 ns mezi excitačním pulsem a měřicím světlem, byla všechna ostatní měření provedena pro řádově více různých zpoždění. Získaná transientní spektra byla následně zpracována pomocí globální analýzy v programu od Mgr. Jana Alstera, Ph.D. Níže jsou pak popisovány a diskutovány především výsledky fitování - DAS křivky Aerobní podmínky, 0,1 % DM Nejprve jsme proměřili všechny vzorky (cthy, hwthy, cbby, hwbby) ve viditelné části spektra (od 364 do 743 nm) a následně ještě v červené části viditelné oblasti (od 621 do 745 nm) s větším rozlišením. Mřížka spektrometru při měření v celé viditelné oblasti měla 100 vrypů/mm, zatímco při detailnějším proměřování červené části byla použita mřížka s 300 vrypy/mm. Kvůli zlepšení poměru signálu k šumu jsme do vzorku přidali DM o výsledné koncentraci 0,1 %. Měření probíhalo za aerobních podmínek. Viditelná oblast spektra K fitování souboru transientních spekter všech vzorků ve viditelné oblasti spektra dobře stačily dvě komponenty, které měly ve všech případech obdobný tvar i podobné doby života. Dlouhožijící komponenta ( ms), která by mohla náležet nezhášeným tripletům chlorofylů, nebyla pozorována. Úbytek β-karotenu tedy patrně nemá vliv na ochrannou roli karotenoidů při zhášení tripletů chlorofylů. Ty byly stejně účinně zhášeny u vzorků s vymytými karoteny jako u kontrolních vzorků. Vymytím tedy pravděpodobně došlo k odstranění β-karotenů plnících hlavně jiné funkce než zhášení tripletů chlorofylů (světlosběrnou a strukturní roli), zatímco menší procento pevněji ukotvených β-karotenů (blíže reakčnímu centru, kde se kumuluje excitační energie a stoupá tak pravděpodobnost vzniku tripletů chlorofylů) zůstalo ve vzorku a mohlo nadále plnit své funkce, především pak ochrannou roli v podobě přejímání nežádoucí tripletní excitace chlorofylů. Jelikož aparatura má lepší časové rozlišení v řádu mikrosekund než nanosekund, jsou získané nanosekundové komponenty zatíženy větší chybou měření než mikrosekundové. Navíc se na výsledném tvaru pomalejších komponent podílí méně procesů, proto je také snazší interpretovat rozdíly mezi křivkami příslušejícími různým vzorkům. (V řádu mikrosekund můžeme pozorovat dohasínání vybělování a absorpce tripletních stavů karotenoidů. Procesy spojené s chlorofyly se na této časové škále neprojeví.) Změny ve spektrech rychlejších komponent 30

35 jsou tedy pouze popsány. Kvůli jejich nižší věrohodnosti a komplikovanosti interpretace dále pracujeme pouze s výsledky pramenícími ze srovnávání pomalejších komponent. A to u všech měření, tedy nejen při porovnávání hexanem vymytých a kontrolních vzorků, ale také u experimentů s různou koncentrací DM, s DT a s enzymy odstraňujícími kyslík ze vzorku (viz dále). Získané mikrosekundové komponenty byly normovány na 426 nm (obr. 3.10). Na dané vlnové délce by absorpce β-karotenu a xantofylů měla být podobná, soudě dle blízkých hodnost jejich extinkčních koeficientů v maximu jejich absorpce [50]. Normování komponent bylo provedeno za účelem usnadnění vyhodnocení změn na ostatních vlnových délkách. Obrázek 3.10: Pomalejší (mikrosekundové) komponenty DAS křivek všech vzorků s 0,1 % DM za aerobních podmínek, normované na hodnotu OD cthy na 426 nm. Porovnáme-li kontrolní a hexanem vymyté vzorky, můžeme u obou typů vzorků (Thy a BBY) pozorovat pokles signálu v pásech na 453 nm a 507 nm u hexanem vymytých vzorků ve srovnání se vzorky kontrolními. V případě thylakoidů se jedná přibližně o 16%, zatímco u BBY jen o 7% pokles změny OD na 507 nm, resp. 43 % (Thy) a 14 % (BBY) na 453 nm. Horní hranici rozdílu mezi dvěma měřeními téhož vzorku za stejných námi sledovaných podmínek spolu s chybou fitu odhadujeme na 20 %. Vymytí β-karotenu tedy zřejmě způsobilo pokles signálu u thylakoidů, zatímco u BBY částic nejsou změny prokazatelné. Doby života u jednotlivých vzorků nabývaly hodnot mezi 4,7 a 5,1 µs s chybou měření 20 %. Podobně jako na 426 nm, kde byla spektra normována, se na 453 nm projeví dohasínání vybělování základních stavů karotenoidů, zatímco signál na 507 nm 31

36 přísluší dohasínání absorpce tripletů karotenoidů. Jelikož je zhášení tripletů chlorofylů ve všech vzorcích vysoce účinné, množství β-karotenu i xantofylů podílejících se na zhášení tripletů chlorofylů se mezi jednotlivými vzorky nebude příliš lišit. Provedeme-li normalizaci na 426 nm a pozorujeme-li změny ve velikosti signálu na 453 a 507, musí docházet ke změně poměru mezi množstvím zhášejících β-karotenů a xantofylů. Nabízejí se dvě možnosti za prvé relativní nárůst signálu tripletů β-karotenu, nebo za druhé relativní nárůst tripletů xantofylů. Pro snazší dostupnost absorpčních spekter pigmentů v základním stavu si zde analyzujeme pouze změny týkající se pásu na 453 nm. Na této vlnové délce se nachází maximum absorpce β-karotenu a zároveň výrazné lokální minimum zastoupeného xantofylu (obr. 3.1), přičemž obě skupiny pigmentů mají podobné extinkční koeficienty v maximu své absorpce. Proto bychom v případě relativního nárůstu signálu od tripletů β-karotenu pozorovali u normovaných křivek nárůst signálu na 453 nm. Naopak, při relativním nárůstu signálu tripletů xantofylů by se více projevil relativní úbytek β-karotenu oproti nárůstu příspěvku xantofylů, což by se v normovaných spektrech projevilo poklesem signálu na 453 nm. Lze tedy říci, že relativní pokles signálu na 453 nm (pozorovaný u thylakoidů) je způsoben relativním nárůstem tvorby tripletních stavů xantofylů oproti tripletům β-karotenu. Jelikož jsou triplety karotenoidů populovány z tripletů chlorofylů, musí tedy u hexanem vymytého vzorku docházet k větší produkci tripletů chlorofylů ve vnějších anténách, kde je zhášejí xantofyly, než ve vnitřních světlosběrných komplexech, kde zháší β-karoten. Protože po vymytí vzorku hexanem nebyla narušena ochranná zhášecí role β-karotenu, došlo pravděpodobně k odstranění β-karotenů více vzdálených od reakčního centra, které byly slaběji ukotveny, byly snáze dostupné pro hexan a zároveň plnily spíše světlosběrnou a strukturní roli. (Ve vnitřní anténě v těsné blízkosti reakčního centra dochází ke kumulaci excitační energie, čímž roste pravděpodobnost tvorby tripletů chlorofylů, a tak i potřeba jejich zhášení.) Anulování strukturní role β-karotenu v periferních částech vnitřních antén pak mohlo vést k odštěpení vnějších světlosběrných komplexů. Mezi anténami tak nedocházelo k přenosu excitační energie, což mělo za následek zvýšení tvorby tripletních stavů chlorofylů v separovaných vnějších anténách a zároveň snížení pravděpodobnosti jejich formování ve vnitřních světlosběrných komplexech. Získané nanosekundové DAS křivky byly normovány na 436 nm, tedy v oblasti, kde se nejvíce projeví dohasínání vybělování chlorofylů. Porovnáme-li pak křivky kontrolních a hexanem vymytých vzorků, můžeme zaznamenat podobné chování jako u pomalejší komponenty, tedy pokles signálu v pásech okolo 457 nm (drobný posun oproti pásu na mikrosekundové komponentě 453 nm) a 507 nm (obr. 3.11). Na 457 nm bude převažovat nárůst vybělování karotenoidů, zatímco na 507 nm můžeme opět pozorovat signál spojený s absorpcí tripletů karotenoidů. Tentokrát se však jedná o jeho nárůst, nikoli dohasínání. Pokles na daných vlnových délkách (457 a 507 nm) činí 30, resp. 29 % u thylakoidů a 16, resp. 9 % u BBY částic. V rámci chyby měření odhadované na 30 % se však nejedná o signifikantní rozdíly mezi křivkami. Programem určené doby života rychlejších komponent jednotlivých vzorků se pohybovaly mezi 5,3 a 7,3 ns s chybou měření 30 %. 32

37 Obrázek 3.11: Rychlejší (nanosekundové) komponenty DAS křivek všech typů vzorků s 0,1 % DM za aerobních podmínek, normované na hodnotu OD cthy na 436 nm. Červená oblast V červené oblasti pozorujeme u všech vzorků výrazný pás kolem 680 nm (obr. 3.12). Příslušné doby života se pak pohybují od 5,8 do 9,5 µs s chybou měření do 30 %. Pozorovaný pás může příslušet rekombinačnímu tripletu primárního elektronového donoru (P680) 1 a akceptoru (plastochinon Q A ) v reakčním centru PSII, nebo se může jednat o tzv. interakční pás. Po separaci náboje na primárním donoru P680 dochází během 400 ps k přenosu elektronu přes přechodný akceptor feofytin (Pheo) na primární akceptor Q A, odkud se pak během 500 µs přenáší na sekundární akceptor Q B [7]. Je-li však primární akceptor již částečně (Q A ), či zcela (Q AH 2 ) redukován, je omezena možnost stabilizace separace náboje na primárním a následně sekundárním akceptoru a narůstá pravděpodobnost rekombinačního procesu. Při zpětném přenosu elektronu z Q A přes Pheo na P680 může dojít k převrácení spinu 3 (P680 + Pheo ) a vzniku tzv. rekombinačního tripletu 3 P680 [51], jehož doba života se pohybuje v řádech mikrosekund až milisekund v závislosti na oxidoredukčním stavu Q A a teplotě [52]. Zvýšení množství excitovaných stavů P680 vede k poklesu absorbance ze základního stavu P680 (vybělování), což se v transientním spektru projeví záporně. Vzhledem k době života komponent (µs) se bude jednat o dohasínání signálu (kladné znaménko), v DAS se tedy rekombinační triplet projeví záporně. K částečné, nebo úplné redukci primárního akceptoru může dojít za nej- 1 Maximum absorpce speciálního páru chlorofylů P680 se nachází na 680 nm. 33

38 různějších stresových podmínek. Ty mohou být způsobeny například nadměrnou excitací vzorku, ať už při vyšší ozářenosti slunečním světlem, či pomocí laseru, nebo prostřednictvím redukčního činidla. Obrázek 3.12: DAS křivky všech vzorků s 0,1 % DM za aerobních podmínek v červené oblasti, normované na hodnotu OD cthy na 678 nm. Pro porovnání jsou znázorněna také normovaná stacionární absorpční spektra (SAS) thylakoidů a kontrolních BBY částic s 0,1 % DM. Svislou čárkovanou linií je označena vlnová délka maxima absorpce cthy v červené oblasti (676 nm). Zatímco doba života rekombinačního tripletu by se měla lišit od doby života tripletů karotenoidů, jelikož se jedná o signál od jiné skupiny pigmentů, doba života interakčního pásu by se měla s dobou života tripletních stavů karotenoidů shodovat. Kvůli efektivnímu přenosu energie mezi chlorofyly a karotenoidy se molekuly těchto pigmentů nachází poměrně blízko u sebe. Dojde-li pak k excitaci jednoho z nich, pozmění se prostorové rozdělení elektronové hustoty dané molekuly, což ovlivní uspořádání elektronů sousedního pigmentu. Pokud tato změna vede k poklesu absorbance ze základního stavu ovlivněného pigmentu, v transientním spektru se projeví záporným signálem. Excitace karotenoidů se tak může projevit i na vlnové délce, kde již absorbují pouze chlorofyly [53]. Kvůli své nízké intenzitě se však příspěvek od tohoto procesu může ve spektru projevit až v době, kdy se již nebude uplatňovat vybělování ani absorpce excitovaných stavů chlorofylů. Jelikož je změna absorpce chlorofylu podmíněna existencí excitovaných karotenoidů, bude daný signál dohasínat spolu s nimi. Vzhledem k velmi krátké době života singletních excitovaných stavů karotenoidů (ps fs) se tedy bude jednat o dohasínání tripletů karotenoidů, jejichž doba života je přibližně 5 µs. V DAS bychom tedy v případě interakčního pásu měli pozorovat záporný signál (dohasínání 34

39 vybělování) na vlnových délkách absorpce chlorofylů (maximum absorpce chlorofylů ve vzorku cthy s 0,1 % DM se nachází na 676 nm) s dobou života shodnou s dobou života tripletů karotenoidů. Zda tedy k signálu okolo 680 nm přispívají více změny způsobené v důsledku formování rekombinačnímu tripletu, či interakčního pásu, lze určit na základě polohy minima pásu a příslušných dob života. Po normalizaci dat na minima hlavních pásů snáze stanovíme odlišnosti ve tvarech jednotlivých křivek. U hexanem vymytých vzorků i u thylakoidů dochází k rozšíření pásu do oblasti kratších vlnových délek ve srovnání s kontrolními vzorky, resp. BBY částicemi. K nejvýraznějšímu rozšíření dochází u hwthy, které je navíc spojeno s modrým posunem minima pásu z 679 na 676 nm. Jak naznačují výsledky měření ve viditelné oblasti spektra, vymytím thylakoidů hexanem může docházet k odpojení vnějších antén. S tím pravděpodobně souvisí i formování většího množství tripletů karotenoidů (příspěvek od většího množství tripletů xantofylů pravděpodobně převyšší pokles příspěvku od tripletů β-karotenu), což posílí signál příslušející interakčnímu pásu. Jelikož ve spektru hwthy pozorujeme posun minima pásu ke kratším vlnovým délkám oproti jeho poloze u cthy, převáží patrně příspěvek od interakčního pásu nad signálem od rekombinačního tripletu. Spolu s posunem by mělo docházet i ke zkracování doby života. Porovnání zjištěných hodnot však není příliš směrodatné, jelikož odhadovaná chyba měření činí přibližně %. Rozdíly mezi zjištěnými dobami života tak mohou být přisouzeny chybě měření. Rozdíly mezi hwbby a cbby nebyly příliš prokazatelné (ve viditelné oblasti ani v červené části spektra), proto patrně vymytí většiny β-karotenů u tohoto typu vzorku nezpůsobí takové strukturní změny jako u hwthy, nebo se u něj neprojeví v takové míře. Stabilita vzorků Relativní pokles OD ve stacionárních absorpčních spektrech v maximu pásu na 678 nm (použitá excitační vlnová délka) po měření časově rozlišených transientních spekter byl u všech vzorků menší než 10 % původní hodnoty OD (před měřením transientních spekter). Časově rozlišená měření byla poměrně dlouhá, vzorky tak byly po delší dobu vystaveny destruktivním účinkům, které se projevily na stabilitě vzorku. Avšak průměrný 6% pokles absorbance v maximu pásu na excitační vlnové délce svědčí o poměrně dobré stabilitě studovaných vzorků. Navíc při porovnání absorpčních spekter vzorku hwthy po měření transientních spekter a toho samého vzorku uchovávaného v chladničce o 21 hod později jsme zaznamenali pokles OD v maximu pásu okolo 678 nm o pouhá 2 %. Všechny vzorky tedy lze považovat za relativně stabilní, a to nejen v průběhu měření. 35

40 Obrázek 3.13: Stacionární absorpční spektra vzorku cthy s různou koncentrací DM. Svislá čárkovaná linie označuje 680 nm Vliv koncentrace DM Kvůli snížení rozptylu a zlepšení poměru signálu k šumu bylo do vzorků přidáno relativně velké množství DM (0,1 % DM). Vzhledem k obavám z možných negativních vlivů detergentu na kompaktnost vzorku jsme se rozhodli prozkoumat vliv koncentrace DM na vybraný vzorek, konkrétně na cthy a cbby. Nejprve jsme připravili vzorek bez přidání DM, z postupu přípravy byla také vynechána centrifugace. Po změření absorpčního spektra jsme přidali určité množství DM, vzorek lehce promíchali, počkali několik minut (cca 1 3 min) a opět změřili absorpční spektrum. Tento postup jsme opakovali až do doby, kdy výsledná koncentrace DM ve vzorku činila 0,12 %. Pouhým okem jsme také mohli sledovat snižování množství rozptylujících částic ve vzorku s rostoucí koncentrací DM. Naměřená absorpční spektra pro vybrané hodnoty v rozmezí 0 až 0,12 % DM ve vzorku pro cthy a cbby jsou na obr. 3.13, resp Kromě rozptylu můžeme ze spekter také vypozorovat, že při určité koncentraci dochází k mírnému modrému posuvu pásu na 678 nm (obr. 3.15). Mezní hodnota koncentrace u cthy se nachází mezi 0,002 a 0,004 %, resp. 0,004 a 0,005 % u cbby, což zřejmě odpovídá CMC DM v použitých pufrech. Kritická micelární koncentrace pro DM ve vodě činí přibližně 0,008 % [39] a v přítomnosti solí a sacharózy klesá [40]. Jelikož oba pufry obsahovaly různé soli a 0,5M sacharózu, je námi určená nižší hodnota CMC oprávněná. Na přechod mezi dvěma různými formami s měnícím se množstvím DM ve vzorku poukazuje také přítomnost isosbestických bodů 2 (přibližně 308, 497, 643 a 683 nm) dobře patrných u cbby (obr. 3.14), kde se ve stacionárních spektrech tolik neuplatnil rozptyl jako u cthy. 2 Vlnová délka, při níž je hodnota absorbance nezávislá na poměrném zastoupení jednotlivých forem látky [54]. V daném bodě se protínají všechny absorpční křivky. 36

41 Obrázek 3.14: Stacionární absorpční spektra vzorku cbby s různou koncentrací DM. Svislá čárkovaná linie označuje 680 nm. Obrázek 3.15: Stacionární absorpční spektra vzorku cthy s různou koncentrací DM - přiblížení pásu na 680 nm (svislá čárkovaná linie). 37

42 Posuv pásu okolo 678 nm a přítomnost isosbestických bodů naznačují, že po překročení CMC dochází ve vzorku k určité změně. U maxim ostatních pásů jsme zaznamenali nulový, nebo jen nepatrný posuv pásů, změna se tedy nejvíce projevila na absorpci chlorofylu a. Pravděpodobně tedy může docházet ke změně uspořádání okolí chlorofylu a, čím dojde k posunu jeho absorpčního maxima. Jelikož je však chlorofyl a zastoupen v reakčních centrech i ve světlosběrných anténách, nelze z měření stacionárních absorpčních spekter určit přesnější lokalizaci změn při použití vyšších koncentrací DM. Pro vybrané koncentrace DM jsme připravili vzorek cthy standardním způsobem (kap. 2.2) a změřili transientní časově rozlišená spektra ve viditelné oblasti a s větším spektrálním rozlišením v červené části spektra. Na obr. 3.16, 3.17 a 3.18 jsou ukázány výsledné nanormované DAS křivky příslušející cthy za aerobních podmínek s 0, 0,002, 0,02, 0,1 a 0,5% koncentrací DM. Vzorky s nízkou koncentrací (nižší než CMC, tj. u cthy kolem 0,003 %) vykazovaly horší poměr signálu k šumu, avšak na rozdíl od ostatních vzorků (hwthy, cbby, hwbby) se je alespoň podařilo připravit v koncentraci použitelné pro měření časově rozlišených transientních spekter (OD > 0,3). U ostatních vzorků se OD pohybovalo kolem 0,2 a méně. Při pokusu proměřit vzorek hwthy s počátečním OD 0,2 byla získaná transientní spektra zatížena natolik vysokou mírou šumu, že výsledky fitu byly naprosto nespolehlivé. Obrázek 3.16: Mikrosekundové komponenty DAS křivek pro pět vybraných koncentrací DM ve vzorku cthy za aerobních podmínek; normované na hodnotu OD cthy na 426 nm (čárkovaná svislá linie). Čárkovanými svislými čarami jsou dále vyznačeny hodnoty 450 a 507 nm. 38

43 Viditelná část spektra Měření transientních spekter při nižších koncentracích DM se kromě horšího poměru signálu k šumu vyznačovalo také nižší intenzitou signálu. Pro snazší srovnání výsledků jsme proto normovali získané DAS křivky ve viditelné oblasti na minima pásů kolem 426 nm (u pomalejších komponent), resp. kolem 435 nm (pro rychlé komponenty). Pomalejší komponenty příslušející vzorkům s podkritickými koncentracemi (0 a 0,002 %) DM a s 0,02 a 0,1 % DM se v rámci chyby měření ( 30 %, resp. 20 %) shodovaly (obr. 3.16). K posouzení rozdílů mezi křivkami proto byly dále použity pouze komponenty třech vzorků (s 0,002, 0,1 a 0,5 % DM). S rostoucí koncentrací můžeme pozorovat posun mikrosekundových komponent ke kratším vlnovým délkám, který je dobře patrný například u pásů kolem 507 nm a 426 nm. Modrý posuv se také projevuje u pásu kolem 455 nm (c < CMC), resp. 450 nm (c > CMC), který s rostoucí koncentrací mizí. U vzorku s 0,5% DM tento pás již nepozorujeme, u 0,02 a 0,1% DM ve vzorku se objevuje plato a u koncentrací nižších než CMC dochází k tvorbě lokálního minima. U nízkých koncentrací (c < CMC) dochází také k vertikálnímu posunu pásu na 473 nm do záporných hodnot. Doby života byly mezi 4,7 a 6,0 µs, přičemž chybu měření odhadujeme na 20 % pro nadkritické koncentrace DM, resp. 30 % pro koncentrace nižší než CMC. Pro určení rozdílu mezi komponentami jsme si vybrali křivky příslušející 0,002, 0,1 a 0,5 % DM ve vzorku. Ty byly normovány na vlnové délce 426 nm, na níž by při uvážení blízkého extinkčního koeficientu obou typů pigmentů v maximu jejich absorpce měla být podobná absorpce z jejich základních stavů. Pozorujeme-li pak s rostoucí koncentrací DM pokles signálu na 453 nm, můžeme podobně jako u měření s hexanem vymytými vzorky usoudit, že bude docházet k relativnímu nárůstu příspěvku od tripletů xantofylů ve srovnání s příspěvkem od tripletů β-karotenu. S tím může souviset i drobný modrý posun křivek u vzorků s vyšší koncentrací DM, který se objevuje i u hexanem vymytých vzorků. Absorpční spektra xantofylů jsou totiž oproti β-karotenu posunuta ke kratším vlnovým délkám. Působením DM dochází k solubilizaci vzorku, což je spojeno i s jistou mírou snížení jeho komplexnosti v závislosti na použité koncentraci DM. Například Roon a kol. [55] studovali vliv n-dodecyl-α,d-maltosidu (α-dm) na strukturální organizaci pigment-proteinových komplexů v thylakoidních membránách špenátu. K solubilizaci vzorku použili poměrně vysokou koncentraci tohoto detergentu, a to 1,2 %. Pozorovali, že přidaný α-dm narušil propojení jednotlivých pigmentproteinových komplexů a navíc způsobil i odtrhnutí vnějších světlosběrných komplexů PSII, především LHCII. Superkomplexy PSI-LHCI zůstávaly poměrně kompaktní. Můžeme tedy očekávat, že zvyšující se koncentrace DM povede k postupné separaci jednotlivých komplexů a jejich světlosběrných částí. V odpojených anténách se bude kumulovat excitace na chlorofylech s nejnižší energií, a bude se tak zvyšovat pravděpodobnost formování tripletních stavů. Zároveň poklesne množství excitační energie ve vnitřních anténách, čímž naopak může dojít k po- 39

44 klesu tvorby tripletů chlorofylů v této části fotosyntetického komplexu. V DAS se pak tyto změny projeví relativním nárůstem signálu tripletů xantofylů oproti tripletům β-karotenu. Významným důsledkem je také snižování průměrné velikosti částic ve vzorku, což vede k poklesu rozptylu a s tím souvisejícímu zlepšení poměru signálu k šumu v naměřených transientních spektrech. Nanosekundové komponenty příslušející vzorkům s různou koncentrací DM mají podobný tvar (obr. 3.17), liší se však poměr intenzit jednotlivých pásů. Jelikož se měření s nízkou koncentrací DM vyznačovala špatným poměrem signálu k šumu, byly i výsledky zatíženy poměrně velkou chybou, která se více projevila v řádu nanosekund než mikrosekund. Kvůli nízké věrohodnosti získaných křivek tak nelze z rozdílů mezi křivkami s podkritickou a nadkritickou koncentrací vyvozovat žádné důsledky. Komponenty příslušející 0,02 a 0,1 % se v rámci chyby měření ( 30 %) shodují. Prokazatelné rozdíly mezi křivkami tak pozorujeme jen u vzorků s 0,1 a 0,5 % DM. Po normování na 435 nm můžeme spolu s rostoucí koncentrací sledovat pokles signálu na 458 a 507 nm. Přičemž si podobně jako u mikrosekundové komponenty můžeme povšimnout podobnosti křivek příslušejících vzorku s 0,5 % DM a hwthy (obr. 3.11). Zatímco však změny u hwthy byly na hranici prokazatelnosti, pokles signálu na 458 nm u vzorku s 0,5 % DM je větší než odhadovaná chyba. Kvůli nespolehlivosti výsledků fitu u nízkých koncentrací DM jsou v obrázku uvedeny pouze doby života příslušející křivkám s nadkritickou koncentrací DM. Ty se pohybují mezi 5,7 a 6,3 ns s chybou měření 20 %. Obrázek 3.17: Nanosekundové komponenty DAS křivek pro pět vybraných koncentrací DM ve vzorku cthy za aerobních podmínek; normované na hodnotu OD cthy na 433 nm. 40

45 Červená oblast Největší změny v tvaru DAS křivek můžeme pozorovat v červené oblasti (obr. 3.18). U vzorků s koncentrací DM nižší než CMC vidíme dva pásy, a to kolem 680 nm a 700 nm. S rostoucí koncentrací DM dochází k zániku pásu na 700 nm, zatímco pás kolem 680 nm se posouvá ke kratším vlnovým délkám a rozšiřuje se. Můžeme také vypozorovat určitou souvislost mezi koncentrací DM ve vzorku a dobou života. Ze zjištěných hodnot se jeví, že s rostoucí koncentrací se zkracuje doba života jednotlivých komponent. Avšak spolehlivost správného určení dob života je především u vzorků s nízkou koncentrací DM poměrně malá. Chyba měření může činit i více než 50 %. Avšak i s takto velkou chybou měření lze předpokládat, že se doba života bude pohybovat spíše v řádu desítek než jednotek mikrosekund. S rostoucí koncentrací bude chyba měření mírně klesat. U vzorku s 0,5 % DM by neměla přesahovat 30%. I přes velké chyby měření můžeme však rozdíly mezi zjištěnými hodnotami považovat za prokazatelné, proto pravděpodobně bude s rostoucí koncentrací DM docházet ke zkracování doby života. Obrázek 3.18: DAS křivky v červené oblasti pro pět vybraných koncentrací DM ve vzorku cthy za aerobních podmínek; normované na hodnotu OD cthy s 0,1 % DM na 678 nm. Čárkovanými svislými liniemi jsou vyznačeny hodnoty 680 a 700 nm. Jak už bylo zmíněno dříve, okolo 680 nm můžeme pozorovat příspěvky od rekombinačního tripletu formovaného v reakčním centru PSII nebo interakčního pásu, kdy excitované karotenoidy ovlivní absorpci chlorofylů. Jelikož na 700 nm absorbuje jen P700, speciální pár chlorofylů sloužící jako primární donor elektronů v reakčním centru PSI, bude signál na této vlnové délce patrně náležet rekombinačnímu tripletu ve PSI. Vzhledem k provázanosti signálů okolo 680 a 700 nm u vzorků s podkritickou koncentrací DM lze usoudit, že se v obou případech bude jednat o příspěvek od rekombinačních tripletů. Převahu příspěvku od rekombinačního tripletu na 680 nm 41