SENZORICKY VÝZNAMNÉ LÁTKY

Transkript

1 SENZORICKY VÝZNAMNÉ LÁTKY AROMATICKÉ (TĚKAVÉ) LÁTKY Fyzikálně-chemické vlastnosti významné pro stanovení aromatických sloučenin: bod varu tlak nasycených par rozměry molekuly tvar molekuly přítomnost funkčních skupin Techniky používané pro izolaci těkavých složek DESTILACE EXTRAKCE - rozpouštědlem - na tuhou fázi -SPE MIKROEXTRAKCE NA PEVNOU FÁZI - SPME HEAD-SPACE - statická - dynamická 1

2 IZOLAČNÍ A KONCENTRAČNÍ TECHNIKY Extrakce organickým rozpouštědlem - volba podle typu matrice (tuk, voda, pigmenty a další netěkavé látky) superkritická fluidní extrakce (SFE) - nejčastěji oxid uhličitý problém - koizolace velkého množství netěkavých látek Destilace nejčastěji s vodní parou, šetrnější při sníženém tlaku ( nižší teploty menší tvorba artefaktů) Kontinuálné extrakce rozpouštědlem chladič rozpouštědlo(ether) vodní lázeň ::: ::: Vzorek nápoje Otvory na dně Zakoncentrování vodných kondenzátů extrakce nemísitelným rozpouštědlem nebo SPE 2

3 Optimalizace izolačního kroku SPME mikroextrakce pomocí chemicky modifikovaných křemenných optických vláken ( mm průměr), desorpce teplem Princip SPME Distribuční konstanta: K = c s / c aq SPME GC: nástřik bez rozpouštědla Možnost užití kolon s tenčím filmem a menším vnitřním průměrem Zvýšení separační účinnosti Zkrácení doby analýzy 3

4 SPME HEAD SPACE TECHNIKY vyšetření těkavých látek v parní fázi nad vzorkem Základní varianty : ROVNOVÁŽNÁ - statická distribuční koeficient : K = Cs / Cv zvýšení přídavkem solí významné matriční efekty 4

5 HEADSPACE: statická varianta K c v c s Dynamická stripování vzorku inertním plynem vyšší citlivost větší množství izolovaných složek (termodynamická rovnováha není dosažena) metoda purge and trap izolace těkavých látek do proudu plynu zachycení na sorbentu při nízké teplotě tepelná desorbce do GC problémy s vlhkostí HEADSPACE: dynamická varianta 5

6 Identifikace a kvantifikace těkavých organických sloučenin metodou GC-MS GC-MS systém Agilent HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Unikátní způsob identifikace i velmi nízkých koncentrací organických sloučenin Princip: 1. krok: IONIZACE CH3OH + 1 elektron CH3OH+.+ 2 elektrony CH3OH+.(molecular ion) CH2OH+(fragment ion) + H. nebo CH3OH+.(molekularní ion) CH3+(fragment ion) +.OH 2. krok: SEPARACE IONTŮ Funkce kvadrupolového hmotnostního analyzátoru 6

7 Funkce hmotnostního analyzátoru typu iontová past Funkce hmotnostního analyzátoru typu time-of-flight - TOF 3. krok: DETEKCE ZÁZNAM SPEKTRA hmotnostní spektrum methanolu 7

8 < TARGET="display"> STUDIUM SLOŽEK AROMA POMOCÍ GC VE SPOJENÍ S OLFAKTOMETRIÍ Cíl identifikace významných nositelů aroma - látek se senzorickou relevancí profil získaný při GC analýze nemusí odrážet profil vlastního aroma - některé látky mohou mít velmi nízké podnětové prahy vnímání a na čichovém vjemu se podílí maximálně A. MĚŘENÍ INTENZITY AROMA V ČASE MĚŘENÍ INTENZITY AROMA V ČASE - pomocí 16 bodové stupnice - komputerizovaný záznam - osmagram 8

9 B. ZŘEĎOVACÍ TECHNIKY - hodnocení GC efluentu v rámci sérií zředění původního extraktu - detekce prahových koncentrací CHARM analýza vzorky analyzovány v náhodném pořadí. Hodnotitel detekuje začátek a konec percepce čichového vjemu. CHARM hodnota: C = d n-1, kde d - je zředění, n - počet hodnocení Purge and trap system a) purge mod b) desorbce Metoda AEDA (Aroma Extract Dilution Analysis) hodnotitel indikuje zda vnímá či nevnímá aromatický vjem a zaznamenává senzorický deskriptor. Výsledek je vyjádřen jako flavour dilution (FD) - relativní hodnota reprezentující práh vnímání dané sloučeniny při dané koncentraci 9

10 AROMATICKÉ (VONNÉ) LÁTKY silice, produkty fermentací, autooxidačních reakcí, reakcí neenzymového hnědnutí aj. reakcí CELKOVÝ OBSAH AROMATICKÝCH CH LÁTEKL Metoda objemová a vážkovv ková destilace s vodní parou a určení objemu vrstvy silice extrakce rozpouštědlem a určení hmotnosti odparku extraktu (gravimetrie) Metoda titrační destilace s vodní parou, oxidace dichromanem 3 C 2 H 5 OH + 2 K 2 Cr 2 O H 2 SO 4 3 CH 3 COOH + 2 K 2 SO Cr 2 (SO 4 ) H 2 O K 2 Cr 2 O KI + 7 H 2 SO 4 3 I 2 + Cr 2 (SO 4 ) 3 + H 2 SO H 2 O STANOVENÍ POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH AROMATICKÝCH LÁTEK Stanovení pryskyřic v silicích destilace, extrakce zbytku rozpouštědlem a určení hmotnosti odparku extraktu 10

11 STANOVENÍ TĚKAVÝCH SLOUčENIN STANOVENÍ ESTERŮ neutrální sloučeniny, nelze je oddělit selektivně úpravou ph izolace z výchozí matrice některým z běžných způsobů pro těkavé látky - např. destilace s vodní parou Analýza destilátu CELKOVÉ MNOŽSTV STVÍ ESTERŮ (nejčastěji jako ethylacetát) metoda titrační zmýdelnění acidimetrická titrace nespotřebovaného hydroxidu (automatizace : potenciometrická indikace bodu ekvivalence) metoda spektrofotometrická zmýdelnění převedení reakcí s hydroxylaminem na hydroxamové kyseliny reakce se solemi Fe 3+ (kyselé ph) barevné komplexy PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE skupinový důkaz eliminace z chromatogramu po zmýdelnění Stanovení jednotlivých esterů izolace z destilátu GC/FID, GC/MS 11

12 STANOVENÍ KARBONYLOVÝCH SLOUČENIN alkanaly n-alk-2-enaly n-alka-2,4-dienaly n-alkan-2-ony dikarbonylové + hydroxykarbonylové aromatické heterocyklické formaldehyd, acetaldehyd, propanal. n-dekanal propenal (akrolein), butenal,.decenal pentadienal,.dekadienal propanon (aceton), butanon (methylethyl keton), dekanon glyoxal, methylglyoxal, biacetyl, malondialdehyd, glyceraldehyd, acetoin benzaldehyd, salicyladehyd, vanilin 2-furaldehyd STANOVENÍ SUMY KARBONYLŮ Metody titrační Metoda alkalimetrická (oximační) extrakce či destilace vzorku reakce s hydrochloridem hydroxylaminu kyselina chlorovodíková alkalimetrické stanovení RCH=O + NH 2 OH.HCl RCH=NOH + H 2 O + HCl Metoda jodometrická reakce s hydrogensiřičitanem reakce hydroxysulfonáty s hydrogenuhličitanem za vzniku siřičitanu stanovení jodometrickou titrací 12

13 RCHO+ NaHSO 3 OH R CH SO 3 Na NaHSO 3 + I 2 + H 2 O NaHSO 4 + HI OH R CH + NaHCO 3 RCHO + Na 2 SO 3 + CO 2 + H 2 O SO 3 Na Na 2 SO 3 + I 2 + H 2 O Na 2 SO HI uvolnění karbonylů z acetalů -hydrolýza: R OC 2 H 5 H + CH + H 2 O RCHO+ 2 C 2 H 5 OH OC 2 H 5 Metoda spektrofotometrická kondenzace karbonylů s 2,4-dinitrofenylhydrazinem izolace produktů do organického rozpuštědla STANOVENÍ JEDNOTLIVÝCH POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH KARBONYLOVÝCH SLOUČENIN FORMALDEHYD Metoda spektrofotometrická reakce s chromotropovou kyselinou v prostředí kyseliny sírové (ruší látky jež se hydrolyzují na formaldehyd - např. methylethylketon; také vyšší alkoholy) OH OH HO 3S SO 3H 13

14 reakce s acetylacetonem H 3 CCO COCH 3 HCH O + H 3 CCCH 2 CCH 3 +NH 3 O O H 3 C NH CH 3 + 3H 2 O 2,4-pentadion (acetylaceton) 3,5-biacetyl-1,4- dihydro lutidin ACETALDEHYD Metoda titrační (jodometrická) nespecifická Metoda spektrofotometrická reakce s fuchsinsiřičitou kyselinou H 2 N H 2 N C + NH.HCl H 2 SO 3 - HCl H 2 N H 2 N C NH 2 2 SO 2 HSO 2 HN HSO 2 HN C SO 3 H 3 R CH O NH 2 - H 2 O HSO 3 CH NH CH HSO 3 NH C + NH CH SO 3 H R 14

15 Metoda enzymová oxidace v přítomnosti aldehyd dehydrogenasy (EC ) NADH se stanoví spektrofotometricky (334 nm) CH3CH=O + NAD+ + H2O enzym CH3COOH + NADH + H+ BIACETYL A ACETOIN Metoda spektrofotometrická reakce s kreatinem a 1-naftolem H 3 C HOOC CH 2 NH N C NH 2 + O C CH 3 + O C CH 3 OH H 3 C N HOOC CH 2 N N CH 3 CH O + další produkty ACETON Metoda jodometrická reakce s jodem v alkalickém prostředí ( = jodoformová reakce) CH 3 COCH I NaOH CHI 3 + CH 3 COONa + 3 NaI + 3 H 2 O 15

16 5-HYDROXYMETHYL-2-FURALDEHYD Metoda spektrofotometrická reakce s barbiturovou kyselinou a 4 toluidinem O NH O NH O + + H 2 N CH 3 HOCH 2 O CH O NH O NH O CH C CH CH C NH OH CH 2 OH O CH 3 + H 2 O STANOVENÍ ALKOHOLŮ methanol ethanol vyšší alkoholy ethylenglykol glycerol Metody stanovení * Fyzikální - zvláště při vyšších obsazích ethanolu rychlé screeningové postupy - ebuliometrie (měření bodu varu) - densitometrie (měření hustoty destilátu) - refraktometrie (měření indexu lomu) * Chemické -spočívají v oxidaci izolovaného alkoholu (destilace s vodní parou) např. dvojchroman draselným, titrace nezreagovaného přebytku omezená selektivita 16

17 Příklad: GC stanovení alkoholů v brandy Kolona: DB-624 (60 m x 0.25 mm x 1.4 µm) Detektor: MS (kvadrupol) Kuhn et al., Application Note 43786, Agilent Technologies METHANOL GC Spektrofotometrie - oxidace pomocí KMnO 4 na formaldehyd - tvorba barevných produktů ETHANOL GC metoda - (n-propanol jako vnitřní standard), možnost varianty headspace AOAC metody pyknometrické (destilát), refraktometrické Metody chemické oxidace dichromanem, stanovení jeho přebytku a) síranem železito-amonným (indikátor o-fenantrolin) b) jodometricky 17

18 2 K 2 Cr 2 O C 2 H 5 OH + 8 H 2 SO 4 3 CH 3 COOH + 2 Cr 2 (SO 4 ) 3 + K 2 SO H 2 O a) K 2 Cr 2 O (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) H 2 SO 4 Cr 2 (SO 4 ) K 2 SO Fe 2 (SO 4 ) H 2 O + 6 (NH 4 ) 2 SO 4 b) K 2 Cr 2 O KI + 7 H 2 SO 4 Cr 2 (SO 4 ) I K 2 SO H 2 O Metody enzymové oxidace alkoholdehydrogenasou (EC ), NADH se stanoví spektrofotometricky C2H5OH + NAD+ enzym CH3-CH=O + NADH + H+ VYŠŠÍ ALKOHOLY Metody spektrofotometrické reakce se salicylaldehydem v přítomnosti horké H 2 SO 4 reakce s N,N dimethyl 4 aminobenzaldehydem 18

19 odstranění látek rušících stanovení: R-CH(OR )2 + H2O acetal (1,1 dialkoxyalkan) H+ R-CH=O + 2 R -OH R-CH=O + Ag2SO4 + H2O aldehyd OH- R-COOR + H2O ester R-COOH + 2 Ag + H2SO4 R-COOH + R -OH METODY CHROMATOGRAFICKÉ prakticky výhradně metoda GC/FID GLYCEROL Metoda spektrofotometrická oxidace HIO 4 na formaldehyd a mravenčí kyselinu, která se stanoví titračně (barevný produkt formaldehydu s floroglucinolem) CH2-OH CH-OH + 2 HIO4 2 H-CH=O + H-COOH + 2 HIO3 + 3 H2O CH2-OH Metody enzymové úbytek NADH se stanoví spektrofotometricky glycerol + ATP enzym I 1-glycerolfosfát + ADP ADP + fosfoenolpyruvát enzym II ATP + pyruvát pyruvát + NADH + H + enzym III enzym I: glycerolkinasa (EC ) enzym II: laktáthydrogenasa (EC ) enzym III: pyruvátkinasa (EC ) Metody chromatografické Metoda HPLC laktát + NAD + 19

20 KARBOXYLOVÉ KYSELINY Původ v potravinách: Biochemická syntéza (přirozená složka) Mikrobiální fermentace přítomných substrátů (cukrů...) Aditiva (látky cíleně přidávané) acidulanty (okyselovadla) konzervační prostředky synergisty antioxidantů stabilizátory barvy významný vliv na senzorické vlastnosti CHARAKTER CHUTI -různý podle typu kyseliny velmi odlišné podnětové prahy vnímání Vliv koncentrace kyseliny na ph 1. k. octová 2. k. mléčná 3. k. pyrohroznová HCl Stanovení ph skleněná elektroda Cap Connecting cable KALIBRACE pomocí certifikovaných pufrů Shielding Highresistence glass body Lead wire Mercury connection Graded glass-glass seal ph-responsive glass membrane Internal reference electrode Internal electrolyte solution 20

21 Celková (titrační) kyselost a) množství ml 1M NaOH potřebných k neutralizaci 100g potraviny / produktu b) % dominující kyseliny (mléčná, vinná, octová ) alkalimetrická titrace indikace bodu ekvivalence: - barevný indikátor, např. fenolftalein - potenciometricky, do ph 8.2 (AOAC) nebo 7 (EU) FIA automatizované stanovení: do proudu roztoku hydroxidu ve směsi s indikátorem (fenolftalein, bromkresolová zeleň + methylčerveň) se vstřikuje vzorek pokles absorbance při nm) - velikost píku log funkce koncentrací STANOVENÍ VÝZNAMNÝCH KARBOXYLOVÝCH KYSELIN SEPARAČNÍ METODY současné stanovení více analytů HPLC často nutná úprava vzorku či extraktu (horká voda, přídavek ethanolu, acetonitrilu apod.) : filtrace, centrifugace - odstranění pevných částic precipitace - odstranění proteinů čiřidlem (želatina ) dialýza -odstranění pigmentů, polyfenolů adsorpční chromatografie, nejlépe SPE - odstranění fenolických sloučenin a barviv (PVP)nebo naopak izolace(zadržení kyselin na katexu) 21

22 HLAVNÍ VYUŽÍVAN VANÉ SEPARAČNÍ MECHANISMY CHROMATOGRAFIE V REVERZNÍ FÁZI Foma analytů: volné nedisociované kyseliny - solvofobní chromatografie mobilní fáze pufr - ph 2-3 (např. 0.01M KH 2 PO 4 upravený fosforečnou kyselinou, někdy přídavek tetrabutylamonium fosfátu - iontové páry) kyseliny po derivatizaci (nejčastěji jako fenacyl- nebo p-nitrobenzyl estery) hydrofobní interakce výrazné zlepšení separace, často i detektability IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE - katexy v H + formě (mobilní fáze zředěná kyselina, např. sírová apod., vyšší t) faktory podmiňující retenci (kapacitní faktor, k): pk, molekulová hmotnost, rozpustnost ve vodě Detekce: RI, UV, příp. elektrochemická (nitroderiváty) HPLC stanovení organických kyselin v červeném víně: IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE Kolona: HPICE AS-1, Mobilní fáze: 2 mm oktansulfonová kyselina, Detektor: elektrochemický Application Note AN21, Dionex 22

23 Plynová chromatografie - GC těkavé možno přímo, častěji jako deriváty (alkylestery, trimethylsilylestery) precipitace ve formě nerozpustných Pb solí CH 2 COOH HO C COOH CH 2 COOH silylace (CH 3 ) 3 Si CH 2 COO Si(CH 3 ) 3 O C COO Si(CH 3 ) 3 CH 2 COO Si(CH 3 ) 3 k. citronová Isotachoforéza separační princip: diference v mobilitě iontů v elektrickém poli (terminální elektrolyt, nosný pufr) Stanovení karboxylových kyselin v lehké šťávě pomocí kapilární isotachoforézy 1. dusičnany 2. k. šťavelová 3. k. mravenčí 4. k. jablečná 5. k. citronová 6. k. glykolová 7. k. octová 8. k. mléčná 9. k. propionová 10. prolin 11. k. asparagová 23

24 Stanovení jednotlivých kyselin OCTOVÁ KYSELINA Titrační metoda jen pro jednoduché vzorky Metoda enzymová spektrofotometrické stanovení NADH acetát + ATP + CoA enzym I acetyl-coa + AMP + difosfá acetyl-coa + oxalacetát + H2O enzym II citrát + CoA malát + NAD+ enzym III oxalacetát + NADH + H+ enzym I: acetyl CoA synthetasa (EC ) enzym II: citrát synthasa (EC ) enzym III: malátdehydrogenasa (EC ) MLÉČNÁ KYSELINA Metoda enzymová L-laktát + NAD+ enzym I pyruvát + NADH + H+ pyruvát + L-glutamát enzym II L-alanin + 2-oxoglutarát enzym I: L laktát dehydrogenasa (EC ) enzym II: glutamát pyruvát transaminasa (EC ) 24

25 Metoda titrační (jodometrická) oxidace manganistanem, stanovení acetaldehydu 5 CH3-CH-COOH OH + 2 KMnO4 + 3 H2SO4 5 CH3-CH=O + K2SO4 + 2 MnSO4 + 5 CO2 + 8 H2O CH3-CH=O + NaHSO3 OH CH3-CH-SO3Na OH CH3-CH-SO3Na + NaHCO3 CH3-CH=O + Na2SO3 + CO2 + H2O Na2SO3 + I 2 + H 2O Na2SO4 + 2 HI VINNÁ KYSELINA Metoda titrační hydrogenvínan alkalimetricky CITRONOVÁ KYSELINA Metoda enzymová spektrofotometrické stanovení úbytku NADH citrát enzym I oxalacetát + acetát oxalacetát + NADH + H+ enzym II L-malát + NAD+ pyruvát + NADH + H+ enzym III L-laktát + NAD+ enzym I: citrát lyasa (EC ) enzym II: malát dehydrogenása (EC ) enzym III: laktát dehydrogenasa (EC ) 25

26 Metoda vážková historická metoda převedení na pentabromaceton CH 2 COOH HO C COOH CH 2 COOH 1/2 O2 - CO2, - H2O HO CH COOH 5 Br2 C -2 CO2, -5 HBr CH 2 COOH O CHBr 2 C CBr 3 TŘÍSLOVINY polyhydroxyfenoly - jen v rostlinných materiálech často vliv na senzorické vlastnosti (barva, chuť, vůně) hydrolyzovatelné: gallotaniny a ellagotaniny účinkem minerálních kyselin se štěpí na gallovou či ellagovou kyselinu a sacharid kondenzované působením minerálních kyselin nehydrolyzují, ale tvoří červenohnědé kondenzační produkty - flobafeny (výzmnamné např. v čaji) prekurzory - katechiny, leukoanthokyanidiny při zrání ovoce postupný úbytek CELKOVÝ OBSAH TŘÍSLOVINT tekuté vzorky se analyzují přímo, tuhé se extrahují horkou vodou Metoda titrační (manganometrická) oxidace manganistanem - diferenční stanovení před a po adsorpci analytů na polyamidový sorbent vhodné pro víno, čaj, kávu - použití empirických přepočítávacích faktorů pro různé komodity 26

27 Metoda srážení solemi kovů soli Cu (sráží i k. gallovou a pektin), Sn stanoví se buď množství kovu ve sraženině nebo úbytek v supernatantu Vhodné pro všechny typy rostlinných materiálů empirické přepočítávací faktory Metoda spektrofotometrická barevné produkty se solemi Fe 3+ v alkalickém prostředí Vhodné pro vzorky s malým obsahem pigmentů PŘIROZENÁ BARVIVA KAROTENOIDY přírodní: all trans izomery (známo asi 50 druhů, obsahy desítky až tisíce mg/kg - paprika) β - karoten OH HO zeaxantin IZOLACE šetrná extrakce - aceton, methanol, ethanol (u materiálů s nižším obsahem vody - např. diethylether) přídavek antioxidantů (BHT) a neutralizačního činidla roztřepání zmýdelnění (nejlépe při pokojové teplotě a v inertní atmosféře) - odstranění lipidů a chlorofylů; odstranění sterolů vymražením 27

28 Spektrofotometrické metody někdy předchází frakcionace na vhodném sorbentu (kolonová chromatografie, TLC) separace podle polarity HPLC často v normální fázi, možná i reverzní identifikace jednotlivých sloučenin LC-MS Extinkční koeficienty (E1cm 1%) karotenoidů v rozpouštědlech Karotenoid astaxanthin kapsanthin kapsorubin a-karoten b-karoten a-kryptoxanthin lutein lykopen rubixanthin violaxanthin zeaxanthin E1cm 1% Vlnová délka (l) Rozpouštědlo aceton benzen benzen benzen cyklohexan hexan benzen benzen aceton benzen aceton Absorpční spektra karotenoidů 28

29 Adsorbenty pro dělení karotenoidů kolonovou chromatografií Typ karotenoidu karoteny monohydroxykarotenoidy karotenoidy o střední polaritě polární xantofyly Adsorbent alumina, silikagel alumina oxid hořečnatý celulosa CHLOROFYLOVÁ BARVIVA porfyrinové pigmenty přítomny ve všech fotosyntetizujících organismech extrakce acetonem, případně methanolem riziko degradace - enzymová (nutnost inhibice chlorfylázy) i chemická (potřeba neutralizace - zvýšení ph) spektrofotometrické metody stanovení chlorofylu a a b vedle sebe výpočtem HEMATINOVÁ BARVIVA extrakce acetonem, chromatografické metody spektrofotometrické metody 29

30 ANTHOKYANY A JINÉ FLAVONOIDY ve vodě rozpustné polyhydroxyfenoly - glykosidy Extrakce zředěné kyseliny v polárním rozpouštědle (často methanol s 1% HCl); pro nativní anthokyaniny 30