PASTOREX CRYPTO PLUS DETEKCE SOLUBILNÍCH ANTIGENŮ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS V BIOLOGICKÝCH TEKUTINÁCH (SÉRUM, C.S.F., B.A.L.

Transkript

1 PASTOREX CRYPTO PLUS DETEKCE SOLUBILNÍCH ANTIGENŮ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS V BIOLOGICKÝCH TEKUTINÁCH (SÉRUM, C.S.F., B.A.L., MOČ) /07 1- KLINICKÝ VÝZNAM Kryptokokóza je oportunní infekce, která se vyskytuje u imunodefi- citních pacientů, zejména u pacientů s AIDS. Kryptokokóza je v současnosti u pacientů s AIDS hlavní příčinou úmrtí v důsledku infekce. Výskyt kryptokokózy se pohybuje v rozmezí 2 % - 10 % v západní Evropě a Spojených státech a v některých částech Afriky je větší než 15 % (3). U těchto pacientů se sníženou imunitou se infekce po primární plicní fázi rychle šíří do centrálního nervového systému (mozkových plen) a dalších orgánů (1). Solubilní antigeny se rychle stávají detekovatelné v séru, mozkomíšním moku (C.S.F.), bronchoalveolární laváži (B.A.L.) a v moči. Diagnóza kryptokokózy je založena na mikroskopické detekci opouzdřených kvasinek, na kultivaci Cryptococcus neoformans a na detekci kapsulárních antigenů v tělesných tekutinách (2). 2- PRINCIP Pastorex Crypto Plus je kvalitativní a semi-kvantitativní test, který využívá jednoduchou aglutinační techniku k detekci kapsulárního polysacharidu Cryptococcus neoformans, glukuronoxylomananu (GXM), v tělesných tekutinách (séru, CSF, BAL, moč). Tento test používá částice pokryté monoklonální protilátkou proti glukuronoxylomananu, který je hlavní složkou pouzdra Cryptococcus neoformans (4). Aglutinace v důsledku reakce mezi částicemi a GXM je viditelná pouhým okem. Hranice citlivosti pro sérum je 50 ng/ml. Test se provádí na tepelně inaktivovaných vzorcích (30 minut při 56 C), aby bylo možné eliminovat riziko HIV kontaminace. U všech vzorků, kromě vzorků moči, je nezbytná předchozí enzymatická úprava, která odstraňuje interference a zvyšuje citlivost detekce (5, 6, 7). Pozitivní vzorky jsou následně titrovány sériovým ředěním v pufru. Titr antigenu indikuje stav a rozšíření infekce Určení kinetiky antigenu v průběhu onemocnění může být využito ke stanovení účinnosti terapie (2). 3- SLOŽENÍ Souprava se 60 testy kód obsahující: Latex Cryptococcus: 1 kapací lahvička s 1 ml latexu Cryptococcus: latexové částice v glycinovém pufru senzibilizované (myší) anti-glukuronoxylomananovou protilátkou. Pozitivní kontrolní antigen: 1 kapací lahvička s 0,5 ml pozitivní kontroly: purifikovaný kapsulární polyosid Cryptococcus neoformans. Ředící pufr: 1 kapací lahvička s 10 ml glycin albuminového pufru Pronáza: 2 lahvičky s lyofilizovaným enzymem (pronáza), který se rozpouští v 1 ml destilované nebo demineralizované vody. Zastavovací roztok: 1 kapací lahvička se 2 ml zastavovacího roztoku (enzymatický inhibitor) 15 aglutinačních kartiček na jedno použití 100 malých jednorázových míchacích tyčinek. Všechny reagencie obsahují 0,02% merthiolát a méně než 0,1% azid sodný. 4- UCHOVÁVÁNÍ Všechny reagencie jsou stabilní až do dat exspirace uvedených na štítku, pokud jsou uchovávány při +2-8 C v nepřítomnosti mikrobiální kontaminace (dokonce i po otevření). Rozpuštěná pronáza může být uchovávána po dobu čtyř týdnů při +2-8 C nebo několik měsíců při -20 C. Lahvičku s latexovou reagencií uchovávejte dnem vzhůru. LATEXOVÁ REAGENCIE NESMÍ BÝT ZAMRAŽENA. 5- POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY. Pipety pro přesné odměření objemů Mikrozkumavky s těsným uzávěrem Horizontální rotační míchačka (160 ot./min) Mixér typu Vortex Vodní lázeň 56 C Nádoba s dezinfekčním přípravkem 1

2 6- UPOZORNĚNÍ Spolehlivost výsledků závisí na důsledném dodržování správné laboratorní praxe. Všechny reagencie a vzorky je třeba používat při laboratorní teplotě ( C). Nedotýkejte se reakčního povrchu aglutinačních kartiček. Pro každý testovaný vzorek použijte novou pipetu nebo pipetovací špičku. Před použitím protřepejte obsah lahviček s latexem. Otřete špičku kapací lahvičky, aby bylo možné získat dobře kalibrované kapky. Abyste nanesli kapky, držte lahvičku s reagencií ve svislé poloze. Pro každou reakci použijte novou tyčinku. Vyhoďte všechny použité jednorázové materiály do autoklávovatelné nádoby na odpad nebo do nádoby s dezinfekčním roztokem. HYGIENICKÉ A BEZPEČNOSTNÍ POKYNY Dodržujte vždy aktuální techniky a pokyny týkající se ochrany proti mikrobiologickým rizikům. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese 7- PRACOVNÍ POSTUP 1) PŘÍPRAVA ENZYMU PRONÁZY Rozpusťte obsah jedné lahvičky s pronázou v 1 ml destilované nebo demineralizované vody. Zamezte tvorbě pěny při rozpouštění a dbejte na úplné rozpuštění lyofilizátu. Pokud provádíte každý měsíc 30 až 40 testů, uchovávejte pronázu při +2-8 C (zůstává stabilní po dobu 4 týdnů). Pokud provádíte méně testů, připravte si do samostatných zkumavek alikvoty po 20 µl a uchovávejte je při -20 C 2) VZORKY Uchovávání Vzorky je nutné zpracovat co nejdříve po odběru. Pokud není okamžité zpracování možné, mohou být vzorky uchovávány po dobu několika hodin při teplotě +2 až +8 C. POZOR: používejte výhradně vzorky séra ze suchých zkumavek. Interference vzniklé nadbytkem albuminu, lipidů, hemoglobinu a bilirubinu nebyly testovány. Nejlepších výsledků je dosahováno při použití čerstvého séra. Zpracování a) Sérum, CSF, BAL Jestliže je CSF zakalený nebo obsahuje červené krvinky, centrifugujte jej po dobu 5 minut při 350 g (2000 otáček/min) a odeberte supernatant. Přeneste 120 µl testovaného vzorku do zkumavky opatřené těsným uzávěrem a přidejte 20 µl pronázy. Důkladně promíchejte a zahřívejte 30 minut při 56 C. Vyjměte zkumavku z vodní lázně a přidejte do ní 1 kapku zastavovacího roztoku (enzymatického inhibitoru). Důkladně promíchejte. POZOR: v případě použití vodní lázně dbejte na to, aby voda nepronikla do zkumavek, průnik vody do zkumavek by mohl vést ke zkreslení výsledků. b) Moč Nařeďte vzorek v poměru 1/2 v glycinovém pufru. 3) AGLUTINAČNÍ REAKCE Naneste 40 µl vzorku do kroužku na aglutinační kartičce. Vedle vzorku přidejte jednu kapku latexu Cryptococcus. Pomocí tyčinky důkladně promíchejte. Připravte negativní kontrolu smícháním 40 µl ředícího pufru s kapkou latexu. Aglutinační kartičku umístěte na třepačku na 5 minut (160 ot./min) při pokojové teplotě ( C) 2

3 8- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Odečtení Pozitivní reakce je indikována aglutinací latexových částic při použití testovaného vzorku, avšak nikoliv při použití negativní kontroly (latex + ředící pufr). Titrace (V tabulce doplnit šipky a závorky) Ředění v glycinovém pufru je možné připravit takto: Ředění 1:10 1:100 1:1000 1: Upravený testovaný vzorek 50 l 50 l 50 l 50 l Pufr 450 μl 450 l 450 l 450 l Poté se provede přesná titrace pomocí dvojnásobných sériových ředění počínaje poslední pozitivní zkumavkou: 50 µl + 50 µl pufru. POZNÁMKA: Interpretace aglutinace při vysokých ředěních se může lišit v závislosti na uživateli; při titraci nového vzorku od stejného pacienta se proto doporučuje ověřit titr předcházejícího vzorku. 9- KONTROLA KVALITY TESTU Citlivost latexu je možné pravidelně kontrolovat pomocí pozitivního kontrolního vzorku, který je součástí soupravy. Koncentrace GXM v pozitivní kontrole činí 200 ng/ml.kontrola kvality prováděná výrobcem 10- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci výrobku. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, pokud odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u společnosti Bio-Rad. 11- ÚČINNOST Monoklonální protilátka E1 používaná v tomto aglutinačním testu byla popsána Dromerem et al. (4). Dřívější studie aglutinačního testu s využitím bílých částic potvrdily dobré parametry účinnosti této protilátky. Jedna z těchto studií (8) byla provedena na 84 sérech od pacientů s kryptokokózou a na 47 kontrolních sérech. Bylo zjištěno, že ošetření pronázou zvyšuje citlivost a specificitu detekce GXM. Další hodnocení (9) prokázalo, že titry antigenů nebyly identické pro různé reagencie a že návrat na negativní hodnoty při detekci antigenu testem Pastorex Crypto Plus může odrážet účinnost léčby. Použití červených latexových částic namísto bílých částic zlepšuje viditelnost agregátů. Během klinického hodnocení prováděného v nemocniční laboratoři byly získány následující výsledky. CITLIVOST Vzorky od 38 pacientů s kryptokokózou. Vzorek Počet pacientů Pastorex Crypto Plus Typ Celkem Séra CSF BAL MOČ CELKEM * Celková citlivost testu Pastorex Crypto Plus hodnocená pomocí těchto 51 vzorků byla odhadnuta na 92 %. * Čtyři vzorky, které unikly detekci testem Pastorex Crypto Plus, byly rovněž negativní i při jiném aglutinačním testu na bázi polyklonálního antigenu. SPECIFICITA Vzorky od 92 pacientů s kryptokokózou. Vzorek Počet pacientů Pastorex Crypto Plus Typ Celkem Séra CSF BAL MOČ CELKEM

4 Specificita testu Pastorex Crypto Plus hodnocená pomocí těchto 96 vzorků byla odhadnuta na 98 %. Doplňující interní hodnocení provedená na 59 sérech, včetně 18 Sér od pacientů se zdokumentovanou nebo suspektní aspergilózou nebo kandidózou, vykázalo specificitu 100 %. Detekční limit GXM v séru činil přibližně 50 ng/ml. 12- OMEZENÍ TESTU Aglutinace může být inhibována velmi vysokými hladinami GXM (tzv. hook efekt). Jestliže máte jakékoliv pochybnosti ohledně interpretace dané reakce, opakujte test s použitím naředěného vzorku v poměru 1/100. Výsledky je třeba interpretovat s přihlédnutím k anamnéze pacienta. Pokud vzorek obsahuje antigen v koncentraci nižší, než je spodní mez detekce testu Pastorex Crypto Plus, mohou být získány falešné výsledky: v takovém případě je vhodné opakovat odběr vzorku později. Metoda detekce solubilních antigenů aglutinací latexovými částicemi umožňuje rychlejší diagnózu než konvenční kultivační metody. Klinické a bibliografické údaje týkající se detekce antigenu GXM ve vzorku získaném BAL a v moči pomocí latexových reagencií jsou v současné době omezené. Antigenní podobnost mezi pouzdrem kryptokoků a stěnou Trichosporon beigelii může vést k falešně pozitivním reakcím u pacientů s trichosporózou (2). Stejně jako u všech ostatních imunologických technik je nutné zvážit možnost zkřížené reakce. Při diagnostice kryptokokózy je nutné posoudit všechny klinické, radiologické a biologické (mikrobiologické, histologické a sérologické) aspekty, každé z těchto hodnocení je nutné provádět samostatně a interpretovat s opatrností. 13- LITERATURA 1. CAMERON M.L, BARTLETT J.A., GALLIS H.A., WASKIN H.A, Manifestations of Pulmonary Cryptococcocis in Patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome, R.I.D., 1991, 13, p STAIB F., Cryptococcocis in Aids - Mycological-diagnostic and epidemiological observations, Aids-Forshung (AIFO), 1987, p DROMER F., MATHOULIN S., DUPONT B, LAPORTE A., and the French Cryptococcosis Study Group. Epidemiology of Cryptococcosis in France : A 9-Year Survey ( ). Clin. Inf. Dis.1996, 23, p DROMER F., SALAMERO J., CONTREPOIS A., CARBON C., YENI P. Production, Characterization and Antibody Specificity of a Mouse Monoclonal Antibody Reactive with Cryptococcus neoformans Capsular Polysaccharide. Infect. and Immun., 1987, 55, p GRAY L.D., ROBERTS G.D. Experience with the Use of Pronase to eliminate Interference Factors in the Latex Agglutination Test for Cryptococcal Antigen. J. Clin. Microbiol., 1988, 26, p HEELAN J.S., CORPUS L, KESSIMIAN N. False-positive reaction in the Latex Agglutination Test for Cryptococcus neoformans Antigen. J.Clin.MIcrobiol. 1991, 29, p HAMILTON J.R., NOBLE A., DENNING D.W., STEVENS D.A. Performance of Cryptococcus Antigen Latex Agglutination Kits on Serum and Cerebrospinal Fluid Specimens of Aids patients before and after Pronase treatment. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, p TEMSTET A., ROUX P., POIROT J.L., RONIN O., DROMER F. Evaluation of monoclonal antibody based latex test for the diagnosis of Cryptococcosis : Comparison with two tests Using Polyclonal Antibodies J. Clin. Microbiol. 1992, 30, p SWINNE D., MEULEMANS L., DE VROEY Ch. Detection of Cryptococcus antigen with a mononucleal antibody based latex test (abstract) Trends in the management of systemic fungal infections, Nijmegen, The Netherlands, 5-7 Sept

5 5

6 6

7 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /07 Fax : +33 (0)