Beads. cytokiny v séru detekce buněčných proteinů. 75 min

Transkript

1 Beads cytokiny v séru detekce buněčných proteinů 75 min něco o kuličkách diagnostické aplikace výzkumné aplikace jak měříme cytokiny jak měříme intracelulární proteiny kam směřujeme?

2 Pročkuličky? ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Bead Array gold standard for clinical use research ELISA reader flow cytometers or Luminex 100 System colorimetry (chemiluminiscence) fluorescence flat surface (96well plate) spherical beads on well = one antigen high-throughput multiplex analysis x Multiplex ELISA ( x cross-reactivities, software sample volume 25uL sample volume 25uL time and cost > time and cost < tissue culture supernatant samples x serum x plasma tissue culture supernatant samples x serum x plasma sensitivity (0,1pg/mL) sensitivity (0,2pg/mL) Kucheletal. ELISA AND MULTIPLEX TECHNOLOGIES FOR CYTOKINE MEASUREMENT IN INFLAMMATION AND AGING RESEARCH, J GerontolA BiolSciMed Sci August ; 63(8): McCoyetal. MultiplexBeadArrayAssays: Performance EvaluationandComparisonofSensitivity to ELISA, Methods April; 38(4): g 10 6 g 10 9 g g g g g g milligram microgram nanogram picogram femtogram attogram zeptogram yoctogram

3 Typy cytometrickýchkuliček FlowCytomix ebioscience Fluorescence parameters and two size discriminators Yes (up to 20) Compatible with most flow cytometers, including single laser instruments. Assays for cytokines, chemokines, CRP, coagulation factors, apoptosis and adhesion molecules in blood, serum, and tissue culture supernatant. H.-Y. Hsu et al. Electrophoresis 2009, 30,

4 Vazba proteinůna kuličky - NH2 H.-Y. Hsu et al. Electrophoresis 2009, 30,

5 Imunoglobulinvazebnéproteiny Species Antibody Class Protein A Protein G Protein A/G Protein L Human Total IgG S S S S IgG 1, IgG 2 S S S S IgG 3 W S S S IgG 4 S S S S IgM W NB W S IgD NB NB NB S IgA W NB W S IgA 1, IgA 2 W NB W S IgE M NB M S Fab W W W S ScFv W NB W S W = weak binding, M = medium binding, S = strong binding, NB = no binding rekombinantní Protein G (65/58kDa) Streptococcus rekombinantní Protein A (56kDa) Staphylococcus aureus rekombinantní Protein A/G (50kDa) rekombinantní Protein L (76kDa) Peptostreptococcus magnus (váže kappa lehké řetězce)

6 Otázky k publiku Konjugujete se sami proteiny nebo jiné molekuly na kuličky?

7 Bead-arraysv diagnostice zeusscientific.comcom AtheNA Multi-Lyte Lyte Test System Infectious Antigen Autoimmune Antigen T. pallidum IgG Treponema pallidum ANA II SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centromere B, Histone ToRCH IgG Toxoplasma gondii, Rubella, CMV, HSV ANA III SSA-52, SSA-60, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centromere B, Ribosomal P MMV IgG Measles, Mumps, Varicella-zoster Autoimmune Vasculitis MPO, PR3, GBM HSV-1&2 IgG HSV TPO/Tg Thyroid Peroxidase (TPO), Thyroglobulin (Tg) EBV IgG/IgM EBV RF IgM RF Borrelia VlsE-1 IgG/pepC10 IgM MMRV IgG Borrelia Measles, Mumps, Rubella, Varicella-zoster BioPlex 2200 System Infectious Antigen Autoimmune Antigen EBV IgG/IgM EBV ANA Screen with MDSS Syphilis IgG/IgM Treponema pallidum Vasculitis MPO, PR3, GBM ToRC IgG/IgM Toxoplasma gondii, Rubella, CMV Anti-CCP (RA) Cyclic Citrullinated Peptide HSV-1 & HSV-2 IgG HSV Antiphospholipid Syndrome, SLE Cardiolipin, Beta-2 Glycoprotein I MMRV IgG Measles, Mumps, Rubella, Varicella-zoster Celiac Disease (currently in development) HIV/Hepatitis Lyme Borreliosis (currently in development) (currently in development) (Luminex)

8 Otázky k publiku Používáte Luminex technologii? Používáte bead-array testy v diagnostice?

9 Bead-arraysve výzkumu Jednoduché testy- cytokiny, fúzní proteiny, Multiplexy- cytokiny, proteiny v séru, intracelulární a povrchové buněčné proteiny MultiScreenHTS Vacuum Manifold

10 Cytokinyv séru I FlowCytomix Simplex Kit FlowCytomix Combination Table

11 Cytokinyv séru II FlowCytomix Multiplex Kit Human Th1/Th2 11plex Human (Mouse) Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 13plex IFN-gamma IL-1beta IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p70 IL-13 IL-17A IL-22 TNF-alpha biotin streptavidin-pe rozlišen ení populací (APC) kvantifikace (PE)

12 Cytokinyv séru III

13 Cytokinyv séru IV

14 Cytokinyv séru V

15 Cytokinyv séru VI

16 Cytokinyv séru VII

17 Cytokinyv séru VIII

18 Cytokinyv séru IX O. Beran, FN Na Bulovce Jak zvýšit senzitivitu? plazmy a séra s neředit edit plazmy a séra s používat čerstvé,, max. 1x zamražen ené plazmy a séra s skladovat v -80 C, max měsíce cytometrx x detektor pro PE (modrý x žlutý laser) použít t jiný kit?

19 Cytokinyv séru X CBA Enhanced sensitivity

20 Cytokinyv séru XI CBA Enhanced sensitivity APC-H7 APC normal sensitivity PE enhanced sensitivity biotin streptavidin-pe Analýza: FCAP Array software : Diva,

21 Otázky k publiku Měříte cytokiny v séru / plazmě? Jakou technologii používáte? Jste spokojeni se senzitivitou? Jak dlouho vydrží cytokiny v zamražené plazmě bez degradace?

22 Buněčnéproteiny I Luminex

23 Buněčnéproteiny II 2,5mil buněk 4-5h PML-RARA Dekking et al. Leukemia 2012 Currently in development: TEL-AML1, E2A-PBX1, MLL-AF4, AML1-ETO and CBFB-MYH11

24 Co je možné/ nemožné? Myslíte, že je možné detekovat v jednom vzorku více než 1700 proteinů najednou?

25 Co je možné/ nemožné? Myslíte, že je možné kromě exprese proteinu detekovat i jeho velikost? Size-exclusion Chromatography FPLC = fast protein liquid chromatography 670 kda 10 kda 24 frakcí

26 Princip SEC-MAP Size-exclusion Chromatography- Microsphere-based Affinity Proteomics 1 izolace proteinů 2 značení proteinů biotinem 3 rozdělení proteinů na chromatografické koloně 4 imunoprecipitace chromatografických frakcí se SEC-MAP array 5 detekce proteinů pomocí streptavidinu-pe 6 měření na průtokovém cytometru 7 analýza protein G Goat anti Mouse STREPTAVIDIN PROTEIN-BIOTIN -PE Mouse anti Human Wu, Antibody array analysis with label-based detection and resolution of protein size. Mol Cell Proteomics 2009 Slaastad, Multiplexed immuno-precipitation with 1725 commercially available antibodies to cellular proteins. Proteomics 2011 Stuchly, An automated analysis of highly complex flow cytometry-based proteomic data. Cytometry A 2012

27 Jak vypadajívýsledky? automatická detekce populací kuliček definice proteinových forem čárový graf kvantifikace

28 ZnačeníproteinůI Biotin EZ-linkNHS PEO 4 Biotin

29 ZnačeníproteinůII Fluorochromy Amine-Reactive Probes Active esters succinimidylesters(se), sulfosuccinimidylesters(sse) tetrafluorophenylesters(tfp) sulfodichlorophenolesters(sdp) Isothiocyanates(ITC) Sulfonyl chlorides(sc) př: Alexa Fluor 488 Succinimidyl Esters Thiol-Reactive Probes Maleimides TS-Link Reagents př: Alexa Fluor 488 C5 Maleimide

30 Na co dávat pozor? Jak správně vyizolovat protein? slabé x silné detergenty (lokalizace proteinu v buňce) Poly[ADP-ribose] polymerase ApoptosisregulatorBAX Cytoplasm Organelles Nucleus Membranes inhibitory proteáz(leupeptin, aprotinin, PMSF, ) a inhibitory fosfatáz (Na 3 VO 4, ) lze přidat přímo k buňkám před izolacíproteinu degradace proteinů v čase!!! Čas mezi odběrem vzorku a zpracováním Apoptóza po stimulaci Kontaminace granulocyty Opakované rozmražov ování

31 Na co dávat pozor? Specifita protilátek kvantita proteinu snižující se velikost biotin streptavidin-pe Vyzkoušet různr zné klony protilátek tek proti jednomu antigenu Kity věř ěřit firmě Imunoprecipituje protilátka tka nativní nebo denaturovaný protein? 0,2% SDS, 100 C

32 Otázky k publiku Měříte intracelulární proteiny bead-array technologií? Jakou technologii používáte? Vidíte také degradaci proteinů v čase?

33 Děkuji za pozornost