Identifikace stafylokoků prostřednictvím sekvenování konzervativních genů

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Identifikace stafylokoků prostřednictvím sekvenování konzervativních genů"

Arnošt Ovčačík
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 Identifikace stafylokoků prostřednictvím sekvenování konzervativních genů Roman Pantůček, Pavel Švec, Ivo Sedláček Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Ústav experimentální biologie M A SA RYKOVA UNIVERZITA BRNO PŘÍ RO D O V ĚD ECK Á FA K U LTA

2 Identifikace stafylokoků založená na DNA Přesná a spolehlivá identifikace prostřednictvím molekulárně biologických metod Nepřímé metody Poskytují zpravidla fingerprint ve formě proužků na gelu nebo membráně Ribotypizace a automatická ribotypizace PCR-RFLP konzervativních genů Amplifikace mezerníků v operonech pro rrna a trna (ITS-PCR) Interrepetitivní PCR (REP-PCR) Přímé metody Stanovení sekvence konzervativních genů o délce bp Moderní vysoce účinné sekvenování celých genomů DNA microarrays

3 Přímé metody pro identifikaci stafylokoků na základě sekvencí DNA Více než 30 ortologních genů vhodných pro diagnostiku a fylogenetické studie Rozdílná úroveň konzervovanosti sekvencí Nejpoužívanější lokusy: geny pro funkční RNA 16S ribosomal RNA (16S rrna) 23S ribosomal RNA (23S rrna) často používané geny, data dostupná pro většinu druhů 60 kda heat shock protein (hsp60, cpn60, groel) RNA polymeráza beta-podjednotka (rpob) 40 kda heat shock protein DnaJ (dnaj/dnak) Shah et al., 2007, IJSEM 57: superoxide dismutase (soda) Poyart et al., 2001, JCM 39: méně často používané geny, data dostupná pro některé druhy glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza (gap) Ghebremedhin et al., 2008, JCM: 46: elongační faktor Tu (tuf) Martineau et al., 2001, JCM 39:

4 16S rrna fylogenetická analýza Takahashi et al., IJSB 1999, 49: Spolehlivá identifikace na úrovni rodu a druhových komplexů Stanovení kompletní sekvence genu pro 16S rrna vyžaduje provedení min. 4-6 sekvenačních reakcí Fylogenetická analýza Dosahované podobnosti sekvencí 97 99% Definovány species-groups

5 16S rrna species groups S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus S. muscae S. hyicus S. intermedius S. simulans S. sciuri S. hominis (X66101) S. haemolyticus (D83367) S. stepanovicii (GQ222244) S. devrisei (AB009941) S. fleurettii (AB233330) S. lugdunensis S. vitulinus (AB009946) (AB009941) S. lentus (D83370) S. sciuri (S83569) S. delphini (AB009938) S. intermedius (D83369) S. schleiferi (S83568) S. aureus S. simiae (D83357) (AY727530) S. hyicus (D83368) S. chromoges (D83360) S. lutrae (X84731) S. felis (D83364) S. rostri (FM244716) S. microti (EU888122) S. muscae (S83566) S. xylosus (D83374) S. saprophyticus (D83371) S. pasteuri (AB009944) S. warneri (L37603) S. auricularis (D83358) S. massiliensis (EU707796) S. condimenti (Y15750) S. piscifermentans (AB009943) S. carnosus (AB009934) S. pettenkoferi (AF322002) S. kloosii (AB009940) S. nepalensis (AJ517414) S. cohnii (D83361) S. arlettae (AB009933) S. gallinarum (D83366) S.equorum (AB009939) S. succinus (AF004219) 0.01 S. simulans (D83373) Pantůček et al., IJSEM 2005, 55: , doplněno

6 Rychlá identifikace stafylokoků prostřednictvím 5'-konce 16S rrna Stanovení částečné sekvence 5'-konce 16S rrna o délce cca 500 bází Amplifikace téměř celého genu Jedna sekvenační reakce s vnitřním primerem 98,7 % průměrná podobnost mezi druhy Nelze odlišit komplex S. delphini-s. intermedius-s. pseudintermedius Nelze odlišit subspecies

7 5'-konec 16S rrna - metodika Becker et al., 2004, JCM 42: Primery pro PCR amplifikující ~900 bp fragment SSU-bact-27f AGAGTTTGATCMTGGCTCAG SSU-bact-907r CCGTCAATTCMTTTRAGTTT Vnitřní primer pro sekvenování SSU-bact-519r GWATTACCGCGGCKGCTG Doporučená databáze pro identifikaci RIDOM Nováková, et al., 2006, JMM 55: Primery pro PCR amplifikující ~1400 bp fragment 16Sfw AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 16Srev GGTTACCTTGTTACGACTT Vnitřní primer pro sekvenování 16S553L CGCTTTACGCCCAATAATTCCG Doporučená databáze pro identifikaci RDP II

8 Získání sekvencí rrna RDP II Release 10 (

9 Získání sekvencí rrna SILVIA v104 (

10 hsp60-60 kda chaperonin - metodika Kwok a Chow, IJSEM 2003, 53: bp fragment genu pro 60 kda heat shock protein Degenerované primery pro PCR obsahující řadu inozinových zbytků a restrikční místa na 5 -konci H279 GAATTCGAIIIIGCIGGIGA(TC)GGIACIACIAC H280 CGCGGGATCC(TC)(TG)I(TC)(TG)ITCICC(AG)AAICCIGGIGC(TC)TT Podmínky PCR: nízká stringence navíc nespecifické produkty Nutnost klonovat produkty PCR Sekvenování prostřednictvím univerzálních primerů kompatibilních s klonovacím vektorem

11 hsp60 příklad gelu s produkty PCR 600 bp hsp60

12 hsp60 - výsledky Výborná korelace mezi fylogenetickými stromy založenými na 16S rrna a hsp60 Diverzita sekvencí genů mezi druhy rodu Staphylococcus 74 až 93 % mnohem vyšší diskriminační schopnost pro druhovou identifikaci než u 16S rrna V rámci rodu Staphylococcus rozlišeno 5 druhových skupin: aureus group, epidermidis group, haemolyticus group, saprophyticus group, intermedius group a sciuri group

13 cpndb: A Chaperonin Database

14 hsp60 fylogenetický strom Pantůček et al., IJSEM 2005, 55:

15 hsp60 výhody/nevýhody Přesná druhová identifikace Pro fylogenetickou analýzu mohou být použity dedukované aminokyselinové sekvence Existence specializované databáze pro archea, bakterie a eukaryota možnost automatického přiřazení sekvencí a fylogenetické analýzy Nutnost investovat do degenerovaných primerů Klonování práce s GMO

16 rpob β-podjednotka RNA-polymerázy Gen používaný pro mikrobiologickou identifikaci u řady rodů jednoduchá technika Rozlišovací schopnost závisí na výběru části genu pro identifikaci výběr hypervariabilní oblasti Diverzita sekvencí genů mezi druhy rodu Staphylococcus 72 až 94 % Vnitrodruhová divergence 0,08 0,8 % V rámci rodu Staphylococcus rozlišeno 9 hlavních klastrů

17 rpob - metodika Mellmann et al., Emerg. Infect. Dis : bp fragment genu pro podjednotku beta RNApolymerázy B Primery pro PCR 1418f CAATTCATGGACCAAGC 3554r CCGTCCCAAGTCATGAAAC Podmínky PCR: vysoká stringence Sekvenování prostřednictvím vnitřního degenerovaného primeru 1975r GCIACITGITCCATACCTGT Drancourt a Raoult, JCM : prvotní práce u stafylokoků 751 bp fragment, technicky náročnější

18 rpob fylogenetický strom Švec et al., SAM 2010, in press

19 rpob výhody/nevýhody Univerzální gen přítomný u všech bakterií Výborně koreluje s výsledky DNA-DNA hybridizace - přesná druhová identifikace a popis nových druhů Většina sekvencí získána moderními sekvenačními technikami v současné době bez chyb Fylogenetické stromy vykazují vyšší stabilitu (bootstrapové hodnoty) než stromy založené na 16S rrna nebo hsp60 Neexistuje specializovaná moderovaná databáze - nutnost vyhledávání sekvencí v GenBank

20 Získávání sekvenčních dat Databáze nukleotidových sekvencí GenBank/EMBL/DDBJ Lokální hledání podobností BLAST FASTA Specializované databáze SILVIA, RDP (rrna) cpndb Integrované zdroje StrainInfo Integrované identifikační databáze BIBI database

24 Závěr Srovnání diskriminační schopnosti sekvenování jednotlivých genů u stafylokokových druhů Lokus Podobnost mezi druhy Průměrná podobnost Délka (bp) 16S rrna 97-99,5 % 98 % ~ 1400 rpob % 86 % ~ 480 nebo 750 hsp % 82 % ~ 600 soda % 81 % ~ 430 dnaj % 78 % ~ 880 gap % 65 % ~ 930 Diagnostika: Využití poznatků a analýzy sekvenčních dat pro přípravu DNA microarrays Taxonomie: Rozvoj a využití vysoce účinných metod pro sekvenování celých genomů pro jejich klasifikaci

25 Přímé metody pro vnitrodruhovou typizaci SLST jednolokusová sekvenční typizace MLST multilokusová sekvenční typizace MLSA multilokusová sekvenční analýza

26 Jednolokusová Spa-typizace Sekvenování DNA polymorfního regionu genu pro protein A (spa) Určení kombinace opakovaných jednotek (repetic) v oblasti X dává jedinečný spa-typ reprodukovatelné, jednoznačné a snadno interpretovatelné výsledky postačující pro zkoumání vypuknutí infekce v dlouhodobém časovém horizontu by měla by být doplněna další technikou (PFGE, MLVA, aj.)

27 Princip spa-typizace 1.stanovení sekvence polymorfní oblasti genu spa TTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCT GGTAAAGAAGACAACAACAAACCTGGCAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCA ACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACGGAGTACATGTCGT TAAACCTGGTGATACAGTAAATGACAT 2.vyhledání koncových signaturních sekvencí 5'-signature TTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCT GGTAAAGAAGACAACAACAAACCTGGCAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCA ACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACGGAGTACATGTCGTTACATGTCGT TAAACCTGGTGATACAGTAAATGACAT 3.identifikace repetic dlouhých zpravidla 24 bp 5' GCACCAAAA GAGGAAGACAACAAAAAACCTGGT repetice č. 26 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACAACAACAAACCTGGC repetice č. 20 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACAACAACAAGCCTGGT repetice č. 12 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACGGCAACAAACCTGGT repetice č. 16 AAAGAAGACGGCAACGGAG 3' TACATGTCGT 4.určení spa typu podle databáze = spa typ t003 3'-signature

28 spa typizace - Staph type software

29 RIDOM Spa Server

30 MLST multilokusová sekvenční typizace Stanovení sekvence 7 genů rozmístěných v různých místech genomu Přiřazení sekvencí do alelových typů Kombinace typů alel tvoří sekvenční typ (ST) Zavedena u celé řady druhů Databáze přístupná na webu S vhodnými statistickými algoritmy umožňuje provádět shlukovou analýzu a dedukci klonálních linií Vhodná pro dlouhodobé a globální epidemiologické analýzy

31 MLST internetová databáze (

32 Rekonstrukce fylogeneze klonů eburst v3 algoritmus pro analýzu MLST typů ( CC8

33 Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

IDENTIFIKACE A TYPIZACE STAFYLOKOKŮ METODOU (GTG) 5 -PCR

IDENTIFIKACE A TYPIZACE STAFYLOKOKŮ METODOU (GTG) 5 -PCR Nováková Dana Česká sbírka mikroorganismů, Masarykova universita, Brno ÚVODEM O REP-PCR PCR = mnohonásobné zmnožení úseků obsahujících fragment