Proteomické aplikace laseru s vlnovou délkou 266 nm

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav chemie Proteomické aplikace laseru s vlnovou délkou 266 nm Brno, 2007 Jan Přikryl

2 Děkuji doc. Mgr. Janu Preislerovi, Ph.D. za vedení mé diplomové práce, za jeho účast a cenné rady při experimentální práci a za poskytnutí zajímavého tématu diplomové práce. Dále děkuji Mgr. Marku Nečasovi, Ph.D. za poskytnutí vzorků, Bc. Pavle Pekárkové za rady a pomoc během měření na přístroji Aminco Bowman 2, Ing. Krásenskému za kvalitní provedení konstrukčních prací a také všem dalším studentům a pracovníkům z Ústavu chemie, kteří mi ochotně pomohli. 2

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně a že jsem použil pouze uvedenou literaturu a experimentální výsledky dosažené v laboratořích Ústavu chemie. datum. Jan Přikryl 3

4 OBSAH I. ÚVOD... 5 II. TEORETICKÁ ČÁST Lasery Princip laseru Typy laserů Optická charakteristika proteinů Nd:YAG zdroj záření pro studium proteinů a peptidů Detekce laserem indukované fluorescence Disociace Fragmentace v plynné fázi Fragmentace v kondenzované fázi Časově rozlišená fluorescence Fluorescence Charakteristiky fluorescence Měření časově rozlišené fluorescence Měření vyhasínání fluorescence v časové doméně Měření vyhasínání fluorescence ve frekvenční doméně III. CÍLE PRÁCE IV. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Fotodisociace Experimentální uspořádání Fotodisociace aromatických aminokyselin Fotodisociace peptidů Časově rozlišená fluorescence Instrumentace Optická sestava Elektronická sestava Sběr a vyhodnocení dat Měření časově rozlišené fluorescence Limity sestavy pro měření časově rozlišené fluorescence Měření časově rozlišené fluorescence v řádu milisekund Měření časově rozlišené fluorescence v řádu mikrosekund Měření časově rozlišené fluorescence v řádu nanosekund V. SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ VI. LITERATURA

5 I. ÚVOD Proteomika je odvětví analýzy pracující na společné základně biologických a chemických věd. Zabývá se analýzou proteomu, která zahrnuje tři základní aktivity: identifikaci všech proteinů produkovaných zkoumaným objektem, definici vzájemných interakcí těchto proteinů nezbytných pro určitou biologickou funkci a stanovení trojrozměrné struktury proteinů, která je zásadní pro identifikaci nízkomolekulárních ligandů, jež mohou sloužit jako potenciální léčiva. Oproti genomu, kde je informace uložená v genech ve formě lineární sekvence čtyř znaků (A, C, T, G) a je tedy jednorozměrná, je v proteinech informace mnoharozměrná, závislá na posttranslačních modifikacích nebo sbalení proteinu vedoucím k trojrozměrné struktuře určující jeho biologii. Jedním z hlavních cílů analytické chemie je získat kvalitativní informace o analytu. K identifikaci proteinu je používáno několik přístupů, například peptidové mapování zahrnující hmotnostně spektrometrickou analýzu (MS) produktů enzymatického štěpení, nebo analýza alespoň jednoho peptidu z proteinu, při níž se stanovuje jeho sekvence nebo přesná molekulová hmotnost. Důležitými informacemi jsou dále typ posttranslační modifikace, pozice modifikované aminokyseliny a míra modifikace. Dalším úkolem analytické chemie je získávání informací o kvantitě analytu a s tím související snaha o neustálé zvyšování citlivosti stanovení. Toho lze dosáhnout například optimalizací detekčních technik a nebo jejich kombinacemi, či vývojem nových analytických metod. Při analýze komplexních směsí, jakou proteom jistě je, je zapotřebí před detekci zařadit separaci. Typické je on-line spojení kapilární zónové elektroforézy (CZE) nebo vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) jako separační techniky s MS detekcí, za použití elektrosprejovacích ionizačních technik (ESI). V obou těchto oblastech analytické chemie lasery nacházejí uplatnění, a to zejména v oblasti laserem indukované fluorescence, časově rozlišené fluorescence, fotodisociace, MALDI nebo SELDI. Tato práce se zaměří na dvě oblasti využití UV laserů k analýze proteinů: fotodisociace a měření časově rozlišené fluorescence. 5

6 II. TEORETICKÁ ČÁST 6

7 1. Lasery V této kapitole bude stručně pohovořeno o principu laseru, budou zmíněny nejdůležitější druhy laserů a bude zdůvodněn výběr laseru pro proteomické aplikace. 1.1 Princip laseru V padesátých letech 20. století byla realizována zařízení generující a zesilující elektromagnetické záření na principu stimulované emise záření. Toto zařízení bylo pojmenováno MASER, což je akronym anglického Microwave Amplification by Stimulated Emission of Radiation. O několik let později bylo zkonstruováno zařízení zesilující a generující na obdobném principu záření z optické spektrální oblasti, pro které se ustálil název LASER, tj. Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation. 1 Při vzájemné interakci fotonu s látkou mohou nastat tři druhy dějů: absorpce, spontánní emise a stimulovaná emise. Při absorpci látka pohlcuje dopadající fotony světla a elektrony v atomech látky přecházejí na vyšší energetické hladiny (obr. 1a). Jestliže elektrony samovolně přechází z vyšší energetické hladiny na nižší hladinu, nastává spontánní emise. Tento děj není vyvolán vnějším působením, ale probíhá jako přirozený přechod atomu do stavu s nižší energií. Atom emituje fotony s energií danou rozdílem energetických hladin podle vztahu hν = E 1 E 0, kde h = 6, J.s je univerzální Plancova konstanta (obr. 1b). Stimulovaná emise nastává u atomů s elektrony excitovanými do vyšších energetických hladin vnějším působením. Stimulovaná emise má rezonanční ráz, to znamená, že ji může vyvolat jen foton s frekvencí odpovídající rozdílu energetických hladin (obr. 1c). 2,3 Stimulovaně vyzářený foton má shodnou energii, směr, fázi a polarizaci s fotonem iniciačním, zatímco spontánně vyzářený foton má náhodnou fázi, polarizaci i směr šíření. To je zásadní rozdíl, kterým se liší spontánní a stimulované záření. 1 7

8 hladině. 3 Pro lasery čerpané opticky je zapotřebí alespoň tří energetických hladin. Do 1 hν 0 1 hν 1 0 hν 1 0 hν a) b) c) Obr. 1: Tři základní kvantové přechody možné mezi dvěma energetickými hladinami: (a) absorpce, (b) spontánní emise a (c) stimulovaná emise Základní podmínkou funkce laserů, jako zesilovačů a generátorů koherentního záření, je dosažení převahy stimulované emise nad spontánní emisí a absorpcí. Převaha emise nad absorpcí je nutná, má-li v soustavě dojít k zesílení, a aby v ní převažovaly vznikající fotony nad pohlcovanými. Spontánní emise nezávisí na vnějším působením přiváděné energii, její fáze i polarizace je náhodná, takže vzhledem ke stimulované emisi má charakter šumu, proto je nutná převaha stimulované emise nad spontánní. 3 Pro vznik stimulované emise je nutné, aby v látce převažovaly atomy v excitovaném stavu, tedy aby nastala tzv. inverze obsazení energetických hladin. Inverze lze dosáhnout čerpáním, tj. dodáním světelné, magnetické nebo jiné energie zvenčí. Čerpání se liší u dvouhladinových soustav a soustav tří- a čtyřhladinových. 2,3 U dvouhladinových soustav je třeba k dosažení inverze jiné energie než je energie fotonů, tedy jiného čerpání než optického. Důvodem je, že budící světlo by bylo schopno nejenom převádět soustavu z nižší úrovně na vyšší, ale i naopak z vyšší na nižší. Libovolně intenzivní buzení tedy nezpůsobí inverzi energetických hladin, nýbrž pouze přiblížení stavu, kdy se počet excitovaných atomů blíží počtu atomů na základní soustavy dopadá optické čerpací záření, které je absorbováno a převádí elektrony z hladiny 0 na hladinu 2. Inverze je možná jen tehdy, vyznačuje-li se soustava zvláště vysokou pravděpodobností přechodu elektronu z hladiny 2 na hladinu 1. Jakmile 8

9 dosáhne intenzita čerpacího záření prahové hodnoty, poklesne obsazení hladiny 0 natolik, že bude dosaženo inverzního obsazení hladin 0 a 1 (obr. 2). 3 2 relaxace buzení 0 1 stimulovaná emise Obr. 2: Energetické schéma tříhladinového systému s přímým buzením horní laserové hladiny U tříhladinové soustavy v neexcitovaném stavu je třeba co největšího počtu elektronů na hladině 0, aby byla účinná absorpce budícího záření. Současně je ale potřeba, aby na základní hladině bylo co nejméně elektronů, aby bylo snadno dosaženo inverze. Tuto nevýhodu nemá čtyřhladinová soustava, u které lze dosáhnout toho, že je hladina 1 prázdná (v neexcitovaném stavu jsou všechny elektrony shromážděny na hladině 0), tudíž se dosahuje inverze obsazení hladin 2 a 1 snadněji (obr. 3). 3,4 3 relaxace 2 buzení stimulovaná emise 1 relaxace 0 Obr. 3: Energetické schéma čtyřhladinového systému s metastabilní hladinou 2 9

10 1.2 Typy laserů Lasery lze rozdělit dle různých kritérií. Podle povahy aktivního prostředí, podle způsobu čerpání energie, podle frekvence vyzařovaného záření, podle pracovního režimu či podle použití (viz tabulka 1). Tabulka 1: Klasifikace laserů aktivní prostředí čerpání emitované záření režim provozu optické infračervené pevnolátkové elektrické viditelné kontinuální kapalinové chemické ultrafialové pulzní plynové termodynamické rentgenové Pevnolátkové lasery Pevnolátkové lasery nacházejí v současné době mnohá uplatnění díky své relativně příznivé ceně, malým rozměrům a dostačující stabilitě. Aktivní prostředí pevnolátkových laserů je tvořeno pevnými krystalickými, případně amorfními látkami dopovanými nejčastěji příměsí přechodných kovů. Pevná fáze slouží pouze jako nosná matrice pro částice dopantu, které jsou zodpovědné za vlastní funkci laseru, tzn., že k optické amplifikaci dochází na elektronových přechodech iontů příměsí. Koncentrace příměsí se typicky pohybuje do 1 %. Typickými dopanty jsou ionty Nd 3+, Sm 2+, Tm 3+, Pr 3+ nebo Cr 3+ a U 3+. Jako nosného prostředí pro aktivní ionty se používají krystalické materiály, jako např. rubín (Al 2 O 3 ), yttrito-hlinitý granát (Y 3 Al 5 O 12, YAG), safír (Al 2 O 3 ) a další, nebo amorfní materiály (skla). Nejstarším laserem této skupiny je rubínový laser emitující záření vlnové délky 694 nm, dalšími lasery patřící do této skupiny jsou Nd:YAG laser nebo Ti:safírový laser. 5 Hlavními přednostmi Ti:safírového laseru jsou laditelnost vlnových délek emise v rozsahu nm a velmi krátké pulzy s trváním i pod 20 fs. 6 Plynové lasery V plynových laserech je aktivní prostředí tvořeno plynem nebo směsí plynů. Plynové lasery jsou velmi perspektivní zdroje infračerveného i ultrafialového záření hlavně díky tomu, že objem plynu je možno podle potřeby zvětšovat a plynulým přítokem je možné dodávat stále nové aktivní prostředí. 10

11 výkony. 5 Dusíkový laser je jedním z laserů emitujících ultrafialové záření. Laser pracuje Z plynových laserů se stal nejrozšířenější helium-neonový laser generující červené (632,8 nm) a infračervené záření (1,152 µm). Helium-neonový laser je tvořen dlouhou skleněnou trubicí naplněnou směsí neonu a helia, ve které se mezi elektrodami budí elektrický výboj na vysokém kmitočtu. 5 Aktivní prostředí laseru s oxidem uhličitým je tvořeno volnými molekulami oxidu uhličitého. Ve skutečnosti jsou energetické hladiny stimulované emise spíše rotačně-vibrační než elektronové, proto nastává emise infračervené záření, a to s vlnovou délkou 10,6 µm a 9,6 µm. Vzhledem k velikosti trubice může podávat vysoké automaticky v pulzním režimu díky společné deexcitaci všech excitovaných molekul ve velmi krátkém okamžiku, výsledkem je velmi krátký intenzivní pulz ultrafialového záření trvající 10 ns nebo méně o vlnové délce 337,1 nm. 5 Argonový laser je jedním z nejběžněji používaných laserů, jejichž aktivní prostředí je tvořeno pouze jedním vzácným plynem. Atomy argonu jsou ionizovány a poté excitovány nárazem elektronů pocházejících z nepřetržitého elektrického výboje. Díky povaze čerpání se v aktivním prostředí vyskytuje populace několika iontových excitovaných stavů, díky tomu nastává emise při několika vlnových délkách v UV a VIS oblasti, z nichž nejintenzivnější jsou vlnové délky 488,0 nm a 514,5 nm. Pro využití v proteomice jsou vhodné emise vlnových délek 275,4 nm a 305,5 nm nebo záření vlnové délky 244,0 nm získané použitím násobiče frekvence. 5 Excimerové lasery Excimerové lasery využívají jako aktivního prostředí exciplexů (excitovaných dvojatomových komplexů). Hlavním rysem excimerových laserů je, že pouze v excitovaném stavu může dojít ke vzniku exciplexu. Nejčastější jsou exciplexy halogenů s vzácnými plyny, jako např. KrF, jehož vznik je popsán níže. Kr + e - Kr + + 2e - F 2 + e - F - + F F - + Kr + KrF * Protože exciplex KrF vzniká pouze v excitovaném stavu a má krátkou dobu života (okolo 2,5 ns), rychle deexcituje za současné emise fotonu na nižší energetickou hladinu. Na této hladině ale existuje Kr a F samostatně, exciplex je tedy nestabilní a 11

12 následně se rozpadne, v důsledku čehož nastává inverze populací. Excimerové lasery jsou tedy ojedinělým příkladem dvouhladinových laserů. 5 Excimerové lasery produkují pulzy trvající ns. Vlnové délky emisí komerčně dostupných systémů jsou F nm, ArF 193 nm, KrCl 222 nm, KrF 248 nm, XeCl 308 nm, XeF 351 a 353 nm. Důležitou skupinou kapalinových laserů jsou barvivové lasery. Aktivní prostředí je tvořeno roztokem organického barviva, umístěného například v průtokové cele, kterou prochází paprsek budícího záření. Jejich výhodou je možná laditelnost vlnových délek v omezeném rozsahu, nevýhodou práce s roztoky. Komerčně dostupné barvivové lasery pokrývají rozmezí vlnových délek 200 nm-1 µm. 5 Polovodičové lasery Narozdíl od jiných pevnolátkových laserů, kde jsou energetické hladiny laserové emise spojeny s dopanty o nízkých koncentracích, se u polovodičových laserů jedná o energetické hladiny celé krystalové mřížky, proto jde spíše o energetické pásy než o diskrétní energetické hladiny. Laserové diody fungují na podobném principu jako LED ( light emitting diode ). Napříč přechodem p- a n-krystalu je aplikováno elektrické napětí, čímž přecházejí elektrony z vodivostního do valenčního pásu a přitom emitují světlo. Materiál krystalu je nejčastěji tvořen atomy prvků 13. a 15. skupiny, přičemž polovodiče typu p a n se dosahuje různými poměry mísení těchto prvků. 5 Ačkoli laserové diody emitují nejčastěji v infračervené nebo viditelné oblasti, v poslední době se již objevují i UV laserové diody s vlnovými délkami 375 nm 7 nebo 350,9 nm 8. Nevýhodou je vyšší rozbíhavost paprsku a poněkud nižší kvalita paprsku, výhodou malá velikost a relativně nízká cena. Násobič frekvence Pro dosažení záření o vyšší energii a vlnových délkách, které jinak nejsou dostupné jinými lasery, slouží násobení frekvence. Násobení frekvence (neboli generování harmonické frekvence) je příklad nelineárního optického procesu, kdy dva fotony světla laseru s frekvencí ν dopadají na některé látky v základním stavu, tato látka je excitována a při přechodu zpět na základní hladinu je emitován foton dvojnásobné frekvence ν. Jak ukazuje obrázek 4, tento proces neprobíhá přes přechodové excitované stavy. 5 12

13 hν hν hν Obr. 4: Energetické schéma násobení frekvence Vznik druhé harmonické frekvence je pozorován pouze u krystalů bez středu symetrie; používány jsou krystaly dihydrogenfosforečnanu draselného (KH 2 PO 4 ), niobičnanu lithného (Li 3 NbO 4 ) nebo v UV oblasti β-boritanu barnatého. 5 Tabulka 2: UV Lasery a vlnové délky emitovaného záření Laser λ (emise) λ (emise) Laser [nm] [nm] F Ar + 275,4 Excimer Ar * F 193,3 Excimer Xe * Br 281,8 Nd:YAG 5. harm. 212,8 Excimer Xe * Cl 308,0 Exicimer Kr * Cl 222,0 Excimer Xe * F 352,0 Ar + 2. harm. 257,3 Nd:YAG 3. harm. 354,7 Excimer Kr * F 248,4 He-Cd 325,0 Nd:YAG 4. harm. 266,0 N 2 337,1 13

14 1.3 Optická charakteristika proteinů Nativní fluorescence peptidů a bílkovin Protein, resp. polypeptid, je lineární polymer složený z aminokyselin vázaných peptidovými vazbami. Narozdíl od peptidů obsahují proteiny větší počet aminokyselin. Funkce proteinů může být katalytická (enzymy), regulační (hormony), transportní, kontraktilní (zprostředkování pohybu), obranná (imunoglobuliny), strukturní (např. kolagen, keratin) i zásobní (např. zásobní bílkovina semen). 9 Nativní fluorescence peptidů a bílkovin je závislá na jejich struktuře; fluorescence je způsobena přítomností aminokyselin tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu (obr. 5) a je závislá na vlastnostech vnitřního okolí proteinu v blízkosti aminokyselin. Tyto aminokyseliny mají odlišné vlnové délky maxim absorpčních a fluorescenčních spekter a liší se i v kvantovém výtěžku fluorescence. Nejsilněji fluoreskuje tryptofan, asi 10krát slabší fluorescencí se vyznačuje tyrosin kvůli nízkému molárnímu absorpčnímu koeficientu. Nejslabší fluorescenci z této trojice vykazuje kvůli nízkému molárnímu absorpčnímu koeficientu a nízkému kvantovému výtěžku fenylalanin. Zřejmě z tohoto důvodu je všeobecně zažité spojovat termín přirozená fluorescence proteinů především s fluorescencí tryptofanu. 10,11 Tabulka 3 uvádí intenzity fluorescence aromatických aminokyselin při excitaci zářením vlnové délky 266 nm, poměry intenzit neodpovídají publikovaným hodnotám např. z důvodu excitace mimo excitační maximum. O O O NH NH 2 OH NH 2 OH HO NH 2 OH tryptofan (W) fenylalanin (F) tyrosin (Y) Obr. 5: Chemické vzorce fluoreskujících aminokyselin 14

15 Tabulka 3: Intenzity fluorescence aromatických aminokyselin v prostředí citrátu a borátu při vlnové délce budícího záření 266 nm 12 Prostředí Aminokyselina Koncentrace (mol.l -1 ) Vlnová délka emise (nm) Intenzita (a. u. ) Tryptofan ,19 citrát Tyrosin ,36 Fenylalanin ,11 Tryptofan ,60 borát Tyrosin ,43 Fenylalanin ,72 7 I [a.u.] W (citrát, ph ~ 2,5; c = 1E-5 M) W (borát, ph ~ 9,5; c = 1E-5 M) Y (citrát, ph ~ 2,5; c = 1E-5 M) Y (borát, ph ~ 9,5; c = 1E-5 M) F (citrát, ph ~ 2,5; c = 5E-5 M) F (borát, ph ~ 9,5; c = 5E-5 M) λ [ nm ] Obr. 6: Emisní spektra W, Y, F při excitaci 266 nm. 12 Fluorescence tryptofanu Absorpce tryptofanu probíhá díky přesunům typu π π * v indolovém kruhu tryptofanu. Excituje se zářením vlnové délky nm, tyrosin zářením o vlnových délkách nm. Ve vodném prostředí se tryptofan projevuje širokým fluorescenčním pásem s maximem vlnové délky 350 nm a šířkou 60 nm. Fluorescenční spektra tryptofanu udávaná v literatuře se mohou mírně lišit, ačkoli jsou měřená za stejných podmínek, což je zřejmě způsobeno použitím odlišné instrumentace. Poloha 15

16 maxima fluorescence se tak pohybuje od 348 do 353 nm, dále se spektra mohou lišit v šířce pásu a tvaru, a to kvůli rozdílům v kalibraci. V dnešní době totiž neexistuje všeobecně akceptovaný standard pro spektrální kalibraci přístrojů v oblasti blízké UV. Protože excitace vede k podstatnému zvýšení dipólového momentu, posuny v emisním spektru jsou výraznější. Tyto posuny jsou způsobeny orientační relaxací jak dipólů fluoroforu, tak dipólů rozpouštědla. Tato citlivost tryptofanu ke změnám polarity a mobility okolního prostředí z tryptofanu činí důležitý nástroj studia struktury a dynamiky proteinů. 11 Absolutní kvantový výtěžek tryptofanu ve vodném prostředí je 0,13. V mnoha případech nicméně není třeba znát absolutní kvantový výtěžek; dostatečný pro praktické aplikace je relativní absolutní výtěžek. Fluorescence tryptofanu je citlivá na zhášení vodou, které nastává při vysoké aktivační energii (46,5 49,7 kj.mol -1 ). Taková hodnota aktivační energie vede k často pozorovatelnému snížení kvantového výtěžku, které nastává při vystavení tryptofanu vodnému prostředí. Ovšem existují i výjimky, kdy je fluorescence tryptofanu zhášena už v nativním stavu proteinu. 10 Téměř všechny polární skupiny bílkoviny mohou do jisté míry zhášet fluorescenci tryptofanu. Zbytky asparagové a glutamové kyseliny v neutrální formě, histidin, disulfidy i samotný cystein, dále amidové a peptidové skupiny jsou dobrými zhášeči. U proteinů obsahujících hem dochází ke zhášení fluorescence překrytím emisního spektra tryptofanu a absorpčního spektra hemu. Tryptofan je výjimečně citlivý na zhášení mnoha dalších druhů látek, jako kyslíku, jodidů, bromidů, akrylamidu, sukcinimidu, peroxidu vodíku, dichloracetamidu, NO - 3, Cs 2+, Cu 2+, Pb 2+, Cd 2+ a Mn 2+. Tato citlivost na zhášení dovoluje stanovit dostupnost tryptofanu vnějšímu prostředí měřením zhášení. Tyto efekty na jedné straně komplikují fluorescenční analýzu proteinu, na druhé straně však mohou zároveň sloužit jako zdroj informací o struktuře proteinu. 10, Nd:YAG zdroj záření pro studium proteinů a peptidů Aktivní prostředí Nd:YAG laseru je tvořeno monokrystalem neodymem dopovaného yttrito-hlinitého granátu Y 3 Al 5 O 12. Tento laser pracuje jako čtyřhladinový systém, tj. spodní laserová hladina není totožná s hladinou základního stavu. K vytvoření inverzní populace se používá optické čerpání pomocí výbojky (pulzní xenonová) nebo polovodičových laserových diod (LD). Nejintenzivnější emisní přechod 16

17 v neodymu vyzařuje na vlnové délce 1,0648 µm, tedy v blízké infračervené oblasti. Pro využití laseru v proteomice je potřebné záření kratších vlnových délek (zejména v UV oblasti) získané s použitím generátorů vyšších harmonických frekvencí (násobičů frekvence). Druhá harmonická frekvence odpovídá vlnové délce 532 nm, třetí 355 nm, čtvrtá 266 nm a pátá 213 nm. Pro proteomické aplikace je nejzajímavější záření vlnové délky 266 nm. 1,5 17

18 2. Detekce laserem indukované fluorescence Jak bylo řečeno výše, v proteomických analýzách je předmětem studia často komplexní vzorek, který vyžaduje provedení separace. Nejběžněji používanými separačními metodami v proteomice jsou vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC), gelová elektroforéza a kapilární elektroforéza (CE). U gelové elektroforézy probíhá detekce po ukončení separace nejčastěji vizualizací zón analytů barvícími činidly ( off-line ), v HPLC a CE jsopu proteiny a peptidy detekovány on-line pomocí UV absorpčního, fluorescenčního nebo MS detektoru. 13 Absorpční detekce využívá silné absorpce peptidové vazby proteinů v oblasti ultrafialového záření vlnových délek nm. Limitujícím faktorem detekce v této oblasti jsou pufry, které nesmí absorbovat UV záření. Proteiny a peptidy obsahující aromatické aminokyseliny mohou být dále detekovány UV absorpčním detektorem nejčastěji v oblasti vlnových délek nm a pomocí detekce laserem indukované fluorescence. Použití laserů místo běžných excitačních zdrojů je v CE nutností kvůli vyššímu výkonu laserů, monochromatičnosti záření a hlavně nižší divergenci paprsků laseru, která umožňuje lepsí zaostření do detekční cely (vnitřní prostor kapiláry). 13,14 Nicméně v CE nativní fluorescenční detekce neposkytuje výrazně vyšší citlivost než absorpční detekce. V CE bylo dosaženo detekčních limitů (LOD) BSA 8, M při excitaci zářením 266 nm (Nd:YAG laser s násobičem frekvence (2x)) 15 a M při 275 nm (Ar-iontový laser) 16. Pro BSA za použití UV absorpčního detektoru bylo dosaženo limitu detekce 7, M BSA 17, což odpovídá rozdílu LOD oproti LIF pouze o jeden řád. Tímto tématem se zde nebudeme zabývat, byla mu věnována bakalářská práce

19 3. Disociace Disociace v plynné fázi je velmi rozšířená technika používaná v tandemové hmotnostní spektrometrii k objasnění struktury analytu. V proteomice nachází uplatnění zejména při stanovení primární struktury peptidů a proteinů. Podle příčiny fragmentace rozeznáváme fragmentace způsobené kolizí s atomem nebo molekulou, záchytem nebo přenosem elektronu, kolizí s povrchem nebo způsobené fotonem. Disociace však může probíhat i v kondenzované fázi, například při syntéze peptidů se využívá selektivity fotodisociace pro zrušení vazby s funkční skupinou chránící reakční místa, kde je reakce nežádoucí apod Fragmentace v plynné fázi Fragmentace v plynné fázi je nejčastěji používána v tandemové MS, která zahrnuje tři základní kroky: výběr prekurzoru (tzv. rodičovského iontu), disociační krok (např. v kolizní cele, iontové pasti nebo jiné pasti) a MS analýzu vzniklých fragmentů. Disociační krok je realizován dodáním energie rodičovskému iontu, který vlivem nadbytku energie disociuje. Jak bylo řečeno výše, dodání energie může být zajištěno kolizí s atomem nebo molekulou (CID, collision-induced dissociation ), záchytem nebo přenosem elektronu (ECD, electron capture dissociation, ETD, electron transfer dissociation ), kolizí s povrchem (SID, surface-induced dissociation ) nebo interakcí s fotonem (PD, photodissociation ). 20,21 K CID protonovaného peptidu žádané m/z dochází po několika stovkách kolizí s atomy vzácného plynu 20, které dodají dostatečnou energii k roztržení kovalentních vazeb. V plynné fázi podléhají disociaci typicky peptidické vazby, které jsou zeslabené protonací a po kolizní aktivaci tedy zanikají. Vlivem CID tedy vznikají fragmenty peptidu lišící se o hmotnost jednoho aminokyselinového rezidua. Hmotnostní spektrum peptidu po CID tedy poskytuje sérii píků, z kterých lze vyvodit sekvenci daného peptidu. 21 Pokud ale peptid obsahuje posttranslační modifikace (PTM), jako např. fosforylace glykosylace, sulfonace nebo další, může být právě vazba modifikující funkční skupiny nejslabší a proto při CID zaniká přednostně. CID spektrum modifikovaného peptidu tedy poskytuje informaci o modifikující skupině. 21 Alternativní metodou k CID peptidů je ECD, kde prekurzorový peptid interaguje s elektrony v magnetickém poli iontového cyklotronu a poté disociuje. Narozdíl od CID 19

20 při ECD nedochází k disociaci jen nejslabších vazeb, ale spíše k náhodné disociaci peptidové kostry proteinu, proto PTM neruší stanovení sekvence peptidu. ECD není možné provádět v nejrozšířenějších současných hmotnostních spektrometrech používajících k zachycení iontů radiofrekvenční elektrické pole (např. iontová past nebo kvadrupól s průletovým analyzátorem), protože nejsou schopny současně zadržet kationty peptidů a elektrony. 22 Nepoužitelnost ECD v běžných hmotnostních spektrometrech používaných v proteomických analýzách zapříčinila vznik ETD, kde je pro transfer elektronu použit anion. Ačkoliv pomocí radiofrekvenční pole nelze současně zadržet kationty a elektrony, kationty a anionty zadržet lze. V těchto přístrojích tedy může dojít k přenosu elektronu z aniontu na kationt. Nadbytečný elektron způsobí přeuspořádání a disociaci podobně jako u ECD. 21 SID zahrnuje přeměnu kinetické energie iontu na vnitřní energii kolizí s povrchem, který bývá obvykle modifikován. 23 Ve fotodisociaci jsou ionty aktivovány absorpcí fotonu, nebo fotonů. V dřívějších exprimentech byly použity UV a viditelné lasery, typicky v paprskových MS 24,25,v dnešní době je populární i multifotonová infračervená fotodisociace (IRMPD) včleněná do iontových pastí 26. Fotodisociace UV zářením tedy zahrnuje odlišný excitační proces a poskytuje fragmentační spektra odlišná od spekter získaných CID, ECD nebo ETD. Nejvýznamnější pozorované reakce po UV excitaci jsou ztráta atomu vodíku a odštěpení postranních řetězců tyrosinu a fenylalaninu. Přičemž odštěpení postranního řetězce fenylalninu probíhá pouze po excitaci zářením vlnové délky 220 nm a odštěpení postranního řetězce tyrosinu pouze při vlnové délce 280 nm. Fotodisociační reakce tedy vedou ke vzniku radikálů, jejichž disociace je specifická a může být použita ke studiu fragmentace, která nebyla pozorována při experimentech s CID a může poskytovat další informace o peptidu. 27 Fotodisociace lez využít i ke stanovení sekvence peptidu, například použitím Nd:YAG laseru emitujícího záření vlnové délky 266 nm v sestavě MALDI-TOF-PD- TOF. Ionty produkované MALDI zdrojem byly separovány dle m/z TOF analyzátorem v lineárním módu, poté byly vybrány prekurzory iontovým deflektorem, ozářeny laserem a analyzovány pomocí reflektoru TOF analyzátoru. Ve spektru peptidu byla pozorována většina fragmentů vzniklých rozštěpením peptidické vazby a dále byly pozorovány fragmenty vzniklé odštěpením postranního řetězce tryptofanu. Oproti 20

21 spektru získanému technikou disociace za iontovým zdrojem (PSD, Post Source Decay ), PD spektrum obsahovalo více píků fragmentů odpovídajících rozštěpení peptidických vazeb a poskytovalo tak více informací o stavbě peptidu Fragmentace v kondenzované fázi Fragmentace v kondenzované fázi není spojena pouze se studiem struktury analytů, ale je používána např. při syntéze peptidů, kde se využívá její selektivity k rozštěpení vazeb chránících skupin v závěru syntetické reakce. 19 Studiu struktury a disociačních procesů se věnoval např. Rogalewicz a kol. 29, který se zabýval mechanizmy fragmentace protonovaných aminokyselin pomocí CID. V těchto experimentech byla fragmentace neselektivní, k získání informací o disociačním procesu je možné použít právě selektivní fotodisociaci. Pochopení základních principů disociace aminokyselin je důležité pro další studium fragmentace peptidů a proteinů způsobené absorpcí fotonů. V předchozí kapitole byla diskutována fotodisociace v plynné fázi, kdy vzorek podléhá fragmentaci po ozáření v plynném stavu v hmotnostním spektrometru. V experimentech, ve kterých byl vzorek sprejován ESI, byly ozařovány kapky roztoku vzorku a desolvatovaný vzorek. Teprve vzniklé fragmenty vstupovaly do hmotnostního spektrometru a bylo zjištěno, že fotodisociační mechanizmy protonovaného tryptofanu a tedy i výsledné fragmenty se liší od fragmentů vzniklých při CID. Tyto disociační kanály jsou spojené s excitovaným stavem, zatímco u CID jde hlavně o statistické disociační kanály základního stavu. 30 Tento mechanizmus zajišťuje pochopení optických vlastností protonovaného tryptofanu v biologickém prostředí, zvláště vysvětluje otázku osudu atomu vodíku v proteinech

22 4. Časově rozlišená fluorescence 4.1 Fluorescence Fotoluminiscence, je jev, při kterém dochází k emisi fotonu po absorpci primárního světelného záření vhodné frekvence, resp. vlnové délky. Absorpcí primárního záření může elektron přejít na vyšší elektronové hladiny a tuto získanou energii může za příznivých podmínek vyzářit jako fluorescenci nebo fosforescenci. Fluorescence nastává při přechodu elektronu z některé z vibračních hladin singletového elektronového stavu zpět na základní hladinu, přičemž spin elektronů na základní a excitované hladině je opačný. Proto je přechod spinově dovolený, a tedy i pravděpodobný, s vysokou rychlostí emise fotonu (10 8 s -1 ). Navzdory tomu, že pozorování dějů probíhajících v řádu nanosekund vyžaduje nákladnou instrumentaci, měření časově rozlišené fluorescence je velmi rozšířené, neboť může poskytnout informace o typu fluoroforu, o jeho bezprostředním okolí, o polaritě prostředí apod Další pochody, které mohou nastat po absorpci světla popisuje Jablonského diagram (obr. 7). S 2 vnitřní konverze s S 1 vibrační relaxace mezisystémový přechod s absorpce s fluorescence 10 hν -9 s F T 1 hν A hν A hν A hν A hν F fosforescence hν P 10-3 s hν P S Obr. 7: Jablonského diagram 22

23 4.2 Charakteristiky fluorescence 33,34 Intenzita fluorescence Intenzita fluorescence je definována jako počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času. Závislost intenzity fluorescence na koncentraci fluoreskující látky je obdobou Bouger-Lambert-Beerova zákona a má tvar: clε F = k ϕ Φ ( 1 10 ), (1) 0 kde F je fluorescenční signál, k je podíl emitovaných fotonů, které dorazí na detektor, Φ 0 je počáteční tok excitačního záření, c koncentrace fluoreskující látky, l tloušťka kyvety, ε je molární absorpční koeficient a φ výtěžek fluorescence definovaný vztahem: k f ϕ =, (2) k + k + k f kde k f je rychlost emise (fluorescence), k i rychlost nezářivých přechodů probíhajících např. v důsledku interakcí s okolím a k x rychlost mezisystémových přechodů. i x Kvantový výtěžek fluorescence Kvantový výtěžek fluorescence je podíl počtu vyzářených světelných kvant (N emit ) a počtu kvant absorbovaných (N abs ): N emit ϕ K =, (3) N abs Spektrální charakteristiky fluorescence Excitační spektrum charakterizuje závislost intenzity fluorescence na vlnové délce excitačního záření (vlnočtu, frekvenci) při konstantní vlnové délce emitovaného záření. Tento typ spektra slouží pro výběr nejvhodnějšího excitačního záření pro daný vzorek. Emisní spektrum popisuje závislost intenzity fluorescence na vlnové délce emitovaného záření (vlnočtu, frekvenci) při konstantní vlnové délce budícího záření. 23

24 4.3 Měření časově rozlišené fluorescence Excitací získanou energii molekula ztrácí návratem na základní energetickou hladinu. Proces návratu z excitovaného stavu může nastat mnoha zářivými i nezářivými pochody, které jsou velmi silně ovlivněny okolním prostředím. Citlivým indikátorem vlivu prostředí na excitovaný stav je průměrná doba, po kterou zůstává molekula v excitovaném stavu. Měřením této doby života fluorescence fluoreskující molekuly lze odhadnout důležité vlastnosti molekuly a jejího bezprostředního okolí jako například rychlost kolizních srážek vedoucích ke zhášení fluorescence, reakce excitovaného stavu, míru relaxace excitovaného stavu rozpouštědlem, změny v anizotropii fluorescence, přítomnost nečistot, teplotu nebo viskozitu prostředí. Návrat molekuly z excitovaného do základního stavu, a tedy dohasínání fluorescence, trvá několik nanosekund. Měření takto rychlých dějů s vysokou přesností vyžaduje nákladná zařízení. Setkáváme se s dvěma přístupy měření doby života fluorescence fluoroforu: (a) přímé měření doby života fluorescence sledováním vyhasínání fluorescence v čase po excitaci pulzem světla velice krátkého trvání (měření v časové doméně) a (b) nepřímé měření doby vyhasínání sledováním změn v harmonických charakteristikách paprsku světla (měření ve frekvenční doméně). Donedávna bylo velmi obtížné tato měření realizovat, vývoj komerčních přístrojů pro měření doby života fluorescence umožnila až dostupnost zdrojů světla emitujících velmi krátké pulzy (<10 ps), dostupnost velmi rychlých detektorů a také rychlé záznamové elektroniky Měření vyhasínání fluorescence v časové doméně Excitací fluoreskující molekuly nekonečně krátkým pulzem světla dojde ke vzniku počáteční populace (N 0 ) fluoroforů v excitovaném stavu. Rychlost vyhasínání fluorescence této počáteční excitované populace je dána rovnicí: dn( t ) = ( k f + kd ) N( t ), (4) dt kde N(t) je počet molekul v excitovaném stavu v čase t následujícím po excitaci, k f je rychlostní konstanta emise a k d je rychlostní konstanta nezářivých přechodů. Integrací získáme: kde τ = (k f +k d ) -1 a nazývá se doba života excitovaného stavu. Dosazením 24 t τ N( t ) = N 0 e, (5)

25 F( t ) = k f N( t ) a F0 = k f N0, (6) do rovnice (5) získáme: t τ F( t ) = F 0 e, (7) kde F(t) je intenzita fluorescence v čase t, F 0 intenzita fluorescence v čase t = 0 a τ je doba života fluorescence odpovídající času, kdy intenzita fluorescence poklesne na 1/e původní hodnoty. Graf závislosti ln F(t) na t má charakter přímky, jehož směrnice má hodnotu τ -1 a umožňuje tedy stanovení doby života fluorescence. F 1,00 excitační pulz fluorescence 1/e 0,00 0 τ Obr. 8: Teoretický průběh vyhasínání fluorescence t Mnohé procesy, jako zhášení fluorescence, matricový efekt (v pevných vzorcích) a další reakce excitovaného stavu, soutěží s vlastní relaxační dynamikou fluoroforu a ovlivňují tak společně s okolím fluoroforu vyhasínání fluorescence. Proto se v praxi setkáváme spíše než s jednoduchou exponenciální závislostí se součtem několika exponenciálních závislostí. Metody měření v časové doméně Běžné komerční přístroje používané k měření dob života fosforescence (mikrosekundy až několik sekund), nejsou vhodná pro měření dob života fluorescence kvůli krátkým dobám dohasínání (nanosekundy). Klíčové součásti přístroje pro měření časově rozlišené fluorescence v řádu nanosekund jsou zdroj excitačního záření, detektor a záznamové zařízení. Pokrok v elektronice umožnil vývoj zdrojů světla, které emitují pulzy subnanosekundových šířek. Tyratronová pulzní záblesková lampa generuje pulzy světla o šířce 1-10 s a představuje tak použitelný zdroj za příznivou cenu. Pulzy s šířkou 25

26 několika set pikosekund vytváří LED 35, pulzy šířky několika pikosekund a dokonce i několika desítek femtosekund vytváří lasery, a některé jsou tak ideálními excitačními zdroji pro měření v časové doméně. Typickým detektorem je fotonásobič, lavinová fotodioda, fotonásobič s multikanálkovou destičkou nebo klíčovaný fotonásobič; druhem záznamového zařízení se jednotlivé metody měření liší. Náhodné vzorkování (RIS, Random Interleaved Sampling ) Po každém excitačním pulzu se velmi krátkým napěťovým pulzem zvýší zisk fotonásobiče. Takto se získá malá část (vzorek) křivky vyhasínání, postup se opakuje s náhodným časovým posunem až se navzorkuje celá křivka vyhasínání. Naměřená data z jednotlivých pulzů mohou být zpracována boxcar integrátorem nebo multikanálovým analyzátorem. Digitální osciloskop V dnešní době jsou na trhu digitální osciloskopy s dobou náběhu až 10 ps a vzorkovací frekvencí až 50 GS.s -1 (GS.s -1 = GSamples.s -1 ), což odpovídá 20 ps.bod -1. Tyto parametry činí osciloskopy jednou z možností pro studium procesů v subnanosekundovém řádu. Navíc digitální osciloskopy umožňují zaznamenaná data uložit a dále je zpracovávat. Časově korelované počítání jednotlivých fotonů (TCSPC, Time-Correlated Single- Photon Counting ) Narozdíl od většiny metod měření doby života fluorescence, kde je žádoucí vysoká intenzita fluorescence, TCSPC vyžaduje nízké intenzity. V praxi jsou pulzy emise nastaveny tak, aby na každých 20 excitačních pulzů vznikl pouze jeden fotoelektron na fotokatodě rychlého fotonásobiče nebo lavinové diodě pro počítání jednotlivých fotonů (SPAD, Single Photon Avalange Diode ). Podobně jako u ostatních metod je měřen časový posun mezi excitačním zábleskem a příchodem proudového pulzu na anodě fotonásobiče. V typickém uspořádání generuje pulzní excitační zdroj excitační pulz a současně startovní pulz, který je veden do TAC ( Time to Amplitude Converter ). Následuje stop pulz, který je generován fluoreskujícím vzorkem prostřednictvím emitovaného fotonu detekovaného fotonásobičem. Amplituda výsledného výstupu TAC je přímo úměrná časovému posunu, který je mezi startovním pulzem a stop pulzem. Pokud není 26

27 detekován žádný foton, TAC je resetován na nulu. Tento výstupní pulz z TAC je potom předán do MCA (multikanálový analyzátor = Multichannel Analyzer ). MCA používaný v módu pro analýzu výšky pulzu digitalizuje výšku vstupu a přiřazuje kanál odpovídající této hodnotě. Výstupem je histogram výskytu stop pulzu v daném čase, histogram má podobný tvar jako křivka vyhasínání vzorku, protože pravděpodobnost výskytu stop pulzu je přímo úměrná pravděpodobnosti emise fotonu vzorkem v daném čase. V případech, kdy je doba excitačního pulzu srovnatelná s dobou vyhasínání fluorescence, je vhodné provést dekonvoluci pozorovaného signálu pomocí charakteristik excitačního zdroje. 27

28 4.3.2 Měření vyhasínání fluorescence ve frekvenční doméně Vzorek je excitován kontinuálním zdrojem, jehož intenzita záření je modulována modulátorem na výsledný sinový průběh: F exc ( t ) = DC + AC sinϖt (8) Pozorovaná fluorescence má také sinový průběh, ale jiný fázový posun a/nebo stupeň modulace: F emit exc exc ( t ) = DC + AC sin( ϖt Φ ), (9) kde F exc (t) a F emit (t) jsou časově závislé intenzity fluorescence excitačního a emit emitovaného záření, DC exc a DC emit jsou stejnosměrné a AC exc a AC emit střídavé složky záření, ω úhlová rychlost, t čas a Φ fázový posun. Z fázového posunu Φ lze vypočítat dobu života fluorescence τ podle rovnice: kde ω = 2πf, f je modulační frekvence. emit tan Φ =ϖ, τ (10) Stupeň modulace excitačního paprsku M exc a fluorescence M emit, stanovený měřením AC a DC komponent signálu podle vztahu: AC M = souvisí s dobou života fluorescence podle vztahu: M kde M je demodulace. 33 AC exc emit exc =,M emit, (11) DCexc DCemit M 1 emit = =, (12) M 2 2 exc 1+ ω τ 28

29 F Φ excitace AC emise DC t Obr. 9: Teoretický průběh vyhasínání fluorescence při měření ve frekvenční doméně Měření ve frekvenční doméně je upřednostňováno pro vícesložkové systémy. Pro takové systémy se předpokládá, že všechny fluorofory jsou nezávislé a přispívají nezávisle k pozorované fluorescenci svými dobami života fluorescence. Modulátory Modulátory světla jsou zařízení používaná pro modulaci excitačního záření pro měření vyhasínání fluorescence ve frekvenční doméně. Komerčně dostupné jsou zařízení akusto-optická nebo elektro-optická. Elektro-optické zařízení jako Kerrova nebo Pockelova cela mají dobu náběhu menší než 1 ns a mohou modulovat signály až do frekvence 1 GHz. Toto zařízení obsahuje krystal vhodné látky, například vápence, který podle vloženého napětí na krystal mění index lomu. Pockelovou celou se dá modulovat intenzita laserového záření nebo vytvářet krátké pulzy laseru. Donedávna bylo nevýhodou Pockelovy cely nepropustnost UV záření a nutnost velkého elektrického pole, dnešní Pockelovy cely jsou propustné pro UV záření, potřebují nižší elektrická pole a pracují při různých frekvencích. 5 29

30 III. CÍLE PRÁCE Tato práce navazuje na bakalářskou práci, která byla zaměřena na použití Nd:YAG laseru (4x) pro detekci laserem indukované nativní fluorescence aminokyselin, peptidů a proteinů v kapilární zónové elektroforéze. Diplomová práce se věnuje dalším dvěma oblastem využití UV laserů k analýze proteinů: fotodisociaci a měření časově rozlišené fluorescence. Cílem první části je prověřit možnost využití fotodisociace v kondenzované fázi pro studium struktury biomolekul (aminokyselin, peptidů a proteinů) metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Pozornost bude soustředěna na nalezení fragmentů vzniklých fotodisociací, které by mohly být využity za účelem stanovení sekvence, zjištění pozice, případně fosforylace aromatické aminokyseliny obsažené ve struktuře peptidu nebo proteinu. Cílem druhé části diplomové práce bylo sestavení instrumentace pro měření časově rozlišené fluorescence v nanosekundové škále. V této části diplomové práce je využita již sestavená instrumentace pro off-line spojení CZE s MALDI a detekcí nativní fluorescence peptidů a proteinů. Instrumentace pro měření časově rozlišené fluorescence zde umožní analýzu analytů v dalším rozměru. Doby vyhasínání fluorescence mohou být cennou informací o stavu analytu, např. o konformaci proteinu apod. V případě rozdílných dob života fluorescence analytu a interferentu, může být instrumentace využita ke zlepšení poměru S/N (signál/šum) nativní fluorescence po CZE. 30

31 IV. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 31

32 Chemikálie Chemikálie pro fotodisociaci acetonitril (99,9% CH 3 CN; Scharlau Chemic S. A., Barcelona, Španělsko) ACTH fragment = fragment adrenokortikotropního hormonu (100% RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) angiotensin I (97% DRVYIHPFHL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bradykinin (99% RPPGFSPFR; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) L-fenylalanin ( 99,0% C 9 H 11 NO 2 ; Fluka Chemie, Buchs, Německo) kyselina 4-hydroxy-3-methoxyskořicová (C 10 H 10 O 4 ; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (97% C 10 H 7 NO 3 ; Aldrich, Steinheim, Německo) kyselina trifluoroctová (98% C 2 HF 3 O 2 ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) peptid DDK (DDKKYTNREEC; Ústav experimentální biologie, MU) peptid HRT (HRTSSVPEY; Ústav experimentální biologie, MU) renin substrát tetradekapeptid (96% DRVYIHPFHLLVYS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) L-tryptofan (98% C 11 H 12 N 2 O 2 ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) L-tyrosin ( 99,0% C 9 H 11 NO 3 ; Fluka Chemie, Buchs, Německo) Chemikálie pro časově rozlišenou fluorescenci 2-aminobenzoová kyselina (C 7 H 7 NO 2 p. a.; Ústav chemie, MU) bengálská červeň B (C 20 H 4 Cl 4 I 4 O 5 ; Lachema, Praha, ČR) dusičnan dysprositý + bis(difenylfosforyl)butan Dy(NO 3 ) 3 + DPPBO 2 (DyN 3 O 9 + C 28 H 28 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) dusičnan dysprositý + bis(difenylfosforyl)ethan Dy(NO 3 ) 3 + DPPEO 2 (DyN 3 O 9 + C 26 H 24 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) dusičnan dysprositý + bis(difenylfosforyl)hexan Dy(NO 3 ) 3 + DPPHO 2 (DyN 3 O 9 + C 30 H 32 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) hexahydrát chloridu europitého + bis(difenylfosforyl)ethan EuCl 3.5H 2 O + DPPEO 2 (EuCl 3.6H 2 O + C 26 H 24 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) hexahydrát chloridu europitého + bis(difenylfosforyl)hexan EuCl 3.5H 2 O + DPPHO 2 (EuCl 3.6H 2 O + C 30 H 32 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) 32

33 lysozym (95% MRSLLILVLC FLPLAALGKV FGRCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA KFESNFNTQA TNRNTDGSTD YGILQINSRW WCNDGRTPGS RNLCNIPCSA LLSSDITASV NCAKKIVSDG NGMNAWVAWR NRCKGTDVQA WIRGCRL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) propan-1,2,3-triol (C 3 H 8 O 3 p. a.; Lachema, Praha, ČR) pentahydrát dusičnanu europitého + bis(difenylfosforyl)butan Eu(NO 3 ) 3.5H 2 O + DPPBO 2 (EuN 3 O 9.5H 2 O + C 28 H 28 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) pentahydrát dusičnanu europitého + bis(difenylfosforyl)hexan Eu(NO 3 ) 3.5H 2 O + DPPHO 2 (EuN 3 O 9.5H 2 O + C 30 H 32 O 2 P 2 ; Ústav chemie, MU) L-tryptofan (98% C 11 H 12 N 2 O 2 ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) L-tyrosin ( 99,0% C 9 H 11 NO 3 ; Fluka Chemie, Buchs, Německo) Ostatní chemikálie kyselina chlorovodíková (30% HCl; MERCK, Darmstadt, Německo) Pro přípravu roztoků byla používána voda redestilovaná v křemenné aparatuře Heraeus, Hanau, Německo. 33

34 Přístroje a vybavení Hmotnostní spektrometr MALDI-TOF model Axima CFR (obr. 10), Kratos Analytical Shimadzu Corporation (Velká Británie) technické specifikace: dusíkový laser 337 nm, maximální výkon 6 mw při frekvenci 10 Hz. Software Kratos Analytical Launchpad verze Obr. 10: MALDI-TOF Axima CFR (36) Digitální osciloskop model WaveRunner 6050 (obr. 11), LeCroy, New York, NY, USA technické specifikace: ; 500 MHz, 5 GS.s -1, doba náběhu 750 ps. Software osciloskopu verze , XStream Browser verze Obr. 11: WaveRunner 6050 (37) Laser model LCS-DTL-382QT (obr. 12), Laser - compact Co. Ltd., Moskva, Rusko technické specifikace: DPSS laser Nd:YAG s násobičem frekvence (4x) emitující záření vlnové délky 266 nm, výkonu >6 mw při 2,5 3 khz (parametry výrobce). Laser byl vybaven vlastní ovládací jednotkou se zdrojem napětí od výrobce Obr. 12: DPSS laser Nd:YAG LCS-DTL-382QT (38) Fotonásobič model H , Hamamatsu Photonics K.K., Iwata City, Japonsko technické specifikace: doba náběhu 780 ps, spektrální citlivost 185 nm 650 nm 34

35 Spektrofluorimetr Aminco Bowman model AMINCO Bowman Series 2 (AB2), Thermo Spectronic, Rochester, NY, USA technické specifikace: spektrofluorimetr vybaven mřížkovými monochromátory, klíčovaným fotonásobičem, 150W xenonovou lampou pro měření excitačních a emisních spekter a 7W zábleskovou xenonovou lampou pro měření vyhasínání fluorescence metodou RIS Spektrofluorimetr Jobin Yvon model FluoroMax -4 (FluoroMax4), HORIBA Jobin Yvon Inc., Edison, NJ, USA technické specifikace: spektrofluorimetr vybaven reflexní optikou, xenonovou lampou pro měření excitačních a emisních spekter a NanoLED nm pro měření vyhasínání fluorescence v rozmezí dob vyhasínání 200 ps 0,1 ms metodou TCSPC Ke zpracování výsledků byl použit software MS Excel 2000 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) a software osciloskopu (viz výše). Ostatní přístrojové vybavení a optické součástky byly předmětem optimalizace experimentální sestavy a jsou popsány dále v textu. 35

36 6. Fotodisociace Jak bylo uvedeno v teoretické části, fotodisociaci je možné použít ke stanovení primární struktury peptidů a proteinů pomocí tandemové MS, kde fotodisociace probíhá v plynném stavu. Byla popsána i fotodisociace látek ionizovaných ESI 30, zde fotodisociace probíhá v roztoku až v desolvatací vzniklé pevné látce. Náplní této části diplomové práce bylo ověřit možnosti fotodisociace probíhající v roztoku a v pevném stavu přímo na MALDI terčíku s následnou MS analýzou MALDI-TOF-MS. 6.1 Experimentální uspořádání Kapalný nebo pevný vzorek byl nanesen na MALDI terčík, poté byl vzorek po definovanou dobu ozařován Nd:YAG laserem (4x) zářením vlnové délky 266 nm. Následně byl vzorek smísen s roztokem matrice metodou quick & dirty a vysušen v sušičce. Analýza MALDI-TOF-MS byla prováděna na přístroji Axima CFR. 6.2 Fotodisociace aromatických aminokyselin Pochopení mechanizmu fragmentace způsobené absorbovaným ultrafialovým zářením aromatických aminokyselin je důležité pro další studium fotodisociace peptidů a proteinů. Studovány byl aminokyseliny tryptofan, tyrosin a fenylalanin. Pozornost byla věnována výběru matrice, optimalizaci doby působení UV záření a vlivu skupenského stavu vzorku. Výběr matrice byl proveden na základě empirie, testovány byly matrice CHC ( α -cyano-hydroxycinnamic acid, kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová) a FA ( ferrulic acid, kyselina 4-hydroxy-3-methoxyskořicová). Při optimalizaci doby působení UV záření byly testovány doby 10 s, 30 s, 300 s a 600 s. Vzorky byly ozařovány na MALDI terčíku ve vodném roztoku nebo desolvatované. Vodný roztok byl ozařován nanesený na MALDI terčíku, desolvataci bylo zabráněno průběžným přidáváním redestilované vody. Desolvatované vzorky byly připraveny nanesením 2 µl vodného roztoku na MALDI terčík, vysušením při laboratorní teplotě (10 minut). Takto vznikl film pevného podílu vzorku průměru ~2 mm. Po ozáření vzorku byl přidán roztok matrice. 36

37 Vyhodnocení Pro kalibraci TOF-MS byl zvolen peptid bradykinin s monoizotopickou m/z = 1060,57 Da; dále sodík s monoizotopickou m/z = 22,99 Da a jeden z fragmentů matrice vykazující vysokou intenzitu (CHC: m/z = 190,05 Da; FA: m/z = 177,06 Da). Roztoky matrice byly připravovány o koncentraci 10 mg.ml -1 v 50% vodném roztoku acetonitrilu (v/v) s 0,1% TFA (kyselina trifluoroctová), metoda nanášení na MALDI terčík quick & dirty. Výběr matrice Výběr matrice zahrnoval MS analýzu vzorků (10,0 µg.ml -1 W, 10,0 µg.ml -1 Y, 10,0 µg.ml -1 F) připravených s matricemi CHC a FA. Sledován byl výskyt fragmentů matrice a intenzita píku molekulového iontu aminokyseliny. Při použití FA jako matrice se v hmotnostních spektrech aminokyselin vyskytovalo méně píků fragmentů než při použití CHC. Soudě podle intenzity píků molekulárních iontů aminokyselin docházelo v přítomnosti CHC k účinnější ionizaci. U vzorků připravených s FA byly píky molekulárních iontů aminokyselin charakterizovány nižším poměrem S/N. Proto byla v dalších experimentech používána CHC. Optimalizace doby působení záření Testovány byly doby působení UV záření 10 s, 30 s, 300 s a 600 s na vodný roztok tryptofanu 11,0 µg.ml -1. Po 10s působení UV záření laseru bylo dosaženo výrazného snížení intenzity píku aminokyseliny. Po 60s působení se již pík aminokyseliny v hmotnostním spektru nevyskytoval. Pro další experimenty byla tedy zvolena doba působení 300 s, aby bylo s jistotou dosaženo fragmentace aminokyseliny. Výsledky Byly provedeny fotodisociační experimenty aminokyselin tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu, vzorky byly ozařovány jak v roztoku, tak v pevném stavu. Na obr. 13 a 14 jsou uvedeny pro ilustraci typická MALDI hmotnostní spektra tryptofanu neozářeného, ozářeného a hmotnostní spektrum CHC. Pík odpovídající WH + je na obr. 13 označen šipkou. 37

38 Je patrné, že ve spektru ozářeného tryptofanu tento pík molekulárního iontu aminokyseliny chybí. Na obr. 14 je výřez hmotnostního spektra v rozmezí Da, bylo pozorována výrazná změna intenzit píků, ale žádné píky fragmentů vzniklých fotodisociací zářením 266 nm nebyly nalezeny. Jak bylo řečeno výše, byla pozorována absence píku aminokyseliny v hmotnostních spektrech ozářených vzorků, lze tedy prohlásit, že k fotodisociaci dochází. Dále byl sledován vznik nových fragmentů. Bohužel nebyly objeveny žádné fragmenty, o kterých by se s jistotou dalo prohlásit, že vznikly jednoznačně pouze v důsledku fotodisociace zářením laseru 266 nm. Píky vzniklých fragmentů se buď překrývaly s píky matrice nebo píky fragmentů aminokyseliny vzniklých působením dusíkového laseru při desorpci a ionizaci (337 nm). Další píky fragmentů nepřekrývajících se s jinými píky byly nízké intenzity (S/N < 3), proto je nelze považovat za důkaz vzniku fragmentů dané efektivní hmotnosti. 38

39 Hmotnostní spektrum W (CHC) M r (W) = 204,23 WH Hmotnostní spektrum po 60 s v roztoku ozařovaného W (CHC) Hmotnostní spektrum CHC Obr. 13: Hmotnostní spektra W (CHC), ozařovaného W (CHC) v roztoku po 60 s a CHC 39

40 Hmotnostní spektrum W (CHC) M r (W) = 204,23 Hmotnostní spektrum v roztoku po 60 s ozařovaného W (CHC) M r (W) = 204,23 Hmotnostní spektrum CHC Obr. 14: Hmotnostní spektra W (CHC), ozařovaného W (CHC) v roztoku po 60 s a CHC 40

41 6.3 Fotodisociace peptidů Na kalibraci TOF-MS byla použita směs peptidů CALMIX obsahující peptidy bradykinin (m/z = 1060,57 Da), angiotenzin (1296,69 Da), renin substrát (1759,94 Da nebo 1760,95 Da) a fragment adrenokortikotrpního hormonu (2466,21 Da). Roztoky matrice byly připravovány o koncentraci 10 mg.ml -1 v 50% vodném roztoku acetonitrilu (v/v) s 0,1% TFA (kyselina trifluoroctová), metoda nanášení na MALDI terčík quick & dirty. Byly provedeny fotodisociační experimenty peptidů, vzorky byly ozařovány v roztoku po dobu 30 s, 60 s, 120 s a 300 s. Jako příklad jsou na obrázku 15 uvedeny výřezy MALDI hmotnostních spekter neozářeného a ozářeného (60 s) peptidu DDK. Bylo pozorováno zvýšení intenzit píků fragmentů, ale tyto píky se objevují i ve spektru neozářeného vzorku, proto nelze jednoznačně prokázat, že vznikly působením záření 266 nm. V hmotnostních spektrech ozářených vzorků bylo pozorováno snížení poměru S/N píků molekulárních iontů peptidů, lze tedy prohlásit, že k fotodisociaci dochází. Dále byl sledován vznik nových fragmentů. Došlo pouze ke zvýšení intenzity píků fragmentů objevujících se i v neozářených vzorcích. Ze zvýšení intenzity píků nelze v MALDI-TOF-MS usuzovat, že tyto fragmenty vznikly fotodisociací způsobenou UV zářením vlnové délky 266 nm. Dále byly provedeny experimenty s fotodisociací proteinů. V hmotnostních spektrech ozářených proteinů byl pozorováno snížení intenzity píku proteinu oproti neozářenému. Nicméně z m/z vzniklých fragmentů nelze vyvodit užitečnou analytickou informaci, protože se ve spektru vyskytovalo příliš mnoho nespecifických píků v oblasti nižších m/z. 41

42 1[c].C2 Data: 000DDKd20001.D2 10 Apr :53 Cal: prikryl20 10 Apr :51 Kratos PC Axima CFR V2.4.1: Mode reflectron1, Power: 140, 1500 (bin 155) %Int. 1.3 mv[sum= 541 mv] Profiles Unsmoothed Hmotnostní spektrum DDK (CHC) M r =1399,63 Da [c].C2 %Int [c].A2 Hmotnostní spektrum v roztoku po Mass/Charge Data: 030DDKc20001.C2 10 Apr :59 Cal: prikryl20 10 Apr :51 Kratos PC Axima CFR V2.4.1: Mode reflectron1, Power: 140, 1500 (bin 155) mv[sum= 2933 mv] Profiles Unsmoothed s ozařovaného DDK (CHC) Mass/Charge Obr. 15: Hmotnostní spektra DDK (CHC), ozařovaného DDK (CHC) v roztoku po 60 s 1[c].D2 42

43 7. Časově rozlišená fluorescence Tato kapitola pojednává o sestavení experimentální sestavy pro měření časově rozlišené fluorescence. Dále se zabývá ověřením funkce sestavy a její charakterizací. 7.1 Instrumentace Optická sestava Jedním z klíčových prvků optické části experimentální sestavy je laser emitující ultrafialové záření vlnové délky 266 nm. Minoritní emise zeleného světla o vlnové délce 532 nm byla odstraněna optickým hranolem. Ultrafialové záření dopadá na vzorek v kapalném nebo pevném stavu nanesený na MALDI terčík. Kolekce emitované fluorescence byla zajišťována reflexním mikroskopovým objektivem (Ealing Catalog Inc., Rocklin, CA, USA; model , numerická apertura 0,5; zvětšení 36x, odrazové plochy upraveny pro vyšší reflektanci v oblasti UV záření) a po odfiltrování rozptýleného záření laseru long-pass filtry (Omega Optical, Inc., Brattleboro, VT, USA; 275 AELP s cut-on vlnovými délkami 269 nm (5 %) a 275 nm (50 %); 298 AELP s cut-on vlnovými délkami 295 nm (5 %) a 298 nm (50 %)) je fluorescenční záření zaostřeno na štěrbinu, která propustí maximum fluorescence a omezí vliv rozptýleného záření laseru. K výběru vlnové délky fluorescence jsou před fotonásobič zařazeny interferenční filtry, použitý interferenční filtr je upřesněn u každého experimentu (viz obrázek 16). Pro umístění MALDI terčíku a optických prvků byla využita instrumentace pro off-line detekci pomocí MALDI-TOF a laserem indukované fluorescence po nanesení na MALDI terčík

44 fotonásobič interferenční filtry laser štěrbina optický hranol long-pass filtry reflexní mikroskopový objektiv MALDI terčík se vzorkem Obr. 16: Schéma optické sestavy pro měření časově rozlišené fluorescence Elektronická sestava Signál fotonásobiče byl zaznamenán digitálním osciloskopem, spuštění záznamu osciloskopu bylo synchronizováno s pulzy laseru pomocí synchronizačních pulzů (1 µs, 2 V na 50Ω vstupu parametry výrobce) generovaných řídící jednotkou laseru. Propojení fotonásobiče a řídící jednotky laseru s osciloskopem bylo realizováno stíněnými BNC kabely délky 78 cm (50 Ω; 101,3 pf.m -1 paramety výrobce). 44

45 fotonásobič řídící jednotka laseru laser mikroskopový objektiv MALDI terčík osciloskop Obr. 17: Fotografie experimentální sestavy pro měření časově rozlišené fluorescence Sběr a vyhodnocení dat Sběr dat byl prováděn osciloskopem LeCroy WR6050 s šířkou pásma 500 MHz. Osciloskop je vybaven několika módy sběru dat: Normal, RIS a Sequence. Záznam signálu je spuštěn po dosažení nastavených hodnot signálu ( trigger ). V módu Normal jsou všechna data zaznamenána A/D převodníkem, zpracována, načtena softwarem osciloskopu a zobrazena. Poté je osciloskop připraven spustit další záznam. Při rychle se opakujících dějích není signál, který přichází během zpracování a zobrazení dat, zaznamenán a zpracován. Proto je osciloskop vybaven režimem Sequence, při kterém je schopen rozdělit paměť A/D převodníku na segmenty, do kterých ukládá pouze výseky dat a až po zaznamenání nastaveného počtu výseků jsou data zpracována softwarem (viz obrázek 18). V tomto režimu je osciloskop schopen zaznamenat děje opakující se s frekvencí až 125 khz, není tedy omezen rychlostí přenosu dat, softwaru a podobně. Při takto vysoké opakovací frekvenci lze záznam dat osciloskopem použít pro on-line detekci časově rozlišené fluorescence v separačních metodách jako např. CZE. 45

46 V obou těchto režimech je nejvyšší vzorkovací frekvence 5 GS.s -1, což odpovídá 200 ps.bod -1. Pro zvýšení rozlišení časové osy slouží režim náhodného vzorkování RIS (Random Interleaved Sampling), ve kterém je dosaženo vzorkovacích frekvencí až 200 GS.s -1, což odpovídá rozlišení 5 ps.bod -1, nevýhodou může být kolísání signálu, protože je výsledný signál složen z bodů různých záznamů. Jelikož je osciloskop omezen šířkou pásma 500 MHz, 5GS.s -1 je odpovídající šířce pásma a RIS nebyl používán. segment 1 segment 2 segment 3 trigger trigger trigger Obr. 18: Schématické zobrazení principu zpracování signálu v módu Sequence K vyhodnocení vyhasínání fluorescence se nejčastěji využívá komerční software dodávaný výrobcem přístroje pro měření dob života fluorescence, jako např. software DAS6 (Decay Analysis Software 6 40 ) firmy Jobin Yvon nebo AB2 (Aminco Bowman 2) firmy Thermo Spectronic. V případě, kdy je šířka excitačního pulzu ve srovnání s vyhasínáním fluorescence zanedbatelná, se experimentální závislost proloží exponenciálou nebo součtem několika exponenciál. Další možností je proložit logaritmovanou experimentální závislost přímkou. V případech, kdy jsou doby excitačního pulzu a vyhasínání fluorescence srovnatelné, je potřeba provést dekonvoluci naměřeného signálu pomocí excitačního pulzu naměřeného nefluoreskující látkou 46

47 způsobující pouze rozptyl excitačního záření. Dekonvoluce se nejčastěji provádí metodou nejmenších čtverců nebo Laplaceovou transformací 33. V této práci bylo vyhodnocování dat prováděno po vynásobení signálu výrazem (-1) proložením exponenciální závislostí nebo součtem exponenciálních závislostí metodou nejmenších čtverců pomocí doplňku programu MS Excel Řešitel. Doplněk Řešitel lze použít k určení maximální nebo minimální hodnoty jedné buňky změnou hodnot jiných buněk, v našem případě byl použit k minimalizaci součtu čtverců rozdílu experimentální a teoretické křivky. Na obrázku 19 je zobrazeno dialogové okno pro nastavení možností Řešitele s hodnotami použitými při vyhodnocování dat. Obr. 19: Nastavení Řešitele 47