PLATELIA TOXO IgG TMB

Transkript

1 PLATELIA TOXO IgG TMB 96 TESTŮ SOUPRAVA PRO KVALITATIVNÍ / KVANTITATIVNÍ DETEKCI ANTI-TOXOPLASMA GONDII IgG V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ POMOCÍ ENZYMOVÉ IMUNOANALÝZY Pouze pro diagnostiku in vitro Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po konečnou komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propuštěna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace vztahující se k výrobě a kontrole každé jednotlivé šarže jsou uchovávány naší společností.

2 OBSAH 1- POUŽITÍ KLINICKÝ VÝZNAM PRINCIP TESTU SLOŽENÍ SOUPRAVY BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, OCHRANA ZDRAVÍ MATERIÁL NUTNÝ K PROVEDENÍ TESTU, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ REAGENCIÍ ODBĚR, PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ VZORKŮ PRACOVNÍ POSTUP VÝPOCET A INTERPRETACE VÝSLEDKU ÚCINNOST A OMEZENÍ TESTU LITERATURA

3 1- POUŽITÍ PLATELIA Toxo IgG TMB je in vitro diagnostická souprava umožňující kvalitativní a kvantitativní stanovení protilátek IgG proti Toxoplasma gondii v lidském séru nebo plazmě. 2- KLINICKÝ VÝZNAM T. gondii je prvok, vyvolávající infekci u různých druhů živočichů a ptáků. Toxoplasmóza, častá u lidí a zvířat, probíhá typicky častěji bez příznaků. Rozšíření této infekce v populaci, stanovený pomocí sérologických testů, se může lišit v závislosti na zemi původu a věku. Během těhotenství toxoplasmóza působí vážné vrozené abnormality (zejména poškození mozkových funkcí) a občas narození mrtvého dítěte. Průkaz Toxo IgG protilátek u žen před početím poskytuje jistotu ochrany plodu před možnou toxoplasmózou během těhotenství. Predispozice k vážným infekcím toxoplasmózou je běžná u osob postižených syndromem získané imunodeficience (AIDS), nebo s jiným postižením imunity. Tyto infekce nastanou hlavně následkem reaktivace cyst T. gondii, přítomných před infekcí HIV. Specifická diagnóza infekce T. gondii může být komplikovaná a izolace parazita je vzácná. Sérologická konfirmace protilátek proti T. gondii svědčí o kontaktu s parazitem a stala se obecně uznávanou jako prostředek k určení imunního stavu a citlivosti vůči infekci. Vyšetření na několik izotypů umožňuje buď určení doby infekce a zvolení vhodné terapie v případě akutní infekce, nebo navrhnout profylaktická doporučení: hygienicko-dietní směrnice u těhotných žen, chemoprofylaxi u imunokompromitované populace. 3- PRINCIP TESTU Tento test je v principu technika enzymové imunoanalýzy na pevné fázi popsaná jako nepřímá ELISA. Antigen T. gondii použitý k potažení mikrotitrační destičky pochází z ultrasonikovaných tachyzoitů a je obohacený membránovými proteiny. Konjugát se skládá z peroxidázou značených monoklonálních protilátek specifických proti lidským řetězcům gama. První krok Naředěné vzorky se napipetují do jamek mikrotitrační destičky potažených antigenem T. gondii. Během inkubace po dobu 1 hod. při 37 C se protilátky proti T. gondii přítomné ve vzorcích naváží na

4 antigen T. gondii, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci se nenavázané protilátky a jiné sérové proteiny odstranění promytím. Druhý krok Do jamek mikrotitrační destičky se přidá konjugát (monoklonální protilátka specifická proti lidským gama řetězcům značená peroxidázou). Během druhé inkubace po dobu 1 hod. při 37 C se značená monoklonální protilátka váže na komplex protilátka IgG antigen T. gondii, navázaný na jamky mikrotitrační destičky. Nenavázaný konjugát se odstraní promytím. Třetí krok Přítomnost imunního komplexu (T. gondii Ag, anti-t.gondii IgG, konjugát anti-igg) se prokáže přidáním roztoku obsahujícího peroxidázový substrát a chromogen, který vyvolá barevnou reakci. Čtvrtý krok Po 30 min. inkubaci při pokojové teplotě se enzymová rekce zastaví přidáním kyseliny, 1 N H2SO4. Hodnota optické denzity naměřené pomocí spektrofotometru při 450/620 nm je úměrná množství protilátky IgM proti T. gondii, přítomné ve vzorku. Naměřená optická denzita je pomocí kalibrační křivky převedena na IU/ml. Kalibrátory (R4a, R4b, R4c) jsou kalibrovány proti standardům WHO (TOXM 185). 4- SLOŽENÍ SOUPRAVY Všechna činidla jsou výlučně pro diagnostické použití in vitro. Štítek Složení reagencie Množství R1 Mikrotitrační destička Mikrotitrační destička:12 stripů po 8 oddělitelných jamkách, potažených antigeny T. gondii ( kmene RH). 1 destička R2 Koncentrovaný promývací roztok R3 Kalibrátor 0 Koncentrovaný promývací roztok (10 x): TRIS-NaCl pufr ph 7,4, 1% Tween 20. Konzervační činidlo: 0,01% thiomerosal. Kalibrátor 0: lidské sérum nereaktivní na protilátky anti-t. gondii a nereaktivní na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBs Ag), na protilátky proti viru lidské imunodeficience( HIV1 - HIV2) a protilátky proti viru hepatitidy C (HCV). Konzervační činidlo: < 0,01% thiomerosal. 1 lahvička 100 ml 1 lahvička 1 ml

5 R4a Kalibrátor 6 Kalibrátor 6 IU/ml: TRIS-NaCl pufr (ph 8 ± 0,2), lidské sérum reaktivní na protilátky anti-t. gondii a nereaktivní na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBs Ag), na protilátky proti viru lidské imunodeficience (HIV1 - HIV2) a protilátky proti viru hepatitidy C (HCV), hovězí sérový albumin, glycerol, E102 a E12, konzervační činidlo: < 0,01% thiomerosal a < 0,5% Proclin 300. R4b Kalibrátor 6 Kalibrátor 60 IU/ml: TRIS-NaCl pufr (ph 8 ± 0,2), lidské sérum reaktivní na protilátky anti-t. gondii a nereaktivní na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBs Ag), na protilátky proti viru lidské imunodeficience (HIV1 - HIV2) a protilátky proti viru hepatitidy C (HCV), hovězí sérový albumin, glycerol, E102 a E122, konzervační činidlo: < 0,01% thiomerosal a < 0,5% Proclin 300. R4c Kalibrátor 240 Kalibrátor 240 IU/ml: TRIS-NaCl pufr (ph 8 ± 0,2), lidské sérum reaktivní na protilátky anti- T. gondii a nereaktivní na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBs Ag), na protilátky proti viru lidské imunodeficience (HIV1 - HIV2) a protilátky proti viru hepatitidy C (HCV), hovězí sérový albumin, glycerol, E102 a E122, konzervační činidlo: < 0,01 % thiomerosalu a < 0,5 % Proclin 300. R6 Konjugát (50 x) Konjugát: myší monoklonální protilátka proti lidským řetězcům gama konjugovaná s křenovou peroxidázou; koncentrovaná (50x). R7 Ředící roztok Ředicí pro vzorky a konjugát: TRIS-NaCl pufr (ph 7,7 ± 0,15), hovězí sérový albumin, 0,1 % Tween 20 a fenolová červeň. Konzervační činidlo: < 0,01 % thiomerosalu. R8 TMB substrátový pufr R9 Chromogen: roztok TMB R10 Zastavovací roztok Substrátový pufr: roztok kyseliny citrónové a acetátu sodného o ph 4,0, obsahující 0,015 % H2O2 a 4 % DMSO. Chromogen: roztok obsahující tetramethyl benzidin (TMB). Zastavovací roztok: 1 N kyselina sírová. 1 lahvička 1 ml 1 lahvička 1 ml 1 lahvička 1 ml 1 lahvička 0,6 ml 2 lahvičky 80 ml 1 lahvička 60 ml 1 lahvička 5 ml 1 lahvička 28 ml Samolepicí fólie. 4

6 5- BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, OCHRANA ZDRAVÍ Upozornění Spolehlivost výsledků správném uskutečnění následujících zásad správné laboratorní praxe: Nepoužívejte reagencie s prošlou exspirační lhůtou. Nekombinujte reagencie z různých výrobních šarží v jednom běhu testu. POZNÁMKA: u promývacího roztoku (R2, identifikace na štítku : 10 x, modré zbarvení), substrátového pufru (R8, identifikace na štítku: TMB buf., modré zbarvení), chromogenu (R9, identifikace na štítku: TMB sol., zelené zbarvení) a zastavovacího roztoku (R10, identifikace na štítku: 1 N, červené zbarvení ) je možno použít s danou soupravou i jiné výrobní šarže než ty, které jsou v soupravě obsaženy, za předpokladu, že pro daný běh testu se použije vždy stejná šarže. Tyto reagencie lze použít i s některými dalšími našimi výrobky. Podrobné informace vám poskytne naše firma. Před použitím ponechte reagencie ustálit po dobu 30 min. při laboratorní teplotě. Reagencie pečlivě nařeďte a zabraňte jejich kontaminaci. Test neprovádějte v přítomnosti reaktivních výparů (kyseliny, alkalické látky, aldehydy) nebo v prašném prostředí, které by mohlo měnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Používejte laboratorní sklo a pomůcky důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo raději materiál pro jednorázové použití. Mikrotitrační destičky nesmí po ukončení promývání před napipetováním další reagencie vyschnout. Enzymatická reakce je velmi citlivá na působení kovových iontů. Proto nesmí substrátový a konjugátový roztok přijít do kontaktu s kovy. Substrátový roztok (substrátový pufr a chromogen) musí být bezbarvý. Pokud se během několika minut po přípravě roztoku objeví modré zabarvení, je roztok nepoužitelný a musí být nahrazen jiným. Tento roztok se může připravovat v čisté plastové vaničce na jednorázové použití nebo ve skleněné nádobce, která byla předem umyta 1 N HCl, důkladně opláchnuta destilovanou vodou a vysušena. Roztok uchovávejte ve tmě. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Promývání mikrotitrační destičky je kritickým krokem testu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a přesvědčte se,

7 že během promývání jsou všechny jamky zcela naplňovány a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může vést k chybných výsledků. Pro konjugát a substrátový roztok nikdy nepoužívejte stejnou nádobku. Kontrolujte přesnost a správnou funkci pipet a jiného náčiní. Neměňte pracovní postup. Ochrana zdraví a bezpečnost práce Všechny reagencie obsažené v soupravě jsou určeny výhradně pro diagnostické použití in vitro. Během manipulace s reagenciemi a vzorky používejte ochranné rukavice určené pro jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Materiál lidského původu použitý pro přípravu reagencií byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBs Ag), protilátky proti viru hepatitidy C (HCV) a protilátky proti virům lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti-hiv2). Poněvadž žádná metoda nemůže zcela vyloučit přítomnost infekčních agens v materiálu, zacházejte s reagenciemi lidského původu a vzorky jako s potenciálně infekčním materiálem schopným přenášet infekční onemocnění. Za infekční považujte veškerý materiál, který přišel do přímého styku s vyšetřovanými vzorky a reagenciemi lidského původu, a stejně tak i promývací roztok. Zamezte rozlití či rozstříknutí testovaných vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Potřísněné plochy musí být opláchnuty chlornanem sodným, naředěným na 10 %. Místa potřísněná kyselinou musí být napřed neutralizována hydrogenuhličitanem sodným, potom vyčištěna roztokem dezinfekčního prostředku a vysušena pomocí savého papíru. Materiál použitý k očištění musí být odložen do kontejneru pro infekční odpad. Vzorky, reagencie lidského původu a kontaminované materiály musí být před odložením dekontaminovány: - buď pomořením do roztoku chlornanu sodného o konečné koncentraci 5 % po dobu 30 min. - nebo autoklávováním při 121 C minimálně po dobu 2 hod. Autoklávování nejméně po dobu 1 hod. při 121 C je nejlepší metoda k inaktivaci virů HIV a HBV. UPOZORNĚNÍ: ROZTOKY OBSAHUJÍC CHLORNAN SODNÝ NESMÍ BÝT AUTOKLÁVOVÁNY.

8 UPOZORNĚNÍ: Některé reagencie obsahují: * Proclin 300 < 0,5% : DRÁŽDIVÝ R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží S28-37: Při styku s kůží okamžitě omyjte velkým množstvím vody a mýdlem. Používejte vhodné ochranné rukavice. Při zacházení s chemikáliemi a při jejich odkládání je třeba postupovat dle správné laboratorní praxe. Vyvarujte se potřísnění kůže a sliznic substrátovým pufrem, chromogenem a zastavovacím roztokem (nebezpečí toxického působení, podráždění či popálení). Bezpečnostní list je k dispozici na vyžádání. 6- MATERIÁL NUTNÝ K PROVEDENÍ TESTU, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Mixer Vortex Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky, vybavený filtry 450 nm a 620 nm (*). Vodní lázeň nebo rovnocenný inkubátor pro mikrotitrační destičky s termostaticky nastavitelným na teplotu 37 ± 1 C (*). Nádoba na biologický odpad. Chlornan sodný a hydrogenuhličitan sodný. Destilovaná nebo deionizovaná voda. Odměrné válce opatřené stupnicí o objemu 25, 50, 100 a 1000 ml. Ochranné latexové rukavice pro jednorázové použití. Ochranné brýle. Savý papír. Automatické či poloautomatické nastavitelné či fixní pipety či multipipety o objemu 10 až 1000 µl a 1 ml, 2 a 10 ml. Manuální, poloautomatická či automatická promývačka mikrotitračních destiček (*). Zkumavky pro jednorázové použití. (*) Na vyžádání vám poskytneme další informace o vhodném vybavení, doporučeném naším technickým servisem. 7- PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ REAGENCIÍ Souprava může být uchovávána při +2-8 C až do data exspirace uvedeného na obalu. Poznámka: před použitím nechte reagencie ustálit na pokojovou teplotu ( C).

9 1) Reagencie hotové k použití Reagencie 1 (R1): mikrotitrační destička Každý rámeček obsahuje 12 stripů po 8 jamkách, které je možno odlomit a je uložen ve vzduchotěsně uzavřeném foliovém sáčku se spojem. Sáček rozstříhejte nůžkami nebo skalpelem 0,5 1 cm nad spojem. Nepoužité stripy ihned vraťte zpět do sáčku. Sáček opět pečlivě uzavřete a uložte jej při teplotě +2-8 C. Stripy jsou poté stabilní po dobu 1 měsíce. Reagencie 3 (R3), reagencie 4a (R4a), reagencie 4b (R4b), reagencie 4c (R4c), reagencie 10 (R10): reagencie uchovávané při +2-8 C jsou stabilní až do data exspirace, uvedeného na štítku (i když již byly jednou otevřeny). 2) Reagencie, které musí být připraveny Reagencie 2 (R2): promývací roztok 10x koncentrovaný K získání roztoku o pracovní koncentraci (R2d) jej nařeďte 1:10 destilovanou vodou. Při manuálním promývání je potřeba pro jednu destičku s 12 stripy 350 ml. Po naředění lze pracovní roztok uchovávat 2 týdny při teplotě +2-8 C. Koncentrovaný roztok lze uchovávat při teplotě C. Roztok konjugátu: reagencie 6 (R6) + reagencie 7 (R7) Pro přípravu roztoku konjugátu o pracovní koncentraci (R6d) pro jednu mikrotitrační destičku nařeďte 0,5 ml 50 x koncentrovaného konjugátu v 25 ml ředícího roztoku (R7). Důkladně promíchejte. Pro přípravu objemu požadovaného pro jednu 8-jamkového stripu vydělte tyto objemy deseti. Roztok konjugátu o pracovní koncentraci je nutno po naředění použít do 60 min. Substrátový roztok: reagencie 8 (R8) + reagencie 9 (R9) Chromogen (R9) nařeďte substrátovým pufrem (R8) v poměru 1 : 11 (např.: 1 ml reagencie R ml reagencie R8). Po naředění lze reagencii uchovávat ve tmě při pokojové teplotě ( C) po dobu 6 hod. 8- ODBĚR, PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ VZORKŮ 1. Doporučeným typem vzorků jsou sérum nebo plazma (EDTA, citrát a heparin). 2. Dodržujte následujíc doporučení pro práci se vzorky, jejich přípravou a uchovávání: Vzorky krve odeberte běžným způsobem ze žíly. Pro přípravu séra ponechte vzorky před centrifugací zcela srazit. Po celou dobu nechte zkumavky zcela uzavřené.

10 Po centrifugaci oddělte sérum nebo plazmu od sraženiny nebo červených krvinek do těsně uzavřených zkumavek vhodných pro uložení. Vzorky mohou být uchovávány při +2-8 C jestliže testování bude provedeno během 7 dnů. Jestliže test nebude dokončen během 7 dnů, nebo pro zasílání vzorků, zamrazte je na -20 C, nebo na nižší teplotu. Vzorky rozmrazujte pouze 3 x. Zamrazené vzorky musí být po rozmrazení pečlivě promíchány. 3. Obsah 90 g/l albuminu, 100 mg/l bilirubinu, ekvivalent 36 g /l trioleinu (triglyceridu) ve vzorcích a do 10 g/l hemoglobinu v hemolyzovaných vzorcích neovlivňuje výsledky. 4. Vzorky nezahřívejte. 9- PRACOVNÍ POSTUP Přesně dodržujte uvedený pracovní postup. Pro každou sérii stanovení používejte kontroly k validaci výsledků testu. Dodržujte správnou laboratorní praxi. 1. Pečlivě sestavte plán umístění a identifikace vzorků. 2. Připravte naředěný promývací roztoku (R2d) (viz kapitola 7). 3. Vyjměte rámeček a stripy (R1) z ochranného sáčku. 4. Stripy mikrotitrační destičky jedenkrát promyjte promývacím roztokem o pracovní koncentraci. Mikrotitrační destičku obraťte dnem vzhůru a lehkým poklepáním na savý papír z jamek odstraňte zbylou tekutinu. 5. Testovaná séra nařeďte tak, že 10 µl vzorku přidejte do 1 ml ředicího roztoku (R7). Kalibrátory 0, 6, 60 a 240 IU/ml (R3, R4a, R4b a R4c) se ředí stejným způsobem 1/101. Naředěné vzorky promíchejte na vortexu. 6. Při manuálním provedení testu, do jamek napipetujte 200 µl naředěných kalibrátorů a testovaných vzorků následujícím způsobem: Jamka 1A: 200 µl kalibrátoru 0 IU/ml (R3) naředěného 1/101. Jamka 1B: 200 µl kalibrátoru 6 IU/ml (R4a) naředěného 1/101. Jamka 1C: 200 µl kalibrátoru 60 IU/ml (R4b) naředěného 1/101. Jamka 1D: 200 µl kalibrátoru 240 IU/ml (R4c) naředěného 1/101. Jamka 1E,1F,1G, atd.: 200 µl vzorku naředěného 1/ Je-li to možné, překryjte mikrotitrační destičku samolepicí fólií a pevně ji na destičku přimáčkněte, aby těsně přilnula k povrchu. Potom mikrotitrační destičku inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v inkubátoru pro mikrotitrační destičky při 37 ± 1 C po dobu 1 hod. ± 5 min.

11 8. 15 minut před koncem první inkubace připravte roztok konjugátu (R6d) o pracovní koncentraci. Pro jednu mikrotitrační destičku nařeďte 0,5 ml 50 x koncentrovaného konjugátu (R6) ve 25 ml ředícího roztoku (R7). Důkladně promíchejte (viz kapitola 7). 9. Odstraňte samolepicí fólii. Obsah všech jamek odsajte do nádoby na biologický odpad (jež obsahuje chlornan sodný). Mikrotitrační destičku 3x promyjte promývacím roztokem (R2d) o pracovní koncentraci. Potom ji obraťte dnem vzhůru a lehkým poklepáním na savý papír z jamek odstraňte zbylou tekutinu (viz kapitola 10). 10. Do všech jamek ihned napipetujte 200 µl konjugátu (R6d) o pracovní koncentraci. Roztok konjugátu musí být před použitím opatrně promíchán. 11. Mikrotitrační destičku přelepte samolepicí fólií a pevně ji na destičku přitiskněte, aby těsně přilnula k povrchu. Potom mikrotitrační destičku inkubujte v termostaticky řízené vodní lázni nebo v inkubátoru pro mikrotitrační destičky při teplotě 37 ± 1 C po dobu 1 hod. ± 5 min. 12. Odstraňte samolepicí fólii, obsah všech jamek odsajte a mikrotitrační destičku 4 x promyjte jak je popsáno výše. Potom ji obraťte a lehkým poklepem na savý papír odstraňte zbylou tekutinu. 13. Do každé jamky ihned rychle napipetujte 200 µl promíchaného substrátového roztoku (R8 + R9). Reakci nechte vyvíjet ve tmě 30 min. při pokojové teplotě (18-30 C). Během této inkubace nepřekrývejte destičku samolepicí fólií. 14. Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku (R10) stejným způsobem a rychlostí jako při pipetování substrátového roztoku. 15. Pečlivě otřete dno destičky. Změřte optickou denzitu na spektrofotometru při 450/620 nm do 30 minut od zastavení reakce (před měřením musí být stripy vždy uchovávány mimo světlo). 16. U všech výsledků zkontrolujte, zda je shoda mezi měřením a s plánem umístění a identifikací vzorků.

12 10- VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 1) Detaily kalibrace Přítomnost a množství protilátek IgG proti T. gondii v testovaném vzorku se stanoví na základě porovnání optické denzity (OD) testovaného vzorku se standardy v jejich rozsahu. Kalibrátory 6, 60, 240 IU/ml obsažené v soupravě jsou kalibrovány proti standardu WHO (TOX M 185). Jestliže je stejné sérum testováno různými sérologickými metodami, mohou se mezi stanovenými titry objevit určité nesrovnalosti. Tyto nesrovnalosti jsou způsobeny skutečností, že T. gondii používaná v těchto různorodých metodách obsahuje různá množství solubilního membránového antigenu. 2) Kontrola kvality Do každého běhu testů zařaďte všechny kalibrátory. Pro validaci testu musí být splněna následující kritéria. Hodnoty optické denzity: - OD R3 0,200 - OD R4c 1,000 Poměr: OD R4a / OD R3 2 Jestliže tato kritéria nejsou splněna, je nutno test opakovat. 3) Výpočet kalibrační křivky a) Sestrojení kalibrační křivky Pro manuální redukci dat použijte milimetrový papír, přičemž naměřené hodnoty OD kalibrátorů (R3, R4a, R4b, R4c) naneste na svislou (y) osu souřadnic a příslušné koncentrace kalibrátorů (IU/ml) na vodorovnou (x) osu souřadnic. Získanými čtyřmi body proložte optimální křivku. b) Výpočet koncentrace v IU/ml Jestliže se naměřená hodnota OD vzorku nachází v intervalu OD R4a až OD R4c, najděte hodnotu změřené OD testovaného vzorku na ose y a tímto bodem proložte přímku rovnoběžnou s osou x směrem ke standardní křivce. V průsečíku se standardní křivkou spusťte kolmici na osu x. V průsečíku s osou x vyhodnoťte koncentraci v IU/ml. Poznámka: V případě, že zjištěná hodnota OD vzorku naředěného v poměru 1/101 je > OD R4c, je nutno původní vzorek naředit ředicím roztokem R7 v poměru 1/1010 a vzorek znovu otestovat. Zjištěné hodnoty IU/ml je pak nutno násobit faktorem 10.

13 4) Interpretace výsledků Průkaz IgG anti-t. gondii pomocí testu Platelia TM Toxo IgG znamená imunní stav pacienta. Titr < 6 IU/ml Hladina protilátek stanovená pomocí této metody není signifikantní = není dosaženo imunity. 6 IU/ml < titr < 9 IU/ml Hladina protilátek stanovená pomocí této metody není signifikantní= výsledek z jednoho vzorku séra není dostatečný důkaz imunního stavu pacienta proti T. gondii. Podle doporučení ve Francii by měl být znovu testován druhý vzorek pomocí dvou různých metod. 9 IU/ml < titr < 240 IU/ml Signifikantní hladina protilátky = dlouhodobá imunita nebo časná fáze sérokonverze. Titr > 240 IU/ml Vysoké hladiny protilátky = akutní sérokonverze nebo perzistentně vysoká úroveň imunity, pozorovatelná u některých subjektů. Omezení testu Diagnózu akutní infekce parazitem lze stanovit pouze na základě kombinace klinických a sérologických údajů. Výsledek vyšetření jednoho vzorku séra neposkytuje dostatečný důkaz pro stanovení diagnózy probíhající infekce. Pouze signifikantní zvýšení titru protilátek IgG proti T. gondii u dvou vzorků odebraných s minimálním odstupem tří týdnů a testovaných v jednom běhu testů umožňuje diagnózu akutní infekce, ale spíše by mělo být považováno za důkaz akutní infekce parazitem. Přítomnost protilátek IgM proti T. gondii by měla být rovněž zařazeno do sérologického sledování jedinců podezřelých na infekci T. gondii, poněvadž protilátky IgG proti T. gondii se mohou objevit poněkud později než protilátky IgM.

14 5) Návod k řešení problémů Nevalidovatelné nebo nereprodukovatelné reakce jsou často způsobeny: nedostatečným promytím mikrotitrační destičky, kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým titrem protilátek, Kontaminací substrátového roztoku oxidačními činidly (chlornan sodný, ionty kovů ). Kontaminací zastavovacího roztoku. 6) Příklad výpočtu Poznámka: Následující údaje jsou uváděny pouze jako příklad a nelze je použít místo výsledků uživatele. Výsledky Obsah jamek OD (450/620) Koncentrace (IU/ml) R3 (negativní) 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1, R4c 2, Sérum 1 (ředění 1/101) 0,108 Negativní Sérum 2 (ředění 1/101) 0,675 7 IU/ml Sérum 3 (ředění 1/101) 0, IU/ml Sérum 4 (ředění 1/101) 2, IU/ml Sérum 5 (ředění 1/101) 1, IU/ml * Pro ředění 1/1010 je konečná koncentrace IU/ml x 10 Validace testu - Hodnoty optické denzity - Poměr. OD R3 0,200. OD R4a / OD R3 2. OD R4c 1, ÚČINNOST A OMEZENÍ TESTU Studie byly provedeny se vzorky odebranými do suchých zkumavek, do zkumavek se separátory séra, zkumavek s aktivátory srážení nebo zkumavek s různými protisrážlivými prostředky (EDTA, heparin, citrát). 1. Účinnost Níže shrnuté funkční charakteristiky testu PLATELIA Toxo IgG TMB byly stanoveny u čerstvých vzorků sér, pocházejících od těhotných žen, imunosuprimovaných pacientů nebo od obyčejných dárců krve a u zmražených vzorků séra, určených jako pozitivní či negativní.

15 Srovnávací studie Celkem 787 náhodně vybraných vzorků pocházejících od těhotných žen bylo vyšetřeno metodou PLATELIA Toxo IgG TMB a dalším komerčně dostupným testem EIA. K rozřešení sporných výsledků byl použit test přímé aglutinace. Neurčité výsledky 23 vzorků byly z následujících výpočtů relativní specifičnosti a citlivosti a relativní shody vyřazeny. PLATELIA Toxo IgG TMB Výsledek Negativní Pozitivní Celkem Jiný test EIA Negativní Pozitivní Celkem Výsledky prospektivní studie (pracoviště 1) Relativní specifičnost 488/ % (99,0-100,0) Relativní citlivost 271/276 98,2 % (95,6-99,3) Relativní shoda 759/764 99,3 % (98,8-99,9) Studie specifičnosti Specifičnost tetu PLATELIA Toxo IgG TMB byla hodnocena na dvou na sobě nezávislých pracovištích. Pro charakterizaci sér byly použity komerčně dostupné testy EIA. Specifičnost testu byla stanovena na základě této charakterizace. K rozřešení sporných výsledků byl použit test přímé aglutinace. Neurčité výsledky byly z následujících výpočtů specifičnosti vynechány: - pracoviště 1: 99,8 % (403/404) - pracoviště 2: 100 % (488/488) Celkem: 99,9 % (891/892) Studie citlivosti Citlivost testu PLATELIA Toxo IgG TMB byla hodnocena na dvou na sobě nezávislých pracovištích. Pro charakterizaci sér byly použity komerčně dostupné testy EIA. Citlivost testu byla stanovena na základě této charakterizace. K rozřešení sporných výsledků byl použit test přímé aglutinace. Neurčité výsledky byly z následujících výpočtů citlivosti vyloučeny: - pracoviště 1: 100 % (196/196) - pracoviště 2: 98,2 % (271/276) Celkem: 98,9% (467/472)

16 Testem PLATELIA Toxo IgG TMB byly vyšetřeny sérokonverzní panely (pracoviště 1 a 2) a postinfekční panely (pracoviště 1) složené z: 84 vzorků séra od 33 těhotných žen (pracoviště 1), 48 vzorků od 14 těhotných žen (pracoviště 2). K charakterizaci sér byly použity komerčně dostupné testy EIA. K rozřešení sporných výsledků byl použit test přímé aglutinace. Na pracovišti 1 byl zaznamenán pozitivní výsledek metodou PLATELIA Toxo IgG TMB ve srovnání s ostatními použitými EIA testy dříve v 5 případech. Na pracovišti 2 byl zaznamenán pozitivní výsledek pomocí jiného testu EIA, odlišného od předtím použitého testu, ve srovnání s testem PLATELIA Toxo IgG TMB, dříve v 6 případech. Prevalence Prevalence pozitivity na IgG protilátky proti T. gondii v populaci se v různých zemích značně liší. V oblasti Paříže (Francie) je v populaci dárců krve, jež je považována za zdravou, míra pozitivity 67,6%: 2. Přesnost Opakovatelnost testu: 3 pozitivní a 1 negativní vzorek byly testovány 30 x ve stejných sériích.

17 Vzorek Negativní koeficient Pozitivní 1 Pozitivní 2 Titr IU/ml Pozitivní 3 Průměrná hodnota 0, Směrodatná odchylka 0,02 0,83 1,35 9,53 Variační koeficient 6,29 7,57 3,55 8,64 Reprodukovatelnost testu: 3 pozitivní a 1 negativní vzorek testovali dva laboratorní pracovníci trojmo v 5 různých dnech. Vzorek Negativní Koeficient Pozitivní 1 Pozitivní 2 Titr IU/ml Pozitivní 3 Průměrná hodnota 0,22 11,8 39,2 127,5 Směrodatná odchylka 0,08 1,65 5,14 14,13 Variační koeficient 34,11 13,90 13,10 11,08

18 3. Významné interference Bylo testováno 141 vzorků s následujícími charakteristikami, které by mohly potenciálně vést ke vzniku nespecifických reakcí. Specifičnost = 99,29% (140/141). Vzorek pozitivní na Počet vzorků Počet Poznámka reaktivních CMV IgG 5 1 Druhý pokus negativní CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Příušnice IgG 7 0 Příušnice IgM 3 0 Spalničky IgG 7 0 Spalničky IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Zarděnky IgG 5 0 Zarděnky IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Myelom 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Celkem 141 1

19 12 REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients ( ). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxo-plasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 18, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIVinfected patients.aids 1996; 10, DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.: Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; , DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988). 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. : Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxo-plasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108:

20 20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

21 PŘEHLED PRACOVNÍHO POSTUPU 1. Termostat inkubátoru nastavte na teplotu 37 ± 1 C. 2. Nařeďte chromogen R9 substrátovým pufrem R8 v poměru 1:11 (substrátový roztok). 3. Nařeďte 10 x koncentrovaný promývací roztok R2 destilovanou vodou v poměru 1: Všechny jamky 1x promyjte naředěným promývacím roztokem (R2d). 5. Kalibrátory a vzorky nařeďte ředicím roztokem R7 v poměru 1: Podle následujícího schématu napipetujte do jamek 200 µl naředěných kalibrátorů a vzorků: A R3 S5 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 F S2 G S3 H S4 S9 S10 S11 S12 7. Inkubujte 1 hod. při 37 C. 8. Připravte pracovní roztok konjugátu (R6 + R7). 9. Odsajte obsah jamek a 3x promyjte naředěným promývacím roztokem (R2d). 10. Do všech jamek napipetujte 200 µl pracovního roztoku konjugátu. 11. Inkubujte 1 hodinu při 37 C. 12. Odsajte obsah jamek a 4x promyjte naředěným promývacím roztokem (R2d). 13. Do všech jamek napipetujte 200 µl substrátového roztoku (R8 + R9). 14. Inkubujte 30 min. při pokojové teplotě (18-30 C) ve tmě. 15. Do všech jamek napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku (R10). 16. Změřte absorbance na spektrofotometru při 450/620 nm.

22

23

24 0459 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2006 Fax.: +33 (0) code: