Metody v ekologii mikroorganismů

Transkript

1 Metody v ekologii mikroorganismů Petr Baldrian Laboratoř environmentální mikrobiologie baldrian@biomed.cas.cz;

2 Prostředí a mikroorganismy Mikroorganisy vnímaji prostředí v jiných měřítcích než makroorganismy. Přirozené prostředí je vysoce komplexní a heterogenní.

3 Depth (cm) Prostorová heterogeneita prostředí Organic matter Bacterial biomass Fungal biomass Respiration L O Relative value (%) Laccase Mn-perox. Endocell, CBH -Glucos. NAG-ase Phosphatase Relative value (%) Ah Soil properties along a vertical profile of forest topsoil.

4 Metodické přístupy ekologie mikroorganismů Classical microbiology Genomics Transcriptomics Proteomics Analysis of microbial processes Study of nucleic acids and proteins from the environment: Brock Biology of Microorganisms (2012) metagenomics, metatranscriptomics, metaproteomics

5 Metodické přístupy ekologie mikroorganismů Metody závislé na kultivaci >IEH00WJ01BK2Y9 xy=533_195 ATTAGCAGTAAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAAACGAATAGGAATGGGGGAGCAAGACG GCAAAGCAAAAGACTGTCGCTGGCTAGATTCATTTCTGGCATGTGCACGTCCTTGCTTTTTTCGTCGACCTTTCTC TTTCTTTCTTTCACACCTGTGCACCCGTTGTAGGTCCTCGAAAGAGGATC >IEH00WJ01DVNL6 xy=1473_2492 TAGTGTAGATAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATCGTAGGCGAGGGTTGTCGCTGGCCT CTCGGGGCATGTGCACGCCCGAGCCCTTGAATCCCAAACACCACATGTGAACCCACCGTAGGCCTTCGGGCCTA TGTCTTATCATATAATCTGAATGTCTAATAGAATGTAAACCCATTTCGTTGC >IEH00WJ01CDN03 xy=858_2645 CGTATGGACAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGAGCATATCAGTAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGG AGCATATCAATAAGCGGAGGAATCCGTAGTGAACCTGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATA AGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGT >IEH00WJ01BNPAZ xy=562_3657 TAGTCGCATAAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGAACGCCCGGGCTTCGGCCTGGTTATTC ATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTCTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTT CAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAA >IEH00WJ01B2AI9 xy=729_323 ATACGACGTAAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAATACGTTTGGTTCTGATGCTGGCTCGTC ACTGAGCATGTGCTCGATCCATAACTATTTATCTTCTCTTGTGCACCTTTTGTAGTCTTTCAGAGCAAGTGATAACT CTCGCAGCAATGCGGTTTGGGGGACTTGGGCGTGAGCCCTTCCCCTTC >IEH00WJ01DAD4P xy=1231_1655 TATCACTCAGAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAAGTAGAGGGCCCCTGGGGTCCAACCTA CCCACCCGGTGTTTAATTGTAACCTTGTTGCTTCGGTGCGCCGCCTCACGGTCCGCCGGGGGCTTCTGCCCCGG GTCCGCGCGCACCGGTAGACACCATTGAACTTCTTGTTCTGAACGATTGCAC >IEH00WJ01AEBMK xy=45_4042 CTATGTACAGAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTGTTCTCTGCCCTCACGGGTAGAAACGCT CACCCTTGTATATTATATCTTTGTTGCTTTGGCAGGCCGCCCTCGGGCACCGGCTCCGGCTGGATCGCGCCTGC CAGAGGAAACCCAAACTCTGAATGTTAGTGTCGTCTGAGTACTATCTAATA >IEH00WJ01DFSEK xy=1292_3578 TAGTGTAGATAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAGAGTTCATGCCCTTTAGGGTAGATCTCCCA TCCTTTGTCTATATACCTCTGTTGCTTTGGCAGGCCGAACTATTAGTCTACCGGCTCTGCTGGTAAGCGCCTGCCA GAGGACCCCCACTCTGAGAGTTAGTGTCGTCTGAGTACTATATAATAGT >IEH00WJ01CMQ2E xy=962_500 CAGTACTGCGAGATCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGTAAACCGAGGTGCGAGGGCTGTCGCTGA CCTTTTTTGGTCGTGCACGCCCGAGCGCTCTCACACAATCCATCTCACCCCTTGTGCACCACCGCGTGGGTTCCC TTTCTGGCTTGTCCGAAGGGGGCTCGCGTTTTCACACAAACTTGAATTGGT Analýza nukleových kyselin Přímá vizualizace Brock Biology of Microorganisms (2012) Zahrnuje všechny mikroorganismy včetně těch nekultivovatelných a neznámých druhy se tvoří uměle na základě matematické podobnosti sekvencí Identita sekvence (příslušný gen a jeho producent) je určena nepřímo na základě podobnosti (větší nebo menší) k některé známé sekvenci

6 Mikrobiální genomy slouží jako databáze informací o fenotypech Brock Biology of Microorganisms (2012)

7 Analýza aktivního společenstva mikroorganismů Prokaryota (bakterie) Eukarota (houby) DNA 5.8S 16S trna 23S 5S trna 18S ITS1 ITS2 28S PCR produkt (templátem je DNA) transkripce PCR produkt (templátem je DNA) transkripce RNA transkript PCR produkt (templátem je RNA) štěpení PCR produkt (templátem je RNA) štěpení hotová rrna PCR produkt (templátem je RNA) ribozóm PCR product (RNA as template) RNA amplikony: Identifikace mikroorganismů obsahujících ribosomy RNA amplikony: Identifikace mikroorganismů produkujících ribosomy

8 Analýza RNA umožňuje sledovat expresi genů Výhody: Kromě informace o složení společenstva v půdě máme šanci analyzovat i to, které procesy právě probíhají. Porovnáním DNA a RNA zjistíme, jaké má společenstvo v půdě složení (DNA) a které mikroorganismy jsou v dané chvíli aktivní (RNA) Nevýhody: RNA je méně stabilní než DNA (štěpení RNAzami) Obsah RNA v prostředí je řádově nižší než DNA Většina RNA molekul nemusí mít informační hodnotu RNA nelze sekvenovat přímo, je nutné ji nejdříve převést na DNA

9

10

11

12

13 Metody ekologie mikroorganismů - přehled

14 Metody ekologie mikroorganismů Kvantifikace mikrobiální biomasy analýza lipidů Charakteristika společenstvev (fingerprintové metody) DGGE, T-RFLP Analýza složení společenstva / metagenomu 454 pyrosekvenace Analýza aktivních členů společenstva - Stable Isotope Probing

15 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) DGGE je elektroforetická separační metoda, která je založená na rozdílech v teplotách tání dvouřetězcových fragmentů DNA. Elektroforéza obvykle probíhá ve vertikálních aparátech na polyakrylamidovém gelu ve kterém je ustaven gradient denaturačního činidla. Elektroforéza trvá poměrně dlouho (až desítky hodin) a tak je nutné cirkulací elektroforetického pufru zabránit vyprázdnění horní nádrže. Gel také musí být v homogenní teplotě (obvykle 60 C), čehož se dosahuje ponořením do média, které je ohříváno a mícháno. Elektroforetické přístroje pro DGGE jsou proto specifické a odlišují se od běžných elektroforéz.

16 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Gely pro DGGE jsou gradientové, obsahují tedy gradient denaturačního činidla. Jako denaturační činidla se používají například formamid a močovina. Výsledky separace jsou závislé na použité koncentraci denaturačních činidel, podobně jako při klasické elektroforéze se používají široké gradienty (pro studium rozdílných DNA molekul) nebo úzké gradienty, které jsou teoreticky schopny odlišit i mutaci v několik málo párech bází. Nalití gelu je klíčovým krokem pro úspěch separace, k ustavení gradientu je třeba použít vhodný mixér.

17 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Při DGGE se dělí PCR produkty vhodné sekvence DNA - často rdna nebo sekvence genu, charakteristického pro určitou skupinu mikroorganismů. K PCR produktu se ligázou připojuje GC-kotva (asi 20 bp), která zajišťuje vhodnou míru denaturace dsdna molekul a usnadňuje migraci. Elektroforéza probíhá po dobu několika hodin (15-20). Po skončení elektroforézy jsou gely obvykle barveny ethidiumbromidem. V optimálním případě by jeden pruh na gelu měl odpovídat jednomu druhu (kmenu) mikroorganismu a intenzita pruhu (do určité míry) odpovídá zastoupení dané molekuly v prostředí. Někdy je možné pruhy z gelu vyříznout a sekvenovat.

18 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Typickým výsledkem DGGE analýzy je kladogram, který umožňuje srovnat druhovou diverzitu a podobnost mikrobiálních společenstev. Analýza sekvencí vybraných pruhů na gelu pomůže odpovědět na otázku, které taxonomické jednotky (druhy, kmeny) mikroorganismů se v daném vzorku vyskytují.

19 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Výhody a nevýhody metod - metoda je vysoce citlivá (to je dáno použitím PCR kroku pro zmnožení materiálu) - ve spojení se sekvenací umožňuje taxonomickou identifikaci - dá se použít pro určitou část populace (specifické primery) - je semikvantitativní (díky PCR) - omezený počet srovnávaných vzorků - není možné analyzovat zároveň taxonomicky vzdálené skupiny (například houby i bakterie) - příprava gelů pro DGGE je pracná a obtížná - náročná je optimalizace metody (volba vhodného primeru, vhodného rozmezí gradientu) - výsledky nemusí být úplně jednoznačné (jeden kmen může dát jako odezvu dva proužky, proužky se mohou na gelu překrývat) - ne vždy je možné použít proužek z gelu přímo k sekvenaci Metoda volby: když potřebujeme identifikovat majoritní zástupce společenstva

20 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) Metoda je založená na rozdílech v umístění restrikčních míst v sledované sekvenci. Umístění restrikčního místa může být specifické pro daný taxon. V prvním kroku prbíhá PCR amplifikace, při které je jeden primer označen fluorescentní sondou. Soubor PCR produktů je úplně naštěpen vybraným restrikčním enzymem. Fragmenty po štěpení jsou elektroforeticky separovány. Pouze ty fragmenty, které obsahují značený primer (tedy terminální) lze detekovat na základě fluorescence a identifikovat jejich délku.

21 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)

22 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) Analýza probíhá na kapilární elektroforéze (podobně jako klasická sekvenace). Výsledkem analýzy je elektroforetogram, v němž výšky píků (osa y) odpovídají relativní četnosti restrikčního fragmentu dané délky (osa x). Jeden pík reprezentuje všechny fragmenty stejné délky, nikoli individuální molekuly. Příliš krátké (ani příliš dlouhé) fragmenty nelze kvantifikovat. Cena: 160 Kč / vzorek.

23 Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) Výhody a nevýhody metod - metoda je vysoce citlivá (to je dáno použitím PCR kroku pro zmnožení materiálu) - dá se použít pro určitou část populace (specifické primery) - je semikvantitativní (díky PCR), kvantifikace je přesnější než u DGGE - teoreticky neomezený počet srovnávaných vzorků - vyšší technická rozlišovací schopnost - není možné analyzovat zároveň taxonomicky vzdálené skupiny (například houby i bakterie) - neumožňuje následnou sekvenaci a taxonomickou identifikaci - část společenstva nemusí být v profilu zastoupena (chybí restrikční místo, nebo je příliš blízko značeného primeru) - jednotlivé píky často zahrnují mnoho (často příbuzných) taxonů Metoda volby: když potřebujeme srovnat mnoho vzorků

24 Next-generation-sequencing : porovnání sekvenačních platforem Mil. sekvencí Kč/milión Délka % chyb v jednom běhu sequences capillary sequencing b < Junior b 1-4% 454 FLX b 1-4% Ion Torrent b >4% Illumina MiSeq x 300 b % Illumina HiSeq x 150 b %

25 Nejběžnější sekvenační platformy Tomáš Větrovský

26 Sekvenace poskytuje detailní obrázek složení mikrobiálního společenstva Složení bakteriálního společenstva ve vzorku půdy Brock Biology of Microorganisms (2012)

27 Pro každou sekvenci lze teoreticky najít jejího producenta a funkci

28 Metagenomika ukazuje teoretický potenciál společenstva Metatranskriptomika napovídá, které procesy právě probíhají

29 454 pyrosekvenace a sekvenace na Illumina MiSeq Výhody a nevýhody metod - umožňuje velkou taxonomickou hloubku (identifikace sekvencí, přítomných ve velmi malém množství několik setin procenta) - rychlá a (relativně) levná sekvenace genomů - vysoký poměr množství informace / cena - jediná alternativa pro tvorbu metagenomů (které skupiny genů jsou v daném prostředí dominantní?) - nelze technicky použít pro omezené množství sekvencí (nejmenší množství cca sekvencí) - poměr informace / cena stoupá s velikostí vzorku - metoda je více chybující než klasická sekvenace Metoda volby: analýza metagenomů, transkriptomů a genomů

30 Analýza mikrobiálních lipidů Podnětem pro využití analýzy mikrobiálních lipidů bylo zjištění, že složení lipidické frakce mikroorganismů se odlišuje a je taxonomicky specifické, obvykle pro vyšší taxony (G+ a G- bakterie, houby). I jednotlivé druhy mají specifické složení lipidické frakce, které je ovšem do určité míry modifikováno podmínkami prostředí. Na podobném principu je založena stará metoda pro kvantifikaci biomasy hub na základě obsahu lipidu ergosterolu ve vzorku. Fakt, že složení lipidické frakce je závislé na nutričním stavu buňky (buňka v příznivých a nepříznivých podmínkách se velmi liší obsahem zásobních lipidů) vede k úvahám, zda by analýza mohla také určit fysiologický stav buňky. Analýza lipidů se obvykle provádí jako: - analýza všech lipidů (TLA) - analýza membrávých lipidů (PLFA, phospoholipid fatty acids) - analýza methylesterů mastných kyselin (FAME, důvodem je nutnost esterifikace při analýze na plynovém chromatografu).

31 Analýza methylesterů mastných kyselin (FAME) Mastné kyseliny jsou v mikrobiální buňce obvykle složkou buněčných a dalších membrán. Volné mastné kyseliny jsou obvykle označovány kódy, které znázorňují délku řetězce, počet a umístění dvojných vazeb, větvení, přítomnost cyklopropanového kruhu atd.

32 Analýza mikrobiálních lipidů

33 Základní kroky analýzy polárních lipidů Postup získání profilů mikrobiálního společenstva na základě analýzy lipidů 1.Extrakce lipidů z půdního vzorku 2. SPE frakcionace lipidů Uvolnění lipidů z buněk do chloroformu i14:0 PLEL i20:1 PLEL i20:0 PLEL 3A. Uvolnění isoprenoidních řetězců archaeálních EL-PLFA fosfolipidů (PLEL) HI 4. Separace & identifikace PLFA/ PLEL (GC-MS) 5. Specifické profily PLEL a PLFA půdního mikrobního společenstva NEL-PLFA 3B. Uvolnění mastných kyselin z bakteriálních a mikroeukaryotních PLFA & 3C. PLFA frakcionace na základě přítomnosti esterově a neesterově vázaných skupin KOH Fosfolipidy (PL) Glykolipidy Neutrální lipidy Original slide courtesy of Dana Elhottová

34 Analýza methylesterů mastných kyselin (FAME) Výsledkem stanovení na GC je chromatogram, na jehož základě se stanoví relativní a absolutní množství jednotlivých MK ve vzorku. Vzhledem k tomu, že jednotlivé mastné kyseliny jsou charakteristické pro určité taxony, umožňuje FAME určit podíl biomasy G+ či G- bakterií nebo hub. Vzorky lze na základě profilů MK srovnávat a stanovovat jejich podobnost či diverzitu. U čistých kultur je do určité míry možno použít výsledků k identifikaci ve spojení s databází kmenů (např. systém Sherlock).

35 Analýza methylesterů mastných kyselin (FAME) Mastné kyseliny jsou v mikrobiální buňce obvykle složkou buněčných a dalších membrán. Volné mastné kyseliny jsou obvykle označovány kódy, které znázorňují délku řetězce, počet a umístění dvojných vazeb, větvení, přítomnost cyklopropanového kruhu atd. např. 18:0 je mastná kyselina s osmnáctiuhlíkatým řetězcem, bez dvojných vazeb 18:2 ω 6,9 je rovněž osmnáctiuhlíkatá MK se dvěma dvojnými vazbami na šestém a devátém uhlíku od methylového konce molekuly br označuje větvení cy označuje pozici cyklopropanového kruhu Před analýzou na plynovém chromatografu jsou MK esterifikovány methylovou skupinou.

36 PC 2 (17.1%) Analýza lipidů: Přeměna listového opadu Month PC 1 (52.4%) Analýza hlavních komponent složení mikrobiálního společenstva v opadovém sáčku na základě profilů PLFA. Enzymové aktivity na rozkládajícím se opadu ukazují sukcesivní změny: pokles aktivity β-glukosidázy, vzestup aktivity endoglukanázy a maximum produkce ligninolytických enzymům mezi měsícem. Mikrobiální společenstvo na rozkládaném opadu se rovněž v čase vyvíjí.

37 Analýza mikrobiálních lipidů Výhody a nevýhody metody - metoda je založena na použití biomasy, nikoli nukleových kyselin; extrakce je proto obvykle jednodušší, produkuje reprezentativnější vzorek a vzorek je analyzován přímo (x PCR) - umožňuje studovat zároveň populace bakterií, půdních hub i dalších mikroorganismů - poměrně nízká citlivost (metoda nezávislá na kultivaci) -náročnost na vybavení (kapalinový nebo plynový chromatograf) - zastoupení mikroorganismů v prostředí nemusí být homogenní (odebrání reprezentativního vzorku) - nerozlišuje se živá a mrtvá, aktivní a pasivní biomasa - nemá vysokou taxonomickou diskriminační schopnost - složení biomasy může odrážet fyziologický stav mikroorganismu

38 Stable Isotope Probing (SIP) Metoda je založená na studiu inkorporace stabilního (neradioaktivního) isotopu uhlíku 13 C do mikrobiální biomasy. Umožňuje spojit studium funkce společenstva s taxonomickou detekcí aktivních druhů (označených 13 C). Do studovaného systému se přidá 13 C-značený substrát (například glukóza). Po inkubaci se stanovuje obsah 13 C v markerových molekulách. Jako markerové molekuly se používají mastné kyseliny (ve spojení s analýzou lipidů), 16S rdna či 16S rrna (rozdělení lehkých a těžkých molekul diferenciální centrifugací). Metoda SIP byla vyvinuta ve spojení s analýzou mastných kyselin. Využití DNA umožnilo taxonomickou identifikaci mikroorganizmů. Nejnověji (v roce 2002) byla popsána metoda RNA-SIP, která přinesla vysoké zvýšení citlivosti protože aktivně rostoucí bakteriální buňky mají až 18,000 kopií 16S rrna namísto pouze 12 kopií 16S rdna. Proto RNA-SIP umožňuje detekci využití substrátu v kratším časovém úseku než se buňky stačí rozdělit, tedy dříve, než může přidání substrátu ovlivnit složení společenstva. Nutné vybavení: značený substrát, centrifuga o požadovaných parametrech.

39 Stable Isotope Probing (SIP) Po přidání substrátu, značeného stabilním isotopem 13 C, se značený isotop akumuluje v biomase aktivně metabolizujících mikroorganismů. Složení aktivního společenstva lze pak vyhodnotit při analýze lipidů anebo po separaci těžkých (značených) a lehkých molekul DNA pomocí molekulárních metod. Separace nukleových kyselin mezi 12 C a 13 C není obvykle v praxi úplně bezproblémová, protože část mikroorganizmů je značena pouze částečně. Proto mezi frakcemi s 12 C a 13 C obvykle bývá postupný přechod.

40 Metody: Stable Isotope Probing (SIP) 13C-značená celulóza DNA extrakce Rozdělení DNA ultracentrifugací na základě vznášivé hustoty DGGE neoznačená 12 C-DNA 13 C DNA T-RFLP Klonování a sekvenace Mikrobiální společenstvo Vzorek CO 2 vysráženi DNA ve frakcích vzorky obsahující 13 C, nebo 12 C DNA identifikace frakcí v kterých je přítomna DNA pomocí qpcr C DNA 0.4 Podíl 13 C-CO 2 Celková respirace Original slide courtesy of Mary Beth Leigh

41 Aktivní část mikrobiálního společenstva: Označení druhů, využívajících celulózu isotopem 13 C Podíl DNA mikroorganismů (qpcr), využívajících celulózu (zeleně) 12 C-DNA Bakterie L horizont Houby Analýza společenstva hub pomocí T-RFLP Zelené sloupce: houby využívající celulózu Červené sloupce: ostatní druhy 400 L horizont 13 C-DNA O horizont Bakterie O horizont Houby

42 Stable Isotope Probing (SIP) Výhody a nevýhody metody - rozlišuje aktivní a neaktivní mikroorganismy (biomasu) - umožňuje selektivně sledovat využití určitého (značeného) substrátu - ve spojení s RT-PCR je extrémně citlivá a umožňuje detekci složení nerostoucího společenstva - vyžaduje spojení s dalšími technikami (PCR nebo RT-PCR a DGGE, RFLP nebo FAME) - nutné speciální vybavení (ultracentrufuga a nejlépe také RT-PCR) - substráty značené stabilními isotopy jsou drahé (13C glukóza Kč/g, 13 C celulóza Kč/g, 13C lignin Kč/g) a je jich k dispozici omezený počet

43 Literatura k dalšímu studiu metody v ekologii mikroorganizmů Alef K a Nannipieri P Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press půdní mikrobiologie a biochemie. Kowalchuk GA a kol Molecular Microbial Ecology Manual. Kluwer Academic Publishers podrobné protokoly molekulárních (DNA) metod. Burns RG a Dick RP Enzymes in the Environment Activity, Ecology and Applications. Dekker půdní enzymy. Madsen EL Environmental Microbiology From Genes to Biogeochemistry. Wiley-VCH environmentální mikrobiologie. Paul EA a kol Soil Microbiology, Ecology, and Biochemistry. Academic Press, 3rd edition metody v půdní ekologii, mikrobiologie půdy. De Bruijn et al Handbook of Molecular Microbial Ecology. Wiley molecular methods and metagenomics

44 DIPLOMOVÉ PRÁCE - EKOLOGIE MIKROORGANISMŮ LABORATOŘ ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGIE Mikrobiologický ústav AV ČR Saprotrofní houby v půdě Exprese a aktivita enzymů v prostředí Přeměna organických látek v půdě Interakce miroorganizmů Procesy cyklu C a N Ekosystémy narušené lidskou činností Více informací: Petr Baldrian (baldrian@biomed.cas.cz, ) sránky skupiny a nabídka témat online: