Principles of Flow Cytometry. Tomáš Kalina MOTOLSKÝ MINIKURZ CYTOMETRIE

Transkript

1 Principles of Flow Cytometry Tomáš Kalina MOTOLSKÝ MINIKURZ CYTOMETRIE

2 Basics of Flow Cytometry Fluidics Optics Electronics Cells in suspension flow in single-file through an illuminated volume where they scatter light and emit fluorescence that is collected, filtered and converted to digital values that are stored on a computer

3 Light can be measured at 90 : Side scatter + Fluorescence Laser Photodiode Freq Fluorescence Side scatter reflects the cell content

4 Fluorescence intensity FITC FITC Number of Events FITC FITC FITC FITC Relative fluorescence intensity

5 The automated Microscope Detector & Counter Waste Sample This primitive diagram shows the principle: Cells are passing the microscope objective, and an electronic circuit decides whether the cells is fluorescent or not. This is how a flow cytometer works!

6 Fluidcs

7 Hydrodynamic focussing in the cuvette Sample pressure low, small core stream. Good for DNA analysis High sample pressure, broader core stream. Bad for DNA analysis Sample Sheath Sample Sheath LOW HIGH

8 Summary Pressure (= Sheath Pressure) drives the sheath buffer through the cuvette, and the higher pressure in the sample tube (= Sample Differential) delivers the sample to the cuvette. In the cuvette the principle of hydrodynamic focussing arranges the cells like pearls on a string before they arrive at the laser interception point for analysis Hydrodynamic focussing cannot separate cell aggregates! Flow cytrometry is a technique that requires single cell suspensions

9 FACS Aria / FACS Canto Basic optics A system of prisms and lenses directs the laser light to the interrogation point in the cuvette LSR 2 / Cyan ADP

10 Laser delay Umožňuje inter-laser kompenzaci Vyžaduje stabilní fluidics Sheath Sample

11 Optics - detection

12 Summary Excitation light is steered with prisms and lenses to the interception point in the cuvette Emitted light is collected using lenses and is split up with dichroic mirrors and filters

13 Tasks for the electronical system Convert the optical signals into electonic signals (voltage pulses) Digitise the data Analyse Height (H), Width (W) and Area (A) of the pulse Send the data to the analysis computer

14 How a voltage pulse from the PMT is generated 1. Laser t Voltage 2. Laser t Voltage 3. Laser t Voltage

15 Height, Area, and Width Voltage Pulse Height (H) Pulse area(a) 0 40 Pulse Width (W) Time (µs)

16

17 Threshold The threshold defines the minimal signal intensity which has to be surpassed on a certain channel. All signals with a lower intensity are not displayed and not recorded for later analysis.

18 Summary During passing the laser voltage pulses are generated at the PMT Amplifiers enhance the signals Only signals passing the desired threshold(s) are analysed and recorded The data are finally passed to the analysis computer connected to the cytometer

19 FASC Sorting

20 Praktické aspekty přípravy vzorku Množství buněk do zkumavky Objem vzorku pro značení Objem protilátky / Titrace Metoda lyzace erytrocytů Fixovat či nefixovat? Objem vzorku pro měření Co a jak lze odložit?

21 Množství buněk do zkumavky Kolik buněk chcete analyzovat? Kolik je dostatečně? Pro správnou analýzu frekvence řídkých buněk (= rare cell analysis) nejmenší populace musí mít naměřeno alespoň 100 buněk Ztráty při každé centrifugaci cca 10-30% Mrtvý objem 5ml zkumavky cca 50ul

22 Množství buněk do zkumavky Např. Lymfocytární subpopulace: Nejmenší je CD19+, cca 10% - Chci změřit správně i 20x snížení CD19+buněk - Lymfocytů celkem (10x víc než CD19+) Ztráty při 2x centrif. cca 50% cca 25% zůstane ve zkumavce Při cca 1x10e6 lymfocytů v 1 ml. 60ul V CLIP-Cytometrie používáme 50ul / vzorek

23 Objem vzorku pro značení Objem protilátky / Titrace Správné množství protilátky je dané objemem vzorku, nikoliv počtem buněk!!! (kdo nevěří ať si to vyzkouší) Tedy čím víc vzorku tím víc protilátky Množství protilátky je závislé na pracovním protokolu, výrobce uvádí obecné doporučené množství pro obvyklý (= jeho vlastní protokol) Riziko špatné titrace: Málo moab snížený signál, až falešná negativita Moc moab zvýšené pozadí, až falešná poz, vysoká cena

24 Titrace Finální konc. ve vzorku 0,01 mg/ml 0,005 mg/ml 0,0025 mg/ml 0,00125 mg/ml 0, mg/ml 0, mg/ml 0, mg/ml viz Current protocols in Cytometry 4.1 Titering Antibodies Pokud zvýšíme množství buněk, např Ficoll separací a zahuštěním suspenze, NENÍ NUTNÉ zvyšovat množství moab

25 Metoda lyzace erytrocytů Fixovat či nefixovat? Amonium chlorid levný, stabilní jen týdny, ne měsíce. lze připravovat in-house FACS Lyse (BD) stabilní, snižuje FSC, dlouhá inkubace poškozuje tandemy, fixuje Versalyse, ADG-LYSE, Excell lyse Hypotonická lyzace

26 Objem vzorku pro měření - Pro 5ml zkumavky obvykle 250ul Vyšší koncentrace = rychlejší měření - Lze použít 1,5ml zkumavky a zmenšit mrtvý objem (u Caliburu a LSR2 pozor na vysátí při vkládání do SIP) - Lze použít HTS loader a 96 well plate

27 Co a jak lze odložit? Když: přijde vzorek v pátek večer.. rozbije se cytometr.. je beznadějně obsazeno Periferní krev vydrží 24h i při RT nebo v lednici Vzorek již připravený na měření 6h na ledu Vzorek již připravený fixovaný 0,5% PFA 24h (ne všechny tandemy tolerují PFA, PFA musí být čerstvý ) Transfix reagent stabilizace plné krve cca 5 dní (nutno ověřit pro vyšetřované znaky+moabs)