E-Klinická biochemie

Transkript

1 E-Klinická biochemie

2 Obsah Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření... 4 Statistika - společná příprava... 9 Referenční hodnoty, způsoby určení Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening Základy tvorby moče Základní vyšetření moče Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Stopové prvky Vitamíny - příprava Vitamíny Štítná žláza - příprava Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Hormony hypotalamu a hypofýzy Hormony kůry nadledvin Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy Význam stanovení kyslíku - příprava Význam stanovení kyslíku Význam stanovení osmolality, metabolismus vody - příprava Význam stanovení osmolality, metabolismus vody Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - příprava Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - text Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi Laboratorní markery onemocnění jater - příprava Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text Laboratorní diagnostika žloutenek Kostní metabolizmus - příprava Obsah 2

3 Obsah Kostní metabolizmus Funkční zkoušky ledvin Laboratorní diagnostika v gastroenterologii Diabetes mellitus - úvod do problému Diabetes mellitus Ischemická choroba srdeční Srdeční selhání Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů Laboratorní známky zhoubného novotvaru - příprava (připomenutí pojmů) Laboratorní známky zhoubného novotvaru Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Příprava Dědičné poruchy metabolismus-laboratorní diagnostika Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Laboratorní vyšetření u urolitiázy Laboratorní vyšetření v těhotenství Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku Základy toxikologie v klinické laboratoři Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Příprava - TDM Terapeutické monitorování léků Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Monitorování antikoagulační léčby Nutrice a metabolické bilance - příprava Nutrice a metabolické bilance Obsah 3

4 Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření Autoři: RNDr. Zdeněk Švagera, Ph.D.; Mgr. Radka Šigutová Recenzent: RNDr. Jiří Zadina, CSc. KAPITOLA 01 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Laboratorní diagnostický proces vedoucí k získání výsledku lze rozdělit na tři fáze, a to preanalytickou, analytickou a postanalytickou fázi (viz. schéma). Preanalytická fáze je definována jako období od indikace vyšetření lékařem až po vlastní analýzu biologického materiálu v laboratoři, tzn. představuje přípravu jedince na odběr biologického materiálu, vlastní odběr, uchování a transport odebraného vzorku do laboratoře a jeho přípravu k analýze. Význam této fáze je podpořen i mnoha publikacemi, které zmiňují, že až % chybných výsledků je způsobeno nedodržením či nerespektováním právě pravidel preanalytické fáze. Z tohoto důvodu je primárním úkolem laboratoře vybavit klienty všemi potřebnými instrukcemi (o přípravě pacienta, o odběru, o skladování a transportu biologického materiálu, o preanalytické úpravě vzorku) tak, aby bylo minimalizováno riziko vzniku chyb, které by mohly následně poškodit pacienta. Všechny tyto informace jsou shrnuty v laboratorních příručkách vyšetřujících laboratoří. Na preanalytickou fázi navazuje analytická fáze, která zahrnuje vlastní analýzu vzorku. Každá laboratoř musí mít zavedený systém kontroly kvality, aby byla zajištěna validita vydávaných výsledků. Analytickou fázi uzavírá fáze postanalytická, která je definována jako období od získání výsledku v laboratoři a jeho předání lékaři. Je nutné mít na paměti, že biologické vzorky jsou potencionálně infekční, a z toho důvodu je nutné při práci s biologickým materiálem (odběr materiálu, práce se vzorkem v laboratoři) používat ochranné pracovní pomůcky (gumové rukavice, ochranný plášť). V případě vysoce infekčního vzorku (např. HIV, hepatitida C) je nutné použít navíc i roušku a ochranné brýle. Při potřísnění oděvu nebo pokožky biologickým materiálem je nutné po omytí zasaženého místa použít dezinfekční přípravky. V případě poranění je nutné ránu ošetřit (nechat několik min. krvácet, umýt mýdlem, dezinfikovat) a vyhledat pomoc lékaře. Preanalytická fáze a zdroje její variability Jak již bylo zmíněno v úvodu, preanalytická fáze, předcházející vlastní analýze daného vzorku (daného parametru) v laboratoři, může být zdrojem mnoha chyb. Proto je nutné si ozřejmit, jaké faktory preanalytickou fázi nejvíce ovlivňují. Tyto faktory lze rozdělit dle časové posloupnosti: 4

5 Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření Před odběrem biologického materiálu Faktory ovlivňující preanalytickou fázi před odběrem biologického materiálu mohou být dále rozděleny na ovlivnitelné a neovlivnitelné. Mezi ovlivnitelné faktory patří např. dodržování určitého denního režimu, dietní návyky atd. Jako neovlivnitelné faktory vystupují např. věk, pohlaví, rasa atd. Ovlivnitelné faktory před odběrem biologického materiálu KAPITOLA 01 Významným faktorem patřícím mezi ovlivnitelné faktory před odběrem biologického materiálu je strava. Odběr krve by se měl VŽDY provádět nalačno. Pokud tomu tak není, lze díky metabolismu přijatých živin pozorovat zvýšení hladin některých metabolitů. Je zvýšena koncentrace glukózy, triacylglycerolů, volných mastných kyselin a lipoproteinů. Pokud má člověk dietu s převážným obsahem tuků, bude mít zvýšenou především koncentraci triacylglycerolů a naopak sníženou koncentraci dusíkatých látek v séru. V případě stravy bohaté na bílkoviny se zvyšuje koncentrace amoniaku a urey. Současně postprandiálně dochází k vyplavení hormonů (např. insulinu, který snižuje hodnoty kália a fosfátů). Skladba stravy může ovlivnit i ph moče, např. při konzumování zeleniny a ovoce je moč alkaličtější, naopak po požití masa a jídla s větším obsahem tuků a proteinů je kyselejší. Hladiny některých metabolitů může ovlivnit i konzumace různých nápojů (např. kofein zvyšuje koncentraci glukózy v krvi). Významný vliv na biochemické vyšetření má také alkohol. Po požití alkoholu stoupá téměř okamžitě v krvi koncentrace laktátu, klesá koncentrace hydrogenuhličitanů a glukózy. Při dlouhodobé zátěži organismu alkoholem dochází k poškození jater, což se projeví zvýšením koncentrace alaninaminotransferasy (ALT), dále aspartátaminotransferasy (AST) a gamaglutamyltransferasy (GGT). Jsou zvýšeny i koncentrace triacylglycerolů a cholesterolu. Dalším faktorem, který může ovlivnit konečný výsledek je fyzická zátěž organismu před vlastním odběrem. Dopad na výsledek bude záležet na typu fyzické aktivity, která může být buď krátkodobá, při které má organismus vysoký podíl především anaerobního metabolismu, nebo dlouhodobá (vytrvalostní), kdy organismus využívá převážně aerobního metabolismu. Při střední zátěži se zvyšuje hladina glukózy a dochází ke stimulaci sekrece inzulinu. Díky svalové činnosti se zvyšují také hodnoty enzymů AST, laktátdehydrogenasy (LD), kreatinkinasy (CK) a roste koncentrace laktátu a mastných kyselin. Při dlouhodobé namáhavé činnosti dochází k poklesu glykémie, nárustu koncentrace kreatininu a mnohonásobnému nárůstu hladiny laktátu. Jsou sníženy i hladiny cholesterolu a triacylglycerolů. Mechanické trauma je také jedním z ovlivnitelných faktorů před odběrem biologického materiálu, např. svalové trauma včetně intramuskulárních injekcí způsobuje vyplavení enzymů (CK, ALT, AST) a bílkovin svalové tkáně (např. myoglobinu). Jízda na kole může způsobit mechanické trauma prostaty, což se může projevit vyplavením prostatického sérového antigenu s následnou falešnou pozitivitou tohoto vyšetření. Při maratónském běhu a při chlopenních vadách dochází k mechanické hemolýze erytrocytů. Velmi častým problémem, který lze ovšem těžko postihnout, je vliv léků. Léky mohou ovlivňovat hladinu některých sledovaných analytů, např. kyselina acetylsalicylová (acylpyrin) v séru zvyšuje AST, ALT, bílkovinu v moči, furosemid zvyšuje v séru glukózu, amylasu (AMS), alkalickou fosfatasu (ALP) a snižuje sodný kation. Léky mohou také interferovat s analytickým principem stanovení, např. vitamín C, který má výrazné redukční vlastnosti, falešně snižuje hladiny analytů, při jejichž stanovení se využívá detekce pomocí peroxidu. Lék může také ovlivňovat rychlost metabolismu nebo eliminace sledovaného analytu či poškozovat nějaký orgán např. hepatotoxicita narkotik. Nezanedbatelným faktorem je také stres. Ve stresových situacích dochází k vyplavení stresových hormonů např. reninu, aldosteronu, somatotropinu, katecholaminů, kortizolu, glukagonu a prolaktinu. Proto je nutné odběr krve na stanovení prolaktinu provést až tři hodiny po probuzení. Dalším příkladem může být pokles cholesterolu o 60% proti výchozí hodnotě během 24 hodin po akutním infarktu myokardu. K normalizaci jeho koncentrace dochází až po řadě týdnů. Z tohoto důvodu se při příjmu pacientů s podezřením na akutní infarkt myokardu nedoporučují odběry na stanovení cholesterolu, HDL a LDL cholesterolu. Naopak, mírný stres může koncentraci cholesterolu zvýšit. Pooperační stres zase snižuje koncentraci tyreoidálních hormonů, transferinu a sekundárně zvyšuje koncentraci feritinu. Neovlivnitelné faktory před odběrem biologického materiálu Mezi neovlivnitelné faktory před odběrem biologického materiálu patří věk, pohlaví, rasa, biologické rytmy. Může sem být zahrnuta i gravidita, která je ale příliš specifickým případem ovlivnění preanalytické fáze, a proto nebude předmětem tohoto sdělení. Těmto efektům, s výjimkou biologických rytmů a gravidity, není nutné věnovat významnou pozornost, protože je nelze ovlivnit a jsou zohledněny pomocí referenčních mezí pro daný analyt. Věk je velmi významným neovlivnitelným faktorem na kterém je závislá většina sledovaných analytů. Starší člověk bude mít vyš- 5

6 Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření ší hodnoty cholesterolu než mladší. U dětí a dospívajících nalezneme vyšší aktivitu celkové alkalické fosfatasy než u dospělých, a to vlivem vyšší produkce kostní izoformy tohoto enzymu v důsledku růstu organismu. Stanovena je totiž celková aktivita alkalické fosfatasy, včetně kostní izoformy. Pozor také na vyšší hladinu celkové ALP u těhotných, a to vlivem vyšší produkce placentární izoformy tohoto enzymu. Pohlaví také významně ovlivňuje výsledek stanovení. Je známo, že mnoho parametrů je závislých na hormonální výbavě a tělesné konstituci, např. kreatinkinasa (CK), ALT, AST, ALP, kyselina močová, urea, hemoglobin, feritin, železo a cholesterol jsou vyšší u mužů než u žen. V ČR také přibývá lidí jiné než bílé rasy. Například aktivity CK a AMS či počet granulocytů roste vzestupně od bělochů přes žlutou rasu k afroameričanům (afroameričané mají až dvojnásobnou aktivitu CK a asiaté zase mají vyšší aktivitu slinné amylázy a vyšší koncentraci celkového bilirubinu). Dalšími vlivy, které je nutné vzít v úvahu, jsou biologické rytmy s různou časovou periodou, ať už v rámci jednoho dne (cirkadiánní) až po cykly s periodou přibližně jednoho roku (cirkanuální). Cirkadiánní změny jsou u různých parametrů různé např. u železa dochází v průběhu dne ke změnám až o 50%, u dalších parametrů se jedná o změny v desítkách procent, např. AST, ALT, LD, ALP. Snad nejvýraznější cirkadiánní změnou prochází kortizol, a to cca 250% s minimem ve večerních hodinách. Příkladem cirkanuálního rytmu může být změna koncentrace vitamínu D, která dosahuje maximálních hodnot v letních měsících díky vystavení pokožky intenzivnímu působení slunečního záření. KAPITOLA 01 Při odběru biologického materiálu Faktory ovlivňující preanalytickou fázi při vlastním odběru biologického materiálu souvisí především s prací odběrové sestry, která musí mít na paměti základní pravidla odběru, která mohou ovlivnit výsledek vyšetření. Jedná se především o načasování odběru, volbu vhodné odběrové soupravy, polohu pacienta při odběru, vliv žilní stáze a lokálního metabolismu, eventuálně vliv infuze a transfuze v nemocničním prostředí. Načasování odběru Načasování odběru je velmi důležitou součástí strategie získání validního výsledku. Odběry se provádí nejčastěji ráno, kdy je zajištěno, že je pacient nalačno (pokud respektuje obecná doporučení před odběrem) a je omezen vliv cirkadiánního rytmu zmíněného v předchozí kapitole. Jiný případ je například sledování glykémie (glykemický profil), nebo sledování farmakoterapie, kdy se provádí odběr na základě poločasu eliminace léčiva.. Poloha pacienta při odběru Při odběru je důležitá také poloha pacienta. Je nutné mít na paměti, že rozdíl v koncentraci proteinů ve vzpřímené poloze proti poloze vsedě po dobu 15 minut je 5 8 % a polohou vestoje proti poloze vleže cca 10-20%. Ve vzpřímené pozici totiž dochází k přesunu vody z intravasálního prostoru do intersticiálního, a tím k následnému vzrůstu vysokomolekulárních látek, především proteinů, lipoproteinů a látek vázaných na proteiny - vápenatý kation, hormony (kortizol, tyroxin) či některých léků. Obecně tedy platí, že by měl být biologický materiál odebírán stále ve stejné pozici, nejlépe standardním způsobem vsedě, což ale u hospitalizovaného pacienta vždy zajistit nelze. Použití turniketu a vliv lokálního metabolismu Zajímavý je také vliv lokálního metabolismu při použití turniketu při odběru. Bylo zjištěno, že již po jedné minutě po zatažení paže turniketem dochází k přesunu významného vody a iontů z cévy do intersticia s následným vzestupem koncentrace proteinů a látek vázaných na proteiny v krvi. Dlouhým zatažením paže či jejím podchlazením dochází ke změně lokálního metabolismu vlivem hypoxie, což má za následek vzrůst parciálního tlaku oxidu uhličitého, koncentrace kália a laktátu, což má za následek snížení ph. Také dochází ke změnám homeostázy spojené s uvolněním tkáňového faktoru. Nedoporučované, či přímo zakázané, je cvičení paže, které způsobuje především zvýšení koncentrace kália. Z těchto důvodů by neměla doba zatažení paže přesáhnout jednu minutu a po napíchnutí žíly je nutné turniket ihned uvolnit. Volba odběrového systému a vliv protisrážlivých činidel Velmi důležitá je také volba odběrového systému. Lze použít uzavřený nebo otevřený odběrový systém. V případě otevřeného 6

7 Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření odběrového systému se používá klasická jehla a Luerova stříkačka a po venepunkci je odebírána volně stékající krev přímo do zkumavky nebo velmi jemným tahem pístu. Dnes je ovšem preferován odběr do uzavřeného systému, při kterém je minimalizována kontaminace odebírajícího pracovníka krví a odběrové zkumavky jsou barevně odlišeny podle přidaného konzervačního či protisrážlivého činidla. Další výhodou uzavřeného systému je to, že je dodržen poměr protisrážlivého, ev. konzervačního činidla a odebrané krve. Jak již bylo zmíněno výše, je možné, na základě znalosti požadovaného vyšetření, zvolit typ protisrážlivého činidla (heparinát, citrát, oxalát, atd.). Pozor ale na volbu protisrážlivého činidla při stanovení kationů, protože protisrážlivé činidlo nesmí obsahovat stanovovaný kation. Např. použití EDTA s káliem způsobí nález vysoce patologické koncentrace kália ve vzorku!! EDTA je nevhodná také pro stanovení koncentrace dvojmocných kationtů, protože působí jako chelatační činidlo a tyto kationty váže do komplexu a způsobí nález falešně nízké koncentrace těchto iontů. V některých případech je k protisrážlivému činidlu přidána další (konzervační) látka, např. fluorid sodný, a to v případě stanovení koncentrace glukózy. Přídavek fluoridu sodného způsobí inhibici glykolýzy v erytrocytech a tím zabrání poklesu koncentrace glukózy v čase. Je nutné mít také na paměti, že pokud je použita odběrová soupravá s protisrážlivým činidlem, je nutné odebranou krev ihned po odběru šetrně promíchat. Bez promíchání je omezen účinek protisrážlivého činidla a dojde k nežádoucímu srážení krve. Při odběru je nutné zvolit také vhodný průsvit jehly, aby nedocházelo k hemolýze erytrocytů. KAPITOLA 01 Vliv infuze a transfuze U pacientů v kritickém stavu je nutné podávat transfuzní přípravky a infuze, které obsahují vysoké koncentrace vybraných látek a nízké koncentrace ostatních. Z tohoto důvodu může infuze ovlivnit stanovení některých látek, a to nejčastěji přímou kontaminací odběru nebo jen vlivem svých vlastností. Například infuze glukózy s káliem způsobuje falešné zvýšení koncentrace glukózy a kália. Infuze tukové emulze způsobuje chylozitu séra a infúze Hartmann obsahující vysokou koncentraci laktátu (>15 mmol/l) falešné zvýšení koncentrace laktátu. Naproti tomu infúze Plasmalyte způsobuje falešnou normalizaci koncentrace iontů v odebraném vzorku. Z tohoto důvodu je nutné při odběru po podání infuzního prostředku dodržovat jistá pravidla. Ideálně, provést odběr z druhé ruky, kde není aplikována infuze nebo zastavit infuzi na 15 minut a pak provést vlastní odběr. Při podání transfuze je nutné, z hlediska preanalytické fáze, brát zřetel především na její stáří. Se zvyšujícím se stářím erytrocytárního koncentrátu totiž dochází k poklesu koncentrace natria a glukózy vlivem metabolismu erytrocytů a naopak ke zvýšení koncentrace kália a laktátu. Po odběru biologického materiálu až do analýzy Toto období se týká času po odběru biologického materiálu až do jeho analýzy v laboratoři a zahrnuje manipulaci se vzorkem po odběru, jeho následný transport do laboratoře, centrifugaci, ev. jeho předúpravu před vlastní analýzou. Obecně platí, že pokud bude prováděn odběr nesrážlivé krve (odběrová nádoba s protisrážlivým činidlem), je třeba zkumavku ihned po odběru šetrně promíchat. V případě odběru srážlivé krve, je nutné s transportem vzorku vyčkat zhruba 30 minut, aby došlo k vysrážení vzorku (přesný čas nutný pro srážení udává výrobce odběrových souprav). Okamžitý transport biologického materiálu ihned po odběru může způsobit hemolýzu, a tím i znehodnocení vzorku. Problém hemolýzy, která ruší stanovení, nesouvisí jenom s uvolněním obsahu erytrocytů do séra či plasmy a následným zvýšením koncentrace těchto látek ve sledovaném materiálu, ale i uvolněním hemoglobinu, který interferuje vlivem své barevnosti přímo s fotometrickým stanovením nebo činidlem používaným pro stanovení. Pozor, hemolýzu může způsobit i přílišné chlazení vzorku, vysoké otáčky při centrifugaci a také úzká odběrová jehla. V následující tabulce je popsán vliv hemolýzy na vybraná biochemická stanovení. Zvýšení koncentrace nebo aktivity Snížení koncentrace nebo aktivity kálium, hořečnatý kation, laktátdehydrogenasa, aspartátaminotransferasa, alaninaminotransferasa, kreatinkinasa, kyselá fosfatasa gamaglutamyltransferasa, alkalická fosfatasa, amylasa Skladování vzorku před transportem či vlastní transport biologického materiálu je velmi důležitý a je nutné mu věnovat dostatek pozornosti, obzvláště jsou-li vzorky transportovány z periferie - obvodní lékaři a svoz vzorků do specializované laboratoře. Délka transportu se různí, ale během něj je nutné zabránit působení extrémních podmínek na transportované vzorky - horko, respektive mráz, minimalizovat třepání vzorku a zajistit, aby nedošlo k úplnému znehodnocení vzorku např. jeho vylitím. Z tohoto důvodu musí být vzorky transportovány v přepravních boxech s regulací teploty a jsou zajištěny proti vylití. Některé vzorky (tkáně) je nutné transportovat zamrazené i při velmi nízkých teplotách (-80 C) v suchém ledu. Pokud není dodržena doba do které je nutné vzorky zpracovat nebo podmínky transportu, dochází ke změnám koncentrace některých látek ve sledovaném materiálu. 7

8 Preanalytické vlivy na laboratorní vyšetření Příkladem může být pokles koncentrace glukózy a naopak nárůst koncentrace laktátu vlivem anaerobní glykolýzy krevních elementů. Některé analyty v biologickém materiálu jsou termolabilní, a to jak při pokojové teplotě (většina parametrů), tak některé paradoxně i při teplotě 4 C (např. klesá aktivita ALT či vzrůstá koncentrace kália vlivem inhibice ATPasy v erytrocytu). Některé analyty jsou fotosenzibilní a pokud nejsou transportovány a skladovány v temnu, dochází k jejich poklesu (např. bilirubin a porfyriny). Z tohoto důvodu mají některé analyty přímo doporučení pro skladování a transport, např. stanovení amoniaku v plazmě: proveďte anaerobní odběr, zabraňte hemolýze, dodržte poměr protisrážlivého činidla a krve a transportujte v transportní nádobě nebo na tajícím ledu. Analýzu je nutné provést do 20 minut po odběru. Jakmile jsou vzorky doručeny a přijaty do laboratoře, jsou buď přímo analyzovány (při použití plné krve) nebo musí být centrifugovány s cílem získat sérum či plasmu. Při centrifugaci je důležité zachovat správné podmínky, aby došlo k dokonalému oddělení séra (plazmy) od erytrocytů, a aby v případě plazmy došlo i k dokonalé sedimentaci leukocytů. Pokud jsou otáčky (relativní odstředivá síla) při centrifugaci příliš vysoké, může dojít k rozbití buněk a vylití jejich obsahu. U mnoha analytů je také nutné centrifugovat při snížené teplotě okolí (chlazené centrifugy), např. při analýzách hormonů. KAPITOLA 01 Samostatnou kapitolou je analýza moče, při které je používána buď moč sbíraná, ranní či jednorázová. Velmi často není pacient poučen o pravidlech sběru, tzn. nejčastěji sbírá moč déle či naopak kratší dobu než by měl a o přesném odečtu množství moče za sběrné období, nejčastěji 24 hodin, ani nemůže být řeč. Není ani zajištěno požadované skladování sbírané moče v lednici či její předúprava nutná pro stabilizaci sledovaného parametru. Obdobná situace je také v případě odběru ranní moče, která musí být pro analýzu sedimentu doručena do jedné hodiny po odběru. Odebraná moč je často do laboratoře doručena se zpožděním a díky tomu dochází k nálezu falešně negativních či pozitivních výsledků (nárůst počtu baktérií, nárůst ph působením ureasy bakterií a rozpadu buněčných elementů). Obecně tedy platí, že je nutné dodržovat podmínky transportu a skladování, které vzorky, lépe řečeno transportovaný materiál, vyžaduje. Nutné je myslet i na svozy materiálu obzvláště za extrémních podmínek (horko a mráz). Desatero rad pro správný výsledek 1. Poučte pacienta (proč vyšetření, dieta, fyzická zátěž) 2. Načasujte odběr 3. Správně vyplňte žádanku 4. Zvolte správný postup odběru 5. Zvolte správnou zkumavku 6. Naberte doporučené množství materiálu 7. Nerozlívejte biologický materiál 8. Správně označte zkumavky 9. Správně skladujte biologický materiálu do transportu 10. Zaručte odpovídající transport do laboratoře Literatura 1. Jaroslav Racek a kolektiv, - II. přepracované vydání, Vydavatelstvo: Galén, Jabor A., Zámečník M. Preanalytická fáze 2005, Ed. ČSKB ČLS JEP a SEKK, spol. s r.o., Praha, Lippi G, Chance JJ, Church S, Dazzi P, Fontana R, Giavarina D, Grankvist K, Huisman W, Kouri T, Palicka V, Plebani M, Puro V, Salvagno GL, Sandberg S, Sikaris K, Watson I, Stankovic AK, Simundic AM. Preanalytical quality improvement: from dream to reality. Clin Chem Lab Med Jul;49(7): Simundic AM, Nikolac N, Vukasovic I, Vrkic N. The prevalence of preanalytical errors in a Croatian ISO accredited laboratory. Clin Chem Lab Med Jul;48(7): Wallin O, Söderberg J, Van Guelpen B, Stenlund H, Grankvist K, Brulin C. Preanalytical venous blood sampling practices demand improvement--a survey of test-request management, test-tube labelling and information search procedures. Clin Chim Acta May;391(1-2):91-7. Epub 2008 Feb Bowen RA, Hortin GL, Csako G, Otañez OH, Remaley AT. Impact of blood collection devices on clinical chemistry assays. Clin Biochem Jan;43(1-2):

9 Statistika - společná příprava Statistika - společná příprava Autoři: Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D.; Ing. František Všianský Náhodná veličina KAPITOLA 02 Výsledkem většiny biochemických stanovení je získání reálného čísla, které je konkrétní hodnotou měřené náhodné reálné veličiny. Náhodné veličiny jsou zpravidla označovány velkými písmeny z konce latinské abecedy, například X, Y, Z, a jejich konkrétní (změřené) hodnoty odpovídajícími malými písmeny, například x, y, z. Pojem náhodná veličina vyjadřuje fakt, že nalezený výsledek je možno obecně získat zcela náhodně, přičemž skutečnost, jak často určitou hodnotu náhodná veličina nabývá, matematicky exaktně popisuje rozdělení pravděpodobnosti. Diskrétní a spojitá náhodná veličina Náhodné veličiny mohou být v principu dvojího typu diskrétní nebo spojité. Základní rozdíl mezi nimi spočívá ve skutečnosti, že zatímco spojitá náhodná veličina může nabýt libovolné reálné hodnoty, diskrétní veličina nabývá pouze izolované hodnoty. Diskrétní náhodná veličina Diskrétní náhodná veličina X může nabýt jen konečného nebo spočetného počtu hodnot, přičemž pro každou hodnotu je přiřazena nenulová pravděpodobnost jejího výskytu, tzn.. Jednotlivé pravděpodobnosti pak charakterizují diskrétní rozdělení pravděpodobnosti. Součet všech těchto pravděpodobností pro jednotlivé hodnoty je roven jedné, tedy platí že. 9

10 Statistika - společná příprava KAPITOLA 02 Obrázek 2p.1 Rozdělení pravděpodobnosti diskrétní náhodné veličiny Spojitá náhodná veličina Spojitá náhodná veličina X nabývá všech hodnot z určitého intervalu. Její pravděpodobnostní rozdělení je popsáno pomocí reálné nezáporné funkce, která se nazývá frekvenční funkce nebo také hustota rozdělení. Pomocí hustoty počítáme hodnoty průměru a rozptylu spojité náhodné veličiny. Velmi často se k popisu rozdělení pravděpodobnosti náhodné veličiny X používá tzv. distribuční funkce. Ta vyjadřuje pro každé reálné x pravděpodobnost, že náhodná veličina X nabude hodnoty menší nebo rovné x, tedy přičemž pro x platí podmínka: Grafickým zobrazením frekvenční funkce (a tedy i vlastního rozdělení) je křivka hustoty pravděpodobnosti náhodné veličiny. Pro každou hodnotu x lze v grafu frekvenční funkce odvodit odpovídající hodnotu jako plochu pod křivkou hustotou pravděpodobnosti f(x) (viz Obr. 2). Distribuční funkci spojité náhodné veličiny lze pak graficky vyjádřit jako neklesající křivku (nebo lomenou čáru) v rozmezí hodnot od 0 do 1. (viz Obrázek 2p.3). 10

11 Statistika - společná příprava KAPITOLA 02 Obrázek 2p.2 Hustota pravděpodobnosti f(x) a hodnota distribuční funkce F(x) spojité náhodné veličiny X v bodě x Obrázek 2p.3 Graf distribuční funkce F(x) spojité náhodné veličiny X Rozdělení pravděpodobnosti Obecně existuje celá řada různých typů rozdělení jak diskrétních, tak také spojitých náhodných veličin. V případě diskrétních veličin jsou nejčastějšími typy například rozdělení alternativní, rovnoměrné, binomické, poisssonovo, geometrické, hypergeometrické a další. Mezi základní typy rozdělení spojité náhodné veličiny patří například rozdělení rovnoměrné, exponenciální, normální (Gaussovo) a Erlangovo. V praxi se velký význam přisuzuje především normálnímu rozdělení. Často se s ním můžeme setkat u veličin, které jsou předmětem řady biochemických vyšetření nebo popisujících velikosti chyb měření. Jeho důležitost vyplývá z několika skutečností, jako například z faktu, že se nejčastěji vyskytuje, nebo že mnoho jiných rozdělení se mu blíží. Právě z tohoto důvodu se normální rozdělení univerzálně používá k aproximaci rozdělení pravděpodobnosti velkého množství náhodných veličin. Předpokladem vzniku náhodné veličiny s normálním rozdělením je to, že: spojitá náhodná veličina se utváří pod vlivem působení mnoha činitelů, jednotlivé činitele jsou vzájemně nezávislé, žádný z činitelů nemá na výsledek rozhodující vliv. 11

12 Statistika - společná příprava Normální rozdělení Náhodná veličina X má normální rozdělení právě tehdy, když má hustota pravděpodobnosti rovnici: KAPITOLA 02 Distribuční funkce pak má tvar: Přitom v obou případech platí, že. Pro symboly v rovnicích platí, že: π = 3,141 a e = 2,718.. jsou známé matematické konstanty, μ a σ jsou parametry určující polohu křivky na ose x (μ - vážený průměr) a míru variability, tedy její "roztažení" podél osy x (σ - směrodatná odchylka). Druhá mocnina směrodatné odchylky, tj. σ 2 je označována jako rozptyl (variance, disperze). Známe-li oba parametry μ a σ, je normální rozdělení plně určeno. Skutečnost, že veličina X má normální rozdělení s průměrem μ a rozptylem σ 2, se pak symbolicky zapisuje jako Grafem hustoty pravděpodobnosti normálního rozdělení je tzv. Gaussova křivka (viz Obr. 4), grafem distribuční funkce pak závislost uvedená na Obr. 3. Obrázek 2p.4 Gaussova křivka - hustota pravděpodobnosti normálního rozdělení náhodné veličiny X Hustota pravděpodobnosti normálního rozdělení má tvar symetrické jednovrcholové křivky zvonovitého tvaru, která nikde neprotíná vodorovnou osu, přičemž její vrchol leží nad takovou hodnotou x, která odpovídá parametru μ, tj. průměru. Pro symetrická rozdělení platí, že i další parametry polohy tj. medián (rozděluje plochu pod křivkou hustoty na dvě shodné poloviny) a modus (nečetnější hodnota rozdělení) leží pod vrcholem hustoty pravděpodobnosti. Jinými slovy platí, že všechny tři míry polohy, tedy průměr, medián i modus jsou shodné. Modus a medián se uplatňují zejména při popisu asymetrických a vícevrcholových rozdělení. 12

13 Statistika - společná příprava Tvar hustoty normálního rozdělení, tedy šířka zvonovitého tvaru, je dána velikostí parametru σ, tj. směrodatnou odchylkou veličiny X. Čím je směrodatná odchylka větší, tím je hustota plošší a naopak, čím je menší, tím je křivka strmější. Plocha pod křivkou hustoty normálního rozdělení je rovna jedné. Pravděpodobnost, že náhodná veličina nabude hodnot z určitého intervalu, je rovna ploše pod frekvenční funkcí nad tímto intervalem. Například pro interval s hranicemi (μ-1,96σ) a (μ+1,96σ) má tato plocha velikost 0,95. Jinými slovy to znamená, že náhodná veličina X nabývá hodnot z tohoto intervalu s 95% pravděpodobností a pouze s 5% pravděpodobností leží její hodnoty mimo uvedený interval (viz Obr.5). KAPITOLA 02 Obrázek 2p.5 95% pravděpodobnost výskytu hodnoty x normálního rozdělení náhodné veličiny X Normované normální rozdělení N(0,1) Jedná se o speciální případ obecného normálního rozložení, kdy μ = 0, σ 2 = 1. Podle přijaté konvence se v tomto případě hustota pravděpodobnosti značí symbolem φ(x) a distribuční funkce symbolem Φ(x). Za výše uvedené podmínky pak platí vztahy: Přitom opět platí, že. Grafy obou funkcí jsou uvedeny na obr. 6 Obrázek 2p.6 Hustota pravděpodobnosti a distribuční funkce normovaného normálního rozdělení náhodné veličiny X 13

14 Statistika - společná příprava Libovolnou veličinu je tak možno transformovat na veličinu, která má standardizované normální rozdělení, tj.. Standardizované normální rozdělení se s výhodou používá pro srovnání normálních rozdělení veličin měřených při různé měřicí škále, pro výpočet jejich kvantilů o dané hladině významnosti a nebo při určení hodnot distribuční funkce rozdělení. KAPITOLA 02 Transformace na normální rozdělení Poměrně často se lze v praxi setkat s veličinami, jejichž rozdělení pravděpodobnosti má charakter normálního rozdělení. Vhodnou transformací původní veličiny X na novou veličinu Y však lze dosáhnout toho, že rozdělení této transformované veličiny má charakter normálního rozdělení. Obvyklou a často používanou transformací je transformace logaritmická., tehdy, jestliže veličina má nor- Veličina X má logaritmicko-normální rozdělení s parametry μ a σ, tzn. že mální rozdělení s parametry μ a σ, tj.. Takové rozdělení praděpodobnosti je u některých veličin stanovovaných pomocí biochemických vyšetřovacích metod časté. V praxi se nevyužívá pouze logaritmická transformace. Jako funkce pro transformaci veličin jsou využívány například také druhá odmocnina, převrácená hodnota aj. Rozhodnutí o potřebě transformovat veličinu je možno provést již na základě tvaru hustoty pravděpodobnosti (například zešikmení dat), nebo po provedení různých testů normality rozdělení. Tento problém obvykle nastává v případě zpracování experimentálních dat měření nějaké veličiny s cílem určit míry polohy a variability jejího rozdělení, které však nemá charakter rozdělení normálního. V takovémto případě se obvykle postupuje následujícím způsobem: 1. Původní veličina se transformuje na veličinu, pro kterou je model normálního rozdělení přijatelným. 2. Pro transformovanou veličinu se zjistí potřebné parametry. 3. Jejich hodnoty se zpětně transformují. Pokud není nalezena vhodná transformace na normální rozdělení, nabízí statistika jiné přístupy založené např. na tzv. neparametrických metodách. Charakteristiky rozdělení pravděpodobnosti Rozdělení pravděpodobnosti poskytuje jednoznačný popis náhodné veličiny, z informativních důvodů však často není dostatečně přehledné. Upřesňujícím popisem rozdělení jsou jeho základní charakteristiky, které popisují některé typické vlastnosti rozdělení. Jsou to vhodně vybrané číselné údaje, shrnující základní informace o rozdělení pravděpodobnosti náhodné veličiny. Podle toho, které vlastnosti charakteristika postihuje, jsou rozdělovány na: charakteristiky polohy charakteristiky variability charakteristiky šikmosti a špičatosti Pozn.: uvedený způsob není jediným, kterým lze tyto charakteristiky třídit. Charakteristiky polohy Charakteristikami polohy jsou určité hodnoty, které lze považovat za střed, kolem něhož náhodné veličiny kolísají. Nejčastěji používanou charakteristikou polohy je střední hodnota. Dalšími používanými charakteristikami jsou také medián a modus. Charakteristiky variability Charakteristika variability určuje velikost odchylek náhodné veličiny od vybrané charakteristiky polohy. Nejpoužívanějšími charakteristikami variability jsou rozptyl, směrodatná odchylka popřípadě variační koeficient a mezikvartilové rozpětí. 14

15 Statistika - společná příprava Charakteristiky šikmosti a špičatosti Charakteristiky šikmosti a špičatosti charakterizují tvar křivky hustoty pravděpodobnosti náhodné veličiny z hlediska její šikmosti (vypovídá o symetričnosti křivky) a špičatosti (vypovídá o strmosti zakřivení křivky). Charakteristikou šikmosti je koeficient šikmosti, charakteristikou špičatosti je koeficient špičatosti. Výběrové rozdělení KAPITOLA 02 V praxi máme možnost pracovat obvykle jen s hodnotami získanými měřením sledované veličiny na omezeném množství prvků z celkové populace.provádět měření všech prvků populace by bylo z řady důvodů nemožné. Tato omezená množina prvků se označuje jako výběr a výsledky měření veličiny v tomto výběru umožňují pouze odhadovat teoretické rozdělení veličiny prostřednictvím rozdělení výběrového. Výběrové rozdělení se graficky znázorňuje pomocí histogramu nebo polygonu četností. Míry polohy výběrového rozdělení V získaném souboru dat je obvyklým úkolem určit určit hodnotu, kolem které se data soustřeďují, stanovit jejich "střední hodnotu". K tomu slouží několik popisných měr, které se nazývají míry polohy. Průměr Průměr (aritmetický průměr) z hodnot ve výběru se vypočítá jako součet všech hodnot dělený rozsahem výběru. Máme-li výběr n pozorování, pak platí: Průměr se určuje pro kvantitativní znaky a je velmi citlivý na odlehlé hodnoty. Modus Modus je hodnota, která se v souboru dat vyskytuje nejčastěji. Důležitý je pro kvalitativní, zejména nominální znaky. Medián Jestliže jsou data setříděna (vzestupně nebo sestupně), je medián hodnotou, která je rozděluje na dvě stejně velké části. Pokud je v souboru dat jejich počet lichý, pak je mediánem prostřední z nich. Při sudém počtu dat je za medián obvykle považován průměr ze dvou prostředních. Medián se používá pouze pro kvantitativní a ordinální veličiny. Míry variability výběrového rozdělení V praxi se obvykle využívá některý ze tři způsobů výpočtu číselných charakteristik postihujících variabilitu dat výběrového rozdělení: zjistí se rozpětí naměřených hodnot, stanoví se určité charakteristické kvantily pomocí kumulativních relativních četností, či vypočítají se číselné charakteristiky popisující kolísání dat kolem průměru Rozpětí Rozpětí (variační rozpětí) R je rozdíl mezi nejvyšší x max a nejnižší x min hodnotou v získaných datech: Pokud se v datech vyskytují extrémní hodnoty, může být hodnota R zkreslena. Kvantily, kvartily, decily a percentily Důležitými ukazateli variability jsou tzv. kvantily. 100P% kvantil označovaný jako x P, je číslo, které odděluje 100P% nejmenších 15

16 Statistika - společná příprava hodnot náhodné veličiny X. Jinými slovy platí, že distribuční funkce v bodě x P je F(x P ) = P. 50% kvantil x 0,50 je tedy totéž co medián. Kvantily zaznamenané po dvaceti pěti procentech se nazývají kvartily, po deseti procentech decily a po jednom procentu percentily. Tedy 25% kvantil je 1. kvartil (dolní kvartil), 10% kvantil je 1. decil a podobně 1% kvantil je 1. percentil. Medián je totéž co 50% kvantil, 2. kvartil, 5. decil nebo 50. percentil. Rozdíl mezi 3.(horním) kvartilem a 1. (dolním) kvartilem je označován jako interkvartilové rozpětí R F : KAPITOLA 02 Rozptyl, směrodatná odchylka a variační koeficient Výběrový rozptyl s 2 je průměr čtverců odchylek jednotlivých hodnot výběru od výběrového průměru. Při výpočtu výběrového rozptylu, se součet čtverců odchylek nedělí celkovým počtem hodnot ve výběru, tj. n ale hodnotou (n-1), protože se tím docílíme lepšího odhadu celkového rozptylu populace σ 2. Pro výpočet rozptylu tedy platí vztah: Výběrová směrodatná odchylka s je druhou odmocninou výběrového rozptylu. Je používána častěji než rozptyl. Variační koeficient VK je relativní mírou rozptýlení dat. Počítá se jako podíl směrodatné odchylky k průměru a vyjadřuje se obvykle v procentech, tedy: 16

17 Statistika - společná příprava KAPITOLA 02 17

18 Referenční hodnoty, způsoby určení Referenční hodnoty, způsoby určení Autoři: Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D.; RNDr. Pavlína Kušnierová, Ph.D.; Ing. František Všianský Recenzent: prof. MUDr. Richard Průša, CSc. KAPITOLA 02 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Výsledky laboratorních vyšetření jsou bezesporu velmi důležitým zdrojem informací pro volbu správné léčby pacienta. Mimo jiné přispívají k určení nebo upřesnění diagnózy, volbě a optimalizaci postupu terapie nebo k jeho sledování, případně ke stanovení prognózy stavu pacienta. Při interpretaci získaných výsledků je ve většině těchto případů posuzováno, nakolik se tento výsledek shoduje s hodnotami, které lze odůvodněně předpokládat u zvolené srovnávací, tj. referenční populace. Jinými slovy je konkrétně získaný výsledek porovnáván s mezemi ohraničujícími interval hodnot výsledků, jež byly získány provedením stejného laboratorního vyšetření na vzorku referenční populace, neboli s referenčním intervalem. Základní pojmy a definice Referenční interval: obecně přijímanou definicí tohoto pojmu je určení hranic, mezi nimiž se nachází 95 % referenčních hodnot (v případě některých parametrů bývá používán interval zahrnující až 99%) Obvykle se ale jedná o interval mezi dolní a horní referenční mezí, za které jsou nejčastěji považovány 2,5 a 97,5 percentil souboru hodnot získaných analýzou dostatečně homogenního a početného vzorku definované referenční populace. Z klinického hlediska může být v některých případech důležitá pouze horní nebo dolní referenční mez, což pak odpovídá 95 percentilu resp. 5 percentilu. Příklady některých konkrétních veličin s jejich přiřazením k typu referenčního intervalu je uveden níže (Tabulka 2.1). Referenční hodnoty: jsou hodnoty (výsledky měření odpovídající veličiny) získané u vybrané skupiny jedinců s definovaným stavem zdraví. Rozložení referenčních hodnot: distribuce jednotlivých výsledků měření, odpovídající některému ze statistických rozdělení. Typ odpovídajícího rozdělení (např. normální, neboli Gaussovo, log-normální, Laplaceovo apod.) je testován vhodnými statistickými metodami. Referenční populace: množina všech jedinců splňujících určité předpoklady, jednak týkající se jejich zdravotního stavu, případně další definované požadavky (věk, pohlaví, rasa). Obvykle je požadována nepřítomnost určité nemoci, přičemž je jasné, že takto definovaný pojem zdraví je značně relativní a svým způsobem nedokonalý. Referenční jedinec: jedinec vybraný z množiny referenční populace Výběr referenční populace (výběrová referenční skupina): náhodně vybraná část referenční populace, u které jsou měřením získány výběrové referenční hodnoty, z nichž je dále proveden odhad referenčních mezí. Reálně nelze měření provádět u celé referenční populace ale jen u vhodně zvoleného náhodného výběru. Výběrové charakteristiky získané měřením u tohoto výběru jsou pak více či méně věrohodným odhadem skutečnosti. Věrohodnost odhadu: tj. shoda mezi odhadem a skutečnou hodnotou charakteristickou pro celou populaci. Závisí na celé řadě skutečností, především na velikosti výběru referenční populace. Obvykle je minimálně požadováno alespoň 120 referenčních jedinců - interval spolehlivosti odhadů charakteristik se podstatně zužuje v závislosti na velikostí výběrové referenční skupiny. Na věrohodnost odhadu mají dále vliv preanalytické aspekty (způsob odběru, transportu a uchovávání vzorků), metoda měření 18

19 Referenční hodnoty, způsoby určení a použitý způsob statistického vyhodnocení. Typ referenčního intervalu DRM HRM pod HRM nad DRM Měřená veličina (parametr) Na +, K +, Ca 2+, glukóza, transferin, hormony štítné žlázy bilirubin, AST, ALT, CK, troponin I, nádorové markery CHS, prealbumin KAPITOLA 02 Tabulka 2.1 Příklady typů referenčních intervalů v závislosti na klinickém významu referenčních mezí (DRM - dolní mez, HRM horní mez) Obrázek 2.1 Souvislosti mezi jednotlivými pojmy souvisejícími s určením referenčního intervalu Možnosti určení referenčního intervalu Pro určení referenčních intervalů z reálných výsledků měření se obvykle volí jeden ze dvou metod. První, označovaná jako přímá (induktivní) metoda odhadu referenčních mezí, se aplikuje v případě, kdy existuje možnost získání dostatečně velké referenční výběrové populace, u které je při splnění odpovídajících preanalytických podmínek provedeno měření sledované veličiny. Volba požadavků na referenční jedince, je poměrně problematická záležitost a může zásadně ovlivnit výsledné hodnoty referenčních mezí. V rámci studie NORIP (Malmø, 27/4-2004) byly navrženy některé z těchto požadavků společně s preanalytickými podmínkami, které by měly být během určování referenčních intervalů dodržovány. Mimo jiné je žádoucí, aby referenční jedinec splňoval tyto podmínky: cítit se subjektivně dobře, stáří více než 18 let, vyloučit těhotné a kojící ženy, v posledních měsících nebyl hospitalizován nebo vážně nemocen, 19

20 Referenční hodnoty, způsoby určení konzumace alkoholu nepřesahující 24 g / za posledních 24 hodin, během posledních 5 měsíců nedarovat krev, poslední 2 týdny neužívat léky, nekouřit v posledních hodinách před odběrem. Druhá metoda označovaná také jako nepřímá (deduktivní) metoda je aplikována v případě, kdy není vhodná referenční výběrová populace k dispozici a je možno využít pouze výsledky dané veličiny získané měřením u tzv. smíšené populace, zahrnující zdravé i nemocné jedince. KAPITOLA 02 Přímá metoda odhadu referenčního intervalu Tato metoda je založena na statistickém zpracování naměřených referenčních hodnot. Data získaná měřením lze vyhodnotit buďto parametrickým nebo neparametrickým způsobem v závislosti na tom, zda jsou pro určení referenčních mezí využívány parametry charakterizující rozdělení referenčních hodnot a pomocí nich jsou pak odvozeny numerické hodnoty odpovídajících kvantilů určujících referenční meze. Neparametrický postup je sice univerzálnější, ale věrohodnost odhadů kvantilů je v tomto případě menší. Parametrický postup Parametrický postup lze oprávněně použít pouze u výběrů pocházejících z normálního (Gaussova) rozdělení, nebo z rozdělení, která je možno na normální transformovat. Pouze v těchto případech lze totiž použít parametry tohoto rozdělení, kterými jsou výběrový průměr a výběrová směrodatná odchylka, jako nejlepší odhady charakteristik polohy a rozptylu tohoto rozdělení a z nich odvodit hodnoty odpovídajících percentilů. Důležitým krokem pro volbu metody odhadu referenčních mezí je potvrzení předpokladu normality rozdělení získaných referenčních hodnot s primárním požadavkem na symetrii rozdělení. Pro posouzení normality jsou používány různé statistické testy (například Kolmogorov-Smirnovův, Anderson-Darlingův, D Agostino-Pearsonův). Přitom je třeba mít na zřeteli, že různé statistické testy mohou mít různou vypovídací schopnost, takže mohou spíše informovat, že s předpokládanou normalitou rozdělení není něco v pořádku. S výhodou jsou tyto testy často používány v kombinaci s grafickými metodami, které umožňují porovnat distribuci změřených referenčních hodnot (znázorňovaných obvykle v podobě histogramu) s normálním rozdělením o shodných parametrech pomocí grafu frekvenční funkce (hustoty pravděpodobnosti). Běžné statistické programy umožňují také z množiny získaných referenčních hodnot konstruovat tzv. rankitové grafy a pomocí nich porovnat kvantily výběrového rozdělení s kvantily normálního rozdělení. V případě shody výběrového rozdělení s rozdělením normálním má tato závislost přímkový charakter. Obrázek 2.2 Histogram rozdělení získaných referenčních hodnot (osa x: hodnota měřené veličiny, osa y: četnost výskytu) a jeho aproximace frekvenční funkcí o stejných parametrech a rankitový graf porovnání kvantilů empirického rozdělení (osa y) s kvantily normálního rozdělení (osa x) Aby byl odhad parametrů nevychýlený, je zapotřebí otestovat, zda referenční hodnoty získané měřením neobsahují odlehlé výsledky případně hrubé chyby. K tomu účelu je možno využít některý z obvyklých testů odlehlých hodnot (Grubbsův test, Dean- -Dixonův test apod.), nebo se i v tomto případě dají využít některé grafické metody. Pokud se v datech odlehlé výsledky nebo hrubé chyby vyskytují, je dalším krokem jejich vyloučení. Normální rozdělení je jednoznačně charakterizováno svými parametry, tj. průměrem µ a rozptylem σ 2. Z dat výběrového souboru lze určit pouze odhady těchto parametrů, kterými jsou výběrový průměr a výběrový rozptyl s 2. Oba parametry lze vypočítat 20

21 Referenční hodnoty, způsoby určení podle následujících vztahů: KAPITOLA 02 Z hodnoty rozptylu se pak prostým odmocněním vypočítá výběrová směrodatná odchylka s. Na základě znalosti těchto parametrů lze pak jednoduše odhadnout 2,5 a 97,5 percentil. Za předpokladu normálního rozdělení totiž platí, že tyto kvantily lze vypočítat jako x (2,5) = x (97,5) = - 1,96 s + 1,96 s Pro normální rozdělení obecně platí, že celková plocha pod křivkou hustoty je rovna 1 a pravděpodobnost, že náhodná veličina nabude hodnot z určitého intervalu, je rovna ploše vymezené pod křivkou hustoty nad tímto intervalem. Například pro interval s hranicemi < μ - 1,96 σ; μ +1,96 σ > má tato plocha velikost právě 0,95. Obrázek 2.3 Graf hustoty pravděpodobnosti náhodné veličiny X s normálním rozdělením N(µ,σ 2 ), znázorňující míru pravděpodobnosti výskytu hodnoty veličiny v intervalech µ -1,96σ až µ+1,96σ V praxi se koeficient 1,96 často zaokrouhluje na hodnotu 2, takže meze referenčního intervalu jsou potom jednodušeji určovány jako ± 2 s. Pro případ určení referenčního intervalu s mírou pokrytí větší pravděpodobnosti než 95%, lze použít koeficienty s vyšší hodnotou. Například koeficient 2,57 odpovídá pravděpodobnosti 99%. Podmínku normálního rozdělení splňuje v praxi jen omezená množina biologicky významných veličin. Tento typ rozdělení lze očekávat pouze u analytů s relativně úzkou biologickou distribucí, jako například při měření koncentrace iontů v séru (Na +, K +, Cl -, Ca 2+ aj.). Většinou se však v praxi setkáváme s veličinami, které mají distribucí hodnot nesymetrickou, sešikmenou směrem k vyšším hodnotám. Příkladem mohou být veličiny jako koncentrace glukózy, kreatininu, močoviny, enzymů AST, ALT, CK, tyreotropního hormonu apod. 21

22 Referenční hodnoty, způsoby určení KAPITOLA 02 Obrázek 2.4 Graf hustoty pravděpodobnosti náhodné veličiny X s nesymetrickým rozdělením sešikmeným vpravo Takto sešikmená nesymetrická distribuce se často modeluje pomocí tzv. log-normálního rozdělení, které lze jednoduše převést na rozdělení normální pomocí logaritmické transformace prostým logaritmováním naměřených hodnot. Pokud není tato transformace dostatečně účinná, lze použít jinou (například mocninnou, nebo Box-Coxovu transformaci). Pro určení referenčního intervalu se pak již postupuje obdobně jako u výběru z normálního rozdělení: tzn. že se u transformovaných dat ověří jejich normalita, provede se odhad výběrových parametrů (transformovaného průměru a směrodatné odchylky) a pomocí nich se vypočítají transformované referenční meze DRM T a HRM T : DRM T = - 1,96 s T T HRM T = + 1,96 s T T Pomocí inverzní funkce k použité transformaci se z nich poté určí meze referenčního intervalu. Například v případě použití logaritmické transformace se provede odlogaritmování vypočítaných hodnot mezí (exp - inverzní funkce k funkci log). Neparametrický postup DRM = exp(drm T ) HRM = exp(hrm T ) Primárně je používán tehdy, pokud je k dispozici dostatečně velká výběrová referenční skupina. Současně tento způsob postupu určení mezí referenčního intervalu je postupem obecnějším a nejsou u něj kladeny požadavky na rozdělení dat. V tomto případě se k určení referenčních mezí přistupuje následujícím způsobem: změřená data jsou vzestupně seřazena podle své velikosti každé hodnotě je postupně přiřazeno pořadové číslo od 1 do N tak, že minimální hodnota má číslo 1 a maximální hodnota má číslo N určí se pořadová čísla prvků v seřazeném souboru určující 2,5 a 97,5 percentil - n (2,5) a n (97,5) DRM se přiřadí hodnota prvku odpovídajícího pořadovému číslu 2,5 percentilu a HRM se přiřadí hodnota prvku odpovídajícího pořadovému číslu 97,5 percentilu (pokud některé z čísel n (2,5) nebo n (97,5) není celé, získá se hodnota referenční meze provedením lineární interpolace mezi hodnotami prvků s pořadovými čísly oboustranně nejbližšími tomuto číslu) za střední hodnotu referenčního intervalu je považován medián výběru referenčních hodnot Pro určení pořadového čísla odpovídajících percentilů je možno postupovat následujícím způsobem (doporučení IFCC): n (2,5) = 0,025 (N+1) n (97,5) = 0,975 (N+1) nebo alternativně podle doporučení Linneta (Linnet K., Clin Chem 2000,46, 867-9): n (2,5) = 0,025 N + 0,5 n (97,5) = 0,975 N + 0,5 22

23 Referenční hodnoty, způsoby určení KAPITOLA 02 Obrázek 2.5 Vzestupné setřídění výběru referenčních hodnot podle jejich velikosti Vydatnost odhadů referenčních mezí Vzhledem k tomu, že pracujeme pouze s výběrovou referenční populací, jsou jakýmkoliv použitým postupem získány vždy pouze odhady referenčních mezí a nikoliv jejich skutečné hodnoty. Mírou věrohodnosti těchto odhadů může být např. velikost jejich 90% konfidenčního intervalu. Ta úzce souvisí s rozsahem výběrové referenční populace, tedy s počtem referenčních jedinců, kteří byli do výběru zahrnuti. Při použití neparametrického postupu jsou konfidenční intervaly obecně širší než v případě použití postupu parametrického. Pro dosažení srovnatelné úrovně věrohodnosti obou postupů by bylo zapotřebí, aby byl v případě neparametrického postupu rozsah výběru přibližně dvojnásobný než v případě postupu parametrického. Je třeba poznamenat, že existuje možnost zlepšení vydatnosti neparametrického postupu, resp. dosažení stejné kvality při rozsahu výběru menším o cca 5-15%. Tento postup je označován jako princip bootstrap. Při něm je opakovaně realizován výše uvedený neparametrický postup, vždy však na podmnožině referenčních hodnot (o rozsahu n) náhodně vybrané z celé výběrové populace o původním rozsahu N. Počet opakování je například k=100. Z každého opakování je získána konkrétní dvojice mezí - dolní DRM i a horní HRM i. Za výsledný odhad dolní referenční meze je považován průměr všech dílčích dolních mezí a obdobně dílčích horních mezí pro odhad horní referenční meze. Nepřímá metoda odhadu referenčního intervalu Tento způsob odhadu mezí referenčního intervalu je možno použít v případě, kdy neexistuje reálná možnost získání dostatečně početné a reprezentativní referenční výběrové populace, ale z praxe jsou k dispozici výsledky měření dané veličiny získané v běžném rutinním provozu laboratoře. Požadavkem je, aby pro tuto metodu bylo k dispozici poměrně velké množství dat, řádově tisíce. Na jedné straně se sice jedná o data získaná u tzv. smíšené populace zahrnující zdravé i nemocné jedince bez možnosti splnění předem definovaných požadavků na její výběr. Na straně druhé je to však populace reálně vyšetřovaných jedinců, umožňujících při dostatečně velkém rozsahu provádět i jejich stratifikaci například podle věku nebo pohlaví. Zpracování reálných výsledků měření vychází z předpokladu, že v dostatečně velkém výběru existuje podstatně vyšší podíl zdravých jedinců než osob nemocných a při volbě vhodného způsobu zhodnocení výsledků budou získané odhady mezí referenčního intervalu odpovídat zdravé populaci. Referenční intervaly získané touto metodou však budou širší než v případě metody přímé s možným posunem směrem k hodnotám typickým pro populaci nemocných. Navíc při použití této metody nelze objektivně odhadnout typ rozdělení hustoty pravděpodobnosti u zdravé populace. Schematický princip metody (dle Baadenhuijssena): 1. sestrojení histogramu (cca 50 tříd, min.1200 hodnot) 2. vyhlazení dat pomocí filtru (Golay-Savicky) 3. vynesení derivace logaritmů frekvence naměřených hodnot proti koncentraci 4. výpočet úseku (a) a směrnice (b) přímky proložené v lineární části závislosti 23

24 Referenční hodnoty, způsoby určení 5. μ = a/b; σ = -1/b 6. referenční meze RM = μ ± 1.96 σ Význam referenčního intervalu při interpretaci výsledků Referenční interval je v praxi využíván při interpretaci výsledků měření tím, že vymezuje hranice normálního nálezu, tedy rozsah, ve kterém by měl ležet výsledek zdravého jedince. Pro snadnější poskytnutí této informace jsou výsledkové zprávy z laboratoří vedle numerického výsledku často doplněny také grafickým znázorněním polohy výsledku vzhledem k referenčním mezím. Obvykle se však jedná pouze o schematické vyobrazení skutečnosti, zda se výsledek měření nachází uvnitř referenčního intervalu nebo mimo něj (např. polohou znaku * = výsledek, uvnitř nebo vně závorek = referenční interval). Bylo by však podstatnou chybou, pokud by lékař situaci, kdy se výsledek měření nachází mimo meze referenčního intervalu, automaticky interpretoval jako patologický nález bez ohledu na to, jak daleko je výsledek vzdálen od referenční meze. KAPITOLA 02 Při posuzování výsledků laboratorního vyšetření vzhledem k referenčnímu intervalu si je třeba uvědomit, že referenční interval je konstruován pomocí odhadů jeho mezí. To znamená, že charakter těchto mezí není bodový, ale ve skutečnosti je intervalový a existuje tak pro každou mez konfidenční interval vyjadřující oblast, kde se skutečná mez s určitou mírou pravděpodobnosti nachází. Především je nutné přistupovat opatrně k interpretaci těch výsledků, které se nacházejí v blízkosti referenčních mezí bez ohledu na to, zda uvnitř nebo vně referenčního intervalu. V těchto hraničních situacích se navíc uplatňuje i nejistota výsledku měření, tedy atribut vlastní každé analytické metodě. Díky nejistotě tak je třeba i změřený výsledek chápat nikoliv jako bod odpovídající jeho hodnotě, ale rovněž jako interval, ve kterém se výsledek měření nachází s 95% pravděpodobností. Z uvedených skutečností pak vyplývá, že v těchto případech může existovat nenulová pravděpodobnost, že výsledek měření může být reálně na opačné straně skutečné referenční meze. Rovněž je třeba si uvědomit, že interpretace laboratorních výsledků pomocí 95% intervalu referenčních hodnot je zároveň vyjádřením následující skutečnosti: i u zdravého jedince existuje 5 % pravděpodobnost, že jeho výsledek bude nižší (2,5% pravděpodobnost), resp. vyšší (2,5% pravděpodobnost) než dolní, resp. horní referenční mez. Literatura 1. Hendl, J.:. Referenční meze v klinické biochemii, ILF, Praha, Murray, R. K. Harperova biochemie. Praha : H & H, Racek, J.. Praha : Galén, Zima, T. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, C28-A2. How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory. NCCLS Second edition. 6. Linnet K. Nonparametric estimation of reference intervals by simple and bootstrap-based procedures. Clin Chem 2000;46: Baadenhuijsen, H. Smith, J.C. Indirect Estimation of Clinical Chemical Reference Intervals from Total Hospital Data. J.Clin.Chem. Clin.Biochem.Vol.23,1985,No.12 24

25 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality Analytickévlastnostilaboratornímetody,kontrola kvality Autoři: Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D.; Ing. František Všianský; RNDr. Pavlína Kušnierová, Ph.D. Recenzent: Ing. Václav Senft KAPITOLA 03 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod S každým měřením a tedy i s každou metodou používanou v biochemických laboratořích je spojena typická sada vlastností, které jsou obecně nazývány výkonnostní charakteristiky metody. Jejich úroveň vypovídá o možnostech měření realizovaných touto metodou a jsou proto určujícím faktorem použitelnosti metody pro požadovanou aplikaci. Úroveň analytických vlastností metody je zároveň určujícím faktorem pro možnost její aplikace ke klinickým účelům. O základních analytických vlastnostech metody by proto měl mít povědomí také každý lékař, který její výsledky měření využívá. Proces, jehož cílem je vedle stanovení funkčních charakteristik metody i komplexní posouzení její vhodnosti pro zamýšlený klinický účel použití, se nazývá validace metody. Jeho realizace je nedílnou součástí vývoje metody. Základní analytické vlastnosti metody jsou prověřovány i před zahájením používání metody v laboratoři a jsou rovněž předmětem pravidelné kontroly během jejího praktického rutinního využívání. V tomto případě se hovoří o verifikaci metody. Soubor operací, které jsou v laboratoři prováděny s cílem zajistit odpovídající věrohodnost výsledků měření, je širší. Obecně jsou tyto činnosti označovány pojmem kontrola kvality. Tento soubor činností je určen především k zajišťování kvality vlastního analytického procesu v klinické laboratoři. V souladu s obecnými trendy jsou však i ve zdravotnických laboratořích zaváděny komplexní systémy managementu kvality, které slouží k řízení všech činností v laboratoři s cílem nejen udržení, ale i postupného zlepšování kvality poskytovaných laboratorních služeb. Zavádění takových mechanismů do řízení laboratoře je prověřováno a osvědčováno nezávislými orgány v procesech certifikace nebo akreditace a postupně je požadováno i plátci zdravotní péče. Výkonnostní charakteristiky analytické metody Mezi základní analytické vlastnosti metody patří bezesporu dva charakteristiky označované pojmy preciznost (precision) a pravdivost (trueness). Za jejich projekci do konkrétního výsledku měření pak lze považovat vlastnost tohoto výsledku označovanou pojmem přesnost (accuracy). Dříve byl pro pojem precision jako český ekvivalent používán výraz přesnost a pro pojem accuracy český ekvivalent správnost. Dnešní české termíny byly zavedeny v souladu s překladem mezinárodní metrologické normy TNI :2009 Mezinárodní metrologický slovník - Základní a všeobecné pojmy a přidružené termíny (VIM). Preciznost Těsnost souhlasu (shody) mezi nezávislými výsledky měření získanými za předem specifikovaných podmínek. Preciznost měření je číselně vyjadřována mírami nepreciznosti postihujícími rozptýlení mezi nezávisle získanými výsledky, například směrodatnou odchylkou, rozptylem nebo variačním koeficientem. Preciznost je vyhodnocením dopadu existence náhodných chyb při měření, které nelze nikdy eliminovat a jejich velikost je vlastní 25

26 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality určité metodě resp. konkrétnímu postupu měření. Tyto chyby jsou způsobeny náhodnými vlivy (nestabilita přístrojů, kolísání okolních podmínek měření např. teploty, výkyvy v činnosti operátora apod.). Výsledkem jejich působení je vznik rozdílů mezi výsledky opakovaných měření. Ty jsou při dostatečném počtu opakování, díky náhodnosti svého původu, rovnoměrně rozptýleny kolem své průměrné hodnoty. Přitom platí, že nejčastěji se vyskytují minimální odchylky a směrem k vyšším hodnotám odchylek se jejich počet snižuje. Rozdělení četností odchylek odpovídá normální (Gaussově) distribuci. Mírou rozptýlení, tedy nepreciznosti výsledků, tak je směrodatná odchylka s. Protože je uváděna v jednotkách měřené veličiny a závisí na její velikosti, používá se raději její relativní vyjádření, tj. variační koeficient CV uváděný v % (někdy označován rovněž jako relativní směrodatná odchylka). Preciznost metody není stejná v celém pracovním rozsahu metody. Její závislost na velikosti měřené veličiny se nazývá profil preciznosti a je důležitým měřítkem kvality měřící metody. Nejnižších hodnot dosahuje variační koeficient ve střední oblasti rozsahu měření, zatímco k jeho koncům se zvyšuje (především v oblasti velmi nízkých hodnot měřené veličiny významně roste). Velikost nepreciznosti ovlivňuje reálný pracovní rozsah metody. Jednou z podmínek pro jeho volbu může být, aby CV nepřesahoval požadovanou úroveň, např. 10% - viz Obr. č. 6. Předem specifikovanými podmínkami měření v definici pojmu preciznost mohou být podmínky opakovatelnosti nebo reprodukovatelnosti. Podmínka opakovatelnosti měření zahrnuje stejný postup měření, obslužný personál, měřicí systém, pracovní podmínky, stejné místo a opakování měření na stejném nebo podobném objektu v krátkém časovém úseku. Podmínka reprodukovatelnosti měření zahrnuje různá místa, obslužný personál, měřicí systémy a opakování měření na stejném nebo podobném objektu. Poměrně velká vůle v nastavení těchto podmínek vyžaduje vždy bližší specifikaci, které faktory byly proměnné. Specifické podmínky reprodukovatelnosti zahrnující měření provedená sice stejným postupem, na stejném místě a opakováním měření stejných nebo podobných objektů, ale v rozšířeném časovém úseku jsou označovány jako podmínky mezilehlé preciznosti měření. Realizace měření v průběhu delšího časového intervalu může postihovat vliv dalších variabilních faktorů, jako např. změny kalibrací nebo kalibrátorů, změnu šarže používaných reagencií, resp. změny operátorů. Preciznost stanovená za těchto podmínek nejlépe vypovídá o kvalitě realizace metody v konkrétních podmínkách dané laboratoře. KAPITOLA 03 Pravdivost Těsnost souhlasu (shody) mezi průměrnou hodnotou získanou z velkého počtu výsledků měření a skutečnou hodnotou resp. přijatou referenční hodnotou x 0. Mírou pravdivosti metody je její odchylka (bias - b): nebo v relativním vyjádření: Skutečná (pravdivá) hodnota měřené veličiny je v praxi z principu nedostupná, mohla by být získána pouze dokonalým měřením. Proto se nahrazuje přijatou referenční hodnotou jako nejlepší praktickou aproximací skutečné hodnoty veličiny. Referenční hodnota se obvykle získá na základě měření veličiny konsenzuálně přijatou referenční metodou nebo jiným všeobecně uznaným postupem (například měřením ve vybraných referenčních laboratořích apod.). Pravdivost metody je určena existencí systematické chyby provázející měření. Tento druh chyby může ovlivňovat výsledek měření buďto konstantním způsobem (výsledky jsou posunuty o stále stejnou hodnotu), proporcionálně (tedy o stále stejný násobek) anebo se může jednat o kombinaci obou způsobů. V této souvislosti se pak hovoří o konstantní a proporcionální složce systematické chyby. Zatímco náhodných chyb se při měření nemůžeme zbavit (lze jen ovlivnit jejich velikost), systematické chyby měření je někdy možné vhodnými úpravami eliminovat nebo alespoň z části korigovat. 26

27 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality Přesnost Těsnost shody mezi změřenou a pravou hodnotou měřené veličiny. Tato vlastnost se dotýká jednoho výsledku měření a je vlastně aktuálním projevem kombinace preciznosti a pravdivosti metody. Jedná se o příspěvek náhodné (RE - Random Error) a systematické (SE - Systematic Error) chyby, který nastal právě v okamžiku konkrétního měření. Součet obou těchto příspěvků se označuje jako celková chyba měření (TE - Total Error). Jak bylo uvedeno výše, je u dané metody míra příspěvků náhodné složky chyby vyjádřena odhadem směrodatné odchylky s, mírou příspěvků systematické složky chyb je odchylka b. Pomocí těchto dvou parametrů je možno charakterizovat metodu odhadem její celkové analytické chyby dosahované při měření TE A : KAPITOLA 03 Úroveň spolehlivosti odhadu vyjadřuje koeficient k, který je roven odpovídajícímu kvantilu zvoleného jednostranného intervalu spolehlivosti (pro 95% má hodnotu 1,65, pro 99% pak 2,33). Klinická využitelnost metody je však vedle obou zmiňovaných charakteristik ovlivněna navíc přirozenou proměnlivostí sledovaného parametru v běžné populaci, nazývanou biologickou variabilitou parametru (stanovovaného analytu). S ohledem na původ příspěvku k celkové biologické variabilitě je rozlišována variabilita interindividuální (mezi různými jedinci dané populace) a intraindividuální (proměnlivost u biologického individua) a pokud jsou použity variační koeficienty pro její relativní vyjádření, pak se obvykle označují jako CV G resp. CV I. Pro řadu biologicky významných parametrů byly konkrétní hodnoty obou příspěvků sledovány a publikovány v odborné literatuře. Z hlediska posouzení klinické využitelnosti metody je žádoucí, aby relativní analytická preciznost metody CV A byla optimálně lepší než polovina intraindividuální biologické variability, tzn. Pro akceptovatelnou relativní analytickou pravdivost metody B A pak platí požadavek, aby byla lepší než čtvrtina celkové biologické variability, tedy Pro celkovou akceptovatelnou analytickou chybu metody TE A pak plyne požadavek: Z hodnot analytické preciznosti metody a intraindividuální variability daného analytu lze vypočítat tzv. kritickou diference CD (někdy označovanou také jako nejmenší významnou změnu LSC - least significant change) mezi dvěma po sobě jdoucími výsledky pacienta. Jedná se o rozdíl mezi dvěma výsledky měření, který lze v závislosti na uvedených charakteristikách označit za významný na zvolené hladině spolehlivosti resp. s určitou pravděpodobností, obvykle 95 %. Jedná se o parametr, který má pro rozhodování klinika při změně laboratorního výsledku v čase bezpochyby významnou roli. Souvislosti mezi precizností a pravdivostí metody Jak již bylo uvedeno výše, vzájemné spolupůsobení obou těchto charakteristik v určitém časovém intervalu realizace měření rezultuje v konkrétní úrovni přesnosti daného výsledku měření (viz Obr. č. 3.1). 27

28 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality KAPITOLA 03 Obrázek 3.1 Vztah mezi pojmy preciznost, pravdivost a přesnost měření V závislosti na úrovních obou charakteristik lze posuzovat celkovou kvalitu metody. Tuto souvislost názorně postihuje příklad s kvalitou střelby na terč, uvedený na Obr. č Se zlepšující se kvalitou metody se zároveň zlepšuje i další vlastnost metody, kterou je její nejistota (viz dále). Obrázek 3.2 Souvislost mezi precizností a pravdivostí metody a jejich vliv na úroveň nejistoty metody Nejistota výsledku měření Nejistotou se rozumí parametr přidružený k výsledku měření, který charakterizuje míru rozptýlení hodnot, jež by mohly být důvodně přisuzovány měřené veličině. Koncepce nejistot nahradila v současné metrologii dřívější koncepci chyb. Na rozdíl od ní lépe postihuje skutečnost, že výsledek měření je s jistou neurčitostí jen odhadem reality. To znamená, že nejde o bodový odhad hodnoty vzdálený od reality o stanovenou chybu, ale že se s určitou spolehlivostí nachází v ohraničeném intervalu možných hodnot. Znalost nejistoty umožňuje lépe porovnávat výsledky měření navzájem, nebo například s referenčními intervaly. Odhad nejistoty výsledků měření získaných danou metodou je zároveň součástí její validace, kdy přispívá k posouzení, zda metoda je pro požadovaný účel dostatečně vhodná. Princip určení nejistoty spočívá ve vyhodnocení efektů, které mohou působit na výsledek měření a následně v odhadnutí intervalu, o kterém je s určenou mírou spolehlivosti možno tvrdit, že se uvnitř nachází skutečná hodnota měřené veličiny. Celková nejistota je výsledkem spolupůsobení mnoha zdrojů. Efektem každého z nich je jeho individuální příspěvek k výsledné nejistotě. Tento příspěvek je označován jako složka nejistoty. Kvantitativní vyčíslení příspěvku některých složek může být získáno ze statistických distribucí výsledků série měření, charakterizovaných jejich experimentální směrodatnou odchylkou (tzv. složky nejistot typu A). Vyčíslení příspěvku jiných složek se získá z pravděpodobnostních funkcí založených na zkušenostech nebo jiných 28

29 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality informacích (tzv. složky nejistot typu B). Číselná hodnota každé složky nejistoty převedená do podoby směrodatné odchylky se nazývá standardní nejistotou a označuje se symbolem u x (index x vyjadřuje příslušnost ke složce x). Nevýznamné příspěvky standardních nejistot se pominou a ostatní se sloučí podle zákona šíření nejistot do tzv. kombinované nejistoty u C : Pozn.: výše uvedený algoritmus je značným zjednodušením provádění odhadu nejistoty měření a současně není jediným možným postupem. V praxi se uvádějí výsledky měření doprovázené tzv. rozšířenou nejistotou U C, což je vlastně kombinovaná nejistota vynásobená koeficientem rozšíření k tak, aby odhad nejistoty odpovídal požadované úrovni spolehlivosti. Pro 95% pravděpodobnost má koeficient hodnotu 1,96, ale v praxi se obvykle používá jeho zaokrouhlená hodnota 2: KAPITOLA 03 Výsledek konkrétního měření je pak prezentován jako hodnota zjištěná měřením doprovázená rozšířenou kombinovanou nejistotou, např.: 132 ± 6 nmol/l. Vedle zdrojů nejistot, které jsou spjaty s vlastní analytickou metodou, zahrnuje výsledná nejistota výsledku měření i příspěvky zdrojů uplatňujících se především v preanalytické fázi vyšetření. Viz Obrázek 3.3. Obrázek 3.3 Hlavní zdroje nejistoty laboratorního vyšetření v klinické laboratoři Význam uvádění nejistoty tkví nejen ve vyjádření jisté míry neurčitosti výsledku, který se s danou pravděpodobností může vyskytovat v celém vymezeném intervalu, ale je důležité s nejistotou výsledku počítat při jeho interpretaci vzhledem k rozhodovacím limitům, především pokud se k těmto limitům přibližuje. Návaznost metody Návazností metody se rozumí vlastnost výsledku měření, pomocí níž může být výsledek vztažen ke stanovené referenci přes dokumentovaný nepřerušený řetězec kalibrací, z nichž každá se podílí svým příspěvkem na stanovené nejistotě měření. Jedná se o velmi důležitou vlastnost metody s ohledem na dosažení její optimální pravdivosti. Pokud v metodě existuje návaznost každé ze vstupních hodnot veličin, jež jsou zahrnuty do modelu měření, až na základní jednotku SI, pak lze považovat zajištění návaznosti metody za optimální a výsledky měření mají předpoklad být v širokém mezinárodním měřítku srovnatelné. Prakticky to znamená, že především u kalibrátorů používaných v postupu měření je požadováno jejich navázání na standardy vyšší metrologické kvality. Tento princip je zajišťován pomocí existence hierarchické struktury referenčních materiálů a metod, pomocí nichž je pracovní kalibrátor postupně navazován až na nejvyšší standard optimálně až na jednotku SI. V této hierarchii vystupují současně také různé subjekty, které realizací jednotlivých kroků zajišťují. 29

30 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality KAPITOLA 03 Obrázek 3.4 Hierarchie kalibrace a metrologická návaznost na SI Pozn.: podle ČSN EN ISO 17511:2004; CGPM Všeobecná konference pro váhy a míry, BIPM Mezinárodní úřad pro váhy a míry, NMI národní metrologický institut, ARML akreditovaná referenční měřicí laboratoř, ML laboratoř výrobce Setkáváme se s několika typy standardů (referenčních materiálů) vystupujících na různé úrovni: primární referenční materiál - substance s maximálně dosažitelnou čistotou, jeho navážením nebo odměřením objemu vzniká materializovaná jednotka měření sekundární (certifikovaný) referenční materiál - obvykle má matricový charakter (obsah proteinové matrice); je doprovázen certifikátem osvědčujícím obsah analytu, zjištěný postupem s návaznosti na primární referenční materiál (obvykle referenční metoda s minimální nejistotou) pracovní kalibrátor - určen ke kalibraci rutinních metod, jejich hodnoty jsou odvozené od certifikovaných referenčních materiálů, nebo na ně navázaných pracovních kalibrátorů výrobce Prověření návaznosti metody je nedílnou součástí procesu její validace. Citlivost metody V praxi je používáno hned několik charakteristik, které jsou označovány jako citlivost a souvisejí se schopností metody rozlišit od sebe určité úrovně měřené veličiny (především v oblasti jejich velmi nízkých hodnot). Pro jejich rozlišení se používají různé přívlastky nebo samostatné pojmy (analytická citlivost, funkční citlivost, mez detekce, mez stanovitelnosti). Pozor!!! Je třeba si uvědomit, že tyto charakteristiky popisují metodu z hlediska jejich analytických vlastností. V klinické praxi je však často používán i pojem diagnostická citlivost resp. diagnostická senzitivita, které charakterizují metodu z hlediska její klinické využitelnosti, tedy obvykle její schopnosti rozlišit zdravé od nemocných. O diagnostické citlivosti je podrobně pojednáno v kapitole 4 Citlivost a specifičnost metody, vzájemné vztahy, laboratorní screening. Analytická citlivost Analytickou citlivostí se rozumí podíl změny odezvy měřicího zařízení (výstupního signálu měřicího přístroje) a odpovídající 30

31 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality změny podnětu (vstupního signálu, měřené veličiny). Jinými slovy analytická citlivost vypovídá o tom, jak velkou změnu detekované odezvy způsobí změna měřené veličiny. U lineárních metod je její hodnota konstantní a odpovídá směrnici (sklonu) kalibrační přímky. U metod nelineárních se samozřejmě mění tak jak se mění směrnice kalibrační křivky. Analytická citlivost metody je závislá především na použitém principu detekce odezvy. KAPITOLA 03 Obrázek 3.5 Určení analytické citlivosti c a metody. Funkční citlivost Funkční citlivostí metody se rozumí hodnota měřené veličiny (např. koncentrace měřeného analytu ve vzorku), při které je opakovatelnost jejího měření na předem určené hranici (obvykle CV = 20%). Jednoduše se zjišťuje z tzv. profilu preciznosti, tedy závislosti preciznosti metody na velikosti měřené veličiny (viz Obr. č. 3.6) Obrázek 3.6 Určení funkční citlivosti c f z profilu preciznosti metody. Mez detekce (L D - Limit of detection) je dána nejmenším množstvím analytu ve vzorku, které může být detekováno (odlišitelné od nulové hodnoty), ale které ještě nemusí být stanovitelné jako exaktní hodnota s určitou nejistotou. Tato limitní hodnota od sebe odděluje oblast šumu detekčního 31

32 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality zařízení a již detekovatelný signál. Stanoví se obvykle z údajů měření vzorku s nulovým obsahem měřené veličiny (blank) za podmínek opakovatelnosti (5-10 opakování). Ze získaných hodnot změřené odezvy se spočítá jejich průměr y B a směrodatná odchylka s B. Z kalibrační závislosti se potom odečte hodnota měřené veličiny odpovídající signálu: Mez stanovitelnosti (L Q - Limit of quantification) KAPITOLA 03 Mez stanovitelnosti naproti tomu určuje takové nejnižší množství analytu ve vzorku (hodnotu měřené veličiny), které může být stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou mírou nejistoty. Při výpočtu se postupuje obdobně jako v případě L D, jen koeficient 3 se nahradí číslem 6 nebo 10, podle toho, jaká míra nejistoty resp. hladina spolehlivosti je požadována. Z kalibrační závislosti se pak rovněž odečte hodnota měřené veličiny, odpovídající spočítané úrovni signálu: Výsledky měření pod mezí L D nelze vydávat a výsledky mezi L D a L Q lze posuzovat jen jako kvalitativní. Obrázek 3.7 Určení meze detekovatelnosti a stanovitelnosti Linearita metody Je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tedy mezi signálem, tj. měřenou odezvou analytické metody a stanovovanou veličinou. Jinými slovy se jedná o schopnost metody poskytnout detekovanou odezvu měření, která je v daném rozsahu přímo úměrná velikosti stanovované veličiny (např. koncentraci analytu ve vzorku). Je výhodné, aby metoda fungovala v oblasti lineární kalibrační závislosti, neboť pak je postačují ke konstrukci této závislosti pouze změření dvou bodů, blanku a jednoho kalibrátoru se známou hodnotou měřené veličiny (provádí se dvoubodová kalibrace). Po odečtení signálu blanku je pak přímková kalibrační závislost definovaná prakticky jediným číslem, tj. kalibračním faktorem F, který lze jednoduše stanovit z podílu známé hodnoty měřené veličiny v kalibrátoru x K a odpovídající velikosti signální odezvy kalibrátoru y K. Pomocí tohoto faktoru a změřené odezvy vzorku y pak lze jednoduše určit hodnotu měřené veličiny ve vzorku x. Pokud má metoda oblast linearity omezenou shora a je zapotřebí analyzovat vzorky s vyšší hodnotou měřené veličiny, pak je nutné volit potřebné ředění vzorku. 32

33 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality Pracovní rozsah Pracovním rozsahem metody se chápe uzavřený interval hodnot měřené veličiny, které lze určit daným měřicím postupem a omezený nejčastěji dolní a horní mezí stanovitelnosti (pokud je nejistota měření v této oblasti přijatelná), nebo rozsahem linearity metody. Viz Obr. č V praxi však existuje také řada metod s nelineárním průběhem kalibrační závislosti. V takovém případě samozřejmě nelze vystačit pouze s dvoubodovou kalibrací. Kalibrační křivka se konstruuje obvykle na základě měření alespoň 6 kalibrátorů a výpočet hodnoty zjišťované veličiny neznámého vzorku je v tomto případě podstatně komplikovanější s potřebou využití složitějšího matematického aparátu. Pracovní rozsah metody je pak v horní oblasti kalibrační závislosti omezen jinými limitujícími faktory, v oblasti blízké 0 samozřejmě mezí stanovitelnosti. KAPITOLA 03 Obrázek 3.8 Vliv meze stanovitelnosti a linearity na pracovní rozsah metody Analytická specifičnost Analytickou specifičností se rozumí schopnost měřicího postupu stanovovat pouze tu měřenou veličinu, která má být stanovena. Analytická specifičnost se obvykle vyjadřuje jako nespecifičnost, tj. jako efekt libovolné složky vzorku odlišné od analytu a způsobující změnu signálu a indikace měřicího přístroje a tím zavádějící systematickou chybu. Analytická specifičnost metody může být zhoršena například přítomností různých interferentů, tedy složek běžně přítomných v biologické matrici analyzovaných vzorků. Nejčastěji bývají sledovány jako možné zdroje interferencí především vlivy zvýšeného množství triacylglycerolů, bilirubinu nebo hemoglobinu. Podstatně mohou ovlivnit průběh reakcí prováděných v rámci analýzy rovněž léky a jejich působky. U některých typů metod (např. imunoanalytické metody) se hovoří o tzv. zkřížených reakcích s látkami velmi podobné struktury jako stanovovaný analyt. Obvykle se jedná o různé prekurzory nebo metabolity stanovovaných analytů, agregované molekuly nebo jejich štěpy obsahující shodné aktivní místa nebo antigenní determinanty. Imunoanalýzy, jakožto metody založené na využití specifických protilátek, mohou být rovněž ovlivněny přítomností různých heterofilních protilátek v analyzovaných vzorcích. Často je zmiňován například vliv tzv. HAMA protilátek (lidské anti-myší protilátky), jejichž výskyt se v populaci zvyšuje. Ovlivnění výsledku měření může být v těchto případech jak směrem pozitivním, tak také negativním. S vlivem zkříženě reagujících nebo interferujících látek je rovněž spojen příspěvek k nejistotě měření. Díky stanovení obsahu jakéhokoliv ovlivňujícího analytu přítomného v matrici biologického vzorku, dochází ke zvýšení nejistoty měření následkem zvýšení systematické chyby. Působení zkřížených reakcí či interferencí na výsledky měření se obtížně vyhodnocuje. Byť existují experimentální postupy, v podmínkách rutinních klinických laboratoří jsou téměř nerealizovatelné. Jejich předpokladem je totiž dispozice dostatečného množství jednotlivých potenciálně zkříženě reagujících látek či interferentů. Testování jejich vlivu by mělo být součástí validace metody. Jedním z obvyklých způsobů prezentace těchto informací například bývá uvedení údaje o tom, jaké množství některé 33

34 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality ovlivňující veličiny, nezpůsobí odchylku měření větší než 10 %. Výtěžnost (recovery) Výtěžnost je vlastností metody, která udává její míru schopnosti postihnout měřeným signálem veškerý analyt přítomný ve vzorku a souvisí tak s celkovou pravdivostí metody. Je mírou účinnosti dané metody. Poukazuje také na případný vliv rozdílů mezi složením vzorků a standardů na výsledky analýzy. Matematicky je definována jako podíl či procento látky získané za specifikovaných podmínek z celkového množství látky, které by mělo být teoreticky stanoveno. Při relativním vyjádření je zřejmé, že vypočtené hodnoty této charakteristiky by se měly přibližovat 100 %. KAPITOLA 03 kde: R(a) výtěžnost stanovení analytu v dané matrici za specifikovaných podmínek Q(a) množství analytu stanovené analýzou Q... skutečné množství analytu v matrici Robustnost metody Tato vlastnost postihuje schopnost metody poskytovat přijatelné výsledky měření i v případě malých odchylek v měřicím postupu či složení vzorku. Faktorů, které se během realizace metody mohou mírně měnit, je celá řada, typicky to mohou být drobná změna teploty nebo reakčního prostředí, změna inkubačních časů, změna operátora apod. Samozřejmě je cílem, aby analytická metoda na takové drobné odchylky, které mohou v praxi běžně nastat, reagovala minimálně. Srovnatelnost metody Obecným požadavkem metod určených pro měření stejné veličiny je jejich vzájemná srovnatelnost. Primárně to je předpokladem shody výsledků získaných různými metodami. Srovnatelnost metody je rovněž důležitá při změně používané metody v laboratoři, kdy je metoda nová porovnávána s metodou stávající. Samozřejmě, že existující diference mohou být zdrojem problémů při interpretaci výsledků. Pro srovnání výsledků dvou metod se využívají různé postupy regresní analýzy, kdy se vyhodnocují párová data získaná paralelní analýzou souboru vzorků oběma metodami. Výstupem je jednak posouzení lineární regresní závislosti a významnost rozdílů jejich parametrů od optimálních hodnot (úsek přímky blízký 0 a směrnice blízká 1). Společně se provádí i posouzením míry korelace mezi výsledky obou metod. Optimálně by korelační koeficient r měl mít hodnotu blízkou 1, tj. párová data by měla být co nejtěsněji soustředěna okolo regresní přímky. Druhou formou výstupu je grafická prezentace srovnání. V grafu se proti sobě vynáší na osu x výsledky získané metodou srovnávací (referenční, původní), na osu y pak výsledky získané metodou srovnávanou (novou) - viz Obr.ázek

35 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality KAPITOLA 03 Obrázek 3.9 Příklad grafického srovnání dvou metod spolu s regresní závislostí. Validace a verifikace metod Jak již bylo zmíněno v úvodu kapitoly, jsou základní charakteristiky analytické metody prověřovány již ve stadiu jejího vývoje s cílem potvrdit, že metoda splňuje požadavky na účel použití. Tento proces se nazývá validace metody a jeho součástí je rovněž posouzení z hlediska klinického účelu použití. Jedná se tak o proces velmi náročný a složitý, který je předem podrobně naplánován, jeho průběh i výsledky jsou pečlivě zdokumentovány. Výstupem je tzv. validační zpráva jednoznačně uzavírající, zda metoda je pro daný účel použití vhodná. Z evropské legislativy vyplývá pro výrobce nebo dovozce in vitro diagnostických zdravotnických prostředků (IVD MD) povinnost vybavit tyto prostředky značkou evropské shody CE, ještě před jejich umístěním na evropský trh. Požadavky na proces posouzení shody se sice mohou lišit v závislosti na zařazení diagnostického prostředku do některé z tříd, v každém případě však zahrnují také validaci diagnostika. V současné rutinní praxi laboratoří klinické biochemie převládá trend používání komerčních diagnostických prostředků. Jestliže si analytickou metodu vyvíjí v laboratoři sami, nebo komerčně dodávanou metodu upravují, přenáší se povinnost její validace na pracovníky laboratoře. V podstatně menším rozsahu je prováděna verifikace metody, jinými slovy pouze prověření zda diagnostikum splňuje vybrané deklarované vlastnosti i při jeho použití v konkrétní laboratoři. Takto je metoda prověřována nejen před jejím zavedením do praxe a následně také potom ve vhodném časovém intervalu, obvykle 1x za rok. Mezi základní charakteristiky metody prověřované v rámci verifikace patří především prověření opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti metody, včetně odhadu nejistoty. Kontrola kvality Pojmem kontrola kvality je obecně označován soubor činností realizovaných v laboratoři s cílem zajistit dostatečnou věrohodnost výsledků prováděných měření. Tyto činnosti se dotýkají prakticky jen zajištění analyltické spolehlivosti používaných metod. Podle toho, kdo se na jejich realizaci podílí, se kontrola kvality dále rozlišuje na: vnitřní kontrolu kvality (VKK) - provádí ji pouze personál laboratoře 35

36 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality externí hodnocení kvality (EHK) - při organizaci a vyhodnocení se uplatňují i vnější subjekty. Vnitřní kontrola kvality Tento druh kontroly je realizován kontinuálním sledováním mezilehlé preciznosti případně i pravdivosti metody pomocí průběžného měření kontrolních vzorků, které jsou analyzovány v každé sérii stanovení. Znalost cílové hodnoty měřené veličiny v kontrolním vzorku je nutností pouze pro sledování pravdivosti metody. Takovou možnost nabízejí například různé komerčně dodávané kontrolní vzorky s atestem. Jinak lze pro sledování preciznosti využít i vzorky bez atestu a pro sledování pravdivosti zvolit alternativní postup. Sérií stanovení je myšlena obvykle délka jedné pracovní směny v případě nepřetržitého nebo směnného automatického provozu, nebo jedno stanovení prováděné ve skupině (dávce) vzorků u manuálních metod. Počet kontrolních vzorků v sérii není striktně definován a odvíjí se od znalosti celkové úrovně kvality dané metody. V praxi se obvykle používají 2-3 vzorky s rozdílnou hodnotou měřené veličiny. Vhodnou volbou je například, aby jeden kontrolní vzorek měl tuto hodnotu uvnitř referenčního intervalu a druhý mimo něj, např. nad jeho horní hranicí. Výsledky měření kontrolních vzorků jsou posuzovány v souvislosti s výsledky nalezenými dříve. V principu jde o sledování velikosti a charakteru chyb aktuálního měření kontrolního vzorku s cílem identifikovat situace, které jsou z hlediska stanovených požadavků na kvalitu neakceptovatelné a provedením operativního zásahu předejít vydání neadekvátních výsledků. Nejčastější formou tohoto sledování je jejich vizualizace v podobě grafů tzv. regulačních diagramů. Tento způsob je založen na hodnocení kolísání hodnoty měřené veličiny kolem zvolené - centrální linie diagramu (cílové, deklarované hodnoty veličiny), přípustné rozmezí je dáno intervalem mezi dolní a horní regulační mezí. Těmito mezemi bývá vhodný násobek směrodatné odchylky, odvozené z mezilehlé preciznosti metody dosahované v předchozím období. Příklad regulačního diagramu je uveden na Obrázek KAPITOLA 03 Obrázek 3.10 Příklad regulačního diagramu bez výskytu podezřelých výsledků Většinou se do diagramu znázorňují dvě hranice - varovná na úrovni ± 2s a zásahové (regulační) na úrovni ± 3s. Situace, kdy odchylka výsledku kontrolního měření přesáhne hodnotu 3s se stává signálem k pátrání po možné příčině odchylky a k provedení operativního zásahu s alternativou opakování celé série měření vzorků, která analýze kontrol předcházela. V regulačním diagramu lze pozorovat i další situace, které mohou vést k nutnosti řešení, například pokud se u výsledků kontrol opakovaně za sebou vyskytuje odchylku od centrální linie stále stejným směrem, nebo mají za sebou získané výsledky shodný trend (viz Obr. č.3.11). 36

37 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality KAPITOLA 03 Obrázek 3.11 Regulační diagram s různými typy anomálií Pro zajištění co největší objektivity při posuzování výsledků vnitřní kontroly byly vyvinuty algoritmy, jejichž cílem je dosažení maximální pravděpodobnosti detekce chyby při minimální pravděpodobnosti falešného zamítnutí série (Wesgardova kombinovaná pravidla). Tyto algoritmy jsou dnes součástí řídících software analyzátorů a bývají rovněž zabudovány i do laboratorních informačních systémů (LIS), čímž přispívají ke zjednodušení hodnocení. Někteří výrobci reagencií nebo komerčních kontrolních vzorků nabízejí rovněž možnost automatického odesílání výsledků kontrolních měření prostřednictvím Internetu do hodnotícího centra, kde jsou vyhodnocovány v kontextu ostatních uživatelů stejných kontrolních materiálů (např. firmy BioRad, nebo Randox apod.) Tento způsob realizace kontroly kvality se již částečně blíží k externímu hodnocení. Externí hodnocení kvality Principem EHK (EQA - External Quality Assessment) je hodnocení analytické metody na základě vzájemného porovnáváním výsledků měření dosažených analýzou identických vzorků v různých laboratořích. Toto hodnocení je organizováno a realizováno za předem definovaných a harmonizovaných podmínek (v souladu s platnými normami a podmínkami regionu, v němž jsou prováděny). Organizaci a hodnocení EHK zajišťuje obecně uznávaný subjekt - poskytovatel EHK. V ČR je takovýmto poskytovatelem pro oblast vyšetření v klinické biochemii firma SEKK s.r.o. Vedle toho však existuje rovněž celá řada zahraničních programů EHK. Vlastní měření je samozřejmě prováděno v účastnící se laboratoři. Kontrolní měření jsou obyčejně zajišťována v rámci různých programů EHK několikrát do roka. 37

38 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality Vlastní realizaci EHK je možno charakterizovat takto: Rozeslání identických kontrolních vzorků do laboratoří; vzorky musí být maximálně komutabilní (tzn. mít vlastnosti obdobné jako vzorky běžně analyzované), musí být dostatečně homogenní a stabilní, tak aby byl zajištěn předpoklad shodných podmínek pro všechny účastníky. Účastnické laboratoře provádějí analýzy v rámci konkrétního programu souběžně a jejich výsledky odešlou poskytovateli programu v předem dohodnutém termínu. Výsledky jsou poskytovatelem vyhodnoceny podle předem definovaných zásad a kritérií, s nimiž jsou účastníci rovněž předem seznámeni. Hodnocení výsledků je sumarizováno do předem dané písemné podoby a rozesláno účastníkům; informace jsou prezentovány jako důvěrné anonymně s kódovanou identifikací jednotlivých účastníků. KAPITOLA 03 Obvykle je v jednom cyklu EHK rozesíláno několik vzorků (nejčastěji 2 vzorky, existují kontrolní programy, kde je v jednom cyklu rozesíláno např. 5 vzorků). Při hodnocení se posuzuje shoda výsledku účastníka se vztažnou hodnotou (cílovou hodnotou). V závislosti na úrovni návaznosti měření dané veličiny a dostupnosti kontrolního materiálu je možno rozlišit několik typů vztažné hodnoty. Pokud pro měření veličiny existuje referenční metoda, může být vztažnou hodnotou certifikovaná referenční hodnota (CRV). Jiným typem je konsenzus expertů (CVE), což je hodnota získaná měřením ve vybraných expertních laboratořích, nebo konsenzus účastníků (CVP), tedy hodnota vypočtená buďto z výsledků všech účastníků v konkrétním cyklu EHK, nebo z výsledků skupiny účastníků používajících shodný postup měření. Pro posouzení shody se vztažnou hodnotou jsou stanoveny maximální toleranční limity, které nesmí být překročeny, pokud má být účastník hodnocen jako úspěšný. Tyto limity vyjadřují přijatelný rozdíl v procentech od vztažné hodnoty D max (vymezují okolí vztažné hodnoty, ve kterém jsou výsledky považované za přijatelné). S ní je porovnávaná odchylka D %, která se jednoduše vypočítá jako relativní chyba účastníka z jeho výsledku x a ze vztažné hodnoty X: Konkrétní výše přípustných odchylek zůstává i přes snahy o sjednocení u různých poskytovatelů různá. K jejich určení může být aplikován některý z možných přístupů: na podkladě biologických rozptylů (při jejich výpočtu se bere v úvahu intra- a interindividuální variabilita měřené veličiny v populaci) na základě soudobých analytických možností (např. jako hodnota mezilaboratorní preciznosti dosažená u 20% nejlepších laboratoří v kontrolním cyklu EHK). Z limitu platného pro určitý analyt v daném programu EHK lze odvodit rovněž limit pro vnitřní kontrolu, jehož plnění by mělo zaručovat úspěšné hodnocení v rámci EHK. Zjednodušeně by mělo platit, že limit pro vnitřní kontrolu (limit pro přípustnou mezilehlou preciznost metody) by měl být na třetinové úrovni jako limit pro EHK. Při hodnocení lze jednoduše posuzovat, zda odchylka laboratoře D % je menší než D max. Podmínkou úspěšnosti účastníka v cyklu EHK je, aby podíl obou hodnot, označovaný jako P-skóre, byl v absolutní hodnotě menší než 1, tedy: V některých programech EHK je pro posouzení úspěšnosti účastníků používán odlišný způsob ohodnocení na základě tzv. z- -skóre. V tomto skóre je proměřována odchylka výsledku účastníka x od vztažné hodnoty X a zjištěné mezilaboratorní preciznosti výsledků účastníků cyklu EHK vyjádřené v podobě směrodatné odchylky. Pro úspěšnost účastníka je v tomto případě požadováno, aby absolutní hodnota z byla menší než 3 (hodnota pod 1 je považována za velmi dobrou a pod 2 za akceptovatelnou): Úspěšná účast laboratoře v programech EHK je známkou kvality její práce a je tak vyžadována orgány prověřujícími funkčnost systému managementu kvality v laboratoři, ale rovněž i plátci zdravotní péče. Vedle tohoto z části represivního charakteru mají 38

39 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality programy EHK nezanedbatelný edukativní charakter, který spočívá například v komentování výsledků kontrolních cyklů pověřenými odborníky (supervizory), poskytováním jejich konzultací, publikováním článků v odborných časopisech apod. Systém managementu kvality v klinických laboratořích Zodpovědný přístup k zabezpečování kvality práce v klinické laboratoři nelze zjednodušit jen na zajištění kvality vlastního analytického procesu. V souladu s obecnými trendy jsou i v klinických laboratořích zaváděny do praxe komplexní systémy managementu kvality (SMK). Vedle zajištění kvality vlastního měření různých veličin je zdůrazňována potřeba řízení s ohledem na kvalitu všech činností prováděných v laboratoři. KAPITOLA 03 Toto se dotýká nejen vlastního řízení laboratoře včetně zajišťování kvalitních zdrojů (personálu, technického vybavení, prostředí laboratoře a prostředků používaných k provádění analýz), udržování korektních dodavatelsko-odběratelských vztahů a zodpovědného chování vůči odběratelům služeb laboratoře, ale rovněž organizace práce s ohledem na zabezpečování všech pre- a postanalytických požadavků analýz, pořizování a uchovávání informací v rámci laboratorního informačního systému apod. Předpokladem správné funkce SMK je, aby všechny procesy a činnosti v laboratoři byly zodpovědně popsány a takto zdokumentované následně udržovány v rámci tzv. řízené dokumentace. Tak je docíleno stavu, kdy se v laboratoři vyskytují jen aktuálně platné dokumenty, neaktuální verze jsou archivovány a potřebné záznamy související s činností laboratoře jsou v případě potřeby i zpětně dohledatelné. Tím, že všichni pracovníci v laboratoři mají pro svou práci k dispozici jednotné a komplexní podklady, je dán zároveň předpoklad maximálního omezení vzniku hrubých chyb pramenících např. z nedokonalého předávání informací. Dokumentace SMK má typickou strukturu: příručka kvality popisující celý systém směrnice a řády charakterizující základní procesy realizované v laboratoři laboratorní příručka, tj. dokument informující především klienty laboratoře o poskytovaných službách a podmínkách jejich poskytování, standardní operační postupy popisující provádění jednotlivých analytických metod a obsluhy technických zařízení záznamy o používání technických prostředků a záznamy o kvalitě realizovaných měření Certifikace a akreditace Podobně jako je tomu i v jiných odvětvích, stupňuje se v posledních letech také ve zdravotnictví tlak na schopnost subjektu prokázat péči o kvalitu své práce. Tyto tlaky mohou být vynucovány jak regulačními mechanismy ve společnosti, tak také mohou být odrazem úsilí subjektu uspět v tržním prostředí, nebo jen dobrovolnou snahou o prezentaci předpokladů pro dosažení odpovídající kvality své práce. Dnes jsou uplatňovány především dva mezinárodně uznávané a podporované mechanismy k podání důkazu o zavedení fungujícího SMK, resp. o potvrzení způsobilosti určitého subjektu k provádění specifikovaných činností. Prvním z nich je certifikace shody SMK s požadavky stanovenými mezinárodně uznávanou normou. Druhým je akreditace, tedy proces potvrzení způsobilosti určitého subjektu rovněž v souladu s požadavky mezinárodních norem. Obecné požadavky na funkční SMK jsou shrnuty v normách řady ISO 9000, konkrétně v normě ČSN EN ISO Tato norma specifikuje požadavky na SMK zavedený u jakéhokoliv subjektu tak, aby byl tento systém správně nastaven a fungující směrem k zajištění kvality činnosti subjektu a její zlepšování. Dneska existuje celá řada certifikačních orgánů, tedy právnických osob, které posuzují shodu SMK žadatele s požadavky zmíněné normy. Rovněž existuje velké množství firem (obecně libovolných organizací a mezi nimi i několik klinických laboratoří), které jsou držitelem takového certifikátu. Nicméně v ČR v rezortu zdravotnictví a zvláště u zdravotnických laboratoří, není tento způsob příliš preferován. Konkrétním podmínkám provozu zdravotnických laboratoří lépe odpovídají požadavky specifikované v normě ČSN EN ISO 15189, která je cíleně orientovaná na problematiku práce těchto laboratoří. Proto je dnes v segmentu klinických laboratoří obecně mnohem více uplatňován proces akreditace, tj. potvrzení jejich způsobilosti v souladu s požadavky této normy. Akreditaci provádí na území státu obvykle pouze jeden národní akreditační orgán, v ČR je jím Český institut pro akreditaci, o.p.s. Obdobným procesem je rovněž systém provádění prověřování nastaveného systému práce v laboratoři ze strany Národního autorizačního střediska pro klinické laboratoře - NASKL. Tento orgán České lékařské společnosti provádí tzv. edukační audity u laboratoří registrovaných v rámci Registru klinických laboratoří. Během dvou navazujících auditů I a II je v laboratoři prověřováno plnění požadavků specifiko- 39

40 Analytické vlastnosti laboratorní metody, kontrola kvality vaných v národních akreditačních standardech. Tyto požadavky jsou obsahově velmi podobné požadavkům normy ISO Každá z uvedených forem je kontinuálním procesem, který se v čase periodicky opakuje formou reauditů a pravidelných dozorových akcí. Prokázání péče o kvalitu v laboratoři je v současnosti nutnou podmínkou, kterou si kladou někteří plátci zdravotní péče k tomu, aby uzavřeli s poskytovateli péče smlouvu o jejich úhradách. Například VZP tak uznává pouze jednu z posledních dvou forem, tedy akreditaci ČIA nebo osvědčení o auditu II od NASKL. Tím se požadavek na fungující procesy k zabezpečování kvality v laboratoři dostává na úroveň regulačních mechanizmů a umožňuje tak provozovat činnosti v oblasti poskytování klinických laboratorních služeb prakticky pouze těm laboratořím, které uvedenými procesy úspěšně prošly a disponují požadovanými osvědčeními. KAPITOLA 03 Literatura 1. Racek, J.. Praha : Galén, Zima, T. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, Suchánek, M. (ed.) Kvalimetrie 8. Základy metrologie v chemii, Eurachem ČR, Suchánek, M. (ed.) Kvalimetrie 9. Vhodnost analytických metod pro daný účel, Eurachem ČR, Suchánek, M. (ed.) Kvalimetrie 11. Stanovení nejistoty analytického měření, Eurachem ČR, TNI :2009. Mezinárodní metrologický slovník - Základní a všeobecné pojmy a přidružené termíny (VIM) 7. ČSN EN ISO 9001:2009 Systémy managementu kvality Požadavky 8. ČSN EN ISO 15189:2007 Zdravotnické laboratoře - Zvláštní požadavky na kvalitu a způsobilost 9. Metrologická terminologie v klinické a analytické laboratoři (2. přeprac. vydání), SEKK s.r.o. a Eurachem ČR,

41 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening KAPITOLA 04 Autoři: Ing. František Všianský; Ing. Vladimír Bartoš Ph.D. Recenzent: Ing. Václav Senft Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Při hodnocení laboratorních metod je třeba znát mimo základní analytické charakteristiky metody, také klinické (diagnostické) charakteristiky metody, které jsou závislé na diagnóze pacienta. Na základě těchto charakteristik můžeme mezi sebou porovnávat účinnost biochemických metod z hlediska schopnosti metody rozlišit zdravé a nemocné. Výpočty těchto klinických charakteristik vychází z čtyřpolní tabulky, kdy máme soubor osob rozdělen na skupinu zdravých a nemocných osob na základě definitivní metody a současně je máme vyšetřeny testovaným laboratorním testem. Podle výsledku laboratorní metody můžeme osoby rozdělit do 4 skupin. Nemocné s pozitivním výsledkem testu (Správně pozitivní SP) Nemocné s negativním výsledkem testu (Falešně negativní FN) Zdravé s pozitivním výsledkem testu (Falešně pozitivní FP) Zdravé s negativním výsledkem testu (Správně negativní SN) Zdraví Nemocní Test pozitivní FP SP Test negativní SN FN Uvedenou situaci lze znázornit rovněž graficky, kdy osa x představuje hodnotu měřené veličiny, například koncentraci stanovovaného analytu, na ose y je znázorněna relativní četnost výskytu této veličiny jednak ve skupině zdravých osob (znázorněno levou křivkou) a ve skupině nemocných (pravá křivka). Uvedený obrázek je pouze ilustrativní, vzájemná pozice obou křivek i jejich tvary se samozřejmě u každé metody liší. 41

42 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening KAPITOLA 04 Diagnostická senzitivita a specifičnost metody Tyto pojmy se často zaměňují za analytickou citlivost a specifičnost (často proto, že se prostě uvede jen citlivost a specifičnost). Ty se ale týkají charakteristiky toho, jak malé množství analytu metoda dokáže zachytit a zda detekuje specificky jen jednu látku. Vůbec tedy nesouvisí se schopností metody rozlišovat zdravé a nemocné osoby. Diagnostická senzitivita Slouží k diagnostice nemoci, hodnotí laboratorní metodu podle toho, jak je schopna zjistit přítomnost nemoci. Může nabývat hodnot 0 až 1 (0-100%). Čím vyšší senzitivita, tím lépe test diagnostikuje přítomnost nemoci. Diagnostická specifičnost Používá se k vyloučení nemoci u skupiny zdravých osob, vyjadřuje pravděpodobnost negativního výsledku u zdravé osoby. Může se opět pohybovat v rozmezí 0 až 1 (0-100%). Je vhodné, aby laboratorní metoda měla pokud možno co největší hodnotu diagnostické specifičnosti, čím je totiž specifičnost vyšší, tím lépe test dokáže vytřídit zdravé osoby ze sledovaného souboru. 42

43 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening Cut-off Hodnota výsledku laboratorní zkoušky, podle které se v praxi rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti. Následně to znamená, že se při jejím překročení již přistoupí k nějaké činnosti (určí se diagnóza, zahájí se léčba,...). Je nastavována tak, aby pro daný účel byl optimální poměr mezi senzitivitou a specifičností (např. u screeningu co nejvyšší senzitivita, při prevenci rizikového terapeutického zásahu u zdravého člověka naopak vysoká specifičnost). Zvolené diskriminační hodnotě cut-off pak odpovídají konkrétní počty osob zařazených do jednotlivých skupin - správně negativních (SN), falešně negativních (FN), správně pozitivních (SP) a falešně pozitivních (FP). Pozn.: místo zkratek SN a SP se někdy používají zkratky TN a TP (podle anglické terminologie (T = true). U dané metody pak zvolené hodnotě cut-off vždy odpovídají KAPITOLA 04 nejen konkrétní úroveň dosahované senzitivity a specifičnosti, ale také věrohodnosti nebo prediktivních hodnot (viz níže). Na uvedeném obrázku je hodnota cut-off (zvolená například na bázi konsensu odborníků) znázorněná svislou čarou. ROC analýza Z podstaty výpočtu hodnot diagnostické senzitivity a specifičnosti metody vyplývá, že obě charakteristiky metody se chovají jako spojité nádoby. Klesá-li senzitivita metody, stoupá její specifičnost a naopak. Při volbě určité hodnoty cut-off jsou tak dány odpovídající hodnoty obou charakteristik. Posouzením vztahu mezi diagnostickou specifičností a senzitivitou se zabývá tzv. ROC analýza. (ROC je zkratkou anglického výrazu Receiver Operating Characteristic, což lze přeložit jako operační charakteristika přijímače a její vznik se datuje do období 2. světové války, kdy byly touto metodou posuzovány schopnosti radarů při odlišování skutečných signálů od šumu). V praxi je využíváno grafické znázornění tohoto vztahu pomocí tzv. ROC křivky. Obvykle se ROC křivka znázorňuje jako vztah mezi správnou pozitivitou, neboli diagnostickou senzitivitou (v rozsahu 0-1, nebo při vyjádření v procentech) na ose y a falešnou pozitivitou, tj. 1-specifičností (resp. 100-specifičností při vyjádření v procentech) na ose x. Ta může být někdy také vyjádřena přímo jako diagnostická specifičnost, takže se pak jedná přímo o vztah mezi senzitivitou a specifičností metody. Rozsah hodnot na ose x je pak ale uváděn opačně, tj. od 1 do 0 (resp %). Vlastní křivka tak představuje množinu bodů odpovídajících specifičnosti a senzitivitě určeným vždy pro zvolenou hodnotu cut off. Na osách je pak možno odečíst senzitivitu při určité specifičnosti a naopak, které jsou danou metodou dosahovány při odpovídající volbě cut off. 43

44 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening KAPITOLA 04 Používaným hodnotícím kritériem je plocha pod ROC křivkou (AUC, Area Under the Curve). U teoreticky nejúčinnější metody je tato plocha rovna 1,0 a v případě neúčinné metody je křivka totožná s diagonálou a AUC je tak rovna 0,5. Podle velikosti AUC pak lze metody klasifikovat: AUC hodnocení 0,90 1,00 výborná 0,80 0,89 velmi dobrá 0,70 0,79 dobrá 0,60 0,69 dostatečná 0,50 0,59 nedostatečná Pomocí porovnání ROC křivek různých metod je možno také vzájemně posuzovat klinickou využitelnost těchto metod. Klinicky vhodnější (lépe diskriminující) metoda má ROC křivku umístěnou více do levého horního rohu, křivka metody s horší diskriminační účinností je blízko diagonály. 44

45 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening KAPITOLA 04 Vhodným statistickým programem lze testovat, zda se AUC mezi sebou liší a tedy, je-li efektivita jedné metody významně lepší než u metody druhé. Další klinické charakteristiky Prevalence, Prev Pravděpodobnost výskytu daného onemocnění v dané populaci. Někdy také apriorní, popř. pretestová pravděpodobnost. Pozitivní prediktivní hodnota, PV+ Vyjadřuje pravděpodobnost výskytu choroby při pozitivním výsledku zkoušky. Je ovlivněna prevalencí choroby. Při nízké prevalenci má i vynikající diagnostický test zvýšený počet falešně pozitivních výsledků. PV+ = TP/(FP+TP) Negativní prediktivní hodnota, PV- Vyjadřuje pravděpodobnost absence choroby při negativním výsledku laboratorního testu. Je také závislá na prevalenci choroby. PV- = TN/(FN+TN) Věrohodnostní poměry testu (LR - likelihood ratio) Věrohodnostní poměr pozitivního testu, LR+ Vyjadřuje schopnost laboratorního testu zachytit přítomnost choroby při výsledku vyšším než cut-off. Udává, kolikrát je vyšší pravděpodobnost zvýšení nad cut-off u nemocných (recidivě) oproti pravděpodobnosti zvýšení nad cut- -off ve skupině osob bez nemoci. LR+ = senzitivita/(1- specificita) Věrohodnostní poměr negativního testu, LR- (likelihood ratio) Udává, kolikrát je vyšší pravděpodobnost výsledku pod cut off u ve skupině bez onemocnění oproti pravděpodobnosti výsledku pod cut off ve skupině těch, kteří onemocnění mají. LR- = (1- senzitivita)/specificita 45

46 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening Interpretace LR LR= 1 Test bez diagnostické hodnoty (ROC je právě digonála grafu, metoda nedokáže rozlišit zdravé a nemocné) LR+ > 1 Výsledek testu je obvykle považován za silně pozitivní výsledek LR- < 1 Výsledek testu je obvykle považován za silně negativní výsledek Poměr šancí - ODDs ratio ODDs ratio je poměr šance pozitivního testu u nemocných, ku šanci pozitivního testu u zdravých, nebo lze poměr šancí chápat jako šance výskytu nemoci, když test je pozitivní ku šanci výskytu nemoci, když test je negativní. KAPITOLA 04 ODDs ratio= (TP*TN)/(FP*FN) ODDs ratio se používá k retrospektivnímu hodnocení studií, kde jsou známy počty pacientů, u nichž bylo a nebylo dosaženo cíle studie. Cílem studie může být například odlišit pacienty s rizikem (šancí) choroby od pacientů bez rizika (šance). OR = 1 znamená neschopnost zkoušky rozdělit pacienty podle výsledku zkoušky do skupin s různou šancí. Čím vyšší ODDs ratio, tím vyšší rozlišovací schopnost testu. Laboratorní screening Screeningem (skríningem) se rozumí organizovaná činnost s rozsáhlým dopadem, která je určena k vyhledávání osob s významným rizikem určité choroby mezi ostatními osobami v populaci. Snahou je vyhledat tyto osoby ještě ve stadiu časné nebo subklinické fáze nemoci tak, aby včasným zásahem mohly ze své účasti ve sreeningovém programu účinně profitovat. Podle zvolené populace, v níž je choroba vyhledávána, lze rozlišovat mezi screeningem celoplošným (screening kongenitální hypotyreózy) a selektivním (v rizikové populaci - mamografický screening). K rozdělení populace na jedince zdravé a rizikové či potenciálně nemocné se využívají vhodně volené a pokud možno jednoduché screeningové testy, kterými může být test klinický nebo laboratorní, případně jejich kombinace (třeba i několik laboratorních testů doplněných testy klinickými - screening Downova syndromu). Screeningový test rozdělí populaci vyšetřovaných osob na dvě skupiny: skupinu osob s pozitivním testem ale s velkou pravděpodobností, že se jedná o osoby nemocné nebo rizikové, skupinu osob s negativním testem a s velkou pravděpodobností, že to jsou osoby bez nemoci či rizika. U osob s pozitivním nálezem při screeningu následuje po primárním screeningovém testu použití vysoce specifického diagnostického testu, kterým dojde k podstatné redukci počtu osob bez nemoci původně označených za nemocné. Obdobně jako u každého laboratorního testu má test využívaný pro účely screeningu své klinické charakteristiky, tedy diagnostickou specifičnost a senzitivitu. Podíl zdravých osob z celkového počtu osob v první skupině představuje falešnou pozitivitu screeningového testu (FP nebo FPR - false positive rate). Specifičností screeningového testu je pak rozdíl 1 - FP, jinými slovy schopnost detekovat jako zdravé skutečně zdravé osoby. Podíl počtu nemocných osob zachycených testem z celkového počtu nemocných je označován jako senzitivitu screeningového testu (DR - detection rate). Požadavkem na vhodný screeningový test je, aby měl co nejvyšší senzitivitu a zároveň dostatečnou diagnostickou specifičnost (tzn. minimální falešnou pozitivitu). Malá míra nespecifičnosti (falešné pozitivity) testu je akceptovatelná, pokud následný diagnostický test osoby s falešně pozitivním screeningovým testem v tomto druhém kole vyloučí. U kvantitativních testů existuje mezi oběma parametry vztah daný vzájemnou polohou distribucí hodnot testu pro zdravou a postiženou populaci (jejich překrytím) a polohou rozhodovacího limitu cut-off, který určuje, od jaké hodnoty screeningového testu bude výsledek brán jako pozitivní. 46

47 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening KAPITOLA 04 Uvedené parametry (specifičnost nebo senzitivita testu) nevypovídají zcela objektivně o účinnosti screeningového programu. Pro tento účel je nutno zohlednit navíc také prevalenci výskytu onemocnění. Pravděpodobnost, že osoba s pozitivním screeningovým testem je skutečně nemocná postihuje prediktivní hodnota pozitivního testu PV+. Hodnota PV+ je prevalencí silně ovlivňována - jestliže je nízká prevalence onemocnění, bude nízká PV+ i v případě vysoce senzitivního a specifického testu. Používanou charakteristikou účinnosti screeningového testu postihujícím prevalenci onemocnění je i parametr označovaný jako OAPR (the odds of being affected, given a positive result), který vyjadřuje, jak velkou šanci má nemocná osoba, že bude screeningovým testem zachycena. Parametr se vypočítá jako podíl skutečně pozitivních osob s pozitivním výsledkem testu k počtu negativních osob s pozitivním výsledkem testu: Parametr OAPR se vyjadřuje jako podíl dvou čísel (např. 1:20) a vyjadřuje vlastně prevalenci onemocnění ve screeningem vyselektované skupině osob. 47

48 Diagnostická senzitivita, specifičnost metody, způsoby určení, vzájemné vztahy, laboratorní screening KAPITOLA 04 48

49 Základy tvorby moče Základy tvorby moče Autor: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. Recenzent: Doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA KAPITOLA 05 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Souhrn: Základní funkční jednotkou ledvin je nefron. Ten se skládá z glomerulu a tubulů. Glomerulus je klubko kapilár, které jsou vystlány speciální polopropustnou membránou. Ta zajišťuje selektivní filtrování krve - glomerulární filtraci. Tubuly pak dále upravují složení profiltrované tekutiny tak, aby se organismus zbavil odpadních látek a zadržel látky potřebné. Kromě glomerulární filtrace a tubulárních funkcí plní ledviny i řadu metabolických a endokrinních funkcí (např. regulace krevního tlaku, glukoneogeneze, erytropoéza, aktivace vitamínu D). Glomerulární filtrace Glomerulární filtrace (GF) je děj, při kterém se krev filtruje přes glomerulární membránu za vzniku primární moči. Glomerulární filtrace závisí hlavně na filtračním tlaku (Obrázek 5.1) a vlastnostech glomerulární membrány. Obrázek 5.5p.1 Znázornění determinant filtračního tlaku. Filtrace v glomerulu je určena hydrostatickým tlakem krve ve vas afferens, proti kterému působí koloidne osmotický tlak plazmy a tlak glomerulárního filtrátu. Glomerulární membrána (filtrační membrána) selektuje molekuly dle velikosti (molekuly menší než cca 70 kda se filtrují) a dle náboje (záporně nabitý povrch membrány - např. albumin je proto zadržen, i když velikostí by prošel). Normální glomerulární filtrace je cca 180 l/den (= objem primární moči) = 2,083 ml/s. Reziduální nefrony jsou nefrony, které přebírají funkci po zaniklých nefronech (chorobně, involucí); pro udržení homeostázy musí "pracovat" více (adaptovat se). Např. snížení glomerulární filtrace (zánikem nefronů) vede k celkově snížené produkci primární moči v reziduálních nefronech a pokud by se v tubulech vstřebalo relativně stejné procento vody jako při normální glomerulární filtraci (1-2%) a stejném příjmu tekutin, pak dojde k retenci vody (jinými slovy: při poklesu GF na 50% by bylo nutné omezit příjem tekutin na 50%); reziduální nefrony proto musí zvýšit vylučování vody. Glomerulární filtrace a možnosti kompenzace tubulárními funkcemi reziduálních nefronů určují různou závislost solutů na poklesu glomerulární filtrace a zjednodušeně je můžeme dělit na 3 skupiny: Skupina A. kreatinin a urea - stoupají v plazmě, když GF < 50% Skupina B. K+, fosfáty, uráty, H+ - stoupají v plazmě, když GF < 25% Skupina C. NaCl - stoupají v plazmě, když GF < 2% Jako ledvinné testy proto nejčastěji (tradičně) označujeme kreatinin a ureu, i když jejich citlivost pro brzký záchyt snížené GF je nízká. Kreatinin je konečný produkt svalového energetického metabolismu (vzniká z kreatinu a kretinfosfátu). Nejdůležitějším faktorem, který určuje produkci kreatininu, je tedy objem svalové hmoty (proto jsou referenční hodnoty děleny dle věku a pohlaví, ev. i rasy [afroameričané mají geneticky vyšší podíl svalové hmoty]). Kreatinin je za fyziologických okolností vylučován téměř výhradně ledvinami (glomerulární filtrací + cca 10 % tubulární sekrecí). Při poklesu GF (částečně také při proteinurii) se zvyšuje podíl kreatininu vyloučený tubulární sekrecí a jinými orgány (střeva, plíce). 49

50 Základy tvorby moče Metoda pro stanovení sérového kreatininu (reakce s kys. pikrovou v alkalickém ph) je známá svou nespecifičností: kromě kreatininu se zachycují i další interferující látky, tzv. Jaffé pozitivní chromogeny (např. ketolátky, glukóza, kyselina močová, kyselina askorbová; významná hyperbilirubinémie naopak falešně snižuje výsledky). Existuje i enzymatická metoda stanovení, která těmito interferencemi netrpí, nicméně ta prozatím není masově rozšířena (vyšší cena, ne zcela jasný přínos pro klinickou praxi). I přes fyziologická a analytická omezení použití kreatininu zůstává tento marker základem metod pro odhad glomerulární filtrace. Zvýšený kreatinin v séru: renální : snížení GF pod 50 %, hyperbolický vztah jiné (je také zvýšený močový kreatinin): zvýšená tvorba : tělesná námaha, poškození svalů, zmnožení svalové hmoty (gigantismus, akromegalie) zvýšený příjem: maso KAPITOLA 05 Snížený kreatinin v séru: fyziologicky: děti, těhotné snížení svalové hmoty (např. imobilizace při dlouhodobém pobytu na lůžku, podvýživa) myodystrofie Kreatinin někdy měříme také v moči (U_krea) - nejčastější indikací pro toto měření je zjištění clearance endogenního kreatininu. Dále koncentraci kreatininu v moči využíváme při odhadu úplnosti sběru moče (překročí-li množství kreatininu v 24 hodin sbírané moči o více nez 30% očekávané hodnotypřekročí více než 30% očekávaných hodnot, pak jde pravděpodobně o neúplný sběr). Poslední významnou indikací k měření U_krea je standardizace odpadu látek močí (obvykle v jednorázovém = nesbíraném vzorku). Výsledek se pak vyjadřuje jako množství dané látky na mmol kreatininu ve vzorku. Močovina (urea) Močovina je konečným produktem metabolismu aminokyselin a je tvořena v játrech. Z 90 % je vylučována ledvinami, proto je označována a indikována jako ledvinný test. Zvýšení hladiny močoviny tedy nejčastěji vidíme u poklesu glomerulární filtrace pod 50 %. Příčiny zvýšení a snížení sérové koncentrace shrnuje podrobněji následující výčet: zvýšení hladiny příčina prerenální (zvýšený přívod bílkovin, katabolismus, dehydratace - nedostatek vody k vyloučení, nedostatečny filtrační tlak při hypotenzi, šoku, krvácení...) příčina renální (glomerulární filtrace < %, výrazněji zvýšena zejména při akutním selhání ledvin a obzvláště z prerenálních příčin typu dehydratace) příčina postrenální (obstrukce - zpětný tlak moče) snížení hladiny snížený příjem bílkovin anabolismus (fyziologicky u dětí) jaterní selhání (močovina se nedostatečně tvoří) zvýšené vylučování (těhotenství) 50

51 Základy tvorby moče Tubulární funkce Segment tubulu Charakteristika Funkce Proximální tubulus Velký objem, nízký koncentrační gradient. Reabsorpce asi 85% filtrovaného HCO 3-, Reabsorpce větší části ultrafiltrátu. Reabsorpce 60-75% filtrovaného Na Místo specifických transportů., K + a vody isoosmolárně Reabsorpce prakticky veškeré glukózy, většiny aminokyselin a velké části dvojmocných KAPITOLA 05 Henleova klička Distální tubulus a sběrné kanálky Malý objem, vysoký koncentrační gradient. Vytváření gradientu pro diluci a koncentraci moče. Místo účinku kličkových diuretik. Malý objem a vysoký koncentrační gradient. Reguluje Na + a vodní rovnováhu a acidobazickou rovnováhu. Místo účinku thiazidových diuretik a antagonistů aldosteronu. Tabulka 5p.1 Shrnutí základních fukcí jednotlivých částí tubulu. kationtů Ca ++, Mg ++ Reabsorpce 20-25% filtrovaného Na + a K + bez zpětné resorpce vody ve vzestupném raménku, což vytváří kortikokapilární osmotický gradient Aktivní transport Cl - do tubulárních buněk s doprovodem Na +, což navodí ředění moče Reabsorpce asi 10% filtrovaného Na + většinou sdruženého se sekrecí H + a K + (řízeno aldosteronem). Regulace Na + a objemu ECT Sekrece H + + a tvorba NH 4 při regulaci ABR. Reabsobce vody řízená ADH nebo další ředění moče Poměr koncentrací Poznámky moč : plazma Na + 100:145 (mmol/l) Cl - 100:110 (mmol/l) glukóza 0:4 (mmol/l) nepřekročí-li se renální práh urea 300:7 (mmol/l) = cca 45:1 kreatinin 12:0.1 (mmol/l) = cca 120:1 volně filtrován, sekrece v tubulech voda 1,8/180 (l) = cca 1:100 hydrogenuhličitan (HCO 3- ) 1:24 (mmol/l) H + (proton) 1000:40 (nmol/l) = cca 25:1 sekrece H + - spojena s reabsorpcí HCO 3 Tabulka 5p.2 Zacházení ledvin s vybranými látkami (ionty, glukóza, urea, kreatinin, voda, hydrogenuhličitan a proton) vyjádřené jako poměr mezi koncentrací v definitivní moči a v plazmě. Všimněte si, že pokud je tedy poměr moč : plazma > 1, dochází k vylučování dané látky. Je-li tento poměr < 1, pak tělo látku zadržuje (šetří). Více o úloze ledvin v acidobazické rovnováze najdete v příslušné kapitole. 51

52 Základy tvorby moče Juxtaglomerulární aparát Juxtaglomerulární aparát je tvořen dvěma částmi: Juxtaglomerulárními buňkami - v medii vas aferens glomerulu, produkují renin na podněty z baroreceptorů (pokles perfúzního tlaku v ledvinách) a z macula densa (chemoreceptory, viz dále) Macula densa - jde o modifikované tubulární buňky tlusté části ascendentní Henleova kličky (přechod do distálního tubulu), které detekují Na + a Cl - v tubulární tekutině KAPITOLA 05 Tento aparát je základem renin-angiotenzin-aldosteronového systému (RAAS), který je, spolu s ADH a natriuretickými peptidy, hlavní regulátor cirkulujícího objemu. Obrázek 5p.2 Spouštěčem celé kaskády je nízký perfúzní tlak v ledvinách (detekovaný baroreceptory a chemoreceptory v macula densa), který nacházíme např. u srdečního selhání nebo dehydratace. Juxtamedulární buňky na tento podnět začnou tvořit renin. Efektorem v této kaskádě jsou hlavně angiotenzin II (vasokonstrikce), angiotenzin III (stimulace sekrece aldosteronu) a aldosteron (vstřebávání Na + a tím i vody). Cílem je obnovit cirkulující objem a udržet dostatečnou perfúzi důležitým orgánům. Renin Renin je proteáza, která štěpí angiotenzinogen na angiotenzin I. Ke zvýšení produkce reninu vede zejména snížení objemu extracelulární tekutiny (viz Obrázek X.). mechanismy zvýšení produkce reninu: baroreceptory - detekují pokles tlaku ve vas aferens snížená koncentrace Na + a Cl - v oblasti macula densa prostaglandiny (prostacykliny) převážně z kůry ledvin aktivace sympatiku klinické situace vedoucí ke zvýšení reninu nedostatek sodíku diuretika hypotenze dehydratace hemoragie vzpřímený stoj konstrikce renální tepny nebo aorty srdeční selhání cirhóza různé psychické podněty Angiotenzin II Angiotenzin II způsobuje systémově vazokonstrikce arteriol; v ledvinách selektivně způsobuje významnější konstrikci vas eferens (při porovnání s vas aferens). To vede ke zvýšení filtračního tlaku v glomerulu -> obnovení (udržení) glomerulární filtrace a syntéze aldosteronu (hlavně účinkem angiotenzinu III) -> tedy zvýšenému vstřebávání Na + a vody. Angiotenzin II zpětnovazebně inhibuje sekreci reninu. Aldosteron Účinkem aldosteronu je resorpce Na + a Cl - v distálním tubulu (a sběrném kanálku) doprovázená sekrecí K + a H +. Sekrece aldosteronu je tedy řízena podněty vedoucími k vyplavení reninu (viz Obrázek 5.2 a příčiny sekundárního hyperaldosteronismu 1 ). 1 Primární hyperaldosteronismus je způsoben sekrečním nádorem (obv. adenomem) kůry nadledvin a je nejčastější příčinou sekundární hypertenze (zvýšené vstřebávání Na + spolu s vodou vede k zvýšenému cirkulujícímu objemu a tedy i hypertenzi). Diagnostickou známkou této hypertenze je hypokalémie. 52

53 Základy tvorby moče Antidiuretický hormon (ADH), vazopresin ADH je produkován v hypotalamu (nucleus supraopticus a paraventricularis). Primárně je sekrece ADH řízena osmolalitou plazmy (osmoreceptory v hypotalamu) - čím vyšší osmolalita plazmy, tím vyšší sekrece ADH (snaha o vyrovnání vysoké osmolality větším vstřebáním vody v ledvinách). Podrobnosti k regulaci sekrece ADH shrnují následující body: zvýšení ADH osmoreceptory (osmolalita plazmy > 287 mmol/kg vody) neosmotické stimuly "objemové" baroreceptory (hypovolemie...) některé léky (valproát, cyklofosfamid, fluoxetin...) traumata mozku nauzea a zvracení... snížení ADH osmoreceptory (osmolalita plazmy < 282 mmol/kg vody) neosmotická inhibice "objemové" baroreceptory (hypervolemie...) - zprostředkováno atriálním natriuretický peptidem, který je produkován srdečními síněmi při nadbytku vody a tlumí sekreci ADH (ledvinami se tedy ztrácí více vody) některé léky (doxycyklin, fenytoin...) a alkohol KAPITOLA 05 Nasednutím ADH na receptory (V2) ve sběrném kanálku nefronu dojde k "otevření" kanálů pro vodu (aquaporinů) a tedy ke zvýšenému vstřebávání vody. Základní farmakologie nefronu Obrázek 5.3. Základní farmakologie nefronu. Obrázek shrnuje účinek často používaných léků na různé části nefronu, jejich nežádoucí účinky a nebezpečí ev. kombinací. Všimněte si aditivního efektu ACEI, NSAID a spironolaktonu - jejich podávání, zejména při snížené glomerulární filtraci (při chronické renální insuficienci - potencované např. dehydratací při diuretické léčbě), často vede k hyperkalémii. Erytropoetin Erytropoetin je hormon produkovaný ledvinami při anémii nebo hypoxii. Jeho efektem je stimulace erytropoézy. Při chronickém selhání ledvin je obvykle nutné erytropoetin dodávat terapeuticky (deficit erytropoetinu se zjistí měřením jeho hladiny v séru). Literatura 1. Masopust, J. (1996)., požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Praha: Univerzita Karlova, Nakladatelství karolínum. 2. Racek, J. (2006). (2nd ed.). Praha: Galén. 53

54 Základní vyšetření moče Základní vyšetření moče Autor: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. Recenzenti: Doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. MBA; MUDr. Marie Šolcová KAPITOLA 05 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Souhrn: Ledviny jsou orgán, který zásadně pomáhá udržovat optimální vnitřní prostředí organizmu. Prostředníkem této snahy je moč, která proto vypovídá o funkci ledvin a složení krve. Moč vzniká filtrováním krve přes síto glomerulární membrány nefronu 1 a následnými úpravami (zpětné vstřebávání důležitých látek - např. vody a vylučování látek odpadních - např. močoviny). Tyto úpravy zprostředkovávají ledvinné tubuly. Tato kapitola se zabývá základním vyšetřením moče, které by vždy mělo být nedílnou součástí vyšetření ledvin. Další testy ledvinných funkcí popisuje kapitola Funkční zkoušky ledvin. Odběr vzorku a preanalytika Moč je jeden z nejsnáze získatelných biologických materiálů a její vyšetření přináší cenné informace. Zároveň jde o potenciálně infekční biologický materiál, proto při zacházení s těmito vzorky je nutné použití rukavic a do znehodnotit, najdeme ve způsobu odběru vzorku, jeho skladování a nedodržení maximálního času do provedení analýzy. Základní druhy klinicky používaných vzorků jsou uvedeny v Tabulce druh moče typické použití poznámka první ranní moč chemicky a sediment viz také náhodný vzorek zjištění těhotenství druhá ranní mikroalbuminurie, glykosurie mikroalbuminurie se vyjadřuje v mg/ mmol kreatininu náhodný vzorek moč chemicky a sediment, bakteriologie odebráno kdykoliv během dne (kultivace + citlivost), amyláza <?> katetrizovaná bakteriologie (kultivace + citlivost) sběr 24 hodin clearance kreatininu časté chyby sběru odpady do moče např. odpady iontů (Na, K, ), proteinu, dusíku, hormonů krátký sběr (cca 4 h) frakční exkrece viz funkční zkoušky ledvin pediatrický vzorek ( chytaná moč <?> ) moč chemicky a sediment (malé děti s plenkami) upozornit rodiče na obtížnost odběru Tabulka 5.1 Vzorky moče: základní druhy a jejich použití Nesbírané (jednorázové) močové vzorky obecně odebíráme po pečlivém očištění genitálu (ale rozhodně stačí očista v rámci běžné hygieny, není přijatelné např. drastické použití desinfekčních prostředků), do zkumavky zachytíme střední proud moče (minimálně cca 2-3 s od počátku močení). U žen během menstruace nelze správný vzorek (bez cévkování ) odebrat. Sběr moče obvykle provádíme 24 hodin (ale i kratší intervaly jsou možné) a postup je následující: pacient se ráno po probuzení vymočí mimo sběrnou nádobu 1 Nefron je základní funkční jednotka ledvin, která se skládá z glomerulu (klubko kapilár se selektivně propustnou filtrační membránou, zde se krev filtruje, vzniká primární moč) a tubulů (základně rozlišujeme tubulus proximální, Henleho kličku, distální tubulus a sběrné kanálky). Funkcí tubulů je vstřebávat, vylučovat, metabolizovat Základy fyziologie a patofyziologie ledvin najdete ve zvláštní kapitole. 54

55 Základní vyšetření moče od té doby sbírá veškerou svou moč do připravené nádoby (ev. více nádob) dalšího dne ráno se po probuzení (přesně za 24 h) ještě vymočí do sběrné nádoby následuje promíchání celého objemu nasbírané moče (pokud je více nádob, je nutné slít je do jedné velké), změření objemu moče (s přesností na 10 ml) a odebrání reprezentativního vzorku Od vyšetření, které vyžadují sběr moče (např. clearance kreatininu) je v současnosti odklon, protože sběr je často zatížen velkou chybou (neúplný sběr, špatné promíchání vzorku, nepřesné změření objemu vzorku ) a pro pacienty je nekomfortní 2. Existuje-li tedy relativně spolehlivá alternativa bez sběru moče, preferujeme ji. KAPITOLA 05 U každého jednotlivého močového analytu je vhodné dodržet čas od odběru vzorku do vlastní analýzy (konkrétní příklady viz dále). Pokud jej nelze dodržet (např. nelze zajistit včasný transport vzorku do laboratoře), mohou někdy pomoci konzervační činidla, která tento čas prodlouží. Nejjednodušším a nejčastějším konzervačním opatřením je chlad a tma, tj. lednice. Uchování v lednici zabrání významnému růstu bakterií přibližně na 24 hodin. Před vlastní analýzou je nutné vzorek nechat temperovat na pokojovou teplotu (jinak mohou v sedimentu být precipitované amorfní fosfáty a uráty, zvýšená specif. hmotnost). Chemické konzervanty jsou obvykle vhodné jen pro jednu nebo několik málo analýz a s jinými stanoveními mohou naopak interferovat a v praxi se používají spíše ve specifických aplikacích (viz preanalytika). Existují i komerčně dostupné zkumavky, které (dle výrobce) mohou zajistit spolehlivou konzervaci vzorku až na 72 hodin (při pokojové teplotě). Pokud nejsou vzorky moče dodány do laboratoře (a analyzovány) včas, může dojít k významnému ovlivnění výsledků. Některé změny jsou vázány na namnožení bakterií ve vzorku: bakterie metabolizují glukózu (a ta pak ve vzorku klesá), některé bakterie mají enzym ureázu (ta metabolizuje močovinu ve vzorku na CO 2 a NH 3 [amoniak] - ten naváže H + za vzniku NH 4+, čímž zvýší ph vzorku). Dále se např. mohou odpařit ketolátky nebo oxidovat bilirubin (na světle). Podrobnosti najdete v kapitole Preanalytika. Fyzikální vlastnosti moče Mezi fyzikální vlastnosti moče můžeme zařadit hustotu, vzhled (barvu, zákal), zápach nebo dokonce i chuť 3. O hustotě pojednáme dále, ostatní fyzikální vlastnosti moče mají obvykle jen velmi orientační až zanedbatelný diagnostický význam. Vzhled moče může být hlavním důvodem, proč pacient navštíví lékaře. Normální moč je slámově žlutá a intenzita tohoto zbarvení obvykle zhruba odpovídá hustotě moči. Normální moč je rovněž čirá, bez zákalu (vyloučíme-li chybný odběr vzorku či arteficiální změnu - např. vysrážení urátů, fosfátů při skladování v lednici). Nejčastější patologická zbarvení moče shrnuje Tabulka 3. Barva Příčina Poznámky Světle žlutá až bezbarvá normální po větším příjmu tekutin; polyurie při diabetu mellitu, diabetu insipidu při polyurii je zvýšený objem moče/24 hod; u diabetu mellitu glukóza v moči Tmavě žlutá koncentrovaný vzorek, užívání riboflavinu (vitamin B 2 ) normální v prvním ranním vzorku nebo po namáhavém cvičení Jantarová dehydratace při horečce nebo popáleninách Oranžová bilirubin, urobilin (žlutooranžový - vzniká fotooxidací urobilinogenu), léky (např. nitrofurantoin), Bilirubin i urobilinogen lze detekovat testačním proužkem (po fotooxidaci nikoliv) karoteny z potravy Žlutozelená, žlutohnědá biliverdin (oxidací bilirubinu) test na bilirubin je pak falešně negativni 2 Zajištění vhodných podmínek pro sběr může být při běžném životním stylu aktivního člověka v ambulantním uspořádání složité. 3 V současné době již nepřijatelný způsob testování, dříve používaný např. k diagnostice diabetu mellitu (sladká moč). 55

56 Základní vyšetření moče Růžová/červená/hnědá Hnědá Černá Modrá/Zelená přítomnost krve, hnědý je methemoglobin (oxidací hemoglobinu při kyselém ph moče); hemoproteiny (myoglobin, hemoglobin) porfyriny (krev chemicky je negativní) léky (např. rifampicin) potraviny (syrová řepa + alkalická moč = červená [jen u geneticky predisponovaných]; ostružiny + kyselá moč = červená; borůvky[růžová -> červená], senna [žlutá až červenohnědá], rebarbora [hnědá]) bilirubin, urologický čaj, melanom, alkaptonurie bakteriální infekce (Pseudomonas), léky (metylenová modř, amitryptilyn ), vrozené poruchy metabolismu aminokyselin <?>, otrava fenolem Erytrocyty, hemoglobin i myoglobin reagují s testačním proužkem na krev (pozitivní výsledek). Rozlišit lze vzhledem moče (v přítomnosti krve bývá zakalená) nebo séra (při intravaskulární hemolýze může být červené, u myoglobinurie ne); nebo specifickými testy (myoglobin v moči, komplement fixační reakce...) chemický průkaz krve je negativní KAPITOLA 05 Tabulka 5.3 Nejčastější patologická zbarvení moče (modifikováno dle [2]). Zákal moče nemusí být patologickou známkou (chyby odběru - zejména u žen; přítomnost spermií; bílý zákal může způsobit precipitace urátů či fosfátů ve vzorku skladovaném v lednici), ale často je zákal patrný v přítomnosti leukocytů a bakterií (močová infekce) nebo krve. Nezvyklý zápach moče může upozornit na ketoacidózu (ovocný, sladký zápach) nebo dědičnou poruchu metabolizmu (např. myšina, jako když se potí vlk u fenylketonurie; jako javorový sirup u nemoci javorového sirupu). Chemické vyšetření moče testačním proužkem Patří k velmi častým orientačním vyšetřením, která nás přiblíží nebo nasměrují k definitivní diagnóze a léčebnému zásahu. Nejčastěji se chemické vyšetření moče indikuje u těchto onemocnění a stavů: infekce močových cest diabetes mellitus zjištění ledvinných funkcí + podezření na onemocnění ledvin (screening) žloutenky (hyperbilirubinémie) V ambulantních podmínkách se výsledek testu nejčastěji odečítá okem, v nemocničních laboratořích je proces automatizován a více objektivizován (měření na principu reflexní fotometrie). Správný postup při použití testačního proužku: 1. Vzorek moče dobře promíchejte 2. Vzorky, které byly uskladněny v lednici, nechte ohřát na pokojovou teplotu 3. Proužek krátce ponořte celý do vzorku 4. Nadbytek moče otřete o okraj zkumavky a proužek položte na savý jednorázový materiál (buničinu ) 5. Porovnejte zabarvení reakčních políček s barevnou škálou od výrobce (obvykle je na obalu). Odečítejte ve správném čase (viz instrukce výrobce) a při dobrém světle. 6. Při interpretaci nezapomeňte na možné interference a preanalytické chyby 56

57 Základní vyšetření moče Jednotlivá stanovení Testační proužky obsahují buď jednotlivá stanovení nebo jejich kombinaci (např. zaměřenou na diagnostiku močové infekce nebo diabetu mellitu), často však obsahují všech 10 nejčastějších parametrů. Následuje výčet jednotlivých testů - princip stanovení je zmíněn jen, když je důležitý pro interpretaci výsledků (rel. časté falešně pozitivní nebo falešně negativní výsledky). Specifická hmotnost (hustota) KAPITOLA 05 Specifická hmotnost vyjadřuje poměr hustoty vzorku k destilované vodě, jde tedy o bezrozměrné číslo. Specifická hmotnost plazmy je 1,010, v definitivní moči zdravého člověka se nejčastěji pohybuje mezi 1,015 a 1, Může se měřit fyzikálně (např. hustoměrem nebo refraktometrem) nebo chemicky 5. Jednotlivé principy měření neposkytují srovnatelné výsledky, nejpřesnější je měření osmometrem 6. Specifická hmotnost moče je odrazem tubulárních funkcí ledvin (sekrece a resorpce iontů a hlavně vody) a může být jednou z prvních známek poškození ledvin (zejména ztráta reakce na změny příjmu tekutin). indikace: rozlišení prerenální a renální příčiny selhání ledvin, testování koncentrační schopnosti ledvin (v této indikaci je třeba měřit přesněji jako osmolalitu moče, viz také Funkční zkoušky ledvin). U prerenální příčiny selhání ledvin (např. dehydratace) lze očekávat vysokou spec. hmotnost moče (maximální koncentrace), u renální příčiny jsou tubulární funkce primárně poškozeny a ledviny produkují málo koncentrovanou moč. ph Koncentrace vodíkových iontů v moči je odrazem rovnováhy produkce, metabolismu a vylučování H +, nicméně může být i příznakem onemocnění ledvin a močových cest. ph první ranní moče se pohybuje mezi 5-6, náhodný vzorek u zdravého člověka však může mít ph 4,5 a 8 (alkaličtější po jídle, kyselejší po fyzické námaze, vliv diety ) 7. Referenční rozmezí pro ph moče je tedy spíše zavádějící a je třeba výsledek hodnotit spolu s dalšími daty (stav acidobazické rovnováhy ). U acidózy nacházíme kyselou moč a u alkalózy zásaditou (kompenzace nebo korekce poruchy ledvinami; samozřejmě jen nejsou-li ledviny příčinou poruchy acidobazické rovnováhy). Rostlinná strava (s nízkým obsahem proteinů, např. u vegetariánů) obvykle vede k nižší základní produkci H + a alkaličtější moči. indikace: hlavně diagnostika infekce močových cest, ale i hodnocení poruch acidobazické rovnováhy nebo diagnostika a sledování léčby urolitiázy Močové infekce způsobené bakteriemi s ureázou (např. Klebsiella) způsobují alkalické ph moče. Tvorba močových kamenů je také závislá na ph moče, např. nejčastější močové kameny (oxaláty vápenaté) vznikají v kyselé moči a při prevenci recidiv je vhodné (hlavně dietními opatřeními) udržovat alkaličtější ph moče. Falešně vysoké hodnoty můžeme očekávat při pozdním dodání vzorku (činnost bakterií, viz výše), falešně nízké při kontaminaci reagenciemi ze sousedního detekčního políčka (často stanovení proteinu, kde reakce probíhá v silně kyselém prostředí). Leukocyty, Nitrity Hlavním účelem obou testů je vyloučení/potvrzení podezření na močovou infekci 8 a následně příp. indikaci mikrobiologické kultivace moče a identifikace patogena a jeho citlivosti k antibiotikům. Neslouží tedy k přesné diagnostice a terapii močových infekcí (to provádíme na základě mikrobiologického vyšetření). U testu na leukocyty detekujeme jeden z enzymů (esterázu) granulocytárních leukocytů. U testu na nitrity využíváme schopnost bakterie redukovat dusičnany (nitráty) na dusitany (nitrity). To umí např. enterobakterie (patří sem např. E. coli nebo Proteus). Podmínkou správné pozitivity (citlivosti) tohoto testu je, že moč 4 Může se však pohybovat mezi 1,003 a 1,035 (vzorky se spec. hmotností < 1,003 pravděpodobně nejsou moč, > 1,035 může být po aplikaci RTG kontrastních látek i.v.). Velmi široké rozmezí je dáno vlivem hydratace (příjmu tekutin) na tento parametr. 5 Případně jako osmolalita nejčastěji kryoskopicky (viz funkční zkoušky ledvin). 6 Osmolalita závisí jen na počtu částic v roztoku. Hustota je ovlivněna i velikostí částic. Na + tedy zvýší hustotu vzorku méně než větší urea nebo glukóza. Chemický princip měření specifické hmotnosti (na testačním proužku) detekuje pouze ionty, není tedy ovlivněn přítomností urey, glukózy nebo kontrastní látky, ale přítomnost proteinu (aniontu) falešně zvyšuje výsledky. Klinicky jsou tato omezení pro orientační charakter vyšetření obvykle zanedbatelná. 7 Vzorky moče s ph < 4,5 a > 9 jsou indikací k novému odběru (pravděpodobná kontaminace nebo arteficiální namnožení bakterií s ureázou). 8 Zejména v případech nejasných klinických potíží, pro časný záchyt cystitid. 57

58 Základní vyšetření moče byla v močovém měchýři min 4 hodiny (nutné pro redukci dostatečného množství nitrátů) a že má pacient dostatečné množství dusičnanů v potravě 9. indikace: diagnostika, screening infekce močových cest Bílkovina Stanovení bílkoviny (albuminu) testačním proužkem je jedno z nejdůležitějších základních vyšetření moče, protože může včas odhalit rozvíjející se renální patologii. Zdravým glomerulem pronikne malé množství albuminu (rel. molekulová hmotnost je cca 70 kda) a všechny malé proteiny (mikroproteiny). Většina těchto fyziologicky profiltrovaných proteinů je však zpětně vstřebána buňkami proximálního tubulu. Při onemocnění ledvin je buď poškozena glomerulární membrána (glomerulární proteinurie) nebo tubulární buňky (tubulární proteinurie). Hranice pro proteinurii je je stanovena na 150 mg/24 hodin. Princip stanovení: acidobazický indikátor, který mění zbarvení v přítomnosti proteinu (zejména albuminu, který má hodně vazebných míst pro protony a může je indikátoru odebrat). Aby nedocházelo ke změně zbarvení i vlivem změn ph moče, je v proužku pufr, který zajišťuje stálé (kyselé) ph okolo 3 (viz Obrázek 5.1). Tento způsob stanovení je nejcitlivější na albumin (pro ostatní proteiny není tolik citlivý). Proužek obvykle zachytí koncentrace albuminu vyšší než 150 mg/l. KAPITOLA 05 Obrázek 5.1 Princip stanovení bílkoviny v moči diagnostickým proužkem a možné falešné pozitivity a negativity. Falešně pozitivní výsledky mohou způsobit silně alkalické (ph > 8) a pufrované moče tím, že indikátoru odeberou protony (a změní jeho barvu) i bez přítomnosti albuminu. Řešením je u silně alkalických močí použít jiný test (např. precipitace s kys. sulfosalicylovou) nebo vyšetření opakovat s časovým odstupem (např. u nekomplikovaných močových infekcí s vysokým ph moče je rozumné stanovení zopakovat po antibiotické terapii uroinfekce). Falešně negativní výsledky můžeme očekávat u většiny prerenálních a tubulárních proteinurií (rel. nízká koncentrace proteinu v moči a nízká citlivost indikátoru), včetně Bence-Jonesovy bílkoviny (volné lehké řetězce v moči při mnohočetném myelomu). Rovněž albumin v pásmu mikroalbuminurie ( mg/l) nebývá standardními testačními proužky detekován (více o mikroalbuminurii viz Diabetes). 9 Hlavním dietním zdrojem dusičnanů je zelenina. Proto např. u některých hospitalizovaných pacientů (např. hladovějící v souvislosti s operačním zákrokem, na parenterální výživě.) může být vyšetření nitritů v moči falešně negativní. 58

59 Základní vyšetření moče Existují i jiné způsoby stanovení proteinu (albuminu) v moči testačním proužkem, které tolik netrpí interferencí ph (např. precipitační reakce s kyselinou sulfosalicylovou nebo novější chromogenní a imunochemické proužkové metody). Proteinurii obvykle dělíme 10 dle lokalizace příčiny na (viz Obrázek 2): prerenální 11 - je způsobena zvýšenou nabídkou mikroproteinu (proniká i zdravým glomerulem) tubulům, které jej nestačí vychytat. Obvykle jde o menší množství proteinu (do 1 g/den). Příkladem takových proteinů jsou β 2 -mikroglobulin, α 1 -mikroglobulin, reaktanty akutní fáze, Bence-Jonesova bílkovina, myoglobin či hemoglobin. Přítomnost těchto proteinů obvykle primárně neznamená poškozenou funkci ledvin a často není testačním proužkem vůbec detekováno. Při podezření na Bence-Jonesovu bílkovinu je nutné provést elektroforézu sérových bílkovin (ev. i změřit koncentraci volných lehkých řetězců v séru) a imunofixaci moče. renální - příčinou proteinurie je poškození ledvin na úrovni glomerulů nebo tubulů. Glomerulární proteinurie je způsobena vyšší propustností glomerulu 12 a vyskytuje se např. u mnohých glomerulonefritid, diabetické nefropatie nebo amyloidózy ledvin. Tubulární proteinurie je podmíněna poškozením (zejm. proximálních) tubulů - např. při otravách těžkými kovy (Hg, Cd), jako nežádoucí účinek některých léků (gentamicin, cyklosporin, cisplatina, litium ) nebo při některých virových infekcích 13. postrenální - přítomny jsou proteiny z odvodných cest močových (např. α 2 -makroglobulin nebo IgM), příčinou může být zánět nebo krvácení, ev. preanalytická chyba (menstruační krev, prostatický sekret, spermie...). KAPITOLA 05 Obrázek 5.2 Rozdělení proteinů v moči dle velikosti při elektroforéze (probíhá v polyakrylamidovém gelu a bílkoviny jsou obvykle obaleny dodecylsíranem sodným SDS-PAGE). Nefrotický syndrom 10 Klasickým laboratorním testem pro určení typu proteinurie je SDS-PAGE elektroforéza, kde se proteiny dělí dle velikosti (a snadno pak můžete určit jejich původ) 11 Někde také označována za over-flow proteinurii. 12 Můžeme ji dále dělit na selektivní (glomerulární membránou pronikají albumin, příp. i transferin) a neselektivní (glomerulární membránou pronikají i velké proteiny jako imunoglobulíny). Prognóza a odpověď na terapii bývá u chorob s glomerulární selektivní proteinurií lepší. 13 V současnosti se pro diagnostiku tohoto typu proteinurie někdy používá stanovení rel. stabilních mikroproteinů v moči (cystatinu C nebo α 1 -mikroglobulinu) 59

60 Základní vyšetření moče Nefrotický syndrom můžeme definovat jako proteinurii, která je schopná způsobit hypoalbuminémii a otoky. Množství proteinurie se může lišit, obvykle bývá > 3,5 g/24 h. Z příčin nefrotického syndromu jmenujme glomerulonefritidu s minimálními změnami, proliferativní glomerulonefritidu nebo systémový lupus erythematodes. Poměr U_protein/U_kreatinin Tento poměr se zdá velmi užitečný a praktický a může nahradit sběr moče při kvantifikaci proteinurie. Poměr se obvykle vyjadřuje v mg (proteinu)/mmol (kreatininu) a číselně je pak hranicí pro proteinurii 15 mg/mmol a pro nefrotický syndrom 350 mg/mmol. KAPITOLA 05 Krev princip stanovení: oxidace chromogenu (detekční barvy) hemem (pseudoperoxidázová aktivita hemu). Detekuje se hem, proto je proužek citlivý jak na erytrocyty (ty lyzují při kontaktu s reakčním políčkem), tak i na hemoglobin nebo myoglobin (obsahuje také hem). Falešně pozitivní výsledky můžeme naměřit, pokud jsou ve vzorku oxidační činidla (např. zbytky desinfekčních přípravků z dekontaminace zkumavky), falešně negativní výsledky jsou pozorovány u klasických testů v přítomnosti vysoké koncentrace vitamínu C 14. Dle intenzity rozlišujeme hematurii: makroskopickou (viditelnou okem, růžové až červené zbarvení moče, přítomný zákal - více viz vzhled moče) mikroskopickou (detekovatelnou mikroskopicky nebo chemicky). Dle příčiny rozlišujeme hematurii: prerenální - do moči se dostane hemoglobin (z intravaskulárně rozpadlých erytrocytů - např. při hemolytické anémii, při inkompatibilní transfúzi) nebo myoglobin (např. při rozsáhlejším poranění svalů, u popálenin, vzácný následek hypolipidemické léčby statiny a fibráty) z krve. Masivnější přítomnost každého ze jmenovaných proteinů může způsobit akutní selhání ledvin (obstrukce tubulů precipitovaným proteinem) 15. Mikroskopicky erytrocyty nenacházíme. Při rozlišování, zda jde o myoglobin či hemoglobin, vycházíme z anamnézy, vzhledu moče a séra (viz Tabulka 3) nebo z dalších laboratorních testů (vysoká aktivita LD a neměřitelný haptoglobin u hemolytické anémie; vysoká CK a AST při poškození svalů nebo lze oba proteiny rozlišit imunochemickým stanovením jejich koncentrace). renální - někdy také nazývaná glomerulární, kdy příčinou bývá glomerulonefritida. Od non-glomerulární hematurie ji můžeme odlišit pomocí mikroskopie ve fázovém kontrastu. Zde se opticky zvýrazní okraje erytrocytů v moči - u glomerulární erytrocyturie najdeme dysmorfní erytrocyty16 (typické jsou erytrocyty s pučícími výběžky, tzv. akantocyty - následek průchodu glomerulárním sítem, viz Obrázek X). Tento typ hematurie bývá často provázen proteinurií a vyskytují se erytrocytární válce (viz také níže). Obrázek 5.3 Dysmorfní erytrocyty (akantocyty) - schéma. Akantocyty jsou typické při glomerulárním původu erytrocytů. 14 Všimněte si podobnosti interferencí se stanovením glukózy. U obou je základním principem oxidace chromogenu (a tedy oxidující látky budou způsobovat falešně pozitivní výsledky a redukující naopak). Novější proužky zabraňují ovlivnění výsledku vitamínem C přidáním látky, která jej zoxiduje a ten pak neinterferuje. 15 Základním preventivním opatřením (prevence akutního selhání ledvin) u masivní myoglobinurie a hemoglobinurie je zvýšený přísun tekutin. 16 Akantocyty se velmi snadno rozpadají, je tedy nutné včasné dodání vzorku do laboratoře, ideálně vzorek odebrat přímo v laboratoři. 60

61 Základní vyšetření moče subrenální - někdy také nazývaná non-glomerulární, kdy příčinou může být krvácení do močových cest při jejich zánětu, urolitiáze, nádoru močových cest nebo ledvin. Relativně často se setkáváme s traumatickým krvácením po cévkování (zejm. při současné antikoagulační terapii). Charakteristické pro tento typ hematurie je relativně minimální proteinurie. Ve fázovém kontrastu najdeme erytrocyty normálního tvaru (bikonkávní, piškotovité). Někdy se vyskytuje i tzv. ponámahová hematurie (přechodná, po velmi intenzivní fyzické námaze, po prochladnutí) nebo arteficiální (pacient vědomě přidá krev do vzorku moče). Glukóza KAPITOLA 05 princip stanovení: oxidace chromogenu (detekční barvy) peroxidem vodíku vzniklým enzymatickým rozkladem glukózy (glukóza je oxidována glukózaoxidázou na glukonolakton a H 2 O 2 ). Stanovení je specifické pro glukózu (ostatní redukující cukry jako je galaktóza nebo fruktóza nereagují) 17. Falešně pozitivní výsledky můžeme očekávat v přítomnosti oxidujících látek (např. některé desinfekční prostředky použité k dekontaminaci zkumavky), falešně negativní výsledek nacházíme v přítomnosti kyseliny askorbové (vitamín C 18 ) nebo nejčastěji při pozdním dodání vzorku (bakteriální rozklad). indikace: zejména prvotní diagnostika diabetu mellitu. U zdravého člověka je glukóza profiltrovaná glomerulem prakticky úplně vstřebána v proximálním tubulu. Pokud však koncentrace v krvi přesáhne cca 10 mmol/l (tzv. renální práh pro glukózu), tubulární buňky ji již nestačí vychytat a objeví se v moči. Příčinou glykosurie tedy může být: nejčastěji překročení renálního prahu pro glukózu (jako je tomu u diabetiků). snížení renálního prahu (Fanconiho syndrom, i u zdravých jedinců) - označujeme ji renální glykosurií v těhotenství, kde je zvýšená glomerulární filtrace (tedy i zvýšené množství glukózy, které projde tubuly) a může být i snížený renální práh pro glukózu. I u zdravého člověka se může po jídle bohatém na sacharidy objevit glykosurie. Proto pro (orientačně) 19 diagnostické účely je vhodné používat druhou ranní moč a pacient by měl být nalačno až do odběru vzorku (v první ranní moči může být postprandiální glukóza z večerního jídla). Je vhodné připomenout, že citlivost tohoto testu není ideální (glukóza se objeví v moči až když je koncentrace v krvi vyšší než 10 mmol/l), renální práh pro glukózu může být značně individuální a může se měnit v průběhu diabetu mellitu. Glykosurie je tedy jen jednoduchým orientačním diagnostickým testem, pro sledování kompenzace diabetika se nehodí. Ketolátky princip stanovení: reakce ketoskupiny s nitroprusidem (v alkalickém prostředí) Ketolátky vznikají převážně neúplnou oxidací volných mastných kyselin (z tuků) v situacích, kdy je nedostatek glukózy (hladovění, diabetes mellitus - zejm. 1. typu, velká fyzická zátěž, zvracení...). Mezi ketolátky řadíme β-hydroxybutyrát (BHB) a jeho 17 Stále se užívá reakce s Benediktovým činidlem (CuSO 4 v alkalickém prostředí + zahřátí -> Cu 2 O [zabarvení precipitátu od modrozelené do cihlově červené]. Hlavní postavení má při screeningu galaktosémie a v některých zemích se doporučuje provést toto stanovení u všech dětí do 2 let věku. 18 Někteří výrobci přidávají do reakční směsi látku, která je schopná askorbát oxidovat a tím zabrání interferenci se stanovením glukózy 19 Definitivní diagnostika diabetu mellitu se provádí z plazmy (viz Diabetes mellitus) 61

62 Základní vyšetření moče oxidovanou formu acetoacetát (AcAc), jehož spontánní dekarboxylací vzniká aceton) 20 - viz Obrázek 5.4. KAPITOLA 05 Obrázek 5.4. Ketolátky. Všimněte si fialově podbarvené ketoskupiny acetoacetátu a acetonu (reagují s nitroprusidem). U β-hydroxybutyrátu je ketoskupina nahrazena hydroxylovou, s nitroprusidem tedy nereaguje. Kvantitativně v moči převažuje β-hydroxybutyrát (asi 80%), zbytek tvoří acetoacetát (acetonu je zanedbatelné množství). S nitroprusidem reaguje pouze ketoskupina acetoacetátu a acetonu. Např. při těžké diabetické ketoacidóze doprovázené hypoxií a šokem nebo při alkoholické ketoacidóze může dojít k významnému zvýšení poměru BHB/AcAc. Vzhledem k tomu, že BHB s nitroprusidem nereaguje, může v této (výjimečné) situaci dojít ke kvantitativnímu podhodnocení výsledků. Indikace: hlavně sledování kompenzace diabetu mellitu, zejména inzulinoterapie u diabetiků 1. typu. Objeví-li se ketolátky v moči u diabetika 1. typu (na inzulinoterapii), znamená to, že má nedostatek inzulínu a je třeba přizpůsobit jeho dávku. Bilirubin, urobilinogen Konjugovaný blirubin v krvi (na rozdíl od nekojugovaného, který je navázaný na albumin) volně proniká do moče, kde jej detekujeme např. při obstrukční žloutence nebo při poškození jater. Urobilinogen se v moči objeví např. při poškození jater nebo při hemolytické anémii. Více v kapitole Játra. 20 Více o patofyziologii ketolátek najdete v acidobazicka_rovnovaha_priprava -> produkce H + 62

63 Základní vyšetření moče Vyšetření močového sedimentu Vyšetření močového sedimentu doplňuje informace získané z chemického vyšetření moče testačním proužkem. Každá laboratoř má vlastní algoritmus pro zpracování vzorku a provádění vyšetření močového sedimentu. Obvykle je chemické vyšetření scereeningové a jen při jeho patologickém výsledku (většinou při pozitivitě leukocytů, nitritů, krve nebo proteinurii) pokračujeme s analýzou močového sedimentu. Vyšetření ve většině případů již probíhá na automatických analyzátorech z promíchaných, nezahuštěných vzorků moče. Principem stanovení je buď softwarová analýza digitálního mikroskopického obrazu nafoceného digitální kamerou nebo průtoková cytometrie (identifikace elementů je založena na měření impedance, rozptylu světla a fluorescenci). Při nejasnostech však má stále rozhodující slovo klasické mikroskopické vyšetření 21, které je prováděno po standardním zahuštění centrifugací (např. 12 ml moče centrifugovat 5 min při 400 RCF, bez brzdění; následně odebrat pipetou 11 ml, resuspendovat a nanést na sklíčko 22 ). Vyšetření lze provádět v nativním vzorku nebo po obarvení (zdůraznění jader, buněčných membrán a dalších struktur). Výsledky vydáváme jako počet elementů v 1 µl. Velmi důležité je správné odebrání a včasné zpracování vzorku - buňky i válce se velmi rychle rozpadají zejména v hypotonické a alkalické moči. Močový sediment by měl být zpracován do 1 hodiny po odběru. KAPITOLA 05 Složení močového sedimentu Močový sediment zdravého člověka může obsahovat celou řadu formovaných struktur. Patří sem i malé množství erytrocytů (< 5/µl), leukocytů (<10/µl), některé epitelové buňky (hlavně dlaždičové epitelie), hyalinní válce nebo různé krystaly. Nejčasteji v normálním močovém sedimentu naleznete jen několik dlaždicových epitelií a hlen. Erytrocyty V močovém sedimentu hlavně potvrzujeme, zda případná chemická pozitivita krve testačním proužkem je doprovázena erytrocyturií nebo ne a jde spíše o myoglobinurii či hemoglobinurii. Dále v močovém sedimentu rozlišujeme erytrocyty glomerulárního a non-glomerulárního původu (Obrázek 5.5, viz také výše). Obrázek 5.5 Dysmorfní erytrocyty. 21 Ev. mikroskopie ve fázovém kontrastu (dysmorfní erytrocyty, identifikace válců a některých buněk). 22 Jsou komerčně dostupná mikroskopická sklíčka, která tuto fázi standardizují (objem nanášeného vzorku). 63

64 Základní vyšetření moče Leukocyty Leukocyty v močovém sedimentu jsou obecné známkou zánětu močové soustavy. Jeho etiologie může být infekční (pyelonefritida, cystitida ) nebo neinfekční (např. autoimunitní poškození). Nejhojněji bývají zastoupeny neutrofily, diagnózu léky indukované intersticiální nefritidy může podpořit nález eosinofilů (je nutné speciální barvení). Epitelie KAPITOLA 05 Dle původu epitelií můžeme rozlišit: dlaždicové (pochází z vaginy a z dolní ⅓ močové trubice) - velké buňky s centrálně uloženým jádrem (veliké přibližně jako erytrocyt), fyziologická součást moče přechodné (výstelka od ledvinných pánviček, přes kalichy, močovody, močový měchýř až po prox. část uretry) - menší než dlaždicové, centrálně uložené jádro, různých tvarů (sférické, s ocáskem ), v malém množství fyziologicky, velké množství po katetrizaci a dalších invazivních zákrocích, atypické buňky při nádorech nebo virových infekcích tubulární buňky (pocházejí z tubulů - mají různý tvar dle lokalizace (trojhranné, kulaté [jádro je oproti přechodným epit. excentricky], kubické) - vždy patologické, známka tubulární nekrózy (např. otrava těžkými kovy, hemoglobin a myoglobinurie, nefrotoxické léky, virové infekce [HBV], akutní rejekce transplantátu) Obrázek 5.6 Buňka přechodného epitelu (vlevo) a tubulární buňky (vpravo). Bakterie a kvasinky Přítomnost bakterií spolu s leukocyturií je obvykle známkou močové infekce (Obrázek 2). Výskyt kvasinek (Obrázek 7) bývá častější u diabetiků (glykosurie + kyselá moč), imunosuprimovaných a pacientek s vaginální moniliázou. Izolovaná bakteriurie a výskyt kvasinek (zejm. při nesterilním odběru a při pozdním dodání vzorku) nemá diagnostický význam. 64

65 Základní vyšetření moče KAPITOLA 05 Obrázek 5.7 Záplava bakterií (vlevo - připomíná rozsypaný čaj ) a kvasinky (vpravo). Všimněte si pučících kvasinek a mycelia, které pomáhají při odlišení od erytrocytů. Paraziti Nejčastěji se můžeme setkat s Trichomonas vaginalis, která je typická 3 bičíky a undulující membránou (viz Obrázek 8) a způsobuje záněty vaginy. Obrázek 5.8 Trichomonas vaginalis v nebarveném preparátu. Šipka ukazuje na 3 bičíky. Hlen Hlen je protein původem ze žlázek urogenitálního traktu nebo z tubulů (Tamm-Horsfallův protein). Často se vyskytuje i ve fyziologických močích, nemá diagnostický význam (může se však zaměnit za hyalinní válce - viz dále). 65

66 Základní vyšetření moče Válce Válce se formují v distálních partiích nefronu. Jsou složené z Tamm-Horsfallova proteinu, který tubulární buňky secernují, a dalších součástí lišících se dle konkrétní patologie (např. erytrocyty, leukocyty ). Jejich tvar (šířka) kopíruje rozměr tubulů - široké válce pocházejí tedy vždy z patologicky dilatovaných tubulů. Některé válce obsahují buněčné struktury: erytrocytární (při erytrocyturii glomerulárního původu) leukocytární (při pyelonefritidě) epiteliální (obsahující tubulární buňky - např. při toxickém požkození těžkými kovy, jedy a léky; u rejekce transplantátu), někdy se těžko odlišují od leukocytárních bakteriální válce, někdy obsahují i leukocyty, můžeme je najít u pyelonefritidy KAPITOLA 05 Dále rozlišujeme válce hyalinní (nejčastější, malé množství může být fyziologické, velké počty ukazují nespecificky na patologii ledvin - ak. glomerulonefrtida, pyelonefritida, chronická ren. insuficience ), granulované (granula pocházejí z lysozomů renálních tubulárních buněk, nebo z rozpadu leukocytů; diagnostický význam je sporný - dle dalšího nálezu může znamenat tubulární poškození, leukocyturii nebo nemusí být známkou patologie) a voskové ( válce chronického renálního selhání, obvykle se nacházejí spolu s dalšími válci). Zjednodušeně se dá říci, že postupem času (s pokračující stázou moče v tubulu) se z hyalinního válce v tubulu stává granulovaný a nakonec voskový. Obrázek 5.9 Válce. Lekocytární válec (nebarvený preparát) Granulocytární válec (barveno dle ) 66

67 Základní vyšetření moče KAPITOLA 05 Voskový válec Krystaly Nález krystalů v moči obvykle není známkou patologie, nedá se podle něj ani usuzovat na druh urolitiázy 23 (je-li přítomna). Výjimkou jsou cystinové krystaly, které se v moči zdravého člověka vyskytovat nemohou. Záplava oxalátových krystalů může doprovázet otravu etylénglykolem (spolu s metabolickou acidózou, viz Toxikologie). Obrázek 5.10 Krystaly. Oxalátové krystaly ( obálky ) Šestiboké krystaly cystinu Literatura 1. Racek, J. (2006). (2nd ed.). Praha: Galén. 2. William J Marshall a Stephen K. Bangert, Clinical Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects, 2nd ed. (Churchill Livingstone, 2008). 3. Strasinger, S. K., & Lorenzo, M. S. D. (2008). Urinalysis and Body Fluids (5th ed.). F. A. Davis Company. 23 Např. nejčastější kámen je oxalát (šťavelan) vápenatý, nicméně oxalátové krystyly se v moči běžně vyskytují i u zcela zdravých lidí (dietní zdroje oxalátů - špenát, rebarbora ) 67

68 Základní vyšetření moče 4. Tesař Vladimír, Zima Tomáš, Racek Jaroslav, Teplan Vladimír, Friedecký Bedřich, Kratochvíla Josef, Granátová Jana, Kubíček Zdenek (2010): Doporučení České nefrologické společnosti a České společnosti klinické biochemie ČLS JEP k vyšetřování proteinurie, KAPITOLA 05 68

69 Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava KAPITOLA 06 ÚVOD V laboratorní terminologii se pojmem celkový protein rozumí velká skupina všech proteinů krevní plazmy a intersticiální tekutiny. Jde o více než 100 strukturně známých proteinů lišících se molekulovou hmotností, vlastnostmi, distribucí i biologickou funkcí. K významným funkcím patří udržování onkotického tlaku krve, transport mnoha látek, obrana proti infekci, enzymová aktivita, hemokoagulace, pufrační a antioxidační působení. Největší podíl na syntéze těchto proteinů mají játra, významně se na ní podílí také lymfocyty. Denní obrat činí přibližně 25 g. Pro syntézu je nezbytný dostatečný přísun proteinů v potravě jako zdroje aminokyselin (zvláště esenciálních). Syntéza je regulována hormonálně. Produktem odbourávání jsou aminokyseliny, které se opětovně využívají pro syntetické reakce (tvorba nových proteinů, syntéza různých nízkomolekulárních dusíkatých látek) nebo jsou dále odbourávány. Konečným produktem degradace proteinů je močovina, která se z těla vylučuje převážně močí. Malé množství proteinových molekul je z těla vylučováno přímo močí a stolicí. Chemická a fyzikální charakteristika, struktura a povaha analytu V krevní plazmě se dají prokázat stovky různých bílkovin, které se liší velikostí molekuly, fyzikálně-chemickými vlastnostmi, distribucí, biologickým poločasem a funkcí. Z analytického hlediska řadíme do této skupiny pouze proteiny, které nalézáme v krevním séru ve významnějších koncentracích (řádově mg/l - g/l): transportní proteiny, proteiny akutní fáze, negativní proteiny akutní fáze, antiproteázy, imunoglobuliny, komplement a lipoproteiny. Ostatní proteiny, jako jsou enzymy, hormony, koagulační faktory (zvláště pokud jde o proteiny krevního séra, v němž se nenachází fibrinogen) a buněčné proteiny uvolňované z poškozených tkání, se na celkové hmotnostní koncentraci podílejí jen nepatrně. Strukturně jde o makromolekulární látky tvořené polypeptidovým řetězcem složeným ze 100 a více aminokyselin, relativní molekulová hmotnost proteinu bývá vyšší než (např. albumin má M.r , IgM ). Mnoho plazmatických proteinů vykazuje polymorfismus (např. alfa-1-antitrypsin, haptoglobin, transferin, ceruloplazmin, imunoglobuliny). Většina proteinů je glykosylována, jde tedy převážně o glykoproteiny. Hodnota fyziologického ph je vyšší než je pi většiny proteinů. Výsledkem je záporný náboj těchto proteinů, plazmatické proteiny proto řadíme mezi anionty. V závislosti na ph okolí mohou proteiny na své funkční skupiny proton vázat nebo uvolňovat, působí tedy jako pufry. Na základě různého náboje a velikosti molekuly lze směs proteinů dělit pomocí elektroforézy. Elektroforetickým dělením proteinů krevního séra na agaróze nebo na acetylcelulóze tak získáme 5-6 frakcí: albumin, alfa1-, alfa2-, beta- (beta1 a beta2) a gama- -globuliny. Kromě frakce albuminu obsahují ostatní globulinové frakce vždy více než jeden protein, který se významně podílí na zbarvení elektroforetické zóny. Role v metabolismu Mezi hlavní funkce proteinů tělních tekutin patří: 1. udržení koloidně-osmotického (onkotického) tlaku krve, který přispívá k uchování tekutin v krevním řečišti - onkotický tlak na stěny kapilár je asi 3,3 kpa; největší podíl na onkotickém tlaku krevní plazmy má albumin, neboť má poměrně 69

70 Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava malou molekulu a je v plazmě ze všech proteinů v největší koncentraci (asi 60 %) 2. pufrační schopnost (udržování ph v úzkém rozmezí), která je dána amfoterním charakterem molekul proteinů; plazmatické proteiny tvoří 7 % pufrační kapacity krve 3. antioxidační působení některých proteinů (albumin, ceruloplazmin, hemopexin, haptoglobin) - ochrana před volnými radikály, resp. zábrana jejich tvorby 4. transport mnoha látek, převážně metabolitů špatně rozpustných ve vodě 5. obrana proti infekci - humorální odpověď na poškození organismu (proteiny akutní fáze, inhibitory proteáz, komplement, protilátky) 6. enzymová aktivita (kromě sekrečních enzymů se v tělních tekutinách nacházejí i enzymy buněčné, které zde neplní svou katalytickou funkci; jde o enzymy uvolněné z buněk při jejich běžném obratu, případně při poškození) 7. hemokoagulace a fibrinolýza (koagulační faktory a faktory zajišťující rozpouštění trombu; v plazmě jsou v neaktivní formě, po aktivaci se část z nich mění na proteolytické enzymy). Specifické role vybraných proteinů, které se významněji podílejí na hmotnostní koncentraci při analýze celkových bílkovin ( proteinu ) krevního séra, shrnuje tabulka 6.6p.1. KAPITOLA 06 transportní proteiny albumin (ALB) ceruloplazmin (Cp) transferin (Tf) transthyretin (TTR) hemopexin lipoproteiny chylomikra, VLDL, LDL, HDL proteiny akutní fáze C-reaktivní protein (CRP) sérum amyloid A (SAA), orozomukoid (a1-gp), haptoglobin (Hp) negativní proteiny akutní fáze albumin, transferin, transthyretin (= prealbumin) antiproteázy alfa-1-antitrypsin (a1-at, a1-pi) alfa1-antichymotrypsin (a1- -CHT) alfa-2-makroglobulin (AMG) funkce přenáší kovové ionty (Ca, Mg, Zn), nekonjugovaný bilirubin, volné mastné kyseliny, aminokyseliny, hormony, léky a jiné cizorodé látky špatně rozpustné ve vodě; významně se podílí na onkotickém tlaku, pufrační a antioxidační funkci krve váže Cu; významný pro transport a dostupnost Fe (oxiduje Fe 2+ na Fe 3+ ) přenáší Fe (jako železitý kation) podílí se na transportu thyroidálních hormonů, váže retinol-vazebný protein přenáší volný hem, má antioxidační funkci zajišťují transport lipidů v organismu; jsou to komplexní částice lipidů s proteiny, proteinové složky se nazývají apoproteiny ve zvýšené míře se syntetizují při poranění tkání, míra zvýšení závisí na vážnosti poškození, typu orgánu, který je maximálně poškozen, rychlosti syntézy a biologickém poločase každého z proteinů; haptoglobin přenáší extrakorpuskulární hemoglobin, má antioxidační funkci jejich syntéza klesá v případě zánětu a při nedostatku proteinů ve stravě slouží jako inhibitory proteolytických enzymů (např. trypsinu, chymotrypsinu, elastázy); udržují tak hladinu proteáz v mezích, aby nedošlo k nadměrnému poškození tkání 70

71 Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava imunoglobuliny IgA, IgD, IgE, IgG, IgM komplement C3, C4, C1 - esterázový inhibitor mají protilátkovou aktivitu (jsou efektory specifické imunitní odpovědi) podílejí se na nespecifické imunitní odpovědi Tabulka 6p.1 Specifické role vybraných proteinů KAPITOLA 06 Zdroj (syntéza, příjem) Optimální příjem proteinů potravou je 0,8-1,2 g/kg/den. Tyto proteiny jsou, v převážné většině, před vstřebáním do krve zcela rozloženy trávicími proteolytickými enzymy na aminokyseliny. Jsou tedy pouze zdrojem aminokyselin pro syntézu proteinů tělu vlastních. Významný je především přísun esenciálních aminokyselin. U kojenců se vstřebává též malé množství nerozložených bílkovin (endocytózou), schopnost jejich resorpce se však s věkem snižuje. Většina proteinů, přítomných v rovnovážných koncentracích v krevní plazmě a intersticiální tekutině, je syntetizována v játrech. Játra mají významnou rezervní proteosyntetickou kapacitu, např. pro albumin trojnásobnou, pro fibrinogen šestinásobnou. Přechod jednotlivých proteinů přes hepatocyt z místa syntézy do krve trvá 30 minut až několik hodin. Některé proteiny jsou produkovány také periferními tkáněmi (např. alfa-1 antitrypsin v hepatocytech, alveolárních makrofázích a monocytech), jiné dokonce všemi jadernými buňkami (např. protein buněčného povrchu beta-2-mikroglobulin). Imunoglobuliny jsou syntetizovány pouze v plazmatických buňkách. Denní obrat plazmatických proteinů je okolo 25 g. Distribuce v organismu, obsah ve tkáních Za fyziologických podmínek jsou jednotlivé proteiny v rovnovážné koncentraci mezi plazmou a intersticiální tekutinou. Míra prostupu kapilární stěnou závisí na velikosti proteinu - bazální membrána působí jako molekulové síto. Malé proteiny procházejí snadněji, proteiny o velké molekule nacházíme naopak ve vyšších koncentracích v plazmě (92 % alfa-2-makroglobulinu o r.m.h proti 32 % transferinu, který má r.m.h ). Přesto neplatí obecné pravidlo, že čím větší je relativní molekulová hmotnost proteinu, tím méně jej nalézáme v intersticiální tekutině (intravaskulárně se nachází 77 % z celkového množství IgM, jehož r.m.h. je ). Do mezibuněčného prostoru se proteiny dostávají buď pinocytózou skrz endotelové buňky nebo mezibuněčnými spoji. Do moče se glomerulární filtrací dostávají jen malé proteiny (hraniční velikost je přibližně r.m.h , ale záleží také na náboji molekuly - záporně nabité látky neprocházejí díky zápornému náboji glomerulární membrány). Filtrát obsahuje malé množství albuminu, zhruba stejné množství tzv. mikroproteinů a stopy proteinů o vyšší molekulové hmotnosti. Proteiny jsou však z primárního filtrátu ve velké většině zpětně resorbovány. Množství proteinů přítomné v moči (proteinurie) nepřesahuje u zdravého člověka 150 mg/den. Koncentrace proteinů v likvoru (proteinorachie) je za fyziologických podmínek 200 krát nižší než v plazmě: mg/l, stoupá s věkem. 80 % proteinů je plazmatického původu, přes hematoencefalickou bariéru se dostávají pinocytózou a různými specifickými přenašeči. Míra transportu závisí na velikosti molekuly, náboji, koncentraci v plazmě a stavu bariéry. Zbývajících 20 % jsou proteiny intratekální (imunoglobuliny, beta-2-mikroglobulin) + modifikované plazmatické proteiny (prealbumin, transferin) a malé množství (2 %) strukturních bílkovin. Proteiny se nacházejí také v lymfě, jejich koncentrace je nižší než v plazmě a závisí na oblasti, odkud lymfa odtéká: kosterní sval, kůže (20 g/l), plíce (40 g/l), zažívací trakt (41 g/l), srdce (44 g/l), játra (62 g/l). Za patologických situací nalézáme plazmatické proteiny i ve výpotku: transsudát obsahuje méně než 30 g/l, exsudát více než 30 g/l. Tento fakt lze použít k diferenciaci mezi těmito tekutinami. 71

72 Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava Katabolismus a způsob vylučování Proteiny jsou z těla částečně vylučovány v nezměněné podobě močí (150 mg/den) a stolicí (po difúzi do gastrointestinálního traktu). Převážně však probíhá jejich odbourání na aminokyseliny. Z uvolněných aminokyselin je % opět použito k proteosyntéze. Zbývající aminokyseliny jsou dále využívány jako substráty pro syntézu mnoha dusíkatých látek, ale také např. i glukózy, nebo jsou dále odbourány až na CO 2, vodu a amoniak. Ten je pro organismus toxický, proto je ve velké většině dále v játrech přeměňován na močovinu, která se vylučuje močí. KAPITOLA 06 Katabolismus proteinů probíhá ve všech buňkách, hlavní podíl na odbourávání však mají hepatocyty, tubulární buňky ledvin a endoteliální buňky kapilár. Glykoproteiny jsou nejprve desialovány membránově vázanými nebo cirkulujícími enzymy. Takto pozměněné proteiny jsou rozpoznány povrchovými receptory buněk a následně pinocytózou transportovány do buňky a degradovány lyzozomálními enzymy (katepsiny). Výbava jednotlivých buněk pro vychytání proteinů z tělních tekutin je různá: jaterní sinusy nemají bazální membránu a mají fenestrované endotelie; tubulární buňky vychytávají proteiny z moče (z primárního filtrátu) pinocytózou; endoteliální buňky mají minimální kapacitu pinocytózy, ale mají velký katabolický potenciál z důvodu velkého kapilárního povrchu. Rychlost katabolismu různých proteinů je různá a je popsána pomocí biologického poločasu. Dospělí degradují denně 1-2 % svých tělesných proteinů (hlavně svalové proteiny). Biologický poločas Pro různé proteiny je různý, pohybuje se v rozmezí několika hodin (proteiny akutní fáze) do několika týdnů (3 týdny pro albumin nebo IgG). Kontrolní (řídící) mechanismy Koncentrace proteinů v tělních tekutinách závisí na rychlosti syntézy, katabolismu, distribuci v kompartmentech a ztrátách do tzv. třetího prostoru (ascites, pleurální exsudát) nebo mimo organismus (proteinurie). Organismus se snaží udržet celkovou koncentraci proteinů v plazmě konstantní. Z toho důvodu je syntéza některých proteinů snížena v případě, že je zvýšena syntéza proteinů jiných (např. při zánětu vede zvýšení koncentrace proteinů akutní fáze a imunoglobulinů ke snížení koncentrace tzv. negativních proteinů akutní fáze). Syntéza proteinů je regulována hormonálně, nebo produkcí různých cytokinů (např. syntéza proteinů akutní fáze). Významnou roli hraje dostupnost aminokyselin, tj. strava s dostatkem proteinů, které dodávají esenciální aminokyseliny. Glukagon a malnutrice (hlavně nedostatek tryptofanu) syntézu inhibuje. Naopak na stimulaci proteosyntézy v játrech mají vliv glukokortikoidy, růstový hormon, inzulin a thyroidální hormony. Katabolismus proteinů může být ovlivněn defektem receptorů, které vychytávají proteiny určené k degradaci (např. v játrech při jaterní cirhóze) nebo zvýšenou sialilací některých proteinů, která vede ke sníženému vychytávání takových proteinů játry. Enzymy Enzymy jsou biokatalyzátory, tj. urychlují v organismu průběh chemických reakcí (snižují aktivační energii katalyzovaných reakcí). Podle typu katalyzované reakce se dělí do 6 tříd: 1. oxidoreduktasy 2. transferasy 3. hydrolasy 4. lyasy 72

73 Význam stanovení plazmatických bílkovin - příprava 5. isomerasy 6. ligasy Z klinicko-biochemického hlediska rozlišujeme: 1. enzymy specifické pro plazmu (např. lipoproteinová lipasa, lecithin-cholesterolacyltransferasa, cholinesterasa, koagulační faktory) za patologických stavů nacházíme v plazmě sníženou aktivitu (např. pokles proteosyntetické kapacity při závažném jaterním onemocnění). 2. enzymy secernované exokrinními žlazami (např. amylasa, lipasa, trypsin, chymotrypsin, prostatická kyselá fosfatasa) při poškození těchto žlaz dochází ke zvýšenému uvolňování těchto enzymů do oběhu; tyto enzymy jsou výrazně orgánově specifické 3. buněčné enzymy s různou orgánovou specificitou (např. aminotransferasy, laktátdehydrogenasa, alkalická a kyselá fosfatasa) při poškození orgánů se dostávají do oběhu a v plazmě nacházíme zvýšené aktivity. V této skupině lze rozlišit enzymy lokalizované na buněčné membráně (gama-glutamyltransferasa, alkalická fosfatasa), v cytoplazmě (LDH, ALT, zčásti AST), v mitochondriích (glutamátdehydrogenasa, některé enzymy cyklu močoviny, zčásti AST), v lysosomech (kyselá fosfatasa). Při poškození orgánů lehkého stupně nacházíme zvýšené aktivity cytoplazmatických enzymů, při těžkém poškození s nekrózou buněk nacházíme zvýšené aktivity enzymů vázaných na buněčné struktury (např. mitrochondrie). KAPITOLA 06 Diagnostický význam jednotlivých enzymů je probrán v příslušných kapitolách. Stanovení aktivity enzymů Aktivita enzymů se vyjadřuje v katalech. 1 katal je takové množství enzymu, které dokáže přeměnit 1 mol substrátu za sekundu. V některých zemích je dosud používána mezinárodní jednotka (IU), která je definována jako množství enzymu, které přemění 1 mikromol substrátu za sekundu. Katal je jednotkou příliš velkou, proto se běžně používají mikrokataly nebo nanokataly. Přepočet jednotek lze snadno odvodit: 1 U = 16,67*10-9 kat = 16,67 nkat Při vyjádření výsledku jako rychlosti přeměny substrátu je nezbytné vztáhnout změřenou hodnotu na celkový objem; hovoříme o koncentraci katalytické aktivity (jednotka kat*l -1 ). Kromě stanovení aktivity se u některých enzymů používá imunochemické stanovení a výsledek se vyjadřuje jako hmotnostní koncentrace (např. CK-MB mass, elastasa ve stolici, viz příslušné kapitoly). 73

74 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Autoři: MUDr. Ing. David Zeman, Ph.D.; RNDr. Pavlína Kušnierová, Ph.D. Recenzent: MUDr. Milan Dastych KAPITOLA 06 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Metody vyšetřování plazmatických bílkovin Stanovení koncentrace celkových bílkovin Pro stanovení koncentrace sérových bílkovin se používá tzv. biuretová reakce, která je v současné době i referenční metodou. Principem je tvorba červenofialového komplexu měďnatých kationtů s dusíkovými atomy peptidových vazeb v alkalickém prostředí. Intenzita zbarvení je úměrná počtu peptidových vazeb a je relativně málo závislá na ostatních vlastnostech jednotlivých bílkovin. Falešně vyšší hodnoty naměříme u silně lipemických a silně hemolytických sér a při výrazné hyperbilirubinémii; falešně nižší hodnoty u výrazné hyperamonémie (kompetující reakce amoniaku s Cu 2+ ionty). Pro stanovení o dva až tři řády nižších koncentrací bílkovin v moči a likvoru nelze tuto metodu použít; zde se využívají turbidimetrické reakce (měření zákalu vzniklého přidáním trichloroctové kyseliny nebo benzethoniumchloridu ke vzorku) nebo vazba různých barviv (pyrogallolová červeň/molybdenan, Coomassie modř) na bílkoviny vzorku. Tyto metody závisejí již více na vlastnostech měřených bílkovin: vazba barviva na obsahu aromatických aminokyselin, turbidimetrické reakce na tvaru molekuly. Elektroforéza sérových bílkovin Metoda využívá rozdílné pohyblivosti bílkovin v elektrickém poli. V prostředí alkalického pufru migrují bílkoviny od katody k anodě. Podle pohyblivosti lze rozlišit pět až šest frakcí: albumin, alfa1, alfa2, beta (často beta1 a beta2) a gama globuliny. Prealbumin migrující ještě rychleji než albumin není normálně patrný. Obrázek 6.1 Elektroforéza sérových bílkovin. V pozicích č. 3, 11 a 13 je patrný výrazný M-gradient. Elektroforéza má význam především jako levné screeningové vyšetření pro diagnostiku monoklonálních gamapatií. Poskytuje také celkový přehled o bílkovinném spektru a umožňuje usoudit na přítomnost akutního či chronického zánětu, hepatopatie nebo stavů spojených se ztrátou bílkovin (ledvinami, gastrointestinálním traktem). 74

75 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Akutní zánět albumin Alfa1 Alfa2 beta gama Pozn. N - Chronický zánět Hepatitida Jaterní cirhosa Beta-gama můstek Nefrotický syndrom Hypogamaglobulinémie Hypergamaglobulinémie Deficience alfa1-antitrypsinu Paraprotein M-gradient M-gradient M-gradient Tabulka 6.1 Nejčastější abnormity na elektroforeogramu KAPITOLA 06 Některá pracoviště dnes využívají techniky kapilární elektroforézy, při které jsou bílkoviny separovány ve velmi tenkých křemenných kapilárách od anody ke katodě podle své iontové pohyblivosti s využitím elektroosmotického toku a u katody jsou detekovány fotometricky v UV oblasti. Výhodou je možnost statimové analýzy; chybí však možnost přímého vizuálního hodnocení. Záznam elektroforeogramu s patrným M-gradientem (paraproteinem, viz dále v textu) je na obr. 2. Obrázek 6.2 Elektroforeogram: zleva doprava albumin, alfa1, alfa2, beta1, beta2 globuliny, vysoký štíhlý pík paraproteinu (M- -gradient) v zóně gama-globulinů. Pozn.: Ve skutečnosti se elektroforeogram při kapilární elektroforéze vykresluje zprava doleva, tj. první jsou v popsaném uspořádání detekovány gama-globuliny a poslední albumin. Zopakujte si principy dělení bílkovin elektroforézou a kapilární elektroforézou (zejm. pojem elektroosmotického toku) a uvědomte si, proč tomu tak je! Stanovení koncentrace jednotlivých plazmatických bílkovin Koncentrace specifických proteinů se měří imunochemickými metodami, tj. metodami využívajícími reakce příslušné bílkoviny se specifickou protilátkou. Pro většinu významných plazmatických bílkovin lze použít turbidimetrický nebo nefelometrický princip měření, který z klinických laboratoří zcela vytlačil dříve používanou radiální imunodifúzi. Pro bílkoviny přítomné ve velmi nízkých koncentracích se používají metody se značeným reaktantem (ELISA, RIA, chemiluminiscence, fluorescence). Výjimkou je stanovení albuminu v plazmě, pro které lze využít jednak výpočet z koncentrace celkové bílkoviny a relativního podílu albuminu na elektroforeogramu (ostatní bílkoviny takto stanovit nelze, protože frakce, v nichž na elektroforéze migrují, jsou tvořeny více bílkovinami, které nelze navzájem rozlišit), jednak jednoduchou fotometrickou reakci založenou na vazbě barviv na albumin (bromkresolová zeleň) s následnou změnou jejich absorpčního maxima (komplex BCG-albumin poskytuje výrazné maximum při 630 nm). 75

76 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Přehled nejdůležitějších plazmatických bílkovin Existuje více různých hledisek dělení bílkovin. Zvolíme přehled bílkovin podle elektroforetické pohyblivosti, takže se od prealbuminu a albuminu dostaneme přes alfa1, alfa2 a beta globuliny až ke gamaglobulinům, tj. imunoglobulinům. V návaznosti na imunoglobuliny probereme problematiku tzv. monoklonálních gamapatií. Dále uvedeme skupiny bílkovin se společnými znaky, tj. skupinu reaktantů akutní fáze, skupinu nízkomolekulárních bílkovin a skupinu enzymů. Problematika bílkovinných hormonů je probírána v jiné kapitole. KAPITOLA 06 Bílkovina M.h.(Da) Referenční meze (dospělí) Elfo pohyblivost Prealbumin ,1-0,4 g/l Prealbumin Albumin g/l Albumin Alfa1-kyselý glykoprotein ,55-1,20 g/l Alfa1 Alfa1-antitrypsin g/l Alfa1 Alfa1-antichymotrypsin ,3-0,6 g/l Alfa1 Haptoglobin Hp 1-1: ,0-2,4 g/l Alfa2 Hp 2-1: Hp 2-2: ,5-3,2 g/l 1,1-2,8 g/l Gc-globulin (Group specific component; ,2-0,55 g/l Alfa2 vitamin-d vázající protein) Alfa2-makroglobulin ,5-4 g/l Alfa2 Transferrin ,0-4,0 g/l Beta1 Hemopexin ,5-1,2 g/l Beta1 Ceruloplazmin ,1-0,6 g/l Beta1 Beta2-mikroglobulin ,9-2,3 mg/l Beta2 C ,8-1,6 g/l Beta2 C ,20-0,65 g/l Beta2 CRP mg/l Beta2 Fibrinogen ,8-4,5 g/l Beta/gama interzóna IgM ,6-2,5 g/l Beta - gama IgA ,9-4,5 g/l Beta - gama IgG ,0-18,0 g/l Gama Tabulka 6.2 Bílkoviny krevního séra molekulová hmotnost, referenční meze a elektroforetická pohyblivost 76

77 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Bílkovina Snížená koncentrace Zvýšená koncentrace prealbumin Malnutrice (nejlepší indikátor krátký poločas!) Jaterní onemocnění Reakce akutní fáze Novorozenci (asi poloviční koncentrace oproti dospělým) Účinek glukokortikoidů a androgenů KAPITOLA 06 albumin AAG Mírný pokles po 50. roce věku Snížená syntéza vrozená (analbuminémie) získaná (zánět, jaterní onemocnění, inhibice syntézy např. alkoholem) Zvýšený katabolismus Ztráty močí (nefrotický syndrom), gastrointestinálním traktem Malnutrice (pomalá odpověď) Snížená syntéza (účinek estrogenů) Zvýšené ztráty (nefrotický syndrom, ztráty gastrointestinálním traktem) (akutní dehydratace) Reakce akutní fáze (3-4x, vrchol 3-5 dní po začátku nemoci) Ulcerózní kolitida (marker aktivity) AAT Genetický defekt (fenotypy Pi Z, 00) Zvýšená utilizace (respirační distress syndrom novorozenců, novorozenecká hepatitida, těžká onemocnění pankreatu) Efekt glukokortikoidů (Cushingův syndrom, kortikoterapie) Reakce akutní fáze (od 2. dne, vrchol za 3-4 dny) Stimulace syntézy estrogeny (těhotenství, léčba estrogeny) Ceruloplazmin Ztráty močí nebo gastrointestinálním traktem Genetický defekt (vzácný) Reakce akutní fáze (pomalé a malé zvýšení) Sekundárně u nedostatku Cu2+ v potravě, Menkesovy nemoci, Wilsonovy nemoci Stimulace syntézy estrogeny (léčba estrogeny, těhotenství), cholestáza CRP Reakce akutní fáze (rychlé a výrazné zvýšení zejm. u bakteriálních infekcí) Alfa1-fetoprotein V séru matky u Downova syndromu Nádorový marker: hepatocelulární karcinom, nádory ze zárodečných buněk haptoglobin Genetický defekt (vzácný) In vivo hemolýza Účinek estrogenů Jaterní onemocnění novorozenci V séru matky u defektů neurální trubice Reakce akutní fáze (4-6 dní po začátku nemoci) Ztráty bílkovin ve spojení s fenotypy Hp 2-1 nebo 2-2 Účinek androgenů nebo glukokortikoidů 77

78 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Alfa2-makroglobulin Transferin Reakce akutní fáze Pankreatitida Karcinom prostaty (MAG váže PSA a komplex je velmi rychle vychytáván játry, na rozdíl od komplexu PSA s alfa1-antichymotrypsinem) Anémie z nedostatku železa (nízká saturace železem) Účinkem estrogenů V dětství (dvakrát až třikrát vyšší koncentrace než u dospělých) Nefrotický syndrom (kompenzace renálních ztrát bílkovin o nižší molekulové hmotnosti) Účinek estrogenů (těhotenství, léčba estrogeny) KAPITOLA 06 Anémie z defektu inkorporace železa do erythrocytů (vysoká saturace železem) Reakce akutní fáze Chronická jaterní onemocnění Malnutrice Ztráty bílkovin močí nebo gastrointestinálním traktem Vrozený defekt (atransferinémie) C3 Genetický defekt Reakce akutní fáze (mírný vzestup) Zvýšená aktivace C3 (systémová onemocnění pojiva, těžké infekce, septikémie U novorozenců o 1/3 nižší koncentrace než u dospělých Obstrukce žlučových cest Fokální glomeruloskleróza (30 % pacientů, koreluje s příznivou prognózou) C4 Genetický defekt (spojen s vysokou prevalencí autoimunitních onemocnění, zejm. SLE) Reakce akutní fáze (mírný vzestup) Konzumpce (SLE, hereditární angioedém, autoimunitní hemolytická anémie, autoimunitní nefritidy) Novorozenci (koncentrace o ½ - ¼ nižší než u dospělých) Imunoglobuliny Primární humorální imunodeficity (vzácné) Sekundární humorální imunodeficity: porucha syntézy (nejprve klesá IgM, pak IgA, nejpozději IgG): lymfoproliferativní onemocnění, účinek léků (fenytoin, penicilamin) Polyklonální zvýšení: odpověď na infekci, chronické záněty, autoimunitní onemocnění (primární biliární cirhóza: zvýšení zejm. IgM) Monoklonální: paraprotein ztráta bílkovin (nefrotický syndrom, popáleniny, ztráty gastrointestinálním traktem) Tabulka 6.3 Změny koncentrace plazmatických bílkovin u některých patologických stavů 78

79 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Prealbumin a retinol vázající protein Prealbumin (transthyretin může vázat dvě molekuly thyroxinu nebo trijodthyroninu) je tvořen v játrech a v choroidálním plexu mozkových komor. Je částečně asociován s retinol vázajícím proteinem v poměru 1:1. Je to neglykosylovaná tetramerní bílkovina složená ze čtyř identických podjednotek. Pro svůj krátký biologický poločas (48 hodin; retinol vázající protein 12 hodin) je citlivým markerem akutní malnutrice a stavu proteosyntézy. Pozn.: Jeho stanovení se někdy využívá při výpočtu tzv. Prognostického zánětlivého a nutričního indexu (PINI z angl. Prognostic inflammatory and nutrition index): PINI = AAG (mg/l)*crp (mg/l) / albumin(g/l)*pa(mg/l) Normální hodnoty PINI jsou <1; pacienti s nízkým rizikem mají hodnoty 1-10, se středním rizikem a s vysokým rizikem Prealbumin patří k negativním reaktantům akutní fáze (viz níže). Jeho koncentrace klesá při zánětlivých a nádorových onemocněních, u jaterní cirhózy a při ztrátách bílkovin ledvinami nebo gastrointestinálním traktem. Retinol vázající protein je monomerní transportní protein pro all-trans retinol (forma vitaminu A). Je syntetizován v játrech a jeho sekrece z hepatocytu je stimulována vazbou retinolu. Tvorba komplexu s prealbuminem zabraňuje filtraci retinol vázajícího proteinu v glomerulech. Po uvolnění retinolu následuje disociace komplexu prealbuminu a retinol vázajícího proteinu, který je pak eliminován ledvinami. Zvýšené koncentrace retinol vázajícího proteinu nacházíme u pacientů s chronickým renálním onemocněním; snížené koncentrace u jaterních onemocnění a proteinové malnutrice. KAPITOLA 06 Albumin Je syntetizován výhradně v játrech, která disponují vysokou rezervní kapacitou v případě jeho zvýšené potřeby nebo ztrát. Jako jeden z mála plazmatických proteinů neobsahuje sacharidy. Při fyziologickém ph má záporný náboj. Pro svou vysokou koncentraci v plazmě se významně podílí na udržování koloidně-osmotického tlaku. Jedná se o kvantitativně nejdůležitější transportní bílkovinu v organismu. Řada látek se v krvi váže na albumin; to je podmíněno přítomností početných nabitých skupin, iontových i hydrofobních specifických vazebných míst. Zejména jde o nerozpustné látky (nekonjugovaný bilirubin, mastné kyseliny, hormony, léky). Hydrofilní látky mohou být na albumin vázány adsorpcí (např. Ca 2+, Zn 2+, kyselina močová). Transportní funkce albuminu je nespecifická, na rozdíl od specifických transportních bílkovin uvedených níže. Albumin se dále podílí na antioxidační aktivitě, za patologických stavů působí jako pufr a inhibuje produkci leukotrienů a aktinu. Albumin je negativním reaktantem akutní fáze, jeho koncentrace klesá v přítomnosti prozánětlivých cytokinů (TNF-alfa, IL-1, IL-6). Alfa-1-globuliny Alfa-1 lipoprotein (HDL) viz příslušná kapitola Orosomukoid (kyselý alfa-1 glykoprotein, AAG) Je syntetizován převážně v játrech, ale při septických stavech přispívá ke zvýšení plazmatické koncentrace významně syntéza v granulocytech a monocytech. Katabolismus se děje převážně vychytáváním desialovaného AAG jaterními receptory pro asialoglykoproteiny; zatímco biologický poločas intaktního AAG činí asi 3 dny, poločas desialovaného AAG je jen několik minut. AAG patří mezi lipokaliny, tj. bílkoviny vázající lipofilní látky. Jeho funkce není dosud plně známa; předpokládá se i jeho imunomodulační efekt, podmíněný patrně strukturou oligosacharidových řetězců molekuly AAG. Alfa-1-fetoprotein Alfa-1-fetoprotein zastává u plodu funkce albuminu, postnatálně je nahrazován albuminem. AFP je významným markerem v prenatální diagnostice (zvýšené koncentrace v amniové tekutině a také v séru matky u defektů neurální trubice, ale i u vícečetných těhotenství, snížené koncentrace u Downova syndromu v této indikaci se dnes používá v rámci screeningu vrozených vývojových vad ( screening VVV v 2. trimestru) výhradně kombinované stanovení s beta-hcg a popř. ještě nekonjugovaným estriolem v séru matky; tzv. tripltest ). U netěhotných dospělých je AFP zvýšený u hepatocelulárního karcinomu a nádorů ze zárodečných buněk; může však být zvýšen i u jaterní cirhózy a hepatitidy. Alfa-1-antitrypsin (Alfa-1-inhibitor proteináz, AAT, alfa-1-pi) Alfa-1-antitrypsin je kvantitativně nejvýznamnější inhibitor proteináz v plazmě. Při jeho geneticky podmíněném významném snížení až chybění (genotypy PiZZ a Pi00) dochází k nedostatečné inaktivaci proteináz (elastázy v plicních sklípcích) uvolňova- 79

80 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin ných granulocyty a makrofágy při fagocytóze a proteolytickému rozrušení tkáně. To má za následek plicní emfyzém s poruchou ventilace a sklonem k těžkým infekcím dýchacích cest a často i poškození jater. Alfa-1-antichymotrypsin Alfa-1-antichymotrypsin je další proteinázový inhibitor; inhibuje katepsin G, chymasu žírných buněk a PSA (zvýšené koncentrace PSA navázaného na alfa1-antichymotrypsin nacházíme u pacientů s karcinomem prostaty). Alfa-2 globuliny KAPITOLA 06 Alfa-2 makroglobulin Alfa2-makroglobulin (AMG) je další z proteinázových inhibitorů. Je složen ze čtyř polypeptidových řetězců; aktivní jednotkou je dimer (tj. jedna molekula AMG může vázat dvě molekuly proteináz). Je syntetizován převážně hepatocyty. Biologický poločas intaktního proteinu činí několik dnů, ale po rozštěpení nitrořetězcové thioesterové vazby nebo po odštěpení kyseliny sialové je rychle (v řádu minut) vychytáván receptory na hepatocytech. Kromě své hlavní funkce - inhibice proteináz - se AMG účastní transportu řady peptidů (cytokinů, růstových faktorů) a divalentních kationtů (zejména Zn 2+ ) a moduluje zánětlivé reakce. Zvýšené koncentrace AMG nacházíme u nefrotického syndromu, u dětí jsou koncentrace vyšší než u dospělých a u žen v reprodukčním věku vyšší než u stejně starých mužů (estrogeny zvyšují syntézu AMG). Snížené koncentrace AMG nacházíme u pankreatitidy a u pokročilého karcinomu prostaty (AMG se váže na PSA a tento komplex je velmi rychle vychytáván játry). Haptoglobin Váže hemoglobin vzniklý při intravazální hemolýze; vzniklý komplex je rychle z krevního oběhu vychytáván buňkami RES v játrech. Zabraňuje tím ztrátám hemoglobinu (Fe 2+ ) močí a vzniku nebezpečného hydroxylového radikálu, na kterém se podílí volný hemoglobin. Haptoglobin je citlivým markerem hemolýzy, při níž dochází k výraznému snížení jeho koncentrace až k nulovým hodnotám. Snížené koncentrace doprovázejí také poruchy proteosyntézy v játrech, u hepatitidy koreluje hladina haptoglobinu s tíží onemocnění. Zvýšené koncentrace nacházíme u reakce akutní fáze. Ceruloplazmin Hlavní úlohou ceruloplazminu je ferroxidázová aktivita (oxiduje Fe 2+ na Fe 3+ a zprostředkuje tak vazbu železa na transferin). Jedna molekula ceruloplazminu váže 6-8 atomů mědi, ale hlavní transportní bílkovinou pro měď je albumin. Výrazně snížené koncentrace ceruloplazminu nacházíme u Wilsonovy nemoci (většinou < 0,1 g/l) a Menkesova syndromu. Druhotně mohou být koncentrace ceruloplazminu snížené při ztrátách bílkovin a poruchách jejich syntézy (jaterní cirhóza). Zvýšené koncentrace nemají diagnostický význam; nacházíme je při zánětech a nádorech, v těhotenství nebo při užívání orálních kontraceptiv (vliv estrogenů) a u cholestázy. Gc-globulin (group specific component, vitamin D vázající protein) Někdy je označován jako inter-alfa globulin, protože může migrovat v alfa1-alfa2 interzóně. Gc globulin je hlavní transportní bílkovinou pro vitamin D; další jeho funkcí je vychytávání aktinu uvolněného z buněk při jejich poškození. Koncentrace Gc globulinu jsou poněkud vyšší u žen než u mužů, stoupají v těhotenství a klesají při akutním jaterním onemocnění a u závažných traumat. Beta globuliny Transferin Každá molekula transferinu má dvě vazebná místa pro železitý kation (Fe 3+ ). Apo-transferin je syntetizován především v játrech, syntéza stoupá při nedostatku železa v organismu. Transferin je nejdůležitější transportní prostředek pro železo z míst resorpce (tenké střevo) a odbourávání hemoglobinu do krvetvorných orgánů, kde se prostřednictvím receptoru váže na erytroblasty. Při nedostatku železa dochází ke stimulaci syntézy transferinového receptoru a ke zvýšení koncentrace solubilního transferinového receptoru v séru (stfr uvolněná extracelulární doména membránového receptoru). Koncentrace stfr není ovlivněna reakcí akutní fáze, proto je stfr (popř. poměr koncentrace stfr k logaritmu koncentrace ferritinu) cenným markerem pro odlišení anémie při deficitu železa od anémie chronických chorob. Procentuální nasycení transferinu železem lze vypočítat podle vzorce: 80

81 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Saturace transferinu = 3,98 * Železo v séru (μmol/l)/transferin v séru (g/l) Fyziologicky je transferin nasycen železem asi z 1/3, neobsazená místa pro vazbu železa představují tzv. volnou vazebnou kapacitu. (Celková vazebná kapacita transferinu pro železo je dána počtem transferinových molekul, které jsou k dispozici, a skutečností, že jedna molekula transferinu má dvě vazebná místa pro Fe 3+.) Transferin obsahuje 2 N-glykanové řetězce, které se mohou dále větvit; každá větev je zakončena negativně nabitou molekulou kyseliny sialové. Molekula transferinu tak může teoreticky obsahovat 0-8 molekul kyseliny sialové; většina molekul obsahuje 4 (64-80 %) nebo 5 (12-18 %). Izoelektrický bod transferinu s klesajícím počtem molekul kyseliny sialové stoupá. U alkoholiků je nacházena zvýšená koncentrace transferinu s nižším počtem zbytků kyseliny sialové (CDT carbohydrate-deficient transferrin, tj. disialo-, monosialo- a asialotransferin) a tedy s vyšším pi, čehož lze využít ke sledování těchto pacientů. Izoelektrický bod transferinu však zároveň klesá při vazbě Fe 3+, proto je třeba před analýzou CDT transferin vysytit železem. KAPITOLA 06 Hemopexin Hemopexin váže hem. Jeho pokles je méně citlivým (pozdnějším) ukazatelem hemolýzy než haptoglobin. Po vyčerpání kapacity haptoglobinu pro vazbu hemoglobinu cirkuluje zbylý hemoglobin v plazmě; zčásti je pak vychytáván jaterními buňkami, zčásti vylučován močí (hemoglobinurie) a zčásti je oxidován na methemoglobin, z něhož snadno disociuje hem. Hem se může vázat na hemopexin a v této vazbě je transportován k jaterním buňkám. Hem se také může nespecificky vázat na albumin za vzniku methemalbuminu, z něhož může být předán opět hemopexinu, jakmile je hemopexin k dispozici. Koncentrace hemopexinu bývá snížena u hemorhagické pankreatitidy a krvácení do tělesných dutin při současně normálních koncentracích haptoglobinu. Beta-lipoprotein Lipoprotein pohybující se v beta2-oblasti odpovídá lipoproteinu o nízké hustotě (LDL). LDL (low density lipoproteins) jsou hlavní lipoproteinové částice, které přenášejí cholesterol v krevní plazmě, s hustotou 1019 až 1063 kg/m3, tj. 1,019 až 1,063 g/ml, pocházejí z katabolismu IDL a VLDL, a jejich hlavní apoprotein je apo-b-100. Největší část pochází z transformace VLDL, ale některé jsou syntetizovány přímo (zvláště u pacientů s familiární hypercholesterolémií). LDL mohou být katabolizovány různými typy buněk (75% játry), a to jak LDL-receptor dependentním mechanismem, tak mechanismy na těchto receptorech nezávislými (např. pomocí scavenger receptorů). C3 a C4 složky komplementu Komplementový systém se skládá z přibližně 30 bílkovin, které lze rozdělit podle funkce do několika skupin: 1. Bílkoviny klasické cesty (C1, C4, C2, C3) 2. Bílkoviny alternativní cesty (C3, faktory B a D, properdin) 3. Membránu atakující komplex (C5-C9) 4. Inhibitory uvedených drah 5. Buněčné receptory Hlavními funkcemi komplementového systému jsou: opsonizace (fragment složky C3, označovaný C3b, který se pevně váže na mikrobiální povrch) chemotaxe (fragmenty C3a a C5a) osmotická lýza (komplex C5b-C9, který se zanořuje do plazmatické membrány atakované buňky a vytváří v ní póry (většina mikroorganismů je však vůči tomuto lytickému působení komplementu chráněna buněčnou stěnou) V klinické praxi se nejčastěji stanovují složky C3 a C4. Jejich koncentrace mírně stoupá při reakci akutní fáze, klesá při jejich aktivaci, resp. spotřebě u některých systémových autoimunitních onemocnění. C3 složka je v plazmě přítomna v nejvyšší koncentraci ze všech komponent komplementu. Syntezována je převážně v játrech; bakteriální endotoxin indukuje také syntézu v monocytech a fibroblastech. Rovněž C4 složka je syntetizována převážně jaterními buňkami, v malém množství jinými tkáněmi. Fibrinogen Fibrinogen je glykoprotein o molekulové hmotnosti 340 kda. Při elektroforéze se pohybuje mezi beta- a gama-globuliny. Jedná se o symetrický dimer, složený ze tří párů řetězců alfa, beta a gama. Během hemokoagulace se působením proteolytického enzymu trombinu uvolňuje fibrinopeptid A a vzniká monomer fibrinu. 81

82 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Pak trombin odštěpuje fibrinopeptid B a dojde k polymerizaci monomeru fibrinu, které jsou příčně pospojovány aktivovaným koagulačním faktorem XIII za vzniku stabilního trombu. Patří mezi pozitivní reaktanty akutní fáze zánětu. Jeho hladina stoupá během několika hodin po vzniku zánětu navozením zvýšené syntézy v játrech a během několika dní může dosáhnout několikanásobku vstupní hladiny. Vysoké koncentrace nacházíme např. u zánětlivých chorob pojiva. Fibrinogen představuje rizikový faktor aterosklerózy. Pokles koncentrace může být způsoben nedostatečnou syntézou u těžkých hepatopatií nebo zvýšenou spotřebou, např. při diseminované intravaskulární koagulopatii (DIC). Na elektroforeogramu nacházíme fibrinogen v beta-gama interzóně. Může být zaměněn za M gradient (a naopak), což je hlavní důvod, proč při elektroforéze dáváme přednost séru před plazmou. KAPITOLA 06 Gama globuliny Imunoglobuliny Imunoglobuliny (protilátky) rozpoznávají antigen a iniciují mechanismy jeho zničení. Všechny imunoglobulinové molekuly se skládají ze dvou identických těžkých (H z angl. heavy) řetězců (alfa u IgA, delta u IgD, gama u IgG, mí u IgM, epsílon u IgE) a dvou identických lehkých (L z angl. light) řetězců (kappa nebo lambda). Každý z řetězců má konstantní část a část variabilní, která se účastní na rozpoznání a vazbě antigenu. Variabilní část těžkého i lehkého řetězce je tvořena jedinou doménou; konstantní část lehkého řetězce je tvořena rovněž jedinou doménou, ale konstantní část těžkého řetězce je tvořena více doménami. Lehký řetězec spolu s variabilní částí a první doménou konstantní části těžkého řetězce tvoří tzv. Fab fragment (ab znamená antigen binding, tj. fragment vázající antigen); další domény konstantních částí těžkých řetězců tvoří tzv. Fc fragment (c zde znamená crystallizable, tj. krystalizovatelný). Každá molekula imunoglobulinu má tedy dva Fab fragmenty a jediný Fc fragment. Na rozdíl od většiny plazmatických bílkovin, které jsou syntetizovány v játrech, jsou imunoglobuliny syntetizovány a secernovány plazmatickými buňkami. Imunoglobuliny jsou glykoproteiny; oligosacharid je vždy vázán na konstantní část těžkého řetězce (na řetězec gama se váže jeden oligosacharid, na ostatní typy H řetězců více molekul oligosacharidů). Obrázek 6.3 Nejjednodušší schématické znázornění molekuly imunoglobulinu sestávající se dvou těžkých (H) řetězců a dvou lehkých (L) řetězců. Lehké řetězce mají variabilní (V) část a konstantní (C) část přibližně stejné velikosti, zatímco u těžkých řetězců představuje variabilní část jen asi jednu čtvrtinu a konstantní část (C1-C3) asi tři čtvrtiny velikosti. Čárky mezi řetězci znázorňují disulfidové vazby. Nejsou znázorněny vnitrořetězcové disulfidové vazby. Počet disulfidových vazeb v pantové oblasti (spojující oba těžké řetězce) je u různých tříd a podtříd imunoglobulinů odlišný. Imunoglobulin G (IgG) Je kvantitativně nejvíce zastoupen (70 75 % celkových imunoglobulinů). 65 % IgG je přítomno extravaskulárně. Hlavní funkcí IgG je neutralizace toxinů ve tkáních. IgG obsahuje jednu molekulu oligosacharidu zakončenou glukosaminem (GlcN), vázanou N-glykosidickou vazbou na asparagin v konstantní části těžkého řetězce. IgG se dělí do několika podtříd (IgG1 IgG4), které se liší zejména uspořádáním pantové oblasti. 82

83 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Imunoglobulin M (IgM) IgM je první imunoglobulin syntetizovaný v průběhu protilátkové odpovědi a také jediný imunoglobulin normálně syntetizovaný již u novorozenců. Existuje jako monomer vázaný na membránu, zatímco většina IgM přítomného v séru je pentamerem složeným z pěti monomerních imunoglobulinových jednotek spojených malým glykopeptidem, tzv. J řetězcem. IgM obsahuje asi 10 % sacharidů. Jeho velká molekulová hmotnost (M.r pro pentamer) zabraňuje jeho úniku do extravaskulárních prostor. IgM účinně aktivuje komplement; tato funkce je zajištěna Fc částí molekuly. Imunoglobulin A (IgA) Představuje 10 až 15 % sérových imunoglobulinů. Obsahuje 10 % sacharidů, biologický poločas je asi 6 dní. Většina IgA je přítomna jako monomer, ale 10 až 15 % sérového IgA je dimerem. Dimer je více odolný vůči destrukci patogenními mikroorganismy. Jinou formou IgA je tzv. sekreční IgA, přítomný v slzách, slinách, potu, mléce, kolostru a v sekretech dýchacích cest a trávicího traktu. Sekreční IgA má M.r a je složen ze dvou monomerních IgA jednotek, sekreční komponenty (M.r ) a J řetězce (M.r ). Je syntetizován hlavně plazmocyty ve sliznicích střeva a bronchů a ve vývodech mléčné žlázy. Sekreční komponenta uděluje sekrečnímu IgA zvýšenou rezistenci k enzymům, což umožňuje ochranu sliznic před mikroorganismy. Jeho přítomnost v kolostru a mléce chrání novorozence před střevními infekcemi. Imunoglobulin D (IgD) Představuje méně než 1 % sérových imunoglobulinů. Je to monomer obsahující 12 % sacharidů, M.r Je přítomen jako membránový receptor pro antigen na B lymfocytech. Imunoglobulin E (IgE) IgE obsahuje 15 % sacharidů, M.r IgE molekuly se váží na povrch žírných buněk (svou Fc oblastí). Dojde-li k vazbě antigenu (alergenu) a spojení dvou takto navázaných IgE molekul, žírné buňky jsou stimulovány k uvolnění histaminu a dalších vazoaktivních látek zodpovědných za projevy alergických reakcí. U novorozenců a kojenců se setkáváme s fyziologickou, přechodnou hypogamaglobulinémií (viz obr. 4). K setrvale nízkým až nulovým hodnotám imunoglobulinů vedou protilátkové imunodeficience; postiženy mohou být buď imunoglobuliny všech izotypů (např. Brutonova agamaglobulinémie vázaná na X chromozóm), nebo jen některých (např. běžná variabilní imunodeficience s poruchou tvorby protilátek IgG a IgA nebo selektivní deficit IgA, který je u nás nejčastějším protilátkovým imunodeficitem). Častější než tyto primární imunodeficience jsou ovšem protilátkové imunodeficience sekundární (získané), např. při střevních zánětech, nefrotickém syndromu, dlouhodobé imunosupresívní nebo cytostatické léčbě a při malignitách postihujících B-lymfocyty. KAPITOLA 06 Obrázek 6.4 Schématické znázornění změn koncentrací imunoglobulinů v prvních měsících života. Transplacentárně přenesené IgG protilátky (migg) klesají v prvním roce života k nulovým hodnotám; nejnižší koncentrace celkového IgG je mezi 3. a 6. měsícem. Koncentrace IgA dosahuje hodnot dospělých až kolem 10. roku věku. Volné lehké řetězce kappa a lambda Lehké řetězce jsou součástí molekuly imunoglobulinů; fyziologicky jsou však produkovány v mírném nadbytku nad řetězci těžkými a jsou proto nacházeny i v krevním séru. Zdá se, že mají určitý význam v regulaci imunitní odpovědi. Při nádorových proliferacích vycházejících z plazmatických buněk můžeme najít v krevním séru výrazně (až o několik řádů) zvýšené koncentrace volných lehkých řetězců jednoho typu; kromě absolutních koncentrací sledujeme také poměr (free kappa/free lambda) nebo 83

84 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin nověji také rozdíl (diferenci) jejich koncentrací (free kappa free lambda nebo naopak). Jejich stanovení vyžaduje použití protilátky specifické proti tzv. skrytým determinantám, tj. determinantám neviditelným, je-li lehký řetězec vázán na těžký řetězec v kompletní imunogloublinové molekule. Problematika imunochemického stanovení volných lehkých řetězců je proto značně specifická a není dosud zcela uspokojivě vyřešena; přesto jsou cenným markerem v diagnostice i sledování pacientů s monoklonálními gamapatiemi, ale také perspektivním markerem aktivity některých autoimunitních onemocnění (systémový lupus erythematosus, revmatoidní arthritida, Sjögrenův syndrom aj.). Monoklonální gamapatie KAPITOLA 06 Termín označuje přítomnost imunoglobulinů (popř. jejich fragmentů) produkovaných jedním klonem plazmatických buněk. Podle mezinárodní klasifikace z r sem patří následující stavy: 1. Monoklonální gamapatie nejistého významu (MGUS z angl. monoclonal gammopathy of undetermined significance) 2. Asymptomatický (doutnající) mnohočetný myelom (ASMM) 3. Symptomatický mnohočetný myelom 4. Solitární kostní plazmocytom 5. Extramedulární plazmocytom 6. Vícečetný solitární plazmocytom 7. Plazmocelulární leukémie Vzácně nacházíme monoklonální imunoglobuliny i u nenádorových onemocnění (AIDS, chronická hepatitida, cirhóza, revmatoidní arthritida aj.); v části případů jde pravděpodobně o koincidenci s MGUS. Screeningovým testem pro diagnostiku monoklonálních gamapatií je elektroforéza sérových bílkovin. Při nálezu monoklonálního (M) gradientu se doplňuje imunofixační elektroforéza, kdy je M gradient typizován (IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, popř. free kappa, free lambda, IgD a IgE). Monoklonální gamapatie ve třídě IgM doprovází onemocnění zvané Waldenströmova makroglobulinémie. Při imunofixaci zde může docházet k vazbě ostatních imunoglobulinů na molekuly monoklonálního IgM a falešné pozitivitě v ostatních třídách. Situaci lze elegantně řešit přidáním malého množství merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu (viz obr. 5a-c). Obrázek 6.5a 84

85 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin KAPITOLA 06 Obrázek 5b Obrázek 6.5c Obrázek 6.5 Imunofixační elektroforéza. ELP: elektroforéza G, A, M, K, L: Imunofixace antiséry proti řetězcům gamma, alfa, mí, kappa, lambda. a. paraprotein IgG kappa b. paraprotein IgG lambda c. paraprotein IgM kappa patrný až po inkubaci vzorku s dithiothreitolem; ve vzorku bez dithiothreitolu je falešná pozitivita ve všech pozicích Při nálezu paraproteinu určujeme jeho kvantitu denzitometricky a při prvním vyšetření doplníme imunofixaci k určení typu těžkého a lehkého řetězce; zpráva laboratoře ošetřujícímu lékaři pak vypadá např. paraprotein IgG kappa, denzitometricky 30 g/l. Při dalším sledování pacientů již znovu imunofixaci neprovádíme, dokud je paraprotein denzitometricky kvantifikovatelný. Při použití moderních léčebných metod paraprotein často vymizí; v okamžiku, kdy již není kvantifikovatelný, je indikována opět imunofixace. Po transplantaci kmenových buněk dochází někdy k oligoklonální odpovědi (několik proužků detekovatelných na elektroforéze, popř. jen při imunofixaci; mohou náležet různým třídám lehkých i těžkých řetězců); ta neznamená relaps onemocnění, nýbrž přechodnou dysregulaci produkce imunoglobulinů po transplantaci. Kryoglobulinémie Kryoglobuliny jsou imunoglobuliny reverzibilně precipitující při teplotách nižších než je teplota lidského těla. Dělíme je do 3 typů: I. typ: izolované monoklonální kryoglobuliny (paraproteiny IgM, vzácněji IgG, IgA nebo monoklonální lehké řetězce) II. typ: smíšené kryoglobuliny (kombinace paraproteinu s polyklonálním imunoglobulinem, obvykle paraprotein IgM s protilátkovou aktivitou proti polyklonálním IgG) 85

86 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin III. typ: polyklonální imunoglobuliny, kdy je kryoglobulin tvořen imunoglobuliny jedné nebo více tříd tvořícími antigen- -protilátkový komplex Kryoglobulinémie ovlivňuje řadu laboratorních vyšetření (mj. zpomaluje sedimentaci), na všechna vyšetření by měl být vzorek séra nebo plazmy předehříván; někdy se doporučuje před elektroforézou inkubace séra s merkaptoethanolem nebo dithiothreitolem. Ještě vzácnější než kryoglobuliny jsou tzv. pyroglobuliny monoklonální imunoglobuliny ireverzibilně precipitující při teplotě 56 C. Polyklonální gamapatie Zvýšené koncentrace polyklonálních imunoglobulinů (t.j. homogenní zvýšení gama-globulinů při ELFO) nacházíme u onemocnění pojiva (systémový lupus erythematosus, Sjögrenův syndrom, revmatoidní arthritida aj.), jater (autoimunitní i virové hepatitidy, primární biliární cirhóza, primární sklerozující cholangoitida, hemochromatóza, alkoholické poškození jater, deficit a1-antitrypsinu), chronických infekcí, lymfoproliferativních onemocnění i nehematologických malignit. Onemocnění kůže, plic a střev, a také některé jaterní nemoci, jsou často provázeny zvýšenou koncentrací IgA, zatímco systémové infekce vedou ke zvýšeným koncentracím všech imunoglobulinů, zejm. IgG. KAPITOLA 06 Reaktanty akutní fáze Označujeme tak bílkoviny, jejichž koncentrace v plazmě se mění při akutním zánětlivém postižení. Dělíme je na pozitivní (CRP, SAA a další), jejichž koncentrace za těchto okolností stoupá, a negativní (prealbumin, albumin, transferrin), jejichž koncentrace v séru naopak klesá. C-reaktivní protein (CRP) Název této bílkoviny je odvozen od schopnosti vázat C-polysacharid buněčné stěny Streptococcus pneumoniae. Váže však různé polysacharidy na površích baktérií, hub a prvoků, ale také fosfatidylcholiny a polyanionty. Po vazbě dochází k aktivaci komplementu klasickou cestou. Hlavní úlohou CRP je rozpoznání potenciálně toxických látek uvolněných z poškozených tkání. CRP je nejvýznamnějším pozitivním reaktantem akutní fáze vzhledem ke snadné dostupnosti jeho stanovení a rychlému vzestupu koncentrace (do hodin). Jeho koncentrace stoupají u bakteriálních infekcí, ale také po infarktu myokardu, traumatech, chirurgických výkonech a při nádorových onemocněních. Sérový amyloid A (SAA) Je protein o celkové M.h , složený z monomerů o M.h Většinou je navázán na HDL lipoproteiny. Jde o skupinu malých lipoproteinů, které při akutní infekci vychytávají lipidové zbytky buněčných membrán a má tak pozitivní účinek; naopak u chronických zánětů může prekurzorový protein SAA vytvářet nerozpustná depozita v orgánech a podílet se tak na vzniku sekundární amyloidózy (na rozdíl od ní jde u primární amyloidózy o depozita lehkých řetězců imunoglobulinů při maligním myelomu a příbuzných onemocněních). Sérová koncentrace SAA je zvýšená rovněž u některých maligních nádorů a stoupá s progresí onemocnění. Prokalcitonin (PCT) Prokalcitonin se zvyšuje v plazmě při bakteriálních infekcích, při sepsi a multiorgánovém selhání. Hlavním stimulem jsou bakteriální endotoxiny. Zvýšení v plazmě nastává po 2 hodinách, jasně zvýšené koncentrace jsou 6 8 hodin a zůstávají zvýšené po dobu 72 hodin. Ferritin Ferritin je především zásobní bílkovinou pro železo; jedna molekula apoferritinu může vázat až 4500 atomů železa (Fe 3+ ). Protože je současně pozitivním reaktantem akutní fáze, je zmíněn na tomto místě. Některé nízkomolekulární bílkoviny Nyní probereme stručně některé významnější nízkomolekulární bílkoviny. Obecným znakem nízkomolekulárních bílkovin je vzestup sérové koncentrace při poklesu glomerulární filtrace, uplatňují se tedy jako markery renálního onemocnění a jako takové jsou probrány v příslušné kapitole. Zde zmíníme nejvýznamnější z nich: 86

87 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin Beta-2-mikroglobulin Beta-2 mikroglobulin je jednoduchý neglykosylovaný polypeptid tvořený 100 aminokyselinami s jedním disulfidickým můstkem o molekulové hmotnosti Da. Je součástí HLA systému na povrchu buněk. Plazmatický beta-2-mikroglobulin je produktem hlavně myeloidních a lymfoidních buněk a dá se užít jako tumorový marker, odrážející proliferaci buněk tohoto původu. Volně prochází plně funkčním glomerulem. V moči roste jeho hladina při lézi tubulárních buněk, hladina v séru stoupá s poklesem glomerulární filtrace. Dlouhodobě zvýšená koncentrace beta-2-mikroglobulinu v séru, např. u dialyzovaných pacientů, může být příčinou sekundární amyloidózy. KAPITOLA 06 Cystatin C Cystatin C je protein z rodiny inhibitorů cysteinových proteáz, filtrovaný glomeruly a plně reabsorbovaný tubuly ledvin, vhodný pro posuzování glomerulární filtrace. Cystatiny mají evoluční a funkční vztah k serinovým proteázovým inhibitorům. Cystatin C, který je především předmětem zájmu klinických biochemiků, patří do cystatinové rodiny II., která je tvořena skupinou extracelulárních inhibitorů cysteinových proteáz. Jednotliví zástupci této skupiny se označují pořadovými čísly, ačkoli třetí cystatin se i nadále nazývá cystatin C. Beta-trace protein Je enzym konvertující PGH2 na PGD2 (prostaglandin-h2 D-isomerasa) o M.h. 25 kda. Jeho původ je výhradně mozkový, hlavním místem syntézy je chorioidální plexus a leptomeningy. Odtud je BTP uvolňován do likvoru. BTP je přítomen ve stopách i v jiných tělních tekutinách včetně séra. Jeho koncentrace v likvoru je 32x vyšší než v séru. Je tedy výborným markerem likvorey. Vedle uplatnění v likvorologické diagnostice se někdy používá jako marker glomerulární filtrace (podobně jako cystatin C). Nevýhodou je vysoká cena stanovení. Cytokiny Termín cytokin označuje signální látku celulárního původu. Cytokiny jsou nízkomolekulární bílkoviny (často glykosylované) produkované buňkami imunitního systému (lymfocyty, monocyty, makrofágy, neutrofilní granulocyty) i buňkami v klasickém pojetí neimunitními (endotel, fibroblasty aj.). Vyznačují se převážným působením na buňky, které je vytvářejí a na buňky v blízkém okolí (autokrinní a parakrinní působení). Působí ve velmi nízkých koncentracích, jejich poločas je velmi krátký (minuty). Interleukin 6 (IL-6) Při akutním zánětu stoupá již za 2-4 hodiny, nezávisle na funkci jater. Proto je vhodný zejména k časné diagnostice. Koncentrace IL-6 v plazmě nebo séru zdravých osob je <11,3 ng/l; koncentrace >400 ng/l budí naléhavé podezření na sepsi. Senzitivita testu je téměř stoprocentní; specificita závisí na základním onemocnění. Zvýšené koncentrace mohou být u autoimunitních onemocnění, glomerulonefritidy, nádorů a v prvních dnech po chirurgickém výkonu. Interleukin 8 (IL-8) Má podobný význam jako IL-6. Zvýšené koncentrace nacházíme u akutního zánětu, ale také při tkáňové hypoxii a traumatech. Tumor nekrotizující faktor (TNF-a) Je považován za marker syndromu systémové zánětlivé odpovědi (SIRS systemic inflammatory response syndrom ). Stanovení je však problematické. TNF-a je po stimulaci secernován jen několik hodin a jeho poločas je <5 minut. Je třeba rozlišovat mezi testy stanovujícími biologicky aktivní TNF-a (trimer) a testy stanovujícími celkový TNF-a (detekuje i monomery a štěpné produkty). Současné zvýšení koncentrací IL-8 a TNF-a svědčí pro aktivaci monocytů (SIRS). Je-li zvýšen jen IL-8, svědčí to pro aktivaci neimunitních buněk, např. po vazbě baktérií nebo jejich lipopolysacharidu na endotelové buňky. Nevýhodou je vysoká cena stanovení cytokinů, z nichž pouze stanovení IL-6 jako časného markeru akutního zánětu doznalo širšího použití. Literatura 1. Bradwell A. R. Serum Free Light Chain Analaysis (plus Hevylite). 6. vydání. The Binding Site Group Ltd., Birmingham, Burtis C. A., Ashwood E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3rd Edition. W. B. Saunders Company, Philadelphia,

88 Význam stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin 3. Dörner K. Klinische Chemie und Hämatologie. 6. aktualizované vydání. Thieme, Stuttgart, Hořejší V., Bartůňková J. Základy imunologie. 3. vydání, Triton, Praha, Racek J. a kol.. 2. vydání. Galén, Praha, Tichý M. Laboratorní analýza monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů). A.L.Instruments, Český Těšín, Zima T. a kol. Lagoratorní diagnostika. 2. vydání. Galén, Praha, Kolektiv autorů (editoři A. Jabor, M. Zámečník, L. Straka): Encyklopedie laboratorní medicíny. Dostupná na: enclabmed.cz/encyklopedie KAPITOLA 06 88

89 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Autoři: MUDr. Milan Dastych; MUDr. Michaela Králíková, Ph.D. Recenzent: prof. MUDr. Antonín Kazda, Ph.D. KAPITOLA 07 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Natrium základní vlastnosti, vstřebávání Sodík je hlavní extracelulární kationt. Jeho metabolismus a přesuny mezi kompartmenty jsou těsně spojeny s přesuny vody. Změny objemu vody v organismu se projevují vychýlením sérové koncentrace Na+ od normy. Úbytek vody v extracelulární tekutině (ECT) při zachování zásob Na+ je spojen se zvýšením koncentrace Na+ (hypernatrémie). Naopak vzestup objemu vody v ECT vede k poklesu koncentrace Na+ (hyponatrémie). Metabolismus vody a sodíku je pevně provázán a platí poučka "kam jde sodík, tam jde voda". Vstřebávání sodíku probíhá v tenkém střevě často ve spojení s resorpcí jiných látek (AK, glukóza), kde je sodík, resp. jeho koncentrační gradient, hnací silou pro transport dalších látek (kotransport). Z buněk je sodík pumpován do extracelulárního prostoru ubikvitérní Na+K+ ATPázou. Energie tohoto transportu pochází z ATP vzniklého při oxidativních procesech v mitochondriích při metabolizaci energetických substrátů. Vstřebávání vody a Na+ je dokončeno v ileu, kde jsou ve větší míře přítomná tight junction, minimálně propouštějící Na+ intraluminálně z paracelulárního prostoru enterocytů. Proto ztráta ilea a vytvoření jejunostomie event jejunokoloanastomózy vede k významným ztrátám vody a sodiku s rozvojem dehydratace organismu. Vstřebávání aminokyselin (AK) a energetických substrátů (cukry, tuky) nebývá při zachování jejuna porušeno. Denní potřeba ve zdraví a nemoci Minimální denní potřeba Na+ je odhadována na mmol, což odpovídá 3-5g NaCl. Vzhledem k tomu, že sodík je převážně z těla vylučován ledvinami, lze na základě odpadů Na+ do moči za 24 hodin usuzovat na jeho příjem v potravě a tekutinách. Obvyklé množství odpadů Na+ do moči za 24 hodin je mmol, což odpovídá 5-15g NaCl (1g NaCl obsahuje 17 mmol Na+). Velikost příjmu je závislá na potřebách organismu a souvisí s pocením, přítomností průjmu, polyurií, léky atd. Příjem NaCl v naší populaci několikanásobně převyšuje minimální potřebu, v průměru se pohybuje mezi 10-15(20) g za den. Tento nadměrný příjem je způsoben moderním zpracováváním potravy, konzervací, vysokou konzumací masných výrobků a sýrů. S tímto vyšším příjmem Na+ se většina jedinců dokáže vyrovnat, pouze u jedné třetiny tzv. "salt senzitive" vede zvýšený příjem k rozvoji hypertenze. Nízký příjem sodíku může vést k rozvoji hypoosmolární dehydratace nebo, při zachovalém příjmu čisté vody, k obrazu otravy vodou s klinickými projevy edému mozku. S nízkým příjmem sodíku se v našich podmínkách setkáváme zřídka, spíše jde o relativně vyšší příjem čisté vody s možností rozvoje hyponatrémie. Výjimkou bývají senioři se snížením pocitu žízně a pacienti s mentální anorexií. Zvýšenou potřebou sodíku se vyznačují osoby se zvýšenými ztrátami a omezenou resorpcí, kterou nelze nahradit zvýšeným perorálním příjmem Na+. Tito nemocní vyžadují infuzní léčbu. Jedná se o následující stavy: resekce tenkého střeva, zvláště ilea tenkostřevní píštěle s vysokým odpadem, pankreatické píštěle střevní malabsorpce spojené s exudativní enteropatií (NSZ, coeliakie, m. Whipple, postradiační enteritidy, vaskulitidy, 89

90 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi střevní ischemizace, lékové poškození střeva) polyurická fáze selhání ledvin se zvýšenou exkrecí sodíku Potřeba NaCl stoupá u těchto stavů na 15-25g/den. Optimální dodávku stanovujeme na základě měření denních odpadů do moči, odhadujeme ztráty potem a stolici, stanovujeme osmolalitu a sérovou koncentraci Na+. Důležitým přístupem při odhadu potřeby Na+ u těchto stavů je sledování dynamiky změn v čase. Z jednorázového vyšetření nelze spolehlivě potřebu stanovit. Je vhodné sledovat trendy odpadů a vývoj natrémie, osmolality, diurézy minimálně sedm dní, resp. 1., 3. a 7. den. Na základě tohoto pozorování stanovíme dlouhodobou denní potřebu a učiníme rozhodnutí o nutnosti i.v. substituce. O i.v. hydrataci uvažujeme zejména u stavů, u kterých dochází k poklesu váhy a poklesu diurézy pod 800ml/24 hod. U těchto stavů klesají odpady Na+ do moči pod 20mmol/24 hod a narůstají odpady draslíku do moči s možným rozvojem hypokalémie. Uvedené změny jsou výrazem sekundárního hyperaldosteronismu. Pokud se tato situace vyvíjí i při maximálně tolerovaném navýšení denního příjmu sodíku (dosolování, NaCl cps (3x2g) rehydratační roztoky), jsou pacienti kandidáti na dlouhodobou i.v. substituci. KAPITOLA 07 Bilance sodíku Významnou metodou při stanovování bilance sodíku je denní sledování váhy pacienta, jako globálního ukazatele celkové vodní a sodíkové bilance. Denní změny tělesné hmotnosti odpovídají změnám v hydrataci organismu, resp. retenci nebo mobilizaci natria. Retence nebo ztráta 140 mmol Na+ (8g NaCl) odpovídá retenci nebo ztrátě 1 litru vody. Pokles váhy v průběhu 3 dnů odpovídá ztrátám vody (Na+) a může nás upozornit na měnící se klinickou situaci: pokud jde o původně normovolemického pacienta (zdravý s rozvojem průjmů různé etiologie), hrozí rozvoj dehydratace (malátnost, slabost, pokles TK, zvýšení tepové frekvence (TF), vzestup albuminu, vzestup hemoglobinu) a na místě je infuzní léčba pokud jde o původně hypervolemického pacienta (edémové stavy - srdeční selhání, jaterní cirhóza, sepse, akutní pankreatitida, polytrauma), jde o příznivou situaci signalizující mobilizaci tekutin Klinický rozdíl těchto situací je markantní a nesmí být zaměněn, neboť léčba je zcela opačná. V prvním případě rehydratatace infuzní léčbou, ve druhém případě nenavyšování denního příjmu tekutin resp. léčba diuretiky. Nárůst váhy v průběhu dnů hodnotíme jako retenci sodíku a vody a může odpovídat zhoršování choroby (srdeční selhání, nárůst portální hypertenze) se vznikem otoků nebo rozvoji katabolismu (metabolický stres) s retencí sodíku. Svým významem podobným ukazatelem je stanovení odpadů sodíku do moči za 24 hodin. Pokud odpady Na+/24 hod klesají pod 20 mmol, může se jednat o dvě situace: sodíkový deficit při extrarenálních ztrátách sodíku (průjmy, pocení, píštěle) i při zachované diuréze. Dochází k reabsorpci Na+ v ledvinách vlivem zvýšené hladiny aldosteronu. Pod vlivem tohoto hormonu se zvyšují odpady K+ a H+. Vznikající hypokalémie a alkalóza je pak výrazem deplece Na+ a dehydratace organismu. Hypokalémii nelze upravit prostou substitucí K+, je nutná také náhrada sodíku a vody. u edémových stavů je situace odlišná v tom smyslu, že obsah Na+ v organismu je zvýšen, a to i při přítomné hyponatrémii. Důvodem je onemocnění organismu, které vede k oběhovým změnám s aktivací renin-angiotensin-aldosteronového systému (RAAS) a retencí Na+ a vody. Léčba tohoto stavu je principiálně zcela odlišná. Spočívá v omezení příjmu vody a sodíku a mobilizaci tekutin a Na+ diuretiky. Z diuretik je nejlépe kombinovat antagonisty aldosteronu (spironolakton), zasahující přímo do aktivované osy RAAS, spolu s kličkovými diuretiky (furosemid). Vysoké odpady sodíku (více jak 250 mmol/24 hod) vypovídají o mobilizaci sodíku a tekutin při přechodu do anabolického stavu po překonání metabolického stresu (sepse, akutní pankreatitida, polytrauma) nebo o pozitivním účinku diuretik, popřípadě o onemocnění ledvin s poruchou sodíkové reabsorpce (tubulointersticiální nefritidy). 90

91 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Koncentrace Na v plazmě Zásoba Na+ v ECT Zásoba Na+ v ICT Příjem Na+ Výdej Na+ močí Výdej Na+ stolicí Výdej Na+ potem Výdej Na+ celkem mmol/l 1400 mmol 1000 mmol mmol/24 hod mmol/24 hod 10 mmol/24 hod mmol/24 hod mmol/24 hod KAPITOLA 07 Tabulka 7.1 Bilance a distribuce sodíku Hyponatrémie Jde o stav, kdy sérová koncentrace natria klesá pod 135 mmol/l. Je nejčastější elektrolytovou poruchou v klinické praxi. Vzniká častěji v rámci diluce než v důsledku deplece Na+. Hyponatrémie je klinicky významná při poklesu Na+ pod 130 mmol/l, závažná s možným ohrožením života se stává při koncentraci pod 120 mmol/l. Pro klinickou závažnost je také důležitá rychlost vzniku, čím rychleji vzniká, tím má nebezpečnější důsledky. Z léčebného hlediska je důležité rozlišovat, zda jde o hyponatrémii akutní (pokles Na+ pod 125 mmol/l v průběhu 48 hodin) nebo chronickou, kdy k poklesu Na+ dochází za více jak 48 hodin. Akutní hyponatrémii léčíme agresivně a rychle, zvláště když pokles Na+ pod 120 mmol/l má klinické příznaky - zmatenost, slabost, svalové záškuby, bolest hlavy, zvracení, event. koma jako klinický dopad mozkového edému. Agresivní léčba chronické hyponatrémie může mít naopak fatální následky ve formě rozvoje demyelinizace CNS (demyelinizační syndrom) v důsledku rychlého přesunu vody z ICT do ECT v mozku na základě vzniklého osmotického gradientu. Klinicky se po přechodném zlepšení stavu rozvíjí různě rychle dezorientace, pyramidové příznaky se spasticitou končetin a pseudobulbární paralýza. Konečným výsledkem může být vigilní kóma nebo exitus. Chronickou hyponatrémii proto musíme léčit pozvolna s maximálním vzestupem natrémie 8-10 mmol/24 hod. Klinické příznaky chronické hyponatrémie jsou mírnější - slabost, spavost, svalové záškuby - a vznikají plíživě. Při správně vedené léčbě mohou pacienti přežít bez následků i hodnoty Na+ kolem 90 mmol/l. Pseudohyponatrémie K tomuto stavu dochází při vysoké koncentraci proteinů v séru (více jak 100 g/l) nebo lipoproteinů (chylózní sérum). Tyto velké molekuly zabírají v plazmě nezanedbatelné místo a obsah vody a Na+ v plazmě se snižuje. Množství sodíku na ml plazmy je nižší. Osmolalita séra vztažená na kg vody je u pseudohyponatrémie v normě. Hyponatrémie může být spojena i se zvýšením osmolality, na kterém se podílí vyšší koncentrace patologicky zvýšených osmotických látek (glukóza, urea). U hyperglykémie dochází k přesunu vody do extracelulárního prostoru a k poklesu koncentrace sodíku. Zvýšení glykemie o 5,5 mmol/l nad horní hranici normy je spojeno s poklesem Na+ o cca 1,6 mmol/l. V ostatních případech je vždy hyponatrémie spojena s hypoosmolalitou. Hyponatrémie při dehydrataci (hypovolémii) Podstatou toho stavu je fakt, že ztráty Na+ jsou vyšší než ztráty čisté vody. Ke zvýšeným ztrátám sodíku dochází z příčin extrarenálních a renálních. ztráty extrarenální jsou podmíněny průjmem, pocením, zvracením, vysokými odpady do stomií anebo píštělí (střevní, biliární, pankreatickou). V těchto situacích je koncentrace Na+ v moči nízká a klesá pod 20 mmol/l, osmolalita moči je vysoká a stoupá nad 400 mosmol/kg H 2 O. ztráty renální jsou vyvolány ovlivněním tubulární resorpce Na+ z různých příčin: diuretika (thiazidy, kličková diuretika) ledvinná onemocnění vedoucí k postižení tubulární resorpce (tubulointersticiální nefritidy, polycystické ledviny, polyurická fáze akutní renální insuficience) transplantovaná ledvina nenatriová osmotická diuréza, kdy vlivem patologicky zvýšeného vylučování osmoticky aktivních látek (glukózy, 91

92 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi ketolátek, močoviny) vzniká polyurie a frakční exkrece Na+ bývá zvýšena deficit mineralokortikoidů a kortizolu - M. Addison V těchto situacích je koncentrace Na+ v moči vysoká, resp. vyšší než 20 mmol/l, ztráty Na+ jsou vyšší než 20 mmol/d a osmolalita moči je nízká - menší než 400 mosmol/kg H 2 O. Žaludeční šťáva Jejunální sekret Ileální sekret Pankreatická píštěl Žlučová píštěl Průjmovitá stolice mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l KAPITOLA 07 Tabulka 7.2 Koncentrace Na+ ve střevních sekretech Euvolemická hyponatrémie K tomuto stavu vede, běžnými klinickými metodami nezjistitelná, mírná retence bezsolutové vody, bez klinického rozvoje edému, s dilucí ECT a vznikem hyponatrémie. V této situaci je vylučování bezsolutové vody sníženo (frakční exkrece čisté vody je snížena) a vylučování sodíku je zachováno. Nejčastější příčinou tohoto stavu je tzv. syndrom inadekvátní sekrece antidiuretického hormonu (SIADH). U tohoto stavu dochází vlivem sekrece látek s účinkem ADH ke sníženému vylučování bezsolutové vody. Nedochází však ke klinicky manifestnímu vzniku otoků, a to nejspíše proto, že mírná retence vody s malou expanzí intravaskulárního objemu je dostatečně silným volumoregulačním podnětem pro zvýšené renální vylučování Na+ prostřednictvím natriuretických peptidů. Diagnostika tohoto stavu se opírá o zjištění sérové hypoosmolality a hyponatremie (pod 130 mmol/l) bez klinicky manifestních otoků a zachovalé renální exkrece Na+ s močovou osmolalitou vyšší než 100 mosmol/kg H2O. Tento syndrom bývá někdy těžké odlišit od tzv. syndromu mozkového plýtvání se solí (Cerebral Salt Waisting Syndrome - CSWS). U tohoto stavu jsou zvýšené ztráty Na+ do moči podmíněny působením patologicky produkovaného natriuretického peptidu. Klinicky jeví nemocní známky dehydratace. Léčba SIADH spočívá v omezení perorálního příjmu tekutin pod 1litr/24 hod. Při těžké symptomatické hyponatrémii volíme léčbu kličkovými diuretiky s hrazením ztrát Na+ k dosažení exkrece čisté vody při zachování vyrovnané bilance sodíku. CSWS léčíme substitucí Na+ spolu s bezsolutovou vodou. Příčiny SIADH jsou onemocnění plic (pneumonie, TBC, aspergilóza), nádory (plic, pankreatu, duodena, thymomy, lymfomy), onemocnění CNS (encefalitis, meningitis, COM, tumory, absces, syndrom Guillaina-Barre, psychózy), léky stimulující výdej ADH (narkotika, barbituráty, carbamazepin, nikotin) nebo potencující jeho účinek (NSAID, cyklofosfamid, clofibrát). Další příčinou euvolemické hyponatrémie může být psychogenní polydipsie provázející chorobné stavy, jako jsou mentální anorexie, neurózy, schizofrenie. Při zjištění hyponatrémie a nepřítomnosti otoků (euvolémie) musíme také pomýšlet na možný hypokortikalismus (M. Addison) nebo hypotyreózu. Hyponatrémie hypervolemická V tomto případě je objem ECT zvýšen a klinicky jsou u pacientů patrné edémy. Patofyziologickým podkladem uvedeného stavu je nedostatečné renální vylučování Na+ a vody v důsledku oběhových změn a onemocnění orgánů: jaterní selhání (aktivace RAAS) srdeční selhání (aktivace RAAS) nefrotický syndrom s rozvojem hypoalbuminemických otoků anurické renální selhání s převodněním energetické selhání organismu Často bývá u těchto stavů zpočátku hypervolémie normonatremická. Při pokračujícím selhávání orgánů dochází k celkové alteraci organismu s rozvojem katabolismu a hladovění s chyběním energetických substrátů. Výrazem úplného energetického vyčerpání organismu je pokles aktivity Na+K+ATPázy s hromaděním Na+ intracelulárně a K+ extracelulárně a rozvojem terminální hyponatrémie. 92

93 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Hypernatrémie Je charakterizována vzestupem koncentrace Na+ nad 145 mmol/l. Klinicky se manifestuje při vzestupu koncentrace nad 150 mmol/l a hodnoty nad 160mmol/l končí často letálně. V klinickém obrazu dominuje pocit žízně, snížený turgor kůže, poruchy CNS, cefalea, zvracení, křeče, kóma. Příčinou tohoto stavu je nejčastěji převaha ztráty čisté vody s klinickými příznaky dehydratace. Vzácněji dochází k hypernatrémii při euvolemii nebo hypervolemii, která je obvykle podmíněna iatrogenním přetížením infúzemi s obsahem sodíku. KAPITOLA 07 Hypernatrémie podmíněná nedostatkem vody hypernatremická dehydratace K tomuto stavu může vést nedostatečný příjem čisté vody nebo její zvýšené ztráty. K deficitu čisté vody v důsledku jejího nedostatečného příjmu predisponují senioři se sníženým pocitem žízně. U starých pacientů i malý deficit vody může vést k alteraci psychického stavu. Pokud není situace správně hodnocena a léčena i.v. dodávkou čisté vody (resp. 5% glukózy) a pacient je naopak tlumen antipsychotickými léky, prohlubuje se dehydratace, dezorientace, vzniká kóma s fatálními důsledky. K poruše příjmu tekutin vedou také nemoci omezující polykání dysfagie různého původu, pseudobulbární syndrom po COM, úrazy hlavy a krku, nádory orofaciální oblasti. V laboratorním nálezu při deficitu čisté vody nalézáme hypernatrémii Na+ více než 145 mmol/l, hyperosmolalitu více jak 300 mosmol/kg H 2 O. Ledviny v maximální míře reabsorbují vodu a sodík, klesá diuréza a stoupá osmolalita moči. Ke zvýšeným ztrátám vody vedou jednak ztráty extrarenální a jednak renální. K extrarenálním ztrátám čisté vody s rozvojem hypernatrémie vedou horečnaté stavy, které zvyšují perspiratio insensibilis a zvyšují výdej potu. Koncentrace sodíku v potu je individuální (9-77 mmol/l) a jeho zvýšený výdej může různou měrou ovlivňovat ztráty Na+ a H 2 O. Ve velké většině případů jsou ztráty vody pocením větší než ztráty sodíku. Ke ztrátám vody vede dále zvracení s rozvojem metabolické alkalózy a průjem s rozvojem hypokalémie a se vznikem metabolické acidózy v důsledku ztrát bikarbonátu. Zvýšené renální vodní ztráty vznikají při polyurické fázi akutního selhání ledvin, v důsledku poruchy tubulárních funkcí při tubulointersticiální nefritidě (TIN) nebo u septických ledvin, kdy ledvinná dřeň není schopna vytvářet koncentrovanou moč. Důležitou příčinou ztrát vody ledvinou je nedostatečná produkce ADH centrální (neurogenní) diabetes insipidus. Při necitlivosti renálních tubulů k ADH hovoříme o nefrogenním diabetu insipidu. Uvedené zvýšené renální ztráty vody se laboratorně projevují poklesem osmolality moče pod úroveň sérové osmolality, za hranici bývá považována hodnota 250 mosmol/kg H 2 O, při maximální vodní polyurii klesá pod 100 mosmol/kg H 2 O, frakční exkrece čisté vody se zvyšuje nad 2%, vzniká polyurie (denní diuréza větší než 2500ml, v extrémních případech diabetes insipidus dosahuje diuréza ml/24 hod). Tělesná teplota Perspiratio insensibilis (ml/24 hod) 37, , , , , Tabulka 7.3 Perspiratio insensibilis v závislosti na tělesné teplotě Hypernatrémie s euvolémií nebo hypervolémií K hypernatrémii bez známek dehydratace dochází ve vzácnějších případech. Nejčastěji se jedná o zvýšení příjmu sodíku ve formě infuzních roztoků při jejich nadbytečném terapeutickém použití (např. fyziologický roztok = 0,9% roztok NaCl obsahuje 154 mmol/l Na+ = 9g NaCl). Dále k tomuto stavu může vést primární hyperaldosteronismus nebo Cushingův syndrom. 93

94 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Kalium Základní vlastnosti K+ je hlavním intracelulárním kationtem. Jeho koncentrace v ICT se pohybuje v rozmezí mmol/l. U 70 kg jedince se nachází v organismu asi 4000 mmol K+. Vysokou ICT koncentraci K+ zajišťuje Na+K+ATPáza. Z tohoto důvodu má pro správnou distribuci K+ zásadní význam dostupnost ATP a energetická situace organismu. Na+K+ATPáza přenáší 3 ionty Na+ z buňky a do buňky transportuje 2 ionty K+. Generuje tedy elektronegativitu intracelulárního prostoru, na které se mimo jiné podílí i rozdílná propustnost buněčné membrány pro Na+ a K+ (b. membrána je více propustná pro K+ než pro Na+). Výsledkem tohoto iontového rozložení je geneze klidového membránového potenciálu, který je fundamentální pro celou řadu fyziologických procesů - nervosvalový přenos, šíření nervového vzruchu, srdeční činnost. Vzhledem k zásadnímu podílu K+ na tvorbě klidového membránového potenciálu mají změny koncentrace K+ v tělních tekutinách dalekosáhlé a mnohdy fatální dopady. Při hypokalémiích dochází ke snižování svalové síly a snižování rychlosti šíření nervových vzruchů, což se může klinicky mimo jiné projevit omezením ventilace s rozvojem respirační insuficience a nutností umělé plicní ventilace. Taktéž činnost hladkého svalstva je při nízké koncentraci kalia snížena a výsledkem je paralytický ileus. Srdeční činnost je patologicky ovlivněna jak hypokalémií, tak hyperkalémií s možným rozvojem maligních arytmií - fibrilací komor nebo asystolií. Z výše uvedeného je zřejmé, že udržování správné koncentrace K+ v jednotlivých tělesných kompartmentech má mimořádný význam. KAPITOLA 07 Potřeba draslíku, bilance, vztah k ABR a stavu výživy Denní potřeba K+ se pohybuje v rozmezí 1-2 mmol/kg/den. Stoupá v anabolismu, kdy nedostatečné hrazení K+ má za následek závažnou hypokalémii. Draslík je za fyziologických podmínek vylučován ledvinami a regulace vylučování je spojena s účinkem aldosteronu. Aniontovým protějškem intracelulárního draslíku jsou fosfátové ionty ve formě organických makromolekulárních fosfátů. I když makromolekulární fosfáty přes buněčnou membránu neprocházejí, mohou hladinu K+ ovlivňovat. Při jejich rozpadu a depleci za katabolismu klesá jejich intracelulární koncentrace a dochází k uvolňování K+ do ECT pro pokles negativního náboje ICT. Naopak v anabolismu, kdy stoupá syntéza makroergních a makromolekulárních fosfátů, dochází k influxu kalia do buněk z důvodu zvyšování negativního náboje ICT. V anabolické situaci se zvyšuje intracelulární koncentrace draslíku a doplňuje se jeho pool. U těžce podvyživených bývá intracelulární deficit draslíku enormní a dosahuje mmol. Pokud je pacient realimentován, je nutná dostatečná substituce draslíku, která dosahuje mmol/24 hod, spolu se substitucí fosforu a magnezia. Nedodržení zvýšené dodávky intracelulárních iontů při zahájení nutriční intervence u významně malnutričních nemocných je podstatou vzniku refeeding syndromu s možností exitu pacienta. Příčinou úmrtí bývá svalová slabost, respirační selhání, kóma a srdeční arytmie. Transport K+ mezi ICT a ECT se také může realizovat směnou za H+, což ukazuje na vztah mezi ABR a koncentrací K+ v ICT a ECT. Změny ABR vedou k přesunům K+, a to tak že MAC podporuje rozvoj hyperkalémie a MAL podporuje vznik hypokalémie. Pokles ph o 0,1 zvyšuje průměrně kalémii o 0,4 mmol/l. Koncentrace v plazmě Koncentrace v buňkách Koncentrace v moči Intracelulární zásoba Extracelulární zásoba Příjem Výdej 3,8-5,2 mmol/l mmol/l mmol/l 3200 mmol 60 mmol mmol/24 hod mmol/24 hod Tabulka 7.4 Bilance a distribuce draslíku 94

95 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Hypokalémie Hypokalémie je definována jako pokles sérové koncentrace K+ pod 3,5 mmol/l, závažná hypokalémie pod 3 mmol/l a život ohrožující pod 2,5 mmol/l. Pro klinickou manifestaci je důležitá rychlost změny. Čím rychleji se hypokalémie vyvine, tím bývá dopad závažnější. Hypokalémie může mít závažné klinické projevy - maligní srdeční arytmie, paralýzu dýchacích svalů s respirační insuficiencí, snížení aktivity hladkého svalstva s rozvojem paralytického ileu. Hypokalémie extrarenální KAPITOLA 07 K diferenciaci mezi hypokalémií extrenální a renální slouží odpady K+ do moči za 24 hodin. Odpady K+ pod 20 mmol/24 hod svědčí pro extrarenální původ. K hypokalémii extrarenální vede nízký příjem draslíku - u pacientů s mentální anorexií, u hladovějících, při nedostatečné suplementaci K+ v průběhu PV nebo EV u podvyživených. Ke zvýšeným extrarenálním ztrátám vede zvracení, ztráty žaludeční šťávy při zavedené nasogastrické sondě, píštěle, průjem, stomie. Ztráty z proximální části trávícího traktu vedou k rozvoji MAL s poklesem K+, při ztrátách z distální části trávicí trubice (ileum, kolon) dochází ke ztrátám HCO 3-, K+. Výsledkem je hypokalémie s MAC. Ke zvýšeným ztrátám draslíku může vést i nadužívání laxativ. Hypokalémie renální Příčinou renálních ztrát bývá renální tubulární acidóza, polyurická fáze akutního selhání ledvin, chronického selhání ledvin, tubulointersticiální nefritida, Gitelmanův syndrom, Bartterův syndrom a deficit magnézia. K hypokalémii z důvodu větších renálních ztrát vede i chronická léčba nebo abusus saluretik (furosemid, thiazidy). Dlouhodobá hypokalémie vyvolává hypokalemickou nefrózu s postižením tubulů, což vede ke zvýšeným ztrátám K+ do moči. Ke zvýšeným renálním ztrátám vede také zvýšení hladiny aldosteronu ať primární či sekundární. Mezi příčiny primárního hyperaldosteronismu patří: adenom nadledviny, zvýšená ektopická produkce ACTH v tumorech, zvýšená produkce ACTH při adenomu hypofýzy. Sekundární hyperaldosteronismus vzniká u srdečního selhání a jaterní cirhózy jako výraz snížení intravaskulárního volumu nebo srdečního výdeje. V těchto případech je v léčbě hypokalémie racionální použití antagonistů aldosteronu (spironolakton). Klinické projevy hypokalémie jsou uvedeny výše. Na EKG křivce nalézáme ploché vlny T, zvýraznění vlny U, deprese ST úseku a KES. Nebezpečnou komplikací je fibrilace komor a svalová rabdomyolýza. Při dlouhodobé hypokalémii dochází k poškození tubulů ledvin. Léčba hypokalémie Hodnotu kalémie vždy posuzujeme ve vztahu k ABR, k vodní bilanci a k energetické situaci organismu (katabolismus vs. anabolismus). Pro správné rozhodnutí o léčbě je nutné stanovení odpadů draslíku do moči za 12, lépe za 24 hodin. Pouhé stanovení kalémie vypovídá velmi málo o příčině vzniku a neumožňuje správně zvolit léčebnou strategii. Kroky v léčbě hypokalémie jsou následující: úprava poruchy acidobazické rovnováhy zajištění dodávky energetických substrátů volbou správné nutriční intervence a úprava energetické rovnováhy. Intracelulární deficit K+ nelze upravit bez současné syntézy intracelulárních fosfátových makromolekul, které představují aniontového partnera K+ v ICT. odstranění dehydratace organismu, která vede k sekundárnímu hyperaldosteronismu se zvýšením renálního vylučování K+, H+ a reabsorpcí Na+ a vody. Bez adekvátní hydratace tuto hypokalémii pouhou substitucí K+ nevyřešíme. substituce magnézia, pokud zjistíme deficit zvýšený přívod K+ infúzemi. Denní dávku určujeme podle odpadů K+ do moči a předpokládaného deficitu za pravidelné monitorace sérových koncentrací K+. Rychlost substituce bývá obvykle 50 mmol/6 hod a dávka mmol/24 hod. V extrémních situacích se substituce může pohybovat kolem 300 mmol/24 hod. Při hladině K+ 1,4 mmol/l se změnami na EKG může být rychlost podání 40 mmol/h s pravidelným 2 hodinovým monitorováním hladiny K+. Při aplikaci do periferní žíly nemá koncentrace roztoků draslíku překročit 30 mmol/l a rychlost 10 mmol/hod v situacích provázených zvýšenou hladinou aldosteronu je na místě léčba jeho antagonisty. Známkou hyperaldosteronismu je pokles poměru koncentrací U-Na/U-K pod 1. Jinými slovy odpady draslíku do moči převýší odpady sodíku odstranění vyvolávající příčiny ztrát draslíku 95

96 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Hyperkalémie Mírná hyperkalémie je definována koncentrací K+ 5,5-6,5 mmol/l, střední 6,5-7,5 mmol/l, těžká více než 7,5 mmol/l. Podobně jako u hypokalémie dochází k hyperkalémii z příčin renálních a extrarenálních. Hyperkalémie extrarenální K rozpoznání příčiny hyperkalémie slouží odpady K+ do moči za 24 hod. V případě extrarenální příčiny stoupají odpady K+ nad 50 mmol/24 hod a při těžkém katabolismu stoupá koncentrace K+ v moči na více jak 100 mmol/l. K extrarenální hyperkalémii dochází v důsledku redistribuce K+ mezi ICT a ECT. K výstupu draslíku z buněk vede intracelulární acidóza z různých příčin a katabolismus při hladovění, jehož dopadem je ztráta makromolekul fosfátů. V těchto situacích může být celková zásoba K+ v organismu snížena. K arteficiální hyperkalémii může vést zvýšený přívod K+ v i.v. roztocích při chybně stanovené bilanci. KAPITOLA 07 Hyperkalémie renální Příčinou tohoto typu hyperkalémie je absolutní snížení glomerulární filtrace u akutního nebo chronického selhání ledvin se sníženým renálním vylučováním K+ a doprovodnou acidózou. Další příčinou jsou choroby a stavy ovlivňující tubulární funkce ledvin ve smyslu snížení tubulární sekrece K+. Jde o některé endokrinopatie s nízkou hladinou aldosteronu (M. Addison, hypoaldosteronismus, hypopituitarismus) a medikamenty (ACEI, Cyklosporin A, NSAID, spironolakton). Odpady draslíku do moči klesají v těchto případech pod 50 mmol/24hod resp. pod 30 mmol/l Klinickými projevy hyperkalémie jsou především srdeční arytmie (bradyarytmie, asystolie) a svalové parestézie. Většinou je klinický obraz pacienta dán základní chorobou, která poruchu způsobila. Na EKG nalézáme hrotnaté vlny T, rozšíření QRS komplexů a bradykardii. Léčba hyperkalémie Pro správnou léčbu hyperkalémie je mimo stanovení sérové koncentrace K+ nutné stanovit S-kreatinin, S-ureu, ABR a odpady K+ do moči za 24 hodin. Odpady K+ do moči umožňují rozpoznat renální a extrarenální příčinu stavu. Při nadměrném přívodu nebo významném katabolismu stoupá koncentrace K+ v moči nad 100 mmol/l, při renální nedostatečnosti klesá koncentrace K+ v moči pod 30 mmol/l. Důležitým momentem při léčbě hyperkalémie je vysazení léků, které vedou k retenci draslíku. Intenzita léčby hyperkalémie závisí na sérové koncentraci K+, dynamice vzestupu, klinickém stavu a změnách na EKG. Dle těchto ukazatelů indikujeme dialyzační nebo konzervativní léčbu. Akutní hemodialýza je indikována při hodnotách K+ více jak 7 mmol/l nebo při hodnotě K+ více jak 6 mmol/l s klinickými projevy bez reakce na konzervativní postup. Konzervativní terapie akutní hyperkalémie zahrnuje: podání Calcium gluconicum ml i.v. podání bikarbonátu 8,4% 80 ml. i.v. podání 500 ml 10% glukozy + 10j inzulinu iontoměniče (Resonium 100g ve formě klysmatu) Konzervativní terapie mírné chronické hyperkalémie zahrnuje snížení přívodu draslíku pod 1,5 g/d (pod 40 mmol) zvýšení vylučování použitím kličkových diuretik (furosemid) léčba bikarbonátem p.o. při MAC dostatečná hydratace vyloučit léky snižující vylučování K+ iontoměniče (Resonium 15g 3x denně) 96

97 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi Chloridový aniont Chloridový aniont je hlavním aniontem extracelulárního prostoru a jeho distribuční prostor odpovídá 20% tělesné hmotnosti. Zvýšení nebo snížení obsahu chloridů je souběžné se změnami zásob Na+, neboť chlorid je aniontovým partnerem sodíku. Cl- je také v elektroneutrální rovnováze s bikarbonátem, a tak změny jeho koncentrace jsou provázeny změnami ABR. Hyperchloridémie způsobuje acidózu a hypochloridémie alkalózu. KAPITOLA 07 Hyperchloridémie Hyperchloridémie je souběžná s retencí sodíku a vzniká, pokud nedochází k adekvátní retenci čisté vody a expanzi ECT. Pokud k expanzi ECT dochází spolu s retencí Na+, zásoby Cl- stoupají, ale koncentrace v séru se nemění. Při hyperchloridémii se vyvíjí metabolická acidóza a hypernatrémie. Příčinou bývá zvýšený přívod chloridů ve formě infuzních roztoků, nebo snížené vylučování při jaterní cirhóze, srdečním selhání a při selhání ledvin. S hyperchloridémií se také setkáváme u pacientů s ureteroileostomií po cystektomiích, v důsledku zvýšené resorpce do moči vylučovaných chloridů střevní neovesikou. V tomto případě je na místě léčba p.o. bikarbonátem. V ostatních případech je podstatou léčby omezení přívodu chloridů (nejčastěji v infuzích) a zvýšení jejich vylučování saluretiky. Hypochloridémie Podobně jako u hyperchloridémie, pokud je zároveň přítomen deficit Na+ a vody, který vede k poklesu objemu ECT, nedojde k rozvoji hypochloridémie, ale klesá zásoba Cl- v těle. V této situaci se koncentrace chloridů v ECT nemění. Pokud je objem ECT zachován, vyvíjí se hypochloridémie, která je spojena s hypochloremickou alkalózou, hypokalémií a většinou hyponatrémií. K jejímu vzniku vedou nejčastěji ztráty střevních sekretů - zvracení, ztráty píštělemi z proximální části GIT, odsávání žaludečního obsahu NG sondou. Hypochloridémie dále vzniká při zvýšeném vylučování ledvinami - polyurická fáze renálního selhání nebo masivní léčba saluretiky. Léčba hypochloridémie spočivá v prvé řadě v odstranění vyvolávající příčiny (zvracení, píštěle, neadekvátní léčba diuretiky) a v dostatečném hrazení chloridů ve formě infuzních roztoků NaCl. Pokud je výrazná expanze ECT, lze s výhodou využít roztoky arginin chloridu, které neobsahují Na+ a nevedou k retenci tekutin. V případě přítomnosti hypokalémie máme k dispozici bilancované roztoky s obsahem K+ (Ringer, Ringerfungin, Darrow). Koncentrace v plazmě Zásoba v ICT Zásoba v ECT Příjem Výdej močí Výdej stolicí Výdej potem Výdej celkem 100 mmol/l 1400 mmol 1000 mmol mmol 24/hod mmol/24 hod 10 mmol/24 hod mmol/24hod mmol/24 hod Tabulka 7.5 Zásoba a distribuce chloridů v těle Seznam zkratek: ABR acidobazická rovnováha ACEI angiotensin converting enzyme inhibitors ACTH adrenokortikotropní hormon ADH antidiuretický hormon AK - aminokyseliny CN Crohnova nemoc 97

98 Význam stanovení Na, K, Cl v klinické praxi COM cévní onemocnění mozku CS coeliakie CSWS cerebrál salt wasting syndrome CTV celková tělesná voda ECT extracelulární tekutina ICT intracelulární tekutina i.v. intravenózní podání KES komorové extrasystoly MAC metabolická acidoza MAL - metabolická alkaloza NG nasogastrická sonda NSAID nesteroidní antirevmatika NSZ nespecifické střevní záněty RAAS - renin-angiotenzin-aldosteronový systém RT radioterapie SIADH syndrom inadekvátní sekrece ADH TF - tepová frekvence TK krevní tlak UC Ulcerozní kolitida KAPITOLA 07 98

99 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava Autor: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. Recenzent: prof. MUDr. Antonín Kazda, DrSc. KAPITOLA 08 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod: Kalcium (Ca), fosfor - tj fosfáty,hpo4 2- (P) a magnézium (Mg) spolu se sodíkem, draslíkem a chloridy tvoří podstatnou část anorganické složky lidského těla. Regulace metabolizmu kalcia, fosforu a magnézia je humorální a podílejí se na ní kalcitropní hormony : parathormon (PTH), parathormonu related protein (PTHrP), vitamin D, kalcitonin (CT) a fibroblast growth factor 23 (FGF23). Hypofosfatúrický efekt v ledvinách je zprostředkován skrze interakci FGF23 s Klotho protein jako lokálním kofaktorem. Cílem této kapitoly je přehled fyziologie a patofyziologie metabolizmu Ca, P, Mg. Klíčové informace na závěr pak poskytují souhrn podstatných informací z celé kapitoly. Kalcium, Ca V těla zdravého člověka je obsaženo cca 1,0-1,3 kg Ca, 99% je uloženo v kostech a zubech, 1% v měkkých tkáních a 0,1 % extracelulárně. V intracelulární tekutině ( ICT) je koncentrace Ca až x nižší, než v extracelulární tekutině (ECT). V plazmě Ca existuje ve formě volné ( ionizované ) 50%, vázané na proteiny, především albumin 40% a 10% tvoří komplexy s citrátem a hydrogenuhličitanem. Ca obsažený v komplexech a ionizovaný pak představují difuzibilní - biologicky aktivní frakci. Tato biologicky aktivní složka Ca je pak přísně regulována humorálním i mechanizmy kalcitropními hormony. Koncentrace Ca je zásadně ovlivněna 2 faktory: 1. Koncentrací albuminu : hladina albuminu ovlivňuje hladinu celkového Ca v plazmě. Pacienti s hypalbuminémií ( albuminem) mají nižší koncentrace celkového vápníku, ale ionizovaná biologicky aktivní frakce je většinou v normě. To je důvodem poměrně časté hypokalcémie u hospitalizovaných nemocných bez klinických projevů. 2. Změnami ph : acidóza snižuje vazbu vápníku na albumin a zvyšuje frakci ionizovaného vápníku, naopak alkalóza snižuje frakci ionizovaného vápníku a vyvolává klinické příznaky spojené s hypokalcémií. Typickým příkladem je hyperventilační tetanie, kdy rychle navozená respirační alkalóza vyvolá hypokalcémii s tetanií s omezením činnosti dýchacích svalů a tím prohlubuje dušnost. CAVE : akutní léčbou je tedy normalizace alkalémie, ne kalcémie. Fyziologie Kalcium je důležitým regulátorem řady biologických procesů, proto je hladina ionizovaného vápníku velmi přísně kontrolována a udržována v poměrně úzkém referenčním rozmezí. Regulační mechanizmy jsou nastaveny tak, aby byla zajištěna normokalcémie v séru. Na regulaci hladiny se podílí tenké střevo (vstřebávání), kostní tkáň ( depozitum ) a ledviny (vylučování). Kalcium je důležité pro: 1. kostní mineralizaci 2. srážení krve 3. neuromukulární přenos ( tvorba a vedení vzruchů) 4. svalovou kontrakci 99

100 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava 5. funkce cytoskeletonu buněk ( endo a exocytóza, dělení buněk) 6. přenos signálu uvnitř buněk - 2. posel 7. aktivaci ezymů ( proteinkinázy, fosforylázy) Denní metabolizmus vápníku: Optimální denní příjem se pohybuje v rozmezí mg denně v závislosti na růstu, graviditě a laktaci. Vstřebávání probíhá v tenkém střevě s maximem v duodenu z přítomnosti kyselého ph a vstřebávání postupně klesá směrem k ileu. Proces střevní resorbce je z části pasivní děj paraceluárně dle koncentračního gradientu, převážně jde o děj aktivní (vazba Ca na specifický přenašeč kalbindin) skrze enterocyty. Aktivní resorbce vápníku je stimulována přítomností aktivního vitaminu D (1,25 (OH) 2 D). Negativní vliv na vstřebání Ca mají některé složky stravy ( tuk, oxaláty, šťavelany). Vstřebaný Ca přechází do ECT, kde je směňován s Ca z kostí. V období růstu, či při volné kapacitě kostí zde dochází k jeho ukládání tzv. pozitivní kalciová bilance. Směna je řízena kalcitropními hormony především pak PTH. Vylučování Ca probíhá v ledvinách. Většina profiltrovaného Ca se vstřebává pasivně v proximálním tubulu a Henleově kličce. Aktivní regulace probíhá v distálním tubulu cca 8-10 % Ca. Zde se jedná o aktivní proces řízený kalcitropními hormony především PTH, minimálně kalcitoninu. Vylučování ovlivňují i léky jako diuretika. Kličková diuretika ( furosemid) snižují tubulární resorpci jak Na tak Ca. Naopak thiazidová diuretika zvyšují zpětnou resorpci Ca při zvýšení sekrece Na a Cl. Rovněž metabolická acidóza ( exkrece) vodíkových iontů brání zpětné resorpci Ca v distálním tubulu. KAPITOLA 08 Fosfor Lidské tělo obsahuje cca g fosforu, 85 % je uloženo v kostech, ECT se nachází méně než 1% a zbytek je uložen v tkáních 14%). Fosfátový anion je nejdůležitější intracelulární anion, jeho koncentrace v ICT 100x vyšší než v ECT. V plazmě zhruba 88 % představuje difuzibilní P ve formě volné (ionizované) 53% a 35% ve formě komplexů. Zbytek tvoří nedifuzibilní P vázaný na proteiny 12%. Fyziologie : Fosfor je nejen nedílnou součástí skeletu, ale zároveň je i nesmírně důležitý pro klíčové buněčné struktury. Je součástí nukleových kyselin, energetického metabolismu (makroergní fosfáty), pufrovacích systémů, fosfolipidové membrány. Vstřebávání probíhá v tenkém střevě s maximem v jejunu. Střevní resorpce je úměrná množství fosfátů ve stravě a dále je stimulovánpřía přítomností 1,25(OH) 2 D a jeho stimulačním efektem na Na-P ko-transportér. Vstřebaný P stejně jako Ca přechází do ECT, kde je směňován s kostmi, které slouží jako hlavní depozitum fosfátů v těle. Vylučování P probíhá v ledvinách % se vstřebá v proximálním tubulu v distálním tubulu a 5-10% ve sběrném kanálku. Jde o aktivní proces na kterém se podílejí specifické Na-P ko-transportéry, jejichž aktivita je řízena přítomností FGF23 a jeho specifického renálního ko-faktoru Klotho. Přítomnost FGF23-Klotho pak vede ke zvýšené fosfatúrii. Přestože je fosfor nezbytný v celé řadě intracelulárních dějů, jeho trvale zvýšená sérová koncentrace je pro organizmus toxická. Urychluje proces stárnutí buněk a mimo jiné je zodpovědná za vaskulární kalcifikace u chronicky dialyzovaných nemocných. 100

101 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava KAPITOLA 08 Obrázek 8p.1 Souhrn denního metabolizmu vápníku a fosforu Magnézium Lidské tělo obsahuje asi jen 24 g Mg, z čehož 50% je ve skeletu, zbývající 50 % se nachází v ICT, především ve svalech. V ECT se nachází méně než 1%. V plazmě zhruba % představuje difuzibilní ionizované Mg a 1-2% vázané v komplexech. Zbývajících 20-30% tvoří nedifuzibilní Mg vázané proteiny. Fyziologie : Mg je 2.nejčastější kation v ICT, podílí se na cca 300 enzymatických reakcích (energetický metabolizmus, syntéza nukleových kyselin, cytoskeleton, stabilita membrán).zásadně se podílí na modulaci, udržování homeostázy, intracelulární koncentrace vápníku. Je dále mediátorem imunologických reakcí a tvorby a sekrece PTH, regulace tonu hladkého svalstva a relaxace kosterního svalstva. Denní doporučený příjem je mg. Vstřebávání probíhá v aktivně tenkém střevě a pravděpodobně je ovlivněno přítomností1,25 (OH) 2 D. Vylučování Mg probíhá v ledvinách % se zpětně vstřebá v proximálním tubulu, % v kortikálním ascendentním raménku Henleovy kličky ( pasivně) a 5-10% aktivně v distálním tubulu, zřejmě pod obdobnými regulačními vlivy jako Ca Parathormon (PTH) Polypeptid -základní regulační hormon kalcium-fosfátového metabolizmu. PTH je polypeptid složený z 84 aminokyselin. Je produkován v příštítných tělískách jako Pre-pro PTH 115 AMK, následně odštěpen pro PTH 90 AMK. Poslední štěpením v Golgiho aparátu vzniká buď intaktní 1-84 PTH (biologicky aktivní), nebo fragment 7-84 AMK (biologicky neaktivní). Jak 1-84, tak 7-84 jsou uvolňovány do cirkulace. Intaktní 1-84 PTH představuje cca

102 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava % celkově uvolněného PTH do cirkulace. Sekrece PTH je zpětnovazebně kontrolována hladinou ionizovaného vápníku v séru, přenos signálu se děje přes specifický receptor CaSR (Calcium sensing receptor). Produkci PTH v příštítných tělískách ovlivňuje hladina fosforu ( stimulace) a naopak hypomagnezémie a hypermagnezémie, 1,25 (OH)2D tvorbu PTH tlumí. Degradace probíhá v játrech a ledvinách rozštěpením molekuly v pozici AMK a 36-37AMK.Vznikají další inaktivní fragmenty PTH. Biologický poločas intaktního 1-84 PTH je cca 5 min. KAPITOLA 08 Obrázek 8p.2 Metabolizmus PTH Fyziologie: Hlavním efektem PTH je zvyšování plazmatické koncentrace Ca Účinek zprostředkován skrze 2 typy receptorů: PTH1 a PTH2. PTH 1 je společný pro PTH i PTH related protein (PTHrP viz níže) a nachází se v kostech a ledvinách. a) V kosti PTH zprostředkovaně skrze osteoblasty vyvolá změnu produkce OPG-RANKL a přeneseně dojde ke stimulaci osteoklastů (osteoresorbci) a uvolnění Ca do ECT. (popis lokální regulace osteoblastů a osteoklastů viz kostní metabolizmus) b) V ledvinách zvyšuje reabsorbci Ca a exkreci P - zvyšuje tvorbu alfa 1 hydroxylázy (enzymu tvořící aktivní 1,25 (OH) 2 D) Cirkadiánní rytmus s maximem h a minimem 11.00h PTH related protein (PTHrP ) PTHrP je peptid, jehož gen se skládá z 9 exonů a jejich různá exprese je zodpovědná za vznik 3 možných izoforem (139 AMK, 141 AMK a 173 AMK).Díky homologii v prvních 13. aminokyselinách se váže na stejný PTH/PTHrP-1 receptor. Na rozdíl od PTH je produkován celou řadou buněk a mechanizmus jeho účinku je především auto či parakrinní. Mezi známé funkce PTHrP patří: 102

103 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava a) ovlivnění enchondrální kostní formace blokuje vyzrávání chondrocytů (růst kostí v prenatálním období) b) Kojení - produkce PTHrP v mléčné žláze zajišťuje odpovídající suplementaci mateřského mléka kalciem. Systémově zvyšuje osteoresorbci a lokálně se podílí na transportu Ca do mateřského mléka c) transepiteliální transport kalcia v placentě d) V ledvinách pak na rozdíl od PTH nestimuluje 1-hydroxylázu Zvýšená produkce PTHrP je u dospělých spojena především s hyperkalcémií u maligních onemocnění. Jedná se o paraneoplastickou nadprodukci PTHrP nádorovými buňkami ( kostními metastázami), vede ke vzniku lytických kostních metastáz. KAPITOLA 08 Vitamin D - 1,25 (OH) 2 D (kalcitriol) Patří mechanizmem účinku mezi hormony, neboť má svůj specifický receptor. Vitamin D se řadí mezi hormony rozpustné v tucích. Existuje ve 2 základních formách: vitamin D2 (ergocalciferol) a vitamin D3 (cholecalciferol). Ergocalciferol vzniká UV-B ozářením fungálního steroidu ergosterolu a je v přírodě vzácnou formou vitamínu D, je však hlavním vitaminem D produkovaným ve farmaceutickém průmyslu. Cholecalciferol vzniká UV-B ozářením z prekurzoru 7-dehydrocholesterolu, který se nachází ve vysoké míře v kůži. Dobu pro dosažení maximální hladiny prekursoru D3 v kůži určuje intenzita UV záření, doba expozice a pigmentace kůže. UV záření zároveň brání nadprodukci cholecaciferolu, neboť po dosažení maximálního nasycení tkáně dochází k fotodegradaci na neúčinné metabolity (lumisterol, tachysterol). Ergosterol a cholecalciferol jsou transportovány v krevním řečišti vázané z 85% na DBP (D vitamin binding protein) a z 15% na albumin. Kromě konverze v kůži je vitamin D, absorbován ve střevě se stravou. Játra jsou místem konverze vitaminu D na 25(OH) vitamin D (kalcidiol). Aktivním hormonem je 1,25 (OH) 2 D (kalcitriol), který vzniká hydroxylací kalcidiolu (25 (OH)D) pomocí α1-hydroxylázy. Zhruba 15 % kalcitriolu je tvořeno v ledvinách a jsou jím zásobovány tkáně nemající vlastní 1-hydroxylázu ( např. enterocyty, pankreas). 85 % kalcitriolu vzniká hydroxylací přímo v periferních tkáních s vlastní 1-hydroxylázou (epiteliální buňky, nervový, imunitní systém, prostata, prs, kolorektum). Zde má roli především autokrinní a parakrinní a je zodpovědný a neskeletární účinky vitaminu D. 24,25-(OH) 2 D je degradační produkt metabolizmu vitaminu D bez biologické funkce. 103

104 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava KAPITOLA 08 Obrázek 8p.3 Tvorba vitaminu D Fyziologie Hlavní funkcí kalcitriolu produkovaného ledvinami je regulace vstřebávání kalcia a fosfátů v tenkém střevě. Obecně vitamin D účinkuje přes specifický nitrobuněčný VDR (vitamin D receptor) a následně X receptor kyseliny retinové (RXR). Komplex kalcitriol-vdr-rxr se váže na specifická místa DNA tzv. VDRE (vitamin D response elements). Tato vazba zahajuje transkripci specifické DNA a RNA s tvorbou příslušných proteinů. V současnosti je odhadováno, že kalcitriol ovlivňuje expresi cca 2000 genů v lidském těle a vitamin D má tedy skeletární (kalcifosfátový metabolizmus) a neskeletární účinky. Skeletární účinky vitaminu D: Střevo: zvyšuje vstřebávání kalcia a fosforu Kost : minimální význam Ledviny: stimulace tvorby PTH receptoru a transportních bílkovin pro Ca zvyšuje reabsorpci kalcia Neskeletární účinky vitaminu D: Stimuluje vylučování inzulínu Imunomodulační a antibakteriální funkce Ovlivňuje tvorbu svalových vláken a metabolizmus vápníku ve svalech Potlačuje tvorbu reninu Zlepšuje diferenciaci a podporuje apoptózu buněk, potlačuje proliferaci, angiogenezu (prostata, prs, epitelie, kolerektum) Hlavní formy v cirkulaci: 104

105 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava 25 OH vitamin D (kalcidiol) - prekurzor aktivního kalcitriolu a zásobní prohormon pro konverzi v periferních tkáních. Ukazatel stavu zásobení vitaminem D. 1,25 (OH) 2 D (kalcitriol) aktivní vitamin, jeho hladina v séru koreluje s produkcí v ledvinách Kalcitonin (CT) KAPITOLA 08 Hormon, peptid 32 AMK, produkovaný parafolikulárními C buňkami štítné žlázy, podílí se na řízení homeostázy kalcium -fosfátového metabolizmu a je citlivým nádorovým markerem pro medulární karcinom štítné žlázy. Fyziologie CT primárně inhibuje osteoklasty zprostředkovanou kostní resorbci. Sekrece kalcitoninu je kontrolována sérovou hladinou ionizovaného kalcia. Kalcitonin má také mírný renální efekt, kde inhibuje reabsorbci Ca a P. Přes tento fyziologický efekt není udržování kalcium-fosfátové homeostázy příliš závislé na kalcitoninu. Pacienti po totální tyroidektomii či s medulárním karcinomem mají prakticky normální kalcium. Fibroblast Growth Factor 23 FGF23 a Klotho protein Jsou molekuly ovlivňující primárně koncentraci fosfátů. Hlavním zdrojem FGF 23 je kostní tkáň (1,25 (OH)2D stimuluje jeho produkci). Klotho protein je naopak produkován v ledvinách. Klotho protein zprostředkovává tkáňově specifický účinek FGF 23 v ledvinách, je tedy ko-faktorem funkce FGF23. FGF23 blokuje produkci bílkovin v renálních buňkách zodpovědných za zpětnou resorpci fosfátů. Má tedy významný fosfatúrický efekt a zároveň blokuje produkci 1α- hydroxylázy v ledvinách, tím snižuje hladinu 1,25 (OH) 2 D a tím snižuje resorbci fosfátů v tenkém střevě, ale i kalcia. Regulace kalciofosfátového metabolizmu Regulace kalcio-fosfátového metabolismu je založena na vzájemné interakci s PTH -1,25 (OH) 2 D CT a FGF23-Klotho. 105

106 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava KAPITOLA 08 Obrázek 8p.4 Základní regulační mechanizmy Ca, Mg a P koncentrací Regulace metabolizmu Mg je prakticky totožná s regulací vápníku a je tedy pravděpodobně také řízena systémem PTH- 1,25 (OH) 2 D. Sérová koncentrace magnézia koncentrace ovlivňuje sekreci PTH. Jak nedostatek, tak nadbytek magnézia blokují produkci PTH. Základním cílem homeostázy je udržení normokalcémie a normofosfatémie. Fyziologicky má lidský organizmus spíše problém zajistit dostatek vápníku a vyloučit nadbytečný fosfor. Magnézium je především intracelulární kationt, takže jeho sérová koncentrace neodráží jeho aktuální tkáňový deficit či přebytek, kromě těžkých forem deficitu či přebytku Na regulaci kalcémie se podílejí : PTH, 1,25 (OH) 2 D a kalcitonin Hyperkalcémii navozuje PTH( EF Ca v ledvinách a osteoresorbci).zároveň přímo stimuluje tvorbu 1,25 (OH) 2 D, který zvyšuje resorbci vápníku ze stravy v tenkém střevě. 1,25 (OH) 2 D naopak částečně tlumí produkci PTH. Hlavním regulátorem produkce PTH je však hladina ionizovaného vápníku (skrze CaSR calcium sensing receptor). Hypokalcémii navozuje kalcitonin (CT), který jako jediný hormon přímo blokuje funkci osteoklastů a tím i kostní resorbci. CT mírně zvyšuje kalciúrii a fosfatúrii v ledvinách. Jeho biologický efekt v lidském těle je ale minoritní, neboť hlavními důvody hypokalcémie jsou nedostatečný přísun Ca ve stravě či porucha funkce příštítných tělísek (deficit PTH) Normokalcémii udržuje organizmus dvojím způsobem : 1. Dostatečným příjmem ze stravy za podpory 1,25 (OH) 2 D. 1,25 (OH) 2 D zároveň stimuluje produkci FGF23, který podporuje vylučování fosfátů a blokuje tvorbu 1,25 (OH) 2 D, čímž se jemně balancuje celý systém. 2. Uvolněním z kostí, které balancuje krátkodobé výkyvy hladin ionizovaného vápníku skrze zvýšení či útlum sekrece PTH. 106

107 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava Dlouhodobý deficit kalcia ve stravě kompenzuje organizmus zvýšenou sekrecí PTH. Důsledkem je zvýšená osteoresorbce, která vede k poruše kostní integrity. Současně uvolněný P v kostech se vylučuje přímým fosfatúrickým efektem PTH v ledvinách a díky zvýšení produkce FGF23 v kostech. PTH stimuluje zároveň tvorbu 1,25 (OH) 2 D a tím i snahu o zvýšení kalcémie fyziologickým způsobem. Není-li přítomno kalcium ve stravě, ani zvýšená produkce 1,25 (OH) 2 D nepomůže. (Kde nic není, není co brát) Na regulaci fosfatémie se podílejí : FGF23 PTH, 1,25 (OH) 2 D Hypofosfatémii navozuje primárně FGF23-Klotoho komplex v ledvinách (fosfatúrický efekt), který současně blokuje produkci 1,25 (OH) 2 D, tím snižuje i resorbci fosfátů v tenkém střevě. PTH na jedné straně zvyšuje fosfatémii osteoresorbcí z kostí a na druhé straně snižuje fosfatémii přímou stimulací fosfatúrie v ledvinách. Hyperfosfatémii navozuje především neschopnost vyloučení fosforu z organizmu např. při chronické renálním selhání a zvýšený příjem ve stravě při přítomnosti 1,25 (OH) 2 D. Efekt 1,25 (OH) 2 D je ve střevě limitován množstvím fosforu ve stravě. Normofosfatémii udržuje organizmus především pomocí FGF23, jeho přímým fosfatúrickým efektem v ledvinách a nepřímo blokací produkce 1,25 (OH) 2 D. Přídatným vlivem je efekt PTH jehož fosfatúrický efekt v ledvinách je částečně vyrovnán i stimulací uvolnění P při kostní resorbci a stimulací tvorby1,25 (OH) 2 D(zvýšení resorbce fosfátů v tenkém střevě). Všechny kalcitropní hormony tedy jemně ladí finální koncentraci Ca a P skrze jejich vzájemné pozitivní a negativní zpětné vazby. Porucha plazmatických (sérových hladin) P a Ca je pak známkou vyčerpání či poruchy těchto regulačních mechanizmů. KAPITOLA 08 Obrázek 8p.5 Regulace Ca, Mg, P -regulační hormony a jejich zpětné vazby (tučně hlavní regulační mechanizmy) 107

108 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava Klíčové informace Základním cílem je udržení normokalcémie a normofosfatémie. Fyziologicky má lidský organizmus spíše problém zajistit dostatek vápníku a vyloučit nadbytečný fosfor. V extracelulární tekutině (ECT) je koncetrace Ca 1000x vyšší než v intracelulární tekutině (ICT) Ca a Na jsou hlavní kationy ECT a naopak Mg a K jsou hlavní kationty ICT. Kosti fungují jako depozitum pro všechny 3 složky, proto je zde zásoba Ca,Mg a P nejvyšší. KAPITOLA 08 Obrázek 8p.6 Distribuce Ca, P, Mg v organizmu Obrovský koncentrační spád Ca mezi ECT a ICT je důvodem využití Ca v regulačních a aktivačních funkcích na intracelulární úrovni. Regulace a biologický efekt jsou založeny na ionizované frakci Ca, Mg a P, které představují cca 50 % celkového hodnoty v plazmě. 108

109 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava KAPITOLA 08 Obrázek 8p.7 Formy, v nichž jsou Ca, P, Mg přítomny v plazmě Na regulaci kalcémie se podílejí : PTH, 1,25 (OH) 2 D a CT Na regulaci fosfatémie se podílejí : FGF23 PTH, 1,25 (OH) 2 D Regulace metabolizmu Mg je prakticky totožná s regulací vápníku a je tedy pravděpodobně také řízena systémem PTH- 1,25 (OH) 2 D PTH je produkována v příštítných tělískách, má hyperkalcemizující efekt a jeho produkce je řízená hladinou Ca 2+. v kostech - stimuluje osteoresorbci a uvolnění Ca, P z kostí do ECT v ledvinách - zadržuje Ca a zvyšuje sekreci P a dále stimuluje tvorbu 1,25 (OH) 2 D 1,25 (OH) 2 D je produkován v ledvinách či lokálně přímo ve tkáních z 25 (OH) D. Má efekt především v tenkém střevě, kde zvyšuje resorpci Ca a P, zároveň reguluje kostní metabolizmus a stimuluje produkci FGF23 v kostech. Kalcitonin, je produkován v parafolikulárních C buňkách štítné žlázy, v regulaci kalcémie v lidském těle má zcela minoritní roli, plní následující funkce v kostech blokuje osteoklasty a tím snižuje kalcémii v ledvinách zvyšuje sekreci Ca i P v CNS stimuluje tvorbu endorfinů - snížení bolesti FGF 23 je produkován v kostech a uvolňován do cirkulace, jeho tvorba je stimulována PTH a 1,25 (OH) 2 D, v ledvinách spolu s Klotho proteinem významně zvyšuje sekreci P do moče. Dále má zatím neobjasněné systémové funkce. Zdrojem Ca, Mg, a P je strava, vstřebávání probíhá v tenkém střevě, které je z části pasivní a z velké části řízeno 1,25 (OH) 2 D. Vstřebaný Ca, P, Mg se tak dostávají do cirkulace a v jsou ukládány do kostí či intracelulárně (Mg, P). Ukládání a 109

110 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava zpětná resorbce z kostí je řízena především1,25 (OH) 2 D a PTH. Ukládání Ca, Mg, P je multihormonální proces zahrnující 1,25 (OH) 2 D, estrogeny, androgeny, IGF1, kalcitonin, leptin atd. Naopak PTH má zásadní roli v resorbci. Vylučování probíhá v ledvinách, pasivně v proximálním tubulu, ale aktivně v distálním tubulu a výsledné množství v moči je řízeno hormonálně (PTH, CT, FGF 23) KAPITOLA 08 Obrázek 8p.8 Souhrn základních hormonálních regulačních mechanizmů homeostázy Normokalcémie dosahuje organizmus dvojím způsobem : Ca, Mg, P ( EF= exkreční frakce) a) Dostatečný příjem ze stravy za podpory 1,25 (OH) 2 D, který zároveň stimuluje produkci FGF23, ten naopak podporuje vylučování fosfátů získaných ze stravy a blokuje tvorbu 1,25 (OH) 2 D, čímž jemně balancuje celý systém, který nenarušuje integritu kostí. b) Uvolněním z kostí, což balancuje krátkodobé výkyvy hladin ionizovaného vápníku skrze zvýšení sekrece PTH. Chronicky zvýšená sekrece PTH vede k poruše kostní integrity. Uvolněný Ca a P z kostí se vylučují přímou stimulací PTH v ledvinách a pomocí zvýšení produkce FGF23 v kostech. PTH stimuluje tvorbu 1,25 (OH) 2 D a tím snahu o zvýšení fyziologického způsobu udržení kalcémie. Normofosfatémii udržuje organizmus především pomocí FGF23 přímým fosfatúrickým efektem v ledvinách a nepřímou blokací produkce 1,25 (OH) 2 D. Přídatným hormonem je PTH, jehož fosfatúrický efekt, který je částečně vyrovnán i stimulací uvolnění P při kostní resorpci a stimulací tvorby1,25 (OH) 2 D a tím zvýšené resorbce fosfátů v tenkém střevě. Porucha plazmatických (sérových hladin ) P a Ca je známkou vyčerpání či poruchy regulačních mechanizmů nebo cílových orgánů. Kalcium je důležitým regulátorem řady biologických procesů, proto je hladina ionizovaného vápníku velmi přísně kontrolována a udržována v poměrně úzkém referenčním rozmezí. Koncentrace celkového vápníku v plazmě/séru je ovlivněna koncentrací albuminu. Nejčastějším důvodem pseudo-hy- 110

111 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia - příprava pokalcémie u hospitalizovaných je hypalbuminémie (nemění se hladina ionizovaného -biologicky aktivního Ca). Změna ph mění významně hladinu ionizovaného Ca : acidóza snižuje vazbu vápníku na albumin a zvyšuje frakci ionizovaného vápníku a naopak. Fosfor je nezbytný v celé řadě intracelulárních dějů, ale trvale zvýšená plazmatická hladina je pro organizmus toxická a urychluje proces stárnutí buněk. Mimo jiné je zodpovědný za vaskulární kalcifikace u chronicky dialyzovaných nemocných. Literatura: KAPITOLA P. Broulík, Poruchy kalciofosfátového metabolismu, Grada Publishing,. Praha A. Jabor a kol, Vnitřní Prostředí, GradaPublishing, Praha, I.Sotorník, Š. Kutílek a kol.; Konstní minerály a skelet při chronickém onemocnění ledvin, Galén, Praha C.J. Rosen;, Primer on Bone Metabolic Diseases and Disorfders of Mineral Metabolism 7th Ed, ASBMR, Washington, L. de Groot, J.L.Jameson; Endocrinology 4th Edition, Vol2W.B Sounders, R. J Belin, K. He :,Magnesium physiology and pathogenic mechanisms that contribute to the development of the metabolic syndrome Magnesium Research. Volume 20, Number 2, , June 2007, 7. M.S. Razzaque: Osteo-Renal Regulation of Systemic Phosphate Metabolism 8. IUBMB Life April ; 63(4): A.Martin, V.David, L. D. Quarles REGULATION AND FUNCTION OF THE FGF23/KLOTHO ENDOCRINE PATHWAYS Physiol Rev January; 92(1):

112 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Autor: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. Recenzent: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. KAPITOLA 08 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Studijní materiál Předchozí kapitola Příprava byla věnována základní fyziologii, popisu analytů a přináší základ pro klinicko- biochemickou část - Studijní materiál. Ta je opět členěna na jednotlivé podkapitoly, tak jak přichází v úvahu užívání laboratorních metod. Zásady indikací, požadavky na odběr materiálu (variabilita a stabilita) a základy interpretace. Konečná stať Klíčové informace poskytuje sumarizaci základních důležitých faktů této kapitoly. Indikace stanovení Vyšetření kalciofosfátového metabolizmu je nedílnou součástí lékařské praxe. Volba testů odpovídá předpokládané chorobě a patofyziologickým mechanizmům vzniku. Většinou je vhodné mít komplexní pohled na koncentrace všech parametrů a hodnotit je s ohledem na klinický stav, zobrazovací metody atd. Základním vyšetření je stanovení Ca, P, Mg v plazmě či v séru a to celkových koncentrací Ca,P, Mg v plazmě a ne metabolicky aktivní, ionizované, frakce, jejichž stanovení je technologicky náročnější. Stanovení Ca, P, Mg v plazmě je poměrně necitlivý nástroj vyšetření kalcifosfátového metabolizmu, protože: Změna koncentrace vápníku při stabilním ph nastane až po vyčerpání regulačních mechanizmů tj PTH, 1,25 (OH) 2 D, kalcitoninu. Měření koncentrace vápníku je tedy relativně hrubý nástroj k detekci poruchy kalciofosfátového metabolizmu. Zvolíme-li současně stanovení PTH či 1,25 (OH) 2 D můžeme detekovat i dysbalance, které zatím nevedou k výkyvu koncentrace Ca. Sérová celková koncentrace vápníku je závislá na koncentraci albuminu. Změny koncentrace albuminu vedou ke změně koncentrace celkového Ca, aniž je zásadně změněna hladina ionizovaného Ca. Koncentrace ionizovaného Ca je závislá na aktuálním ph, provádí se na ionselektivní elektrodě současně se stanovením ph na POCT ( Point of Care Testing) analyzátorech Mg je především intracelulární kation, jeho množství v ECT v porovnání s ICT je zanedbatelné. Stanovení sérové koncentrace neodráží koncentraci tkáňovou, ale spíše jen aktuální příjem. U Ca, P, Mg je možné zobecnit, že stanovení sérových hladin celkových či ionizovaných poskytuje obraz o aktuálním stavu ve vztahu k regulačním hormonům, Stanovení odpadů Ca, P, Mg do moči poskytuje informaci o stavu zásobení v organizmu za předpokladu normální regulace v ledvinách. Pokud je funkce ledvin porušená nutné je současně hodnotit jak plazmatické, tak močové koncentrace a současně i regulační hormony. Stanovení v moči je zatíženo často velkou chybou v preanalytické části ( špatně změřený objem moči, nestabilita v roztoku nutno přidat stabilizační činidlo, HCL, zamíchat po dokončení sběru a před odebráním vzorku, nevymyté nádoby atd ), rovněž jsou velké inter individuální rozdíly v souvislosti se stravou, fyzickou aktivitou atd. Stanovení regulační hormonů : PTH, 25 OH vitamin D, 1,25 OH 2 vitamin D, kalcitonin, FGF23 provádí pouze specializovaná pracoviště a jsou velké rozdíly mezi různými výrobci. Stanovení PTH a interpretace výsledků je závislá na volbě metodiky, tj zkříženou reaktivitou s fragmenty. U stanovení 25 OH vitaminu D volba imunoanalytické metody rozhoduje zda budete měřit jak D2, tak D3 a jakém poměru. Optimální je užívat metodu stanovující 100% jak D2, tak D3. Referenční metodou je HLPC umožňující stanovit 112

113 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia veškeré frakce vitaminu D včetně metabolitů. Stanovení FGF23 patří zatím pouze mezi výzkumné metody Stanovení kalcitoninu má prakticky pouze jedinou indikaci a to v diferenciální diagnostice hypokalcémie, kde jednou z možných příčin je medulární karcinom s nadprodukcí kalcitoninu. Při podezření na poruchu regulace kalcio-fosfátového metabolizmu je často nezbytné stanovit kompletní spektrum testů počínaje plazmatickými koncentracemi Ca, P, Mg, po regulační hormony a dále odpady Ca, P, Mg v moči. Například v případě primárná hyperparatyreózy je laboratorní nález často citlivějším ukazatelem než zobrazovací metody. KAPITOLA 08 Variabilita při odběru a stabilita vzorků, odběry moči Během dne minimální diurnální rytmy kromě PTH, koncentrace jsou závislá na stravě, odběry provádět nalačno. Stanovení Ca, Mg, P: Odběr nelze do EDTA či citrátu, které vyváží veškerý Ca a Mg ve vzorku. Hemolýza zvyšuje hodnoty Mg a P Stanovení PTH, PTHrP: při odběru do EDTA jsou stabilní 24 hodin po centrifugaci při teplotě 4 8 C 25 OH vitamin D je stabilní parametr jak v séru tak v plazmě nevyžaduje jiná než běžná opatření Stabilita: Sérum: celkové koncentrace Ca, P, Mg jsou stabilní 7dní při 8 C Plná krev: maximálně 2 hodiny, hemolýza zvyšuje hodnoty P, Mg, hladinu celkového kalcia neovlivňuje. Hladinu celkového kalcia ovlivňuje koncentrace albuminu v plazmě, nízká koncentrace albuminu vede k hypokalcémii, která je pouze relativní, neboť hladina ionizovaného vápníku je většinou v normě. Korekce koncentrace Ca na albumin je vhodná provádět u všech pacientů s hypalbuminémií. Ionizované formy Ca2+ a Mg2 : odběr jako na astrup ( heparinizovaná žilní, arteriální, smíšená krev. Zpracovat do 2 hodin spolu se stanovením ph. Koncentraci ionizovaných Ca2+ a Mg2 je nutné korigovat na aktuální ph (většinou provede automaticky analyzátor) Moč : Hodnoty Ca, P, Mg jsou stabilní min 3 týdny při 20 C, 3 dny při +4 C, mají však tendenci tvořit precipitáty či sedimentovat, vzorek je nutné stabilizovat a pečlivě před analýzou promíchat. Samotný sběr moči vnáší do měření celou řadu nepřesností. Sběr je snadno realizovatelný u pacientů s močovým katetrem. U pacientů bez katetru je vysoké riziko chyby při sběru Sběr moči za 24 hodin: Důkladně vymýt nádobu na sběr moči, následně označit po ml po skončení sběru změřit celkový objem v ml. Sběrné nádoby se vymývají pouze horkou vodou bez použití saponátů a dezinfekčních prostředků Moč se sbírá od 6,00 do 6,00 h Sběr se zahajuje ráno po probuzení vymočením mimo nádobu, od té dob veškerou moč střádat do sběrné nádoby včetně noci a poslední moč je ráno po probuzení 24 hodin od zahájení sběru. Před zahájením sběru přidáte k moči činidlo 10 ml 6 M HCL. Nádoba se uchovává v temném a chladném místě, po dokončení sběru důkladně promíchat a odebrat vzorek do zkumavky a donést. Během sběru moči dodržujte běžné pitný a dietní zvyklosti. Během sběru moče je nutné dosáhnout dostatečného objemu moče vhodným a rovnoměrným příjmem tekutin. Za vhodný se považuje takový příjem tekutin, aby se dosáhlo ml moče u dospělého za 24 hodin. To znamená, že na každých 6 hodin sběru moče (kromě noci) vypije pacient asi 3/4 litru tekutin (voda nebo minerální voda). Nordinův index - 2 hodinový sběr moči Tento sběr se provádí u pacientů nalačno, sběrem moči mezi hodin. Pacient se před zahájením testu vymočí, pak vypije min 250 ml tekutiny a sbírá se veškerá moč za 2 hodiny. Proveden se stanovení Ca a kreatininu a jejich poměru. 113

114 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Nejčastější zdroje chyb při stanovení Ca, P, Mg v moči: 1. Špatně změřený obsah - důkladné poučení, ideálně speciální sběrná nádoba kalibrovaná po 50 ml. 2. Nedostatečné promíchání sběru před odebráním vzorku vede k falešně nižším koncentracím. 3. Vymytí sběrné nádoby a ponechání zbytků mycím prostředkem s fosfáty - falešně vysoký odpad fosforu. 4. Precipitace Ca, P a Mg nutná acidifikace, která ochraňuje moč před tvorbou nerozpustných komplexů. Většina preanalytických chyb u sběru moči vede k falešně nižším hodnotám. Falešně vyšší hodnoty způsobuje, je-li sbírána pouze noční a první ranní moč, kdy je zvýšený odpad jak Ca, Mg i P. V běžné ambulantní praxi většina sběrů probíhá doma a manipulace s HCL (acidifikačním činidlem) je spojena s příliš velkými riziky poškození pacienta a jeho věcí, proto se většinou provádí sběr bez činidla. Dalšími možnostmi zhodnocení odpadů Ca, P, Mg do moči jsou: 1. Přepočet odpadu kalcia za 24 hod na kg tělesné hmotnosti- velmi vhodné především o dětí a pacientů s nadváhou 2. Stanovení poměru Ca/Mg zhodnocení riziky vzniku nefrolithiazy 3. Výpočet frakčních exkrecí Ca, P a Mg a porovnání s referenčními intervaly. KAPITOLA 08 Metody stanovení: Ke stanovení celkových koncentrací Ca a Mg a P se využívají fotometrická stanovení, u hořčíku často dochází k falešnému zvýšení koncentrace při hemolýze. Stanovení koncentrace ionizovaného Ca (Ca2+ a Mg2+) se provádí pomocí iontově selektivních metod se současným stanovením ph. Odběr musí probíhat bezprostředně před měřením, měření probíhá na acidobazickém analyzátoru a hodnoty jsou korigovány na aktuální ph. Stanovení Mg2+ se provádí minimálně. Ke stanovení PTH, PTHrP a FGF23 se používajíc imunoanalytické metody, založené na principu specifické reakce antigenu a protilátky. Jedná se o velmi citlivé metodiky, kde výběr protilátky rozhoduje o specificitě stanovení, tedy zkřížené reaktivitě s příbuznými látkami či degradačními produkty. Stanovení PTHrP a FGF23 nepatří mezi rutinně zavedené testy, stanovení je tedy většinou manuální pomocí ELISA či EIA imunoanalytických metod. Stanovení PTH je běžně užívaný test dostupný na automatických imunoanalyzátorech. Současně užívané testy stanovují intaktní PTH, tj. směs intaktního 1-84 PTH( biologicky aktivního PTH) a jeho fragmentu 7-84 PTH, poměr zastoupení 35% : 65 %. Existuje v současnosti pouze několik metod stanovujících pouze 1-84 PTH( např : Diasorin, Roche) Stanovení vitaminu D I když převážnou většinu cirkulujícího vitaminu D tvoří forma D3, tak většina vitaminových doplňků obsahuje D2. Co do biologického efektu jsou ekvivaletní. Dále je nutné odlišit stanovení 25 OH D a 1,25 (OH) 2 D. Hladina 25 OH D nám poskytuje informaci o stavu zásobení vitaminem D a je tedy klíčovým stanovovaným parametrem. Stanovení aktivního hormonu 1,25 (OH) D nám poskytuje informaci o aktivitě 1α hydroxylázy v ledvinách či upozorní na možnou ektopickou produkci. Koncentraci 1,25 (OH) D, které produkují tkáně lokálně nejsme schopni detekovat. 2 2 Základní metodou stanovení je buď HPLC nebo kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrofotometrií. Tyto metody poskytují přesnou informaci o koncentracích jednotlivých frakcí izoforem D3 a D2 a také hlavních metabolitů 25 OH D a 1,25 (OH) D a i katabolitů 24,25 OH D. Stanovení je velmi přesné, specifické, ale je drahé přístrojové vybavení, 2 náročná obsluha a kapacita přístroje je menší. Imunoanalytické metody se používají prakticky výhradně ke stanovení 25 OH D, kde jsou stanovení prováděna na automatických analyzátorech, stanovení jsou méně přesná a záleží na kvalitě protilátky, zda detekuje jak D3 a D2 izoformy. Optimálně metoda detekuje stejně D3 i D2. Imunoanalytické stanovení 1,25 (OH) D vyžaduje extrakci ( přípravu vzorku), provádí se pouze manuálně na enzymatických či radioizotopových 2 metodách. 114

115 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Interpretace výsledků Referenční meze: Sérum, plazma KAPITOLA 08 Moč Ca : 2,18-2,6 mmol/l (data dárci Klatovy, n=96) Ca2+: 1,15-1,35 mmol/l Mg 0,7 1,1 (1,3) mmol/l P 0,84-1,45 mmol/l 25 OH D nmol/l Intact PTH pg/ml ( N-tact PTH, ILMA, Dia Sorin, dárci n= 96 Klatovské nemocnice/) meze jsouzávislé na metodě/ 1-84 PTH 8-28 pg/ml (ILMA, Dia Sorin, dárci n= 96 Klatovské nemocnice) Ca odpad za 24 hod referenční mez do 6,20 mmolca/24h u žen a do 7,5 mmolca/24h u mužů při průměrné tělesné hmotnosti Ca odpad za 24 h na kg referenční mez do 0,1 mmol Ca/1 kg hmotnosti Ca Nordinův index - referenční mez do 0,6 mmol Ca/mmol kreatininu Ca/Mg index referenční interval 1,0-2,0 Frakční exkrece : FE Ca do 5 %, FE P 5-20%, FE Mg do 3% Mg odpad za 24 hod : referenční interval při průměrné tělesné hmotnosti 3-5 mmolmg/24h Mg/kreatinin 0,2-0,05 mmol/mmol krea Výpočty 1. Korekční rovnice celkového Ca na aktuální hladinu albuminu v séru Ca korigované = Ca měřené (mmol/l) +0,020*(41,3 c. albuminu v g/l) 2. Korekční rovnice ionizovaného vápníku Ca2+ na ph 7,40 Ca2+ korigované ph7,40 = Ca2+měřené (mmol/l) *(1-0,53*(7,4 ph měřené)) 3. Frakční exkrece FE Ca = UCa* SKrea/ Ca2+odhad */UKrea (mmol/l) obdobně P a Mg 4. Odhad koncentrace ionizovaného vápníku Ca2+odhad = 878*SCa/(SAlbumin *15, ) SCa v mmol/l, Albuminv g/l 5. Nordinův index UCa NI = UCa/UKrea (mmol/l) 6. Litogenní index = UCa/UMg (mmol/l) Interpretace Hyperkalcémie Kromě primární hyperparatyreózy jsou dalšími nejčastějšími příčinami nádorové onemocnění s metastatickým postižením kostí při nadprodukci PTHrP, mnohačetný myelom, Pagetova choroba, granulomatózní onemocnění s nadprodukcí vitaminu D (sarkoidóza). 115

116 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Diff dg. hyperkalcémie: 1. Zvýšený příjem kalcia: Milk alkali syndrom 2. Zvýšená absorpce kalcia ve střevě 2.1. Intoxikace vitaminem D 2.2. Sarkoidóza, tuberkulóza 2.3. Akromegalie KAPITOLA Addisonova nemoc 3. Zvýšená kostní resorpce: 3.1. Primární hyperparatyreóza (sporadická, MEN 1 či MEN 2A, familiární) 3.2. Ektopická sekrece PTHrP 3.3. Tyreotoxikóza 3.4. Hematologické malignity (Osteoklasty aktivující faktor, Lymfotoxin, TNF) 3.5. Tiazidová diuretika 3.6. Lithium 3.7. Imobilizace 4. Pokles renální exkrece Familiární hypokalciúrická hyperkalcémie 5. Abnormality sérových proteinů (vzestup vázané frakce): Hyperlabuminémie, mnohačetný myelom, hyperglobulinémie, Waldenströmova makroglobulinémie Hypokalcémie: U hospitalizovaných se nejčastěji jedná o hypokalcémii relativní- snížená koncentrace celkového Ca je dána nízkou koncentrací albuminu. Z akutních stavů se jedná o hypokalcémie při akutní pankreatidě, z opakovaného podávání transfúzních přípravků obsahující citrát, tvorba komplexů při crush syndromu. Akutně vzniklá hypokalcémie se podílí i na klinických příznacích hyperventilační tetanie. Rychle navozená respirační alkalóza vede k poklesu ionizovaného vápníku (zvýšením vazby na albumin) a ke klinickým projevům hypokalcémie (tetanických křečích), které ještě dále zhoršují klinický obraz. Nejčastější chronické příčiny hypokalcémie: stavy spojené s nedostatečným příjmem vápníku a vitaminu D ( malabsorpce, osteomalácie), chronické renální selhání, hypomagnezémie. Vzácněji se jedná o hypoparatyreózu (nedostatečná tvorba PTH) nejčastěji iatrogenně navozenou nebo medulární karcinom (nadprodukce kalcitoninu). Diff dg. Hypokalcémie: 1. Hypoparatyreóza 2. Hypomagnezémie 3. Rezistence na PTH 4. Osteoklasty blokující léky (kalcitonin, bisfosfonáty) 5. Deficit vitaminu D (hereditární i získaný) 6. Rezistence k vitaminu D (porucha Vitamin D receptoru) 7. Akutní podání komplexotvorných látek či depozice kalcia 7.1. Hyperfosfatémie akutní (včetně iatrogenní) 116

117 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia 7.2. Crush syndrom s myonekrózou 7.3. Akutní pankreatitida 8. Transfúze obsahující citrát Hypofosfatémie: V akutním stavu se vyskytuje při přesunu P do ICT po podání glukózy (anabolická fáze), alkoholici. Diff dg. chronické hypofosfatémie: KAPITOLA 08 Malabsorpce Těžký deficit vitaminu D Primární hyperparatyreóza, Renální poruchy - ztráty(fanconiho sy) či nádory produkující FGF23. Nedostatek STH Hyperinzulinismus Fenylketonúrie Alkoholizmus Nádory produkující PTHrP De Toni-Debre-Fanconi syndrom = distální tubulární acidóza a glykosúrie, renální rachitis, aminoacidúrie Fosfátový diabetes = syndrom Albright Buttler-Bloomberg pozdní rachitis rezistentní na vitamín D Hyperfosfatémie : hlavní příčiny: renální selhání, hypoparatyreóza, akutní metabolická acidóza ( přesun P z ICT), crush syndrom a akutní lýza nádorových buněk Diff. dg Hyperfosfatémie: Renální selhání Hypoparatyreóza Pseudohypoparatyreóza Akutní metabolická acidóza Crush syndrom Akutní lýza nádorových buněk Addisonova choroba Nadprodukce STH Hypermagnezémie: je však poměrně vzácná Diff dg. hypermagnezémie akutní a chronické selhání ledvin, Addisonova ch.,. Akutní a chronické renální selhání Hyperparatyreóza Hypotyreóza Addisonova choroba Intoxikace lithiem 117

118 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Nadbytek antacid a laxativ obsahujících hořčík Familiární hypokalciúrická hyperkalcémie Hypomagnezémie má obdobné příčiny jako hypokalcémie, dále primární hyperladosteronismus, Bartterův sy, Gitelmanův sy, nejčastěji však při nedostatečném příjmu ve stravě, či malabsorpci nebo zvýšených renálních ztrátách, současně i s poruchou kalcia. Diff dg hypomagnezémie: Akutní respirační alkalóza Akutní pankretitida Střevní malabsorpce Renální tubulární poškození Polékové (furosemid, Aminoglykosidy, digoxin, Cis-platina Hyperkalcémie a hypofosfatémie Hyperaldosteronizmus Hypertyreóza Hypoparatyreóza Alkoholizmus KAPITOLA 08 Vitamin D Klasifikace nedostatečnosti zásobení vitaminem D dle sérových hladin 25 OH D Těžká nedostatečnost < 25 nmol/l Nedostatečnost nmol/l Mírný nedostatek nmol/l Dostatečná hladina nmol/l Riziko intoxikace > 500 nmol/l Snížené hodnoty jsou většinou způsobeny nedostatkem expozice slunečního světla (včetně užívání krémů s UV filtry) a poruchou příjmu ( malabsorbce) či poruchou konverze na aktivní vitamin D při renálním selhání. Vzácně jsou poruchy produkce 1,25 (OH) 2 D přinadprodukce FGF23. Zvýšené hodnoty nalézáme u granulomatózních onemocnění 1,25 (OH) 2 D (sarkoidóza) a při předávkováni substitučními preparáty - zvýšená hladina 25 OH D. Při předávkováni aktivními metabolity vitaminu D je imunochemické stanovení negativní (nutné detekce na HPLC, hmotnostní spektrofotometrii) PTH Laboratorní diagnostika hyperparatyreózy je založena především na vyšetření PTH, Ca, Ca 2+, a jejich odpadů do moči, v diferenciální diagnostice se doplňuje 25 OH vitamin D. Primární hyperparatyreóza postihuje nejčastěji postmenopauzální ženy, je i součástí familiárních syndromů MEN 1 a MEN2B. Většinou se jedná o adenom příštítných tělísek, zcela výjimečně o karcinom. Nejčastější příčiny sekundární hyperparatyreózy jsou : nedostatek vitaminu D, malabsorpční syndromy a kostní choroba při renálním selhání. Terciární hyperparatyreóza vzniká jako autonomní hyperplazie příštítných tělísek na podkladě původně sekundární hyperparatyreózy při renálním selhání. 118

119 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Klíčové informace: Indikace: Základním vyšetřením je stanovení Ca, P, Mg v plazmě či v séru a celkové koncentrace Ca,P, Mg v plazmě a ne metabolicky aktivní, ionizované, frakce, jejichž stanovení je technologicky náročnější. Stanovení sérových hladin celkových či ionizovaných poskytuje obraz o aktuálním stavu ve vztahu k regulačním hormonům, Stanovení Ca, P, Mg v plazmě je poměrně málo citlivý nástroj k vyšetření kalciofosfátového metabolizmu, protože změna koncentrací nastává až po vyčerpání regulačních mechanizmů. Celková koncentrace vápníku v plazmě je závislá na koncentraci albuminu. Změny koncentrace albuminu vedou ke změně koncentrace celkového Ca, aniž je zásadně změněna hladina ionizovaného Ca (pacienti mají nízké Ca, ale nemají příznaky hypokalcémie). Koncentrace ionizovaného Ca je závislá na aktuálním ph, provádí se na ionselektivní elektrodě současně se stanovením ph na POCT ( Point of Care Testing) analyzátorech Mg je především intracelulární kation, stanovení sérové koncentrace neodráží koncentraci tkáňovou, ale spíše jen aktuální příjem. Stanovení odpadů Ca, P, Mg do moči poskytuje informaci o stavu zásobení v organizmu za předpokladu normální regulace v ledvinách a je často doprovázeno velkou chybovostí při sběru vzorků Stanovení regulační hormonů : PTH, 25 OH vitamin D, 1,25 OH 2 vitamin D, kalcitonin, FGF23 provádí pouze specializovaná pracoviště a jsou velké rozdíly mezi různými výrobci a na tom je závislá interpretace Stabilita Stanovení Ca, Mg, P odběr nelze do EDTA či citrátu, které vyváží veškerý Ca a Mg ve vzorku, celkové koncentrace Ca, P, Mg jsou stabilní 7dní při 8 C, hemolýza zvyšuje hodnoty Mg a P, Stanovení PTH, PTHrP: při odběru do EDTA jsou stabilní 24 hodin po centrifugaci při teplotě 4 8 C 25 OH vitamin D je stabilní parametr jak v séru tak v plazmě nevyžaduje jiná než běžná opatření Ionizované formy Ca2+ a Mg2 :odběr jako na astrup ( heparinizovaná žilní, arteriální, smíšená krev. Zpracovat do 2 hodin spolu se stanovením ph. Moč Ca, P, Mg, : Hodnoty Ca, P, Mg jsou stabilní min 3 týdny při 20 C, 3 dny při +4 C, mají však tendenci tvořit precipitáty či sedimentovat, vzorek je nutné stabilizovat (10 ml 6Mol HCL na 24 h sběr) a pečlivě před analýzou promíchat. Metody stanovení: Ke stanovení PTH, PTHrP a FGF23 se používajíc imunoanalytické metody, ty se často liší mezi výrobci a mají tudíž rozdílné referenční meze ( rozdíly jsou ve specificitě a citlivosti testu) Současné běžně dostupné testy PTH detekují jak 1-84 PT, tak jeho fragment 7-84 PTH, Existují ale i metody měřící pouze biologicky aktivní PTH 1-84, ale mají výrazně nižší referenční meze. Optimální stanovení vitaminu D je kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrofotometrií, které stanovuje i všechny metabolity, není však rutinní, rutinně jsou zatím využívané imunoanalytické metody, které se liší ve specificitě k D2 a D3 izoformám ( optimálně měří D2 a D3 izoformy 25 OH vitaminu D stejně) Interpretace: Korekční rovnice celkového Ca na aktuální hladinu albuminu v séru Ca korigované = Ca měřené (mmol/l) +0,020*(41,3 c. albuminu v g/l) Hyperkalcémie nejčastější příčiny: primární hyperparatyreóza, nádorové onemocnění s metastatickým postižením kostí při nadprodukci PTHrP, mnohačetný myelom, Pagetova choroba, granulomatózní onemocnění s nadprodukcí vitaminu D (sarkoidóza). Hypokalcémie Akutní -rychle navozená respirační alkalóza vede k poklesu ionizovaného Ca hyperventilační tetanie Hypokalcémie chronické: stavy spojené s nedostatečným příjmem vápníku a vitaminu D ( malabsorpce, osteomalácie), chronické renální selhání, hypoparatyreóza, medulární karcinom Hypofosfatémie nejčastěji u : Malabsorbce, těžký deficit vitaminu D, primární hyperparatyreóza,renální poruchy, nádorová onemocnění KAPITOLA

120 Metabolizmus kalcia, fosforu a magnézia Hyperfosfatémie je nejčastěji u: renální selhání, hypoparatyreóza, akutní metabolická acidóza ( přesun P z ICT), crush syndrom a akutní lýza nádorových buněk 25 OH vitamin D parametr stavu zásobení vitaminem D - dostatečná hladina nmol/l (těžká nedostatečnost< 25nmol/L, často spojena se sekundární elevací PTH) Diferenciální diagnostika primární a sekundární hyperparatyreózy viz. obr KAPITOLA 08 Obrázek 8.1 Diferenciální diagnostika hyperparatyreózy (HPT) Literatura: 1. P. Broulík, Poruchy kalciofosfátového metabolismu, Grada Publishing,. Praha A. Jabor a kol, Vnitřní Prostředí, GradaPublishing, Praha, I.Sotorník, Š. Kutílek a kol.; Konstní minerály a skelet při chronickém onemocnění ledvin, Galén, Praha C.J. Rosen;, Primer on Bone Metabolic Diseases and Disorfders of Mineral Metabolism 7th Ed, ASBMR, Washington, L. de Groot, J.L.Jameson; Endocrinology 4th Edition, Vol2W.B Sounders, L. Thomas: Clinical Laboratory Diagnostics, TH-Books,

121 Stopové prvky Stopové prvky Autoři: doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA; MUDr. Milan Dastych Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, Ph.D.; prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc., MBA KAPITOLA 09 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Esenciální stopové prvky Lidský organismus, jako součást zemského ekosystému čerpá svoje elementární složení z prvků zemské kůry. Použijeme-li dostatečně citlivou analytickou metodu, můžeme v lidském těle prokázat prakticky všechny prvky Mendělejevovy periodické soustavy. Interpretace takového nálezu je ovšem velmi obtížná, je-li vůbec v současné době možná. Tab. 9.1 ukazuje procentuální (prvkové) složení zemské kůry a lidského těla. Vzhledem k převaze organické hmoty dominují v elementárním složení lidského těla stavební kameny organických sloučenin (O, C, H, N). Procentuální zastoupení prvků (%) Zemská kůra Lidské tělo O 47 Mg 2,1 O 62,8 Na 0,26 Si 28 Ti 0,4 C 19,4 K 0,23 Al 8 H 0,1 N 9,3 Cl 0,18 Fe 5 Al 5,1 Mg 0,04 Ca 4 Ca 1,4 Fe 0,009 Na 2,8 P 0,63 Zn 0,00003 K 2,6 S 0,60 Cu 0, Tabulka 9.1 Procentuální (prvkové) složení zemské kůry a lidského těla Stopové prvky se vyskytují v organismu ve velmi nízkém stopovém množství nepřesahujícím 0,01 % tělesné hmotnosti v typické koncentraci μmol/l (μg/l) a nižší. Rozdělují se na esenciální a neesenciální stopové prvky. Esenciální stopové prvky pro člověka jsou: Fe, Zn, Cu, Se, Cr, Co, Mn, Mo, I; možné esenciální stopové prvky: Al, Si, F, V, Ni; stopové prvky s dosud neznámou fysiologickou funkcí, považované za toxické těžké kovy: Pb, Cd, Hg, As, Bi, Sn, Ag, Au, Pt, Ti, Rb, Sr, Ba, Y (Tab. 2). 121

122 Stopové prvky KAPITOLA 09 Tabulka 9.2 Zařazení uvedených prvků v Měndělejevově periodické soustavě Definice esenciality Esencialita je rámcově definována vznikem specifické poruchy struktury nebo funkce tkáně či orgánu vyvolané deficitem příslušného prvku a úpravou poruchy resp. prevenci jejího vzniku při suplementaci. V současné době doplňuje definici esenciality i požadavek na znalost a popis jeho působení na molekulární úrovni včetně konkrétního fysiologického účinku v organismu. Většina esenciálních stopových prvků má důležitou funkci jako kofaktory enzymatických katalytických procesů, jako metaloenzymy a neenzymatické metaloproteiny. Deficit stopových prvků může být způsoben nedostatečným příjmem v potravě nebo jejich sníženou využitelností z potravy, sníženou resorpcí (maldigesce, malabsorpce), zvýšenými ztrátami (průjem, krvácení do GIT, exsudativní enteropatie) nebo zvýšenou potřebou (stres, horečka, sepse, nádory, traumata, popáleniny). Modelovým případem navození deficitu esenciálních stopových prvků byly počátky totální parenterální výživy bez jejich suplementace. Jsou známé četné interakce mezi stopovými prvky i ostatními nutrienty, které mohou rovněž přivodit jejich deficit v organismu. V populaci se vyskytují i geneticky podmíněné defekty významně zasahující do metabolismu stopových prvků (Zn-Acrodermatitis enteropatica, Cu-Menkes disease, Wilsonova choroba, vrozené defekty štítné žlázy, hemochromatóza). Některé stopové prvky vedle svojí esenciality vykazují vysokou toxicitu ve vyšších koncentracích (Se), jiné působí toxicky až při vysokých dávkách v souvislosti s otravou nebo chronickou často profesionální expozicí. Diagnostika deficitu esenciálních stopových prvků Diagnostika deficitu esenciálních stopových prvků se v současné době zakládá na třech principech: laboratorní stanovení obsahu stopového prvků v různých tělních tekutinách (plasma, sérum,moč,sliny) a v buňkách nebo tkáních (erytrocyty,leukocyty,trombocyty, vlasy, nehty, bioptický materiál), stanovení aktivity na stopových prvcích závislých enzymů, klinické projevy deficitu. Klinické projevy provází většinou až těžké stavy celotělového deficitu. Trvalým problém je absence dostatečně citlivého a specifického testu pro odhalení mírného a středního deficitu stopových prvků. Doporučuje se kombinovat všechny tři postupy s jejich komplexním posouzením a hodnocením respektujícím všechny dostupné znalosti o specifických i nespecifických projevech deficitu včetně ostatních vlivů na sledované parametry. Za této situace má stále vysokou vypovídací schopnost terapeutický test. Podání suspektně deficitního mikronutrientu vede v případě kauzální souvislosti k úpravě klinických i laboratorních projevů. 122

123 Stopové prvky Metodiky stanovení stopových prvků v biologickém materiálu Metodicky je pro stanovení koncentrace stopových prvků vyjma jódu nejčastěji používaná atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) s plamenovou nebo elektrotermickou atomizací. Naprostou nutností je důsledné dodržení všech kautel pro stopovou analýzu v preanalytické i analytické fázi; použití speciálních odběrových souprav, laboratorní sklo myté v kyselině, reagencie suprapure, nejvyšší kvalita používané vody a plynů (pro AAS) včetně dodržení čistého bezprašného laboratorního prostředí, zvláště nutné pro ultrastopové analýzy. KAPITOLA 09 Obecná pravidla pro adekvátní a bezpečný příjem esenciálních stopových prvků v potravě Tak, jak byla u jednotlivých stopových prvků zjišťována jejich esencialita pro lidský organismus, byly tyto esenciální stopové prvky zařazovány do doporučení pro jejich dietní příjem v potravě. V současné době je diskutována otázka definice a stanovení doporučených hodnot optimálního denního dietního příjmu esenciálních mikronutrientů (stopových prvků a vitamínů). Tato problematika má již mnohaletou historii. První doporučení Recommended Dietary Allowances (RDA) byla publikována v USA v roce Vznikla v souvislosti s válečnou situací II. světové války a zavedením přídělového potravinového systému. Obsahovala doporučené dávky živin včetně mikronutrientů, zvl. vitamínů, které měly zabezpečit jejich dostatečný příjem pro širokou populaci. Důraz byl kladen na zabránění nutričně podmíněného výskytu křivice, kurdějí a pellagry. Teprve v průběhu opakovaných revizí tohoto dokumentu byly stanoveny RDA pro esenciální stopové prvky. V současné době je RDA nahrazováno nově definovaným termínem Daily Recommended Intake (DRI), který má zastřešovat čtyři další termíny: Estimated Average Requirement (EAR), Recommended Daily Allowance (RDA), Adequate Intake (AI) a tolerable Upper Limit. V Evropě je definován Population Reference Intake (PRI). Definice uvedených pojmů se liší v detailech a ve vymezení jejich aplikace na různě stratifikovanou populaci zdravých a nemocných. Obecně splňují kritéria: minimální množství mikronutrientu předcházející vzniku specifické poruchy množství potřebné k zachování optimálního nutričního stavu denní příjem s nejmenším rizikem možného toxického účinku Z hlediska zdraví naší populace je možné konstatovat, že běžná smíšená strava je dostatečným zdrojem živin včetně stopových prvků snad s výjimkou jódu a selenu. Potravní řetězec a produkce potravin Obsah esenciálních stopových prvků v potravě souvisí významným způsobem s potravním řetězcem (půda, rostliny, hospodářská zvířata, člověk). Obsah stopových prvků v půdě, který vykazuje značné, v celosvětovém měřítku často ohromné, regionální rozdíly, může přímo ovlivnit především pasoucí se hovězí dobytek. Ostatní hospodářská zvířata, prasata a drůbež jsou v přísunu stopových prvků plně odkázána na složení připravované potravy a krmných směsí. I zde mohou vznikat a skutečně existují závažné deficitní stavy postihující celé chovy. V současné době se do určité míry snižuje vliv lokální produkce potravin vzhledem k pokračující globalizaci v rámci celosvětového obchodu, exportu a importu základních potravin. Využitelnost stopových prvků v potravě - interakce Stopové prvky jsou integrální součástí lidské stravy. Jejich zdrojem jsou především živočišné produkty, jejichž organicky vázané prvky jsou lépe pro lidský organismus využitelné než jejich anorganické formy. Pro úvahy o adekvátním příjmu esenciálních stopových prvků je třeba znát a respektovat vzájemné interakce mikro i makronutrientů a ostatních složek potravy. Nejčastější interferující látky jsou fosfáty, vláknina, kys. fytanová (inositol-hexafosfát) a jiné chelační látky. Obecně platí, že jeden element přiváděný v nadbytku může negativně ovlivnit resorpci a metabolismus ostatních. V dalším textu bude podrobně pojednáno o Jódu, Železe, Zinku, Mědi a Selenu. Ostatní esenciální stopové prvky Chrom, Cobalt, Mangan a Molybden budou zmíněny pouze okrajově vzhledem k tomu, že dosud nenašly v klinické medicíně jednoznačnou praktickou aplikaci. 123

124 Stopové prvky Jód Biochemie a metabolismus Jód se vstřebává ve střevě ve formě jodidu. Z krevní plazmy je velmi efektivně vychytáván parenchymem štítné žlázy jodidovou pumpou za účasti Na/K dependentní ATPázy pod kontrolou TSH. Účinkem tyreoperoxidázy je molekula tyrozinu postupně jodidována za vzniku mono-, di-, tri- a tetrajódtyrozinu-tyroxinu, který je uložen (koncentrován) v koloidu tyreoidálního folikulu. Hlavní účinná forma hormonu štítné žlázy trijodtyronin vzniká odštěpením jednoho atomu jódu z molekuly tetrajódtyrozinu (tyroxinu) účinkem selendependentní 5 -dejodázy. Jód se z organismu vylučuje močí. Jeho odpad koreluje s příjmem v potravě, proto lze jodurii použít k odhadu příjmu. KAPITOLA 09 Biologické funkce Jód se řadí mezi esenciální stopové prvky pro svoji jedinou, zato zcela zásadní nezastupitelnou funkci v organismu. Je nezbytný pro syntézu a tím i funkci hormonů štítné žlázy, trijodtyroninu T3 (3 atomy I) a tetrajodtyroninu T4 (4 atomy I). Při jeho nedostatečném přívodu potravou klesá syntéza T4 a T3 a jejich hladina v krvi. Na tuto situaci reaguje hypofýza, na principu negativní zpětné vazby, zvýšenou sekrecí TSH, která vede k hypertrofii štítné žlázy a později ke vzniku strumy. Prostřednictvím suboptimální funkce tyreoidálních hormonů působí deficit jodu poruchu vývoje a funkce CNS, růstu a sexuálního dozrávání, poruchu regulace energetického metabolismu, teploty a dalších funkcí. V dospělosti se projevuje komplexními příznaky myxedému většinou spolu se strumou. Zaručeným zdrojem jódu v potravě jsou mořské ryby, u ostatních rostlinných a živočišných produktů závisí na obsahu jódu v prostředí jejich vzniku. Významným zdrojem může být cílené nebo i náhodné obohacení potravinových produktů jódem (např. kontaminace mléka stopami jodových prostředků používaných k dezinfekci mlékárenských nádob a potrubí). Doporučená denní dávka jódu pro muže 150 μg, pro ženy 120 μg, v těhotenství 170 μg. Deficit příčiny; projevy Deficit jódu (IDD - Iodine Deficiency Disorders) je považován za celosvětově nejčastější příčinu poškození CNS s projevy mentální retardace, kterou by bylo možné cíleným a důsledným preventivním opatřením odstranit. Podle údajů WHO je cca 1/3 celosvětové populace (cca 2,2 mld) ohroženo projevy nedostatku jódu. Jód se přirozeně nachází v půdě a v mořské vodě. Na zeměkouli existují oblasti s velmi nízkým obsahem jódu v zevním prostředí, ve kterých je vysoký výskyt projevů jeho deficitu s markantními klinickými projevy, strumy a mentálních poruch. Nejtěžší formy poruchy intelektu na úrovni imbecility, vázané na tato území, daly vznik označení endemický kretenismus. Názvem sporadický kretenismus se označuje stejný klinický obraz způsobený vrozeným defektem činnosti štítné žlázy, který nebyl včas rozpoznán a hned po narození postiženého dítěte účinně léčen. Pozorování rozsáhlého celosvětového endemického výskytu projevů deficitu jódu vedlo ke snaze jeho odstranění širokou plošnou suplementací. Ta byla zahájena v USA v roce 1920 a v průběhu let se rozšířila na většinu deficitem jódu ohrožených míst ve více jak 140-ti zemích světa. Z mnoha možných způsobů suplementace jódu se osvědčila jako optimální jodizace kuchyňské soli. Sůl je dostupná všem socio-ekonomickým skupinám, vykazuje rovnoměrný příjem bez sezonních výkyvů, nehrozí předávkováním, jodizace přídavkem KI je jednoduchá a levná. Diagnostika deficitu Deficit jódu je provázen poklesem hladiny tyreoidálních hormonů (ft4, ft3) a zpětnovazebně zvýšeným TSH. Při nedostatečném příjmu jódu v potravě klesá jeho vylučování močí (jodurie), < 20 μg /l svědčí pro závažný deficit proti normální hodnotě μg/l. 124

125 Stopové prvky Toxicita Nadbytečný příjem jódu může provázet excesivní příjem mořských produktů, většinou však bez zřetelných somatických známek. Iatrogenně způsobený nadbytečný příjem (např. KI) může vyvolat příznaky hyperfunkce štítné žlázy včetně hyperfunkční strumy. Železo KAPITOLA 09 Je nejhojněji zastoupeným esenciálním stopovým prvkem v lidském těle. Rozsahem celosvětového výskytu jeho deficitu je podobný jódu. Biochemie a metabolismus Většina železa je v organismu vázána v hemoglobinu (60 %), zbývající část v myoglobinu, feroproteinech a železo-dependentních enzymech. Metabolická cesta železa z potravy do cílových molekul v buňkách, tkání a orgánů vyžaduje součinnost různých systémů. Většinová forma železa v potravě (Fe 3+ ) musí být před absorpcí v tenkém střevě redukována na Fe 2+. Redukci napomáhá HCl v žaludeční šťávě, vitamin C, kyselina citronová a mléčná. Po absorpci je železo opět oxidováno účinkem ceruloplasminu (také nazývaným ferooxidáza) a vestavěno do molekuly transferinu. Transferin přivádí železo k buňkám, do kterých je inkorporováno prostřednictvím povrchových receptorů. V kostní dřeni je železo vestavěno do hemoglobinu, ve svalech do myoglobinu a v ostatních buňkách do železo dependentních enzymů a rezervních metaloproteinů (feritin, hemosiderin). Na denní ztrátě železa (0,35 mg) se podílí okultní ztráty krve zažívacím traktem, žlučí, kůží a močí (80 μg). Tyto ztráty mohou významně stoupnout při onemocnění GI traktu, zvláště krvácení a u žen poruchami menstruačního cyklu. Denní potřeba závisí na věku a pohlaví, kvalitě a složení stravy a velikosti ztrát; pro muže 10 mg a pro ženu 15 mg (v těhotenství 25 mg). Biologické funkce Biologická funkce železa je úzce spjata s kyslíkovým energetickým metabolismem. Šestivazebné železo v hemoglobinu (čtyři valence směřují k dusíkům čtyř pyrolových jader, pátá vazba poutá histidin globinu a šestá valence je volná pro kyslík) zajišťuje jedinečným způsobem transport kyslíku do tkání a buněk, kde oxidoredukční řetězce cytochromů (Fe 2+ Fe 3+ ) uvolňují energii pro tvorbu makroergních fosfátových vazeb ATP. Primárně je železo nezbytné pro syntézu hemoglobinu v erytrocytech. Při jeho nedostatku vzniká mikrocytární hypochromní anémie. Deficit příčiny; projevy Deficit železa je nejčastěji se vyskytující nutriční deficit a nejčastější příčina anemie mil. osob trpí sideropenickou anémií. Sideropenická anémie je nejčastější onemocnění krve v dětském věku. Deficit železa v organismu vzniká při nevyrovnaném vztahu mezi jeho příjmem a zvýšenými případně i jen obligatorními ztrátami. U žen je vzhledem ke krevním ztrátám při menstruaci výskyt deficitu železa častější. Příčinou může být rovněž nevhodné složení stravy s nízkým obsahem železa, přítomnost látek, které snižují jeho využitelnost (kyselina šťavelová a polyfenoly v kávě, čaji a čokoládě, které tvoří s železem nerozpustné komplexy) případně i v nadbytku přiváděné stopové prvky (Zn, Cu, Mn), které kompetitivně snižují resorpci železa ve střevě. Diagnostika deficitu Markantní deficit železa v organismu vede ke vzniku hypochromní mikrocytární anémie. K potvrzení etiologické role deficitu železa lze použít stanovení železa, saturace transferinu, feritinu a solubilních transferinových receptorů v séru viz Tab

126 Stopové prvky S-železo 9,0-30,0 μmol/l Saturace sérového transferinu < 16 % S-feritin < 15 μg/l S-solubilní transferinové receptory > 8,5 mg/l Tabulka 9.3 Laboratorní parametry k dg anémie z deficitu železa KAPITOLA 09 Toxicita Typické projevy toxického působení nadbytku železa v organismu provází hemochromatózu s vrozenou abnormálně vysokou absorpcí železa ve střevě vedoucí k poškození jater, diabetu a kožním pigmentacím (bronzový diabetes). Sekundárně může jít o excesivní perorální příjem železa nebo abundantní transfuze. Toxicita železa souvisí s jeho prooxidačním působením. Fe 3+ v nadbytku nevázané na vazebné bílkoviny může působit zvýšenou produkci volných radikálů a oxidativní poškození tkání. Molekulární úroveň (Pato)fysiologické funkce Klinické projevy Fe-metaloenzymy Cytochromy c kyslíkový energetický metab. hypoxie Cytochromy P450 transformace xenobiotik neúčinnost/toxicita léků Fe-proteiny hemoglobiny transport kyslíku v krvi hypoxie myoglobin kyslíkový metab. ve svalech, intracel. transport O 2 transferin transportní protein Fe, prot.akutní fáze anemické stavy feritin prot. zásobní formy Fe anemické stavy hemosiderin prot.střádající nadbytek Fe Tabulka 9.4 Molekulární základ klinických projevů deficitu železa (příklady) Zinek První kompletně klinicky a laboratorně dokumentovaná pozorování těžkého deficitu zinku popsal poprvé u člověka prof. Prasad v roce 1961 v Iránu. Přesto teprve objev Barnese a Moynahana (1970) role zinku v etiologii a klinických příznacích Acrodermatitis enteropathica a kauzální léčba s kompletním ústupem příznaků po suplementaci zinku vedl k jeho zařazení mezi esenciální stropové prvky s určením jeho RDA (1974). Biochemie a metabolismus zinku Celkový zinek v plazmě (13-18 μmol/l) zahrnuje zinek volně vázaný na albumin, pevněji vázaný na ostatní bílkoviny plazmy, zvl. alfa-2-makroglobulin, difuzibilní zinek vázaný na plazmatické aminokyseliny, zvl. histidin, cystein a lysin a malý podíl ionizovaného zinku. Plazmatický zinek představuje jen asi 0,1 % celkového obsahu zinku v organismu. Doporučená denní dávka zinku v běžné smíšené stravě obsahující živočišné bílkoviny se pohybuje mezi 8-15 mg/den. Na výdejové straně bilance zinku to jsou především jeho ztráty zažívacím traktem, stolicí μmol/den (1-2 mg/den), močí 7,5 μmol/den (0,5 mg/den) a potem 7,5 μmol/den (0,5 mg/den). 126

127 Stopové prvky Biologické funkce zinku V současné době je známo více jak 200 enzymů, které pro svoji funkci vyžadují přítomnost zinku ve své molekule. Zastoupeny jsou téměř všechny skupiny enzymů, jejichž prostřednictvím se zinek plošně zúčastňuje metabolismu glycidů, lipidů, bílkovin a nukleových kyselin včetně mnoha dalších metabolických pochodů. Zinek je potřebný pro syntézu a metabolismus nukleových kyselin (DNA, RNA) a má tak, jejich prostřednictvím, těsný vztah k rychlosti buněčného dělení a tím i k růstu, diferenciaci, morfogenezi, regeneraci, hojení ran apod. Jako součást Zn,Cu-superoxiddismutázy je zinek nezbytnou součástí antioxidační obrany buněk proti účinku superoxidových.- radikálů (O 2 ). Zinek je důležitý pro udržení integrity a správné bariérové funkce kůže. Těžký deficit je provázen různými kožními změnami, parakeratózou, vesikulopustulózním exantémem s krustami a častou infekcí s maximem změn cirkumorálně, v genitoanální oblasti a na akrech končetin. Nejvíce vyjádřené příznaky provázejí enteropatickou akrodermatitidu s defektem vstřebávání zinku ve střevě. Velmi komplexní je účast zinku v efektivním působení imunitního systému. Postižena je především buněčná část imunity, klesá počet a diferenciace T-lymfocytů, klesá poměr subpopulace T4+/T8+ lymfocytů. Průvodním jevem je atrofie thymu provázená výrazným poklesem koncentrace thymulinu v plazmě. Klinickým projevem vlivu deficitu zinku na imunitní funkce může být snížená odolnost k infekcím, recidivující infekty, chronické kožní a slizniční zánětlivé afekce. KAPITOLA 09 Deficit zinku příčiny; projevy Deficit zinku může v závislosti na své tíži vyvolat těžké, život ohrožující stavy včetně vývojových vad, retardace růstu a pohlavního dozrávání nebo jen diskrétní kožní změny, mírné snížení vzrůstu, poruchu chuti, šeroslepost nebo vyšší náchylnost k různým infektům. Deficit zinku v organismu může obecně způsobit jeho snížený příjem, zvýšené ztráty, zvýšená potřeba nebo kombinace těchto vlivů. Živočišné produkty představují hodnotnější zdroj zinku vzhledem k jeho vyšší využitelnosti při resorpci v zažívacím traktu. Pro vegetariány jsou nejlepším zdrojem zinku luštěniny a ořechy Porucha resorpce zinku provází chronické střevní choroby typu Crohnovy choroby, coeliakální sprue, ulcerózní kolitidy, chronických průjmů, jejunálního bypasu, insuficience zevní sekrece pankreatu apod. Zvýšené ztráty zinku, především močí, provází stavy se zvýšeným katabolismem, jako jsou popáleniny, polytraumata, sepse, neuroinfekce apod. Zvýšená potřeba zinku je typická pro období rychlého růstu, těhotenství, laktaci a anabolickou fázi po těžké zátěži s katabolismem. Diagnostika deficitu Nejčastěji je vzhledem k dostupnosti odběru vyšetřován zinek v séru. Vždy je třeba znát současně hladinu albuminu (hypalbuminémie působí snížení zinkémie) a CRP. Infekce a zánět působí prostřednictvím cytokinů redistribuci zinku z plazmy do buněk a snížená koncentrace zinku v séru tak nesvědčí pro jeho celotělový deficit. Velkým preanalytickým problémem je zabránění kontaminace sběrných a transportních nádob. Hrubé chyby může způsobit i krátkodobý kontakt krve nebo moče s gumovou zátkou. Guma obsahuje jako plnidlo ZnO a eluce zinku z ní je velmi rychlá. Zkoušelo se rovněž stanovení zinku v leukocytech, trombocytech, vlasech a svalech bez širšího praktického využití. Nadějné se zdálo být stanovení aktivit buněčných zinek-dependentních enzymů. Např. erytrocytární karboanhydrázy, leukocytární alkalické fosfatázy, erytrocytární Zn,Cu-superoxiddismutázy apod., i když dosud neexistuje zcela jednoznačná a jednotná interpretace nálezů. Vzhledem k obtížnému jednoznačnému laboratornímu průkazu zvláště hraničního deficitu zinku, je při klinickém podezření na celotělový deficit indikován terapeutický test. Příznaky vyvolané deficitem zinku po jeho suplementaci promptně mizí. Dosud neuzavřená je problematická substituce zinku v akutních stavech kriticky nemocných pacientů s hypozinkémií (stejně 127

128 Stopové prvky jako v případě železa). Toxicita zinku Zinek je relativně málo toxický prvek. Akutní a chronické otravy zinkem jsou popsány jako choroby z povolání osob vdechujících páry nebo jemný prach kovového zinku (horečka slévačů) s pocitem malátnosti, bolestí hlavy, kašlem, třesavkou a teplotou. Molekulární úroveň (Pato)fysiologické funkce Klinické projevy Zn-metaloenzymy Thymidinkináza DNA polymeráza Metabolismus nukleových kyselin Buněčné dělení, růst, regenerace Opoždění růstu, trpasličí vzrůst, špatné hojení ran KAPITOLA 09 Zn,Cu-superoxiddismutáza Antioxidační obrana Projevy oxidačního stresu Retinoldehydrogenáza Regenerace zrakového purpuru Šeroslepost Kolagenáza Metabol. kolagenních fibril Poruchy pojiva Zn-proteiny Metalothionein Genová regulace, finger-zn-proteiny a exprese genů různých proteinů Metabolismus esenciálních a ostatních stopových prvků Stabilizace buněčných membrán Snížená exprese genů různých prot., buněčný růst, diferenciace, morfogeneza Příznaky deficitu, toxicity prvků Vývojové vady neurál. trubice, spina bifida, meningokela, anencefalie Spermatogeneza Bariérové funkce kůže Snížení počtu spermií, snížená hladina testosteronu, hypogonad. Parakeratóza, vesikulopapilózní exantém, genitoorálně, akra Thymulin Diferenciace T-lymfocytů, chemotaxe, antigenní odpověď T bb. Snížená odolnost k infekcím, recidivující infekty, chron. kožní a slizniční zánětlivé afekce Receptory glukokortikoidů, estrogenů Specifická vazba kortizolu, estrogenů Hormonální poruchy Tabulka 9.5 Molekulární základ klinických projevů deficitu železa (příklady) Měď Měd je po železe a zinku třetím nejhojněji zastoupeným esenciálním stopovým prvkem v lidském těle. V rutinní klinické praxi se s poruchou metabolismu mědi setkáváme především v rámci diferenciální diagnostiky a sledování Wilsonovy choroby (hepatolentikulární degenerace). Biochemie a metabolismus mědi Měd je široce rozšířena v biologických tkáních, kde se nachází ve formě organických komplexů, většinou metaloproteinů a metaloenzymů. 128

129 Stopové prvky V krvi je měd v zásadě rozdělena mezi erytrocyty a plazmu. V erytrocytech je většina mědi obsažena v Cu,Zn-superoxiddismutáze. V plazmě se fyziologicky koncentrace mědi pohybuje mezi μmol/l. U žen je koncentrace mědi v plazmě asi o 10 % vyšší, zvyšuje se až na trojnásobek v pozdním stádiu těhotenství a zvýšena je i u žen užívajících kontraceptiva na bázi estrogenů. Spolu s ceruloplasminem se zvyšuje v rámci nespecifické reakce na stresovou zátěž (úrazy, operace, maligní nádory, biliární obstrukce apod.). Metabolismus mědi je velmi těsně spojen se syntézou a funkcemi ceruloplasminu. Ceruloplasmin je plazmatická bílkovina, syntetizovaná v játrech, obsahující 6-7 atomů mědi a vykazující významnou enzymovou oxidázovou aktivitu. V ceruloplasminu vázaná měd tvoří % její plazmatické koncentrace. Zbývajících 7 % je volně vázáno na albumin a některé plazmatické aminokyseliny. Hlavní cestou vylučování mědi je její exkrece žlučí ve formě špatně vstřebatelných komplexů, které odcházejí se stolicí. Močí se za normálních okolností vylučuje jen velmi malé množství (32-64 μg/24 hod, 0,5-1,0 μmol/24 hod). Vzhledem k vysoké reaktivitě jsou atomy mědi v organismu transportovány, extra i intracelulárně, vázané na různé transportní nosiče. Transportní systém mědi v plazmě je tvořen ceruloplasminem, albuminem a některými aminokyselinami. Měd resorbovaná ve střevě je navázaná na albumin přes aminodusík a imidazolový dusík histidinu a portální krví přenesena do jater. Zde je vestavěna do ceruloplasminu a s ním uvolněna do cirkulace. KAPITOLA 09 Biologické funkce mědi Četné fysiologické funkce mědi jsou odvozeny od známých aktivit měď-dependentních metaloenzymů. K těmto aktivitám patří především působení ceruloplasminu jako ferroxidázy I. v metabolismu železa a hemoglobinu a enzymu lysyloxidázy, který je klíčovým enzymem při síťování (cross-linking) pojivových tkání. Významná oxidázová aktivita ceruloplasminu v plazmě působí jako esenciální prostředek oxidace dvojmocného (Fe 2+ ) na trojmocné železo (Fe 3+ ). Tím je umožněna mobilizace zásobního železa z feritinu, jeho vestavění do transferinu a použití pro syntézu hemoglobinu. Lysyloxidáza katalyzuje oxidaci lysylových a hydroxylysylových zbytků v polypeptidových řetězcích elastinu a kolagenu. Kondenzací vzniklých aldolových skupin vznikají konfigurace přemosťující polypeptidické řetězce se zásadním významem pro pevnost, pružnost a ohebnost nejdůležitějších vláknitých bílkovin pojivové tkáně. Samostatnou jednotku v patofysiologii mědi představuje Wilsonova choroba, geneticky podmíněná choroba s familiárním výskytem. Patognomickým podkladem je výrazně omezená inkorporace mědi do ceruloplasminu a její snížené vylučování žlučí. To vede k pozitivní bilanci mědi a její postupné akumulaci v játrech. Zvyšuje se na ceruloplasmin nevázaná měď v plazmě, což vede ke zvýšenému vylučování mědi ledvinami a k jejímu ukládání do dalších extrahepatických tkání, především rohovky, kde tvoří známý Kayser-Fleischerův prstenec, do mozku především v oblasti bazálních ganglií, do ledvin, svalů a kostí. Typickým laboratorním nálezem je snížená až nulová koncentrace ceruloplazminu. Měď v séru je většinou souhlasně s ceruloplasminem snížená, můžeme však zjistit normální nebo zvýšenou hodnotu. V tomto případě se jedná o tzv. volnou, na ceruloplasmin nevázanou měď, která je toxická, svědčí pro dekompenzaci choroby s častou průvodní intravaskulární hemolýzou. Je zvýšené vylučování mědi močí. V játrech lze prokázat zvýšený obsah mědi (víc jako 300 μg/g suché tkáně). Velmi pečlivě a důsledně je třeba vyšetřit i sourozence postižených jedinců vzhledem k vyšší pravděpodobnosti výskytu metabolického defektu mědi v rodině. Aktivním přístupem v diagnostice Wilsonovy choroby lze předejít opožděným diagnózám se vznikem trvalých následků. Deficit mědi příčiny; projevy Čistě nutričně podmíněný těžký deficit mědi s klinickými projevy je spíše vzácný. Může se objevit u kojenců s umělou výživou, při nevhodně stopovými prvky zajištěné realimentaci po těžkých malnutričních a katabolických stavech a v průběhu dlouhodobé nedostatečně balancované parenterální výživy. Častěji se rozvinutý deficit mědi objevuje v rámci enteropatií a malabsorpce nejrůznějšího původu. Nejbohatším zdrojem jsou játra, humří maso, ústřice, dále ořechy, hrách a čokoláda. Vzácně se vyskytující dědičnou poruchou metabolismu mědi s fatálním průběhem a s klinickými projevy jejího deficitu je tzv. 129

130 Stopové prvky Menkes disease. Příčinou choroby je porucha resorpce, transportu a utilizace mědi Laboratorní diagnostika deficitu mědi Na deficit mědi může upozornit snížená hladina ceruloplasminu a mědi v séru. Konstantním příznakem deficitu mědi je hypochromní mikrocytární anemie nereagující na podání železa a leukopenie. Významné změny jsou patrné na kostech, zvláště u dětí. Jedná se o známky osteoporózy, pohárkovitě rozvlákněné metafýzy dlouhých kostí a periostální apozice provázené zvýšenou aktivitou alkalické fosfatázy v séru. KAPITOLA 09 Toxicita mědi Vdechovaná ve formě aerosolu nebo jemného prachu vyvolává příznaky akutní intoxikace "horečku z kovů" s příznaky stejnými jako v případě zinku, kašlem, třesavkou, teplotou, malátností a bolestí hlavy. Molekulární úroveň (Pato)fysiologické funkce Klinické projevy Cu-metaloenzymy Cytochrom c oxidáza transport elektronů v dých. řetězcích nespecifické, por. erytropoézy Superoxidismutáza scavanger superoxid. radikálů projevy oxidačního stresu Monoaminooxidáza metabol. katecholaminů nespec. poruchy CNS Tyrosináza syntéza melaninu poruchy pigmentace kůže Lysyloxidáza metabol. pojiva, cross-links poruchy kolagenu, cutis laxa, laxita kloubů Cu-proteiny Ceruloplasmin prot. akutní fáze, oxidace Fe 2+ anemie Metalothionein vazba a transport. Cu v buňkách deficit/toxicita Cu Tabulka 9.6 Molekulární základ klinických projevů deficitu železa (příklady) Selen Selen je na rozdíl od zinku a mědi z medicínského pohledu značně kontroverzní prvek. Do veterinární a humánní medicínské praxe vstoupil ve 30. letech minulého století svým zařazením mezi nejvíce toxické prvky. Překvapivé bylo zjištění jeho esenciality a závažných projevů deficitu. V oblastech s nízkým příjmem selenu je uvažován příznivý vliv jeho substituce na snížení výskytu nádorů přičemž seleno-sulfid je považován za kancerogen, má antioxidační, ale i prooxidační vlastnosti. Je zřejmé, že struktura atomu propůjčuje selenu v jeho sloučeninách rozmanité a mnohdy protikladné fyzikálně chemické a biologické vlastnosti. Selen je proto stále předmětem intenzivního základního i aplikovaného výzkumu v technických i biologických oborech. Biochemie a metabolismus Selen je součástí četných metaloenzymů a metaloproteinů, ve kterých se nachází převážně ve formě selenomethioninu a selenocysteinu. Selenomethionin je výhradně rostlinného původu a představuje kolem 50 % denního příjmu selenu. Slouží mimo jiné také pro syntézu selenocysteinu v organismu % selenu v plazmě je vázáno na selenoprotein-p, 30 % v glutathionperoxidáze (GSHPx-3) a zbývající část na albumin a v selenomethioninu. Referenční meze v naší populaci, spíše nižší v evropském měřítku, jsou 0,8-1,4 μmol/l. 130

131 Stopové prvky Doporučená denní dávka pro dospělého je 55 μg. Obiloviny, luštěniny a zvláště ořechy jsou vhodným zdrojem selenu. Biologické funkce Selen je zapojen v obraně tělesných tkání proti oxidativnímu stresu, v obraně proti infekci, modulaci růstu a vývoje. Existují dvě skupiny selen-dependentních enzymů. V první jsou glutathion peroxidázy ve čtyřech isoformách a thioredoxin reduktáza, které působí v antioxidační ochraně proti reaktivním kyslíkovým radikálům. Druhou skupinu tvoří tři typy selen-dependentních 5 deiodináz, které jsou nezbytné pro konverzi tyroxinu (tetrajódtyroninu T4) na fysiologicky účinnější (aktivnější) trijódtyronin (T3). Tyto tři isoformy se liší svým zastoupením a funkcí v různých tkáních a orgánech. Je známý současný výskyt deficitu selenu i jódu a jejich synergie v projevech hypotyreodismu. Je důležitý pro spermatogenezu a správnou funkci spermií, metabolismus a funkci svalů a imunitu organismu. KAPITOLA 09 Deficit - příčiny; projevy Při vzniku nutričně podmíněného deficitu selenu se zásadním způsobem (významným) uplatňuje regionální obsah selenu v půdě na začátku potravního řetězce. Klinické projevy těžkého deficitu selenu popsané níže se v naší populaci nevyskytují. Velmi podobné projevy nejsou však vzácné v různých chovech hospodářských zvířat i u nás. Kashin-Beck disease je endemická, chronická osteoartropatie dětí v Číně, Rusku a Koreji, která primárně postihuje chrupavky kloubů (atrofie, degenerace, nekrózy) s markantními projevy deformovaných artrotických kloubů. Zjevným projevem je i snížení postavy vlivem multifokálních nekróz v oblasti růstových plotének dlouhých kostí. Tuto klinickou jednotku popsal poprvé Kashin v oblasti Bajkalu (1848) a Beck v Číně (1906). Etiologie choroby není dosud zcela jasná. Kromě deficitu selenu se uvažuje i o účinku plísní kontaminovaného obilí a dalších faktorech. Keshan disease endemicky postihuje především děti a mladé ženy v oblastech Číny s nízkým obsahem selenu v půdě. Dominujícím patologicko anatomickým nálezem jsou multifokální nekrózy myokardu, které vedou k dilataci srdce, městnavému srdečnímu selhání a smrti. I když se incidence akutních a subakutních případů choroby dramaticky snížila po suplementaci selenu, je etiologická role selenu v poslední době směřována spíše do podoby predisponujícího faktoru. Klinické projevy deficitu selenu, v našich podmínkách hlavně v rámci malnutričních stavů, jsou nespecifické a komplexní tak, jak dosud nespecificky dovedeme definovat účinky zvýšeného oxidačního stresu v organismu. Populace žijící v oblastech s nízkým obsahem selenu v půdě (severské státy, ale i ČR) mají jeho nižší koncentraci v séru. Vzhledem k celosvětové globalizaci potravinových zdrojů a živočišné velkovýrobě (krmné směsi apod.) ztrácí půdní potravinový řetezec poněkud na bezprostředním významu. Dosud neuzavřená je diskuse o případné potřebě celoplošné substituce selenu v naší populaci. Laboratorní diagnostika deficitu Nejčastějším postupem je stanovení koncentrace selenu v krvi, plazmě nebo séru pomocí atomové absorpční spektrometrie. Použitelnou metodou je rovněž stanovení aktivity GSHPx v erytrocytech, případně koncentrace selenoproteinu-p. Při hodnocení nálezů výše uvedených metod je třeba počítat s tím, že jsou všechny uvedené parametry ovlivněny redistribucí a plazmatickým poklesem při stresu, poranění, zánětu apod. Toxicita selenu Z rostlin rodu Astragalus, kterých existuje ve světě více jak 1500 druhů, pouze asi 25 patří mezi tzv. primární akumulátory selenu, které jsou schopné akumulovat selen z půdy s jeho běžným obsahem do vysoce toxických koncentrací (až 1000 ppm). Sekundární akumulátory selenu jsou rostliny, které jej akumulují v oblastech s jeho vysokým obsahem v půdě. V obou případech působí jejich konzumace u hospodářských zvířat letální onemocnění označované jako alkali disease u hovězího dobytka a blind staggers (motolice) u ovcí. 131

132 Stopové prvky U lidí se chronický toxický účinek selenu projevuje stejně, jako u zvířat: lomivostí, změnami a vypadáváním vlasů, změnami na nehtech (lomivost, praskliny, barevné změny) včetně typického zápachu dechu po česneku.toxicita selenu spočívá v jeho interakci s thioly, selenit reaguje s glutathionem a H 2 Se za vzniku superoxidového radikálu (O 2.- ). Následná peroxidace biogenních molekul a membrán představuje molekulární základ toxického účinku určitých forem selenu. Molekulární úroveň (Pato)fysiologické funkce Klinické projevy Se-metaloenzymy Glutathionperoxidázy (1,2,3,4) rozklad anorg. a org. peroxidů projevy oxidačního stresu Thioredoxin reduktáza Intracelulární redox stav dtto 5 -deiodinázy (1,2,3) přeměna tyroxinu na trijodtyronin projevy hypotyreózy? metabolismus pojivové tkáně poruchy pojiva KAPITOLA 09 Se-proteiny Selenoprotein-P zásobní forma Se v plazmě projevy deficitu Selenoprotein-W forma Se ve svalech projevy deficitu Selenoprotein-spermie správná funkce spermií infertilita? Tabulka 9.7 Molekulární základ klinických projevů deficitu železa (příklady) Chrom Chrom hraje roli v zajištění normálního metabolismu glukózy a cholesterolu, má vliv na spermatogenezu a fertilitu. Pro stanovení denního příjmu nejsou k dispozici dostatečně validní data. Případy deficitu chrómu jsou vzácné, snad v rámci těžkých případů malnutrice. Deficit chrómu může být příčinou porušené glukózové tolerance, hypercholesterolémie, sníženého počtu spermií a porušené fertility. Cr 3+ má vysoký alergogenní potenciál, který vede k častému výskytu profesionálního kontaktního ekzému u pracovníků ve stavebnictví (cement), kožodělném průmyslu, tiskárnách a kovodělném průmyslu. Mangan Mangan je součástí četných metaloenzymů (argináza, pyruvátkarboxyláza, Mn-superoxiddismutáza v mitochondriích,...). Nespecificky aktivuje některé enzymy (hydrolázy, dekarboxylázy a transferázy) u nichž může být jeho funkce nahrazena jinými stopovými prvky (Fe, Cu,...). Projevy deficitu jsou nespecifické. Molybden Molybden je součástí tří metaloenzymů (xantinoxidáza, aldehydoxidáza a sulfitoxidáza). Je popsán vrozený deficit molybdénu s mortalitou do jednoho roku života. 132

133 Stopové prvky Cobalt Jediná znám funkce, která určuje esencialitu kobaltu, je jeho přítomnost v molekule vitaminu B 12 (Cobalamin). Referenční meze; odpady močí; doporučené dávky (Tab) KAPITOLA 09 ref. meze (sérum) odpad močí za 24 hod. dop. denní dávka (per os) dop.denní dávka (parenterálně) Zinek 10,7-18,4 µmol/l 3,0-12,0 µmol mg 3,2-6,5 mg µg Měď M 11,0-22,0 µmol/l 0,5-0,9 µmol 0,9-1,2 mg 0,3-1,3 mg Ž 12,6-24,3 µmol/l µg Železo M 11,6-30,4 mol/l 1,8-3,6 µmol M 10 mg 1,2 mg Ž 9,0-27,0 µmol/l µg Ž 15(25 * ) mg Selen 0,7-1,24 µmol/l 0,1-1,3 µmol 55 µg µg µg Jód 0,28-0,25 µmol/l 0,8-1,6 µmol µg 130 µg µg Chrom 1,0-10,0 nmol/l 9,6-38,5 nmol µg µg 05-2,0 µg Mangan 7,0-13,0 nmol/l 9,0-36,0 nmol 2-5 mg 0,2-0,3 mg 0,5-0,2 µg Molybden 1,0-30,0 nmol/l nmol µg 50 µg 19 µg Kobalt 1,9-7,6 nmol/l 8,8-35,1 nmol 0,5-2,0 µg Tabulka 9.8 Refrenční meze, odpady močí, doporučené perorální a parenterální dávky esenciálních stopových prvků ( * gravidita) 133

134 Stopové prvky Obsah esenciálních stopových prvků ve farmaceutických přípravcích Parenterální přípravky (Tab) KAPITOLA 09 TRACUTIL [10 ml] ADDAMEL [10 ml] ELOTRACE [100 ml] Zinek 3,3 mg 6,6 mg 6,0 mg Měď 0,76 mg 1,3 mg 1,2 mg Železo 2,0 mg 1,1 mg 1,1 mg Selen 24 µg 32 µg 12 µg Jód 127 µg 127 µg 127 µg Chrom 10 µg 10 µg X Mangan 550 µg 110 µg 300 µg Molybden 10 µg 20 µg 20 µg Fluor 570 µg 950 µg 950 µg Tabulka 9.9 Obsah stopových prvků v přípravcích pro parenterální podání Enterální přípravky (Tab) NUTRIDRINK [100 ml] FRESUBIN [100 ml] NUTRISON [100 ml] Zinek 2,9 mg 1,5 mg 1,8 mg Měď 0,43 mg 0,3 mg 0,27 mg Železo 3,8 mg 2,0 mg 2,4 mg Selen 14 µg 10 µg 8,5 µg Jód 132 µg 30 µg 20 µg Chrom 16 µg 10 µg 10 µg Mangan 800 µg 400 µg 500 µg Molybden 24 µg 15 µg 15 µg Fluor 200 µg Tabulka 9.10 Obsah stopových prvků v přípravcích pro enterální podání 134

135 Stopové prvky Literatura 1. Clinical Chemistry; technics, principles, correlations. Sixth eddition. M.L.Bishop, E.P.Fody, L.E.Schoeff. Wolters Kluwer/ Lippincott Williams&Wilkins, Burtis C. A., Ashwood E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th. Edition, Elsevier, Saunders, Bogden J.D., Klevay L.M.: Clinical Nutrition of the Essential Trace Elements and Minerals. Humana Press, Burtis C.A., Ashwood E.R., Bruns D.E.: TIETZ Fundamentals of CLINICAL CHEMISTRY. Saunders Elsevier, 2008 KAPITOLA

136 Vitamíny - příprava Vitamíny - příprava Autoři: MUDr. Michaela Králíková, Ph.D.; MUDr. Milan Dastych Recenzent: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. KAPITOLA 10 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Vitaminy Člověk přijímá potravou hlavní živiny (sacharidy, bílkoviny a tuky), kromě nich však musí potrava obsahovat další látky, které jsou nepostradatelné, protože nemohou v těle vznikat přeměnou jiných složek. Patří mezi ně zejména esenciální aminokyseliny, esenciální mastné kyseliny, minerální látky a vitaminy. Vitaminy se rozdělují podle rozpustnosti v tucích a ve vodě. Tato klasifikace mj. pomáhá odhadnout, ve kterých potravinách se daný vitamin může vyskytovat a za jakých okolností můžeme očekávat jeho deficit. Vyvážená strava připravená z čerstvých potravin obvykle obsahuje potřebná množství všech vitaminů. Dlouhodobě nízký přívod některého z vitaminů může vyvolat buď hypovitaminózy s nespecifickými příznaky nebo vážnější poruchy s charakteristickými příznaky (avitaminózy). Deficit vitaminů může vzniknout též jako důsledek poruchy jejich vstřebávání v trávicím traktu nebo zvýšené potřeby v průběhu nemocí aj. stavů (rekonvalescence, těhotenství, kojení). Nadbytek hydrofilních vitaminů přiváděných potravou je z těla obvykle rychle vyloučen močí. Naproti tomu v tucích rozpustné vitaminy mohou být v těle ukládány po delší dobu, v játrech vitaminy A a D, omezeně vitamin K, v tukové tkáni tokoferoly. Toxické projevy mohou vyvolat jen opakované vysoké dávky retinolu příp. kalciolů (označované někdy jako hypervitaminóza A nebo D). Téměř vždy jsou následkem nesprávného dávkování při jejich léčebném použití. Vitaminy rozpustné ve vodě Nejsou v těle ukládány (výjimkou je vitamin B 12 ), přebytek se vylučuje močí, a proto musí být potravou plynule doplňovány. V organismu jsou složkami kofaktorů enzymů. Thiamin (vitamin B 1 ) Thiamin je derivátem pyrimidinu a thiazolu. V roztoku je poměrně nestálý a termolabilní. Biologicky aktivní formou je koenzym thiamin-difosfát, který v průběhu oxidačních dekarboxylací pyruvátu a 2-oxoglutarátu váže meziprodukt reakce. Je tak nezbytný pro odbourání všech živin, zejména sacharidů. Přibližná denní potřeba pro dospělé je 1-2 mg. Značně se zvyšuje při přebytku sacharidů v potravě, nadměrném pocení při práci v horku a u alkoholiků. Thiamin je přítomen v mnoha potravinách rostlinného i živočišného původu, hlavním zdrojem je maso, zejména vepřové, a vnitřnosti, kvasnice, celozrnný chléb a pečivo. Bílé pečivo a hlazená rýže byly při zpracování zbaveny většiny původního obsahu thiaminu. Za první příznaky nedostatku thiaminu se pokládá např. zvýšená únavnost, svalová slabost, sklon k neuritidám. Extrémní avitaminóza je u nás vzácná, v jihovýchodní Asii je známa jako onemocnění beri-beri, s různými formami poruch kardiovaskulární a nervové soustavy a také gastrointestinální symptomatologií. Toto onemocnění se vyskytuje, je-li potravou téměř výlučně loupaná rýže. Riboflavin (vitamin B 2 ) Riboflavin se skládá z heterocyklického isoalloxazinového kruhu navázaného na ribitol. Je součástí flavinmononukleotidu (FMN) nebo flavinadenindinukleotidu (FAD), kofaktorů flavinových dehydrogenáz a jiných oxidoreduktáz. Denní potřeba riboflavinu pro dospělého je asi 2 mg. Jeho zdrojem v potravě je mléko a mléčné výrobky, vejce, maso a různé rostlinné potraviny. Většinou se v nich vyskytuje vázán v podobě FMN nebo FAD, volný riboflavin obsahuje pouze mléko. Avitaminóza B 2 známa není. Omezený přívod se projevuje zejména postižením sliznic (zánět rtů, jazyka, ústních koutků, vaskularizace okrajů rohovky) a kůže obličeje. 136

137 Vitamíny - příprava Niacin (vitamin B 3 ) Niacin je název pro dva deriváty pyridinu: nikotinovou kyselinu a její amid nikotinamid. Přestože mohou vznikat v organismu člověka a ostatních savců z aminokyseliny tryptofanu, řadí se mezi vitaminy skupiny B. Biochemický význam nikotinamidu spočívá v tom, že je součástí pyridinových nukleotidů, NAD + a NADP +, uplatňujících se jako koenzymy přenášející vodík v reakcích katalyzovaných mnoha dehydrogenázami. Denní potřeba niacinu pro zdravého dospělého je mg. Příjem dostatečného množství biologicky plnohodnotných bílkovin mléka nebo vajec potřebu nikotinamidu pokryje, i když je v nich jeho obsah nepatrný, protože niacin vzniká v buňkách z tryptofanu. Bohatým zdrojem niacinu jsou játra, maso, droždí. Závažný deficit niacinu vyvolává onemocnění nazývané pelagra. Projevuje se mj. průjmy (diarhea), kožními záněty s pigmentacemi (dermatitis) a psychickými poruchami (demence) - nemoc tří D, později i srdečními a nervovými poruchami. Pelagra se endemicky vyskytuje jen tam, kde je hlavní potravinou kukuřice (obsahuje málo tryptofanu). KAPITOLA 10 Kyselina pantothenová (vitamin B 5 ) Pantothenová kyselina je amid vzniklý z beta-alaninu, na jehož aminoskupinu je navázán acyl pantoové kyseliny. V přírodě je velmi rozšířena (pantothen, řecky odevšad), v potravě dostatečně zastoupena. Nachází se v krvi, v buňkách je převážně jako složka pantetheinu, který je součástí koenzymu A a multienzymového komplexu syntázy mastných kyselin. Denní potřeba je přibližně 6-8 mg, smíšená strava ji pokrývá. Bohatým zdrojem jsou např. játra, vaječné žloutky. Suplementace pantothenátu je nezbytná při úplné parenterální výživě. Deficit se nijak charakteristicky neprojevuje. Vápenatá sůl nebo alkoholový prekurzor panthenol (dexpanthenolum) mohou být doplňkem urychlujícím hojení neinfikovaných popálenin, povrchových poranění nebo katarů horních dýchacích cest. Vitamin B 6 Vitamin B 6 je skupinový název pro tři příbuzné deriváty substituovaného pyridinu. Všechny mají stejnou biologickou účinnost, vzájemně se liší skupinou navázanou v poloze 4; pyridoxin (pyridoxol) má skupinu primárně alkoholovou, pyridoxal aldehydovou a pyridoxamin primární aminovou. Aktivní formou je kofaktor pyridoxal-5-fosfát, prostetická skupina enzymů zúčastněných zejména v přeměnách aminokyselin (např. aminotransferázy, dekarboxylázy). Denní potřeba dospělých kolem 2 mg je kryta běžnou smíšenou stravou, výrazně se však zvyšuje např. během laktace, při všech katabolických stavech, při velké konzumaci ethanolu. Absolutní nedostatek vitaminu B 6 je vzácný, dílčí se může projevit u alkoholiků, těhotných nebo kojících žen poruchami kůže a sliznic nebo anémií. Kyselina listová (folát, vitamin B 11 ) Listová kyselina je název obvyklý pro pteroylglutamovou kyselinu. Živočichové tyto látky nedovedou syntetizovat, jsou závislí na jejich přívodu potravou. Aktivní formou je v buňkách tetrahydrofolát, kofaktor přenášející jednouhlíkaté zbytky v různých oxidačních stavech. Denní potřeba folátů pro dospělého je přibližně 0,15-0,2 mg. Nejbohatším zdrojem jsou játra, z rostlinných potravin listová zelenina (zelí, kapusta, špenát) a droždí. Nedostatek folátů má obvykle příčinu v nedostatečné resorpci, projevuje se především v krevním obraze (megaloblastická anémie, trombocytopenie). Nedostatek folátů v graviditě je spojen s vrozenými vývojovými vadami plodu, především defekty neurální trubice. Vitamin B 12 (kobalamin) Kobalamin má dosti složitou strukturu. Základem je tetrapyrrolový korinový kruh, v jehož středu je vázán ion kobaltu. Produkován je pouze mikroorganismy, nachází se pouze v potravinách živočišných, ne v rostlinné stravě. K resorpci kobalaminu přijatého potravou je nezbytný specifický glykoprotein vylučovaný žaludeční sliznicí, zvaný vnitřní faktor. Resorbovaný kobalamin je skladován v játrech. V buňkách je kobalamin přeměněn na kofaktory methylkobalamin a deoxyadenosylkobalamin. Jsou potřebné v odbourávání některých aminokyselin a zejména, společně s listovou kyselinou, k methylačním reakcím (remethylaci homocysteinu na methionin, což je jedním z předpokladů pro plynulou syntézu bází nukleových kyselin). Denní potřeba B 12 u dospělých je přibližně 2 µg. Bohatým zdrojem jsou vnitřnosti, též maso, mléčné výrobky a vejce. Kobalamin se rovněž tvoří činností střevní mikroflóry, ale nevstřebává se a je vylučován stolicí. Příčinou deficitu kobalaminu bývá poměrně zřídka nevhodná strava, např. u veganů, kteří se vyhýbají potravinám živočišného původu. Častěji je jeho příčinou nedostatek vnitřního faktoru a nedostatečná resorpce kobalaminu z potravy. Projevuje se jako megaloblastická či makrocytová anémie a neurologické poruchy. 137

138 Vitamíny - příprava Vitamin C (kyselina askorbová) L-askorbová kyselina je derivátem monosacharidů. Nejedná se o karboxylovou kyselinu, zřetelně kyselý charakter jí dodává přítomnost dvou enolových hydroxylů. Syntetizují ji rostliny i většina živočichů, výjimkou je však člověk, primáti a morče. Je významným hydrofilním redukčním činidlem (antioxidantem). Snadno je oxidována na biologicky neúčinnou L-dehydroaskorbovou kyselinu; reakce je sice reverzibilní, většinou však chybí dostatečně účinné redukční činidlo ke zpětné redukci. Účastní se hydroxylačních reakcí v syntéze kolagenu, žlučových kyselin, adrenalinu a odbourávání tyrosinu tím, že udržuje kovové ionty metaloenzymů v redukovaném stavu. Zvyšuje i resorpci železa v trávicím traktu. Denní potřeba je oproti jiným vitaminům o jeden až dva řády vyšší, pro dospělé mg. L-Askorbát se vyskytuje především v rostlinách, zejména v čerstvém ovoci a zelenině. Nejbohatším zdrojem jsou citrusy, kiwi, černý rybíz, paprika, brambory. Znehodnocení askorbátu oxidací probíhá snadno působením vzdušného kyslíku za vyšší teploty, zejména v přítomnosti stop těžkých kovů, Cu a Fe. Lidé s relativně nízkým přívodem vitaminu C bývají snadno unavitelní, náchylnější k drobným infekcím, může se objevit zduření a krvácení z dásní, podkožní krvácení z fragilních kapilár. Extrémní avitaminóza (kurděje, skorbut) bývá v současnosti vzácná. Dlouhodobé požívaní vysokých dávek askorbátu (více než 0,5 g denně) se nepokládá za prospěšné. Přebytek se rychle vylučuje močí, více askorbátu je odbouráváno na oxalát (riziko urolitiázy), může se zvýšit riziko rozvoje poruch acidobazické rovnováhy (acidóza). Askorbát jako antioxidant sice chrání před účinkem volných kyslíkových radikálů, jeho příliš vysoká koncentrace však podporuje výskyt redukovaných forem kovových iontů, které tvorbu agresivních kyslíkových radikálů katalyzují (Fentonova reakce). KAPITOLA 10 Biotin (dříve vitamin H) Biotin má v molekule kondenzovaný heterocyklický systém, složený z thiolanu a imidazolidinu. Působí jako kofaktor karboxyláz katalyzujících karboxylační reakce. Heteroatom dusíku navazuje molekulu CO 2 za vzniku karboxybiotinu, který je donorem karboxylové skupiny pro karboxylaci např. pyruvátu na oxalacetát nebo acetylkoenzymu A na malonylkoenzym A. Má tak důležitou úlohu v glukoneogenezi (syntéze glukózy z laktátu a z některých aminokyselin), pro citrátový cyklus (syntézu oxalacetátu) a pro syntézu mastných kyselin. Biotin se nachází ve většině potravin, značná část potřebného množství je kromě toho syntetizována mikroflórou tlustého střeva. Deficit biotinu u člověka je proto poměrně vzácný. Lze jej vyvolat nadměrnou konzumací syrových vaječných bílků. Obsahují termolabilní glykoprotein avidin, specificky vázající biotin (komplex není rozkládán trávicími enzymy) a znemožňující jeho vstřebávání. Vitaminy rozpustné v tucích Mají nepolární (hydrofobní) charakter, protože se jedná buď přímo o isoprenoidy (A a D), nebo je součástí jejich molekuly isoprenoidní řetězec (E a K). V rostlinných i živočišných potravinách bývají rozpuštěny v tucích, se kterými jsou ve střevech vstřebávány. Při dlouhodobé poruše trávení tuků je jejich resorpce snížena, a může tak vzniknout hypovitaminóza, i když je jejich přívod v potravě dostatečný. Do cirkulace vstupují jako součást chylomikronů. Vitamin A (retinol) Retinol náleží k isoprenoidům. Vzniká též oxidačním štěpením provitaminu beta-karotenu, přítomného v zelenině a ovoci. V játrech je určitá zásoba retinolu v podobě jeho esterů. Aldehyd retinal je součást rhodopsinu (zrakového purpuru tyčinek a čípků sítnice). Retinová kyselina se v buňkách účastní na regulaci exprese některých genů. Jedním z prvních příznaků deficitu retinolu je šeroslepost, následují poruchy kůže a sliznic - suchost a keratinizace, poškození spojivek a rohovky (xeroftalmie). Opakované mnohonásobné dávky retinolu jsou toxické, mohou kromě jiného ohrožovat vývoj plodu během těhotenství. Hlavními zdroji v potravě jsou játra, tučné ryby, žloutek, máslo. Karoteny jsou obsaženy v žluté, červené a zelené zelenině a ovoci. Vitamin D Kalciol (vitamin D 3, cholekalciferol) a erkalciol (vitamin D 2, ergokalciferol) jsou 9,10-sekosteroly. Kalciol se může tvořit v kůži působením UV záření z 7-dehydrocholesterolu, podobně erkalciol vzniká v rostlinách z ergosterolu. Hydroxylací v játrech a ledvinách z nich vzniká hormon kalcitriol (1,25-dihydroxykalciol), který má spolu s parathormonem a kalcitoninem ústřední roli v hospodaření s Ca 2+ a fosfáty. Kalcitriol indukuje syntézu proteinu, který umožňuje střevní resorpci Ca 2+, a reguluje mineralizaci kostní tkáně. Důsledkem deficitu kalciolu je nedostatečná mineralizace organické složky kosti. U dětí se závažný nedostatek projevuje jako křivice (rachitis), u dospělých jako osteomalacie. Opakované podávání příliš vysokých dávek vitaminu D vede k hyperkalcemii, případně i k nežádoucím kalcifikacím v různých tkáních nebo ke kalciové urolitiáze. Hlavním zdrojem je rybí tuk, tresčí játra, tučné ryby, rovněž obohacené kelímkové margariny. 138

139 Vitamíny - příprava Vitamin E Vitamin E je název pro skupinu přirozených antioxidantů vykazujících kvalitativně stejnou biologickou aktivitu jako alfa-tokoferol, který je z nich nejúčinnější a v přírodě nejvíce rozšířený. Poprvé byl izolován z oleje pšeničných klíčků. Všechny tyto antioxidanty jsou deriváty chromanu, který má v poloze 2 připojen 16-uhlíkatý isoprenoidní zbytek. Pro funkci je rozhodující fenolový hydroxyl v poloze 6. Přenosem jeho atomu vodíku je zneškodněn některý z volných radikálů a vzniklý fenoxy-radikál je buď regenerován askorbátem na původní tokoferol, nebo je dalším radikálem nevratně rozložen. Tokoferoly omezují peroxidaci nenasycených mastných kyselin membránových lipidů a lipoproteinů, zabraňují oxidaci i jiných významných sloučenin. Denní potřeba je přibližně 15 mg alfa-tokoferolu, stoupá se zvyšujícím se příjmem polynenasycených tuků. Bohatým zdrojem jsou rostlinné oleje, ořechy, semena, obilné klíčky. V dehydratovaných nebo zmražených potravinách se autooxidací obsah tokoferolů značně snižuje. Deficit tokoferolu se u člověka nijak charakteristicky neprojevuje, může snad vyvolat anémii a některé neurologické příznaky. KAPITOLA 10 Vitamin K Vitamin K je společný název pro skupinu derivátů naftochinonu, označovaných jako antihemoragický vitamin. Přirozené jsou fylochinon (K 1, 3-fytylmenadion) a menachinony (K 2 ), které mají navázán postranní polyisoprenový řetězec, a jsou proto rozpustné v tucích. Stejný účinek má syntetický, ve vodě rozpustný menadiol nebo menadion. Jsou nezbytné pro dokončení biosyntézy faktorů krevního srážení II (protrombinu), VII, IX a X a bílkovin potřebných pro mineralizaci kostí tím, že se účastní na vytvoření vazebných míst pro Ca 2+ (zavedením další karboxylové skupiny do postranních řetězců zbytků glutamové kyseliny). Používají se proto při předcházení nebo léčení zvýšené krvácivosti. Jejich nedostatek u dospělého člověka není častý, protože vitamin K je poměrně rozšířen v potravinách (nejvíce listová zelenina) a kromě toho jej tvoří mikroflóra tlustého střeva. Sklon ke krvácení z nedostatku vitaminu K se může projevit u novorozenců (jejich střevo je sterilní), při všech poruchách resorpce tuků, nejčastěji při nedostatečné sekreci žlučových kyselin, nebo při chybění střevní mikroflóry vyvolaném širokospektrými antibiotiky. Důležitými antagonisty vitaminu K jsou antikoagulancia (warfarin). 139

140 Vitamíny Vitamíny Autoři: MUDr. Michaela Králíková, Ph.D.; MUDr. Milan Dastych Recenzent: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. KAPITOLA 10 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Vitaminy Kromě hlavních živin (sacharidy, bílkoviny a tuky) musí potrava člověka obsahovat další nepostradatelné látky, které lidský organismus nedokáže syntetizovat. Patří sem zejména esenciální aminokyseliny, esenciální mastné kyseliny, minerální látky a vitaminy. Vitaminy a kofaktory od nich odvozené jsou nezbytné pro normální průběh velké řady metabolických dějů. Podle rozpustnosti rozdělujeme vitaminy na rozpustné v tucích (A, D, E, K) a ve vodě (ostatní). Tato klasická klasifikace je také praktická - pomáhá mj. odhadnout, ve kterých potravinách se daný vitamin může vyskytovat a za jakých okolností můžeme očekávat jeho deficit. Vyvážená strava připravená z čerstvých potravin obvykle obsahuje potřebná množství všech vitaminů. Dlouhodobě nízký přívod některého z vitaminů může vyvolat buď hypovitaminózu, zpočátku subklinickou, kdy lze pouze dokázat snížené množství daného vitaminu v organismu (častá u vit. D nebo B12), a posléze klinickou s nespecifickými příznaky, nebo vážnější poruchu s charakteristickými příznaky (avitaminózu). Deficit vitaminů může vzniknout také jako důsledek poruchy absorpce v trávicím traktu, zvýšené potřeby v průběhu nemocí aj. stavů (rekonvalescence, těhotenství, kojení) nebo jejich zvýšené exkrece. Nadbytek hydrofilních vitaminů přiváděných potravou je z těla obvykle rychle vyloučen močí, výjimkou je vit. B12 (viz. dále). Naproti tomu vitaminy rozpustné v tucích mohou být v těle ukládány po delší dobu, v játrech vitaminy A a D, omezeně vitamin K, v tukové tkáni tokoferoly. Projevy toxicity (označované někdy jako hypervitaminóza) nacházíme pouze u vitaminu A a D. Téměř vždy jsou následkem nesprávného dávkování při jejich léčebném použití. Doporučené denní dávky vitaminů Doporučená denní dávka (DDD) určité látky je dávka, která vyjadřuje potřebný individuální denní příjem považovaný za dostatečný na to, aby pokryl potřebu 97 % - 98 % zdravých jedinců bez rozdílu pohlaví v každé věkové skupině. Hodnota je odvozena z vědeckých studií o fyziologických potřebách u zdravých osob. Například základem pro určení DDD určitého vitaminu je množství, které je nutné k udržení jeho správné hladiny v krvi u testované zdravé osoby. Tyto hodnoty se mohou různě interpretovat, a proto se mohou v jednotlivých zemích od sebe více či méně lišit. Hodnoty nejsou také hodnotami doporučovanými pro optimální výživu. Přestože bylo provedeno mnoho výzkumů, o definitivním vyhodnocení optimálního příjmu vitaminů se stále diskutuje (v současnosti je dobrým příkladem např. vitamin D). 140

141 Vitamíny Vitamin Jednotka Množství B1 mg 1,1 B2 mg 1,4 Niacin mg 16 Kyselina pantothenová mg 6 B6 mg 1,4 Kyselina listová μg 200 B12 μg 2,5 Vitamin C mg 80 Biotin μg 50 A μg 800 D μg 10 (400 IU) E mg 12 K μg 75 Tabulka 10.1 DDD vitaminů dle vyhlášky číslo 225/2008 Sb. KAPITOLA 10 Metody stanovení vitaminů Pro stanovení stavu vitaminu v organismu, resp. při podezření na jeho deficit máme možnost několika přístupů. Jedná se buď o přímé stanovení konkrétního vitaminu (nejčastěji v séru, ale lze i v plazmě, plné krvi, erytrocytech, leukocytech či bioptických tkáňových vzorcích), stanovení močové exkrece vitaminu (bez nebo po zátěži), či nepřímé postupy. Ty zahrnují stanovení typického metabolitu daného vitaminu či typického produktu vznikajícího v těle díky jeho působení (opět možno po zátěži) a stanovení katalytické aktivity vhodného enzymu, jehož kofaktorem je příslušný vitamin. Konkrétní možnosti jsou uvedeny vždy u jednotlivých vitaminů. Vitaminy rozpustné ve vodě Tyto vitaminy nejsou v organismu ukládány (s výjimkou vitaminu B12), jejich přebytek se vylučuje močí, a proto musí být potravou plynule doplňovány. V organismu jsou složkami kofaktorů enzymů. Vstřebávání hydrofilních vitaminů (opět s výjimkou vitaminu B12) probíhá saturabilním aktivním Na+-dependentním multivitaminovým transportérem, při vyšších koncentracích v potravě se navíc uplatňuje prostá difuze. Thiamin (vitamin B 1 ) Thiamin je nejdéle známý vitamin - od r Je derivátem pyrimidinu a thiazolu, které jsou navzájem spojeny methylenovým můstkem. Biologicky aktivní formou je thiamindifosfát (TDP). Hlavními potravinovými zdroji thiaminu jsou obilné klíčky, kvasnice, luštěniny, ořechy, maso, mléko a mléčné výrobky. Jeho obsah v bílém pečivu a hlazené rýži je naopak nízký, proto se v mnoha zemích (včetně ČR) obilniny a pečivo thiaminem obohacují. Thiamin z potravy je snadno absorbován. Absorpce probíhá v horní části tenkého střeva dvěma mechanismy. Za nízkých koncentrací se uplatňuje aktivní saturabilní transport thiaminovým Na + -dependentním přenašečem (symport). Při příjmu vyšším než 5 mg/den se uplatňuje pasivní transport difuzí. Ten je významný pro alkoholiky, protože alkohol inhibuje pouze aktivní transport. animace: absorpce vit. B1 (malo vitaminu - symport s Na, vice vitaminu - transporter je saturovan, pridava se difuze) Portální žilou se thiamin dostává do jater, kde je fosforylován na aktivní TDP enzymem thiamindifosfotransferázou (přítomná i v mozku). Zdrojem difosfátu je ATP. V plazmě je thiamin z 90% transportován volný. V organismu se nachází asi 30 mg thiaminu, z toho cca ½ je ve svalech, zbytek v myokardu, játrech, ledvinách a nervové tkáni. 90% je ve formě TDP, 10% v nervové tkáni jako 141

142 Vitamíny thiamintrifosfát. Nadbytečný thiamin je vylučován močí. TDP je kofaktorem oxidačních dekarboxylací 2-oxokyselin (např. přeměna pyruvát acetyl-coa, 2-oxoglutarát sukcinylcoa, citrátový cyklus; 2-oxok. z valinu, leucinu a isoleucinu; 2-oxobutyrát při katabolismu methioninu ad.) a transketolázové reakce pentosového cyklu. Je tedy nezbytný pro metabolismus sacharidů i ostatních živin. Při nedostatku TDP nemůže být pyruvát metabolizován na AcCoA, stoupá hladina laktátu a rozvíjí se laktátová acidóza refrakterní na léčbu hydrogenkarbonátem. Hromadění 2-oxokyselin vznikajících z větvených aminokyselin vede k příznakům nemoci javorového sirupu. Thiamin také stimuluje funkci neutrofilů a lymfocytů a při deficitu vzniká náchylnost k infekcím. K nedostatku thiaminu dochází často při malnutrici, chronickém alkoholismu, podávání diuretik nebo malárii. Typickými příčinami nedostatečného příjmu je konzumace hlavně neobohacené hlazené rýže nebo pšeničných výrobků a také syrových ryb, které obsahují mikrobiální thiaminázu. U alkoholiků se deficit rozvíjí jednak z důvodu redukovaného příjmu a jednak je omezeno vstřebávání vlivem inhibice aktivního transportu. Ve stáří se typicky nedostatečný příjem kombinuje s výše uvedeným podáváním diuretik (zejména při léčbě srdečního selhání). Mezi příznaky deficitu patří změny nálady (vznětlivost, deprese), poruchy paměti, periferní neuropatie, těžkým deficitem je onemocnění beri-beri. To se projevuje zmateností, gastrointestinálními příznaky (nechutenství, špatné trávení, pokles hmotnosti), svalovou slabostí, ataxií, periferními parestéziemi, oftalmoplegií, otoky ( vlhká beri-beri ), tachykardií, srdečním selháním ( suchá beri-beri ) až kómatem. U alkoholiků se deficit typicky manifestuje jako tzv. Wernickeova-Korsakovova encefalopatie (ztráta paměti, konfabulace, delirium, nystagmus, ataxie + příznaky beri-beri). O tkáňových zásobách thiaminu informuje stanovení transketolázy v erytrocytech. Enzymová aktivita se měří v hemolyzátu erytrocytů před a po přídavku TDP. KAPITOLA 10 Riboflavin (vitamin B 2 ) Molekula riboflavinu se skládá z heterocyklického izoalloxazinového jádra připojeného na alkohol ribitol. Je základem struktury flavinových nukleotidů FAD a FMN, které slouží jako prostetické skupiny řady dehydrogenáz aj. enzymů potřebných pro transport elektronů. V potravě se nachází hlavně vázaný v podobě FAD a FMN, volný riboflavin je obsažen v mléce. Hlavními zdroji jsou mléčné produkty, vejce, játra, maso, brokolice, petržel, kvasnice. Stravou přijaté flavinoidy jsou působením žaludeční HCl uvolněny z nekovalentní vazby na proteiny a působením intestinálních enzymů je uvolněn volný riboflavin. Především v jejunu je pak riboflavin resorbován saturabilním Na+-dependentním aktivním transportem. Resorpci urychlují žlučové kyseliny, snižují kovy (Cu, Zn, Fe), vit. C, nikotinamid, tryptofan, kofein, theofylin a některé léky (ATB, anacida ad.). Krví je B2 transportován ve vazbě na albumin, imunoglobuliny i jiné proteiny. K přeměně B2 na kofaktory dochází v buňkách většiny tkání, nejvíce v enterocytech, játrech, myokardu a ledvinách. Fosforylací působením flavokinázy za účasti ATP nejprve vzniká FMN a větší část je dále přeměněna na FAD působením ATP-dependentní FADsyntetázy. Zásoba B2 v organismu je malá, přebytečný vitamin je vyloučen močí, proto renální exkrece odráží denní příjem B2. FAD a FMN se podílí na řadě redoxních procesů - dýchacím řetězci (cytochrom c-reduktáza), citrátovém cyklu (sukcinylcoa-dehydrogenáza), syntéze a odbourávání mastných kyselin, metabolismu purinů (xantinoxidáza), některých aminokyselin, xenobiotik (součást CYP 450), je součástí glutathionreduktázy (antioxidační fce), peroxidázy, oxidáz 2-oxokyselin aj. enzymů. Deficit riboflavinu většinou doprovází deficit ostatních vitaminů skupiny B. Mezi typické příznaky patří angulární stomatitida ( koutky ), cheilóza, glositida, otok sliznic, seboroická dermatitida a jiné kožní defekty, konjuktivitida, korneitida a nervové poruchy. Při podezření na deficit riboflavinu se stanovuje aktivita glutathionreduktázy v hemolyzovaných erytrocytech před a po přídavku FAD. Niacin (vitamin B3) Pojmem niacin rozumíme deriváty pyridinu kyselinu nikotinovou a její amid - nikotinamid, který je strukturní součástí kofaktorů řady dehydrogenáz NAD a NADP. Dobrými potravinovými zdroji jsou maso (krůtí, tuňák), játra, slunečnicová semena, arašídy, černý chléb a luštěniny, ale značná část niacinu vzniká endogenně z tryptofanu. Kyselina nikotinová se vstřebává již v žaludku, v tenkém střevě se vstřebává také nikotinamid. Jedná se o saturabilní Na+ depen- 142

143 Vitamíny dentní aktivní transport. Při vysokém obsahu v potravě a nasycení přenašeče je možný také pasivní transport difuzí. Nejběžnější formou cirkulující v krvi je nikotinamid. V hepatocytech můžeme nalézt i malou frakci volného nikotinamidu, v ostatních buňkách dochází k přeměně na nukleotidy. V cytosolu dochází k deaminaci nikotinamidu na k. nikotinovou a dále vzniku desamidonad +. Ten je adenylován pomocí ATP na aktivní NAD +. K případné fosforylaci na NADP + dochází v mitochondriích. Zásoba v organismu je malá, přebytek je vylučován především jako N-methylnikotinamid, vznikající methylací v játrech. Cílovými orgány jsou všechny tkáně, zejména játra a svaly. Nikotinamidové kofaktory jsou esenciální pro oxidoredukční reakce v citrátovém cyklu, dýchacím řetězci, glykolýze, metabolismu mastných kyselin, aminokyselin a velké řady dalších dějů, celkem ovlivňuje funkci více než 200 enzymů. Hrají také roli při vazodilataci, v neredoxních reakcích při replikaci a reparaci DNA, apoptóze, zvyšují hladinu HDL a snižují LDL cholesterolu a triglyceridů. K deficitu dochází při nedostatečném příjmu potravou, alkoholismu, cirhóze, při nízkém příjmu (kukuřičná strava) či poruchách vstřebávání tryptofanu nebo např. při karcinoidu, kdy je tryptofan ve větší míře (až 60% oproti norm. 1%) přeměňován na serotonin, 5-hydroxytryptofan a 5-hydroxyindoloctovou kyselinu. K akutnímu deficitu může dojít při léčbě isoniazidem (kompetitivní inhibice pyridoxalfosfátu, který je zapotřebí pro přeměnu tryptofanu na niacin). Typickým onemocněním z nedostatku je pellagra - nemoc tří D - dermatitis, diarhea a demence. Pigmentová vyrážka postihuje predilekčně místa exponovaná slunci a jsou také postiženy sliznice dutiny ústní a jazyka. Průjem se rozvíjí v důsledku slizničního zánětu a mezi další neurologické příznaky patří deprese, iritabilita, dezorientace, halucinace či katatonie. Niacin se používá jako léčivo při dyslipoproteinémiích (antiaterogenní aktivita), karcinoidu a vrozené poruše vstřebávání tryptofanu (Hartnupova choroba). Jako doplněk jej lze využít u diabetiků (zlepšuje toleranci sacharidů) či při vaskulárních onemocněních. Je vhodná klinická kontrola vzhledem k projevům předávkování, zvláště vazodilataci (zčervenání, brnění, bolesti hlavy, nauzea, zvracení), hepatitidě, myopatii a trombocytopatii. Pro určení deficitu se využívá stanovení močové exkrece metabolitů N -methylnikotinamidu a N -methyl-2-pyridon-5-karboxylamidu kapalinovou chromatografií. KAPITOLA 10 Kyselina pantothenová (vitamin B 5 ) Kyselina pantothenová je šestiuhlíkatá větvená hydroxykyselina pantoová vázaná na alanin. Aktivní formou je koenzym A a protein přenášející acyl (acyl carrier protein ACP). V potravě je široce dostupná, je obsažena především v živočišných potravinách, celozrnných výrobcích, zelenině, luštěninách. Nachází se hlavně jako součást koenzymu A (CoA) a jeho esterů. Ty jsou ve střevě hydrolyzovány a vstřebávání pantothenátu pak probíhá saturabilním aktivním Na+-dependentním multivitaminovým transportérem, při vyšších koncentracích v potravě se navíc uplatňuje prostá difuze. Krví je k. pantothenová přenášena k hepatocytům a dalším tkáním (svaly, ledviny, nadledviny, testes), do kterých vstupuje obdobným mechanismem, jako do enterocytů a slouží zde opět k syntéze CoA, příp. ACP. CoA a ACP jsou zapotřebí k přenosu acylových zbytků, ACP při syntéze mastných kyselin, CoA v řadě reakcí - citrátovém cyklu, oxidaci a syntéze mastných kyselin, syntéze cholesterolu, glykolýze, glukoneogenezi, katabolismu aminokyselin, acetylačních reakcích xenobiotik, syntéze hemu ad. Pantothenát zvyšuje odolnost vůči infekcím a alergiím a také urychluje hojení ran. Izolovaný deficit se u člověka nevyskytuje, snížené hodnoty v séru nacházíme při mentální anorexii, malabsorpčním syndromu, sepsi, imunodeficitech. Terapeuticky se podává při malnutrici, jako doplněk případně při katabolických stavech či intoxikaci etanolem. Laboratorně je možno stanovení v séru, plné krvi a moči a stanovení CoA v erytrocytech, ale v praxi se téměř neprovádí. Vitamin B 6 Pod pojem vitamin B 6 zahrnujeme deriváty pyridinu pyridoxin (pyridoxol), pyridoxal, pyridoxamin a jejich 5-fosfáty. Aktivní formou vitaminu je pyridoxal- 5 -fosfát (PLP) a pyridoxamin-5 -fosfát, které vznikají ATP dependentní foforylací pyridoxalkinázou v cytosolu buněk. Vit. B 6 je v živočišných i rostlinných tkáních široce distribuován, převládají PLP a pyridoxamin-5 -fosfát, rostliny obsahují také pyridoxin-5 -glukosid, který se odlišně vstřebává. V léčivech se B 6 vyskytuje ve formě pyridoxin hydrochloridu. Dobrými potravinovými zdroji jsou vnitřnosti, drůbeží maso, ryby, brambory, ořechy, luštěniny, banány, kvasnice a celozrnné cereálie. Potravou přijaté fosforylované formy jsou v tenkém střevě hydrolyzovány intraluminální alkalickou fosfatázou a nefosforylova- 143

144 Vitamíny ný vitamin je vstřebán pasivní difuzí zejména v jejunu. Pyridoxin-5 -glukosid je hydrolyzován až intracelulárně nespecifickými glukosidázami. V enterocytech dochází k fosforylaci. V enterocytu nevyužitý PLP je opět defosforylován (nespec. alkalická fosfatáza plazmatické membrány) a portální žilou se dostává do jater a dále do cirkulace. Zde je přenášen jako pyridoxal ve vazbě na albumin nebo hemoglobin v erytrocytech. Hlavní formou ve tkáních je PLP a hlavní zásobárnou B 6 jsou svaly (asi 80%). Všechny formy B 6 jsou vylučovány do moči, při vysokých koncentracích je hlavním metabolitem 4-pyridoxinová kyselina (4-PA). PLP je kofaktorem více než 100 enzymů aminotransferáz (ALT, AST), dekarboxyláz (vznik katecholaminů, serotoninu) a deamináz aminokyselin, transsulfuráz, cystathionin-beta-syntázy (CBS, metabolismus homocysteinu), glykogenfosforylázy a dalších enzymů. Je také nezbytný pro glukoneogenezu, syntézu hemu, myelinu, DNA, taurinu, moduluje efekt hormonů a má význam pro imunitní funkce. Nedostatek se vyskytuje zřídka a jako součást smíšeného deficitu ostatních vitaminů skupiny B. Příznaky se mohou projevit jako hypochromní sideroblastická anémie, dermatitida s cheilózou a glositidou, folikulární hyperkeratóza, záněty očních koutků nebo epileptikogenní křeče. Jsou také známy klinické deficity PLP-dependentních enzymů, např. CBS (homocystinurie - mentální retardace, deformity skeletu, trombembolie). Při všech těchto onemocněních se podává vit. B 6 (do 300 mg/den), stejně jako při léčbě tuberkulózy isoniazidem či při podávání penicilaminu (např. léčba Wilsonovy choroby nebo cystinurie). Nadbytek B 6 (z vitaminových preparátů) může vést k rozvoji neurotoxických a fotosenzitivních projevů, proto se doporučuje neužívat více než 100 mg B 6 denně. Stav B 6 v organismu je možno hodnotit přímými a nepřímými postupy. Přímé metody zahrnují stanovení PLP v plné krvi a exkreci 4-PA do moči. Používá se hlavně HPLC. Nepřímou metodou je stanovení enzymové aktivity erytrocytární ALT a AST v hemolyzátu před a po přidání PLP. KAPITOLA 10 Kyselina listová (folát, vitamin B 11 ) Jedná se o k. pteroylglutamovou, tedy substituovaný pteridin s k. p-aminobenzoovou (PABA) a glutamovou. Aktivní formou v těle je tetrahydrofolát, který slouží k přenosu jednouhlíkatých zbytků a je mj. nezbytný pro syntézu nukleových kyselin. Živočichové neumí syntetizovat PABA, proto je nezbytný příjem folátu potravou. Hlavními zdroji jsou játra, ledvinky, listová zelenina a citrusy. V potravě je k. listová přijímána ve formě polyglutamátu. Ten je enzymy střevní mukózy hydrolyticky štěpen na monoglutamát, který se vstřebává aktivním transportem (při nízkých koncentracích) a difuzí (při koncentracích vyšších). V enterocytech dochází k redukci a methylaci a do cirkulace se uvolňuje 5-methyltetrahydrofolát. Ten je transportován ve vazbě na albumin a folát-vázající protein. Hlavním cílovým orgánem jsou játra, ale k utilizaci folátů dochází ve většině tkání. V buňkách dochází k demethylaci a konverzi na polyglutamát účinkem polyglutamát syntázy. Ta pomáhá uržet foláty uvnitř buňky, protože k uvolnění do cirkulace je nutná zpětná konverze na monoglutamát. Zásoby folátů v organismu vystačí 2-4 měsíce. Exkrece probíhá močí a žlučí, zde je významný enterohepatální oběh. Hlavní funkcí k. listové v organismu je přenos jednouhlíkatých zbytků. Ty jsou využity při syntéze purinových nukleotidů, dtmp a při konverzi homocysteinu na methionin, který je ve formě S-adenosylmethioninu hlavním a univerzálním donorem methylu v methylačních reakcích (syntéza kreatinu, adrenalinu, fosfatidylcholinu, karnitinu, methylace v nukleových kyselinách). K deficitu listové kyseliny dochází běžně při malabsorpci (resekce, celiakie, střevní záněty), zvýšených ztrátách (dialýza), sníženém přísunu potravou (chron. alkoholismus), stavech vyšší potřeby (těhotenství, kojení, jaterní onemocnění, malignity) a lékových interakcích (metotrexat, fenytoin). Vede k poruchám buněčného dělení, které se typicky projevují jako pancytopenie s megaloblastickou anémií. Méně často nacházíme gastrointestinální a neurologickou a psychiatrickou symptomatologii. Nedostatek folátu v 1. trimestru těhotenství je spojen s defekty neurální trubice (spina bifida, encefalokéla, anencefalie), proto by suplementace měla být zahájena jestě v prekoncepčním období. K vyšetření folátového stavu se stanovuje hladina v séru a erytrocytech. Koncentrace v erytrocytech je vhodnější pro sledování dlouhodobého zásobení organismu. Používá se nejčastěji chemiluminiscenční imunoesej, podobně jako u vitaminu B 12, a je vhodné stanovení obou vitaminů zároveň. Vitamin B 12 (kobalamin) Pod pojem vitamin B 12 zahrnujeme skupinu kobalaminů lišících se typem postranní skupiny vázané na kobalt v korinovém kruhu. Aktivními formami vitaminu jsou methylkobalamin a deoxyadenosylkobalamin, dietou a příp. terapeuticky přijímáme hydroxykobalamin a kyanokobalamin. Všechny tyto formy jsou mikrobiálního původu, hlavním potravinovým zdrojem je výhradně 144

145 Vitamíny živočišná strava, tedy masné a mléčné produkty. B 12 je tvořen také mikroflórou tlustého střeva, ale tento se nevstřebává a je vyloučen stolicí. Vit. B 12 uvolněný z potravy se v žaludku váže na protein haptokorin. V tenkém střevě se komplex rozpadá a haptokorin je štěpen pankreatickými enzymy. Uvolněný B 12 se váže na vnitřní faktor (intrinsic factor, IF) - glykoprotein secernovaný parietálními buňkami žaludeční sliznice. V distálním ileu komplex B 12 -IF vstupuje do enterocytu endocytózou prostřednictvím receptoru CUBN (cubulin; v epitelu ilea, prox. tubulu ledvin a žloutk. váčku; komplex cubulin-megalin = multiligandový receptor pro transport většiny bílkovin, např. transferinu při reabsorpci v ledvinách). V enterocytu se komplex rozpadá a volný B 12 se váže na holotranskobalamin (HTC, dříve označovaný transkobalamin II). Komplex B 12 -HTC opouští enterocyt aktivním transportem pomocí přenašeče a portální žilou se dostává do jater. Zde je B 12 skladován a v případě potřeby uvolněn do cirkulace, kde se nachází v komplexu s HTC (aktivní B 12 dostupný buňkám, poločas 5-6 minut) nebo haptokorin (80-85%, pevně navázán několik měsíců až rok, poločas > 2 týdny). V játrech je běžně skladován asi 1 mg B 12, což při obvyklých potřebách organismu vystačí cca na 2000 dnů (5,5 roku). Proto se příznaky deficitu objevují obvykle až s pětiletou latencí. B 12 je neustále vylučován do žluče a ze střeva zpětně resorbován, enterohepatální oběh činí 70-80%. Pokud množství cirkulujícího vit. B 12 překročí kapacitu HTC, je vyloučen močí. Celkem se žlučí, stolicí a močí vyloučí asi 0,2% denních zásob. Vitamin B 12 je kofaktorem řady enzymů, z nichž nejdůležitější jsou methioninsyntáza (MS) a methylmalonylcoamutáza. Kofaktorem MS je methylkobalamin. Enzym je nebytný pro konverzi homocysteinu na methionin, přeměnu folátových koenzymů a dále pro veškeré methylační reakce v organismu. Při jeho deficitu dochází k rozvoji hyperhomocysteinémie a tzv. folátové pasti (dochází k akumulaci N5-methyltetrahydrofolátu, který nemůže předat methylovou skupinu na B 12 ; hladiny ostatních forem folátu nezbytných pro syntézu bazí nukleových kyselin naopak klesají). Kofaktorem methylmalonylcoamutázy je deoxyadenosylkobalamin. Enzym je nezbytný pro katabolismus některých aminokyselin a vznik sukcinylcoa (anaplerotická reakce citrátového cyklu). Při jeho deficitu dochází k rozvoji methylmalonové acidurie a metabolické acidózy. Vit. B 12 je nezbytný pro plynulou syntézu nukleových kyselin, buněčnou proliferaci, tvorbu a stabilitu membrán, syntézu myelinu, adrenalinu, kreatinu ad., maturaci erytrocytů a hematopoezu, má antiperniciózní účinek. Deficit nacházíme u malnutrice (vegani), malabsorpce (typicky při atrofické gastritidě, kdy chybí IF, nebo střevních zánětech), chronické pankreatitidě a interakci s některými léky a s alkoholem. Deficit dělíme do čtyř stádií: 1. plazmatické koncentrace; 2. koncentrace v buňkách; 3. metabolické odchylky (hyperhomocysteinémie, homocystinurie, acidóza ad.); 4. klinická manifestace deficitu. Ta zahrnuje megaloblastickou, permiciózní anémii (blokáda syntézy DNA v kostní dřeni vede k hromadění megaloblastů) a neuropatii (parestezie, bolest v končetinách, hypotonie, spasmy, paralýza, poruchy vnímání polohy, zmatenost, poruchy paměti, bradypsychika, demence, deprese). Pro laboratorní stanovení koncentrace v séru se používá nejčastěji chemiluminiscenční imunoesej. Vzhledem k tomu, že funkce B 12 je propojena s funkcí folátu, je nutné stanovení obou vitaminů zároveň. KAPITOLA 10 Vitamin C (kyselina askorbová) Kyselina askorbová je derivát monosacharidů, lakton kyseliny gulonové. Je významným antioxidantem díky přítomnosti dvou enolových hydroxylů. Během reakce se přeměňuje na biologicky neúčinnou kyselinu dehydroaskorbovou. I když je reakce vratná, většinou chybí činidlo pro zpětnou redukci na askorbát. Vit. C syntetizují rostliny i živočichové s výjimkou člověka, primátů a morčete. K hlavním potravinovým zdrojům v ČR patří brambory, mezi další bohaté zdroje patří např. paprika, kysané zelí, citrusy, jahody, černý rybíz. Vit. C je citlivý na zmrazování, dlouhodobé zahřívání, sušení, solení, působení kyslíku, světla a ionty kovů (hl. Cu, Fe, Al, Pb). Vit. C se vstřebává v jejunu a ileu Na + -dependentním aktivním transportem. Ten hraje hlavní roli také v ledvinných tubulech, do ostatních buněk vit. C vstupuje také transportéry podobnými nebo shodnými s glukosovým přenašečem GLUT-1 (facilitovaná difuze) a malou roli hraje také prostá difuze. K akumulaci v organismu, s výjimkou nadledvin, nedochází. Nejvíce se koncentruje v rostoucích a mladých buňkách, hlavně ve žlázách, leukocytech, játrech a oční čočce. Hlavním metabolitem je oxalová kyselina, což má význam při konzumaci vysokých dávek vitaminu, kdy se zvyšuje riziko oxalátové urolitiázy. Nevyužitý vit. C se vylučuje močí. Vit. C v běžných dávkách vykazuje antioxidační účinky, redukuje železité ionty na železnaté, čímž umožňuje jejich vstřebávání, chrání před oxidací (např. adrenalin), je esenciální pro funkci mnoha hydroxyláz např. lysinu a prolinu (význam pro tvorbu příčných můstků v kolagenu), fenylalaninu a tyrosinu (jejich katabolismus + tvorba katecholaminů), cholesterolu (přeměna na žlučové kyseliny), vznik steroidních hormonů, serotoninu, metabolismus kyseliny listové, histaminu, karnitinu ad. Je nezbytný pro funkci imunitního systému, chrání před toxickými účinky kovů. 145

146 Vitamíny Dlouhodobé užívání vysokých dávek vit. C však také vede k projevům toxicity. Stoupá především riziko rozvoje oxalátové urolitiázy. Dochází k okyselování organismu (může zvýšit riziko metabolické acidózy) a teoreticky se může projevit osmotická diuréza. Nadbytek vznikajících redukovaných forem iontů kovů (hl. Fe 2+ ) zvyšuje tvorbu reaktivních forem kyslíku, takže převáží prooxidační efekt vitaminu. U pacientů s deficitem glukóza-6-fosfátdehydrogenázy se může rozvinout hemolytická anémie. Při deficitu vit. C je přítomná únava, zvýšený sklon k infekcím, zhoršené hojení ran, slabost, svalová bolest, nechutenství, projevy na sliznicích, deprese, v důsledku snížené přeměny na žlučové kyseliny dochází k rozvoji hypercholesterolémie. Typickým onemocněním z nedostatku jsou kurděje (skorbut). Dochází ke krvácení z dásní a sliznic, uvolnění vazivového aparátu zubů, vzniku krevních podlitin a konečně anémii. Při podezření na deficit v současné době převládá stanovení plazmatické koncentrace (nejč. pomocí HPLC) i přesto, že neinformuje o tkáňových zásobách vitaminu C. K tomu je možno provést stanovení v leukocytech. Ty (společně s trombocyty) vychytávají askorbát z plazmy i proti koncentračnímu gradientu. Další možností je provedení saturačního testu, kdy po podání 500 mg askorbátu se močí normálně vyloučí minimálně 50%, při deficitu toto množství klesá. KAPITOLA 10 Biotin (dříve vit. H) Biotin je derivát 2 kondenzovaných heterocyklů, imidazolidinu a thiolanu, s kys. valerovou. Jeho dobrými potravinovými zdroji jsou žloutky, játra, čokoláda, kvasnice, obilniny, luštěniny, mořské ryby či ořechy. Velkou část potřeby u člověka pokrývá jeho syntéza střevní mikroflórou. Biotin v potravě je většinou vázán na proteiny. Ty jsou štěpeny na biotinylpeptidy, z kterých je biotin uvolněn biotinidázou. Vaječný bílek obsahuje termolabilní bílkovinu avidin, která biotin pevně váže, a brání tak jeho absorpci. Ta se uskutečňuje saturabilním aktivním Na + -dependentním multivitaminovým transportérem (kompetice s pantothenátem). Stejným mechanismem biotin vstupuje do buněk, hl. jater, svalů a ledvin, kde se nachází v cytosolu a mitochondriích jako kofaktor karboxyláz. Aktivní formou je karboxybiotin vázaný na enzym, k jehož vzniku jsou zapotřebí HCO 3-, ATP, Mg ++ a AcCoA. Nejvýznamnější kaboxylační reakce zahrnují acetylcoakarboxylázu syntézy mastných kyselin, vznik oxalacetátu a sukcinylcoa (anaplerotické reakce citrátového cyklu), dále je biotin nezbytný pro metabolismus cholesterolu, leucinu, glukoneogenezi, při buněčném růstu. K deficitu může dojít při malnutrici, špatné parenterální výživě nebo při značném příjmu syrového vaječného bílku. Vzácný je deficit biotinidázy. Klinické příznaky zahrnují dermatitidu, alopecii, deprese, nauseu a zvracení. Biotin se uplatňuje při zmírňování svalové bolesti, brání šedivění a vypadávání vlasů, zlepšuje kvalitu nehtů a pomáhá při kožních chorobách. Laboratorně je možno přímo stanovit koncentraci v séru / plazmě nebo nepřímo stanovit aktivitu biotin-dependentních enzymů. K hodnocení renální exkrece může být stanovena koncentrace metabolitu (kys. 3-hydroisovalerové) v moči. Vitaminy rozpustné v tucích Tyto vitaminy jsou v rostlinných i živočišných potravinách rozpuštěny v tucích, se kterými jsou ve střevech vstřebávány. Jejich hypovitaminóza tak může vzniknout i při dlouhodobé malabsorpci tuků, i když je jejich přívod v potravě dostatečný. Vstřebávají se v proximálním tenkém střevě, absorpce je usnadněna přítomností žlučových kyselin. V enterocytech se vitaminy stávají součástí chylomikronů, s nimiž vstupují do lymfy a posléze krve. Vitamin A (retinol) Vitamin A patří mezi isoprenoidy, jeho molekula obsahuje mj. 4 dvojné vazby v postranním řetězci, které mohou vytvářet příslušné cis, trans-izomery. Z nich však pouze dva jsou biologicky účinné. Vitamin A je přítomen v potravě ve formě retinolu nebo karotenoidů, z nichž nejznámější je beta-karoten, který má 6krát nižší účinnost než retinol. Část beta-karotenu je na retinol hydrolyzována ve střevech za pomocí enzymu beta-karoten-15,15 -dioxygenázy. Beta-karoten je tedy provitaminem vit. A. Zdrojem retinolu jsou játra, žloutek, tučné mléčné výrobky a ryby, karotenoidy jsou obsaženy hlavně v listové, žluté a oranžové zelenině a ovoci. Resorpce vit. A probíhá v duodenu. Nejprve dochází k hydrolýze esterů retinolu, volný retinol se pak dostává do enterocytů, kde je oxidován na retinal. Ten je buď zpětně redukován na retinol (většina) nebo oxidován na kyselinu retinovou. Retinol je reesterifikován mastnými kyselinami (hl. palmitovou) a vestavěn do chylomikronů, s nimiž vstupuje do lymfy a posléze krve. Společně s remnanty chylomikronů se estery retinolu dostávají do jater, kde jsou skladovány (retinyl-palmitát, 80-90% celkového množství 146

147 Vitamíny vit. A v organismu). V případě potřeby je retinol z jater uvolněn a transportován krví k extrahepatálním tkáním ve vazbě na retinol-vázající protein (RBP, Mr ), který se dále váže na prealbumin. Kyselina retinová se váže na albumin a karotenoidy cirkulují ve vazbě na LDL a HDL. Vychytávání komplexu retinol-rbp tkáněmi umožňují specifické receptory na povrchu buněk. Aktivní formou vitaminu A v buňkách je 11-cis-retinal a kyselina retinová. 11-cis-retinal je nezbytný pro reprodukci a vidění a jeho nedostatek způsobuje šeroslepost. V sítnici je biologicky aktivní forma vit. A, all-trans-retinol, po vstupu do buněk esterifikována a hydrolýzou je posléze uvolněn 11-cis-retinol. Ten je oxidován alkoholdehydrogenázou na 11-cis-retinal, který se společně s bílkovinou opsinem stává součástí pigmentu rhodopsinu (Mutace genu pro rhodopsin vede k retinitis pigmentosa.). Po absorpci fotonu dochází k izomerizaci 11-cis-retinalu na all-trans-retinal, což vyvolá jeho uvolnění z vazby na opsin. All-trans- -retinal je redukován na all-trans-retinol a celý cyklus se opakuje. Kyselina retinová je zodpovědná za ostatní účinky vitaminu A. Indukuje růst a diferenciaci epiteliálních buněk, růst kostí, podílí se na integritě lipoproteinů a lyzosomů a je nezbytná pro syntézu steroidních a tyroidálních hormonů a kalcitriolu. Kyselina retinová vzniká z retinolu oxidací v buňkách cílových tkání. Váže se na specifické jaderné receptory a takto aktivovaný komplex interaguje s chromatinem a aktivuje transkripci specifických genů, např. genu pro syntézu keratinu v epiteliálních buňkách. Obr.: Resorpce, transport a přeměny vit. A (upraveno dle Lippincott s illustrated reviews Biochemistry, 5th ed., str. 383, nejde mi vlozit do GD) Mezi příznaky deficitu vitaminu A patří šeroslepost, xeroftalmie, keratinizace epiteliálních buněk, xerodermie, hyperkeratóza nebo ichtyóza, zubní kaz, nechutenství. Deficit predisponuje k poruchám imunity a k infekcím hl. zažívacího a dýchacího traktu a při závažném nedostatku dochází ke keratinizaci až ulceraci rohovky a oslepnutí. Celková hladina vitaminu A v séru může být snížena až po vyčerpání jaterních zásob, nacházíme ji při onemocněních spojených s deficitem vitaminů rozpustných v tucích (malabsorpce lipidů, cystická fibróza, střevní záněty, defekt apob48 ad.) a při značné hypoproteinémii v důsledku nedostatku RBP a prealbuminu. Pro léčbu deficitu se používá retinol a jeho prekurzory (estery, karoteny). Kyselina retinová se používá v dermatologii pro léčbu akné (13-cis-retinová k., isotretinoin, p.o.; all-trans-retinová k., tretinoin, lokálně) a lupénky (tretinoin) a v onkologii při léčbě promyelocytární leukémie (tretinoin). Nadměrný příjem (100x DDD pro dospělé) vit. A je toxický a teratogenní, zatímco zvýšený příjem karotenoidů nikoliv. Při léčbě k. retinovou je třeba vyvarovat se těhotenství, za rizikovou dávku retinolu jsou považovány 3 mg, zejména pokud jej žena užívá v prvních 10 týdnech gravidity. Vzhledem k tomuto faktu by měla být každá žena, která plánuje těhotenství, poučena, aby se vyvarovala užívání vitaminových preparátů a potravin s vysokým obsahem vit. A. K časným projevům hypervitaminózy patří suchost a svědění pokožky, následuje alopecie, hepatomegalie až cirhóza, neurologické poruchy (zvýšení intrakraniálního tlaku, cefalea, diplopie). Při déletrvajícím deficitu se také zvyšuje poměr HDL/LDL, dochází k poruchám kostí. Teratogenní účinky zahrnují potraty a tzv. vit. A embryopatii (srdeční, ušní a nosní VVV, mandibulární hypoplasie, rozštěpy patra, hydrocefalus). Laboratorní stanovení umožňuje měření sérové koncentrace vitaminu A, toto stanovení však neposkytuje informaci o tkáňových zásobách vitaminu. Používanou metodikou je kapalinová chromatografie. KAPITOLA 10 Vitamin D Pod pojmem vitamin D zahrnujeme steroly erkalciol (ergokalciferol, vit. D 2 ) a kalciol (cholekalciferol, vit. D 3 ), které samy o sobě postrádají biologickou účinnost. Jejich přeměnami v organismu vzniká vlastní účinný hormon 1,25-dihydroxycholekalciferol (kalcitriol). Erkalciol je rostlinného původu a je tedy přijímán výhradně potravou. Kalciol je buďto přijímán živočišnou potravou, nebo je tvořen ze 7-dehydrocholesterolu v kůži působením UV záření. Pro dosažení dostatečných plazmatických hladin stačí 15 minut každodenní expozice obličeje a paží slunečním paprskům (bez použití ochranných krémů). Ve stáří je syntéza 7-dehydrocholesterolu i jeho přeměna na kalciol (cholekalciferol) snížena. K hlavním potravinovinovým zdrojům patří tučné ryby, žloutek, játra, sýry, máslo, fortifikované margaríny aj. tuky. Lipofilní vit. D z potravy se vstřebává v proximálním tenkém střevě. V enterocytu se stává součástí chylomikronů a lymfou a posléze krví se dostává do jater. V játrech dochází k hydroxylaci na kalcidiol (hlavní zásobní forma vit. D v organismu) a ten je dále hydroxylován v ledvinách (a placentě) na biologicky aktivní kalcitriol. Kalcidiol i ostatní metabolity podléhají enterohepatální cirkulaci. V plazmě je vit. D transportován ve vazbě na alfa1-globulin a DBP (vit. D binding protein, transkalciferin), s menší afi- 147

148 Vitamíny nitou se váže i na albumin a lipoproteiny. DBP má vysokou afinitu vůči kalcidiolu a neaktivní formě 24,25-dihydroxyD3, ale slabě váže kalcitriol, čímž se tento hormon stává biologicky snadno dostupným. Významnou zásobárnou kalciolu je tuková tkáň, za fyziologických podmínek je zde uloženo více než 50% vitaminu. Kalcitriol hraje společně s parathormonem (PTH) a kalcitoninem ústřední roli v hospodaření s vápníkem a fosfáty. Váže se na jaderné receptory v cílových buňkách (střevo, kosti, ledviny, placenta, mamma) a přímo ovlivňuje transkripci. Ve střevech zvyšuje absorpci Ca a fosfátů usnadněním vstupu do enterocytu změnou konformace cytosolového kalmodulinu, usnadněním transportu v enterocytu indukcí syntézy kalbindinu a usnadněním transportu Ca z enterocytu indukcí syntézy Ca ++ -ATPázy. V kostech urychluje maturaci osteoklastů, ale má vliv i na mineralizaci stimulací osteoblastů. V ledvinách zvyšuje resorpci Ca a fosfátů a zvyšuje jejich transport také v placentě a mléčných žlázách. Novější průzkumy také ukazují, že kalcitriol má imunomodulační, antiproliferativní a prodiferenciační účinky. Také syntéza a hladina kalcitriolu je regulována řadou mechanismů. Hlavním místem regulace je poslední krok syntézy kalcitriolu - reakce katalyzovaná 1alfa-hydroxylázou. Jejím hlavním aktivátorem je parathormon, inhibičně naopak působí Ca (přímo i nepřímo prostřednictvím PTH), fosfáty a produkt reakce (kalcitriol). Aktivita enzymu je také modulována stavem ABR a koncentracemi jiných hormonů (kalcitonin, inzulín, STH-IGF-I, prolaktin, pohlavní hormony). Dalším mechanismem regulace homeostázy kalcitriolu je aktivace syntézy 24,25-dihydroxyD 3 kalciolem a inhibice PTH. 24,25-dihydroxyD 3 je považován za neaktivní degradační produkt, jeho funkce není zcela jasná. Obr.: regulace hladiny a syntézy kalcitriolu (bude u Ca, kostí, hormonů?) K deficitu dochází při nedostatečném příjmu potravou, poruchách absorpce, cholestáze (nedostatek žluč. kyselin), nedostatečném osvitu slunečním zářením (roční období, indoor lifestyle, opalovací krémy), snížené hydroxylaci (jaterní a ledvinná onemocnění, hypoparathyreóza), nefrotickém syndromu. Demineralizace kostí vede u dětí k rozvoji křivice, u dospělých k osteomalacii. Jako léčba se podává vit. D, při rezistenci kalcitriol. Při chronickém renálním selhání se rozvíjí osteodystrofie v důsledku poklesu 1alfa-hydroxylace. Pacientům se podává kalcitriol a je nutno snížit hladinu fosfátů jako prevence tvorby kalcium-fosfátových kamenů. V současné době se odhaduje, že dlouhodobě nízká saturace organismu vitaminem D je přítomna minimálně u ⅓ zdravé evropské populace. Není spojena s typickými projevy deficitu, ale zvyšuje se riziko rozvoje autoimunitních (tyroiditida, revmatoidní artritida) a civilizačních onemocnění (nádory, deprese aj.). Při dlouhodobě velmi vysokém příjmu vit. D může dojít k projevům toxicity - ztráta chuti k jídlu, nausea, průjmy a zvracení, žízeň, svědění kůže, stupor. Rozvíjí se hyperkalcémie, která vede ke kalcifikacím, zejm. cévních stěn a ledvin. V současnosti se nejčastěji stanovuje plazmatická koncentrace kalcidiolu a kalcitriolu imunochemickými technikami, příp. HPLC. Stanovení kalcidiolu (25-hydroxycholekalciferolu) se jeví jako nejvhodnější pro určení celkových zásob vit. D v organismu. Pozn. k příjmu a DDD: 1 µg = 40 IU; DDD = 10 µg = 400 IU KAPITOLA 10 Příjem vitaminu D µg IU % DDD minut vystavení celého těla slunci losos /100 g sardinky /100 g máslo /100 g Vitamin E Jako vitamin E označujeme skupinu osmi tokoferolů a tokotrienolů, z nichž nejvyšší biologickou aktivitu má alfa-tokoferol. Ten je také nejběžněji zastoupen v potravě, k bohatým zdrojům patří obilné klíčky, ořechy, mák, žloutek. Lipofilní vit. E z potravy se resorbuje společně s tuky (míra resorpce je asi 35%), v enterocytech je zabudován do chylomikronů a dostává se do lymfy a krve. Vstupuje do buněk tkání, které mají aktivní lipoproteinovou lipázu, zbytek se spolu s remnanty dostává do jater. Zde je zabudován do VLDL a opět se dostává do cirkulace. Cílovými orgány jsou všechny tkáně, vyšší obsah je v buňkách s vysokým po2 (ery, plíce), skladován je v tukové tkáni. Exkrece probíhá ze 70-80% játry, zbytek močí jako k. tokoferová a gama-laktoglukuronidy. Vitamin E má antioxidační vlastnosti a v organismu slouží hlavně pro protekci polynenasycených mastných kyselin v plazmatických membránách a lipoproteinech před účinkem volných kyslíkových radikálů, zabraňuje oxidaci i jiných významných sloučenin. Podílí se na integritě membrán, chrání erytrocyty před hemolýzou, inhibuje mutageny v trávicím traktu, hraje roli v buněč- 148

149 Vitamíny ných signálních dráhách. Deficit vitaminu E se může vyskytnout jako řídká komplikace těžké a dlouhotrvající steatorey a špatné parenterální výživy nebo při malnutrici. Zvláště u dětí může dojít k rozvoji hemolytické anémie v důsledku porušené stability membrány erytrocytů. Je také snížena životnost ery a zvýšená agregabilita trombocytů. Dochází k funkčním změnám periferního nervstva a zvýšení exkrece kreatininu a zvýšení aktivity CK v důsledku narušení membrány a rozpadu buněk kosterního svalstva. Dlouhodobý deficit doprovází myopatie, nekrózy svalů, hypo- až areflexie, spinocereberální ataxie, retinopatie. Mezi toxické projevy při předávkování patří gastrointestinální potíže, únava, bolesti hlavy, svalová slabost. Předávkování u těhotných (20-70 x DDD) může vyvolat poškození plodu (vrozené vývojové vady srdce, omfalokéla, změny porodní hmotnosti). Pro stanovení koncentrace vitaminu E v plazmě či séru se využívá nejčastěji kapalinová chromatografie s UV nebo fluorescenční detekcí, je možno využít i plynovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií. KAPITOLA 10 Vitamin K Jako vitamin K označujeme deriváty naftochinonu fylochinon (fytomenadion, K 1 ) a menachinony (K 2 ). Zdrojem fylochinonu je potrava především listová zelenina, brokolice, ovesné vločky; menachinon je syntetizován střevními bakteriemi (syntéza normálně pokryje potřebu vit. K) a také je obsažen ve fermentovaných potravinách (jogurty, sýry) a játrech přežvýkavců. Stejné účinky jako přirozený vitamin mají také syntetické deriváty menadiol a menadion, které jsou rozpustné ve vodě. Resorpce probíhá v tenkém i tlustém střevě, 10-80% přijatého vit. K, ten je lymfou a posléze krví transportován do cílových tkání. V játrech probíhá skladování především K 2, zásoby jsou ale omezené, proto je zapotřebí trvalé substituce. Vitamin K je nezbytný pro posttranslační přeměnu glutamátových zbytků v bílkovinách na gama-karboxyglutamát, který je následně schopen vázat Ca 2+. K této přeměně dochází ve faktorech krevního srážení II, VII, IX a X, proteinu C a S a také osteokalcinu, bílkovině produkované osteoblasty a nezbytné pro kostní novotvorbu a remodelaci. K deficitu vitaminu K dochází nejčastěji v důsledku léčby antikoagulanty (kumariny = warfarin inhibice cyklu vit. K v endoplazmatickém retikulu jater) a jeho typickým projevem je zvýšená krvácivost. Mezi méně časté příčiny deficitu patří malabsorpce lipidů (např. při obstrukčním ikteru) a chybění střevní mikroflóry po antibiotické terapii. Deficit a nutnost substituce u novorozenců je fyziologická, protože vit. K neprochází přes placentární bariéru a střevo novorozenců je sterilní. Vit. K 1 se používá jako antidotum při předávkování p.o. antikoagulancii, společně s transfúzí krevní plazmy. Protože jeho účinek přetrvává několik dní až týdnů, po zástavě krvácení je nutno provést krátkodobou antikoagulační léčbu heparinem. Pro stanovení koncentrace vitaminu K 1 v plazmě se využívá převážně kapalinová chromatografie. Kazuistiky 1. K hospitalizaci byl přijat pacient s ikterem a bolestí v pravém epigastriu. Je bledý, má horečku a třesavku. Lab. nález: ALP 8,5 mikrokat/l, AST 0,64 mikrokat/l, celkový bilirubin 418 mikromol/l, konjugovaný bilirubin 311 mikromol/l, v moči pozitivní bilirubin, negativní urobilinogen, protrombinový čas prodloužený, celkový cholesterol 7,5 mmol/l. Co je nejpravděpodobnější příčinu ikteru u pacienta? Proč je prodloužen protrombinový čas? Odpověďi: Ikterus je způsoben extrahepatální obstrukcí. Prodloužení protrombinového času je způsobeno chyběním vitaminu K nutného pro aktivaci protrombinu. Vitamin K je rozpustný v tucích a při cholestáze dochází k malabsorpci lipidů. Po injekci vitaminu K došlo k úpravě protrombinového času. 149

150 Štítná žláza - příprava Štítná žláza - příprava Autor: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. Recenzenti: MUdr. Daniel Rajdl, Ph.D. KAPITOLA 11 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Štítná žláza je v dospělosti orgánem o váze cca 20 g a objemu ml. Porucha funkce štítné žlázy ovlivňuje intermediární metabolizmus všech buněk v lidském těle. Dysfunkce štítné žlázy spolu s obezitou a diabetem tvoří triádu nejčastějších endokrinopatií v populaci. Laboratorní vyšetření je základním pilířem v diagnostice, léčbě a sledování poruch funkce štítné žlázy, neboť jejich změna často předchází rozvoj klinických příznaků. Anatomické a histologické poznámky Štítná žláza vzniká vychlípením spodiny faryngu, dále pak sestupuje ke kořeni jazyka a dolů před tracheu (průběh této sestupné trasy je nazýván jako duktus thyreoglossus). Definitivně je štítné žláza uložena těsně pod prstencovou chrupavkou a nad jugulární jamkou v úrovní obratlů C5- Th1. Skládá se z pravého a levého laloku spojených istmem štítné žlázy. Velikost obou laloků je závislá na zásobení jódem, věku a pohlaví. Při dostatečném zásobení jódem je normální velikosti štítné žlázy (měřeno sonogragicky) u dospělé ženy do 18 ml a u mužů do 22 ml. Štítná žláza má bohaté krevní zásobení a to z obou stran a. thyroidea superior a a. thyroidea inferior zásobující oba laloky štítné žlázy a a. thyroidea ima zásobující istmus. Krev je odváděna žilami cestou v. thyroidea superior, media a inferior. V těsné anatomické souvislosti se štítnou žlázou probíhají podél okrajů obou krajů laloků n. laryngeus recurrens dexter a sinister, jehož poranění je častou komplikací chirurgických výkonů na štítné žláze. Na zadní ploše obou laloků se nalézají 2 páry příštítných tělísek, které naléhají na štítnou žlázu zezadu nejčastěji v horní a střední částí obou laloků. Jsou zodpovědné za tvorbu parathormonu. (Obrázek 11p.1) 150

151 Štítná žláza - příprava KAPITOLA 11 Obrázek 11p.1 Základní histologickou funkční jednotkou štítné žlázy je folikul. Jde o přibližně kulovité útvary o průměru 300 µm. Stěna je tvořena folikulárními buňkami jejichž bazální část naléhá na mezifolikulární prostor s bohatým cévním a lymfatickým zásobením. 151

152 Štítná žláza - příprava Vnitřní, apikální, část je obrácena do lumen folikulu a obsahuje koloid, jehož hlavní složkou je tyreoglobulin. V mezifolikulárním prostoru se kromě bohatého cévního a lymfatického drenážního systému nacházejí parafolikulární buňky (C-buňky) produkující kalcitonin, které do štítné žlázy vcestovaly v průběhu embryogeneze. (obrázek 11p.2 a 11p.3) KAPITOLA 11 Obrázek 11p.2 a 11p.3 Klíčové informace Metabolizmus hormonů štítné žlázy Jód je nezbytný k syntéze hormonů ve štítné žláze, denní potřeba je cca µg/den, v ČR je zdrojem jodovaná sůl. Tyreocyt aktivně vychytává z cirkulace jód, který se na apikální straně chemicky váže na aminokyselinu tyrosin v tyreoglobulinu. Syntéza hormonů štítné žlázy probíhá v koloidu a tyreoglobulin je donátorem tyrosinu a zároveň matricí, na které dochází ke slučování jodovaných tyrosilových AMK na tetrajodtyronin (T4) a trijiodtyronin (T3). Majoritním produktem štítné žlázy je T4 (tetrajodtyronin). T4 a T3 jsou v plazmě vázány na transportní bílkoviny (TBG, transtyretin, albumin), které udržují stabilní hladinu cirkulujících T4 a T3. Štítná žláza je zdrojem pouze 20 % koncentrace T3 v cirkulaci, majorita T3 vzniká dejodací z T4 v periferních tkáních. Pouze 0,03 % T4 a 0,03 % T3 se nachází v cirkulaci ve volné biologicky dostupné formě a jde o tzv. volný T4 (freet4, FT4) a volný T3 (free T3, FT3), jejichž hladiny jsou odpovědné za biologický efekt. T4 je v periferních tkáních konvertován na biologicky aktivní T3, nebo deaktivován na reverzní T3 (rt3) a to účinkem specifických enzymů dejodáz ( ty jsou závislé na dostatku Selenu- selenoenzymy). T3 i částečně T4 jsou aktivně transportovány do buněk, kde hlavní efekt T3 je zprostředkován skrze jaderné receptory pro T3. T3 především zvyšuje bazální metabolické tempo (lipolýzu, glykogenolýzu, glukoneogenezi a současně i spotřebu O 2 a produkci tepla). Degradace T4 a T3 se děje především dejodací dejodázami a dále sulfonidací a glukorunidací. Regulace tyreoidálních hormonů Klíčové součásti regulace produkce tyreoidálních hormonů jsou 4 (Obr 11.4): A. Hypotalamus (produkce Tyreotropin releasing hormonu, TRH) B. Hypofýza (produkce Tyreoidálního stimulačního hormonu, TSH) 152

153 Štítná žláza - příprava C. Štítná žláza (produkce T4, minimálně T3-15%) D. Periferní tkáně (produkce T3) Klíčovou roli v regulaci hraje TSH, který je stimulován TRH a naopak zpětně blokován volnými frakcemi FT4 a FT3 a to nezávisle. Existuje řada lokálních faktorů, které ovlivňují především sekreci TRH a TSH na lokální úrovni (např. somatostatin, dopamin, stres, chlad), většinou jsou krátkodobé a nemají vliv na hladiny FT4 a FT3 TSH má stimulační vliv na tyreocyty, vede k jejich hypertrofii a proliferaci a finálně ke zvýšení produkce T4. Hladina TSH 100 x citlivěji reaguje na individuální změny hladiny FT4, TSH je pak nejcitlivějším markerem změny možné tyreoidální dysfunkce. Hladiny T4 závisí na produkci TSH, dostatku jódu a v případě celkových frakcí na hladinách vazebných proteinů. Předpokládá se, že každý jedinec má geneticky definovanou optimální hladinu hormonů štítné žlázy, a proto referenční meze FT4 vykazují poměrně široké rozpětí. Hladina T3 závisí na stavu produkce T4, funkci dejodáz (dostatku selenu) a metabolickém stavu (viz low T3 syndrom). Předpokladem správné tyreoidální funkce je tedy normální funkce osy hypotalamus-hypofýza, dostatek jódu a selenu, nepřítomnost poškození štítné žlázy (nejčastěji autoimunitní) a nepřítomnost závažných komorbidit KAPITOLA

154 Štítná žláza - příprava KAPITOLA 11 Obrázek 11p.4 Laboratorní parametry u vyšetření štítné žlázy TSH Shodná beta podjednotka s FSH, LH, hcg, při jejich nadbytku dochází i ke stimulaci štítné žlázy (těhotenství, mola hydatinoza) TSH má stimuluje tvorbu hormonů v tyreocytech a zároveň má i proliferační efekt 154

155 Štítná žláza - příprava T4 a T3 Biologicky jsou aktivní jejich volné frakce. Koncentrace T4 odráží produkci ve štítné žláze Koncentrace T3 odráží za aktivitu periferních dejodáz, především jaterní, ale existuje hyperfunkce štítné žlázy z izolované nadprodukce nadprodukce T3. TBG Produkce stimulována estrogeny (těhotenství), defekt v produkci je velmi vzácný Tg (tyreoglobulin) Koncentrace v séru koreluje s velikostí štítné žlázy, její aktivitou a s aktitvitou onemocnění štítné žlázy (záněty, nádory) Anti TSH Ve většině se jedná o stimulující protilátky, které vedou k Graves-Basedowově tyreotoxikóze, výjimečně jsou inhibiční a vyvolají hypotyreózu. Jsou zodpovědné ze endokrinní orbitopatii při Graves-Basedowově tyreotoxikóze. Anti TPO, Anti Tg Jsou hlavní markery Hashimotovy tyreoiditidy - chronického lymfocytárního zánětu, Anti TPO jsou hlavním rizikovým markerem, Anti Tg jsou častější izolovaně u jodově deficitních jedinců a u jedinců s uzlovitou strumou. Patří mezi metody s nejvýznamnějšími rozdíly mezi stanoveními koncetrací různými metodami. Přítomnost Anti Tg v séru může interferovat při stanovení TG a vést k falešně pozitivním nebo negativním výsledkům. KAPITOLA 11 Metabolizmus hormonů štítné žlázy Štítná žláza je místem produkce tyreoidálních hormonů T4 ( tetrajodtyroninu, tyroxinu) a T3 (trijodtyroninu). Majoritním produktem štítné žlázy je T4, zatímco buněčně aktivním hormonem je T3. Lidské tělo, musí tedy zajistit transport vyprodukovaného T4 a jeho následnou konverzi na aktivní T3 a následnou deaktivaci a degradaci, což provádějí především tkáňové enzymy dejódázy. Metabolizmus jódu Jód je spolu se selenem esenciálním prvkem v metabolizmu hormonů štítné žlázy. Jeho dostatečný přísun je nezbytný pro tvorbu T4 (T3) ve štítné žláze. Nedostatek jódu vede k nedostatečné produkci hormonů štítné žlázy s klinickými projevy od strumy po těžké poškození CNS (kretenismus) u novorozenců. Jeho příjem je geograficky závislý na jeho obsahu v přírodě. Česká republika svým přirozeným obsahem patří mezi regiony s deficitem jódu, a proto jodace potravin (soli), vody je nezbytná. Běžná denní potřeba jódu se u dospělého člověk pohybuje okolo 80 µg/den a u těhotných až 200 µg/den. Jód je získán jednak zpětným využitím hormonů T4 a T3 a dále především jeho vychytáváním z krve. Hlavní ztráty jódu po degradaci T4 a T3 se dějí v ledvinách a stolicí, přičemž odpad stolicí je poměrně stálý cca 16 µg/den. Stanovení jodurie poskytuje základní informaci o stavu zásobení jódem. Optimální denní příjem jódu se tedy pohybuje mezi µg/den a u těhotných µg/den. Syntéza tyreoidálních hormonů Vychytávání jódu na bazální membráně folikulárních buněk je aktivní proces pomocí ATP dependentního Sodium-iodine symporter (NIS). Jeho aktivitu zvyšuje TSH a blokují kompetitivní inhibitory jako anionty thiokyanátu (SCN -) a perchlorátu (ClO4 -). NIS lze fyziologicky nalézt i v jiných orgánech např. mléčné žláze, slinné žláze, placentě, CNS. V mléčné žláze zajišťuje přenos jódu do mateřského mléka. Po vychytání na bazální membráně je jód transportován směrem do apikální (luminální stranu). Zde je oxidován pomocí tyreoidální peroxidázy (TPO) na reaktivní volný jód, který se ihned váže na tyrosiny v molekule tyreoglobulinu. Tento proces probíhá v koloidu v blízkosti apikální membrány. Vzniká tak tyreoglobulin bohatý na 155

156 Štítná žláza - příprava jodované tyrosiny (monojodtyrosin MIT a dijodtyrosin DIT). Na tyreoglubulinu následně dochází, díky prostorovému uspořádání tj. blízkosti MIT a DIT na tyreoglobulinu, ke spojení 2 tyrosinových molekul za vzniku trijodtyroninu (T3) a tetrajodtyroninu tyroxinu (T4), opět za účasti TPO (Obr a 11.5) KAPITOLA 11 Obrázek 11p.5 Obrázek 11p.6 Tyreoglobulin obsahující T4, T3 a DIT a MIT je endocytován zpět do tyreocytu a účinkem fagolyzozómů je hydrolyzován TG, přičemž jsou uvolněny T3 a T4 do sekrečních granulí krve, zatímco z MIT a DIT se odštěpí jodid, který je uvnitř buňky recyklován pro další syntézu stejně jako TG. Sekrece T4 a T3 do cirkulace je řízena TSH. Štítná žláza produkuje více T4 (70%) než T3. T3 je 156

157 Štítná žláza - příprava metabolicky aktivnější (3-8x) a T4 je tedy spíše prohormonem. Po transportu krví do periferních tkání je T4 přeměněn na aktivní T3. Transport T4 a T3 do periferní tkáně: T4 a T3 jsou v plazmě transportovány ve vazbě na transportní bílkoviny. Pouze malá část je v plazmě volná (metabolicky aktivní) a měříme ji jako volnou T4 (0,02-0,05% celkového T4 - TT4) a volnou T3 (0,01-0,3%). Hlavními transportními bílkovinami jsou Tyroxin Binding Globulin TBG, prealbumin (transtyretin), albumin. T4 a T3 vázané na transportní bílkoviny představují pool hormonů štítné žlázy pro tkáně, zajišťují stabilní hladiny volných T hormonů a chrání T4 a T3 před ztrátou do moči. Naopak hladiny volných FT4 a FT3 se prakticky nemění při změnách koncentrací vazebných proteinů, kromě extrémů. Např. během těhotenství roste TBG o 200 %, ale koncentrace volného FT4 a FT3 zůstává beze změny, obráceně je tomu u malnutrice. KAPITOLA 11 Konverze a eliminace T4 a T3 : Štítnou žlázou vyprodukovaný T4 se zhruba z 1/3 mění na T3, dále z 1/3 na rt3 (metabolicky neaktivní) a zbytek je degradován glukuronidací a sulfatací v játrech. Konverzi T4 na aktivní T3 či neaktivní rt3 zajišťují tkáňově specifické enzymy dejodázy (seleno dependentní enzymy). Ty rovněž zajišťují i degradaci rt3 a T3 na T2. V organizmu existují 3. typy dejodáz, které se liší lokalizací v orgánech, specificitou vůči substrátu a citlivostí na propylthiouracyl (PTU). Ke své funkci potřebují selen vázaný na cystein místo síry, selen pak v reakci odebírá jodid. Dejodáza typu I. D1 výskyt játra ledviny, štítná žláza; majoritně degraduje rt3 na T2 a T4 na T3, je zdrojem majoritního poolu T3 v cirkulaci a podílí se na zachování jódu pro další syntézu hormonů štítné žlázy, tj. při hypertyreóze stoupá její aktivita, což ještě zhoršuje stav, je inhibována PTU. Dejodáza typ II. D2 - výskyt mozek, hypofýza sval, srdce, hnědá tuková tkáň, tvoří lokálně T3 z T4, je málo až necitlivá k PTU Dejodáza typ III. D3 - mozek, placenta, kůže, zodpovídá za deaktivaci T4 na rt3 a T2, v placentě reguluje přechod hormonů do fetálního oběhu, je málo až necitlivá citlivá k PTU. Fyziologické účinky tyreoidálních hormonů: Hormony štítné žlázy mají intracelulárně uložený receptor (TR), větší afinitu a biologickou aktivitu vykazuje T3, Receptory se nachází v jádře buněk. Vazbou hormonu s receptorem vzniká TRE (Thyroid Response Element), který se váže na DNA a vyvolá expresi specifických genů a u jiných naopak supresi. TR je součástí skupiny intercelulárních receptorů zahrnujících receptory pro: estrogeny, progesteron, androgeny, gluko- a mineralokortikoidy, vitamin D. TR existují minimálně ve 4 izoformách TRα1, TRα2, TRβ1, TRβ2. DNA vazebná doména obsahuje zinek. Hlavním metabolickým efektem T3 je regulace bazálního metabolického tempa Basal Metabolic Rate, kromě stimulace lipolýzy, glykogenolýzy a glukoneogeneze, zvyšuje citlivost buněk na katecholaminy a současně zvyšuje spotřebu O 2 a produkci tepla. Regulace tyreoidálních hormonů viz klíčové informace a dále Osa hypotalamus hypofýza štítná žláza periferní tkáně Nejvyšším a prvním stupněm regulace syntézy tyreoidálních hormonů je CNS, produkce neurotrasmiterů má tedy jak stimulující tak inhibující účinek na produkci a uvolňování TRH. Řídící mechanizmy na úrovni hypotalamu: 1. Stimulující faktory produkce TRH: Stres, chlad, leptin, andrenergní receptorové dráhy. 2. Inhibující faktory: teplo, T3, dopaminergní a opoidní receptorové dráhy Na regulaci na úrovni hypofýzy se podílí především TRH, který stimuluje výdej TSH v hypofýze, a naopak somatostatin, jenž sekreci TSH inhibuje. Hlavní zpětně vazebná inhibice je realizována přes T3 (T4). Kromě těchto mechanizmů se na regulaci podílí celá řada mediátorů, signálních molekul, hormonů. 157

158 Štítná žláza - příprava Řídící mechanizmy na úrovni hypofýzy: 1. Inhibice výdeje TSH: androgeny, T3 (T4), kortizol, zánětlivé cytokininy (IL6, TNF α, IL1β ), malnutrice, dále Cholecystokinin (CCK), gastrin-releasing peptide (GRP), neuropeptidey (NPY). 2. Stimulace výdeje TSH: leptin, růstový hormon (GH) estrogeny, vasopressin (AVP), glucagon-like peptide-1 (GLP-1), galanin Je třeba si uvědomit, že vlastní biologický efekt TSH je odvislý od potranslační modifikace, tj glykace. Tento fakt se může projevit u některých forem centrálních hypotyreózy, kdy měřená hodnota TSH neodpovídá klinickému stavu, KAPITOLA 11 Na úrovni štítné žlázy jsou hlavními regulačními mechanizmy TSH a zpětná vazba přes T3 (T4). Inhibici syntézy hormonů štítné žlázy způsobuje rovněž nadbytek jódu a to blokací tvorby peroxidu vodíku s následnou oxidací jódu a vazbou na tyreoglobulin (tzv. Wolff-Chaikoff efekt). Syntézu hormonů ve štítné žláze rovněž blokují látky používané k léčbě hypertyreózy - thioamidy (propylthiouracil a methimazol). Mezi hladinou FT4 a TSH existuje vzájemný logaritmický vztah viz Obr. 7, TSH pak 100x citlivěji reaguje na změny hladin FT4, proto TSH také využíváme jako nejcitlivějšího parametru k detekci tyreoidální dysfunkce. Obrázek 11p.7 Popis laboratorních parametrů Tyreoidální stimulační hormon (TSH, tyreotropin) TSH je glykoproteinový hormon o molekulové hmotnosti kda, který je produkován tyreotropy (bazofilními buňkami) v předním laloku hypofýzy. Patři do skupiny glykoproteinových hormonů (FSH, LH, hcg), které mají společnou α podjednotku a liší se v β podjednotce. α podjednotka je kódována společným genem na chromozómu 6 a skládá se ze 4 exonů a 3 intronů. β podjednotka je kódována genem na 1. chromozómu a skládá se z 3 exonů a 2 intronů. Vlastní protein je tedy tvořen α řetězcem o 92 aminokyselinách a β řetězcem o 112 aminokyselinách. Tento β řetězec je v 38% homologií s β řetězcem molekuly hcg. To nabývá významu v těhotenství či v případě hydatinózní moly, kdy nadbytek hcg a částečná homologie vedou ke stimulaci TSH 158

159 Štítná žláza - příprava receptorů ve štítné žláze a tedy k hypertyreóze. Karbohydráty tvoří 15-20% relativní molekulové hmotnosti TSH a zahrnují 3 oligosacharidové řetězce (2 vázané na α podjednotku a 1 na β podjednotku). Proces glykace je velmi důležitý pro biologickou aktivitu TSH. Některé formy centrální hypotyreózy jsou způsobeny sníženou biologickou aktivitou při poruše glykace TSH. Jeho uvolňování do krevního oběhu je řízeno hypotalamem prostřednictvím TRH a somatostatinu. TSH se váže na svůj specifický TSH receptor, což je receptor ze skupiny G protein aktivujících receptorů. TSH receptor se skládá: A. Extracelulární doména : váže TSH a protilátky proti TSH, 40% shoda s receptory pro FSH a LH, 398 aminokyselin KAPITOLA 11 B. Transmembránová doména 7 transmembránových domén, 70% shoda s FSH a LH receptory, 346 aminokyselin, aktivace G proteinu na třetí kličce. TSH má za předpokladu intaktní hypotalamo-hypofyzární osy logaritmický vztah s volnou T4, což znamená, že jen malá změna FT4 se projeví 10x větší změnou TSH. Funkce TSH : 1. Stimuluje různé funkce tyreocytů: vychytávání a organifikaci jódu, tvorbu TG a tvorbu a sekrece hormonů štítné žlázy. 2. Podporuje růst tyreocytů hypertrofii a hyperplazii 3. Inhibuje apoptózu tyreocytů 4. Extratyroidální funkce: přes své receptory ovlivňuje lymfocyty, adipocyty, adrenální a testikulární buňky Hormony štítné žlázy T4 a T3 Hormony štítné žlázy jsou tyroxin (T4), trijodtyronin (T3) a reverzní trijodtyronin (rt3), dijodtyroniny (T2), monojodtyroniny (T1). Většina hormonů cirkulujících v krvi je vázána na transportní bílkoviny a tudíž biologicky inaktivní. Biologickou aktivitu vykazuje jen malá část hormonů, která se v krvi vyskytuje ve volné formě. Celkové koncentrace hormonů štítné žlázy celkový T3 (TT3) a celkový (TT4) mají diagnostickou hodnotu pouze v případě, že není změněna vazebná kapacita transportních bílkovin (užíváním nejrůznějších léků, závažným celkovým onemocněním aj.). Volné frakce tyroxinu (FT4) a trijodtyroninu (FT3) naopak informují o aktuálním stavu funkce štítné žlázy. Tyroxin Binding Globulin (TBG) TBG je hlavním transportní proteinem T hormonů v plazmě, má relativní molekulovnou hmotnost 5400 Da, je produkován v játrech, skládá se z 395 aminokyselin. TBG gen je lokalizován na X chromozómu a je složen z 6 exonů. Indikace k jeho stanovení jsou velmi řídké, dnes je to především vrozený deficit TBG a diskrepance výsledků TT4 a FT4. Tyreoglobulin (Tg) Lidský TG je glykoprotein, obsahující jód, o relativní molekulové hmotnosti Da. Skládá se ze 2 identikých polypeptidových řetězců. Karbohydráty tvoří necelých 10% hmotnosti. Zhruba 30% jódu vázaného na TG je ve formě T3 a T4, zbytek tvoří neaktivní prekurzory monojódtyrozin (MIT) a dijódtyrozin (DIT). Ve folikulárním lumen dosahuje koncentrace g/l. Tg gen se nachází na 8 chromozomu, skládá se 48 exonů. TG je za normálních podmínek syntetizován ve folikulárních buňkách štítné žlázy. Jeho syntéza je řízena TSH. Poločas v plazmě je 3-4 dny. 1 g normální tkáně štítné žlázy produkuje 1-2 ug/l TG při normální koncentraci TSH a jeho koncentrace koreluje s objemem štítné žlázy, dále pak s aktivitou štítné žlázy (zvýšená u hyperfunkce) a zvyšuje se i s aktivitou zánětlivých nebo nádorových procesů. Autoprotilátky Autoimunitní onemocnění štítné žlázy je nejčastější příčinou poruch funkce štítné žlázy a u žen je 4x častější než u mužů v oblastech bez jódového deficitu. Stanovení autoprotilátek má diferenciálně diagnostický a prediktivní význam. Metody na stanovení protilátek anti TPO, anti TG a anti TSH vykazují velkou heterogenitu ve výsledcích, rozdílné senzitivity a specificity, což je způsobeno: 159

160 Štítná žláza - příprava a. protilátky interindividuálně rozeznávají rozdílné epitopy, mají rozdílnou afinitu a většinou se jedná o směs heterogenní protilátek b. výrobci používají rozdílné standardy, rozdílné metody detekce (kompetitivní a nekompetitivní) a rozdílně připravené antigeny. Tyto dva základní postuláty vedou k rozdílným výsledkům mezi jednotlivými metodikami v řádech desítek až stovek procent. Protilátky proti TSH receptoru -Anti TSH (atsh, TRAb) KAPITOLA 11 Protilátky proti TSH receptoru můžeme podle funkce rozdělit do 2 skupin: 1. TRAbS (Thyroid receptor stimulating antibodies) vazba na N terminální region vede k imitaci funkce TSH, stimulace produkce a výdeje hormonů štítné žlázy a růstu buněk. Jsou etiologickým faktorem Graves Basedowovy tyreotoxikózy. 2. TRAbB (Thyroid receptor blocking antibodies) vazba na C terminální region vede k inhibici vazby TSH a tedy ke snížení výdeje hormonů štítné žlázy. Pomocí běžných imunoanalytických metod nelze tyto 2 protilátky rozlišit, rozlišení je možné pomocí biologických analýz. U jednoho jednice se mohou vyskytnou jak stimulující, tak blokující protilátky (výjimečně) a to jak současně, tak po sobě, což zásadně ovlivňuje klinický obraz. Jsou zodpovědné za klinickou manifestaci endokrinní oftalmopatie i u eutyreoidiních jedinců. Protilátky procházejí transplacentárně a jsou rizikovým faktorem fetální hypertyreózy. Protilátky proti tyreoidální peroxidáze, AntiTPO (atpo, TPOAb) Tyreoidální peroxidáza je enzym lokalizovaný na apikální membráně tyreocytů a katalyzuje tvorbu peroxidu vodíku a tím následnou organifikaci jódu a jeho vazbu na TG. Má relativní molekulovou hmotnost cca Da. Gen pro TPO se nachází na 2. chromozómu. V normálních případech je gen kódem pro dva proteiny (TPO1 a TPO2), které vznikají postranskripčními modifikacemi mrna. Anti TPO byly původně popsány jako autoprotilátky proti mikrozomům, teprve později byl jako hlavní antigen detekována tyreoidální peroxidáza. Anti TPO jsou protilátky třídy IgG, které mají velkou interindividuální variabilitu v podtřídách (IgG1, IgG2 a IgG3) a v reaktivitě. Na rozdíl od anti Tg jsou schopny fixovat komplement. Jsou hlavním markerem chronické lymfocytární tyreoiditidy. Protilátky proti tyreoglobulinu, Anti-Tg (atg, TG Ab) Na rozdíl od anti TPO nedokáží fixovat komplement, mají větší heterogenitu vzhledem k velkému počtu epitopů na Tg. Jsou obdobným markerem autoimunitní tyreoiditidy, ale mají vyšší frekvenci výskytu pozitivity než anti TPO v jodově deficitních oblastech a u pacientů s modulární strumou. Mohou interferovat se stanovením Tg ( způsobit jeho falešnou pozitivitu či negativitu) a mají vyšší variabilitu interidividuální a i v reaktivitě než anti TPO. Literatura: 1. L. De Groot: Thyroid Disease Manager,, chapters 1-7http:// 2. L.M Demers, C. Spenser: LABORATORY MEDICINE PRACTICE GUIDELINES Laboratory Support for the Diagnosis and Monitoring of Thyroid Disease;NACB 2002, český překlad 2009, vydal AV Pron, Plzeň, ISBN , 3. J.Fiala, J.Valenta : Anatomie štítné žlázy, CEVA [online] , poslední aktualizace [ ]. Dostupný z WWW: ISSN Z. Límanová, Štítná žláza, kapitola 2 a 3, Trendy soudobé endokrinologie, Galén, Praha, L. J. DeGroot,J. L. Jameson Endocrinology Volume 2, W.B.Saunders Copany, L. Thomas: Clinical Laboratory Diagnostics, TH-Books,

161 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Autor: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. Recenzent: doc. RNDr. Kristian Šafarčík, Ph.D., Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D. KAPITOLA 11 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Specifické laboratorní vyšetření u poruch funkce štítné žlázy je velmi důležité, neboť laboratorní známky tyreopatií jsou často citlivější než klinické příznaky. Na druhé straně některé tyreopatie mohou být laboratorně beze změn (eufunkční struma, uzly štítné žlázy). V textu se věnujeme pouze parametrům hrazeným z veřejného zdravotního pojištění a tedy užívaným v běžné praxi. Mezi specifické parametry vyšetřování tyreopatií patří: Základní testy : Parametry funkce štítné žlázy : TSH Tyreoidální stimulační hormon (TSH), volný T4 (FT4), volný T3 (FT3), celkový T4 ( TT4), celkový T3 (TT3) Parametry autoimunity: protilátky proti TSH receptoru (Anti TSH, TRAK, TRAb), protilátky proti tyreoidální peroxidáze (Anti TPO,TPOAb), protilátky proti tyreoglobulinu (Anti Tg, TgAb) Ostatní testy : Tyreoglobulin (Tg), Jodurie,Tyroxin Binding Globulin (TBG), Kalcitonin, Klíčové informace: Indikace vyšetření Obecné: Doporučuje se užívat metodu stanovení TSH s funkční citlivostí min. 0,02 miu/. Je dána přednost stanovení volných T4 a T3. Stanovení T3 je indikováno pouze u hyperfunkce štítné žlázy, Stanovení Anti TPO a Anti Tg jsou indikována při podezření na autoimunní tyreopatii, a u rizikových skupin Anti TSH je indikováno v případě podezření na Graves-Basedowu tyreotoxikózu, ke sledování efektu její léčby a dále při objasnění etiologie exoftalmu. Stanovení Tyreoglobulinu (Tg) je indikováno jako nádorový marker u pacientů s diferencovaným karcinomem štítné žlázy a to vždy spolu AntiTg. Stanovení kalcitoninu je indikováno při podezření na medulární karcinom štítné žlázy Specifická diagnostika a monitorování tyreopatií U ambulantních pacientů je první metodou volby stanovení TSH, které je schopno diagnostikovat i subklinické poruchy. U pacientů léčených pro hypofunkci štítné žlázy se provádí TSH, FT4 U pacientů léčených pro hyperfunkci štítné žlázy se provádí TSH, FT4, FT3 a Anti TSH u G-B tyreotoxikózy. Specifická diagnostika a monitorace tyreopatie rizikové skupiny U rizikových skupin je indikováno pravidelné kontrolní stanovení TSH a Anti TPO, AntiTg 1x za 2 roky. 161

162 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Do rizikových skupin vzniku tyreopatie patří: Těhotné ženy Pacientky s poruchou fertility Ženy nad 50 let Pacienti s jinými autoimunitními onemocněními (hlavně DM I. typu, celiakie atd.) Pacienti s manifestní ICHS, tachyarytmiemi Pacienti s léky či léčbou indukující tyreopatie (amiodaron, lithium, interferony gama i další, radioterapie v oblasti krku a hrudníku) KAPITOLA 11 Odběr: Vzorky lze odebírat kdykoliv dopoledne, ale vždy před užitím léku obsahující T4 či T3 ( zvyšují se hodnoty FT4 a FT3 o % po dobu 6 hodin). Vzorek lze v lednici uchovat do druhého dne, stabilita séra v lednici je týden. Referenční meze se neliší dle věku a pohlaví kromě dětského věku do 5 let ( do 5 let jsou vyšší hodnot TSH a širší rozmezí FT4 a FT3 ). Interference léků a vnějších vlivů např. stres ovlivňují především stanovení TSH a celkových T4 a T3 (TT4 a TT3).. Jodurie se stanovuje z první ranní moči, uchovávat v lednici, není nutný přídavek stabilizačních látek do moči Interpretace výsledků: Výsledky nutné hodnotit s ohledem na klinický stav, anamnézu a užívané léky. Referenční meze, jsou-li užívány k diagnostice poruch funkce štítné žlázy, by měly být definovány na základě vybrané /selektované/ populace zdravých jedinců dle doporučených výběrových kritérií. Těhotné mají specifické referenční meze pro TSH v jednotlivém trimestru. První trimestr je charakterizován poklesem TSH s lehkou elevací FT4 ( stimulace štítné žlázy molekulou hcg). Pro léčené pacienty (substituční léčba) a pacienty léčené s diferencovaným karcinomem štítné žlázy existují arbitrárně doporučené cílové hodnoty TSH, které se liší od referenčních mezí. Subklinického poruchy jsou ty, kdy většinou chybí klinické příznaky, či jsou minimálně vyjádřené, ale hodnota TSH je mimo referenční mez a hodnoty volných hormonů jsou v referenčních mezích. Primární porucha, znamená onemocnění postihující štítnou žlázu a u hypofunkce nalezneme nízké FT4 a zvýšené TSH, u hyperfunkce naopak zvýšené FT4, FT3 a nízké či nedetekovatelné koncentrace TSH. Nejčastější příčinou primární hypofunkce je autoimunní tyreoiditida ( Hashimotova tyreoiditida, AITD) s typickým nálezem pozitivity Anti TPO a/nebo Anti Tg. U hyperfunkce je nejčetnější příčinou tyreotoxikóza Graves- -Basedow s typicky pozitivními Anti TSH autoprotilátkami. Pozitivita autoprotilátek není fyziologická a jejich přítomnost při normálním TSH a FT4 jsou známkou eufunkční tyreoditidy. U pacientů s tyreopatiemi se při úspěšné léčbě relativně rychleji normalizují volné hormony (FT4 a FT3) a s odstupem několika týdnů až 1 roku dochází k normalizaci TSH. U hospitalizovaných pacientů v klinicky závažném stavu (šok,sepse atd), rozsáhlé operační zákroky, hospitalizace na JIP, dochází k dysbalanci tyreoidální parametrů od Syndromu nízkého T3 až po pouhé suprese TSH při léčbě dopaminem. Výsledky tak mohou být jakékoliv a většinou nejsou způsobené tyreoidálním onemocněním, ale akutním stavem a jeho léčbou. Po rekonvalescenci se tyreoidální testy normalizují. Nesouhlasný výsledek je stav, kdy změřené laboratorní výsledky neodpovídají klinickému stavu pacienta. Identifikuje ho ošetřující lékař a je nezbytné o něm informovat odpovědnou laboratoř. Důvodů vzniku nesouhlasných výsledků může být celá řada: od technické chyby včetně špatné identifikace vzorku, po chybu v laboratorním postupu či přítomnost interferujících látek nebo neobvyklých izoforem např. TSH. 162

163 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Indikace vyšetření Obecné: TSH je citlivější parametr pro tyreopatie za předpokladu správné funkce osy hypotalamus- hypofýza a nepřítomnosti závažného netyreoidálního onemocnění. Doporučuje se užívat metodu stanovení TSH s funkční citlivostí min. 0,02 miu/l, což umožňuje spolehlivě odlišit hyperfunkci štítné žlázy od poměrně časté suprese TSH. Je dána přednost stanovení volných T4 a T3 před jejich celkovými koncentracemi. Stanovení T3 je indikováno pouze u hyperfunkce štítné žlázy, u hypofunkce není indikováno, protože majoritním produktem štítné žlázy je T4. Stanovení autoprotilátek se provádí k objasnění etiologie onemocnění, odhadu rizika vzniku tyreopatie v budoucnosti a u anti TSH i ke sledování efektivity léčby. Stanovení Anti TPO a Anti Tg jsou indikována každé 2 roky, či při změně klinického stavu, vždy z předpokladu podezření na možnou tyreopatii. Anti Tg se stanovuje spolu s Tg, pokud je Tg užit jako nádorový marker ke sledování stavu pacientů po léčbě karcinomu štítné žlázy. Anti TSH je indikováno v případě podezření na Graves-Basedowu tyreotoxikózu, ke sledování efektu její léčby a dále při objasnění etiologie exoftalmu. Stanovení Tyreoglobulinu (Tg) je indikováno jako nádorový marker u pacientů s diferencovaným karcinomem štítné žlázy. Předoperačně k odhadu rozsahu onemocnění, efektu léčby a dále k časné diagnostice recidivy onemocnění a to vždy spolu AntiTg. Stanovení Tg dále pomáhá k monitoraci akutních a subakutních zánětů štítné žlázy a při podezření na nadužívání T4. Stanovení TBG je indikováno v případě podezření na genetickou poruchu produkce TBG. Stanovení Jodurie je především užíváno v epidemiologických studiích ke zjišťování stavu zásobení jódem v populaci. Stanovení kalcitoninu je indikováno při podezření na medulární karcinom štítné žlázy a to ze stejných důvodů jako Tg, taktéž v diferenciální diagnostice hypokalcémie. KAPITOLA 11 Specifická diagnostika a monitorování tyreopatií U ambulantních pacientů je první metodou volby stanovení TSH, které je schopno diagnostikovat i subklinické poruchy. U pacientů léčených pro hypofunkci štítné žlázy se laboratorní testy (TSH, FT4) opakují po 6 týdnech, po dosažení normalizace stavu každých 6 měsíců v prvních 2 letech, a dále 1x ročně. U pacientů léčených pro hyperfunkci štítné žlázy se laboratorní testy (TSH, FT4, FT3 a Anti TSH u G-B tyreotoxikózy) opakují po 6 týdnech, po dosažení normalizace stavu každých 6 měsíců. Specifická diagnostika a monitorace tyreopatie rizikové skupiny Všeobecně platí, že u rizikových skupin je indikováno pravidelné kontrolní stanovení TSH. Při nálezu hladiny TSH mimo referenční interval se stanoví FT4 (při podezření na hypertyreózu i FT3) a stanovení Anti TPO, AntiTg při negativním nálezu při využití stejné metodiky se doporučuje opakovat 1x za 2 roky. Do rizikových skupin vzniku tyreopatie patří: Těhotné ženy - TSH, FT4 a Anti TPO na začátku gravidity Pacientky s poruchou fertility TSH a Anti TPO Ženy nad 50 let- TSH 1x za 4 roky Pacienti s jinými autoimunitními onemocněními (hlavně DM I. typu, celiakie atd.) Pacienti s manifestní ICHS, tachyarytmiemi - TSH 1x ročně. Pacienti s léky či léčbou indukující tyreopatie (amiodaron, lithium, interferony gama i další, radioterapie v oblasti 163

164 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy krku a hrudníku) - při léčbě každých 6 měsíců vyšetření TSH Odběr - zdroje variability při odběru u tyreoidálních testů Přítomnost autoprotilátek není fyziologická, nelze tedy mluvit o fyziologické biologické variabilitě a veškeré údaje se vztahují k TSH, FT4, FT3, Tg. Všechny tyreoidální analyty vykazují větší inter-individuální variabilitu v porovnání s intra-individuální variabilitou. Inter-individuální variabilita je obzvláště vysoká pro koncentrace Tg a autoprotilátek v séru %. Hodnoty sérového TSH vykazují rovněž vysoký stupeň variability, jak inter- tak i intra- individuální (25 %; 19%). Tento fakt primárně souvisí s krátkým poločasem TSH (~60 minut) a rovněž s cirkadiánní a diurnální variabilitou. Užitím hodnot biologické a analytické variability bylo možné spočítat minimální signifikantní změny (LSC) pro jednotlivé parametry. KAPITOLA 11 LSC FT4 6,0 pmol/l FT3 1,5 pmol/l TSH 0,75 miu/l Tg 1,5 µg/l (ng/ml) LSC... znamená k jaké změně měřeného parametru musí dojít, aby se při zahrnutí nejistoty měření a biologické variability jednalo o významnou změnu. Přesnější je uvádění LSC v %, ale zde pro ilustraci jsou prezentovány absolutní hodnoty LSC v rozmezí hodnot referenčího intervalu. Například pokud se od minulého vyšetření před 6 týdny TSH změnilo z výchozí hodnoty 3,6 miu/l na 4,1 miu/l ( tj o 0,5 miu/l) nejedná se ještě o významnou změnu, čili rozdíl může být způsoben součtem chyb intra- a inter-individuální variability a analytické chyby). Cirkadiánní rytmus: existuje s nejnižšími hodnotami v pozdním dopoledni a maximálními hodnotami před usnutím. TSH rovněž vykazuje pulsatilní sekreci s intervaly 2-6 hodin přes den a kratšími intervaly a frekvencí ve spánku. TSH hladiny jsou variabilní v rozmezí 0,5-2,0 násobku průměrné denní hladiny a klinicky jsou výkyvy zanedbatelné. Věk liší se referenční intervaly u novorozenců a dětí.fetus a novorozenec TSH se prvně objevuje okolo 13. týdne těhotenství, postupně se jeho hodnoty zvyšují na několikanásobek normy dospělých. Dětství - od narození postupně klesají hodnoty TSH a referenčního intervalu normě jako u dospělých dosahují mezi rokem věku, u dospělých jedinců se referenční intervaly neliší. Pohlaví není rozdílu Gravidita - V prvním trimestru dochází u přibližně 20 % normálních těhotenství k poklesu TSH, což je způsobeno stimulací štítné žlázy působením humánního choriového gonadotropinu (hcg). Minimální hodnoty TSH a zvýšené hodnoty FT4 se objevují současně v období gestačního týdne. Přibližně u 10 % těchto případů (tj. 2 % všech těhotenství) může vést až k syndromu tzv. přechodné těhotenské tyreotoxikózy (GTT = gestational transient thyrotoxicosis), pro kterou jsou charakteristické více či méně klinicky manifestní příznaky tyreotoxikózy. Tento klinický stav doprovází často zvýšené zvracení v prvním trimestru těhotenství. Z hlediska klinické prognózy je tento stav nezávažný a většinou se spontánně upraví. Zvýšená produkce estrogenů v průběhu těhotenství zvyšuje průměrné koncentrace TBG 2-3x. To má následek posun rozmezí referenčních hodnot pro TT4 a TT3 v 16. gestačním týdnu přibližně až na 1,5 násobek hodnot netěhotných, ale hodnoty FT4 a FT3 se prakticky nemění a odpovídají netěhotným. Koncentrace sérového Tg v průběhu normálního těhotenství obvykle stoupá. Tyto hodnoty se vracejí k původním za 6 až 8 týdnů po porodu. 164

165 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Jaterní či renální dysfunkce - především poruchy vazebných proteinů, u volných T4 a T3 se projevují až při těžkých deficitech. Léky tyreoidální parametry vykazují časté interakce s léky, především se to však týká koncentrace vazebných proteinů a vytěsnění hormonů štítné žlázy z vazby na ně. Tomu se lze vyhnout stanovením volných T4 a T3, u kterých jsou hodnoty v séru poměrně stabilní. Většina lékových či patologických činitelů má vliv na hladiny TSH blokováním nebo stimulací na úrovni hypotalamu a hypofýzy (typická je blokáda TSH sekrece dopaminem, GH RH analoga, stres atd). Amiodaron - lék s vysokým obsahem jódu, při dlouhodobém podávání indukuje tyreopatii u cca 15 % pacientů, častěji s předchozí autoimunní tyreoiditidou (AITD). Užití T4 (levotyroxinu) užití léků obsahujících T4 ( Letrox, Euthyrox) zvyšuje významně hodnoty FT 4 od % a to minimálně po dobu 6 hodin po užití léku. Obdobná situace nastává i u FT3 v případě užití kombinovaných preparátů obsahujících T4 a T3. Odběr u těchto pacientů se provádí zásadně před užitím léků obsahujících T4 či T3. Stabilita - Tyreoidální hormony jsou relativně stabilní, sérum: h při + 22 C, 5-7dní při C a min. 6 měsíců při - 20 C (týká se všech parametrů i protilátek) Zmrazování nemá vliv na hodnoty, za předpokladu, že po rozmrazení dojde k důkladnému promíchání séra převracením zkumavek ( míchaní na vortexu nepostačuje). Hemolýza, lipémie a hyperbilirubinémie - signifikantně při imunoanalytických testech neinterferují. Zkumavky s gelem - vzorky odebírané do zkumevek s gelem výsledky většiny testů TSH ani testů tyreoidálních hormonů neovlivňují. Heterofilní protilátky (HAMA) V séru pacientů mohou být přítomny heterofilní protilátky HAMA protilátky, které se dělí do dvou tříd. Jsou buď relativně slabě multispecifické, polyreaktivní protilátky, které jsou často revmatoidním faktorem třídy IgM nebo mohou být široce reaktivními protilátkami, které jsou indukovány infekcí nebo léčbou obsahující monoklonální protilátky. Někdy se nazývají lidské anti-myší protilátky (human anti-mouse antibodies = HAMA). Někdy mohou být specifickými lidskými anti-zvířecími imunoglobuliny (human anti-animal immunoglobulins = HAAA), které se vytvářejí proti dobře definovaným specifickým antigenům následně po podání terapeutické látky obsahující zvířecí antigeny (tj. myší protilátky) nebo vznikají náhodně imunizací na pracovišti (tj. při manipulaci se zvířaty ). Jak HAMA tak i HAAA mají vliv více na metodiku stanovení nekompetitivní než na kompetitivní imunoanalytické testy tím, že vytvářejí přemostění mezi vazebnými a detekčními protilátkami, a tím tak generují falešný signál, který způsobí neadekvátně vysoké hodnoty. Netyreoidální onemocnění (NTI = Nonthyroidal Illness) U pacientů se závažným onemocněním se často vyskytují patologické tyreoidální testy, přesto však u nich není zjištěna porucha tyreoidální funkce. Důvodem je špatně regulovaná centrální inhibice hypotalamických releasing hormonů, včetně TRH U těchto stavů má stanovení FT4 i TSH smysl jen tehdy, pokud jsou přítomny klinické příznaky nebo anamnéza poruch štítné žlázy. Kromě výše uvedené příčiny se podílejí na etiologii různé léky, jako jsou například dopaminergní léky, glukokortikoidy, furosemid nebo heparin, které buď inhibují hypofyzární TSH přímo nebo nepřímo inhibicí vazby T4 na sérové proteiny. Průběh změn tyreoidálních hormonů u NTI je schématicky znázorněn na Obrázek 11.1 KAPITOLA

166 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy KAPITOLA 11 Obrázek 11.1 Diagnostika a léčba poruchy štítné žlázy u pacientů se závažným netyreoidálním onemocněním není vůbec jednoduchá, a proto se doporučuje spolupracovat se specializovanými endokrinology, nebo nejlépe vyšetření tyreoidálních hormonů odložit. Hodnoty 2-3 x mimo referenční rozmezí většinou nepředstavují závažnou tyreopatii. Interpretace laboratorních výsledků parametrů štítné žlázy Referenční meze (intervaly) Základním předpokladem správného hodnocení laboratorních výsledků je stanovení referenčních mezí. Referenční meze se obecně používají k diagnostice onemocnění. Ty musí zohlednit četnost onemocnění štítné žlázy, specifické fyziologické stavy např. těhotenství, věk pohlaví atd ( selektovaná populace). Při léčbě tyreopatií se pak setkáváme s pojmy substituční a supresní terapie, tj klinickými stavy, které mají doporučené cílové koncentrace tyreoidálních testů bez ohledu na referenční meze a jde o arbitrárně určené meze. Dále je třeba mít na vědomí, že imunoalytické stanovení je sice schopné měřit extrémně nízké koncentrace u volných frakcí (pmol/l), ale jejich výsledky závisí na použité metodě, zajména na kvalitě protilátek, volbě standardů apod., což může vést k významným rozdílům ve výsledcích mezi jednotlivými laboratořemi. Tyto rozdíly jsou relativně malé v případě THS a volných FT4a FT3 (20-30% v průměru), ale velmi významné u autoprotilátek ( anti TSH, Anti TPO, anti Tg) a tyreoglobulinu. Kromě tlaku na vzájemnou standardizaci mezi výrobci, je jediným řešením interpretovat výsledky pomocí referenčních mezí, 166

167 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy které jsou odpovídající použité metodě. V laboratorní diagnostice tyrepatií pak používáme 2 typy mezí: Referenční meze pro diagnostiku tyreopatií : Tyto meze jsou stanoveny na základě výběru vzorku refereční populace pomocí selekčních kritérií, která jsou použita s ohledem na poměrně vysokou prevalenci tyreopatií (autoimunní tyreoiditidy či deficitu jódu), která je vyšší než 5 %. Ke stanovení referenčních mezí pak nelze použít metodu 95% konfidenčního intervalu běžné zdravé populace, ale je nutné z této populace vybrat skutečné zdravé jedince. Selekční kritéria jsou specifické k dané laboratorní metodě. Pro určení referenčních mezí v tyreoidální diagnostice jsou na základě konsenzu doporučena následující kritéria : Výběrová kritéria pro TSH, FT4 a FT3 Referenční intervaly by měly být stanoveny na základě 95% intervalu spolehlivosti (pro TSH log transformovaných) hodnot získaných od 120 vyšetřených zdravých eutyreoidních dobrovolníků (60 mužů a 60 žen), u kterých: Byly negativní hodnoty Anti-TPO a Anti-TgAb v séru imunoanalytické stanovení Nemají v osobní ani rodinné anamnéze přítomnou tyreoidální dysfunkci ani jiné autoimunitní choroby Nemají viditelnou či hmatnou strumu Neužívají léky Optimální je věkové ohraničení dospělých do let a vyšetření štítné žlázy ultrazvukem. Očekávaná rozpětí hodnot dolních a horních referenčních mezí: TSH 0,3-0,5 a 3,5-4,5 miu/l FT4 9,0-11,0 a 21.,0-24,0 pmol/l, FT3 3,2-3,6 a 6,1-6,5 pmol/l. Vývběrová kritéria pro Anti-TPO, Anti-Tg a Anti-TSHR Referenční intervaly pro testy stanovující tyreoidální protilátky jsou významně metodicky závislé. Měly by být stanoveny na základě vyšetření 120 normálních jedinců, kteří nemají anamnéze onemocnění štítné žlázy. Jedinci by měli být vybíráni tak, aby osoby s predispozicí k AITD byly vyloučeny. Optimální je vyšetřit u nich i UZ štítné žlázy. Za normální jsou považování tito jedinci: Muži - věk (18-30 let), bez viditelné či hmatné strumy S koncentracemi TSH v séru v rozmezí 0,5 2,0 miu/l Bez tyreoidálního onemocnění v osobní nebo rodinné anamnéze Bez netyreoidálního autoimunitního onemocnění (např. celiakie, diabetes I. typu, lupus, a další) Vzhledem k velké variabilitě výsledků mezi výrobci nelze většinou udat kvantitativní referenční meze. Obecně se výsledky hodnotí buď pozitivní či negativní. Selekční kritéria Tyreoglobulin (T)g Referenční interval pro Tg by měl být stanoven podle lokality, protože koncentrace Tg v séru jsou ovlivněny příjmem jódu. Pro země s dostatečným přísunem jódu, mezi které lze v současné době počítat i ČR, se referenční interval pro Tg v séru pro eutyreoidní populaci ( TSH, FT4 v referenčních mezích plus negativní na AntiTg protilátky) se nachází v rozmezí 3 40 μg/l. KAPITOLA 11 Pro pacienty léčené (substitutované) pro tyreopatie se doporučují následující cílové hodnoty ( arbitrární meze ): Substituční terapie levotyroxinem (LT4): TSH cílová hodnota: 0,3-3,0 miu/l, u starších osob (nad 80 let) či individuálně se toleruje hraničně vyšší hodnota. Hladiny FT4 jsou v referenčních mezích. Supresní terapie levotyroxinem(lt4): U pacientů po operaci štítné žlázy a léčbě radiojódem pro diferencovaný karcinom štítné žlázy se indikují dávky levotyroxinu ( 167

168 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy LT4) tak, aby došlo k supresi TSH pod běžnou referenční mez a snížil se tak jeho proliferaci stimulující vliv na tyreocyty. Cílové hodnoty TSH jsou arbitrárně doporučené s tím, že FT4 je často hraničně vyšší. TSH pod 0,1 miu/l - vysoce a středně rizikoví pacienti, do 5 let od operace TSH: 0,1-0,5 miu/l- pro málo rizikové pacienty, nebo za 5-10 let od operace při příznivém stavu (Toto doporučení se netýká období přípravy k léčbě radiojódem ( cílená indukce hypotyreózy, spíše elevace TSH), kdy je naopak žádoucí dosáhnout hodnot TSH nad 30 miu /l a to buď přerušením léčby levotyroxinem či podáním hrtsh. KAPITOLA 11 Referenční meze v dětské populaci: Pro dětskou populaci platí, že regulační osa hypotamus - hypofýza reaguje po narození na změnu prostředí a zároveň vyzrává. Proto mají děti do 1,5 roku významně vyšší hodnoty TSH, naopak FT4 zhruba ve 3 měsících odpovídá hodnotám dospělých. Na obrázku č 2 jsou znázorněny poměry - násobky hodnot TSH a FT4 k dospělým a demonstrují významné diference v hodnotách TSH v prvním 1,5 roce života, ale především v prvních měsících života. Referenční meze u těhotných V těhotenství je ovlivněna především hladina TSH, která významně klesá s narůstající hodnotou hcg a nejhlubší supresi TSH lze tedy očekávat koncem prvního trimetru. FT4 mírně roste v prvním trimestru a pak naopak klesá lehce pod průměr běžné populace a to do konce těhotenství. Proto je třeba užívat trimestr specifické referenční meze pro TSH a u volné FT4 jsou změny hraničně významné a lze užít i hodnoty pro běžnou populaci s individuálním posouzením. V těhotenství lze předpokládat následující hodnoty TSH : 1. trimestr TSH 0,1-2,5 miu/l 2. trimestr TSH 0,2-3,0 miu/l 3. trimestr TSH 0,3-3,0 miu/l Intepretace výsledků stanovení tyreoidálních parametrů Při interpretaci výsledků je vždy nutné brát v úvahu klinický stav pacienta, rizikové faktory a anamnézu. U hospitalizovaných a 168

169 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy polymorbidních ambulantních pacientů je nezbytné vzít v úvahu ovlivnění hodnot léky a stres. KAPITOLA 11 Na následujícím obrázku jsou vypsány očekávané hodnoty tyreoidálních parametrů, ale není uvažováno o možných vlivech koincidujících onemocnění a lékových interferencí Obrázek 11.3 Specifické interpretace Změny hladin hormonů štítné žlázy po zahájení léčby hypofunkce či hyperfunkce štítné žlázy: Jak je demonstrováno na následujícím obrázku vývoj dysfunkce štítné žlázy je relativně pomalý, počíná fází subklinickou ( změna TSH a volné frakce v referenčních mezích) a postupně přechází do fáze klinické ( období 1 a 2). Po zahájení léčby doje naopak k normalizaci volných frakcí a postupné normalizaci TSH, toto přechodné období může trvat od několika týdnů až po 9-12 měsíců (viz Obrázek 11.4). 169

170 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy KAPITOLA 11 Obrázek 11.4 Primární hypofunkce, nejčastěji na autoimunním podkladě, což se projevuje pozitivitou antitpo či AntiTg, výjimečně pozitivní blokující antitshr. Subklinická (latentní) forma: pouze změna hladiny TSH, ale FT4 či FT3 v referenčním intervalu, klinické příznaky převážně chybí nebo jsou vyjádřeny minimálně. Diagnóza subklinické tyreopatie (patologické TSH, normální FT4) by měla být potvrzena nejméně dvěma patologickými výsledky TSH v odstupu 6 8 týdnů (až u 25 % je při kontrole výsledek normální). Manifestní forma - porucha je plně rozvinutá: klinické příznaky, změna TSH i FT4 Zvýšená funkce štítné žlázy (primární hyperfunkce, tyreotoxikóza): suprimovaná až nedetekovatelná hladina TSH, zvýšený FT4 i FT3. U zhruba 5% případů je izolovaně zvýšený pouze FT3 (T3-tyreotoxikóza) Gravesova-Basedowova nemoc typicky pozitivní AntiTSHR (etiologický faktor onemocnění), ale často spíše jen středně pozitivní AntiTPO, AntiTg, nedetekovatelné TSH, vysoké FT4, FT3. Existují i blokující antitshr, které vyvolávají většinou klinicky manifestní hypofunkce spolu s orbitopatií, relativně vzácně může dojít u jednoho 170

171 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy pacienta ke změně protilátkové odpovědi ze stimulujících protilátek na blokující protilátky (z hyperfunkce do hypofunkce). Tyreotoxikóza při podávání amiodaronu, vzniká cca u 15 % léčených, dána nadbytkem jódu v amiodaronu vzniká tak tyretoxikoza: je přítomná suprese (nedetekovatelné) TSH, elevace FT4 a jen mírná elevace FT3, protilátky mohou i nemusí být prokazatelné, přispějí k rozlišení I. a II. typu. AntiTPO jsou pozitivní spíše u 1. typu, k rozlišení obou typů přispěje vyšetření ultrazvukem. Subakutní tyreoiditida v incipientní fázi klinický obraz (bolest, vysoká FW), laboratorní známky hyperfunkce ( zdrojem poškození tyreocyt- vylití zásob vyprodukovaných T hormonů), negativní protilátky, nízká akumulace 131 I a nerovnoměrné rozložení aktivity při scintigrafii, vysoká hladina tyreoglobulinu ( marker poškození tyreocytů). Autoimunní tyreopatie (AITD) Hashimotova tyreoidittida Výskyt 10 % fertilních žen většinou eufunkční, pozitivita roste s věkem až % nad 65 let věku u žen, u mužů je prevalence několikanásobně nižší. Mohou být eufunkční, pozitivita antitpo indukuje chronický lymfocytární zánět, který dlouhodobě vede k destrukci štítné žlázy a konečně i k rozvoji subklinické a klinické primární hypofunkce. Doba rozvoje dysfunkce je zcela individuální, čím vyšší koncentrace anti TPO, tím je pravděpodobnější rychlejší průběh. Akutní exacerbace (např. poporodní tyreoiditida) probíhá napřed ve fázi hyperfunkce následovaná fází hypofunkce, která přejde často v trvalou hypofunkci, či se funkce normalizuje. Rovněž může dojít k rozvoji jiné protilátkové odpovědi např. vzniku anti TSHT a rozvoji G-B tyreotoxikózy Eufunkční fáze je charakteristická TSH, FT4 v referenčních mezích, pozitivní antitpo a/nebo AntiTg Poporodní tyreoiditida vzniká v poporodním období u 50 % žen s pozitivními AntiTPO, je zde typický bifázický průběh jak demonstruje následující obrázek ( Obrázek 11.5). U protilátek Anit TPO a/nebo AntiTg dochází po porodu k navýšení hodnot. KAPITOLA

172 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy KAPITOLA 11 Obrázek 11.5 Netyreoidální onemocnění Často pozorováno u akutně hospitalizovaných pacientů v klinicky závažném stavu (šok,sepse), rozsáhlé operační zákroky, hospitalizace na JIP) můžeme nalézt jakékoliv výsledky TSH, FT4 a FT3 mimo referenční meze. Jde o důsledek více faktorů: kalorický nedostatek, hyposaturace tkání kyslíkem, vliv cytokininů působících na centrální úrovni. Typické pro podávání dopaminu a podobných látek je suprese TSH (až nedetekovatelné) a normální FT4. Low T3 syndrom: především u pacientů s metabolickým rozvratem, šokovými stavy či jiným klinicky velmi závažným onemocněním. Vzniká na podkladě zvýšené konverze T4 na (reverzní) metabolicky neúčinné rt3, laboratorně se projeví nízkou hodnotou FT3 a normální či lehce snížené FT4, TSH. Kritický pokles hladiny T3 je špatným prognostickým ukazatelem. Stanovení tyreoidálních parametrů je třeba u netyreoidálních onemocnění hodnotit vždy s rezervou a mírné laboratorní dysbalance 2-3 násobek normy u TSH většinou nepředstavují závažnější tyreopatie, ale jsou indikovány netyreoidálními onemocněními. 172

173 Laboratorní vyšetření poruch štítné žlázy Předávkování tyreoidálními hormony (tyreotoxicosis factitia) laboratorní známky hyperfunkce, ale velmi nízká hladina tyreoglobulinu, nízká akumulační schopnost radiofarmaka. U centrální hypotyreózy je snížený FT4 a TSH může být hraničně nižší, normální nebo i mírně zvýšený ( pokud je produkováno biologicky neaktivní TSH). Test s TRH je patologický. Centrální hyperfunkce: nejčastěji je důvodem adenom hypofýzy s nadprodukcí TSH, pak hodnoty TSH, FT4 a FT3 jsou zvýšené. Syndrom rezistence na tyreoidální hormony KAPITOLA 11 Obvykle je způsoben mutací genu pro beta receptor tyreoidálního hormonu, která se vyskytuje v poměru 1: živě narozených dětí. Hodnoty FT4 a FT3 v séru jsou typicky zvýšené a jsou spojeny s normální nebo mírně zvýšenou hodnotou TSH v séru. Sekrece TSH ale není nepřiměřená, neboť odpověď tkání na tyreoidální hormon je snížena a vyžaduje vyšší hladiny tyreoidálních hormonů pro udržení normálního metabolického stavu. Při TRH testu se TSH zřetelně zvyšuje. Chybí symptomatologie hypertyreózy, ale může být tachykardie či dysrytmie. Nesouhlasný výsledek Je výsledek, kdy změřené laboratorní výsledky neodpovídají klinickému stavu pacienta. Identifikuje ho ošetřující lékař a je nezbytné o něm informovat odpovědnou laboratoř. Důvodů vzniku nesouhlasných výsledků může být celá řada: od technické chyby včetně špatné identifikace vzorku, po chybu v laboratorním postupu či přítomnost interferujících látek či neobvyklých izoforem např. TSH. Doporučený postup řešení: 1. Informovat provádějící laboratoř o vzniku nesouhlasného výsledku 2. Porovnat nesouhlasný výsledek s možnými interferencemi léky, které pacient užívá. 3. Ověření správné identifikace vzorku 4. Požádat o opakované přeměření vzorku. 5. Provést nový odběr a změření vzorku. 6. Požádat o přeměření vzorku v jiné laboratoří užívající jinou technologii, pokud je variabilita výsledků mezi různými laboratořemi více než 50% je pravděpodobná interference (netýká se měření Anti-TPO, Anti.Tg - kde je variabilita mezi výrobci v řádech desítek až stovek procent). Laboratoř dále postupuje v souladu s vlastním systém interní kontroly kvality. Literatura: 1. L. De Groot: Thyroid Disease Manager,, chapters L.M Demers, C. Spenser: LABORATORY MEDICINE PRACTICE GUIDELINES Laboratory Support for the Diagnosis and Monitoring of Thyroid Disease;NACB 2002, český překlad 2009, vydal AV Pron, Plzeň, ISBN Z. Límanová, Štítná žláza, kapitola 2 a 3, Trendy soudobé endokrinologie, Galén, Praha, L. J. DeGroot,J. L. Jameson Endocrinology Volume 2, W.B.Saunders Copany, L.Thomas: Clinical Laboratory Diagnostics, TH-Books, Límanová Z., Pikner R., Springer D.: Doporučení pro laboratorní diagnostiku funkčních a autoimunních onemocnění štítné žlázy, Klin. Bioechem. Metab. 19(40),No1, 2010: Stagnaro-Green A., Abalovich M., Alexander E. et al : Guidelines of ATA for Diagnosis and managment odf Thyroid Disease during preganncy na dpostpartum: Tyhroid, vol 21, No10, 2011: Cooper D., Doherty G., Haugen B. et al: Revised ATA management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer, Thyroid vol19, No 11, 2009,

174 Hormony hypotalamu a hypofýzy Hormony hypotalamu a hypofýzy Autor: MUDr. Tomáš Franěk Recenzenti: doc. RNDR. Kristian Šafarčík, Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D. KAPITOLA 12 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Hormony hypotalamu a hypofýzy Prolaktin Prolaktin je polypeptidový hormon, tvořený v eosinofilních buňkách předního laloku hypofýzy, jehož sekrece je centrálně inhibována z hypotalamu působením prolaktin-inhibujícího hormonu (PIH) a dopaminu naopak vliv serotoninergních neuronů, prolactin- releasing hormonu a některých léků působí stimulaci sekrece. Prolaktin stimuluje přeměnu lobuloalveolárního epitelu prsní žlázy na sekreční typ s následnou tvorbou mateřského mléka. Působením na ovaria dochází k inhibici zrání folikulů a inhibici aktivity aromatázy s následným snížením syntézy estradiolu. Indikací k vyšetření prolaktinu je infertilita, poruchy menstruačního cyklu amenorea, dysmenorea, galaktorea, gynekomastie u mužů, tumory a traumata v oblasti sella turcica, známky virilizace. Zvýšené hodnoty nacházíme fyziologicky u žen v graviditě, poporodní laktace, silného stresu, u prolaktinomů, při ektopické produkci, a dále jeho sekreci stimulují léčiva: chlorpromazin, haloperidol, fenothiaziny, cimetidin, tricyklická antidepresiva a reserpin, metoclopramid FSH folikuly stimulační hormon FSH je glykoprotein secernován bazofilními gonadotropními buňkami předního laloku hypofýzy. Funkcí FSH je stimulace růstu a dozrávání ovariálních folikulů, společně s LH podporují sekreci estrogenů a podílí se na změně endometria v proliferativní fázi menstruačního cyklu. U mužů stimulací Sertoliho buněk pomáhá udržovat spermatogenní epitel, ovlivňuje syntézu inhibinu a vazebného proteinu pro androgeny (SHBG) v semenotvorných tubulech. Indikací ke stanovení je amenorea, dysmenorea, oligomenorea, infertilita, primární a sekundární hypogonadismus, st.p. léčbě cytostatiky nebo po ozáření, atypie v pohlavním zrání u dětí, traumata a tumory hypofýzy, gonadální dysgeneze, poruchy hypotalamo-hypofyzárně-gonadální osy, diagnostický význam má i stanovení LH a FSH u syndromu polycystických ovarií, kde hodnota FSH klesá nebo je normální a hodnota LH stoupá, takže poměr LH/FSH se na rozdíl od zdravých jedinců zvyšuje. Zvýšené hodnoty nacházíme u primární insuficience vaječníků, Turnerova syndromu, climacterium praecox, gonadotropinomy, fyziologicky v menopauze a u primárního hypogonadismu u mužů. Snížené hodnoty nacházíme u traumat a endokrinně neaktivních tumorů hypofýzy, mentální anorexie, sekundární insuficience vaječníků, pseudopubertas praecox. LH luteinizační hormon LH je glykoprotein, secernovaný bazofilními gonadotropními buňkami adenohypofýzy. Funkcí LH je působení na thekální buňky ovarií, kde dochází ke stimulaci syntézy steroidů, jež jsou následně, za přispění FSH, přeměňovány na estradiol. Dále je LH odpovědný za konečné zrání vaječníkových folikulů a vyvolává též ovulaci a počáteční vývoj žlutého tělíska s následnou sekrecí progesteronu. U mužů LH stimuluje syntézu testosteronu v Leydigových buňkách intersticiální tkáně varlat. Indikací ke stanovení jsou amenorhea, dysmenorhea, oligomenorea, infertilita, primární a sekundární hypogonadismus, st.p. léčbě cytostatiky nebo po ozáření, atypie v pohlavním zrání u dětí, traumata a tumory hypofýzy, gonadální dysgeneze, vybrané chromozomální aberace, poruchy hypotalamo-hypofyzárně-gonadální osy. Zvýšené hodnoty nacházíme u primární insuficience vaječníků, Turnerův syndrom, climacterium praecox, gonadotropinomy, fy- 174

175 Hormony hypotalamu a hypofýzy ziologicky v menopauze, primární hypogonadismu u mužů. Snížené hodnoty nacházíme u traumata a tumory hypofýzi, mentální anorexie, sekundární insuficience vaječníků, pseudopubertas praecox. Oxytocin Oxytocin je peptidový hormon tvořený převážně v paraventrikulárních jádrech hypotalamu, odkud je transportován a deponován v granulech nervových zakončení neurohypofýzy. Funkcí tohoto hormonu je působení na myoepitelové buňky vystýlající vývody mléčné žlázy, což vede k ejekci mléka z mammy. Další významnou funkcí je ovlivnění hladké svaloviny dělohy v graviditě, čímž u konce gravidity zesiluje porodní činnost. Stanovení tohoto hormonu se běžně neprovádí vzhledem k nízkému diagnostickému významu. KAPITOLA 12 ADH Adiuretin ADH nebo-li vazopresin je druhý hormon skladovaný v neurohypofýze. Jedná se o hormon tvořený 9 aminokyselinami. Jeho základním fyziologickým účinkem je zadržování vody v těle, čímž se podílí na tělní homeostáze. Secernován je při zvýšení osmolality krevní plazmy a funkcí je zvýšení propustnosti distálních tubulů a sběrných kanálků v ledvinách, takže voda může vstupovat do hypertonického intersticia ledvin. Porucha v sekreci či na receptorové úrovni v periferii se projeví jako diabetes insipidus s neschopností ledvin koncentrovat moč se specifickými klinickými dopady. Opačná situace nastává při některých traumatech či krváceních do CNS, kdy dochází k nadprodukci ADH při normální osmolalitě krevní plazmy. Tento stav se označuje jako syndrom inadekvátní sekrece ADH (SIADH). Indikací ke stanovení je diabetes insipidus, SIADH. TSH-thyreotropin TSH je peptidový hormon syntetizovaný tyrotropními buňkami předního laloku hypofýzy. Funkcí tohoto hormonu je stimulace buněk štítné žlázy k tvorbě periferních hormonů, tj. thyroxinu a trijodthyroninu. Sekrece tohoto tropního hormonu je zase zčásti regulována přímou inhibiční (negativní) zpětnou vazbou, působenou vysokou hladinou hormonů štítné žlázy v krvi, inhibující adenohypofýzu, zčásti se tu uplatňují nervové mechanismy působící přes hypothalamus. Stanovení tohoto hormonu má zásadní význam v diagnostice poruch štítné žlázy. Zvýšené hodnoty nacházíme u hypotyreózy, subklinické hypotyreózy, po thyreoidektomii, adenomu hypofýzy produkujícím TSH. Snížené hladiny nacházíme u hyperthyreózy, hypopituitarismu a některých non-tyreoidálních onemocněních jako jsou febrilní stavy, infarkt myokardu, závažná traumata a operace. ACTH- adrenokortikotropní hormon ACTH je hormon syntetizovaný v buňkách adenohypofýzy ve formě prekurzoru POMC tzv. proopiomelanokortinu. Tento prekurzor je následně enzymaticky štěpen na několik fyziologicky účinných peptidů, mezi které patří i ACTH. Tento hormon je hlavním hormonem, řídícím tvorbu glukokortikoidních hormonů kůry nadledvin. Stanovení tohoto hormonu není z důvodu specifických a komplikovaných preanalytických faktorů běžně prováděno a používá se výhradně v diagnostice funkčních poruch kůry nadledvin a to zejména k rozlišení primární a sekundární poruchy sekrece kortizolu. Zvýšené hodnoty nacházíme u primárního hyperkortikalismu, Addisonovy choroby, adrenogenitálním syndromu, Cushingovy choroby, poškození nadledvin. Snížené hodnoty nacházíme u Cushingova syndromu, kdy dochází ke zpětnovazebné inhibici ACTH. STH somatotropin Polypeptidový hormon tvořený acidofilními buňkami adenohypofýzy. Sekrece je řízena z hypotalamu řídícími hormony jako je somatoliberin a somatostatiny. Funkcí tohoto hormonu je řízení a stimulace růstu, díky rozličným účinkům na metabolismus. Mezi hlavní účinky patří stimulace proteosyntézy a navozením pozitivní dusíkové bilance, dále má anti-inzulínové účinky a zvyšuje podíl volných mastných kyselin v krevní plazmě. Periferní účinky tohoto hormonu jsou závislé na tvorbě peptidických růstových faktorů, zvaných somatomediny (IGF-1 a IGF-2). Indikací ke stanovení jsou poruchy růstu, nanismus, akromegalie. Zvýšené hodnoty nacházíme u gigantismu, endokrinně aktivních tumorů hypofýzy, akromegalie. Snížené hodnoty pozorujeme u nanismu. 175

176 Hormony kůry nadledvin Hormony kůry nadledvin Autor: Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. Recenzenti: doc. RNDR. Kristian Šafarčík, Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D. KAPITOLA 13 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Biochemickáhistologie,řízenísekreceaúčinkyhormonůkůry nadledvin Nadledviny novorozence váží dvacetkrát více v poměru k celkové hmotnosti než žláza dospělého. Tzv. fetální zóna, která je u plodu značně široká, odpovídá lokalizací retikulární zóně. Netvoří se však u anencefalů. Kortisol matky přestupuje do oběhu plodu a ovlivňuje zpětnou vazbou produkci ACTH v hypofýze plodu. Hormony matky zajišťují rovnováhu elektrolytů. Involuce fetální zóny začíná za 3 až 4 dny po narození a postupuje velmi rychle, takže základní přestavba kůry nadledvin je ve třetím týdnu po porodu ukončena. Novorozenec dovede udržovat homeostázu vnitřního prostředí v obvyklých podmínkách, přestože adrenální kůra prochází rychlou přestavbou. Výjimkou jsou dědičné defekty steroidogenních enzymů v kůře nadledvin, které vedou např. k její kongenitální hyperplazii. Kůra nadledvin je histologicky diferencována do tří zón, které se liší také genovou expresí enzymů, které se podílejí na syntéze kortikoidů. V zona glomerulosa se tvoří především aldosteron (zóna nemá 11 beta-hydroxylázu), v zona fasciculata se tvoří kortisol (zóna nemá P450-aldosyntetázu, tj. 18-hydroxylázu/18-oxidázu), v zona reticularis se tvoří kortikoidy s androgenním účinkem, např. dehydroepiandrosteron (DHEA). V mládí je DHEA vysoký, jeho koncentrace klesá s věkem. Fetální DHEA je konvertován v placentě na estrogen. Zvláštní bílkovinou, která se uplatňuje v syntéze kortikoidů, je steroidogenní faktor 1 (SF-1). Jedná se o transkripční faktor, který se váže na TGGCTA motiv regulační domény genů. Jeho absence vede ke ztrátě nadledvin a gonád. Obrázek 13.1 Syntéza hormonů kůry nadledvin Základním glukokortikoidem je kortisol, jehož sekrece je řízena z hypothalamu kortikoliberinem (CRH) a z adenohypofýzy adrenokortikotropinem (ACTH). Množství vylučované za den je přibližně: kortisolu mg, kortikosteronu 3 mg, aldosteronu 0,3 mg. Biologický poločas kortisolu je přibližně 100 minut. Typicky se zde uplatňuje zpětná vazba přes glukokortikoidní receptory v hypothalamu a v hypofýze. Poruchy mohou vznikat i na jiné než steroidogenní úrovni: byl popsán defekt genu pro glukokortikoidní receptor a mutace v genu pro ACTH receptor (vedou k hereditárnímu syndromu deficience glukokortikoidů). 176

177 Hormony kůry nadledvin Pro vývoj funkční hypothalamo-hypofýzo-adrenální osy je esenciální gen pro jaderný hormonální receptor (DAX-1), jehož mutace nebo delece vedou ke vzniku kongenitální hypoplazie vázané na chromozom X. Vysoká hladina kortisolu vyvolává pokles produkce CRH a ACTH během několika minut. Při dlouhodobé vysoké koncentraci kortisolu je snížena také syntéza prekurzoru pro-opimelanokortinu (POMC). Významným stimulem pro zvýšení sekrece kortisolu jsou stresové situace, včetně hypoglykemie nebo anxiózní reakce (důležité v pediatrii). Výrazný cirkadiánní rytmus kortisolu se využívá v laboratorní diagnostice. Nejnižší koncentrace bývají obvykle ve 4 hodiny ráno, maxima dosahuje kortisol a také ACTH v 8.00 hod. Kortisol je v krvi vázán na bílkoviny (přibližně 90 %) transkortin (CBG, kortisol vázající globulin) a albumin. Kortisol je z větší míry metabolizován v hepatocytech na 17-hydroxysteroidy, které jsou eliminovány močí. Více než 95 % metabolitů je v játrech konjugováno s kyselinou glukuronovou (3alfa-hydroxy skupina), v menší míře dochází k sulfataci na 21-hydroxy skupině. V játrech také probíhá proměna kortisonu (biologicky inaktivní formy, která se neváže na glukokortikoidní receptory) na kortisol. Jen malá část se vylučuje močí jako volný kortisol. Kortisol ovlivňuje přeměnu základních metabolitů: v játrech stimuluje přeměnu aminokyselin na glukózu (glukoneogeneze), ve svalech stimuluje proteolýzu, v tukové tkáni lipolýzu (prostřednictvím hormon senzitivní lipázy). Významně zasahuje do imunitní reakce organismu, má účinek antialergický, antiedematózní, protizánětlivý, antiexsudativní. Účinky kortisolu jsou zprostředkovány přes jaderné steroidní receptory. Nejprve kortisol nebo aldosteron proniká do cytoplazmy, váže se na steroidní receptor, přičemž uvolňuje na tuto strukturu na karboxylovém konci předtím navázaný Hsp90 (heat shock protein). Hsp zabraňuje translokaci receptoru, na který není navázán hormon, do jádra. Receptory pro steroidní hormony jsou dimerní transkripční faktory. Po navázání steroidu komplex penetruje do jádra, mění se konformace a vytváří se DNA vazebné místo (s tzv. zinkovými prsty) a struktura odpovědná za ovlivnění promotorové oblasti, kde jsou negativní a pozitivní odpovědní úseky (HRE, hormone response elements). Jedná se o krátké (15 bp) palindromové sekvence. KAPITOLA 13 Laboratorní diagnostika Kortisol celkový v séru Vyšetření je hlavně využíváno k diagnostice Cushingova syndromu, u kterého je potlačeno diurnální kolísání hladin kortisolu. Vyšetření je však méně spolehlivé než vyšetření volného kortisolu v moči sbírané 24 hodin. Vyšetřuje se sérum nebo plazma, odběr se provádí mezi hodinou ranní, nebo jako denní profil, vždy před jídlem, je nutné zabránit hemolýze. Pacient musí být před odběrem alespoň 30 minut v klidu. Referenční rozmezí je závislé na metodě, uvádíme orientační hodnoty: Pupečníková krev Děti 1-15 let Dospělí let nmol/l 8.00 hod nmol/l nmol/l hod nmol/l nmol/l hod. méně než 50 % ranní hodnoty méně než 50 % ranní hodnoty Konverzní faktor: ug/dl x 27,6 = nmol/l Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny v reagenciích a interferovat, ale křížové reakce nebyly prokázány. Zvýšení hladin kortisolu prokazujeme u těchto diagnóz: popáleniny, Crohnova choroba, Cushingova nemoc, Cushingův syndrom, ektopická produkce ACTH, eklampsie, těžší hepatopatie, hyperpituitarizmus, hypertenze, hypertyreóza, těžší infekce, obezita, osteoporóza, akutní pankreatitida, gravidita (zvýšený CBG, v třetím trimestru mohou být až 2,5x vyšší hodnoty kortisolu), těžší renální onemocnění, šokové stavy, větší stres (tepelný, chladový, traumatický, psychický), chirurgický výkon, virilizace. Kortisol se zvyšuje po podávaných estrogenech, perorální kontracepci, yohimbinu, vasopresinu, zvýšení je rovněž po amfetaminech, metamfetaminech, nikotinu, alkoholu, spironolaktonu, interferonu gama, metoklopramidu. Snížení hladin kortisolu je typické pro tyto diagnózy: Addisonova choroba, adrenální insuficience, adrenogenitální syndrom (kongenitální adrenální hyperplazie), kongenitální adrenální hypoplazie, chromofobní adenom, kraniofaryngeom, hypofyzektomie, hypopituitarizmus, hypotyreóza, hepatopatie, revmatoidní artritida, Waterhouse-Friderichsenův syndrom, po podání 177

178 Hormony kůry nadledvin dexamethasonu a odvozených preparátů, ketokonazolu, morfia, inhalace glukokortikoidů při léčbě asthma bronchiale, požití grapefruitového džusu Kortisol volný v moči Volný kortisol je nekonjugovaný kortisol, který se dostává do moči glomerulární filtrací. Představuje jen asi 5 % celkového cirkulujícího kortisolu, ale množství filtrované do moči přesně sleduje sekreční vzorec kůry nadledvin. Význam vyšetření spočívá v tom, že sběr moči za 24 hodin eliminuje vliv diurnálních variací. Hlavní indikací vyšetření je Cushingův syndrom a diferenciální diagnostika obezity, vyšetření není vhodné pro diagnostiku Addisonovy choroby. Opatrnost v interprataci je nutná u pacientů se sníženou glomerulární filtrací (renální insuficience). Pacient by měl být bez fyzické zátěže a bez stresu. Správný odběr moči se provádí do skla nebo plastu (chlazený kontejner), vhodná je konzervace moči kyselinou boritou (10 g do 3 l kontejneru) nebo kyselinou octovou (33%). Pokud je pacient katetrizován, sběrný vak musí být umístěn na ledu a vyprazdňován do chlazeného kontejneru každou hodinu. Referenční rozmezí je závislé na metodě, uvádíme orientační hodnoty: KAPITOLA 13 Děti 1-12 let Obě pohlaví let 6-74 nmol/24 hodin nmol/24 hodin Konverzní faktor: ug/24 hodin x 2,76 = nmol/24 hodin 17-hydroxyprogesteron 17-hydroxyprogesteron, který vzniká z progesteronu, je metabolickým prekurzorem 11-deoxykortisolu v syntetické dráze kortisolu. Má výrazný diurnální rytmus (nejvyšší hodnoty ráno). Zvýšené hladiny jsou obvykle důsledkem deficience steroidní 21-hydoxylázy nebo 11-hydroxylázy. 17-hydroxyprogesteron je konvertován a vylučován jako pregnantriol. Vyšetřuje se sérum nebo plazma, v novorozeneckém screeningu ze suché kapky krve. Odběr se má provádět ráno, u menstruujících žen ve folikulární fázi. Velmi malé děti, zejména kojenci mladší 2 3 měsíců mají velmi vysoké hladiny 17 OH-pregnenolonsulfátu. Vzorky kojenců je vhodné stanovovat po extrakci. Vyšetření slouží hlavně k diagnostice kongenitální adrenální hyperplasie, dále se využívá při ACTH stimulačním testu a k monitorování pacientů na substituční terapii glukokortikoidy. Zvýšení 17-hydroxyprogesteronu prokazujeme např. u těchto diagnóz: Antleyův-Bixlerův syndrom, kongenitální adrenální hyperplazie (hodnoty nmol/l), germinom, hirsutismus, ovariální cysty a tumory, syndrom polycystických ovarií, virilizace, steroidy, metformin. Naopak snížení je typické pro kongenitální adrenální hypoplazii, mužský pseudohermafroditismus (deficience 17 beta-hydroxylázy), Addisonovu chorobu. Referenční rozmezí je závislé na metodě, uvádíme orientační hodnoty: Pupečníková krev nmol/l 0 6 týdnů 0,2 21 nmol/l 6 týdnů 1 rok 0, 2 9,1 nmol/l 1 10 let 0,1 2,7 nmol/l let 0,6 8,0 nmol/l nad 15 let muži ženy 1,5 7,2 nmol/l 0,4 9, 4 nmol/l folikulární fáze luteální fáze gravidní postmenopuzální Konverzní faktor: ng/dl x 0,03 = nmol/l 0,45 3,3 nmol/l 2,1 9,4 nmol/l 6 36 nmol/l 0,24 3,9 nmol/l 178

179 Hormony kůry nadledvin ACTH, aldosteron, renin Stanovení ACTH má význam k rozlišení primární a sekundární poruchy sekrece kortisolu. Jde o speciální vyšetření prováděné jen v malém počtu laboratoří a vyžaduje dodržení zvláštních preanalytických podmínek (např. dodání vzorku na ledu a rychlé zpracování). Orientační referenční meze jsou 5 41 ng/l (1 10 pmol/l). Vyšetřením aldosteronu a reninu, který úzce souvisí např. s hypoaldosteronismem, je věnována jiná kapitola. Orientační referenční meze pro aldosteron jsou vleže 0,08 0,61 mmol/l, vsedě 0,19 0,83 mmol/l. KAPITOLA 13 Funkční vyšetření CRH test Indikace: Cushingův syndrom odlišení primárního (periferního) a sekundárního (centrálního) původu. Odebírá se 1 ml nesrážlivé krve s K2EDTA pro stanovení kortisolu a ACTH (předtím musí být pacient nejméně 2 hodiny v klidu). Po stanovení basálních hodnot se podá intravenózně 100 μg CRH (humánního). Odběry se provádějí za 15, 30, 45 a 60 min. Pozor mohou se objevit flush-symptomy! Pro hypofyzární nedostatek ACTH svědčí konstantní hladiny kortisolu a ACTH. Excesivní vzestup kortisolu a ACTH znamená hypothalamicko-hypofyzární Cushingův syndrom. (Při dlouho přítomné hypothalamické příčině může vzestup ACTH přetrvat.) Vzestup ACTH při normální hladině kortisolu svědčí pro tumor nadledvin. ACTH (Synacthenový) stimulační test Jedná se o diagnostický test k posouzení funkce kůry nadledvin používaný při podezření na deficit produkce kortisolu. Podáním exogenního ACTH se stimuluje kůra nadledvin. Test ukazuje na její sekreční kapacitu. Kontraindikací je čerstvá vředová choroba žaludku a duodena, dekompenzovaný diabetes mellitus, akutní infekce, akutní psychóza či akutní glaukom. Krátkodobý test: V 7.00 hodin ráno na lačno, ještě před podáním léků, se odebere vzorek srážlivé žilní krve na stanovení sérové hladiny kortisolu (S-kortisol před ). Poté se aplikuje syntetický analog ACTH (např. Synacthen inj. Novartis; 1 amp.= 0,25 mg) v dávce 0,25 mg i.v. Aplikace se provádí pod lékařským dohledem, hrozí nebezpečí anafylaktického šoku. Další vzorky srážlivé krve na stanovení sérové hladiny kortisolu se odeberou za 1 a 2 hodiny po podání. Hodnocení: zvýšení S-kortisolu nad 690 nmol/l diagnózu insuficience vylučuje, velmi výrazný vzestup svědčí pro Cushingův syndrom na základě oboustranné hyperplazie kůry nadledvin, normální odpověď, případně zvýšená, je u 50 % případů autonomního tumoru nadledvin, u dalších 50 % případů se nepozoruje žádná odpověď kůry nadledvin. Dlouhodobý test: V 7.00 hodin ráno nalačno se odebere vzorek srážlivé žilní krve na stanovení sérové hladiny kortisolu. Pak se podá 1 mg depotního ACTH intramuskulárně a další vzorky srážlivé krve (2 ml) na stanovení sérové hladiny kortisolu se odebírají za 1, 2, 4, 8, 12, 24 hodin. Hodnocení: normální odpověď- více než 900 nmol/l (maximum za 8 hodin), nedostatečná odpověď ve všech fázích po stimulaci svědčí pro primární formu nadledvinového selhání, nedostatečná (nebo žádná odpověď) v první hodině, pak pozvolný vzestup kortisolu s vrcholem za 24 hodin, ukazuje na sekundární nadledvinovou insuficienci. Metyraponový test (Metopironový test) Vyjadřuje hypofyzární rezervu ACTH a je indikován při podezření na primární či sekundární hypokorticismus. Metyrapon inhibuje 11-b-hydroxylázu a tím přeměnu 11-deoxykortisolu na kortisol a další metabolity. Poklesem kortisolemie je stimulována sekrece ACTH. Zvýšená hladina ACTH vede ke zvýšené tvorbě 11-deoxykortisolu, který však nemůže být dále metabolizován a 179

180 Hormony kůry nadledvin jeho hladina stoupá. V 8 hodin ráno se odebere krev na stanovení S-kortisolu. Ve 24 hodin se podá metyrapon (Metopirone 250 mg cps Novartis): 2 g u pacientů vážících do 70 kg, 2,5 g u vážících 70 až 90 kg a 3 g u vážících nad 90 kg. Někdy je vhodné provést test s menší inhibiční dávkou 750 mg. Hodnocení: norma - snížení S-kortisolu pod 222 nmol/l. Dexametazonový supresní test Jedná se o diagnostický test supresibility osy hypothalamus - hypofýza - kůra nadledvin používaný při podezření na hyperkortisolismus. Vyšetřuje se schopnost hypothalamo-hypofyzárního systému snížit sekreci ACTH a tím i kortisolu po zvýšení množství cirkulujících glukokortikoidů. Kontraindikace jsou shodné jako pro provedení ACTH testu. Standardní test: Test začíná získáním bazálních hodnot volného kortisolu ve vzorku ze tří 24-hodinových sběrů moče. Potom se dva dny podává po 6 hodinách 0,5 mg dexametazonu per os (Dexamethazon tbl, 1 tbl. = 0,5 mg), začíná se v 6 hodin ráno (denní dávka 2 mg). Druhý den podávání se vyšetří volný kortisol v 24-hodinovém sběru moče. Dále se pokračuje zvýšenou dávkou 2 mg každých 6 hodin v průběhu dalších dvou dní (denní dávka 8 mg). Druhý den této silnější blokády se opět vyšetří volný kortisol v 24-hodinovém sběru moče. Hodnocení: Slabší blokáda (2 mg): u zdravých osob se sníží vylučování volného kortisolu pod 60 nmol/den. U pacientů s Cushingovým syndromem nedojde ke snížení. Silnější blokáda (8 mg): při centrální formě Cushingova syndromu se sníží volný močový kortisol na hodnotu menší než 50 % výchozí koncentrace (průměr ze tří bazálních hodnot). U pacientů s adrenokortikálním nádorem produkujícím kortisol nebo s paraneoplastickým Cushingovým syndromem snížení nenastane. Nedostatečná suprese zvýšených bazálních hodnot volného močového kortisolu při slabší blokádě svědčí pro diagnózu Cushingova syndromu a silnější blokáda odliší centrální Cushingův syndrom od ostatních forem. Rychlý (zkrácený, noční) test: V 8 hodin ráno nalačno, ještě před podáním léků, se odebere vzorek 2 ml srážlivé krve na stanovení sérové hladiny kortisolu. Ve hodin se podá dexametazon (Dexamethazon tbl.; 1 tbl. = 0,5 mg) v dávce 1 mg (2 tbl.) p.o. Tablety se podají spolu s malým množstvím jídla. Dexametazon je syntetický fluorovaný glukokortikoid s mírným mineralokortikoidním účinkem; inhibiční aktivita na osu hypothalamus - hypofýza - kůra nadledvin je největší, podá-li se dexametazon v noci. U většiny zdravých jedinců jednorázové podání 1 mg dexametazonu v noci dostatečně potlačí sekreci ACTH na dobu 24 hodin. Druhý den se opět v 8 hodin ráno na lačno, ještě před podáním léků, odeberou 2 ml srážlivé krve na stanovení sérové hladiny kortisolu. Hodnocení: U zdravých jedinců snížení S-kortisolu ráno na lačno pod 100 nmol/l. U pacientů s Cushingovým syndromem je nedostatečná suprese (nad 100 nmol/l). Noční silnější dexametazonový test: Ráno v 8 hodin nalačno se odebere 2 ml srážlivé krve na stanovení sérové hladiny kortisolu, ve 23 hodin se podá 8 mg dexametazonu. Druhý den ráno v 8 hodin se odebere vzorek 2 ml krve na vyšetření kortisolémie. Hodnocení: Při centrální formě Cushingova syndromu nastává snížení kortisolémie pod 50 % výchozí koncentrace. Při adrenokortikálních nádorech produkujících kortisol a při paraneoplastickém Cushingově syndromu se tento stupeň snížení nedosáhne. KAPITOLA 13 Renin-aldosteron-ortostázový test Indikací k tomuto vyšetření je diferenciální diagnostika idiopatického primárního hyperaldosteronismu od m. Conn (trias: hypokalemie, hypernatremie, hypertonie), event. průkaz izolovaného hypoaldosteronismu. Není indikován u prokázaného adenomu nadledvin. Provedení testu: pacient je od 24:00 hod. v klidu na lůžku, v 8:00 hod. se vleže provede stanovení výchozích hodnot aldosteronu a reninu, po 2hodinové ortostáze se odběr opakuje. Hodnocení: Normální je 0,5 až 2násobný vzestup hladiny aldosteronu a reninu. Inzulinový test Hypoglykemie patří k silným stresovým impulsům sekrece ACTH a STH. Ráno se odebere krev na stanovení glykemie, kortisolu, ACTH, STH. Podá se i.v. inzulin: 0,05-0,1 j/kg tělesné váhy při podezření na hypothalamo-hypofyzární insuficienci, 0,15 j/kg při očekávané normální odpovědi, 0,20-0,30 j/kg u obézních pacientů s Cushingovým syndromem. Krev se odebírá za 30, 60, 90, 180

181 Hormony kůry nadledvin 120 minut. Hodnocení: u zdravých klesá glykemie pod 2,2 mmol/l a kortisol stoupá nad 320 nmol/l, resp. dosáhne 1,5-krát vyšší hodnoty než byla hodnota bazální. ACTH dosahuje nejméně dvojnásobné zvýšení koncentrace oproti hodnotě bazální. Kontraindikace provedení testu jsou ICHS, cerebrovaskulární změny, gestóza, epilepsie. Hyperkortikalismus KAPITOLA 13 Nadprodukce glukokortikoidů se projeví klinickými příznaky známými pod názvem Cushingův syndrom. Pacienti jsou obézní, hypertenzní, mají úbytek svalové hmoty, mívají steroidní diabetes (hypergklykemie), hypernatremii a hypokalemii. Connův syndrom je důsledkem a projevem izolované nadprodukce aldosteronu. Primární příčinou bývá především adenom nebo adenokarcinom kůry nadledvin. Chybí cirkadiánní rytmus, je nízká koncentrace ACTH. Sekrece kortisolu je autonomní, sekrece nestoupá po stimulaci (ACTH nebo inzulinový test) a neklesá po aplikaci supresních látek (dexametason). Sekundární (centrální) příčinou je adenom adenohypofýzy s vyššími koncentracemi ACTH (Cushingova choroba). Na funkční testy kůra nadledvin reaguje dle očekávání (stimulace, suprese). Pokud je příčinou nadprodukce CRH v hypothalamu, stav se označuje jako terciární hyperkortikalismus. Ektopická tvorba ACTH provází relativně často některá nádorová onemocnění, např. malobuněčný i bronchogenní karcinom plic, někdy se současnou produkcí např. ADH. V klinickém obrazu mohou někdy dominovat metabolické účinky mineralokortikoidů. Kortisol nereaguje při funkčních stimulačních a supresních testech. Terapie glukokortikoidy (dlouhodobá, vysokými dávkami) vede k rozvoji Cushingova syndromu, tj. k hypokalemii, hyperglykemii atd. Dochází k supresi produkce CRH a ACTH a k atrofii kůry nadledvin. Náhlé vysazení může být život ohrožujícím stavem. Nejúčinnější uměle vyrobené glukokortikody (např. dexametason) neinterferují při stanovení kortisolu. Hypokortikalismus Příčinou primárního hypokortikalismu je destrukce kůry nadledvin. Sem patří autoimunitní adrenalitida (provádíme stanovení autoprotilátek proti steroidní 21-hydroxyláze) a infekční adrenalitida (tuberkulóza, infekce meningokoková, cytomegalovirová, HIV a jiné). Vzácné je postižení nadledvin při metastázách nádorů nebo postižení pacientů mužského pohlaví kongenitální adrenální hypoplázií (AHC, mutace nebo delece DAX genu, event. mikrodeleční syndrom spojený s defektem glycerolkinázy a genu pro dystrofin - DMD). Pokud je nedostatek glukokortikoidů provázen deficitem mineralokortikoidů, rozvíjí se adrenální insuficience - Addisonova choroba (slabost, hypotenze, hyponatremie, hyperkalemie), která může vyústit v tzv. Addisonskou krizi. Průkazné je zvýšení koncentrace ACTH. Hladina kortisolu je snížená nebo normální. Na stimulační testy kůra nadledvin nereaguje. Zvýšená pigmentace je důsledkem zvýšené produkce POMC (proopiomelanokortin). Příčinou sekundárního hypokortikalismu bývá neschopnost hypofýzy produkovat ACTH nebo poškození hypothalamu. Tyto stavy nastávají po traumatech (mozku), krvácení, radioterapii, hypofyzektomii, neurochirurgických výkonech, při růstu nádoru z ostatních buněk (prolaktinom), po krvácení do hypofýzy po porodu, při infekci (tuberkulóza). Hladina ACTH je nízká. Na stimulační test s ACTH kůra nadledvin reaguje, na CRH a hypoglykemii (inzulinový test) nikoliv. Častý je současný defekt tvorby ostatních hormonů adenohypofýzy. K adrenální insuficienci vede také dlouhodobá terapie glukokortikoidy, která může způsobit atrofii kůry nadledvin. Náhlé vysazení léčby (nebo prudké snížení dávky) ohrožuje pacienty adrenální krizí. Vrozená adrenální hyperplazie (CAH) je skupina genetických onemocnění charakterizovaná hyperplastickým růstem kůry nadledvin (vliv ACTH) a porušenou syntézou adrenokortikálních hormonů jako důsledku enzymatických defektů. Klinické příznaky jsou důsledkem nedostatku kortisolu a v některých případech aldosteronu a nadbytku prekurzorů, které jsou syntetizovány před defektní enzymatickou reakcí. Jedná se o vůbec nejčastější autosomálně recesivně děděné onemocnění (1:100) se širokým spektrem fenotypových projevů od solných poruch život ohrožujících (hyponatremie, hyperkalemie) s těžkými malformacemi zevního genitálu v novorozeneckém věku až po méně nápadné formy hirsutismu nebo virilizace ve věku pozdějším. 181

182 Hormony kůry nadledvin Cornelius ,,27. června 1670 se narodilo v Delftu dítě, jehož rodiče se kvůli malformaci pohlavních orgánů nechtěli sami bez rady odborníka rozhodnout pro dívčí nebo chlapecké jméno. Odborníci usoudili na chlapce podle zjevně perfektního mužského údu a útvaru velmi podobnému šourku. Proto dítě bylo pojmenováno Cornelius. Přemožen vážnou nemocí, opustil Cornelius tento život 19. července. Při autopsii bylo rozhodnuto, že Cornelius byl však dívkou s nadměrným klitorisem. Regnier de Graaf (1672): De mulierum organis generationi inservientibus tractatus novus KAPITOLA 13 Obrázek 13.2 Vzhled novorozence s CAH V laboratorním nálezu nejtěžších forem dominují vysoké hladiny ACTH, reninu a 17-hydroxyprogesteronu, hyponatremie a hyperkalemie. Novorozenecký screening CAH je založen na stanovení 17-hydroxyprogesteronu ze suché kapky krve. Význam má pro včasné zahájení substituční terapie kortikoidy. Prenatální diagnostika umožňuje nasazení intrauterinní léčby, která zabrání především virilizaci plodu ženského pohlaví. Nejčastější příčinou CAH jsou mutace v genu pro steroidní 21-hydroxylázu (přibližně 90 % případů). Další příčinou CAH (asi 5 %) je deficit mitochondriálního enzymu 11beta-hydroxylázy. Zvláštní je deficit 17alfa-hydroxylázy/17,20- -lyázy (jedná se o jeden gen, jeden enzym, ale dvě enzymové aktivity závislé na potranslační modifikaci). Deficience tohoto enzymu je obvykle přítomna v nadledvinách i v gonádách, projevuje se CAH, hypertenzí, u žen syndromem Biglieriho, u mužů syndromem Newové. Vzácně byla pozorována izolovaná deficience 17,20-lyázy. Dalším enzymem, jehož deficit působí klasické formy CAH se solnými ztrátami, je 3beta-hydroxysteroid dehydrogenáza. Poslední příčinou CAH mohou být defekty ve StAR proteinu (steroidogenní akutní regulační protein), který je spoluzodpovědný za mitochondriální konverzi cholesterolu na pregnenolon (toto onemocnění se někdy označuje jako kongenitální adrenální lipoidní hyperplazie). 182

183 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému Acidobazickárovnováhaaoxygenacetkání:úvod do problému Autor: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, Dr.Sc., MUDr. Helena Brodská, Ph.D., prof. MUDr. Jaroslav Racek KAPITOLA 14 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Souhrn: Aktivita vodíkových iontů zásadně ovlivňuje mnoho fyziologických dějů. Rovnováha mezi produkcí a vylučováním (či metabolizováním) vodíkových iontů je udržována zejména ledvinami a játry. Extra- (např. bikarbonát) i intracelulárně (např. hemoglobin) má organismus k dispozici pufry, které okamžitě vyrovnávají výkyvy v koncentraci protonů. Poruchy acidobazické rovnováhy (ABR) a oxygenace tkání jsou vzájemně spjaty ve 2 základních ohledech: Poruchy ABR jsou časté u respiračních chorob, kdy vázne vylučování oxidu uhličitého. Zároveň bývá špatná oxygenace tkání a ta je příčinou (laktátové) acidózy. Parametry ABR i oxygenace se obvykle měří na jednom přístroji, obdobnými principy měření a ze stejného vzorku. Koncentrace vodíkových iontů (H + ) Koncentrace vodíkových iontů (H+)1 je v krvi zdravého člověka udržována ve velmi těsném rozmezí. Důvodem je závislost mnoha fyziologických dějů (zejm. enzymatických reakcí) na optimální koncentraci H+ (mění se náboj a disociace molekul, konformace proteinů...). Normální hodnoty H+ se pohybují mezi 35 a 45 nmol/l (ph 7,4 ± 0,05). Za kritické, nebezpečné koncentrace lze považovat hodnoty > 120 nmol/l a < 20 nmol/l (viz Obrázek 1). V klinické praxi v ČR stále přetrvává vyjadřování ve formě záporného dekadického logaritmu koncentrace H+, tzv. ph2 (viz Obrázek 14p.1). 1 Terminologická poznámka: elektrody, kterými měříme H + reagují na aktivitu H +, která v krvi není zcela totožná s koncentrací H + (to je jen v ideálních roztocích). V textu vědomě používáme termín koncentrace H +, i když správnější by bylo aktivita H + 2 V rámci hodnot, které můžeme u pacientů naměřit, však vyjadřování formou ph nemá žádné výhody, naopak je často zbytečně matoucí (např. změna z ph 7,4 na 7,0 znamená vzestup koncentrace H + z 40 na 100 nmol/l, tedy 2,5 krát). V anglosaských zemích je tendence k používání koncentrace H + místo ph. V klinické praxi u nás se však setkáte výhradně s vyjadřováním pomocí ph. 183

184 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému KAPITOLA 14 Obrázek 14p.1 Vztah mezi koncentrací H + a ph. Vyznačeno je i referenční rozmezí (zeleně) a kritické, nebezpečné hodnoty (červeně). Rovnováha mezi produkcí a exkrecí/metabolizováním H + je udržována činností zejména ledvin, plic, jater a částečně i zažívacího traktu. Při (některých) onemocněních těchto orgánů můžeme tedy předpokládat vychýlení homeostázy H +. Produkce H + Vodíkové ionty jsou produkovány v mnoha metabolických pochodech a mezi nejdůležitější zdroje kyselin (H + ) patří tkáňové dýchání, anaerobní glykolýza (produkce laktátu) a tvorba urey (Tabulka 14p.1). Kyselina Zdroj Odstranění Množství (mmol/d) <?> CO 2 tkáňové dýchání exkrece plícemi laktát glykolýza (anaerobní) glukoneogeneze, oxidace H + ze syntézy urey ureageneze oxidace aminokyselin volné mastné kyseliny lipolýza reesterifikace, oxidace 600 ketolátky ketogeneze oxidace

185 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému sulfáty metabolismus sirných aminokyselin exkrece ledvinami 40 Tabulka 14p.1 Přibližná denní produkce a vylučování kyselin u zdravého dospělého člověka (adaptováno dle [3]). CO 2 vyprodukovaný během oxidačních dějů může být hydratován na kyselinu uhličitou a částečně disociovat (pk = 6,37): CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO 3 - (1) KAPITOLA 14 Nicméně rovnováha reakce je výrazně posunuta na stranu CO 2, jen v tkáních s vyšší aktivitou karboanhydrázy (např. ledviny, erytrocyty nebo žaludeční buňky tvořící kyselinu) dochází k významnější produkci bikarbonátu a H + z CO 2. Kyselina mléčná [CH 3 CH(OH)COOH], která vzniká hlavně v erytrocytech a kosterních svalech (při anaerobní glykolýze), je silná kyselina (pk 3,9) - je tedy v krvi plně disociována na laktát - a H + : glukóza 2 x laktát H +. Dalším osudem laktátu může být: pufrování bikarbonátem 3 laktát - + H HCO 3 laktát - + CO 2 + H 2 O (2) oxidace (při aerobní glykolýze) laktát - + H O 2 3 CO H 2 O 4 (3) substrátem pro glukoneogenezi přepsáním a doplněním rovnice (2) si uvědomíme, že při glukoneogenezi z laktátu by měly vzniknout 2 bikarbonáty 2 laktát CO H 2 O glukóza + 2 HCO 3 (4) Ketolátky jsou produkovány při oxidaci mastných kyselin (MK) v játrech. Volné MK jsou uvolňovány z tuků (triacylglycerolů) účinkem hormon senzitivní lipázy (aktivuje ji adrenalin nebo glukagon, inhibuje inzulín) za stavů, kdy je nedostatek jiných energetických substrátů (hlavně glukózy). Jednou z příčin může být hladovění nebo diabetes mellitus (DM) s absolutním nedostatkem inzulínu (DM 1. typu). Při hladovění využívají některé tkáně (mozek, srdeční a kosterní sval) ketolátky jako alternativní zdroj energie (ketolátky jsou snadno, bez nosiče, transportovány v krvi; všechny buňky s mitochondriemi [kromě jater] je mohou oxidovat). U DM 1. typu ke zvýšené produkci ketolátek (způsobené také nepřítomností inzulínu, který normálně inhibuje hormon senzitivní lipázu) přibývá i jejich špatné odbourávání v periferních tkáních kvůli absolutnímu nedostatku oxalacetátu (ten je produkován pouze při oxidaci glukózy) a zastavení cyklu kyseliny citrónové (viz Obrázek 2). U DM bývá zvýšení koncentrace ketolátek v krvi až 30 násobné a acidóza může být daleko závažnější než při hladovění. Jako acidifikující substance působí jednak volné mastné kyseliny a pak hlavně ketolátky acetoacetát a β-hydroxybutyrát 5 (jde o silné kyseliny - pk cca 4, v krvi jsou plně disociované). Aceton (vznikající spontánní dekarboxylací acetoacetátu) koncentraci protonů neovlivňuje. Obrázek 2. Schématické znázornění patogeneze diabetické ketoacidózy. Diabetik 1. typu má absolutní nedostatek inzulínu (1), což vede k tomu, že glukóza se nemůže dostat do svalů a tukové tkáně (2). Ve svalech se proto začínají rozkládat proteiny a vzniklé aminokyseliny stimulují pankreas k sekreci glukagonu (3). Glukagon stimuluje štěpení glykogenu (v játrech a svalech) a syntézu glukózy ze svalových aminokyselin a glycerolu vzniklého štěpením triacylglycerolů (4). Stimulace glukoneogenezy vede také k snížené tvorbě oxaloacetátu z fosfoenolpyruvátu a vyčerpání oxaloacetátu a inhibici citrátového cyklu (5). Zvýšená produkce glukózy játry spolu s nemožností spotřebování glukózy ve svalech a tukové tkáni vede k hyperglykémii (7) a následně osmotické diuréze. Volné mastné kyseliny (VMK) zvýšeně produkované v tukové tkáni (2) účinkem hormon senzitivní lipázy - HSL (stimulovaná glukagonem) podléhají beta-oxidaci a vzniká acetyl-coa. Ten pak není dostatečně metabolizován v cyklu kyseliny citrónové (nedostatek oxaloacetátu, viz výše) a je substrátem pro vznik ketolátek. Ketolátky jsou příčinou metabolické acidózy (MAC), při osmotické diuréze a zvracení dochází k dehydrataci, která dále MAC prohlubuje. Protože ketolátky jsou vylučovány močí spolu s kationty (nejvíce Na + a K + ), vede ketonurie k jejich ztrátám. Je vhodné připomenout, že úplná oxidace glukózy a mastných kyselin až na CO 2 a vodu, protony neprodukuje ani nespotřebovává, tedy neovlivňuje jejich koncentraci. Vodíkové ionty vznikající při inkorporaci NH 3 z aminokyselin do močoviny (syntéza močoviny) jsou u neutrálních aminokyse- 3 Z rovnice je patrné, že např. 1 mmol laktátu je pufrován 1 mmolem bikarbonátu 4 Oxidací solí organických kyselin (jako např. laktátu sodného) dodaných infúzními roztoky (např. Hartmannův roztok) docílíme poklesu H +, tedy alkalizace. Reakci (3) lze pak přepsat do tvaru: laktát + 3 O 2 2 CO 2 + HCO H 2 O; rozdíl oproti reakci (3) je, že s infúzními roztoky nedodáváme H + a samotný laktát může být metabolizován na bikarbonát (hydratací CO 2 karboanhydrázou). Obdobně je to i s dalšími organickými kyselinami v i.v. dodávaných roztocích (např. citrát z transfuze po metabolizaci také alkalizuje). 5 β-hydroxybutyrát vzniká redukcí acetoacetátu a obvykle je převažující ketolátkou (při oxidaci MK se produkuje velké množství NADH + H + a to posouvá reakci katalyzovanou 3-hydroxybutyrát dehydrogenázou na stranu β-hydroxybutyrátu) 185

186 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému lin použity při oxidaci jejich uhlíkového skeletu. Pokud však konečným produktem není močovina (ale např. NH 3 vyloučený jako pufr do moči), pak se při oxidaci uhlíkového řetězce aminokyselin protony spotřebovávají (alkalizuje). Další aminokyseliny (dibazické jako lyzin a obsahující síru jako cystein) při katabolismu protony produkují, jiné (dikarboxylové jako aspartát) protony spotřebovávají. Pufry Pufry (nárazníky) slouží k okamžitému vyrovnání změn koncentrace H +. Jsou složeny ze: slabé (tj. částečně disociované) kyseliny (např. H 2 CO 3 ) aniontu, který zbude po odštěpení H + z dané kyseliny (např. HCO 3- ) KAPITOLA 14 Při zvýšení koncentrace protonů se na příslušný aniont naváže H + za vzniku kyseliny, při nízké koncentraci H + naopak kyselina disociuje a uvolní H +. Pufry tedy vlastní nerovnováhu mezi produkcí a vylučováním H + neřeší, umožňují však zmírnit případné změny v koncentraci H + a tím získat čas na vyřešení příčiny. V krvi jsou nejdůležitějšími pufry hydrogenuhličitanový a bílkovinný (zejména hemoglobinový) - viz Tabulka 14p.2. Pufr Plazma Erytrocyty Hemoglobin - 35 % - HCO 3 /H 2 CO 3 35 % 18 % Plazmatické proteiny 7 % - Fosfáty anorganické 1 % 1 % Fosfáty organické - 3 % Celkem 43 % 57 % Tabulka 14p.2 Podíl jednotlivých pufrů na pufrovací kapacitě krve (převzato z [2]). Jako nejvýznamnější plazmatický pufr můžeme označit hydrogenuhličitanový, protože jde o otevřený systém (bikarbonát se může produkovat v ledvinách i přeměnit na CO 2 a být vyloučen plícemi, viz také reakce 1) podléhající regulaci (např. při acidóze se zvyšuje produkce bikarbonátu, zvyšuje se vylučování CO 2 ). Vyjdeme-li z reakce (1), pak pro hydrogenuhličitanivý pufr platí, že: K a disociační konstanta (v tomto případě 800 nmol/l) H 2 CO 3 měříme jen jako parciální tlak CO 2 (pco 2 ) - chceme-li převést na mmol/l, pak: CO 2 [mmol/l] = pco 2 [kpa] * 0,225. Všimněte si, že poměr koncentrací H 2 CO 3 a HCO 3 - je v krvi fyziologicky roven cca 0,05 = 1:20. Při změně tohoto poměru dojde ke změně koncentrace H + v krvi. Na druhou stranu normální koncentrace H+ při změně poměru H 2 CO 3 /HCO 3 - je známkou kompenzované poruchy acidobazické rovnováhy 6. Naproti tomu hemoglobinový pufr má svou důležitou úlohu při vyrovnávání změn koncetrace H + mezi periferními tkáněmi (vysoká koncentrace H + ) a plicními alveoly (nízká koncentrace H + ) - viz Obrázek 3, ale regulaci nepodléhá (pufrovací kapacita hemoglobinu bude však snížená např. při anémii) a de facto jde o uzavřený systém. 6 Např. hyperkapnie ( pco 2 ) kompenzatorně povede k produkci hydrogenuhličitanu, poměr H 2 CO 3 /HCO 3 - pak může být 10 kpa * 0,225/44 mmol/l = přibližně 1:20. Koncentrace H+ v krvi by v tomto hypotetickém příkladu zůstala normální, nicméně pacient zjevně není zdráv. 186

187 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému KAPITOLA 14 Obrázek 14p.3 Hemoglobinový pufr. Nejdůležitější pufry v moči jsou fosfátový a amoniak (viz Obrázek 4). Močové pufry zásadně 7 zvyšují kapacitu ledvin vyloučit H +. Z hlediska poruch acidobazické rovnováhy je tím důležitějším močovým pufrem amoniak, protože podléhá účinné regulaci (jeho produkce významně stoupá při acidóze). Fosfátový pufr má svůj konstantní účinek a nereaguje na změny koncentrace H + v krvi. Primární intracelulární pufry jsou proteiny, fosfáty a hemoglobin (v erytrocytech, viz výše). Je také zřejmé, že kostní tkáň působí jako významný aktivní regulátor acidobazické rovnováhy (zejména uvolňováním půfrů jako NaHCO 3, KHCO 3 a následně i CaCO 3 a CaHPO 4 ) při acidóze. Odhaduje se, že asi 40 % pufrování při akutní metabolické acidóze obstarává právě kost. 7 Bez močových pufrů by ledviny byly schopny zvýšit koncentraci H + v moči jen cca x (změna ph ze 7,4 [fyziologické ph krve] na 4,5 [koncentrační maximum ledvin]), což odpovídá méně než 1 mmol H + /den. Za fyziologických okolností je však třeba vyloučit ledvinami cca 70 mmol H + denně, při acidóze i více než 250 mmol H + denně. 187

188 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému Exkrece a metabolismus ovlivňující koncentraci H + Ledviny Proximální tubulus je místem, kde se vstřebává většina profiltrovaného bikarbonátu, tvoří se nový a vzniká amoniak jako důležitý močový pufr. Podrobnosti najdete v Obrázku 4. Obrázek 14p.4. Metabolismus bikarbonátu v proximálním tubulu a močové pufry. Červeně je znázorněna krevní strana, odstíny žluté močová. H + secernovaný tubulárními buňkami do moče je vyměněn za Na + - a ten pak transportován spolu s HCO 3 do krve. - HCO 3 je ledvinami: reabsorbován (filtrovaný bikarbonát reaguje se secernovaným H + za vzniku CO 2, který se vstřebá a uvnitř tubulární - buňky je karboanhydrázou přeměněn nakonec na HCO 3 a H + ). regenerován (syntetizován de novo ) - glutamin z jater nebo profiltrovaný z plazmy poskytuje jednak amoniak jako - močový pufr, dále také CO 2 pro syntézu HCO 3 KAPITOLA 14 Světle žlutě jsou podbarveny reakce s fosfátovým a amonným pufrem v moči. Obrázek 14p.4 Distální tubulus (a jeho přilehlé části) jsou důležité v exkreci H + a regulaci vstřebávání Na +, Cl - a K +. Významnou úlohu v řízení těchto dějů má aldosteron. Obrázek 14p Úloha distálního tubulu v homeostáze H +. Modifikováno dle [4]. Popis z levého dolního rohu po směru hodinových ručiček: v tlustém ascendentním raménku Henleho kličky: 188

189 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému NKCC2 - Na+, K+, 2 Cl- kotransporter (blokován furosemidem) NHE3 - Na + /H + výměník 3 Na + /K + ATPáza v distálním stočeném tubulu NHE2 NCC spojovací tubulus ENaC - pravděpodobně důležitý v patogenezi nefrotického syndromu (vznik otoků) NHE2 Na + /K+ ATPáza (řízená aldosteronem) H + -ATPáza (řízená aldosteronem) Cl - /HCO 3 - výměníky AE1 - anion exchanger - mutace v genu pro AE1 vede k distální renální tubulární acidóze pendrin - vyměňuje anionty (Cl -, HCO 3-, OH -, I - ) KAPITOLA 14 Obrázek 14p.5 Plíce a metabolismus kyslíku Ventilace a výměna plynů Ventilace zajišťuje výměnu vzduchu v alveolech, následuje výměna plynů na alveolokapilární membráně 8 a transport kyslíku hemoglobinem do tkání. Zde je kyslík uvolněn a naopak CO 2 se z tkání odvádí (Obrázek 14.6). 8 Nejvíce nás zajímá výměna O 2 a CO 2 - CO 2 proniká alveolokapilární membránou snáze než O 2. Proto při onemocnění plic bývá nejprve postižena oxygenace (parciální respirační insuficience) a až při dalším poškození plic dochází k hyperkapnii (globální respirační insuficience). 189

190 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému Obrázek 14p.6. Úloha ventilace a výměny plynů při udržení žádoucích parciálních tlaků plynů v krvi (modifikováno dle Lit. 1, str. 44, Fig. 2). KAPITOLA 14 Obrázek 14p.6 Transport kyslíku a disociační křivka hemoglobinu Účelem transportu kyslíku v krvi je jeho dodávka tkáním. V krvi je transportován vázaný na hemoglobin, jen asi 2% kyslíku jsou rozpuštěná v plazmě. Transport kyslíku může být narušen dvěma základními způsoby: 1. sníženým obsahem kyslíku v krvi (snížení parciálního tlaku kyslíku - po 2 - např. snížením po 2 ve vdechovaném vzduchu, poruchou ventilace či poruchou difúze na alveolokapilární membráně; snížená koncentrace hemoglobinu; špatná funkce hemoglobinu - dyshemoglobinémie) 2. špatným krevním oběhem (snížený srdeční výdej při selhání srdce, poruchy periferního prokrvení např. při aterosklerózou způsobené ischemii končetin nebo při akutním infarktu myokardu) Není-li zajištěna dostatečná oxygenace tkání, probíhá v nich anaerobní glykolýza, která produkuje laktát (hypoxie tkání tedy 190

191 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému vede i k metabolické acidóze). Závislost saturace hemoglobinu na po 2 popisuje disociační křivka hemoglobinu (Obrázek 7), vyjadřuje tedy afinitu hemoglobinu ke kyslíku. Poloha křivky se může měnit vlivem různých okolností, mluvíme o posunu: doprava (a dolů) - typická situace v tkáních: vysoká koncentrace látek, které snižují vazbu kyslíku na hemoglobin [H + (nízké ph), CO 2, 2,3-difosfoglycerát] vysoká teplota Všechny tyto vlivy způsobí, že se kyslík bude z hemoglobinu z tkání snáze uvolňovat. doleva (a nahoru) - typická situace v plicích (opak výše uvedeného stavu v tkáních). Vede to k silnější vazbě kyslíku na hemoglobin. KAPITOLA 14 Kromě polohy křivky se může změnit i její tvar, což je dobře patrné zejména při dyshemoglobinémiích (viz Obrázek 7). Obrázek 14p.7 Disociační křivka hemoglobinu = závislost saturace hemoglobinu na po 2. a - posun doleva (situace v plicích), b - posun doprava (situace v tkáních). Všimněte si také průběhu křivky myoglobinu (c) a při otravě oxidem uhelnatým (50% CO, d). Játra Játra pro své pluripotentní metabolické funkce musí hrát roli i v regulaci koncentrace H +. Patří sem zejména produkce laktátu a ketogeneze na straně produkce H + a glukoneogeneze nebo syntéza mastných kyselin na straně spotřebovávání H +. Vysoká koncentrace H + v krvi obvykle vede např. k snížení tvorby ketolátek nebo inkorporaci amoniaku místo do močoviny do glutaminu. Glutamin pak slouží jako zdroj amoniaku (pufru) v moči. Onemocnění jater, které způsobí poruchu regulace H +, musí postihnout velkou část jater (velká funkční rezerva), aby bylo klinicky významné. S takovým postižením se setkáváme např. u pokročilé cirhózy jaterní. 191

192 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému Zažívací trakt Poruchy lokalizované v zažívacím traktu mohou rovněž často ovlivnít acidobazickou rovnováhu. Žaludeční šťáva má obvykle nízké ph (cca 2) a vysoký obsah chloridů. Střevní (a zejména pankreatická) štáva je alkaličtější (ph cca 7,5) a obsahuje vysokou koncentraci bikarbonátu, chloridů a sodíku. Objem denní produkce šťav zažívacího traktu je veliký (cca 6-10 l/den) - v případě patologie dochází tedy k významným ztrátám iontů a tekutin. Typicky ztrátou kyselé žaludeční šťávy (zvracením, odsáváním) dojde k metabolické alkalóze a ztrátou alkalické střevní tekutiny (průjem) k metabolické acidóze. KAPITOLA 14 Teorie elektroneutrality plazmy Teorie elektroneutrality plazmy 9 vychází z předpokladu, že je v plazmě vždy stejný počet kladných a záporných nábojů. Na straně kationtů jsou Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+. Na straně aniontů jsou Cl -, HCO 3-, aniont albuminu (někdy označovaný jako náboj albuminu ), fosfáty a takzvané neměřené anionty (viz Obrázek 8). Tato teorie poskytla několik praktických výpočtů, které umožňují identifikaci příčiny poruchy ABR. Nejrozšířenějším výpočtem je anion gap (AG): AG = (Na + + K + ) - (Cl - + HCO 3- ) [RR: mmol/l; střed 15 mmol/l] Fyziologické mechanismy (zejména funkce ledvinných tubulů) zajistí, že při ztrátě chloridů dojde k jejich nahrazení bikarbonátem a naopak - v těchto případech nedochází k významné změně AG. Nejpřínosnější je nález vysokého AG, který je typický pro zvýšenou koncentraci organických kyselin (např. laktát, ketolátky, kyselina octová, salicyláty), tedy metabolickou acidózu. Přidáme-li do výpočtu AG na stranu aniontů ještě náboj albuminu a fosfátu, získáme neměřené anionty (UA). Jejich interpretace je obdobná jako u AG, výpočet je však přesnější. Teorie elektroneutrality může být přínosná také při identifikaci smíšených poruch ABR, je však bezcenná pro určení časového průběhu (kompenzace ) poruch ABR. Koncentrace chloridů se může měnit vlivem hydratace (a pak se mění proporcionálně s koncentrací sodíku) nebo je změna chloridů na koncentraci sodíku (alespoň částečně) nezávislá (např. při zvracení se ztrácí významně více chloridů než sodíku). Korigované chloridy slouží k posouzení toho, zda změny chloridů jsou pro acidobazickou rovnováhu významné (nemění se sloupec kationtů a aniontů současně; tj. vedou k hypochloremické MAl nebo hyperchloremické MAc). Výpočet je jednoduchý: Cl korigované = S_Cl * 140/S_Na [rozhodovací mez je 102 mmol/l] Tedy naměřenou koncentraci cloridů v séru [S_Cl] vynásobíme poměrem 140 (normální koncentrace Na v séru) a naměřenou koncentrací Na v séru [S_Na]. 9 Často také uváděno jako hodnocení ABR dle Stewarta a Fencla. 192

193 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému KAPITOLA 14 Obrázek 14p.8 Model elektroneutrality plazmy - dělení na kationty a anionty a grafická reprezentace používaných výpočtů. - Ztráta chloridů (např. při zvracení) vede tedy ke ztrátě chloridů a jejich nahrazení HCO 3 vzniká alkalóza. Významný pokles - - albuminu (např. ze 40 g/l na 20 g/l) vede k nahrazení albuminátu HCO 3 (v tomto případě stoupne koncentrace HCO 3 o cca 6 mmol/l). Pokles albuminu má tedy alkalizující vliv. Naopak zvýšený přívod chloridů infúzemi nebo hromadění organických kyselin (ketolátky, laktát, salicyláty, formiát při otravě - metanolem, oxalát při otravě etylénglykolem, acetát při intoxikaci etanolem ) vede k poklesu HCO 3 a k acidóze. Terminologie Kompenzace a korekce Dojde-li k poruše acidobazické rovnováhy, organismus se snaží ji kompenzovat. Dělá to: plícemi - hypoventilace zvyšuje pco 2, hyperventilace snižuje. Kompenzujeme jimi metabolické poruchy (např. hluboké a rychlé Kussmaulovo dýchání při ketoacidóze). Tato kompenzace se rozvíjí a mizí během hodin. ledvinami - ledviny tvoří více (acidóza) či méně (alkalóza) kyselou moč; většinou kompenzují respirační poruchy ABR. Pokud ledviny upravují metabolickou poruchu, označujeme to někdy jako korekci. Korekcí rovněž nazýváme infúzní acidifikační a alkalizační léčbu, ev. umělou plicní ventilaci při respirační acidóze. Tato kompenzace se rozvíjí a mizí během 3-5 dnů. Acidémie/acidóza; alkalémie/alkalóza Acidémií resp. alkalémií rozumíme pouhou změnu koncentrace H + v krvi (méně nebo více než 40 ± 5 nmol/l). Acidémie je tedy vzestup koncentrace H + a alkalémie je její pokles. Naproti tomu acidóza je patologický děj (nahromadění kyselin nebo ztráta 193

194 Acidobazická rovnováha a oxygenace tkání: úvod do problému zásad), který vede k nabourání homeostázy H + (primárně vedoucí ke zvýšení koncentrace H + ) a nemusí být (vlivem např. kompenzačních dějů nebo kombinací s jinou poruchou) spojen s acidémii. Obdobně je tomu i u alkalózy. Metabolické a respirační poruchy O respiračních poruchách se mluví při změnách parciálního tlaku CO 2 (vzestup = acidóza, RAc; pokles = alkalóza, RAl), o metabolických poruchách při změnách koncentrace HCO 3 - (vzestup = alkalóza, MAl; pokles = acidóza MAc. Je zřejmé, že metabolické i respirační poruchy se často vyskytují společně (např. laktátová acidóza při hypoxii). KAPITOLA 14 Hydrogenuhličitan, bikarbonát, HCO 3 - Jde o odvozený parametr, který se počítá z měřených parametrů ph a pco 2 pomocí Henderson-Hasselbachovy rovnice (a je konstanta převádějící pco 2 na H 2 CO 3 ): Base Excess (BE) Vyjadřuje množství silné kyseliny nebo zásady, které musíme přidat ke každému litru ECT, aby se ph vrátilo na 7,4; při 37 C a fyziologickém pco 2 = 5,3 kpa. Chybí-li v ECT kyseliny, je BE pozitivní (při metabolické alkalóze); chybí-li zásady, je negativní (při metabolické acidóze). Jde (podobně jako hydrogenuhličitan) o odvozený parametr a počítá se také modifikací Henderson-Haselbachovy rovnice. Literatura 1. Gaw, A., Murphy, M., Cowan, R., O Reilly, D., Stewart, M., & Shepherd, J. (2008). Clinical Biochemistry: An Illustrated Colour Text (4th ed.). Churchill Livingstone. 2. Racek, J. (2006). (2. vydání). Praha: Galén. 3. Marshall, W. J., & Bangert, S. K. (2008). Clinical Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects (2nd ed.). Churchill Livingstone. 4. Carraro-Lacroix, L. R., & Malnic, G. (2010). Acid-base transport by the renal distal nephron. Journal of Nephrology, 23 Suppl 16, S Rose, B., & Post, T. (2000). Clinical Physiology of Acid-Base and Electrolyte Disorders (5th ed.). McGraw-Hill Professional. 194

195 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Autor: prof. MUDr. Jaroslav Racek, Dr.Sc. Recenzent: prof. MUDr. Antonín Kazda, Ph.D., MUDr. Helena Brodská, Ph.D. KAPITOLA 14,15,16 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Poruchy acidobazické rovnováhy se podle příčiny dělí na dvě velké skupiny: metabolické a respirační; podle toho, zda převažují kyseliny či zásady, pak rozlišujeme acidózu a alkalózu. Jak již bylo uvedeno, rozeznáváme čtyři hlavní skupiny poruch ABR: metabolickou acidózu (MAc) metabolickou alkalózu (MAl) respirační acidózu (RAc) respirační alkalózu (RAl) V dalších odstavcích probereme tyto základní poruchy, všimneme si jejich příčin, klinických příznaků, laboratorních změn a způsobu kompenzace. Stručně se zmíníme i o jejich léčbě. Metabolické poruchy acidobazické rovnováhy Metabolické poruchy ABR jsou laboratorně charakterizovány změnami v koncentraci hydrogenuhličitanů. Jsou ze všech potuch ABR nejčastější. Metabolická acidóza Metabolická acidóza (MAc) může být způsobena nahromaděním kyselých metabolitů nebo ztrátou hydrogenuhličitanů. V klinickém obraze MAc je typické hluboké acidotické Kussmaulovo dýchání, jehož příčinou je stimulace dechového centra vysokou koncentrací vodíkových iontů. Pokles ph mozkomíšního moku se projeví bolestmi hlavy, poruchami vidění, dezorientací, somnolencí až komatem. GIT projevy mají charakter nauzey a zvracení. Laboratorně se MAc projeví negativní hodnotou BE, snížením HCO 3-, poklesem ph a později v důsledku plicní kompenzace poruchy poklesem p a CO 2. Nízký p a CO 2 vede k alteraci psychického stavu až komatu. Moč bývá obvykle kyselá, ve zvýšené míře se vylučují fosfáty a amonné ionty. Snižuje se exkrece HCO 3-. Metabolická acidóza se zvýšenou hodnotou AG Příčinou MAc tohoto typu může být nahromadění kyselých endogenních metabolitů nebo příjem kyselin a látek na kyseliny v organismu transformovaných. Tak je tomu při ketoacidóze, nacházené u dekompenzovaných diabetiků, při hladovění, u alkoholiků, po dlouhodobém tělesném výkonu; laktátové (mléčné) acidóze např. při nedostatečné oxygenaci krve a perfuzi tkání, kdy se v organismu hromadí se kyselina mléčná, stejně při poruše odbourávání této relativně silné kyseliny - viz níže; renální acidóze u pacientů se selháním ledvin - hromadí se endogenní anionty - fosfáty a sulfáty); hromadění exogenních aniontů při intoxikacích, kdy toxická látka je buď sama kyselinou (např. kyselina salicylová) nebo je metabolizována na kyselý katabolit (laktát jako produkt odbourávání etanolu, kyseliny glykolová, glyoxalová a oxalová (šťavelová) vzniklé z etylénglykolu, kyselina mravenčí z metanolu atd.); nevhodně vedené parenterální výživě např. po rychlém podání sorbitolu, xylitolu, fruktózy nebo hydrolyzátů proteinů; proto se dnes jiné cukry než glukóza při parenterální výživě prakticky neužívají. 195

196 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Z uvedených poruch se patrně nejčastěji setkáváme s laktátovou acidózou. Dělíme ji podle příčiny na typ A a B. Laktátová acidóza typu A je spojena s nedostatečnou oxygenací krve a tkáňovou hypoxií - hypoxickou, anemickou, stagnační nebo histotoxickou. Příčinou hypoxické hypoxie může být nízký po 2 ve vdechovaném vzduchu, hypoventilace, plicní onemocnění spojená s omezením dýchací plochy, alveolokapilární bloky atd. Anemická hypoxie je způsobena erytrocytovým či hemoglobinovým defektem nebo anémií. Příčinou stagnační hypoxie může být selhání srdce jako pumpy, trombóza, sepse, snížení objemu cirkulující krve až šok. Příčinou histotoxické hypoxie bývá poškození enzymatických buněčných systémů radiací, teplem, infekcí, hypoxií, při otravě oxidem uhelnatým, kyanidy apod. Laktátová acidóza typu B není provázena tkáňovou hypoxií. Příčinou je zhoršené odbourávání laktátu při onemocnění jater, ledvin, leukémii, při léčbě perorálními antidiabetiky (typu biguanidů - metformin), při rychlém podání fruktózy, sorbitolu, xylitolu, dále u vrozených metabolických poruch, např. u glykogenózy typu I, metylmalonové acidurie aj. Poruchu odbourávání laktátu může způsobit i nedostatek thiaminu (vitaminu B 1 ), který je nutný pro oxidační dekarboxylaci α-ketokyselin (tedy i kyseliny pyrohroznové). Ve skutečnosti se však oba typy laktátové acidózy často kombinují - tak např. u pacienta v šoku je vzestup koncentrace laktátu z hypoxie potencován poruchou jeho odbourávání v hypoxických játrech. Užitečným parametrem pro hodnocení hypoxie určitého orgánu je stanovení rozdílu v koncentraci laktátu v artérii a příslušné véně. Konečně další možností posouzení hypoxie organismu je určení poměru laktát/pyruvát, který se mění v závislosti na zásobení tkání kyslíkem. Protože glykolýza probíhá v cytoplazmě, doporučuje se někdy obdobný poměr beta-hydroxybutyrát/acetoacetát, který zobrazuje oxidoredukční děje v mitochondriích. S laktátovou acidózou se setkáváme i fyziologicky při práci svalů na kyslíkový dluh. Doprovází tak všechny tělesné výkony sprintérského charakteru, zatímco dlouhodobá (vytrvalostní) fyzická zátěž musí být konána v aerobním režimu. Stupeň trénovanosti organismu se dá posoudit podle tzv. anaerobního prahu. Při bicyklové ergometrii se plynule zvyšuje fyzická zátěž a v pravidelných intervalech se sleduje hladina laktátu. Ta zprvu roste jen mírně a hodnota zátěže, při které dojde ke zlomu a koncentrace laktátu začne prudce narůstat, se nazývá anaerobní práh. (obr. 15.1). KAPITOLA 14,15,16 196

197 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy KAPITOLA 14,15,16 Obrázek 14.1 Stanovení anaerobního prahu Zátěž vyšší intenzity už člověk nezvládá v aerobním režimu. Pravidelným tréninkem se dá anaerobní práh posunout do vyšších hodnot - člověk podává větší výkon aerobně. To má význam nejen u sportovců, ale i např. u pacientů po infarktu myokardu. Je však pravdou, že schopnost zvládat zátěž aerobně či anaerobně je do určité míry vrozená a je dána poměrem bílých (anaerobních) a červených (aerobních) svalových vláken. Metabolická acidóza s normální hodnotou AG Příčinou jsou nadměrné ztráty hydrogenuhličitanů. Dochází k nim při těžkých průjmech, ztrátách střevního obsahu drény a píštělemi GIT distálně od duodena; hypoaldosteronismu; ureterosigmoideostomii (střevní sliznice vstřebává Cl - ); renální tubulární acidózy 1. typu (distální), kdy buňky distálního tubulu nejsou schopny secernovat H + ); po podání NH 4 Cl a argininhydrochloridu při léčbě MAl; po podání acetazolamidu (inhibitor karboanhydrázy); u diluční acidózy, kdy je relativní úbytek hydrogenuhličitanů po podání infuzí, ve kterých chybí nárazníkový systém (např. izotonický roztok NaCl); kyselá složka hydrogenhličitanového pufru je v normální koncentraci. Metabolická acidóza je kompenzována hyperventilací, která vede ke snížení p a CO 2, a tedy k vzestupu ph. Maximální stupeň kompenzace ke dosažen za h po vzniku poruchy, po jejím odstranění stejnou dobu přetrvává. Účinnost kompenzace závisí na zdatnosti dýchacího aparátu: zatímco u mladého jinak zdravého jedince může být velmi účinná, u osoby s těžkým emfyzémem je účinná jen omezeně. Při terapii MAc (i ostatních poruch ABR) se řídíme zásadou, že je třeba léčit především základní onemocnění - hypoxii oxygenoterapií, diabetickou ketoacidózu inzulinem, ketoacidózu z hladovění dodávkou glukózy atd. K alkalizační léčbě přistupujeme jen výjimečně; snažíme se přitom upravit hodnotu ph, nikoliv BE. 197

198 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Z infuzních roztoků se užívá prakticky jen 8,4% roztok NaHCO 3 a při současné hypokaliémii 10% roztok KHCO 3 ; oba roztoky - obsahují 1 mmol HCO 3 v 1 ml. Obvykle se nepřekračuje dávka 50 ml (často postačí podání 20 ml roztoku). I podání roztoku NaHCO 3 má omezení. Roztok NaHCO 3 je vhodný pouze pro nehypoxické typy metabolických acidóz (urémie, diabetes, průjmy). U laktátových acidóz vede k nadprodukci CO 2 v ECT s rozvojem respirační acidózy, zároveň se v důsledku hromadění protonů v buňkách zhoršuje jejich metabolismus (dochází k dalšímu poklesu nitrobuněčného ph). Roztok laktátu sodného je vhodný jen u acidóz s dobrou funkcí jater, kde nehrozí retence kyseliny mléčné. Organické kyseliny (mléčná, acetoctová, beta-hydroxymáselná) jsou po odstranění příčiny jejich hromadění metabolizovány na hydrogenuhličitan. Předchozí podání NaHCO 3 by tedy mohlo vést k přesunu ph krve na stranu alkalickou se všemi nevýhodami alkalémie. KAPITOLA 14,15,16 Řada nevysvětlitelných laktátových acidóz je způsobena deplecí thiaminu (vitaminu B 1 ), který je nezbytný pro oxidativní dekarboxylace, tedy i pro aerobní glykolýzu a správnou funkci Krebsova cyklu. Tak tomu může být např. u pacientů na dlouhodobé parenterální výživě. Po podání vitaminu B 1 dochází k rychlé úpravě poruchy. Metabolická alkalóza Tato závažná porucha se podle vyvolávající příčiny a také podle způsobu terapie dělí na dvě skupiny. Metabolická alkalóza odpovídající na léčbu chloridy Příčinou tohoto typu MAl jsou nadměrné ztráty chloridů, a to v kyselé žaludeční šťávě nebo moči. Dochází k nim při: odsávání žaludeční šťávy; dlouhotrvajícím zvracení (ztrácí se i Na + a významně i K + ); protrahovaných průjmech se ztrátou chloridů (chloridorea); předávkování alkalizujícími diuretiky (furosemid); ztráty Cl - jsou vyšší než ztráty Na + ; močí se navíc vylučuje nezanedbatelné množství K +. V patogeneze tohoto typu MAl se uplatňuje nedostatek chloridů v proximálním tubulu ledvin, které se zde normálně vstřebávají spolu s Na +. V důsledku toho většina Na+ přichází do distálního tubulu, kde se směňují za K + a H + : U tohoto typu je typická velmi nízká koncentrace chloridů v moči (U-Cl - < 20 mmol/l). Metabolická alkalóza rezistentní na léčbu chloridy Příčiny tohoto stavu jsou rozmanité; patří k nim např.: primární hyperaldosteronismus (Connův syndrom); sekundární hyperaldosteronismus (při nefrotickém syndromu, kardiální insuficienci, chronické hepatopatii či stenóze renální tepny); dlouhodobé podávání kortikoidů, kdy se projeví jejich mineralokortikoidní účinek; nadměrné podávání antacid (např. NaHCO 3 ) či pití velkého množství mléka; katabolismus s výstupem K + z buněk výměnou za H + a Na + ; výsledkem je acidóza ICT a alkalóza ECT; rychlá úprava ketoacidózy, kdy jsou ketolátky metabolizovány na hydrogenuhličitany; - dehydratace se zahuštěním vnitřního prostředí, relativním vzestupem HCO 3 a sekundárním hyperaldosteronismem (koncentrační alkalóza). Při hyperaldosteronismu, který je nejčastější příčinou tohoto typu MAl, se v distálním tubulu ledvin vstřebává Na + a vylučuje se 198

199 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy nadměrné množství H + a K + ; současně dochází k retenci HCO 3-. V tomto případě však bývá koncentrace chloridů v moči vyšší než 20 mmol/l. Při alkalémii klesá koncentrace ionizovaného kalcia v plazmě a zvyšuje se neuromuskulární dráždivost, pohotovost ke křečím je zvýšená. Pokles K + v plazmě může vést k poruchám srdečního rytmu. Zhoršuje se uvolňování kyslíku z vazby na hemoglobin, disociační křivka hemoglobinu se posouvá doleva. Dalšími projevy jsou anoxie, zvracení, subileózní stavy, svalová slabost, parestezie a zmatenost. Při MAl bývá někdy kyselá reakce moče - hovoříme o tzv. paradoxní acidurii. Příčinou je hypokalémie, která často metabolickou alkalózu doprovází: v distálním tubulu ledvin se pro nedostatek K + musí Na + směňovat za H +. Výsledkem je tvorba kyselé moči; protože spolu s Na + se resorbují ionty HCO 3-, prohlubuje se metabolická alkalóza. Circulus vitiosus se přeruší dodáním K + (obvykle ve formě KCl, který navíc acidifikuje vnitřní prostředí). KAPITOLA 14,15,16 Kompenzace metabolické alkalózy plicní cestou (hypoventilací) je nedokonalá - vede nejen k hyperkapnii, ale i k hypoxémii. Pokles p a O 2 pod 8,0 kpa je registrován chemoreceptory s následnou stimulací dechového centra. Tento mechanismus nedovolí, aby p a CO 2 stoupl nad hodnotu 8,0 kpa ani při několik dní trvající poruše. Výjimkou jsou stavy, kdy při oxygenoterapii vzestupem p a O 2 odstraníme poslední stimul provokující dechové centrum k vystupňování činnosti. Zatímco se člověk ve svém vývoji běžně setkával s metabolickou acidózou (při hladovění, fyzické námaze aj.) a dovede ji poměrně dobře tolerovat i kompenzovat, je metabolická alkalóza kompenzována a tedy i snášena mnohem hůře; to podtrhuje nutnost včas rozpoznat její hrozící vývoj. Laboratorně se MAl projeví vzestupem HCO 3-, BE a ph, kompenzatorně pak vzestupem p a CO 2. Současně je hypokalémie, hypochloridémie, klesá podíl ionizovaného kalcia v rámci celkové kalcémie. Koncentrace Cl - v moči se liší podle příčiny MAl (viz výše). Moč, jak již bylo uvedeno, může být kyselá při tzv. paradoxní acidurii. Léčba MAl se liší podle typu poruchy. U MAl ze ztrát chloridů podáváme argininhydrochlorid, menší acidifikační schopnost mají i roztoky NaCl a KCl. Je možné i podání 0,1 mol/l kyseliny chlorovodíkové v pomalé infuzi do centrální žíly. Tento typ MAl nelze považovat za vyléčený, dokud nedojde k normalizaci ztrát chloridů močí. Při léčbě druhého typu MAl se snažíme ovlivnit prvotní příčinu, chybějící kalium dodáváme obvykle ve formě KCl. Při hrozivé poruše může být metodou volby hemodialýza, která vede poměrně rychle a účinně k úpravě metabolické složky ABR. Při léčbě metabolické alkalózy, ale i jiných poruch ABR je třeba počítat se závislostí koncentrace K + v extracelulární tekutině na jejím ph, aby změny ph nevyvolaly prudké kolísání kalémie s možným vyvoláním srdeční arytmie. Respirační poruchy acidobazické rovnováhy Jsou charakterizovány primárními změnami v p a CO 2. Respirační acidóza Respirační acidóza (RAc) je poměrně vzácná u pacientů v intenzivní péči, pokud akutnímu onemocnění nebo úrazu nepředcházelo chronické plicní onemocnění. Příčinou respirační acidózy může být: centrální deprese dýchání (při úrazech, zánětech, tumorech v oblasti dechového centra nebo účinkem sedativ a hypnotik, u tzv. syndromu spánkové apnoe apod.); ventilační porucha (při chronickém obstrukčním plicním onemocnění, edému plic, rozsáhlé pneumonii, pneumothoraxu, velkém hydrothoraxu, astmatickém stavu, deformitách hrudníku, po úrazech hrudníku, kdy bolest omezuje dýchání, při extrémní obezitě (Pickwickův syndrom) aj.); zástava činnosti srdce a plic, kdy se RAc kombinuje s metabolickou laktátovou Laboratorně se RAc projeví vzestupem p a CO 2 a poklesem ph, při poklesu p a O 2 i zvýšením koncentrace laktátu a dochází tedy k její kombinaci s MAc. Nárůst p a CO 2 (hyperkapnie) normálně nutí dechové centrum k zvýšené činnosti. Při hodnotách p a CO 2 nad 8,0 kpa vnímavost dechového centra na tento podnět klesá a jediným stimulem se stává nízký p a O 2 (hypoxémie). Kompenzace RAc probíhá renální cestou. V tubulech se stupňuje výměna Na + za nadbytečné H +. Zvyšují se ztráty H + a Cl -, zatímco 199

200 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Na + je retinováno. Dochází rovněž k retenci hydrogenuhličitanů, jejichž koncentrace v krvi roste: V krvi se zvyšuje koncentrace K + a Ca 2+. Disociační křivka hemoglobinu se posouvá doprava. V periferii dochází k vazodilataci. Klinicky se RAc projeví především neurologickou symptomatologií z acidémie a cerebrální vazodilatace - bolestmi hlavy, tremorem, křečemi, motorickými poruchami, psychózami, poruchami spánku, spavostí, malátností až komatem. KAPITOLA 14,15,16 Terapie RAc spočívá u akutních stavů v odstranění vyvolávající příčiny s cílem zlepšit alveolární ventilaci. Je možné zasáhnout i farmakologicky (bronchodilatancia, sympatomimetika). Při oxygenoterapii postupujeme zvláště u chronických stavů opatrně, abychom prudkým zvýšením p a O 2 neodstranili poslední stimulační podnět pro dechové centrum, kterým je hypoxémie. Chronické poruchy jsou kompenzovány vzestupem koncentrace hydrogenuhličitanů; po odstranění hyperkapnie řízenou ventilací přetrvává řadu dní renální kompenzace, což by nemocného ohrozilo alkalémií se všemi jejími nepříznivými následky. Pokles p a CO 2 při řízené ventilaci nemá být proto rychlejší než 0,3-0,7 kpa/h. Respirační insuficience Stav, kdy plíce nejsou schopny zajistit dostatečnou výměnu kyslíku a oxidu uhličitého mezi atmosférickým vzduchem a krví, se označuje jako respirační insuficience. Laboratorně je charakterizována patologickými hodnotami krevních plynů (p a O 2 a p a CO 2 ). Pokles p a O 2 a saturace hemoglobinu kyslíkem jsou typické pro tzv. parciální respirační insuficienci (hypoxemické selhání). Zprvu se nalézá pouze po námaze, později i u nemocných v klidu. V laboratorním obraze globální respirační insuficience (hyperkapnické selhání) je navíc vzestup p a CO 2, tedy respirační acidóza. Pozdější nástup hyperkapnie je způsoben vlastnostmi oxidu uhličitého, který difunduje 30x rychleji než kyslík. Příčiny respirační insuficience mohou být na úrovni dechového centra, plic a dýchacích cest nebo jde o onemocnění hrudní stěny a kryjí se s příčinami respirační acidózy. Hypoxémie podporuje anaerobní metabolismus tkání s hromaděním laktátu a rozvojem metabolické laktátové acidózy. Klinický obraz respirační insuficience je dán základním onemocněním a kombinovaným účinkem hypoxémie, hyperkapnie a RAc. Pokles pao2 pod 6,7 kpa může vést k manifestaci latentních poruch prokrvení jako je angina pectoris, intermitentní klaudikace, tranzitorní ischemické ataky CNS atd. Nemocný má bolesti hlavy, deprese, úzkost, je spavý nebo naopak motoricky neklidný. Hyperkapnie vyvolá vazodilataci a vzestup permeability mozkových cév, krátkodobé usínání, nespavost v noci, spavost ve dne. Respirační alkalóza Respirační alkalóza (RAl) se rozvíjí u stavů provázených drážděním dechového centra s následnou hyperventilací. K dráždění dechového centra dochází při volní hyperventilaci; stresu a u hysterických pacientů; poruchách dechového centra (iktus, trauma, tumor, zánět); metabolických poruchách (u horečky, jaterní encefalopatie, vlivem léků - salicyláty); nevhodně nastavených parametrech řízeného dýchání; při řízeném dýchání může být mírná RAl navozena i úmyslně jako prevence edému mozku (pokles p a CO 2 způsobí cerebrální vazokonstrikci se snížením průtoku krve mozkovými cévami). Podráždění dechového centra vyvolá i lokální acidóza, např. při anémii nebo srdečním selhání. Laboratorně se RAl projeví poklesem p a CO 2 a vzestupem ph. Kompenzace probíhá renální cestou: v tubulech ledvin poklesne výměna Na + za H +, ztrácejí se hydrogenuhličitany, koncentrace H + a Cl - v krvi stoupá (Cl - nahrazují chybějící hydrogenuhličitany ve sloupci aniontů). 200

201 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Klinický obraz RAl je charakterizován paresteziemi, pocením, závratěmi, slabostí, únavou a poruchami vědomí (při p a CO 2 2,7-3,4 kpa je významně omezena cerebrální perfuze i funkce). Může dojít k poklesu ionizovaného podílu vápníku v plazmě se sklonem k tetanii. Při léčbě RAl se opět zaměříme na příčinu poruch. U RAl psychogenního původu je na místě zklidnění pacienta (sedativa) a prodloužení mrtvého prostoru plic např. trubicí nebo vakem tak, aby nemocný znovu vdechoval část již jednou vydýchaného oxidu uhličitého. Při řízeném dýchání se snažíme postupně zvýšit p a CO 2 až na optimální hodnotu kolem 4,7 kpa. Respirační alkalóza může být prvním příznakem hypoxémie (při latentním srdečním selhání, sukcesivní embolizaci do plicnice, u pacientů s těžkým stupněm anémie apod.). KAPITOLA 14,15,16 Kompenzační (diagnostický) graf ABR Kompenzační graf ABR umožňuje orientační, rychlé zhodnocení stavu acidobazické rovnováhy s klasifikací (zařazením) poruchy podle hodnot p a CO 2 a BE. Zároveň ukazuje předpokládaný vývoj poruchy v rámci kompenzačních dějů. Jedná se pouze o prvotní orientaci. Pro stanovení přesné diagnózy potřebujeme znát anamnézu, klinické projevy onemocnění, jeho časový průběh, výsledky stanovení základních minerálů i jiných analytů v séru ev. v moči (laktát, ketolátky) a ostatních, nejen laboratorních vyšetření. Kompenzační graf ABR ukazuje obr. 2. Jak je z něho patrné, můžeme poznat nejen akutní a kompenzované poruchy ABR, ale i poruchy smíšené kromě jednoho případu - kombinace MAc a MAl. Pro tento případ se obvykle užívá výpočet tzv. anion gap (aniontové mezery, AG); počítá se podle následujícího vzorce: AG = (Na + + K + ) (Cl - + HCO 3- ). Jeho hodnota se obvykle pohybuje v rozmezí mmol/l, průměr je 15 mmol/l. Zvýšená bývá u MAc způsobené hromaděním jiných aniontů než jsou chloridy, nízká bývá u MAl ze ztrát chloridů. Pro posouzení kombinace MAc a MAl lze využít i postup podle Stewarta a Fencla. Ten vychází ze skutečnosti, že sloupce kationtů a aniontů v plazmě musí být stejně vysoké. Tito autoři rozlišují silné ionty (sem patří kationty Na +, K +, Ca 2+ a Mg 2+ ), z aniontů pak Cl -. Jejich rozdíl je označován SID (strong ion difference) = (Na + + K + + Ca 2+ + Mg 2+ ) Cl -. Na něm se podílí slabé anionty albumin a anorganický fosfát, dále tzv. neměřené anionty, kam patří např. laktát, β-hydroxybutyrát, anionty vznikající oxidací alkoholů při intoxikacích apod. a konečně hydrogenuhličitan, který hraje zvláštní roli: může v organismu vznikat z CO 2 nebo být naopak rozkládán a nahrazován anionty silnějších kyselin, je proto považován za tzv. závislou proměnnou. Právě posouzením podílu jednotlivých těchto iontů lze odhadnout podíl jednotlivých metabolických poruch na změnách acidobazické rovnováhy. 201

202 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy KAPITOLA 14,15,16 Obrázek 14.2 Kompenzační (diagnostický) graf ABR; zeleně s vlnkami je rozmezí fyziologických hodnot, u zkratek poruch: a = akutní, u = ustálená (maximálně kompenzovaná) Měření acidobazické rovnováhy (a krevních plynů) Odběr krve Pro stanovení parciálního tlaku krevních plynů je nejvhodnější arteriální krev, odebraná obvykle z a. brachialis event. a. radialis. K odběru se užívá stříkačka s pístem (obr. 3) či speciální kapilární odběrový systém, do něhož arteriální krev natéká sama vlastním tlakem až do úplného naplnění. 202

203 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy KAPITOLA 14,15,16 Obrázek 14.3 Odběr arteriální krve na stanovení krevních plynů Při opakovaných odběrech a pro vyšetření acidobazické rovnováhy se obvykle užívá tzv. arterializovaná krev, získaná z hyperemizovaného ušního lalůčku, tj. po jeho důkladném prohřátí (teplou vodou, pomocí hyperemizující masti apod.). Docílí se tím zrychlení průtoku krve kapilárami a její složení se blíží složení krve arteriální. V tomto případě se krev odebírá do skleněné kapiláry, která se po naplnění uzavírá víčky z plastické hmoty. Nevhodná je krev odebraná z prstu v důsledku nedostatečného prokrvení periferních částí těla, kde může být po 2 o 2 3 kpa nižší než v krvi arteriální. Při centralizaci krevního oběhu a při inhalační léčbě kyslíkem se nehodí ani krev odebraná z ušního lalůčku. Všechny odběrové stříkačky či kapiláry obsahují heparin jako protisrážlivé činidlo; je tedy třeba krev po odběru důkladně promíchat. Protože řada analyzátorů kromě ph a parciálního tlaku krevních plynů měří i koncentraci dalších analytů (minerály, laktát, glukóza, močovina, kreatinin aj.), je vhodné užít odběrové stříkačky obsahující lithnou sůl heparinu, který je navíc nasycen vápníkem, aby nevázal vápník a hořčík z krve. Do skleněných odběrových kapilár se před uzavřením vkládá kovové míchadlo (drátek), míchání probíhá magnetem přiloženým na kapiláru zvenčí. Při odběru vždy dáváme pozor, aby proběhl anaerobně. Krev nesmí stékat po prstu, do stříkačky či kapiláry se nesmí dostat vzduchová bublina. Její přítomnost by vyšetření kyslíku zcela znehodnotila; je známo, že vzduchová bublina může zvýšit hodnotu po 2 až o několik kpa! Nezbytný požadavek je i vzduchotěsné uzavření stříkačky s krví. Po odběru musí být stříkačka či kapilára uloženy ve vodorovné poloze a co nejrychleji provedena analýza. Vzorky se transportují na tajícím ledu, čímž zamezíme snížení hodnoty po 2, ke které by došlo vlivem metabolických pochodů v odebrané krvi (kyslík spotřebovávají leukocyty a trombocyty, nikoliv erytrocyty). I při tomto ošetření krve by stanovení mělo proběhnout do 2 hodin po odběru. 203

204 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy Vlastní měření acidobazické rovnováhy a krevních plynů Měření na analyzátorech acidobazické rovnováhy a krevních plynů v komůrce vyhřívané na 37 C; měří se ph a p a CO 2 a vždy i p a O 2 ; Kromě měření ph a parciálního tlaku krevních plynů nabízejí tyto analyzátory i všechny odvozené výpočty (např. HCO 3-, BE), charakterizující acidobazickou rovnováhu a metabolismus kyslíku. Přístroje měří také koncentraci hemoglobinu a mnohé i jeho saturaci kyslíkem přímou metodou (obr. 4) a podíl ostatních derivátů hemoglobinu. Přístroje nabízí řada firem, mj. Radiometer, ROCHE, Instrumentation Laboratory, Nova Biomedical, Siemens aj. Speciální přístroje pro měření krevních plynů, acidobazické rovnováhy i jiných akutních parametrů jsou sestrojeny tak, aby mohly být užívány přímo u lůžka nemocného na jednotkách intenzivní péče či resuscitační stanici a na operačních sálech. Malý rozměr zajišťuje přenosnost a jednoduchá obsluha umožňuje, že stanovení provádí zacvičený personál klinického pracoviště. Příkladem jsou analyzátory firmy Instrumentation Laboratory, Roche, Radiometer či Abbott. KAPITOLA 14,15,16 Obrázek 14.5 Měření na analyzátoru krevních plynů, acidobazické rovnováhy a některých dalších analytů Doporučená literatura 1. Jabor, A., Kazda, A., Hendl, J.: Vhodné veličiny při hodnocení kombinovaných acidobazických poruch: reziduální anionty, nárazníkové báze séra, proteiny a delta báze. Čas. Lék. čes. 129, 1990: Jabor, A.: Voda, ionty a modelování poruch vnitřního prostředí. STAPRO, Pardubice, Kazda, A.: Biochemické monitorování nemocných v intenzivní péči. Avicenum, Praha, Kazda, A., Hendl, J., Nejedlý, B., Vacek, V.: Význam výpočtu residuálních aniontů pro rozpoznání jednoduchých a smíšených 204

205 Metabolické a respirační poruchy acidobazické rovnováhy poruch acidobazické rovnováhy. Čas. Lék. čes. 116, 1997: Kolektiv autorů: Vybrané kapitoly z problematiky biochemického sledování v intenzivní péči. STAPRO, Pardubice, Moran, R. F.: The blood gases: physiologic and interpretative concepts, analysis and quality control. Klin. Biochem. Metab. 2, 1994: Nejedlý, B.: Vnitřní prostředí, klinická biochemie a praxe. Avicenum, Praha, Rose, B. R.: Clinical physiology of acid-base and electrolyte disorders. McGraw-Hill, New York, Jabor, A. a kol.: Vnitřní prostředí. Grada, Praha, 2008 KAPITOLA 14,15,16 205

206 Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy Kombinovanéporuchyacidobazickérovnováhy Autor: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D., prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, Ph.D., MUDr. Helena Brodská, Ph.D. KAPITOLA 17 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Souhrn: Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy jsou způsobené kombinací více jednoduchých poruch. Příklady častých kombinací: zvracení (ztráta chloridů metabolická alkalóza) + hladovění (hromadění ketolátek metabolická acidóza) diabetická ketoacidóza + dehydratace (špatné prokrvení tkání tvorba laktátu metabolická acidóza) otrava salicyláty (organická kyselina metabolická acidóza + dráždění dechového centra salicylátem respirační alkalóza) respirační insuficience s hyperkapnií (respirační acidóza; např. při CHOPN) je spojená i s hypoxií a laktátovou acidózou) Při léčbě kombinovaných poruch se snažíme odstranit příčinu (pokud je jich více, tak všechny najednou), cílovým laboratorním parametrem je ph (nikoliv BE). Jestliže jsou současně přítomny dvě nebo dokonce více jednoduchých poruch, hovoříme o tzv. kombinovaných (smíšených) poruchách ABR. Poruchy se vyvíjejí buď nezávisle na sobě, nebo jedna porucha podmiňuje rozvoj další; ta však nikdy nevzniká za účelem kompenzace poruchy prvé. Může jít o poruchy působící proti sobě (kombinace acidózy a alkalózy), takže výsledné ph není příliš odchýleno a může se dokonce stát, že ph krve i ostatní parametry ABR jsou ve fyziologickém rozmezí. Jindy obě poruchy posouvají ph stejným směrem a navzájem se tedy potencují. V dalších odstavcích uvedeme několik příkladů kombinovaných poruch. Kombinace poruch působících proti sobě Kombinace MAc a MAl Pacient zvrací a vyvíjí se proto u něho hypochloremická MAl. Protože současně nepřijímá potravu, rozvine se postupně druhá porucha - metabolická ketoacidóza z hladovění. Obě poruchy se mohou vyrovnat, takže vyšetření ABR nevykážou patologickou odchylku. V tomto případě je nesmírně důležité vyšetřit koncentraci základních iontů v séru (Obrázek 17.1). Prvý sloupec představuje anionty v séru zdravého člověka. Druhý sloupec ukazuje změny způsobené pouze ztrátou chloridů při zvracení. Ve třetím sloupci hromadící se ketolátky (jsou zahrnuté mezi neměřené anionty) způsobí pokles koncentrace HCO 3 - až na normální hodnotu. O nutnosti vzít v úvahu anamnestické údaje a klinický obraz onemocnění není třeba diskutovat. Jiným příkladem kombinace MAc a MAl je pacient v urémii (má renální MAc), který opakovaně zvrací (vyvíjí se hypochloremická MAl). 206

207 Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy KAPITOLA 17 Obrázek 17.1 Vývoj kombinované poruchy ABR při zvracení a současném hladovění podle aniontů v séru; čísla uvádějí koncentraci iontů v mmol/l. Při zvracení jsou ztracené chloridy nahrazeny hydrogenuhličitanem (a ke změně anion gapu nedochází). Vzestup ketolátek (organických kyselin) při hladovění vede ke zvýšení neměřených aniontů (a anion gapu) - příslušné výpočty viz přípravy. Kombinace MAc a RAl Při otravě salicyláty vyvolává přítomnost poměrně silné kyseliny salicylové v krvi nejprve MAc. Po přestupu této kyseliny přes hemato-encefalickou bariéru se přidává RAl, způsobená drážděním dechového centra. Kombinace poruch působících stejným směrem Kombinace dvou různých MAc Příkladem je dekompenzovaný diabetik v ketoacidóze s hyperglykémií; ta způsobí osmotickou diurézu s polyurií a dehydratací. Hypovolémie vede ke tkáňové hypoxii a vyvíjí se druhá MAc, tentokráte laktátová. Kombinace RAc a MAc Typickým příkladem je situace při zástavě srdce a dýchání. V organismu se hromadí oxid uhličitý (RAc) a tkáně nedostávající kyslík produkují velké množství laktátu (MAc). Následkem je prudký pokles ph vnitřního prostředí. 207

208 Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy Další příklady kombinace RAc a MAc, které se vyvíjejí z kompenzované jednoduché poruchy, ukazuje graf na Obrázku Pacient A je diabetik s metabolickou ketoacidózou, která se akutně rozvíjí (poloha A1). Protože porucha trvá delší dobu, dochází ke kompenzaci hyperventilací, nejprve částečné (A2), později úplné (A3). Poté byl stav komplikován únavou dechového svalstva, která nejenže znemožnila plicní kompenzaci, ale vedla dokonce k rozvoji respirační acidózy (A4). Druhý pacient B trpí respirační acidózou, nejprve akutní (B1), později částečně (B2) a plně kompenzovanou (B3) činností ledvin. Rozsáhlá pneumonie vedla k dalšímu zhoršení výměny plynů v plicích s dalším růstem hyperkapnie a hypoxémií, která měla za následek hypoxickou laktátovou MAc (B4). KAPITOLA 17 Obrázek 17.2 Vývoj kombinované poruchy z prvotní jednoduché kompenzované poruchy (podrobnosti v textu). Kombinace většího počtu poruch Snad nejlepším příkladem celého spektra možných poruch je nemocný s těžkým onemocněním jater. Mohou u něj nastat následující poruchy acidobazické rovnováhy: laktátová MAc následkem poruchy odbourávání laktátu v játrech; metabolická Al při hypoalbuminémii (snížení sloupce aniontů je kompenzováno nárůstem koncentrace hydrogenuhličitanů); snížený onkotický tlak při hypoalbuminémii může vést ke snížení náplně krevního řečiště s nadprodukcí reninu a následně i aldosteronu, který podporuje rozvoj MAl; respirační Al je následkem dráždění respiračního centra hromadícími se toxickými látkami; je-li selhání jater komplikováno hepatorenálním syndromem, vyvine se renální MAc; další poruchy může vyvolat medikamentózní léčba diuretiky (např. hypochloremická metabolická alkalóza při podávání furosemidu) existuje i alkoholická ketoacidóza - ta se vyskytuje zejména u alkoholiků nebo i po nárazovém požití většího množství etanolu. Její příčinou je kombinace hladovění (zvýšené odbourávání mastných kyselin a vznik ketolátek), dehydratace při zvracení (snížené vylučování ketolátek ledvinami) a metabolických účinků etanolu (zejména zvýšení poměru NADH + H + /NAD a z toho plynoucí 208

209 Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy snížení glukoneogeneze a tvorba ketolátek s převahou β-hydroxybutyrátu - není detekován detekčními močovými proužky) Shrnutí diagnostiky smíšených poruch ABR Zjednodušený postup, který vás při diagnostice poruch ABR nejrychleji přivede k cíli, je následující: 1. Klinický pohled - pečlivá anamnéza a fyzikální vyšetření jsou mnohdy dostatečnými prostředky ke správné diagnóze. Např. údaj o zvracení, průjmu, polyurii, vystavení toxické noxe, alkoholismu, užívání diuretik, přidružených onemocněních nebo Kussmaulovo dýchání, acetonový zápach z dechu či známky srdečního selhávání nás mohou velmi rychle přívést ke správné diagnóze. 2. Kompenzační (diagnostický) graf - viz Obrázek 2 a 3, jeho výhodou je snadné určení vývoje poruchy v čase (kompenzace, korekce), rozlišení respirační a metabolické složky a odhad terapeutických dávek. Selhává při smíšených poruchách (zejména protisměrných), nelze podle něj odhalit příčinu poruchy a pásmo kompenzované MAl je příliš široké (vlivem limitace hypoventilační kompenzace hypoxií) 3. Pomocné výpočty - založené na modelu elekrtoneutrality. Užitečné jsou zejména korigované chloridy a anion gap (ev. přesnější neměřené anionty). Korigované chloridy pomohou odhalit případný vliv změny chloridů na acidobazickou rovnováhu, anion gap pomáhá při zvýšené produkci kyselin (zejména u otrav - metanol, etylénglykol, etanol, salicyláty; méně u laktátové acidózy a ketoacidózy - tam bývá klinický obraz poměrně charakteristický) KAPITOLA 17 Poznámky k léčbě poruch ABR Při léčbě poruch ABR se vždy vychází z anamnézy a klinického obrazu onemocnění. Snažíme se odstranit nebo zmírnit základní příčinu nemoci (zvracení u hypochloremické MAl, poruchy oxygenace tkání u laktátové MAc, léčíme bronchopneumonii u RAc, dekompenzaci diabetika u diabetické ketoacidózy atd.). Pokud při terapii metabolických poruch ABR podáváme acidifikující nebo alkalizující roztoky, snažíme se dosáhnout tzv. cílového ph; to je u acidóz 7,2, u alkalóz 7,4. Úprava BE na nulovou hodnotu není vhodná a nevede k normalizaci ph, která by měla být konečným cílem léčby. Při infuzní korekci metabolických poruch ABR musíme postupovat opatrně, zvláště u kompenzovaných acidóz nebo u poruch smíšených s podílem acidózy i alkalózy. Většina poruch se upravuje spontánně, pokud se podaří odstranit vyvolávající příčinu. V každém případě však u kompenzovaných poruch musíme počítat s přetrváváním kompenzačních mechanismů po odstranění příčiny poruchy. Totéž platí samozřejmě i pro kompenzované respirační poruchy, kde renální kompenzace přetrvává několik dnů. U smíšených poruch pak musíme dodržovat zásadu léčit obě poruchy současně, aby druhá nepřevládla. Několik příkladů nevhodného postupu ukazuje Obrázek

210 Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy KAPITOLA 17 Obrázek 17.3 Příklady nevhodné léčby kompenzovaných a kombinovaných poruch ABR, vedoucí k nebezpečné alkalémii. Tak pacient A je diabetik v ketoacidóze (A 1 ), která se postupně kompenzuje hyperventilací (A 2, A 3 ). Jestliže podáním inzulinu rychle odstraníme prvotní poruchu, tj. MAc, přetrvávající hyperventilace uvrhne nemocného do těžké alkalémie, i když s hodnotou BE = 0 (A 4 ). Pacient B má chronickou respirační acidózu, plně kompenzovanou funkcí ledvin (B 1 ). Jestliže se u něho řízeným dýcháním docílí normokapnie, způsobí přetrvávající renální kompenzace respirační poruchy opět alkalémi (B 2 ). Poloha C 1 představuje pacienta s hypochloremickou MAl (zvracení) kombinovanou s metabolickou ketoacidózou (hladovění). Kdybychom odstranili jen MAc, např. infuzí glukózy, vedlo by to opět k posunu do oblasti alkalémie (C 2 ). U kombinovaných poruch je tedy třeba obě poruchy léčit současně, tj. kromě glukózy dodávat i chybějící chloridy - např. formou infuze izotonického roztoku NaCl. Ve všech výše uvedených případech ohrožovala nemocné alkalémie se všemi jejími negativními následky, ke kterým patří: hypokalémie; snížení koncentrace ionizovaného kalcia a magnezia se sklonem k tetanii; posun disociační křivky oxyhemoglobinu doleva se sníženým uvolňováním kyslíku z vazby na hemoglobin; zvýšení toxicity některých léků, např. digoxinu. 210

211 Význam stanovení kyslíku - příprava Význam stanovení kyslíku - příprava Autor: doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, DrSc.; MUDr. Helena Brodská, Ph.D. KAPITOLA 18 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Metabolismus kyslíku Role kyslíku v organismu Role kyslíku v energetickém metabolismu je zásadní pro veškerý život. Elektronové páry vzniklé oxidací NADH a FADH2 jsou v mitochodriích prostřednictvím dýchacích řetězců přeneseny na kyslík, čímž se uvolní energie pro syntézu ATP fosforylací ADP. Vzniklé makroergní fosfátové vazby představují přímý zdroj energie pro buněčné, tkáňové a orgánové funkce organismu. Aerobní získávání energie je velmi efektivní, ale vyžaduje nepřetržitou dodávku kyslíku do buněk v množství, které odpovídá aktuální potřebě. 1 mol glukózy poskytne za aerobních podmínek 38 mol ATP. Při nouzovém anaerobním metabolismu jsou to pouze 2 mol ATP. 211

212 Význam stanovení kyslíku - příprava KAPITOLA 18 Transport kyslíku významný způsobem usnadňuje jeho tlakový gradient mezi atmosférou a intracelulárním prostorem; (atmosféra mitochondrie). Na jeho cestě do buněk jsou určitá místa, která mohou nepříznivě ovlivnit jeho transport s konečným dopadem na vznik tkáňové hypoxie. 212

213 Význam stanovení kyslíku - příprava Parciální tlak kyslíku v průběhu kyslíkového tlakového gradientu kpa atmosferický vzduch 19,9 alveolární vzduch 14,6 arteriální krev 13,3 venózní krev 5,3 Cytoplazma buněk 2,7 Mitochondrie 0,3 KAPITOLA 18 Sledované parametry související s kyslíkovým metabolismem (orientační hodnoty) Parciální tlak kyslíku v arteriální krvi [10,0-13,3 kpa] Parciální tlak ve smíšené/centrální žilní krvi [4,5-5,5 kpa] Hemoglobin [ g/l; 8,0-10,0 mmol/l] Karbonylhemoglobin [ <0,03] * Methemoglobin [<0,02] * Saturace hemoglobinu kyslíkem [0,95-0,98] * P50 [3,3-3,9 kpa] FiO 2 [ 0,21 atmosféra; 0,4 obvykle při plicní ventilaci; 1,0 čistý kyslík] * Plicní zkraty [0,02-0,05] * Laktát-plazma venózní [0,5-2,2 mmol/l] pozn. * [hodnoty jsou uvedeny jako relativní podíl] Podmínky pro adekvátní dodávku kyslíku tkáním a možné příčiny hypoxie dostatečné množství a parciální tlak kyslíku ve vdechovaném vzduchu adekvátní ventilace-výměna alveolárního vzduchu optimální poměr ventilace / perfuze na úrovni plicního parechnymu efektivní difuze kyslíku z alveolárního vzduchu přes alveolo-kapilární membránu do krve (hypoxická hypoxie) dostatečné množství funkčního (efektivního) hemoglobinu v krvi optimální afinita a vazba kyslíku na hemoglobin (anemická/transportní hypoxie) adekvátní minutový srdeční výdej (cirkulační/ischemická hypoxie) účinné uvolnění kyslíku do tkání a buněk (histotoxická hypoxie) Buněčná hypoxie jakékoliv etiologie vede k celé řadě metabolických změn, které nakonec, pokud není obnovena dodávka kyslíku, vedou ke smrti buňky a celého organismu.

214 Význam stanovení kyslíku - příprava 5BqGa81Lb1f8MZAJhvdTil3TZooa701OhpKmAmkwTpvbp9qVNiiC1DLqHLwBMSm5mfX2Dy-Yb3iCIEWw KAPITOLA 18 regulace dýchání dechové centrum Dechové centrum v prodloužené míše reaguje na signály z periferních chemoreceptorů v glomus caroticum. Snížená hodnota po2, ph a zvýšená hodnota pco2 vede ke stimulaci dechového centra a k prohloubení a zrychlení dýchání. složení atmosferického vzduchu Množství dostupného kyslíku v atmosféře závisí na barometrickém tlaku. Parciální tlak jednotlivých plynů v atmosféře se vypočítá z barometrického tlaku podle jejich objemového zastoupení (kyslík 20,93%, dusík 78,1%, CO2 0,03%, inertní plyny cca 1%). Procentuální zastoupení všech plynů v atmosféře je stejné ve všech nadmořských výškách. Do kalkulace parciálních tlaků musí být započítána tenze vodních par [6,25 kpa] dýchací cesty.mechanika dýchání..respirační objemové parametry.mrtvý objem Hypoventilace může být způsobena snížením dechového objemu (exhausce, poranění hrudníku, pleuritida) nebo snížením dechové frekvence (útlum dechového centra). Při mělkém dýchání (nízkém dechovém objemu) vzrůstá význam tzv. mrtvého objemu., tj. objem vzduch, který zůstává v plicích a dýchacích cestách po maximálním výdechu. poměr ventilace/perfuze.0,8 plicní zkraty.prokrvení a ventilace v různých částech plic V plicním parenchymu se i za fyziologických situací vyskytují perfundované, ale neventilované oblasti plic. Jejich podíl se může výrazně zvýšit za patologických situací. Zvyšuje se tak hodnota tzv.plicních zkratů, tj. podíl neoxygenované krve po průchodu plicemi (norm. do 5 %). difuze kyslíku a oxidu uhličitého v plicních alveolech Poruchu difuze kyslíku v plicích může způsobit: 214

215 Význam stanovení kyslíku - příprava porucha/destrukce alveolů (emfysém, intersticiální plicní fibróza); plicní edém (tekutina nahromaděná v alveolech); nedostatečné prokrvení plic (snížená perfuze, embolizace, plicní hypertenze, srdeční selhání). transport kyslíku.hemoglobin.struktura fyzikálně-chemické vlastnosti dyshemoglobiny..anémie.hemoglobinopatie K zabezpečení dostatečné dodávky kyslíku do tkáni podle jejich aktuální potřeby je nezbytná normální hodnota tzv. efektivního hemoglobinu v plnohodnotných erytrocytech krve. Kyslíkovou kapacitu krve snižuje patologická přítomnost tzv. dyshemoglobinů (karbonylhemoglobin, methemoglobin, sulfhemoglobin) afinita a vazba kyslíku na hemoglobin Afinitu hemoglobinu ke kyslíku graficky vyjadřuje saturační / disociační křivka.typický esovitý průběh saturační / disociační křivky v sobě skrývá významné výhody pro transport kyslíku v organismu. Pravá koncová část křivky s vysokými hodnotami parciálního tlaku kyslíku i saturace odráží situaci v plicích. Z průběhu křivky vyplývá, že i relativně velký pokles hodnoty parciálního tlaku kyslíku působí jen nevýznamný pokles saturace hemoglobinu kyslíkem. Naopak v levé části stejný pokles působí významný pokles saturace hemoglobinu a tím i velké množství uvolněného kyslíku, který je k dispozici pro difuzi do tkání a buněk. Afinita hemoglobinu ke kyslíku není neměnná. Mění se (zvyšuje a snižuje se ) vlivem působení změn některých fyzikálně chemických parametrů. (teplota, ph, pco 2, 2,3-bisfosfoglycerát). Tato skutečnost se označuje jako Bohrův jev. Afinitu hemoglobinu ke kyslíku zvyšuje: alkalické ph, snížená teplota, snížený pco 2, snížená hodnota 2,3-bisfosfoglycerátu Afinitu hemoglobinu ke kyslíku snižuje: kyselé ph, zvýšená teplota, zvýšený pco 2, hodnota p50 P50 udává hodnotu parciálního tlaku kyslíku, při které je hemoglobin, v aktuální situaci pacienta, z 50 % saturován kyslíkem. Grafickým vyjádřením zvýšené afinity hemoglobinu ke kyslíku je posun saturační/disociační křivky doleva (snížené p50); snížení afinity je provázeno posunem křivka doprava (zvýšené p50). Střední polohu saturační/disociační křivky případně rozsah jejího posunu doleva a doprava vyjadřuje hodnota parametru p50. minutový srdeční výdej Minutový srdeční výdej představuje objem krve vypuzený činností srdce do krevního oběhu (tepový objem x tepová frekvence) za minutu. Reaguje na aktuální potřebu dodávky kyslíku do tkání. Jeho snížení způsobené srdeční slabostí (nedostatečností) nebo poruchou srdečního rytmu vede k nedostatečné dodávce kyslíku do tkání a k hypoxii. Naopak při aktuální nedostatečné dodávce kyslíku tkáním zvýšený srdeční výdej, pokud to výkonnost srdečního svalu dovoluje, přísun kyslíku do tkání zvýší. KAPITOLA

216 Význam stanovení kyslíku Význam stanovení kyslíku Autor: doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, DrSc.; MUDr. Helena Brodská, Ph.D. KAPITOLA 18 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Metabolismus kyslíku Role kyslíku v organismu Role kyslíku v energetickém metabolismu je zásadní pro veškerý život. Elektronové páry vzniklé oxidací NADH a FADH 2 jsou v mitochodriích prostřednictvím dýchacích řetězců přeneseny na kyslík, čímž se uvolní energie pro syntézu ATP fosforylací ADP. Vzniklé makroergní fosfátové vazby představují přímý zdroj energie pro buněčné, tkáňové a orgánové funkce organismu. Vzhledem k omezené zásobě tohoto zdroje energie je lidský organismus odkázán na kontinuální přívod kyslíku z atmosféry a jeho efektivní dodávku do buněčných mitochondrií. Transport kyslíku významný způsobem usnadňuje jeho tlakový gradient mezi atmosférou a intracelulárním prostorem. Na jeho cestě do buněk jsou určitá místa, která mohou nepříznivě ovlivnit jeho transport s konečným dopadem na vznik tkáňové hypoxie. Parciální tlak kyslíku v průběhu kyslíkového tlakového gradientu kpa atmosferický vzduch 19,9 alveolární vzduch 14,6 arteriální krev 13,3 venózní krev 5,7 cytoplazma buněk 2,7 mitochondrie 0,3 Sledovanéparametrysouvisejícískyslíkovýmmetabolismem (orientační hodnoty) Parciální tlak kyslíku v arteriální krvi [10,0-13,3 kpa] Parciální tlak ve smíšené/centrální žilní krvi [4,5-5,5 kpa] 216

217 Význam stanovení kyslíku Hemoglobin [ g/l; 8,0-10,0 mmol/l] Karbonylhemoglobin [ < 0,03] * Methemoglobin [< 0,02] * Saturace hemoglobinu kyslíkem [0,95-0,98] * P50 [3,3-3,9 kpa] FiO 2 [0,21 atmosféra; 0,4 obvykle při plicní ventilaci; 1,0 čistý kyslík] * KAPITOLA 18 Plicní zkraty [0,02-0,05] * Laktát-plazma venózní [0,5-2,2 mmol/l] pozn. * [hodnoty jsou uvedeny jako relativní podíl] Podmínkyproadekvátnídodávkukyslíkutkánímamožnépříčiny hypoxie dostatečné množství a parciální tlak kyslíku ve vdechovaném vzduchu adekvátní ventilace-výměna alveolárního vzduchu optimální poměr ventilace / perfuze na úrovni plicního parechnymu efektivní difuze kyslíku z alveolárního vzduchu přes alveolo-kapilární membránu do krve (hypoxická hypoxie) dostatečné množství funkčního (efektivního) hemoglobinu v krvi optimální afinita a vazba kyslíku na hemoglobin (anemická/transportní hypoxie) adekvátní minutový srdeční výdej (cirkulační/ischemická hypoxie) účinné uvolnění kyslíku do tkání a buněk (histotoxická hypoxie) a) dostatečné množství a parciální tlak kyslíku ve vdechovaném vzduchu Množství dostupného kyslíku v atmosféře závisí na barometrickém tlaku. Při hladině moře je barometrický tlak roven 760 mmhg 760 Torr 101 kpa (1 mmhg = 0,133 kpa). Podle Daltonova zákona platí, že barometrický tlak je součtem parciálních tlaků plynů obsažených v atmosféře. (P (atmosfer.) = po 2 + pco 2 + pn 2 + ph 2 O + p ostatní plyny v atm. ) Parciální tlak jednotlivých plynů v atmosféře se vypočítá z barometrického tlaku podle jejich objemového zastoupení Kyslík 20,93% Dusík 78,1% CO 2 0,03% Inertní plyny cca 1% Procentuální zastoupení všech plynů v atmosféře je stejné ve všech nadmořských výškách. Do kalkulace parciálních tlaků musí být započítána tenze vodních par [6,25 kpa]. 217

218 Význam stanovení kyslíku Ke snížení po 2 v atmosferickém vzduchu dochází ve vysokých nadmořských výškách; vysokohorské túry, výškové lety, případně spotřebováním kyslíku např. hořením v uzavřených prostorách, vytěsněním kyslíku z atmosféry jiným plynem, např. CO 2 v tzv. psích jeskyních, kdy nahromaděný těžší CO 2 vytvoří při zemi bezkyslíkovou zónu. b) adekvátní ventilace-výměna alveolárního vzduchu Hypoventilace může být způsobena snížením dechového objemu (mělké dýchání) nebo snížením dechové frekvence (hypopnoe). Vzhledem k tomu, že ventilace plic je zajišťována nasáváním atmosferického vzduchu objemovými změnami hrudníku (činností dýchacích svalů včetně bránice) vedou bolesti při dýchacích pohybech (poranění hrudníku, pleuritida) ke snížení dechového objemu. Útlum dechového centra může vést k extrémnímu snížení dechové frekvence až na několik málo dechů za minutu (např. otrava morfinem). Rovněž exhausce kriticky nemocných pacientů s projevy svalové slabosti může být příčinou výrazné hypoventilace a indikací k umělé plicní ventilaci. Při mělkém dýchání (nízkém dechovém objemu) vzrůstá význam tzv. mrtvého objemu, tj. objem vzduch, který zůstává v plicích a dýchacích cestách po maximálním výdechu. Má nižší hodnotu po 2 a vyšší pco 2 a naředí tak vdechovaný atmosferický vzduch tím více, čím je jeho relativní podíl vzhledem k dechovému objemu větší. Alveolární vzduch má po 2 cca 14,6 kpa proti atmosferickému po 2 19,9 kpa. KAPITOLA 18 c) optimální poměr ventilace / perfuze na úrovni plicního parechnymu V plicním parenchymu se i za fyziologických situací vyskytují perfundované, ale neventilované oblasti plic. Jejich podíl se může výrazně zvýšit za patologických situací. Příčinou mohou být stavy vedoucí k atelektáze. Krev protékající těmito oblastmi si zachovává venózní charakter a snižuje saturaci hemoglobinu kyslíkem v arteriálizované krvi. Zvyšuje se tak hodnota tzv.plicních zkratů, tj. podíl neoxygenované krve po průchodu plicemi (norm. do 0,05; 5 %). Svým charakterem odpovídají plicní zkraty hemodynamickému pravolevému srdečnímu zkratu. V závislosti na rozsahu poruchy dosahuje hodnota plicních zkratů desítek % s nejvyššími hodnotami při šokové plíci v rámci ARDS až 80 %; 0,8. d) difuze kyslíku z alveolárního vzduchu přes alveolo-kapilární membránu do krve Kyslík difunduje 20x obtížněji/pomaleji než CO 2, proto je citlivější na stavy ztěžující difuzi plynů v plicích. Strukturální nebo patofyziologické poruchy difuze (alveolo/kapilární) do značného stupně poruchy alterují především transport kyslíku s minimálním vlivem na difuzi/vylučování CO 2. Poruchu difuze kyslíku v plicích může způsobit: porucha/destrukce alveolů Normální velikost povrchu alveolů je přibližně veliká jako tenisový kurt. Tato plocha může kriticky poklesnout např. při emfysému. Difuzi výrazně ztěžují fibrotické procesy např. intersticiální plicní fibróza plicní edém Kyslík difunduje z alveolů do plicních kapilár přes velmi tenký prostor. Tekutina nahromaděná v tomto prostoru při plicním edému, prodlužuje dráhu difuze a ztěžuje ji. nedostatečné prokrvení plic Snížená perfuze embolie/embolizace, plicní hypertenze, srdeční selhání e) dostatečné množství funkčního (efektivního) hemoglobinu v krvi K zabezpečení dostatečné dodávky kyslíku do tkání podle jejich aktuální potřeby je nezbytná normální hodnota tzv. efektivního hemoglobinu v plnohodnotných erytrocytech krve. Tento hemoglobin představuje tzv. kyslíkovou kapacitu krve. 1g hemoglobinu může vázat 1,39 ml (0,062 mmol) kyslíku (O 2 ). Snížená hodnota koncentrace efektivního hemoglobinu může působit tzv. anemickou hypoxii. Vedle adultního hemoglobinu A se vyskytují v krvi i varianty hemoglobinu, které nemohou reverzibilně vázat kyslík a jsou tak z 218

219 Význam stanovení kyslíku přenosu kyslíku v organismu vyloučeny. Nazývají se dyshemoglobiny a patří k nim karbonylhemoglobin (COHb - obyvatelé měst do 5 %, kuřáci až 10 %) s reverzibilní vazbou CO, která je však 200 x silnější než s kyslíkem, methemoglobin (MetHb - do 3 %), který není schopen vázat kyslík, protože Fe v jeho molekule je nevratně oxidováno na Fe 3+. Stejně je z transportu kyslíku vyloučen sulfhemoglobin a cyanhemoglobin. Patofyziologický význam nabývají tyto formy hemoglobinu pokud se jejich % v krvi významně zvýší a mohou tak zapřičinit hypoxii (otrava CO, účinek nitritů, iatrogenní působení léků např. sulfonů-organických sloučenin síry v dermatologii apod.) Zvláštní variantou je fetální hemoglobin, který svojí vyšší afinitou ke kyslíku plní dodávku kyslíku plodu ve specifických intrauterínních podmínkách je v prvních dnech po narození dítěte zaměněn za adultní hemoglobin A. Formy hemoglobinu s geneticky determinovanými změnami jejich primární struktury (zastoupení a pořadí aminokyselin), které rovněž alterují vazbu kyslíku se nazývají varianty hemoglobinu nebo hemoglobinopatie. KAPITOLA 18 f) optimální afinita a vazba kyslíku na hemoglobin Afinitu hemoglobinu ke kyslíku graficky vyjadřuje saturační / disociační křivka. Nezávisle proměnnou (osa x) je parciální tlak kyslíku, závisle proměnná (osa y) je hodnota saturace hemoglobinu kyslíkem. Vazba kyslíku na hemoglobin neprobíhá rovnoměrně zpočátku je obtížná a energeticky málo výhodná, protože je při ní nutno zrušit většinu elektrostatických vazeb mezi podjednotkami alfa a beta. Snazší navazování dalších molekul kyslíku je vyjádřeno tvarem (strmostí) disociační křivky hemoglobinu. Typický esovitý průběh saturační / disociační křivky v sobě skrývá významné výhody pro transport kyslíku v organismu. Pravá koncová část křivky s vysokými hodnotami parciálního tlaku kyslíku i saturace odráží situaci v plicích. Z průběhu křivky vyplývá, že i relativně velký pokles hodnoty parciálního tlaku kyslíku působí jen nevýznamný pokles saturace hemoglobinu kyslíkem (pokles po 2 o 3 kpa pokles saturace o 2 %) Naopak levá část křivky s nízkými hodnotami po 2 přísluší situaci ve tkáních. Stejný pokles po 2 působí významný pokles saturace hemoglobinu a tím i velké množství uvolněného kyslíku, který je k dispozici pro difuzi do tkání a buněk. Afinita hemoglobinu ke kyslíku není neměnná. Mění se (zvyšuje a snižuje se) vlivem působení změn některých fyzikálně chemických parametrů (teplota, ph, pco 2, 2,3-bisfosfoglycerát). Tato skutečnost se označuje jako Bohrův jev. Afinitu hemoglobinu ke kyslíku zvyšuje: alkalické ph snížená teplota snížený pco 2 snížená hodnota 2,3-bisfosfoglycerátu Afinitu hemoglobinu ke kyslíku snižuje: kyselé ph zvýšená teplota zvýšený pco 2 zvýšená hodnota 2,3-bisfosfoglycerátu Vzhledem k veliké funkční rezervě vazby kyslíku na hemoglobin v plicích (viz průběh saturační křivky hemoglobinu) je jednoznačný benefit tohoto jevu směřován do kyslíkového metabolismu ve tkáních ve smyslu jeho snadnějšího uvolňování. Obrázek 18.1 Vliv hodnoty ph krve na polohu disociační/saturační křivky hemoglobinu. 219

220 Význam stanovení kyslíku Grafickou polohu křivky matematicky charakterizuje hodnota p50 (3,0 << 3,6 >> 4,4 [kpa])účinek zvýšené hodnoty 2,3-bisfosfoglycerátu se projevuje rovněž jako kompenzační mechanismus u rozvíjející se anémie, kde působí jako kompenzátor možného hypoxického stavu. Vazbou na molekulu Hb snižuje jeho afinitu ke kyslíku. Pacienti s postupným/pomalým vznikem anémie mají zvýšenou koncentraci 2,3-BPG, což může částečně vysvětlit, proč pacienti i s extrémně nízkou hodnotou Hb mohou vykonávat běžnou aktivitu. 2,3-BPG se rovněž zvyšuje jako součást adaptace organismu na vysoké nadmořské výšky. Hodnota p50 P50 udává hodnotu parciálního tlaku kyslíku, při které je hemoglobin, v aktuální situaci pacienta, z 50 % saturován kyslíkem. Grafickým vyjádřením zvýšení afinity hemoglobinu ke kyslíku je posun saturační/disociační křivky doleva; snížení afinity je provázeno posunem křivka doprava. Střední polohu saturační/disociační křivky případně rozsah jejího posunu doleva a doprava vyjadřuje hodnota parametru p50. Referenční interval p50 pro ph 7,4 a T 37 C je 3,3-3,9 kpa. Proti standardní hodnotě se liší, pokud se liší ph od 7,40, pco 2 od 5,3 kpa, teplota od 37 C a koncentrace 2,3-BPG od 5,0 mmol/l. Pro novorozence je hodnota p50 2,4-3,2 kpa vzhledem k fetálnímu Hb. Zvýšená hodnota P50 ukazuje na posun disociační křivky Hb doprava tj. snížení afinity Hb ke kyslíku. Příčinou může být: hypertermie, acidémie, hyperkapnie, zvýšený 2,3-BPG nebo jejich kombinace. Snížená hodnota P50 ukazuje na posun disociační křivky doleva a zvýšenou afinitu kyslíku k Hb. Hlavní příčiny jsou: hypotermie, akutní alkalémie, hypokapnie, nízká koncentrace 2,3-BPG. Patofysiologickým následkem zvýšené afinity kyslíku k hemoglobinu je méně účinné uvolňování kyslíku z oxyhemoglobinu v periferních tkáních a tím nízký tkáňový po 2. KAPITOLA 18 g) adekvátní minutový srdeční výdej Minutový srdeční výdej představuje objem krve vypuzený činností srdce do krevního oběhu (tepový objem x tepová frekvence) za minutu. Reaguje na aktuální potřebu dodávky kyslíku do tkání. Jeho snížení způsobené srdeční slabostí (nedostatečností) nebo poruchou srdečního rytmu vede k nedostatečné dodávce kyslíku do tkání a k hypoxii. Naopak při aktuální nedostatečné dodávce kyslíku tkáním zvýšený srdeční výdej, pokud to výkonnost srdečního svalu dovoluje, přísun kyslíku do tkání zvýší. Adaptační reakce kardiovaskulárního systému na hypovolémii případně šokové stavy s centralizací oběhu dramaticky snižují přívod kyslíku do hypoperfundovaných tkání s následnými projevy jejich ischémie/hypoxie. V těžké sepsi, septickém šoku a u dalších kritických stavů, kde při objemových problémech klesá průtok krve splanchnickou oblastí a ledvinami, je průtok myokardem a mozkem udržován. h) uvolnění kyslíku do tkání a buněk Uvolnění kyslíku do tkání z vazby na hemoglobin je umožněno velkým tlakovým gradientem mezi po 2 krve a tkáňovými buňkami a snadnou disociací vazby kyslíku na hemoglobin při nízkém po 2 na rozhraní krev-povrch tkáňových buněk. PO 2 na venózním konci kapiláry je přibližně 5,0 kpa, takže normální arterio-venózní diference po 2 je mezi 5,0-8,3 kpa. Arterio-venózní diference A-v diference v obsahu kyslíku ukazuje aktuálně množství kyslíku dodané krví do tkání. Příklad a-v rozdílu různých parametrů kyslíkového metabolismu ukazuje tabulka

221 Význam stanovení kyslíku arteriální krev smížená žilní krev konc. hemoglobinu [mmol/l] 9,0 9,0 saturace hemoglobinu [0,00] 0,98 0,68 po 2 [kpa] 10,6 5,0 cto 2 [mmol/l] 9,0 6,7 a-v rozdíl O 2 [mmol/l] 2,3 a-v rozdíl O 2 [ml/l] 51 KAPITOLA 18 cto 2 celkový obsah kyslíku v krvi; 1 mol hemoglobinu váže 1 mol kyslíku. Uvedený a-v rozdíl 51 ml O 2 /l krve je nutný pro zabezpečení klidové spotřeby kyslíku cca 250 ml/min (70 kg hmotnost) a klidovém minutovém srdečním výdeji (5 l/min.). Hodnoty uvedené v tabulce jsou odvozeny od grafu saturační/disociační křivky na obrázku 18.2 Vedle opětovného potvrzení výhody esovitého průběhu saturační/ disociační křivky hemoglobinu je nutné připomenout zásadní význam dostatečného tlakového gradientu pro transport kyslíku. Při nízkém pao 2 v arterii musí být uvolnění 2,3 mmol/l (51 ml/l) kyslíku provázeno poklesem pvo 2 ve smíšené žilní krvi. Hodnoty pod 4,0 kpa mohou vést k hypoxii. Kritickou hodnotou je pvo 2 ve smíšené žilní krvi < 2,5 kpa, kdy již vzniká hypoxické poškození mozku. Na ose Y je namísto hodnot saturace so 2 uveden celkový obsah kyslíku cto 2. Vychází se z předpokladu, že 1 mol hemoglobinu váže 1 mol kyslíku. Při 100% saturaci Hb (150g/L = 9,1 mmol/l) je cto 2 = 9,1 mmol/l. S poklesem saturace úměrně klesá i cto 2. Respirační insuficience Chronická respirační insfucience, která je výsledkem chronického patologického procesu v plicích se dělí na parciální, postihující dodávku kyslíku (hypoxie) a globální spojenou i s retenci oxidu uhličitého (hyperkapnie a respirační acidóza). Akutní respirační insuficience - syndrom akutní dechové tísně - ARDS (adult respiratory distress syndrom) je závažný stav spojený s vysokou úmrtností. Často bývá spojen s šokovým stavem (šoková plíce) i jako součást multiorgánového selhání různé etiologie. Laktát Laktát je produktem anaerobní glykolýzy. Jeho zvýšená koncentrace v plazmě (> 2,2 mmol/l) může být způsobena zvýšenou produkcí nebo sníženým odbouráváním. V souvislosti s metabolismem kyslíku provází vzestup koncentrace laktátu, laktátová acidóza, tkáňovou hypoxii (typ A). Laktátová acidóza může vzniknout i jako důsledek poruchy odbourávání laktátu při renálním a jaterním selhání, nutričními a iatrogenními vlivy, jako např. komplikace léčby biguanidy, realimentace při deficitu thiaminu, intoxikacemi etanolem, salicyláty, metanolem včetně vrozených poruch glycidového metabolismu (typ B). 221

222 Význam stanovení kyslíku Vzestup jeho koncentrace u kriticky nemocných pacientů je alarmujícím příznakem často předcházející a provázející šokové stavy. Plně indikované je průběžné monitorování plazmatické hladiny laktátu a jejího trendu pro sledování úspěšnosti prováděných terapeutických zásahů. Trvale zvýšená nebo zvyšující se hodnota je spojena se zhoršující se prognózou a vysokou mortalitou. Obecně je u šokových, neseptických stavů s laktatémií 1,3 4,4 mmol/l uváděna mortalita %, při hyperlaktatémii 4,5 8,9 mmol/l je mortalita 73 % a pro hodnoty nad 13 mmol/l je již 100 %. U septických stavů jsou za prognosticky nepříznivé považovány už hodnoty 3,0 3,5 mmol/l. Zvýšení laktátu je tam signálem přechodu sepse z metabolicky kompenzovaného do dekompenzovaného stadia, kdy klesá spotřeba kyslíku tkáněmi i při jeho dostatečné nabídce. KAPITOLA 18 Perinatální asfyxie Asfyxie je jednou z nejčastějších příčin úmrtí nebo těžkého poškození plodu. Příčiny mohou být na straně matky (srdeční, plicní choroby, porušený průtok krve placentou, abnormální děložní kontrakce) dále ji může vyvolat komprese nebo uzel na pupečníku, předčasné odloučení placenty nebo patologie plodu (vrozené srdeční vady, poruchy srdečního rytmu, těžká anemie, sepse, pneumonie apod). Samostatnou jednotkou je respiratory distress syndrom (RDS) novorozenců. Vyskytuje se především u nedonošených dětí. Příčinou je nedostatek plicního surfaktantu v nezralých plicích. Ten zabraňuje kolapsu alveolů v expiriu a brání tak vzniku funkčních atelektáz. Stupeň porodní asfyxie se klinicky hodnotí pomocí Apgar score (mezinárodní systém hodnocení poporodní adaptace novorozence; posuzuje se barva kůže, srdeční akce, dechová frekvence, reakce na podráždění a svalový tonus; za každou funkci obdrží novorozenec 0-2 body; maximum je 10 bodů). Hodnota score 0-3 v 5., 10., 15. a 20. minutě po porodu se považuje za výrazně patologickou. K laboratornímu posouzení závažnosti hypoxie plodu se používá stanovení ph v pupečníkové krvi odebrané při porodu. Pro hypoxii svědčí hodnota ph<7,0. Vliv vysoké nadmořské výšky Složení atmosferického vzduchu je stejné u hladiny moře i na Mount Everestu, liší se pouze barometrický tlak a tím i parciální tlak kyslíku. Snížený po 2 působí hypoxii, která vyvolává řadu adaptačních reakcí. Při dlouhodobějším pobytu ve vyšší nadmořské výšce se jedná především o zvýšenou tvorbu erytropoetinu (EPO) v ledvinách s následnou stimulací tvorby hemoglobinu a erytrocytů s výsledným zvýšením kyslíkové kapacity krve. Zvyšuje se i 2,3-bisfosfoglycerát, který usnadňuje uvolňování kyslíku do tkání. Těchto adaptačních mechanismů se využívá při přípravě vysokohorských horolezců ale často i pro zvýšení kyslíkové výkonnosti u různých vrcholových sportovních disciplín. Potápění S opačnou problematikou se potýkají potápěči. S hloubkou ponoru pod hladinu se dramaticky zvyšuje tlak a tím i pao 2 vdechovaného vzduchu až do toxických hodnot. Při dýchání vzduchu o stejném složení jako je atmosferický vzduch tak hrozí hyperoxie. Pro potápění do větších hloubek se proto používá směs plynů, která obsahuje menší podíl kyslíku (tzv.trimix). Nadbytečný dusík a kyslík je v této směsi nahrazen netečným plynem (heliem). Měřené a počítané parametry kyslíkového metabolismu pao 2, saturace Hb, frakce hemoglobinu, laktát, (ph, paco 2, FiO 2, ) plicní zkraty, spotřeba kyslíku, a-v diference Pro vyšetření parametrů metabolismu kyslíku se nejlépe hodí nesrážlivá (heparinizovaná) arteriální krev nebo arterializovaná kapilární krev z hyperemizovaného ušního lalůčku dospělého nebo patičky novorozence. pao 2 v krvi se měří Clarkovou elektrodou na amperometrickém principu. Elektroda je standardní součástí analyzátorů acidobazických parametrů a krevních plynů spolu s ph elektrodou a Severinghanzovou elektrodou na stanovení pco 2. Vedle analyzátorů určených pro klinickobiochemické laboratoře existují přístroje s maximálně zjednodušenou obsluhou a údržbou pro klinická 222

223 Význam stanovení kyslíku pracoviště u lůžka nemocného POCT Point of care testing. Saturace hemoglobinu kyslíkem (SO 2 ) se v těchto přístrojích většinou odvozuje z hodnoty pao 2, ph a hemoglobinu empiricky z normálního průběhu a polohy disociační křivky Hb. Správný výsledek předpokládá normální afinitu kyslíku k Hb, norm. konc 2,3-BPG a nepřítomnost dyshemoglobinů. Nevýhody a omezení výše uvedené aproximativní metody odstraňuje přímé měření obsahu všech typů hemoglobinu v krvi na základě jejich různých absorpčních spekter (oxyhemoglobin, redukovaný hemoglobin, karbonylhemoglobin, methemoglobin, sulfhemoglobin, fetální hemoglobin, saturace a celkový obsah kyslíku cto 2 ). Po ultrazvukové hemolyze erytrocytů je hemolyzát spektrofotometricky proměřen a z hodnot jejich absorpčních maxim je vypočítáno zastoupení přítomných hemoglobinů. Obvyklým způsobem výpočtu saturace je výsledek poměru oxyhemoglobinu k celkovému hemoglobinu. Cooximetr je v současné době již většinou součástí acidobazických analyzátorů vyššího typu. K monitorování saturace hemoglobinu kyslíkem slouží pulzní oximetry. rozdílné absorpce červeného (resp. infračerveného) světla hemoglobinem a oxyhemoglobinem.metoda je založena na principu Čidlo, které vysílá záření o vlnové délce obvykle 660 nm (červené světlo) a 940 nm (infračervené světlo), se přiloží na akrální část těla, obvykle prst či ušní lalůček. Dojde k prosvícení této části těla a je měřeno prošlé světlo. Světlo je absorbováno tkání, žilní, kapilární i arteriální krví, přičemž pouze složka arteriální má pulzující charakter. Podle absorpce záření obou vlnových délek pulzující a nepulzující složkou lze odhadnout procentuální saturaci hemoglobinu v arteriální krvi kyslíkem, tedy SaO 2. Je samozřejmé, že při obsahu jiných derivátů hemoglobinu v krvi nemocného (COHb, MetHb) dává metoda falešně vysoké výsledky saturace. Rovněž při poruchách periferní cirkulace není tato metoda vhodná: naměřený výsledek odpovídá hodnotě ve špatně prokrvené periferii a nikoliv hodnotě v arteriální krvi. Metoda pulzní oxymetrie se užívá pro jednoduchost a rychlost při odhadu oxygenace krve pacienta v průběhu anestezie a na jednotkách intenzivní péče a resuscitačních stanicích, kde hrozí rychlý rozvoj respirační insuficience. Plicní zkraty se počítají většinou automaticky z naměřených hodnot krevních plynů v arteriální a smíšené/centrální žilní krvi, měřené saturace kyslíkem, hodnoty FiO 2, teploty a barometrického tlaku. Z arteriovenózní diference pao 2 a polohy disociační křivky hemoglobinu lze odvodit a-v rozdíl v obsahu kyslíku, tj. množství kyslíku, které je v dané situaci k dispozici tkáním. Informaci o aktuální spotřebě kyslíku lze získat pomocí přístrojů, které průběžně analyzují obsah kyslíku ve vdechovaném a vydechovaném vzduchu. Na stejném principu pracují moderní kalorimetry při zjišťování energetického výdeje/energetické potřeby tzv. nepřímou kalorimetrií; energetický ekvivalent 1,0 litru spotřebovaného kyslíku = 4,8 kcal (20,2 kj). Za bazálních podmínek je spotřeba kyslíku u dospělých cca 3,5 ml.kg -1.min -1. Výkonnost kardiopulmonálního systému vyjadřuje maximální spotřeba kyslíku, které je dosaženo při stupňující se dynamické zátěži. U netrénovaných mužů středního věku odpovídá cca desetinásobku bazální spotřeby kyslíku. KAPITOLA 18 Léčebné postupy při hypoxii Spontánní dýchání - oxygenoterapie vzduchem obohaceným kyslíkem Umělá plicní ventilace (ventilační režimy) Při konstatním tlaku-tlakově řízená ventilace Při konstantním objemu-objemově řízená ventilace PEEP-positive end-expiratory pressure Vysokofrekvenční ventilace ECMO-extracorporeal membrane oxygenation Hyperbarická oxygenoterapie (otrava CO, kesonová nemoc, clostridiové infekce, hrozící odhojení transplantovaných štěpů/kožních laloků) 223

224 Význam stanovení kyslíku Indikace k oxygenoterapii a řízenému dýchání Z biochemického hlediska jsou indikací k oxygenoterapii a řízenému dýchání hodnoty pao 2 < 9,3 kpa a paco 2 > 6,6 kpa u neventilovaného nemocného v akutním stavu; jedná se o hodnoty v arteriální krvi. Cílem oxygenoterapie je zvýšit saturaci hemoglobinu kyslíkem na hodnotu 0,85-0,90 s následnou normalizací hodnot krevních plynů. Volíme přitom nejnižší účinnou koncentraci kyslíku ve vdechované směsi (FiO 2 ), abychom zamezili jeho toxickým vlivům na plicní tkáň. Dlouhodobě jsou dobře snášeny koncentrace kyslíku do 60 %. Trvalé zvýšení FiO 2 nad 60 % vede k rozvoji zánětlivých změn a infiltraci alveolů s následnou fibrózou. Pokud je nutno podávat kyslík v koncentraci vyšší než %, volíme řízenou ventilaci. Čistý, 100% kyslík se podává během neodkladné resuscitace, inhalace 100% kyslíku je bezpečná nejméně 6 hodin. Toxické účinky se začínají projevovat po 48 hodinách. Zvýšenou pozornost je třeba věnovat oxygenoterapii chronických hyperkapnických stavů. Jediným stimulem dechového centra je zde totiž nízký pao 2. Pokud odstraníme i tento ventilační podnět, může dojít k dalšímu zvyšování paco 2 s depresí až zástavou ventilace. Rovněž řízená ventilace vedoucí k poklesu paco 2 musí být vedena pomalu - pokles by neměl být rychlejší než 0,3-0,7 kpa/h a vždy je třeba mít na paměti přetrvávání renální kompenzace poruchy a nebezpečí přechodu do alkalémie. Vývoj situace monitorujeme opakovanými analýzami krevních plynů - před začátkem, minut po zahájení řízené ventilace a po každé změně nastavení dýchacího přístroje. KAPITOLA 18 Preanalytika. Zásadním preanalytickým požadavkem je zajištění anaerobního způsobu odběru krve a rychlý transport k provedení analýzy. Anaerobním odběrem se rozumí co nejkratší kontakt odebírané krve s atmosferickým vzduchem (kapilární odběr) a absolutní vyloučení vzduchových bublin v kapiláře nebo v odběrové stříkačce. Nedodržení tohoto principu může vyšetření zcela znehodnotit a poskytnou falešné výsledky. Dokonalé promíchání odebrané krve s antikoagulačním prostředkem (heparin) je nutné pro zabránění vzniku krevních koagul (rotace odběrové stříkačky; promíchání obsahu kapiláry pomocí drátku a magnetu), které vyšetření znemožní a mohou vyřadit analyzátor z provozu ucpáním. Anaerobně odebraná krev do heparinizované stříkačky a kapiláry; drátek a magnet k promíchání nesrážlivé krve; mikrosítko k zachycení mikrokoagul při nasátí do přístroje. 224

225 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody - příprava Význam stanovení osmolality, metabolismus vody - příprava Autoři: prof. RNDr. Eva Táborská, CSc.; doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, DrSc.; MUDr. Helena Brodská, Ph.D. KAPITOLA 19 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Osmolalita a metabolismus vody Tělesná voda Množství celkové tělesné vody (CTV) je závislé na stavu hydratace, věku, pohlaví a množství tělesného tuku. Podíl CTV na tělesné hmotnosti je přibližně následující: novorozenci asi 75 % hmotnosti dospělí muži asi 60 % hmotnosti dospělé ženy asi 50 % hmotnosti u hubených je podíl CTV na tělesné hmotnosti vyšší než u obézních ve stáří je podíl CTV na tělesné hmotnosti nižší než v dospělém věku Rozdělení CTV CTV je rozdělena do těchto prostor Intracelulární (nitrobuněčnou) tekutina (ICT) - asi 40 % tělesné hmotnosti Extracelulární (mimobuněčnou) tekutina (ECT) - asi 20 % celkové tělesné hmotnosti, ta se dělí se dále na: Intravazální tekutinu (IVT) - krevní plasma, tvoří asi 3,5-5 % tělesné hmotnosti Intersticiální tekutinu (IST) - mezibuněčná tekutina, tvoří asi % tělesné hmotnosti. Ta je z hlediska iontového složení prakticky totožná s plazmou, obsahuje však méně bílkovin a více Cl - iontů. Transcelulární tekutina: mozkomíšní mok, kloubní tekutina a tekutina v trávicím traktu. Její množství za fyziologických okolností nepřesahuje 500 ml, po jídle se přesunem do trávicího traktu zvyšuje na 2-3 litry. Tekutiny ve třetím prostoru : vyskytují se jen za patologických stavů, patří sem například tekutina v dutině břišní, hrudní, ve střevě při neprůchodnosti střeva, rozsáhlé hematomy apod. Bilance vody. Průměrnné denní ztráty vody jsou odhadovány na 1900 ml (renální ztráty 1200 ml; insenzibilní perspirace 900 ml, metabolická voda 200 ml). Při extrémním denním kolísání příjmu vody i elektrolytů je pro zachování vyrovnané vodní bilance nutný průměrný denní příjem vody ml. Regulace objemu, osmolality a složení vody v různých tělových kompartmentech primárně slouží pro optimální stav v intracelulárním prostoru v reakcích na změny ECT. Z glomerulárního filtrátu (primární moč) o denním objemu cca 180 litrů je unikátní činností jednotlivých částí nefronů 99 % resorbováno zpět za produkce definitivní moče s osmolalitou v rozsahu mmol/kg v závislosti především na extrémech 225

226 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody - příprava v příjmu vody. Osmotický tlak je vlastností každého roztoku. Je koligativní vlastností (vlastnost závislá na množství molekul), jeho hodnota záleží na koncentraci částic v roztoku bez ohledu na jejich velikost. Oddělíme-li roztok látky od čistého rozpouštědla (vody) polopropustnou (semipermeabilní) membránou, která bude propouštět pouze molekuly rozpouštědla a ne molekuly rozpuštěné látky, pak touto membránou budou pronikat molekuly rozpouštědla do roztoku látky. Roztok látky se bude postupně zřeďovat a zvětšovat svůj objem. Tomuto samovolnému zřeďování roztoku pronikáním molekul rozpouštědla přes semipermeabilní membránu říkáme osmóza. Tlak, který bychom museli vyvinout na roztok, abychom zamezili difuzi molekul rozpouštědla semipermeabilní membránou, svou velikostí odpovídá osmotickému tlaku roztoku. KAPITOLA 19 Osmotický tlak Π (kpa) lze pro zředěné roztoky vypočítat podle vztahu: P = i c R T kde i je počet částic vzniklých disociací z jedné molekuly rozpuštěné látky, c je látková koncentrace roztoku (mol l 1), R je univerzální plynová konstanta (8,314 J mol 1 K 1) a T je absolutní teplota (K). Je-li rozpuštěná látka nedisociovaná (neelektrolyt), i = 1. Jestliže rozpuštěná látka disociuje, pak ve velmi zředěných roztocích (ideální roztok) je každý ion osmoticky aktivní částicí: pro silný elektrolyt i = 2, 3, N, pro slabý elektrolyt i = 1 + αc(n 1), kde N je počet iontů vzniklých disociací jedné molekuly, αc je disociační stupeň. Dochází-li k asociaci částic rozpuštěné látky v roztoku, pak i < 1, např. při tvorbě dimerů i = ½. Uvedený vztah pro osmotický tlak je odvozen pro ideální roztoky, v reálných roztocích je třeba uvažovat snížení osmotické aktivity částic v důsledku interakcí mezi ionty. Osmolalita (jednotka mmol kg 1 H 2 O) se zjišťuje většinou měřením snížení teploty tuhnutí roztoku (kryoskopie). Takto zjištěná veličina odráží osmolální aktivitu rozpuštěných látek. Při použití ideální semipermeabilní membrány (propouštějící pouze vodu) budou dva roztoky se stejným počtem osmoticky aktivních částic v rovnováze, budou vykazovat stejný osmotický tlak a nebude docházet ke změnám jejich objemu. Biologické membrány však nejsou polopropustné v pravém slova smyslu, protože jimi pronikají kromě rozpouštědla i mnohé rozpuštěné látky, zejména neelektrolyty. Pro popis interakce roztoku s buněčnými membránami se užívá termín efektivní osmolalita (tonicita). Tento pojem se vztahuje pouze ke koncentraci látek, které nemohou volně přecházet přes buněčnou membránu (především iontů) a vyjadřuje, jaký vliv má určitý roztok na změnu buněčného objemu, pokud je buňka roztokem obklopena. V isotonických roztocích se se objem buňky nemění, v hypotonických dochází k zvětšování objemu až lýze buněk, v hypertonickém prostředí se buňka smršťuje. Typickým příkladem látky, která prochází biologickými membránami je močovina. Zvýšení její koncentrace v plazmě je následováno difuzí do ostatních kompartmentů a nevede proto zpočátku k přesunům vody mezi nimi. Močovina tedy ovlivňuje osmolalitu plazmy, ale ne její tonicitu. Za ustáleného stavu v organismu je krevní plasma isotonická s cytoplasmou erytrocytů i s intersticiální tekutinou a intersticiální tekutina je isotonická s cytoplasmou buněk, které obklopuje. Vodní hospodářství v organismu je udržováno regulací objemu a 226

227 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody - příprava osmolality extracelulární tekutiny. Osmolalita krevního séra u zdravých lidí má rozpětí 285±10 mmol/kg. K celkové osmolalitě plazmy přispívá více než z 90% kation Na + a jeho doprovodné anionty Cl - a HCO3 -. Ostatní kationty a anionty mají jen malý podíl. Z neelektrolytů se podílí hlavně glukóza a močovina. Stabilní osmolalita tělesných tekutin je udržována schopností ledvin měnit osmolalitu moče. Nejčastější hodnoty u zdravých jsou mmol/kg H 2 O, s extrémy mmol/kg. KAPITOLA

228 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody Významstanoveníosmolality,metabolismusvody Autoři: prof. RNDr. Eva Táborská, CSc.; doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. Recenzenti: prof. MUDr. Antonín Kazda, DrSc.; MUDr. Helena Brodská, Ph.D. KAPITOLA 19 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Osmolalita a metabolismus vody Průměrný podíl vody na hmotnosti lidského těla činí 60%. Rovnoměrné a stálé rozložení vody a v ní rozpuštěných látek v různých tělesných kompartmentech je jeden ze základních předpokladů pro zajištění všech životně důležitých funkcí v organismu. Zásadnímu významu vody pro metabolismus a správnou funkci buněk, tkání, orgánů i celého těla odpovídá dokonalý mechanismus regulace jejího objemu, složení i rozdělení do jednotlivých tělesných kompartmentů. Tělesná voda je v buňkách prostředím pro všechny enzymatické i jiné fyzikálněchemické reakce, transport substrátů a produktů a zachování optimálního objemu nitrobuněčných struktur, buněk a tkání. V makroměřítku organismu je klíčová pro efektivní cirkulaci krve s optimální perfuzí tkání. Na regulaci objemu a pohybu vody v organismu se podílejí systémy vybavené citlivými osmo-, volumo- a baroreceptory. V centru regulačních smyček, jejichž cílem je udržení (zachování) optimálního obsahu a rozložení vody v těle je sodný kationt (Na + ), který se 90 % podílí na osmolalitě extracelulární tekutiny. Účinky mechanismů regulujících osmolalitu, Na+ a vodu se proto vzájemně ovlivňují a prolínají (viz také kapitola Význam stanovení Na,K,Cl). Bilance vody. Vodní bilance má straně příjmů vodu přijatou potravou (nápoje a potraviny) a vodu metabolickou (kolem 0,2 l/den). Výdej zahrnuje moč, ztráty stolicí (běžně 0,1 l/den, při průjmech několik litrů), ztráty potem (0,1 l), odpařováním kůží při termoregulaci (0,35 l) a ztráty vydechovaným vzduchem v plicích (0,35 l). Ztráty kůží, potem a plícemi, a zisk metabolismem se označují za neměřitelné (při zjišťování vodní bilance je nelze vyčíslit), je však s nimi nutno počítat. Při běžných okolnostech činí neměřitelné ztráty přibližně 700 ml /den, zvyšují se však při horečce a zvýšeném pocení a naopak se mohou snižovat při umělé ventilaci. Regulace objemu, osmolality a složení vody v různých tělových kompartmentech primárně slouží pro optimální stav v intracelulárním prostoru v reakcích na změny ECT. Z glomerulárního filtrátu (primární moč) o denním objemu cca 180 litrů je unikátní činností jednotlivých částí nefronů 99 % resorbováno zpět za produkce definitivní moče s osmolalitou v rozsahu mmol/kg v závislosti především na extrémech v příjmu vody. Vylučování denní osmotické nálože močí může i za fyziologických okolností značně kolísat. U zdravých osob s vysokým příjmem soli a bílkovin a s vysokou fyzickou aktivitou mohou být hodnoty vyloučené osmotické nálože vyšší než 1500 mmol/24 hod. Naopak při nízkém příjmu bílkovin a v tělesném klidu u hospitalizovaných nekatabolických osob klesá denní vylučování osmotické nálože pod 600 mmol. V kritických stavech je vylučování osmotické nálože významně zvýšeno. Na tomto vylučování se podílejí především vysoké hodnoty močoviny, iontů a časté glykosurie při zhoršené toleranci glukózy, osmoterapeutika, event. látky o malé molekule vylučované při katabolismu a intoxikacích. Ztráty nad 1500 mmol/den se vyskytují u více než 1/3 hyperkatabolických pacientů a ani ztráty dosahující 3000 mmol/den a více nejsou vyjímečné Vylučování takto vysoké osmotické nálože představuje značné nároky na funkci ledvin. Pokud je jejich koncentrační schopnost snížená, např. po hypoxických příhodách, po intenzivní léčbě diuretiky, nebo při depleci kalia, musí být nemocní dostatečně závodńováni, mají-li tuto vysokou osmotickou nálož vyloučit a zabránit tak retenci osmoticky aktivních katabolitů v organismu. 228

229 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody Osmolalita je fyzikální vlastnost roztoku založená na koncentraci rozpuštěných látek vyjádřená jako mmol/kg (w/w). Osmolalita má vztah ke změnám četných vlastností roztoku vzhledem k bezsolutové vodě jako například snížení bodu tuhnutí a snížení tenze vodních par. Tyto tzv. koligativní parametry (vlastnosti závislé na počtu molekul) jsou také základem rutinního měření osmolality v biologických vzorcích. Termín osmolarita představuje vyjádření mmol/l (w/v..weight/volum). Je nepřesný (nevhodný) při hyperlipidémii a hypeproteinémii; pro měření v moči; za přítomnosti některých osmoticky aktivních látek jako např. alkohol nebo manitol. Navíc je vztažení na objem roztoku, který je teplotně závislý. KAPITOLA 19 Regulace osmolality a tělesné vody Systémová regulace osmolality Udržování vodního a iontového hospodářství je založeno na regulaci osmolality a objemu extracelulární tekutiny. Přestože je tato regulace řízena rozdílnými mechanismy, je průsečíkem obou regulačních systémů vztah ke koncentraci Na + iontů v plazmě. Osmolalita (ovlivněná především koncentrací Na + ) je regulována změnami bilance vody a intravazální objem je regulován změnami koncentrace Na +. Rozhodujícím hormonem pro regulaci osmolality je antidiuretický hormon (ADH). ADH je nonapeptid syntetizovaný v hypothalamu (nucleus supraopticus a paraventricularis). Sekreční granula s ADH jsou skladována v zadním laloku hypofýzy. Poločas ADH je ca minut. Na zvýšenou osmolalitu krve, která je zaznámenána osmoreceptory v hypothalamu, reaguje hypotalamus impulzem ke zvýšení sekrece antidiuretického hormonu (ADH) spolu s vyvoláním pocitu žízně. Přirozenou odpovědí na pocit žízně je zvýšený příjem tekutin, který vede ke zvýšení obsahu vody v extracelulárním prostoru, naředění zvýšené koncentrace Na + s následným poklesem osmolality plazmy. Žízeň je rozhodujícím prostředkem v regulaci příjmu tekutin v závislosti na osmolalitě plazmy. Stimulem je zvýšení osmolality o 2% a více. Hormonální regulaci osmolality zajišťuje ADH řízením vylučování vody ledvinami. ADH je krví transportován do ledvin, kde působením na V2 receptory v distálním tubulu a spojovacím segmentu aktivuje aquaporiny. Zvýší se tak resorpce vody v distální části ledvin. Zadržená voda v ledvinách sníží osmolalitu plazmy s následným utlumením sekrece ADH. K zajištění osmolality v rozmezí 285±10 mmol/kg reagují osmoreceptory v hypotalamu velmi rychle i na malé změny osmolality plazmy. 1%-2% vzestup osmolality vede ke čtyřnásobnému vzestupu koncentrace ADH v cirkulaci. Naopak pokles osmolality o 1%-2% zastavuje sekreci ADH. Odpověď je rychlá. Na sekreci ADH se podílí i další faktory. Baroreceptory aortální a karotické a volumoreceptory atriální stimulují sekreci ADH při poklesu krevního tlaku o 10 %. Simultáně se při poklesu tlaku zvyšuje aktivita sympatiku v srdci a cévách a zpětnovazebně je podporován účinek ADH i pocit žízně. ADH cirkulující v krvi působí působí na arterioly a vyvolává jejich konstrikci. Snížení průtoku krve ledvinami vyvolá uvolnění reninu, který vede ke zvýšení tvorby angiotensinu II. Angiotensin II působením v mozku vyvolá uvolnění ADH Renální regulace se významněji uplatňuje při zvládání nadbytku vody v organismu, zatímco žízeň je významnějším regulátorem v prevenci vzniku deficitu vody a dehydratace. Regulace osmolality na úrovni buňky Pro rozložení a přesuny vody mezi buňkami a extracelárními prostory je rozhodující efektivní osmolalita tekutin. Její hodnota je ovlivněna látkami, které se akumulují pouze v některém z prostorů a nemohou samovolně přecházet přes kapilární stěnu nebo buněčné membrány. Typicky se jedná o sodné ionty a glukózu. Při zvýšení jejich koncentrace v ECT se tato tekutina stane oproti ICT hypertonickou (její efektivní osmolalita je vyšší) a naopak, při poklesu jejich koncentrace se efektivní osmotický tlak ECT sníží. Změny hodnoty efektivní osmolality vedou k přesunům vody do prostoru s její vyšší hodnotou. Tento proces trvá tak dlouho, až je opět dosaženo osmotické rovnováhy. Močovina, která přechází volně přes buněčné membrány efektivní osmolalitu a tím i přesuny vody nepůsobí. Nachází-li se buňka v hypertonickém prostředí, typicky při hypernatremii, začne rychle ztrácet vodu. Snížený intracelulární 229

230 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody objem aktivuje pochody, které zvýší obsah osmoticky aktivních látek následovaný vstupem vody do buňky a úpravou buněčného objemu. Dochází zejména k influxu Na+ iontů, např.mechanismem Na + Cl - symportu, Na + K + 2Cl- symportu, Na + /H + antiportu. Tyto mechanismy založené na zvýšení intracelulární koncentrace sodných iontů jsou efektivní jen krátkodobě, protože velmi rychle následuje zvýšení aktivity Na + /K + pumpy. Proto buňky, které se pravidelně dostávají do kontaktu s hypertonickým extracelulárním prostředím, zejména mozkové buňky, mají k dispozici další sekundární mechanismy sloužící k udržení optimálního objemu. Po několika hodinách mohou začít syntetizovat speciální osmoticky aktivní organické sloučeniny. Povaha těchto molekul byla dlouho neznámá, byly nazývány idiogenní osmoly. V poslední době bylo zjištěno, že jde o více organických sloučenin (polyoly, aminokyseliny, aminy, cholinové sloučeniny, fosfokreatinin). Díky tomu jsou pacienti s chronickou hypernatrémií nebo diabetickou hyperglykémií schopni tolerovat vysoké hodnoty osmolality plazmy bez poškození mozkových buněk. Jestliže se buňka ocitne v hypotonickém prostředí, její objem se přesunem vody začne zvyšovat. Reakcí k zachování buněčného objemu dochází k aktivaci transportních pochodů vedoucích ke snížení obsahu osmoticky aktivních látek v buňce, vyrovnání osmolality a zachování buněčného objemu. Různé buňky využívají různé regulační mechanismy, nejčastěji se jedná o zvýšené uvolňování K + zprostředkované stimulací kanálů pro K +. V mozkových buňkách se snižuje obsah organických sloučenin (idiogenních osmolů). KAPITOLA 19 Regulace intravazálního objemu. Adekvátní intravazální objem je nezbytný pro udržení krevního tlaku a k zajištění potřebné perfuze tkání a orgánů. Při kontrole intravazálního objemu se uplatňuje regulace obsahu (množství) Na + a vody. Systém renin-angiotenzin-aldosteron odpovídá primárně za snížení intravazálního objemu. Renin je vylučován juxtaglomerulárními buňkami v aferentních arteriolách ledvin v blízkosti ledvinných glomerulů jako reakce na snížené prokrvení ledvin. Renin konvertuje angiotenzinogen na angiotenzin I, ze kterého posléze vzniká angiotenzin II. Angiotenzin II působí vasokonstrikci, která rychle zvýší krevní tlak a současně zvýší sekreci aldosteronu, který zvýší retenci Na + a vody, která Na + doprovází. Obrázek 19.1 Působení změn osmolality a intravazálního objemu na metabolismu Na + a vody. (Clinical Chemistry; technics, principles, correlations. Sixth eddition. M.L.Bishop, E.P.Fody, L.E.Schoeff. Wolters Kluwer/Lippincott Williams&Wilkins, 2010) Recenzentem doporučeno převést obrázek do češtiny. Změny intravazálního objemu jsou primárně detekovány serií tenzních receptorů umístěných v různých místech kardiopulmo- 230

231 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody nální cirkulace, karotickém sinu, oblouku aorty a glomerulárních arteriolách. Signály z těchto receptorů aktivují řadu odpovědí, které mají za cíl upravit intravazální objem úpravou cévního odporu, srdečního výdeje a renální retencí nebo exkrecí Na + a vody. Další faktory ovlivňující intravazální objem. Natriuretické peptidy: atriový natriuretický peptid (ANP) a mozkový natriuretický peptid (BNP) uvolňované ze srdečních síní a komor jako odpověď na expanzi intravazálního objemu podporují exkreci Na + v ledvinách; BNP a ANP působí společně v regulaci krevního tlaku a vodní bilance. Volumoreceptory stimulují nezávisle na osmolalitě rovněž uvolňování ADH, který šetří vodu renální reabsorpcí. Glomerulární filtrace se zvyšuje a snižuje se zvýšením a snížením intravazálního objemu. 1%-2% snížení tubulární reabsorpce Na + může zvýšit ztráty vody řádově v litrech za den. Osmolalita moče má široké rozmezí v závislosti na příjmu vody a stavu hydratace organismu. KAPITOLA 19 Deficit vody-dehydratace. Nedostatek vody způsobený nedostatečným příjem nebo nadměrnými ztrátami vede k vzestupu osmolality plazmy. Oba regulátory, žízeň a ADH jsou aktivovány. Zatímco ADH minimalizuje ztráty vody, je žízeň hlavním korekčním faktorem. Ten ovšem nepůsobí u osob s poruchou vědomí a může selhat u starých lidí, dětí nebo v případech nemožnosti pít či jinak zajistit dostupnost vody. Osmotická stimulace žízně výrazně klesá u osob starších 70-ti let. Deficit vody, dehydratace, vede k zahuštění vnitřního prostředí, které se v plazmě projeví hemokoncentrací, tj. vzestupem koncentrace hemoglobinu, bílkovin a močoviny se zvýšením hematokritu (ke zvýšení nad referenční meze dojde pouze při výchozích hodnotách v referenčních mezích; původně snížené hodnoty se mohou pouze upravit ). Podle hodnoty osmolality můžeme rozlišit izotonickou, hyper- a hypotonickou dehydrataci. Izotonická dehydratace je způsobena ztrátou tekutiny, která je izotonická s krevní plazmou (zvracení, průjem, popáleniny). Ztráta není provázena vzestupem osmolality ECT, proto nedochází ke kompenzačnímu přesunu vody z ICT. Jsou známky hemokoncentrace, snižuje se kožní turgor, klesá diuréza. Snížený objem krve stimuluje renin a sekreci aldosteronu. Tím je zvýšena absorpce sodíku z distálního tubulu a tím pádem jeho nízká koncentrace v moči. Vzhledem k relativně malému objemu ECT může dojít rychle k hypovolémii, centralizaci krevního oběhu a jeho selhání. Hypertonická dehydratace je způsobena nedostatkem/ztrátou prosté vody. Nejčastější příčinou je snížený příjem vody (bezvědomí, snížený pocit žízně, nemožnost polykat) nebo nedostatečně hrazené ztráty (polyurická fáze renálního selhání, diabetes insipidus centrální nebo nefrogenní). Vedle známek hemokoncentrace se zvyšuje osmolalita a koncentrace Na+ v ECT. Hyperosmolalita ECT vede k přestupu vody z ICT ve snaze korigovat porušenou osmotickou rovnováhu. Vzhledem k dvojnásobnému obsahu vody v ICT se může z počátku porucha v ECT korigovat a oddálit tak klinické projevy hypovolémie. Hypotonická dehydratace je méně častá. Vzniká při ztrátách tekutiny s relativně vyšším obsahem Na + než je v ECT (pankreatická píštěl, některé typy průjmů). Relativní hyperosmolalita ICT vede k přesunu vody do tohoto prostoru s prohloubením již existující hypovolémie. Nadbytek vody-hyperhydratace Nadbytečný příjem nebo nedostatečné vylučování vody vede k poklesu osmolality. Oba regulátory (žízeň i ADH) jsou utlumeny. V nepřítomnosti ADH není voda z primární moče reabsorbována, tvoří se velký objem zředěné moče. Normálně fungující ledviny působí tak účinně, že ani nemusí dojít k hypoosmolalitě a hyponatrémii (pijáci piva). Za patologických situací může dojít k izotonické, hypotonické nebo hypertonické hyperhydrataci. 231

232 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody Izotonická hyperhydratace vzniká při hromadění izotonické tekutiny vedoucí ke zvýšení objemu ECT, aniž se mění její osmolalita. Vyskytuje se u pacientů se srdečním selháním, dekompenzovanou cirhózou a nefrotickým syndromem. Tyto stavy jsou provázeny sekundárním hyperaldosteronismem s retencí sodíku a vody. Jsou přítomné známky hemodiluce (pokles proteinéme, hemoglobinu a hematokritu), osmolalita i koncentrace Na + je v referenčních mezích, zásoby Na+ jsou většinou zvýšené. Jsou přítomné otoky případně ascites. Hypotonická hyperhydratace KAPITOLA 19 provází stavy, u kterých je omezená možnost vylučování vody, která je přiváděna v nadbytku, například při selhání ledvin a u kardiaků. U polytraumat dochází ke kapilárnímu úniku vody a tím rovněž k sekundárnímu hyperaldosteronismu, díky kterému lze v počátcích léčby snadno pacienty převodnit. Jsou přítomné laboratorní projevy hemodiluce, hyponatrémie a hypoosmolalita. Zvláštní skupinu tvoří pacienti s tzv. syndromem inadekvátní sekrece antidiuretického hormonu (SIADH). Ten může provázet některá zánětlivá a nádorová onemocnění plic a CNS, stavy po úrazech a operacích. U těchto stavů je zvýšená produkce ADH, aniž by byla vyvolána zvýšenou osmolalitou nebo hypovolémií. Podobný klinický i laboratorní obraz provází tzv. cerebral salt wasting syndrome (CSWS) způsobený patologickou nadprodukcí natriuretického peptidu. V obou případech je přítomna hyponatrémie a hypoosmolalita. Zatímco u CSWS nacházíme známky dehydratace, u SIADH je intravaskulární objem normální nebo jen mírně zvýšený. Hypertonická hyperhydratace vzniká spíše iatrogenně hrazením ztrát čisté vody fysiologickým roztokem (154 mmol Na + /L), podáním hypertonických roztoků, pitím mořské vody apod. Ledviny jsou nuceny reagovat na extrémní situace v bilanci vody, což je umožněno jejich schopností vytvářet moč v širokém rozsahu osmolality ( mmol/kg). Příčiny hyperosmolality Hypertonická dehydratace (žíznění, diabetes insipidus centrální i nefrogenní) Hyperglykémie.hyperosmolální diabetické koma Otrava nízkomolekulárními látkami (1 etylalkoholu=23 mmol/kg, metanol, etylénglykol..) Při terapeutické úpravě poruch efektivní osmolality ECT platí zásada pečlivě řízené pozvolné úpravy (max. změna osmolality séra o 2-4 mmol/kg za hodinu, především s ohledem na nebezpečí vzniku poškození CNS. Hypoosmolalita ECT vede k průniku vody do relativně hyperosmolálního prostředí CNS za vzniku edému mozku a zvýšení nitrolebního tlaku s neurologickými příznaky (bolesti hlavy, dezorientace, letargie, zvracení) včetně nebezpečí herniace mozkového kmene. Kompenzačně dochází v mozkových buňkách během 24 hodin k poklesu obsahu Na + i K + a do 48 hodin ke snížení obsahu organických látek (polyolů) s poklesem efektivní osmolality. Hyperosmolalita ECT a zvláště příliš rychlá úprava předchozí hypoosmolality ECT vede k dehydrataci mozku s prudkým zmenšením objemu mozkových buněk s demyelinizací a poškozením mozkových kapilár. Klinické příznaky jsou opět neurologické. Měření osmolality Osmolalita krevní plazmy se zjišťuje pomocí osmometrů založených převážně na měření snížení teploty bodu tuhnutí. Osmometry na kryoskopickém principu jsou vybaveny velmi citlivými termistory měřících s přesností na tisícinu C. 1 mol rozpuštěné nedisociované látky způsobí pokles hodnoty bodu tuhnutí roztoku o 1,86 C. Osmolalita krevního séra u zdravých lidí má rozpětí 285±10 mmol/kg. K celkové osmolalitě plazmy přispívá více než z 90% kation Na + a jeho doprovodné anionty Cl - a HCO3 -. Ostatní kationty a anionty mají jen malý podíl. Z neelektrolytů se podílí hlavně glukóza a močovina. Vzhledem k tomu, že močovina snadno proniká do intracelulárního prostoru a nepůsobí tak osmotický gradient mezi ECT a ICT, nepočítá se mezi látky s efektivním vlivem na osmolalitu určenou k léčebné korekci. 232

233 Význam stanovení osmolality, metabolismus vody V klinické praxi se osmolalita krevní plazmy rovněž odhaduje výpočtem z látkových koncentrací (mmol/l) osmoticky významných součástí plazmy. O hodnotě osmolality plazmy (séra) rozhoduje především koncentrace Na+ a jemu odpovídajících aniontů, dále urea, glukóza a v malé míře bílkoviny. Existuje celá řada empirických vztahů, např.: osmolalita plazmy (mmol/ kg H 2 O) 2 [Na + ] + [glukosa] + [močovina] (vše v mmol/l) Tyto výpočty se provádějí i tehdy, je-li známa hodnota osmolality zjištěná měřením. Naměřená hodnoty osmolality je obvykle jen o 5-10 mmol/kg vyšší než vypočítaná. Větší rozdíl mezi přibližným výpočtem a změřenou hodnotou (tzv. osmolární okno, osmolární gap) upozorní na přítomnost většího množství nízkomolekulárních látek normálně se v plazmě nevyskytujících, např. alkoholu, acetonu, ethylenglykolu. Je-li rozdíl mezi měřenou a odhadovanou osmolalitou větší než 10 mmol/kg je přítomnost těchto látek v plazmě velmi pravděpodobná. Např. 1 alkoholu zvyšuje osmolalitu o 23 mmol/kg. Přítomnost těkavých arteficiálních látek lze prokázat pouze kryoskopickým způsobem měření, nikoliv měřením na principu snížení tenze vodních par. Při hodnocení osmolálního okna je třeba počítat s tím, že i podání osmoticky aktivních látek, jako např. manitol vede ke zvýšení osmolality plazmy. KAPITOLA 19 Procentuálně malý, avšak důležitý podíl (~ 0,5 % z celkového osmotického tlaku) mají molekuly proteinů, především albumin. Tato vlastnost bílkovin se označuje jako koloidně-osmotický (onkotický) tlak a je důležitý pro přesuny vody mezi plazmou a intersticiem. Vysokomolekulární látky nepronikají za normálních okolnosti z cévního prostoru do intersticia, působí tak proti hydrostatickému tlaku krve a přispívají tak k udržení intravazálního objemu. Dramatické zhoršení této funkce provází šokové stavy s poruchou permeability a únikem albuminu do intersticia. Za kritické hodnoty osmolality séra jsou považovány hodnoty <250 mmol/kg a >325 mmol/kg. Význam stanovení osmolality Sérum Diferenciální diagnostika poruch vodního a iontového hospodářství Zjištění závažnosti a stupně hyperosmolálních stavů Kontrola a sledování poklesu osmolality při léčbě hyperosmotických stavů Zjištění tzv. osmolálního okna z rozdílu měřené a vypočítané osmolality Moč Sledování vylučování osmotické nálože u hyperkatabolických stavů Stanovení koncentrační schopnosti ledvin v rámci koncentračního pokusu (adiuretinový test) Sérum/moč Určení osmolálního indexu (U Osm / S Osm ) v dif. dg renálních a prerenálních poruch Výpočet osmolální clearance (Cl Osm ) a clearance bezsolutové vody (Cl H2O. Literatura 1. Clinical Chemistry; technics, principles, correlations. Sixth eddition. M.L.Bishop, E.P.Fody, L.E.Schoeff. Wolters Kluwer/ Lippincott Williams&Wilkins, Burtis C. A., Ashwood E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th. Edition, Elsevier, Saunders, Racek J. a kol.. 2. vydání. Galén, Praha, Schneiderka, P. a kolektiv: Vybrané kapitola z klinické biochemie. 2.dopl. a přepr. vyd.,praha, Karolinum,

234 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Autor: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Recenzent: MUDr. Tomáš Franěk Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko KAPITOLA 20 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Lipidy Patří k nim jak látky hydrofóbní (Tg, mastné kyseliny, esterifikovaný cholesterol), tak i látky současně hydrofóbní i hydrofilní (fosfolipidy, volný cholesterol). Lze je dělit do čtyř skupin: mastné kyseliny, jednoduché lipidy, složené lipidy a izoprenoidní lipidy. Mastné kyseliny Jsou to látky s jednoduchým uhlíkatým řetězcem, které mohou v molekule obsahovat jednu či více dvojných vazeb. V živočišných tkáních jsou mastné kyseliny výhradně se sudým počtem uhlíků o délce převážně uhlíků. Jejich zdroj je jednak potrava, jednak jsou syntetizovány v játrech. V krvi jsou transportovány ve vazbě na albumin (volné mastné kyseliny) nebo ve formě složených lipidů v lipoproteinech. Jsou hlavním zdrojem energie pro srdeční a kosterní svalstvo. Jejich štěpení (beta-oxidace) probíhá v mitochondriích, kam jsou transportovány ve vazbě na karnitin. Produktem beta-oxidace mohou být ketolátky, které jsou důležitým zdrojem energie. Volné mastné kyseliny v krvi mají velmi krátký biologický poločas (asi 2 minuty), jsou vychytávány v játrech a reesterifikovány na Tg. Nasycené MK Nemají ve svém řetězci dvojnou vazbu, jsou především pohotovým zdrojem energie. Mohou být v játrech syntetizovány z ostatních energetických substrátů (glukóza, aminokyseliny, alkohol) a ve formě triaclyglycerolů ukládány jako zásobní zdroj energie. Fysiologicky významnými nasycenými MK jsou kyselina laurová (C12:0), myristová (C14:0), palmitová (C16:0), stearová (C18:0) a arachová (C20:0). Jejich zdrojem jsou především živočišné tuky (zde jsou pravidelně doprovázeny cholesterolem), ale i některé rostlinné tuky (např. palmový olej). Jsou relativně stabilní i při vyšších teplotách, nedochází snadno k jejich oxidaci. Vztah k ateroskleróze: jsou bohatým zdrojem energie a jejich zývšený příjem podporuje rozvoj obezity. Kromě toho má jejich zvýšená konzumace proaterogenní účinky, vede ke zvýšení hladiny LDL-cholesterolu v krvi (pravděpodobně indukcí zvýšené syntézy cholesterolu v játrech). Výjimkou je kyselina stearová, která může být v organismu měněna na nenasycenou kyselinu olejovou. Z hlediska prevence aterosklerózy je doporučeno komzumaci nasycených mastných kyselin omezovat. CH 3 - (CH 2 ) n - COOH Obrázek 20.1 Struktura nasycených MK 234

235 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Nenasycené MK Tyto MK obsahují ve svém řetězci 1 nebo více dvojných vazeb, fysiologicky většinou v cis-konfiguraci. Jsou obsaženy především v rostlinných tucích a v rybích olejích. Monoenové mastné kyseliny Hlavními představiteli jsou kyselina palmitoolejová (C16:1, ω-7), a kyselina olejová (C18:1, ω-9). Mohou být syntetizovány v játrech a nejsou tedy esenciálními, v případě kyseliny olejové je však vhodný i její exogenní přívod, protože její syntéza v organizmu nebývá dostatečná. Vztah k ateroskleróze: kyselina olejová může při dostatečném přívodu snižovat hladinu LDL-cholesterolu a je považována za součást tzv. středomořské diety, která omezuje riziko rozvoje aterosklerózy. KAPITOLA 20 CH 3 - (CH 2 ) 5 - CH = CH - (CH 2 ) 7 - COOH Obrázek 20.2 Příklad struktury mononenasycené MK: Polyenové mastné kyseliny Mají více dvojných vazbou, první vazba bývá na třetím (ω-3) nebo šestém (ω-6) uhlíku od jejich karboxylového konce. Slouží mimo jiné i jako zdroj pro syntézu prostaglandinů, leukotrienů či tromboxanů. Jsou méně stabilní než nasycené mastné kyseliny a snáze podléhají oxidaci. Obrázek 20.3 Příklad struktury polynenasycené MK ω-6 mastné kyseliny Hlavními představiteli jsou kyseliny linolová 18:2 (9,12), γ-linolenová 18:3 (6,12,12) a arachidonová. Jsou zdrojem pro syntézu eikosanoidů, které mají prozánětlivé a vasokonstrikční účinky a zvyšují agregabilitu trombocytů. Při jejich zvýšené konzumaci se může snižovat hladina HDL-cholesterolu. ω-3 mastné kyseliny Jejich hlavními představiteli jsou kyseliny linolenová 18:3 (9,12,15), eicosapentaenová 20:5 (5,8,11,14,18) a docosahexaenová 22:6 (4,7,10,13,16,19). Jsou zdrojem pro syntézu eicosanoidů, které mají vasodilatační a protizánětlivé účinky a snižují agregabilitu trombocytů. Při dostatečném příjmu snižují hladinu triacylglycerolů a působí preventivně proti rozvoji komplikací aterosklerózy. Jejich zdrojem jsou především rybí tuky, v menší míře jsou obsaženy i v rostlinných olejích. Trans mastné kyseliny Jde o izomery nenasycených mastných kyselin, jejichž prostorové uspořádání připomíná nasycené mastné kyseliny (napřímený řetězec). Vznikají z cis mastných kyselin činností bakterií ve střevech přežvýkavců, odkud se dostávají do všech výrobků z jejich masa a mléka. Mohou vznikat také při nešetrné hydrogenaci nenasycených mastných kyselin (výroba tvrdých maragarínů pro pečení a smažení; měkké margaríny určené k přímé konzumaci jsou vyráběny jinými technologiemi a neobsahují trans izomery mastných kyselin). Vznikají také při dlouhodobém vystavení nenasycených mastných kyselin vysoké teplotě (např. při smažení). 235

236 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Jejich zdrojem v potravě jsou tedy běžně konzumované potraviny živočišného původu, dále pečivo a především různé pochutiny s polevami a napodobeninami či náhradami čokolády Trans mastné kyseliny mohou mít proaterogenní účinky, jejich zvýšený příjem může akcelerovat aterosklerózu a zvyšovat hladinu LDL-cholesterolu. KAPITOLA 20 Obrázek 20.4 Struktura trans a cis MK Jednoduché lipidy Do skupiny jednoduchých tuků patří acylglyceroly a vosky. Acylglyceroly vznikají vazbou mastných kyselin na trojsytný alkohol glycerol, vosky vznikají vazbou mastných kyselin na primární nebo sekundární alifatický alkohol. Triacylglyceroly (Tg) Vznikají vazbou 3 MK na trojsytný alkohol - glycerol (triestery glycerolu). Na prvním uhlíku triacylglycerolů je preferenčně vázána kyselina palmitová, na druhém kyselina linolová a na třetím kyselina olejová (pokud jsou tyto mastné kyseliny k disposici). Tg jsou původu exogenního (potravou přijímáme asi mmol/den) i endogenního (syntéza v játrech). Ke štěpení triacylglycerolů v tukové tkáni dochází účinkem hormon senzitivní lipázy. Tento enzym je inhibován inzulínem, aktivní je tedy pouze při poklesu inzulinémie (pokud organizmus hladoví). Zvýšená syntéza Tg v játrech (zvýšená koncentrace triacylglycerolů v krvi na lačno ) je většinou způsobena nadměrným příjmem energie (glycidy, tuky, alkohol) v potravě. Tg jsou hlavní zásobní formou energie: dospělý neobézní člověk má asi 15 kg Tg. Při obsahu asi 38 kj energie na gram hmotnosti to odpovídá to asi kj, což představuje zásobu energie na téměř 3 měsíce hladovění. V krvi jsou Tg transportovány ve všech lipoproteinech, jejich nejvyšší obsah je však v VLDL a chylomikronech. Fysiologická koncentrace Tg v krvi je do 1,7 mmol/l za předpokladu, že pacient byl lačný hodin před odběrem krve. Zvýšená koncentrace Tg v krvi je markerem zvýšeného rizika aterosklerózy a kardiovaskulárních onemocnění. Velmi častou příčinou zvýšené hladiny triacylglycerolů je nadměrná konzumace alkoholu. Snížení koncentrace triacylglycerolů v krvi je většinou možné dosáhnout pouhým omezením energetického příjmu (a alkoholu) bez ohledu na složení potravy a také zvýšenou fysickou aktivitou. Hyperinzulinémie (např. u nemocných s diabetes mellitus 2. typu nebo při obezitě) inhibuje hormon-senzitivní lipázu v tukové tkáni a znemožňuje tak odbourávání triacylglycerolů. K aktivaci tohoto hormonu dojde pouze při poklesu inzulinémie - při omezení energetického příjmu. 236

237 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi KAPITOLA 20 Obrázek 20.5 struktura triglyceridů Složené lipidy Složené lipidy se skládají z vícesytného alkoholu s navázanými mastnými kyselinami a dalšími složkami, patří mezí základní strukturální látky v organismu. Jejich molekuly mají hydrofóbní i hydrofilní konec, což je rozhodující pro jejich fysiologické funkce - jsou základní stavební součásti všech buněčných membrán. Buněčné membrány mají charakter dvojvrstvy, jejích vnější vrstvu tvoří cholinové fosfolipidy a glykolipidy, vnitřní vrstvu pak tvoří aminofosfolipidy. Stanovení fosfolipidů ani glykolipidů se běžně neprovádí, jejich hladiny nemají vztah k aterogenezi. Fosfolipidy Jsou základní součástí všech buněčných membrán na celulární i subcelulární úrovni a tvoří také povrchovou strukturu krevních lipoproteinů. Syntézy fosfolipidů jsou schopny všechny buňky. Dělí se na glycerofosfolipidy a sfingofosfolipidy. Obrázek: struktura fosfolipidů Glycerofosfolipidy Jsou odvozeny od triacylglycerolu, ve kterém je jedna mastná kyselina nahrazena zbytkem kyseliny fosforečné s navázanou další látkou (cholin, etanolamin, serin). Představitelem fosfolipidu vnější vrstvy buněčné membrány je fosfatidylcholin (někdy též lecithin ), vnitřní vrstva buněčných membrán je nejčastěji tvořena fosfatidylserinem. Vztah k aterogenezi: nebyl jednoznačně prokázán Obrázek: struktura glycerofosfolipidů Sfingofosfolipidy Typickým zástupcem je sfingomyelin, ve kterém je aminoalkohol sfingosin, 2 mastné kyseliny, zbytek kyseliny fosforečné a cholin. Sfingosin je hlavním fosfolipidem membrán na subcelulární úrovni a je také dominantním fosfolipidem myelinu nervových vláken. Je i součástí povrchových struktur lipoproteinů. Obrázek: struktura sfingofosfolipidů 237

238 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Glykolipidy Glykolipidy obsahují sfingosin s navázanými mastnými kyselinami a sacharidovou složkou. Jsou součástí cytoplasmatických membrán, pochev neuronů, a řady dalších organických struktur. Obrázek: struktura glykolipidů Isopreniodní lipidy KAPITOLA 20 Cholesterol Cholesterol patří mezi základní biologické sloučeniny: má klíčovou funkcí ve stavbě membrán na celulární i subcelulární úrovni, je výchozí látkou pro syntézu steroidních hormonů, žlučových kyselin a vitamínu D. Je nutný pro resorpci a transport triacylglycerolů a v tucích rozpustných vitaminů. Jeho syntézy jsou schopny prakticky všechny buňky v těle, intenzivní syntéza probíhá v především v hepatocytech, enterocytech, neuronech a v endokrinních žlázách produkujících steroidní hormony. Pro regulaci jeho syntézy je klíčový enzym 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA reduktáza, katalyzující přeměnu hydroxymethylglutaryl-coa na mevalonát. Aktivita tohoto enzymu je inhibována statiny - léky ke snížení hladiny cholesterolu v krvi. Intenzita syntézy cholesterolu v buňce je regulována zpětnou vazbou na úrovni HMG-CoA reduktázy: dostatečná zásoba cholesterolu intracelulárně tento enzym inhibuje, nedostatek cholesterolu ho odbrzďuje. Aktivitu tohoto enzymu stimuluje například také inzulin a inhibuje glukagon. Druhý mechanismus, který reguluje intracelulární zásoby cholesterolu, je regulace syntézy LDL-receptorů: při nedostatku cholesterolu je syntéza receptorů zvýšena (zvýšené vychytávání lipoproteinů LDL z krve), dostatečné zásoby cholesterolu naopak syntézu LDL-receptorů utlumí. Syntéza cholesterolu v játrech je často zvýšena při obezitě a při zvýšeném přívodu nenasycených MK v potravě. V krvi je cholesterol transportován v lipoproteinech, z těla je eliminován cestou žluče (v nezměněné podobě a ve formě žlučových kyselin), přičemž asi 50 % takto vyloučeného cholesterolu a asi 95 % žlučových kyselin je opět ve střevě reabsorbováno. Cholesterol volný Je částečně hydrofilní a je jednou ze základních součástí buněčných membrán na celulární i sbucelulární úrovni. V krvi je transportován na povrchu lipoproteinů. Cholesterol esterifikovaný Obrázek 20.6 struktura volného cholesterolu Má navázanou mastnou kyselinu a je zásobní formou cholesterolu v buňkách. Esterifikace cholesterolu probíhá intracelulárně za katalýzy acetyl-coa C-acetyltransferázy, jejíž aktivita se zvyšuje při dostatku cholesterolu a klesá při jeho nedostatečné zásobě v buňce. K esterifikaci cholesterolu dochází dále v krevních lipoproteinech za katalýzy lecitin:cholesterol acyltransferázy. V lipoproteinech jsou na cholesterol vázány přednostně kyseliny linolová a linolenová, intracelulárně pak přednostně kyselina olejová a palmitoolejová. 238

239 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi KAPITOLA 20 Vztah cholesterolu k aterogenezi Obrázek 20.7 struktura esterifikovaného cholesterolu Zvýšená hladina cholesterolu je základním rizikovým faktorem pro rozvoj aterosklerózy a kardiovaskulárních onemocnění. Cholesterol je vždy základní součástí aterosklerotického ložiska (není aterosklerózy bez cholesterolu). S jeho zvyšující se koncentrací v krvi roste i riziko kardiovaskulárních komplikací, a to již od koncentrace celkového cholesterolu 3,9 mmol/l. Průměrné hladiny cholesterolu u dospělé populace České republiky jsou asi 5,6-5,8 mmol/l. Za optimální koncentrace celkového cholesterolu je pro obecnou populaci považována hodnota do 5,0 mmol/l a tato hodnota by také měly být uváděna jako fysiologická horní hranice cholesterolémie na výsledcích měření hladiny cholesterolu v laboratořích. Nižší jsou doporučené hladiny cholesterolu pro osoby v primární prevenci ve vysokém riziku kardiovaskulárních komplikací (do 4,5 mmol/l). Pro nemocné v sekundární prevenci kardiovaskulárních onemocnění je optimální hladina celkového cholesterolu v krvi do 4,0 mmol/l. Intervenční studie prokázaly, že snížení hladiny cholesterolu v krvi o 1 % vede ke snížení výskytu ischemické choroby srdeční asi o 2 %. Při agresivním snížení hladiny cholesterolu je možné dosáhnout i regrese aterosklerózy. Lipoproteiny Lipoproteiny jsou sférické částice, které transportují lipidy v krvi. Přehled základních tříd lipoproteinů je v tabulce 1. De novo jsou syntetizována chylomikra a VLDL. IDL a LDL jsou produktem katabolizmu VLDL. Vznik a metabolizmus HDL je popsán v příslušném odstavci této kapitoly. V krvi probíhá intenzivní metabolismus lipoproteinů a kromě jejich degradace dochází k výměně a přenosu prakticky všech jejich složek (cholesterol, Tg, fosfolipidy, apolipoproteiny) mezi jednotlivými typy lipoproteinů. Atypickým lipoproteinem je lipoprotein(a), který zasahuje do procesu fibrinolýzy a je popsán k kapitole Laboratorní markery aterosklerózy. Vztah jednotlivých tříd lipoproteinů k ateroskleróze je uveden v tabulce

240 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi KAPITOLA 20 Obrázek 20.8 tvar a struktura lipoproteinů Třída lipoproteinů Zkratka názvu Riziko ischemické choroby srdeční Chylomikra CL Neovlivňují Zbytky chylomiker CL remnanta Zvyšují (++) Lipoproteiny o velmi nízké hustotě VLDL (very low density lipoproteins) Mírně zvyšují (+) Lipoproteiny o střední hustotě IDL (intermedial density lipoproteins) Silně zvyšují (+++) Lipoproteiny o nízké hustotě LDL (low density lipoproteins) Silně zvyšují (++++) Lipoproteiny o vysoké hustotě HDL (high density lipoproteins) Silně snižují ( ) Tabulka 20.1 Vztah lipoproteinů k ateroskleróze. Chylomikra Jsou syntetizována v enterocytech (společně s apolipoproteinem B 48), jejich fysiologickou funkcí je transport triacylglycerolů ze střeva do periferních tkání (především tukové tkáně) a transport cholesterolu ze střeva do jater. V krevních kapilárách periferních tkání (především tkáň tuková a svalová) jsou částečně degradována a uvolněné Tg jsou hydrolyzovány za katalýzy lipoproteinové lipázy. Tento enzym je lokalizován na endotelu krevních kapilár především kosterního svalstva, myokardu, tukové tkáně a také prsní žlázy v době laktace. Částice se tak postupně zmenšuje a po odštěpení asi 70 % triacylglycerolů vznikají z chylomiker tzv. remnanta chylomiker, které jsou relativně bohaté cholesterolem. Ty jsou velmi rychle vázány především v játrech cestou receptorů pro apolipoprotein E. Remnantní částice jsou pro hepatocyty zdrojem exogenního cholesterolu. Nejvyšší koncentrace chylomiker v krvi je obvykle za 3-6 hodin po jídle a po asi 9 hodinách by již neměly být v krvi přítomny. Atherogenita: chylomikra nemají aterogenní potenciál, jejich remnanta jsou však silně aterogenní (mají však za fyziologických okolností velmi krátký biologický poločas). Obrázek: schéma metabolismu chylomiker VLDL Jsou syntetizovány v hepatocytech, limitující pro jejich sekreci do krve je rychlost syntézy apolipoproteinu B-100. Transportují 240

241 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi endogenní triacylglyceroly (syntetizované v játrech) do periferních tkání (především tkáně tukové a svalové) a cholesterol. V krvi přebírají VLDL další apolipoproteiny (apo E, apo C) z částic HDL. V krevních kapilárách periferních tkání (především sval, tuková tkáň) jsou VLDL částečně degradovány za současné hydrolýzy triacylglycerolů účinkem lipoproteinové lipázy, lokalizované na cévním endotelu kapilár tkání s vysokou spotřebu mastných kyselin. Lipoproteinová lipáza je aktivované apolipoproteinem C-II a také inzulinem. Od částic HDL přebírá částice VLDL esterifikovaný cholesterol výměnou za Tg. Částice VLDL je tak ochuzována o Tg a obohacována o estery cholesterolu, zmenšuje se a stává se z ní částice IDL ( remnanta VLDL). Biologický poločas VLDL je asi 2-4 hodiny. Atherogenita: zvýšená koncentrace VLDL navyšuje riziko kardiovaskulárních onemocnění. Jejich přítomnost v krvi se podílí (spolu se zbytky chylomiker) na zvýšené hladině triacylglycerolů. Obrázek: schéma metabolismu VLDL - IDL - LDL KAPITOLA 20 IDL Jsou produktem katabolismu VLDL a nesou v sobě přibližně stejné molární zastoupení cholesterolu i triacylglycerolů. Jejich osud je dvojí: a) při průtoku játry jsou vychytávány hepatocyty pomocí receptoru pro apolipoprotein E (který nesou IDL na svém povrchu) a v játrech jsou degradovány; b) při průtoku játry podléhají účinku jaterní lipázy, která v nich hydrolyzuje většinu zbývajících triacylglycerolů a vzniká částice LDL. IDL mají za fyziologických okolností velmi krátký biologický poločas a jejich koncentrace normálně nepřesahuje 1/10 koncentrace LDL. Atherogenita: IDL jsou vysoce aterogenní a mohou výrazně akcelerovat rozvoj aterosklerózy. LDL Vznikají jako produkt katabolismu VLDL a IDL v krvi a na svém povrchu nesou apolipoprotein B100, který je nutný pro vazbu LDL na LDL-receptor na povrchu buněk. Jejich funkcí je dodávka cholesterolu všem periferním tkáním - prakticky všechny buňky na svém povrchu exprimují LDL-receptor. Vstup cholesterolu do buněk cestou LDL-receptorů je regulován zpětnou vazbou. LDL jsou pro buňky hlavním zdrojem cholesterolu především pro syntézu buněčných membrán. Během 24 hodin je obvykle katabolizováno asi % částic LDL, z toho asi 80 % cestou LDL receptorů. LDL mají dlouhý biologický poločas a část z nich podléhá chemické modifikaci, např. glykaci a/nebo oxidaci. Takto modifikované LDL ztrácí schopnost vazby na LDL receptory a jsou katabolizovány cestou tzv. scavengerových receptorů, především makrofágy v subendoteliálních prostorách. Vstup modifikovaných LDL do buněk cestou scavengerových receptorů není regulován zpětnou vazbou, makrofágy v subendoteliálních prostorách tak akumulují nekontrolovatelně cholesterol a postupně se mění v pěnové buňky, které jsou základem aterosklerotického ložiska. Existuje několik podtypů LDL, které se liší velikostí, hustotou a složením (obsahem cholesterolu a triacylglycerolů): velké LDL1, střední LDL2 a malé LDL3. Malé LDL3 vznikají v krvi u pacientů s hypertriacylglycerolémií, při degradaci původně velmi velkých (atypických) částic VLDL. Ty jsou v játrech syntetizovány při nadměrném přívodu energie (obezita), při diabetes mellitus 2. typu, u pacientů s metabolickým syndromem. Atherogenita: LDL jsou vysoce aterogenní, aterogenita LDL se zvyšuje s jejich klesající velikostí (nejvíce aterogenní jsou jsou malé LDL3). HDL Tyto nejmenší lipoproteiny mají vysoký obsah proteinů (apolipoproteinů i dalších bílkovin a enzymů), jejich hlavní funkcí je zpětný (reverzní) transport cholesterolu z periferních tkání a z ostatních lipoproteinů zpět do jater. Pro jejich vznik a funkci je klíčový apolipoprotein A-1, který je po syntéze v játrech secernován do krve. Tam na sebe váže volný cholesterol, fosfolipidy, další apolipoproteiny a enzymy, za vzniku diskoidní (tzv. nascentní) částice HDL. Cholesterol je v částicích HDL esterifikován účinkem LCAT (lecithin:cholesterol acyl transferázy), esterifikovaný cholesterol je transportován dovnitř HDL a postupně vzniká větší sférická částice HDL. Současně dochází k výměně takto esterifikovaného cholesterolu za Tg mezi HDL a lipoproteiny bohatými na Tg (VLDL, chylomikra) účinkem CETP (cholesterol-ester transfer proteinu). Další osud HDL částic může být dvojí: a) jsou vychytávány hepatocyty cestou HDL-receptoru a takto získaný cholesterol hepatocyty vylučují do žluče; b) účinkem jaterní lipázy jsou hydrolýzovány Tg a vzniká opět menší částice HDL, která se vrací do procesu zpětného transportu cholesterolu. Atherogenita: HDL působí protektivně před rozvojem aterosklerózy - zajišťují přenos přebytečného cholesterolu z cévní stěny (a také z periferních tkání a ostatních lipoproteinů) zpět do jater. Kormě toho mají HDL i řadu dalších antiaterogenních účinků, např. chrání LDL částice před oxidativní modifikací (činností enzymy paraoxonázy na svém povrchu), stimulují v endotelu synté- 241

242 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi zu oxidu dusnatého, chrání cevní endotel, atd. Obrázek: schéma metabolismu HDL Apolipoproteiny Apolipoproteiny jsou bílkoviny, které jsou součástí lipoproteinové částice a které mají v metabolismu lipoproteinů celou řadu funkcí: jsou kofaktory enzymů, ligandami pro receptory, účastní se v přenosu a výměně látek mezi lipoproteinovými částicemi (cholesterol, Tg, fosfolipidy), jsou strukturálními bílkovinami lipoproteinů. Charakteristika některých hlavních lipoproteinů je v tabulce 2. Klinicky významné lipoproteiny, které jsou stanovovány a které mají největší význam v diagnostice a léčbě nemocných s hyperlipoproteinémií, jsou apolipoprotein B 100 a apolipoprotein A-I. KAPITOLA 20 Apolipo- Místo syntézy Obsažen v lipoproteinech Funkce -protein A I Játra, střevo HDL, CL Aktivátor LCAT A IV Játra, střevo HDL, CL Aktivátor LCAT B 48 Střevo CL Strukturální lipoprotein B 100 Játra VLDL, IDL, LDL Liganda pro LDL receptory C I Játra, nadledviny HDL, VLDL, CL Aktivátor LCAT C II Játra, střevo HDL, IDL, VLDL, CL Aktivátor LPL C III Játra, střevo HDL, IDL, VLDL, CL Inhibitor LPL, jaterní lipázy E Játra, periferní tkáně HDL, IDL, VLDL, CL Liganda pro LDL a apo E receptory. Tabulka 20.2 Některé významné apolipoproteiny a jejich funkce Legenda: LCAT - lecitin:cholesterol acyltransferáza; LPL - lipoproteinová lipáza; Apolipoprotein A-I Tento polypeptid je vázán reverzibilně na povrchu lipoproteinů HDL a chylomiker. V krevním řečišti je z chylomiker při jejich degradaci transportován do HDL, kde je akumulován. Je strukturálním apolipoproteinem HDL, je kofaktorem enzymu LCAT (lecithin:cholesterol acyltransferázy), který je nutný pro esterifikaci cholesterolu v částicích HDL a tím i pro reverzní transport cholesterolu. Apolipoprotein A-I je také ligandou pro vazbu HDL částice na receptor v hepatocytech. Stanovení hladiny apolipoproteinu A-I je již běžně prováděno v biochemických laboratořích. Toto vyšetření je důležité pro posouzení kardiovaskulárního rizika, protože informuje o množství antiaterogenních HDL částic v krvi (nejsou-li v krvi současně chylomikra tedy není-li sérum chylosní). Atherogenita: zvýšená koncentrace apolipoproteinu A-I má protektivní účinky před rozvojem aterosklerózy. Apolipoprotein B 100 Je největším apolipoproteinem (4536 aminokyselin), jeho syntéza probíhá v hepatocytech (denně asi 10 mg) a je strukturální součástí lipoproteinů VLDL, IDL, LDL. Je ligandou pro vazbu LDL částice na LDL-receptor na povrchu všech buněk. Syntéza apolipoprotein B určuje rychlost sekrece VLDL z hepatocytu do krve. Po sekreci VLDL do krve je aktivní část řetězce apolipoproteinu B 100 maskována, takže VLDL a IDL částice nejsou vázány na LDL-receptor. Teprve po hydrolýze triacylglycerolů z VLDL a IDL (kdy vzniká částice LDL) dochází i odmaskování specifických částí řetězce apolipoproteinu B 100 a částice LDL může být vázána na LDL-receptory na povrchu buněk. Po internalizaci komplexu receptor-ldl je apolipoprotein B 100 degradován v lysozymech. Mutace v genu pro apolipoprotein B 100 (stejně jako mutace v genu pro LDL-receptor) vede k onemocněnímu familiární hypercholesterolémie. V obou případech nejsou LDL částice vychytávány v dostatečné míře z krve a dochází k výraznému zvýšení hladiny LDL-cholesterolu v krvi. Důsledkem je velmi časná ischemická choroba srdeční. Stanovení hladiny apolipoproteinu B 100 v krvi patří mezi běžné laboratorní analýzy. 242

243 Sérové lipidy a lipoproteiny, vztah k aterogenezi Atherogenita: koncentrace apolipoproteinu B 100 je ukazatelem součtu hlavních aterogenních lipoproteinů v krvi (LDL, IDL a VLDL), jeho zývšená hladina je tedy rizikovým faktorem kardiovaskulárních onemocnění. KAPITOLA

244 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - příprava Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - příprava Autor: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Recenzent: prof. MUDr. Richard Průša, CSc. Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko KAPITOLA 21 Laboratornímarkeryaterosklerózy (kromělipidůalipoproteinů) Markery zánětu C-reaktivní protein (CRP) CRP je reaktantem akutní fáze, který se podílí na rozvoji imunitní reakce organismu. Jeho syntéza v játrech je indukována cytokiny (především interleukin-1 a interleukin -6). CRP patří do skupiny pentraxinů, jeho molekula je tvořena pěti podjednotkami. Váže se na exogenní i endogenní ligandy a umožňuje tak jejich rychlejší eliminaci aktivací komplementu a fagocytózou. Hladina CRP nad 10 mg/l je markerem systémového zánětlivého (ale také např. nádorového) procesu v organismu. Zvyšuje se především u zánětu bakteriálních (koncentrace může dosáhnout i na několik set mg/l), u virových infekcí je většinou vzestup CRP jen malý. Ateroskleróza je chronický zánětlivý proces v cévní stěně a pokud je tento proces aktivní, jsou zde produkovány cytokiny, které v játrech indukují syntézu CRP. Původní diagnostické soupravy byly schopné měřit CRP pouze v koncentracích nad 10 mg/l. Teprve soupravy nové generace, označované jako vysoce sensitivní (hs-crp, high sensitivity CRP) dovolují měřit i koncentrace v rozmezí 1-10 mg/l. V literatuře se pak můžeme setkat s termínem že je měřeno hs-crp, což znamená, že je měřeno CRP pomocí vysoce sensitivní soupravy. Je prokázáno, že mírné zvýšení CRP v rozmezí 3-10 mg/l je spojeno se zvýšeným rizikem rozvoje kardiovaskulárních komplikací a je markerem rizika aterosklerózy. Interleukin 6 (IL-6) IL-6 (interferon β-2, monocyte derived human B cell growth factor) patří do skupiny cytokinů, které iniciují v játrech syntézu proteinů akutní fáze, včetně CRP. IL-6 je produkován celou řadou buněk podílejících se na zánětlivém procesu, především T-lymfocyty, makrofágy, fibroblasty, endoteliálními buňkami nebo nádorovými buňkami. Reguluje nejen imunitní odpověď a zánět, ale např. i hematopoezu. Kromě stimulace syntézy proteinů akutní fáze v hepatocytech reguluje i další procesy v průběhu zánětu, např. diferenciaci T a B lymfocytů a makrofágů. Klinické studie prokázaly, že zvýšená hladina IL-6 (podobně jako hladina CRP) je sdružena s vyšším rizikem kardiovaskulárních komplikací. Sérový amyloid A (SAA) SAA je souhrnným názvem pro skupinu proteinů, asociovaných s lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL), především HDL3. Doposud bylo prokázáno 5 variant SAA. SAA je také reaktantem akutní fáze a markerem zánětu. Je syntetizován v játrech účinkem interleukinu IL-6. SAA působí také jako chemoatraktant pro zánětlivé buňky (leukocyty) a může sám o sobě dále stimulovat tvorbu zánětlivých cytokinů. Bylo prokázáno, že jeho zvýšená hladina má vztah k riziku kardiovaskulárních komplikací. Myeloperoxidáza (MPO) 244

245 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - příprava Enzym ze skupiny peroxidáz, produkovaný monocyty a neutrofily v místě zánětu. Je to hemoprotein (obsahuje molekuly hemu, které způsobují zelenavé zbarvení hnisavých sekretů). Má antimikrobiální aktivitu: volné radikály, tvořené při respiračním vzplanutí fogocytů, jsou za působením MPO přeměňovány na kyselinu chlornou, která je vysoce baktericidní. MPO bývá přítomna také v aterosklerotickém plátu při jeho infiltraci fagocyty a zvýšená aktivita MPO má vztah k riziku kardiovaskulárních komplikací. Markery hemostázy a trombózy Lipoprotein(a) [Lp(a)] KAPITOLA 21 Lp(a) je svojí strukturou prakticky totožný s částicí lipoproteinů o nízké hustotě (LDL), na níž je navíc disulfidovou vazbou navázána další bílkovinný řetězec - apolipoprotein(a). Apolipoprotein(a) je glykoprotein o variabilní velikosti kda. Jeho řetězec vytváří smyčky (kringle), které jsou svým prostorovým uspořádáním podobné struktuře plazminogenu. Plasminogen je bílkovina, která vazbou na plazmin spouští proces fibrinolýzy - rozpouštění trombu). Lp (a) tak soutěží s plazminogenem o vazbu na plazmin, na rozdíl od plazminogenu však plazmin neaktivuje a tím brání fibrinolýze. Výsledkem může být převaha trombogeneze nad trombolýzou. Jeho fysiologická funkce není jednoznačně objasněna a předpokládá se, že může hrát roli v odpovědi na poranění a podpoře hojení ran. Fibrinogen Fibrinogen je vláknitý glykoprotein, složený ze tří párů polypeptidových řetězců (fibrinopeptidů), spojených disulfidickými můstky. Je syntetizován v játrech. Účinkem trombinu je měněn na fibrin, což je klíčový krok při tvorbě krevního koagula. Zasahuje i do procesu trombogeneze (podílí se na agregaci trombocytů), ovlivňuje také viskositu krve. Fibrinogen je také reaktantem akutní fáze a jeho koncentrace se zvyšuje při zánětlivých stavech, po operacích, apod. Zvýšená koncentrace fibrinogenu může být navozena také estrogeny (těhotenství) a zvyšuje se většinou také se stoupajícím věkem. Je považován za rizikový faktor kardiovaskulárních komplikací. Faktor VII Je to glykoprotein o jediném řetězci. Neaktivní faktor VII má proteolytické vlastnosti - patří mezi serinové proteázy, jeho hlavní funkce je ale v procesu koagulace: jeho aktivaci (rozštěpením na dva spojené řetězce) se spouštějí aktivované faktory IX, X a XI a tkáňový faktor. Jeho zvýšená hladina souvisí i s rizikem komplikací aterosklerózy. PAI-1 PAI je zkratka pro přirozené inhibitory tkáňového aktivátoru plazminogenu (tpa). PAI-1 je serpin, který je tvořen v endoteliálních buňkách a megakaryocytech, nejvyšší obsah PAI-1 je v trombocytech a v endoteliálních buňkách. Jeho tvorbu v játrech mohou stimulovat cytokiny. Zvýšení jeho hladiny je typické u nádorových onemocnění, jaterních onemocnění a u trombóz, zvýšená hladina ale souvisí i s rizikem komplikací aterosklerózy. Homocystein Je to neesenciální AMK (vzniká demetylací methioninu), která je meziproduktem přeměny methioninu na cystein. V plasmě je převážně v oxidované formě, vázané na bílkoviny, v menší míře je ve formě redukované a ve formě disulfidu. Koenzymy v jeho dalším metabolismu jsou tři vitamíny: vitamin B6 jako pyridoxalfosfát, B12 jako methycyanokobalamin a kyselina listová jako metyltetrahydrofosfát. Při vyšetřování hladiny homocysteinu v krvi je důležité co nejrychleji oddělit plasmu (sérum) od krvinek, protože jinak by došlo k přestupu homocysteinu z erytrocytů do plasmy a hladina by tím byla falešně zvýšena. Fysiologické koncentrace v krvi se pohybují většinou v rozmezí 5-15 μmol/l, u mužů jsou hladiny o něco vyšší než u žen. Zvýšená hladina homocysteinu může být dána geneticky, zevními vlivy životního stylu, případně jde o interakci genetických a zevních vlivů. Zvýšená hladina homocysteinu může být indikátorem zvýšeného kardiovaskulárního rizika. Lp-PLA2 (fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny) Fosfolipázy A2 představují skupinu nitrobuněčných a sekretovaných enzymů. Lp-PLA2 je serinová lipáza o molekulární hmotnosti 45,4 kda. Je syntetizována převážně v makrofázích, v krvi je vázána na lipoproteiny. V krevních lipoproteinech katalyzuje 245

246 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - příprava přeměnu oxidovaného fosfatidylcholinu na volné (neesterifikované) mastné kyseliny a lysofosfatidylcholin. Výsledné produkty jsou bioaktivní a mohou zprostředkovat zánětlivé procesy, vedoucí k procesu aterogeneze. Mikroalbuminurie Fysiologické vylučování albuminu do moče nepřesahuje 30 mg/24 hodin. Zvýšené vylučování albuminu močí je indikátorem glomerulární proteinurie. Mírně zvýšené vylučování albuminu močí v rozmezí mg se nazývá mikroalbuminurie, hodnoty nad 300 mg/24 se pak nazývají albuminúrie. Stanovení mikroalbuminurie byla zavedena do klinické praxe jako časný ukazatel rozvoje diabetické nefropatie. Později ale bylo prokázáno, že nález mikroalbuminurie má vztah i k riziku kardiovaskulárních komplikací. KAPITOLA 21 Porucha glukózové homeostázy Mezi poruchy glukózové homeostázy patří: inzulinorezistence s hyperinzulinémií, porušená glykémie nalačno, porušená glukózová tolerance, diabetes mellitus (především diabetes 2 typu). Porušená glykémie nalačno je definována jako glykémie v žilní plasmě nalačno v rozmezí 5,7-7,0 mmol/l, diabetes mellitus jako hodnota nad 7,0 mmol/l. Porušená glukózová tolerance je definována jako hodnota glykémie v žilní plasmě po zátěži (orální glukózový toleranční test) v rozmezí 7,8-11,0 mmol/l. Všechny uvedené poruchy mohou vést k poškození cévního endotelu a jsou proto sdruženy se zvýšeným rizikem aterosklerózy a jejích komplikací. 246

247 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - text Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - text Autor: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Recenzent: prof. MUDr. Richard Průša, CSc. KAPITOLA 21 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Laboratornímarkeryaterosklerózy (kromělipidůalipoproteinů) Markery zánětu Ateroskleróza je charakterizována chronickým zánětlivým procesem v cévní stěně a není proto překvapením, že markery zánětu mají vztah i ke komplikacím aterosklerózy. C-reaktivní protein (CRP) CRP je klinický významným proteinem akutní fáze, jehož hladina se zvyšuje především u systémových bakteriálních infekčních a nádorových onemocnění. Pro systémové bakteriální infekce jsou typické hodnoty CRP v desítkách, často i stovkách mg/l. Klinické studie ale prokázaly, že mírně zvýšené hladina CRP v rozmezí 3-10 mg/l je sdružena se zvýšeným rizikem manifestace kardiovaskulárních komplikací. Zvyšuje se především riziko ischemické choroby srdeční, ale také riziko ischemické cévní mozkové příhody i aterosklerózy v jiných lokalizacích. V klinických studiích bylo na velkých souborech prokázáno, že osoby s mírným zvýšením CRP měly zvýšenou morbiditu i mortalitu na kardiovaskulární onemocnění. Tato závislost platí nejen pro osoby doposud zdravé bez kardiovaskulárních komplikací (v primární prevenci), ale i pro nemocné v sekundární prevenci, kteří již nějakou komplikací aterosklerózy v minulosti prodělali. V současné době jsou hodnoty CRP do 3 mg/l považovány za hodnoty fysiologické, hodnoty 3-6 mg jsou ukazatelem mírně zvýšeného rizika a hodnoty 7-10 mg/l pak ukazatelem silně zvýšeného rizika kardiovaskulárních onemocnění. CRP však s největší pravděpodobností není rizikovým faktorem, který aterosklerózu navozuje, ale je pouhým ukazatelem rizika (podobně jako ostatní zánětlivé markery). Hladina CRP je zvýšena u osob s hlavními kausálními rizikovými faktory, jako je kouření, hypertenze, obezita, metabolický syndrom, diabetes mellitus atd. Hladina CRP se snižuje, pokud se podaří např. snížit hladinu cholesterolu, zredukovat hmotnost, navodit regresi diabetes (redukce nadváhy či obezity) atd. Navíc mírné zvýšení CRP neznamená vždy zvýšené riziko kardiovaskulárních komplikací: interpretace výsledku CRP v rozmezí 3-10 mg/l musí být vždy velmi individuální a opatrná, protože jeho mírné zvýšení může být důsledkem jakéhokoliv zánětu v organismu bez vztahu ke kardiovaskulárním onemocněním (chronické onemocnění střeva, plic, kloubů, atd.), nebo důsledkem počínajícího nebo odeznívajícího akutního zánětu. Interleukin 6 (IL-6) IL-6 patří mezi cytokiny, které v játrech stimulují syntézu proteinů akutní fáze, včetně CRP. IL-6 je produkován také v aterosklerotických lezích cévní stěny, především v makrofázích a v buňkách hladké svaloviny. Aktivita zánětu (aterosklerózy) v cévní stěně je tedy spjata se zvýšenou hladinou IL-6 v krvi. V klinických prospektivních studiích, které se zabývaly rizikem kardiovaskulárních onemocnění, bylo prokázáno, že se zvyšující se hladinou IL-6 se zvyšuje také riziko morbidity a mortality na kardiovaskulární onemocnění, především na ischemickou chorobu srdeční. Není však doposud jasné, zda je vztah mezi IL-6 a aterosklerózou kausální, nebo jen zprostředkovaný. Existují pravděpodobně dva mechanismy, kterými může IL-6 ovlivňovat kardiovaskulární 247

248 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - text riziko: a) proces zprostředkovaný dalšími cytokiny a proteiny akutní fáze (CRP, SAA, modifikace lipoproteinů); b) přímý vliv IL-6 na endoteliální buňky. Zvýšenou hladinu IL-6 je však třeba interpretovat (podobně jako u CRP) velmi opatrně, protože u konkrétního pacienta nemusí mít vztah ke kardiovaskulárním komplikacím, ale k jinému zánětlivému onemocnění. Navíc je hladina IL-6 často zvýšena (podobně jako CRP) u nemocných s diabetem, dyslipidémií a u kuřáků. Za fysiologické jsou považovány hodnoty 1,5-7,0 ng/l. Sérový amyloid A (SAA) KAPITOLA 21 SAA je název pro několik proteinů, patřících do rodiny reaktantů akutní fáze. Má však také úzký vztah ke krevním lipoproteinům, především k lipoproteinům o vysoké hustotě (HDL). SAA je s nimi velmi často asociován - je vázán na jejich povrchu, nejčastěji na částicích HDL 3. Při chronickém zánětlivém stavu je SAA vázán na povrch HDL ve zvýšené míře a vytěsňuje z vazby na HDL enzym paraoxonázu-1. Tento enzym zajišťuje antioxidační vlastnosti HDL, které jsou nutné v prevenci rozvoje aterosklerózy. Částice HDL tak pozbývá svých antioxidačních vlastností, stává se částicí dysfunkční a ta může dokonce nabývat i proatherogenní vlastnosti. Zvýšené hladiny SAA bývají často nalézány u osob s obezitou, inzulinorezistencí, metabolickým syndromem a diabetes mellitus. Podle výsledků klinických studií je zvýšení SAA jako markeru kardiovaskulárního rizika souběžné se zvýšením jiného zánětlivého markeru aterosklerózy - CRP. Myeloperoxidáza Enzym (hemoprotein) ze skupiny peroxidáz, produkovaný monocyty a neutrofily v místě zánětu. Při aktivitě zánětlivého procesu v aterosklerotických plátech dochází jejich působením k přeměně původně stabilního plátu na plát nestabilní (vulnerabilní) s rizikem jeho ruptury a nasedající trombózy tepny s uzávěrem jejího průsvitu. Zvýšená aktivita MPO v krvi je tedy známkou rizika nestability aterosklerotických plátů a rizika akutní kardiovaskulární příhody. Markery hemostázy a trombózy Akutní komplikace aterosklerózy (infarkt myokardu, cévní mozková příhoda) většinou vznikají v důsledku nasednutí trombu na aterosklerózou poškozenou cévní stěnu. Z tohoto hlediska je logické, že je intenzivně studován vztah markerů hemostázy a trombózy k ateroskleróze a jejím komplikacím. Kromě níže uvedených faktorů - lipoprotein(a), fibrinogen, faktor VII, inhibitor aktivátoru plazminogenu - se v procesu aterogeneze mohou uplatnit i další koagulační a protrombotické faktory. Lipoprotein(a) [Lp(a)] Lp(a) je v podstatě částicí LDL, na jejímž povrhu je kromě apolipoproteinu B-100 navázána ještě jedna bílkovina - apolipoprotein(a). Apolipoprotein(a) je vysoce homologní s plazminogenem, soutěží s ním o vazebná místa na plazminu, ale neaktivuje ho. Ve vyšších koncentracích tak může blokovat proces fibrinolýzy. Částice Lp(a) navíc není (na rozdíl od částice LDL) katabolizována cestou LDL receptorů. Hladina Lp(a) je většinou geneticky determinována. Často je zvýšená u pacientů s familiární hypercholesterolémií, zvyšuje se však u nemocných s chronickým renálním selháním a s nefrotickým syndromem, u žen v období po menopauze. Za fysiologickou je považována koncentrace do 0,3 (někdy do 0,5) g/l, u části populace je však jeho koncentrace velmi nízká až neměřitelná. Při zvýšené koncentraci Lp(a) je zvýšené riziko uzávěru artérie trombem. Epidemiologické studie prokázaly, že zvýšená koncentrace Lp(a) je nezávislým rizikovým faktorem především pro vznik předčasné ischemické choroby srdeční. Snížení hladiny Lp(a) je velmi obtížné, většina hypolipidemik (statiny, fibráty, pryskyřice, ezetimib) nemá na jeho hladinu prakticky žádný vliv. Jediné hypolipidemikum, které může jeho hladinu snižovat, je niacin (kyselina nikotinová). Stanovení koncentrace Lp(a) zatím není standardizováno - hlavním problémem je existence několik desítek variant řetězce Lp(a) s různou mírou vazebnosti na protilátky, používané v diagnostických soupravách. Imunonefelometricky lze měřit i velmi nízké koncentrace Lp(a). Fibrinogen Fibrinogen patří mezi koagulační faktory: účinkem trombinu je měněn na fibrin, což je klíčový krok při tvorbě krevního koagula. Jeho fysiologická koncentrace v krvi jsou udávány většinou 2-4 g/l, ale podle současných názorů je horní hranice jen asi 3,5 g/l (hladina kolem 4 g/l již může znamenat mírné trombofilní riziko). Epidemiologické studie prokázaly, že zvýšená koncentrace fib- 248

249 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - text rinogenu je rizikovým faktorem pro kardiovaskulární onemocnění především pro ischemickou chorobu srdeční a cévní mozkové příhody, ale i pro periferní formy aterosklerózy. Predikuje riziko vzniku těchto komplikací. Mechanismus, jakým zasahuje do procesu aterogeneze, je stále předmětem diskuse a předpokládá se několik možností: a) zvýšení agregace trombocytů a tím i zvýšení rizika vzniku trombu na AS plátu b) zvýšení viskozity krve c) infiltrace arteriální stěny a stimulace proliferace buněk Jeho hladinu v krvi snížují některá hypolipidemika, především fibráty a kyselina nikotinová. Fibrinogen je sice ukazatelem rizika KVO (podobně jako např. zánětlivé markery), pravděpodobně však není příčinným rizikovým faktorem: snížení jeho koncentrace v krvi v intervenčních studiích nevedlo ke snížení výskytu kardiovaskulárních komplikací. Jeho zvýšená koncentrace je často sdružena s dalšími rizikovými faktory: s kouřením, s diabetes mellitus, s obezitou, metabolickým syndromem a zvyšuje se také při fysické inaktivitě. KAPITOLA 21 Faktor VII Patří mezi koagulační faktory, jeho fysiologická hladina v krvi je obvykle udávána jako % standardní aktivity. Jeho zvýšená koncentrace je sdružena se zvýšeným rizikem vzniku trombu v cévní stěně, poškozené aterosklerotickým plátem. Podle výsledku epidemiologických studií je zvýšená hladina faktoru VII sdružena se zvýšeným rizikem vzniku kardiovaskulárních onemocnění. Zvýšenou koncentraci faktoru VII lze často nalézt (společně se zvýšením PAI-1) u osob s metabolickým syndromem. PAI-1 Název PAI-1 zahrnuje přirozené inhibitory tkáňového aktivátoru plazminogenu. Při zvýšené hladině PAI-1 dochází k poruše fibrinolýzy a PAI 1 je proto považován za rizikový faktor aterosklerózy. Je syntetizován mimo jiné i v cévním endotelu, kde může jeho syntézu zvyšovat hypertriglyceridémie, resp. zvýšení lipoproteinů o velmi nízké hustotě (VLDL). Zvýšený PAI-1 je typicky nalézán (spolu se zvýšeným faktorem VII) u osob s metabolickým syndromem. Jeho zvýšení koreluje i s inzulinémií a jeho syntéza v adipocytech (intraabdominální tuk) může být indukována inzulínem. Pro souvislost zvýšeného PAI-1 s hyperinzulinémií svědčí to, že u diabetiků léčených metforminem hladina PAI-1 klesá. Homocystein Zvýšení hladiny této neesenciální aminokyseliny v krvi se nazývá hyperhomocysteinémie (hhcy). Rozlišuje se mírná hhcy (16-30 μmol/l), středně těžká hhcy ( μmol/l) a těžká hhcy (nad 100 μmol/l). Těžká hhcy je dána geneticky a je provázena výskytem trombóz žilního i tepenného systému, trombembolické nemoci i komplikacemi AS. Její výskyt v populaci je naštěstí vzácný. V souvislosti aterosklerózou je však věnována pozornost především mírné hhcy, která je v populaci poměrně frekventní (prevalence asi 1:70). Je prokázáno, že mírná hhcy je sdružena se zvýšeným rizikem kardiovaskulárních komplikací. U zdravých osob byla prokázána slabá asociace mezi mírnou hhcy a KVO, naproti tomu u nemocných s ischemickou chorobou srdeční, trombembolickou nemocí, diabetes mellitus a s renálním selháním byla mírná hhcy silným prediktorem budoucích kardiovaskulárních příhod. Nejčastější genetickou příčinou mírné hhcy je polymorfismus v genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu, který se manifestuje především při nedostatečném přívodu kyseliny listové v potravě. Hladina homocysteinu se dále zvyšuje v důsledku renálního selhání, kouření, stoupá s věkem a zvyšuje se u žen po menopauze. Vyšší koncentrace homocysteinu bývají časné u nemocných s předčasnou manifestací aterosklerózy. Mechanismus proaterogeního působení homocysteinu není zatím jasný. Předpokládá se jeho přímý vliv na cévní endotel, útlum fibrinolýzy, oxidativní stres (zvýšení tvorby volných radikálů), rozvoj endoteliální dysfunkce s následnou aktivací destiček a tvorbou trombů bohatých na destičky. Hladinu homocysteinu u mírné hhcy lze většinou snadno ovlivnit podáváním vitaminů skupiny B, především pyridoxinu, B12 a kyseliny listové. Homocystein ale s velkou pravděpodobností není kauzálním rizikovým faktorem: prakticky ve všech v klinických intervenčních studiích s podáváním kyseliny listové a vitaminů skupiny B došlo sice ke snížení koncentrace homocysteinu, nemělo to ale žádný vliv na výskyt kardiovaskulárních komplikací. Lp-PLA2 (fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny) Lp-PLA2 je syntetizována převážně v makrofázích (částečně i v T-lymfocytech a hepatocytech), v krvi je pak vázána na lipoproteiny (převážně na LDL, v malé míře i na HDL). Tam katalyzuje přeměnu oxidovaného fosfatidylcholinu na volné mastné kyseliny 249

250 Rizikové faktory aterosklerózy (kromě lipidů) - text a lysofosfatidylcholin. Výsledné produkty pak mohou akcelerovat zánět a aterogenezi. Lysofosfatidylcholin je chemoatraktantem monocytů a T lymfocytů a může aktivovat rozvoj dysfunkce cévního endotelu, indukci exprese endoteliálních adhesivních molekul, proliferaci buněk hladké svaloviny a makrofágů v cévní stěně, expresi PDGF (růstového faktoru odvozeného z trombocytů). Oxidované volné mastné kyseliny jsou chemoatraktantem monocytů, zvyšují expresi adhesivních molekul (VCAM-1) a permeabilitu buněčných membrán. Lp-PLA2 je přítomna také v aterosklerotických plátech, kde jsou jejím zdrojem částice LDL a zánětlivé buňky. Je prokázáno, že zvýšená koncentrace Lp-PLA2 v krvi je asociována se zvýšeným rizikem infarktu myokardu a cévních mozkových příhod. Lp-PLA2 je totiž exprimována především v nestabilních aterosklerotických plátech s tenkým fibrózním krytem a její zvýšená koncentrace v krvi tak ukazuje na riziko ruptury plátu, jejíž důsledkem může být akutní infarkt myokardu nebo cévní mozková příhoda. Asociace mezi zvýšením Lp-PLA2 v krvi a zvýšením rizika kardiovaskulárních onemocnění bylo prokázáno v řadě epidemiologických studií. Výsledky těchto studií svědčí pro to, že zvýšená koncentrace Lp-PLA2 je prediktorem kardiovaskulárního rizika nezávisle na přítomnosti ostatních rizikových faktorů. Hladinu Lp-PLA2 však zvyšuje také kouření, diabetes mellitus, obezita a metabolický syndrom. Za zvýšené jsou považovány koncentrace nad ng/ml. KAPITOLA 21 Mikroalbuminurie Jako mikroalbuminurii nazýváme nález albuminu v moči v rozmezí mg/24 hodin. Toto vyšetření je prováděno především u nemocných s diabetes mellitus, protože je časným ukazatelem rozvoje diabetické nefropatie. Klinické studie ale prokázaly, že mikroalbuminurie je sdružena i s rizikem kardiovaskulárních komplikací, a to nejen u nemocných s diabetes mellitus, ale i u ostatní populace. Přítomnost mikroalbuminurie je proto prediktorem kardiovaskulární morbidity a mortality u diabetiků, hypertoniků i v obecné populaci. Předpokládá se, že je ukazatelem nejen poškození glomerulů, ale v obecné rovině i markerem poškozené cévní permeability, která je přítomna u endoteliální dysfunkce. Dysfunkce cévního endotelu je jedním z klíčových kroků při rozvoji aterosklerotického ložiska. Porucha glukózové homeostázy Prakticky všechny poruchy glukózové homeostázy (inzulinorezistence s hyperinzulinémií, porušená glykémie nalačno, porušená glukózová tolerance, DM 2 typu) jsou rizikovým faktorem pro manifestaci předčasné aterosklerózy a rozvoj kardiovaskulárních komplikací. Kardiovaskulární onemocnění jsou také hlavní příčinou mortality nemocných s diabetes mellitus. Incidence ischemické choroby srdeční je u diabetiků 2 4 krát vyšší, riziko CMP 3 5 x vyšší a riziko ischemické choroby dolních končetin dokonce až 30 krát vyšší než u nediabetiků. Mechanismy, kterými dochází k urychlení aterogeneze, zatím nejsou zcela objasněny. Diabetes mellitus je pravidelně doprovázen dyslipidémií, hypertenzí a obezitou, která je také hlavní příčinou vzniku diabetes mellitus 2. typu. Kromě výše uvedených rizikových faktorů se v akceleraci aterosklerózy uplatňuje celá řada dalších patofysiologických procesů: endotheliální dysfunkce, hyperreaktivita trombocytů, porušení fibrinolytické rovnováhy, poruchy proudění krve, chronický zánět. Trombocyty u nemocných s diabetes melllitus zvýšeně adherují k cévnímu endotelu a mají zvýšenou agregabilitu, k jejich aktivaci přispívá také zvýšená tvorba von Willebrandova faktoru v poškozeném endotelu. Zvýšená je i koncentrace dalších koagulačních faktorů (fibrinogen, faktor VII, VIII, XI, XII, kallikrein) při současné inhibici systému fibrinolýzy (zvýšení PAI-1). Poškozena je permeabilita buněčných membrán. Diabetes mellitus 2. typu je pravidelně provázen dyslipidémií, charakterizovanou přítomností malých částic LDL3, snížením HDL-cholesterolu a zvýšenými triglyceridy. K akceleraci procesu aterosklerózy však dochází již v době před manifestací diabetu, kdy je přítomna hyperinzulinémie a inzulinorezistence: ty iniciují rozvoj dysfunkce cévního endotelu jako prvního kroku v rozvoji aterosklerózy. 250

251 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi Autoři: Prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc.,MBA, prof. MUDr. Marta Kalousová, PhD. Recenzent: MUDr. Daniel Rajdl, PhD. KAPITOLA 22 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Co je oxidační stres Oxidační stres je mechanismus poškození organismu, který se spoluúčastní v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací, např. aterosklerózy, diabetu mellitu, onemocnění ledvin, ischemicko-reperfúzního poškození, neurodegenerativních onemocnění, karcinogenezi či zánětlivých onemocnění. Oxidační stres je definován jako nerovnováha mezi zvýšenou tvorbou oxidantů a nedostatečnými ochrannými antioxidačními mechanismy, vedoucí ke tkáňovému poškození. Oxidanty volné radikály a reaktivní formy kyslíku a dusíku Oxidanty jsou volné radikály a další reaktivní formy kyslíku a dusíku, které s radikálovými reakcemi úzce souvisejí. Volné radikály jsou atomy, molekuly nebo ionty, které obsahují ve valenční sféře jeden nebo více nepárových elektronů. Jsou nestabilní, vysoce reaktivní a mají tendenci k řetězovým reakcím. Významnými oxidanty jsou např. hydroxylový radikál OH, superoxid O 2 -, singletový kyslík 1O 2, peroxid vodíku H 2 O 2, oxid dusnatý NO, kyselina chlorná HClO, peroxylové a alkoxylové radikály ROO a RO atd. Reakce vedoucí ke vzniku oxidantů jsou ukázány na obr

252 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi KAPITOLA 22 Obrázek 22.1 Vznik oxidantů je jejich vzájemné reakce. Nejvýznamnějším zdrojem volných radikálů v organismu je mitochondriální respirační řetězec. Kyslík běžně akceptuje 4 elektrony a je přeměněn na vodu. Tato reakce ovšem probíhá postupně: kyslík superoxid peroxid vodíku hydroxylový radikál voda. Dalším významným producentem oxidantů jsou fagocyty (neutrofily a monocyty-makrofágy), a to jejich NADPH-oxidáza a myeloperoxidáza. Při respiračním vzplanutí (obr. 2), po aktivaci zánětlivými stimuly, NADPH-oxidáza redukuje molekulární kyslík na superoxid a ten je následně konvertován na peroxid vodíku. Tyto látky pak mohou být dalším zdrojem oxidantů oxidu dusnatého, peroxynitritu a hydroxylového radikálu. V přítomnosti chloridových iontů je navíc peroxid vodíku myeloperoxidázou metabolizován na kyselinu chlornou, která může následně reagovat s endogenními aminy za vzniku chloraminů. Volné radikály vznikají také při detoxifikaci xenobiotik a v řadě dalších chemických reakcí reakce katalyzované cytochromem P450, xantinoxidázou, lipoperoxidázou či cyklooxygenázou. Jejich vznik je urychlován přechodnými kovy (železo, měď Fentonova reakce: H 2 O 2 + Fe 2+ HO + OH - + Fe 3+ ). Oxid dusnatý (NO ) vzniká z L-argininu vlivem NO syntázy. Konstitutivní NOS se nachází zejména v endotelu a neuronech, inducibilní NOS zejména v makrofázích. 252

253 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi KAPITOLA 22 Obrázek 22.2 Respirační vzplanutí neutrofiů. Antioxidanty látky působící proti oxidantům Antioxidanty jsou látky, které působí proti vzniku a efektu volných radikálů jako scavangery (lapače) volných radikálů, jako inhibitory vzniku volných radikálů, např. vazbou přechodných kovů, nebo odstraňují hydroperoxidy a reparují poškození. Antioxidanty v lidském organismu je možno rozdělit do dvou skupin: enzymy a jejich kofaktory = stopové prvky (superoxiddismutáza - měď, zinek, mangan; glutathionperoxidáza - selen; kataláza - železo; cytochrom P450, laktoperoxidáza substráty lipofilní (tokoferoly a karotenoidy) a hydrofilní (kyselina askorbová, glutathion, thioly, ceruloplasmin, transferin, ferritin, albumin, bilirubin, kyselina močová a další). Antioxidační vlastnosti má i řada syntetických látek, např. cheláty železa a mědi deferoxamin a penicilamin, inhibitory xantinoxidázy allopurinol a oxypurinol, probukol, lazaroidy, inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu a statiny. Látky vzniklé vlivem oxidačního stresu produkty radikálových reakcí a jejich význam při tkáňovém poškození Vlivem oxidačního stresu dochází k modifikaci biologicky významných látek změně struktury fragmentaci, agregaci, ze- 253

254 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi sítění, změně vlastností - hydrofobicity, náchylnosti k proteolýze, funkci a změně imunologických vlastností. Změny závisejí na chemické podstatě působící látky a na intenzitě ataky. Poškození se týká lipidů, proteinů, sacharidů i nukleových kyselin. V lipidech jsou k radikálovým reakcím nejvíce náchylné mastné kyseliny s více dvojnými vazbami polynenasycené mastné kyseliny a děj se nazývá lipoperoxidace. Postupně dochází k přeuspořádání jejich struktury, vznikají konjugované dieny, peroxylové a alkoxylové radikály a hydroperoxidy a může také dojít ke štěpení modifikované molekuly na kratší produkty a vzniku malondialdehydu či 4-hydroxynonenalu. Poškození se může týkat jak membránových lipidů, tak lipoproteinů. V proteinech jsou poškozovány především aminokyseliny tyrosin, methionin, cystein a tryptofan, může dojít k jejich oxidaci, nitraci, chloraci a vzniku dimerů. Proteiny pak mohou agregovat a síťovat, vznikají tzv. produkty pokročilé oxidace proteinů (AOPP, advanced oxidation protein products). Za přispění sacharidů a též vlivem karbonylového stresu vznikají konečné produkty pokročilé glykace (AGEs, advanced glycation end products). Proteiny mohou být také modifikovány prostřednictvím produktů lipoperoxidace (malondialdehydlyzin, hydroxynonenal a akrolein addukt proteinu) a vznikají tzv. konečné produkty pokročilé lipoperoxidace (ALEs, advanced lipoperoxidation products). Poškození DNA se týká deoxyribózy i bází, jejich následkem jsou zlomy řetězce DNA a křížové vazby řetězců. Poškození biologických struktur a jeho následky je znázorněno na obr KAPITOLA 22 Obrázek 22.3 Následky oxidačního stresu. Oxidační stres úzce souvisí s karbonylovým stresem, který je charakterizován jako zvýšení reaktivních karbonylových sloučenin způsobené jejich sníženou tvorbou a/nebo jejich sníženým odbouráváním a vylučováním. Jde o látky obsahující karbonylovou skupinu, např. glyoxal, methylglyoxal, či produkty lipoperoxidace malondialdehyd a 4-hydroxynonenal. Reaktivní karbonylové sloučeniny mohou vznikat ze sacharidů, lipidů i aminokyselin oxidační i neoxidační cestou a mohou dát vznik ALEs a AGEs. Nejlépe charakterizovány jsou AGEs, heterogenní skupina látek, mezi než patří např. karboxymethyllyzin, pentosidin, glyoxal-lyzindimer či methylglyoxal-lyzindimer, vznikající spontánně neenzymatickou glykací, ale též vlivem oxidačního a karbonylového stresu. Konečné produkty pokročilého poškození oxidačním a karbonylovým stresem (AGEs, ALEs, AOPP) mají kromě poškození 254

255 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi struktury a změny biologických vlastností důležitých látek řadu dalších účinků zprostředkovaných přes specifické receptory, z nichž jako první byl popsán RAGE (receptor pro AGEs, podstatné jsou ale zřejmě AGE-R1, R2 a R3). RAGE je receptor multiligandový, AGEs byly popsány jako 1. ligandy. Na RAGE se váže např. β-amyloid, S100-proteiny/kalgranuliny nebo HMGB1 (high mobility box group protein 1). Interakce ligand s receptorem RAGE spustí signální kaskádu, zahrnující p21ras, MAPK (mitogen activated protein kinases), ERK (extracellular regulated kinases) a JNK (c-jun N-terminal kinase), a dochází k aktivaci NFκB (nukleárního faktoru κb), což je také spojeno s oxidačním stresem. Následuje stimulace transkripce genů pro cytokiny a růstové faktory (TNF, IL-1, PDGF, IGF-1, interferon γ), adhezní molekuly (ICAM-1, VCAM-1), stimulace buněčné proliferace, zvýšení vaskulární permeability, indukce migrace makrofágů atd. Interakce AGE-RAGE a následný oxidační stres a také AGEs přímo působí také poškození DNA. Navíc aktivací RAGE dochází k ovlivnění exprese a aktivy glyoxalázy I, což je enzym detoxifikující prekurzory AGEs methylglyoxal a glyoxal. RAGE hraje roli v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací, jako je diabetes mellitus, ateroskleróza, Alzheimerova choroba, revmatoidní artritida, zánětlivá onemocnění či metastazování nádorů. KAPITOLA 22 Fyziologická a patologická role reaktivních forem kyslíku a dusíku, význam v patogenezi onemocnění Hovoříme-li o oxidačním stresu, je v jeho definici kromě nerovnováhy mezi oxidanty a antioxidanty ve prospěch oxidantů třeba zdůraznit následné poškození organismu, protože oxidanty, tj. volné radikály a další reaktivní formy kyslíku a dusíku, mají řadu významných biologických funkcí v zánětlivé odpovědi, v metabolismu xenobiotik, v regulaci cévního tonu nebo druhých poslů v signální transdukci (Tab. 1). Naopak patologické působení radikálů a produktů radikálových reakcí zahrnuje komplexní poškození biologických struktur, signalizace poškození přes receptory s následným spuštěním řady kaskádovitých reakcí dle buněčného typu - prozánětlivé odpovědi, buněčné proliferace či apoptózy a ovlivnění dalších struktur vzniklými chemickými látkami. Oxidační stres tak hraje roli a spolupůsobí v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací, od onemocnění zánětlivých (sepse, chronická zánětlivá onemocnění), přes onemocnění kardiovaskulární (hypertenze, ateroskleróza, ichemie-reperfuze), přes diabetes mellitus a jeho komplikace, poškození ledvin a jeho následky, onemocnění neurodegenerativní (Alzheimerova choroba, roztroušená skleróza), nádorová onemocnění a jejich léčba či těhotenství a především patologické stavy v těhotenství (preeklampsie) (Tabulka 22.1). Fyziologická role Zánětlivá reakce Respirační vzplanutí fagocytů Patologická role při oxidačním stresu Poškození biologických struktur lipoperoxidace glykoxidace modifikace proteinů modifikace DNA Signální transdukce Intracelulární signalizace - úloha druhého posla 255

256 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi Monooxygenázové reakce hydroxylace steroidů, metabolismus xenobiotik Význam v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací Ateroskleróza diabetes mellitus nemoci ledvin nádorová onemocnění zánětlivá onemocnění neurodegenerativní onemocnění a další KAPITOLA 22 Regulace cévního tonu NO relaxace, superoxid - konstrikce Mediátory NO - neuromodulátor v CNS Tabulka 22.1 Význam reaktivních forem kyslíku a dusíku Laboratorní diagnostika Stanovení volných radikálů v tělních tekutinách je vzhledem k jejich krátkému biologickému poločasu problematické. Vhodnější je proto měření koncentrace látek vzniklých vlivem oxidačního stresu nebo antioxidační ochrany. Stanovení je možné provádět v různém biologickém materiálu - séru, plazmě, moči, plné krvi, krevních elementech či vydechovaném vzduchu. Laboratorní diagnostika musí být vždy komplexní a často již výsledky běžných vyšetření mohou ukazovat na pravděpodobnou přítomnost oxidačního stresu. Laboratorní výsledky je nutno hodnotit individuálně v souvislosti s klinickým stavem nemocného. Laboratorní vyšetřování parametrů oxidačního stresu a antioxidantů se využívá zejména v rámci výzkumu příčiny a průběhu onemocnění, nikoli v běžné klinické praxi. Přímá měření zahrnují stanovení vznikajících radikálů a reaktivních forem kyslíku a dusíku. Patří mezi ně především pulzní radiolýza, elektronová spinová rezonance a chemiluminiscence. Tyto metody se využívají zejména v základním výzkumu a nejsou běžně dostupné. Nepřímá měření stanovují látky vznikající při radikálových reakcích, antioxidanty a autoprotilátky. Je také možné stanovit degradační produkty vznikajícího NO (nitrity, nitráty) či imunochemické stanovení (ELISA) enzymů generujících radikály myeloperoxidázy či xanthinoxidázy. Z hlediska látek vznikajících při radikálových reakcích (klasické markery oxidačního stresu) je možno jich stanovit celou řadu. Lipoperoxidaci charakterizuje např. malondialdehyd, oxidované LDL, nebo 8-isoprostan jako metabolit kyseliny arachidonové. Poškození proteinů můžeme ozřejmit měřením modifikovaných aminokyselin či jako AOPP, pro přispění sacharidů jsou pak typické AGEs nebo srage (solubilní receptor pro AGEs). 8-hydroxy 2 deoxyguanosin je markerem poškození DNA. Metodicky se nejvíce uplatňuje ELISA, vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) a plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (GC/MS). Dostupnější je stanovení vybraných antioxidantů - vitamin A a E (HPLC), stopové prvky, především zinek a selen (atomová absorpční spektrometrie), ale je možné stanovit také aktivitu antioxidačních enzymů či celkovou antioxidační kapacitu spektrofotometricky. Další možností, rovněž spíše výzkumnou, je stanovení autoprotilátek, jejichž tvorba reaguje na modifikaci biologických struktur. V průběhu oxidačního stresu vznikají látky, které jsou imunogenní a organismus proti nim vytváří protilátky. Uplatňuje se tak další systém (imunitní systém), který může být vlivem oxidačního stresu narušen. Příkladem jsou protilátky proti oxidovanému 256

257 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi LDL stanovované metodou ELISA. Molekulárně biologické metody mohou určit genetickou predispozici ke tkáňovému poškození (např. polymorfismu genů pro antioxidační enzymy či enzymy degradující reaktivní karbonylové sloučeniny nebo genů pro receptory zprostředkující tkáňové poškození, např. RAGE receptor pro AGEs). Základní laboratorní vyšetření mohou ukázat různé patologie a signalizovat tak pravděpodobnou přítomnost oxidačního stresu. Rutinně je vyšetřována funkce ledvin a je známo, že oxidační stres je přítomen u pacientů se sníženou funkcí ledvin. Oxidační stres také významně souvisí se zánětlivou reakcí (ukazatelé např. C-reaktivní protein, orosomukoid) a procesem aterogeneze (modifikované LDL částice, myeloperoxidáza). Vyšší glykémie či hladina lipidů znamenají více substrátů pro tvorbu reaktivních karbonylových sloučenin. Na druhou stranu albumin a bilirubin (vyšší hodnoty bez postižení jater, např. Gilbertův syndrom), ale i glukóza působí antioxidačně. V erytrocytech je obsažen další významný antioxidant, glutathion, a při anémii tedy předpokládáme jeho celkové snížení. Vybraná vyšetření pro ozřejmení oxidačního stresu jsou shrnuta v Tab Uvedené metody popisují jednotlivé reakce či procesy které v lidském organismu probíhají při oxidačním stresu. Jednotlivé analyty je třeba dávat do vzájemných vztahů a následně vyhodnocovat stupeň poškození organismu oxidačním stresem.. KAPITOLA 22 Skupina vyšetření Přímá měření stanovení vznikajících radikálů Parametry Pulzní radiolýza, elektronová spinová rezonance, chemiluminiscence Markery poškození oxidačním stresem Antioxidanty Autoprotilátky Molekulárně biologické metody Základní laboratorní vyšetření Lipoperoxidace malondialdehyd, konjugované dieny, oxldl, ALEs, 8-izoprostan Oxidace aminokyselin a proteinů modifikované aminokyseliny (3-chlorotyrosin, 3-nitrotyrosin, dichlorotyrosin), AOPP Glykoxidace AGEs, srage Oxidační poškození DNA - 8-hydroxy 2 deoxyguanosin Degradační produkty vznikajícího NO (nitrity, nitráty) Enzymy generující radikály xanthinoxidáza, myeloperoxidáza Vitaminy A a E stopové prvky Se, Zn albumin, bilirubin glukóza, kyselina močová antioxidační enzymy superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza, kataláza celková antioxidační kapacita Protilátky proti oxidovanému LDL polymorfismus genů pro antioxidační enzymy a enzymy degradující reaktivní karbonylové sloučeniny nebo genů pro receptory zprostředkující tkáňové poškození, např. RAGE receptor pro AGEs Funkce ledvin odhad glomerulární filtrace, sérový kreatinin C-reaktivní protein, albumin, glykémie, HbA 1c, mikroalbuminurie, lipidy, bilirubin, krevní obraz Tabulka 22.3 Vybraná vyšetření pro ozřejmení oxidačního stresu 257

258 Volné radikály, vztah k nemocem a ochrana před nimi Terapeutické možnosti ovlivnění V současné době neexistují jednotná doporučení pro terapii oxidačního stresu. V řadě studiích byl ovšem ukázán pozitivní efekt podávání některých antioxidantů a také je známo, že některé léky, které jsou často podávány v jiné indikaci, mají antioxidační vlastnosti (inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu, blokátory AT 1 receptoru pro angiotenzin II či statiny). Při terapii musíme vždy myslet na fyziologickou rovnováhu mezi oxidanty antioxidanty a možné nežádoucí účinky, např. že některé antixodanty mohou mít také prooxidační účinky. Podávání antioxidantů není v současné době součástí doporučení k léčbě či prevenci onemocnění vyjma několika vzácných onemocnění. Nevhodné podávání antioxidantů (např. beta-karoten u kuřáků) může naopak vést i k poškození organismu. Antioxidanty se podávají jako podpůrná či doplňková terapie nikoliv kauzální léčba. KAPITOLA 22 Literatura 1. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods Enzymol 1990, 186, Himmelfarb J., Stenvinkel P., Ikizler T.A., Hakim R.M. The elephant in uremia: Oxidative stress as a unifying concept of cardiovascular disease in uremia. Kidney Int 2002, 62, Kalousová M., Zima T. Nové biomarkery v nefrologii. In: Pokroky v oboru nefrologie. 2008, 2, 2, Sies H. Oxidants and antioxidants. Exp Physiol 1997, 82, Štípek S. Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing Praha s. 6. Zima T., Kalousová M. Reaktivní formy kyslíku a dusíku a antioxidační systémy. In: Zima T. Laboratorní diagnostika. 2.doplněné a přepracované vydání. Galén Karolinum Praha 2007, 906 s., s

259 Laboratorní markery onemocnění jater - příprava Laboratornímarkeryonemocněníjater-příprava Autor: Vítek L, Jirsa M Poškození jaterní tkáně je velmi častou situací v medicínské praxi a laboratorní vyšetřování jaterních funkcí patří mezi základní vyšetřovací postupy ve většině lékařských oborů. Laboratorní diagnostika v hepatologii však dnes již zdaleka není založena jen na biochemických vyšetřeních, ale patří sem i analýzy hematologické, sérologické, imunologické a molekulárně genetické. Mezi základní biochemická vyšetření indikovaná u nemocných s podezřením na nemoci jater patří následující analyty. KAPITOLA 23 Bilirubin a urobilinogen Za fyziologických okolností je celkový bilirubin v krvi reprezentován převážně nekonjugo vaným (nepřímým) bilirubinem (Obr. 23.1a, b). Dělení bilirubinu na přímý tj. konjugovaný a nepřímý tj. nekonjugovaný bilirubin pochází od Van den Bergha, který aplikoval Ehrlichovu diazo reakci důkazu bilirubinu v moči na stanovení bilirubinu ve žluči a v krvi. Při Van den Berghově reakci poskytuje nekonjugovaný i konjugovaný bilirubin s diazotovanou kyselinou sulfanilovou za přítomnosti methanolu červenofialovou azosloučeninu. Bez přítomnosti metanolu (obecněji akcelerátoru, dnes se namísto metanolu používá směs kofeinu a benzoátu v acetátovém pufru) dává přímou diazoreakci pouze bilirubin konjugovaný (Obr. 23.1c). Konjugovaným bilirubinem rozumíme v klinické biochemii především bilirubin konjugovaný s alespoň jednou molekulou (většinou však se dvěma molekulami) kyseliny glukuronové. V moči se může vyskytovat pouze konjugovaný bilirubin, který není vázaný na sérové bílkoviny. Obr. 23.1: Chemická struktura jednotlivých typů bilirubinu. A - strukturní vzorec nekonjugovaného bilirubinu. B - konformační vzorec nekonjugovaného bilirubinu. Konformace 4Z,15Z (tj. cis na dvojné vazbě obou methenylových můstků) fixovaná intramolekulárními vodíkovými vazbami brání napadení uhlíků č. 9 a 11 diazotovanou kyselinou sulfanilovou. Důsledkem je malá reaktivita při přímé diazoreakci. C bilirubin bisglukosiduronát. M = methyl, V= vinyl. D delta bilirubin. Přímou diazoreakci dávají i jiné konjugáty bilirubinu s polárními sloučeninami. Klinický význam má tzv. delta bilirubin (Obr. 23.1d), který vzniká spontánní záměnou kyseliny glukuronové vázané labilní glykosidickou vazbou za stabilní vazbu peptidickou. Donorem aminoskupiny jsou bazické aminokyseliny plazmatických proteinů, zejména albuminu. Delta bilirubin se vyskytuje pouze v plazmě. Dává sice přímou diazoreakci, avšak není vylučován do moči a má poločas blízký poločasu albuminu. Vysky- 259

260 Laboratorní markery onemocnění jater - příprava tuje se u nemocných s obstrukčním ikterem a je zodpovědný za diskrepantní nález pozitivity přímého bilirubinu v krevním séru při negativitě v moči. Naopak hemato encefalickou bariérou prostupuje jedině nekonjugovaný bilirubin, respektive jeho frakce nenavázaná na plazmatické bílkoviny. Při těžké nekonjugované hyperbilirubinémii u novorozenců, přesahující obvykle 340 μmol/l, tak může dojít během několika týdnů po narození k rozvoji akutní bilirubinové encefalopatie vedoucí až k úmrtí novorozence, nebo v pozdějším období ke vzniku klasického jádrového ikteru (kernikterus) s akumulací bilirubinu v bazálních gangliích mozku a v mozečku v rámci tzv. bilirubinem indukované neurologické dysfunkce (tzv. BIND), která se ovšem může manifestovat i mírnějšími příznaky. Nekonjugovaný bilirubin vzniká dvoustupňovou degradací hemu pocházejícího především z odbourávaných erytrocytů a zárodečných buněk červené krevní řady a z jaterních cytochromů. Hem je oxidován hemoxygenázou na biliverdin, následuje redukce na bilirubin katalyzovaná biliverdinreduktázou. Nekonjugovaný bilirubin je v játrech uvolněn z vazby na albumin a kombinací difuze a aktivního transportu vstupuje do cytosolu hepatocytů, kde je navázán na cytosolové proteiny (Obr. 24.1). Z cytosolu přestupuje do hladkého endoplazmatického retikula, kde je konjugován se dvěma molekulami kyseliny glukuronové za katalýzy bilirubin UDP glukuronosyltransferázy (UGT1A1). Konjugovaný ve vodě rozpustný bilirubin přestupuje do cytosolu, odkud je exportován do žluče prostřednictvím multispecifického transportéru pro organické anionty (cmoat/mrp2/abcc2) (Obr. 24.1). Část konjugovaného bilirubinu se vrací do krevní plazmy prostřednictvím transportéru MRP3. Konjugace a sekrece konjugovaného bilirubinu do plazmy probíhá i v enterocytech. Konjugovaný bilirubin je z portální krve vychytáván především centrizonálními hepatocyty prostřednictvím dvojice transportérů OATP1B1 a OATP1B3. Ve střevním lumen dochází působením bakteriální střevní flóry k dekonjugaci a redukci na urobilinoidy, z nichž nejznámější je urobilinogen a sterkobilinogen, s následnou oxidací na urobilin, respektive sterkobilin propůjčující stolici charakteristickou barvu. Redukce spočívající v hydrogenaci dvojných vazeb methenylových můstků a postranních řetězců tetrapyrolové molekuly. Nekonjugovaný bilirubin prodělává za určitých okolností enterohepatální cyklus podobně jako urobilinogen. Urobilinogen však na rozdíl od bilirubinu nemá rigidní strukturu, je polárnější a u některých typů žloutenek může být zvýšeně vylučován močí. Za fyziologických podmínek se urobilinogen prakticky nedostává do systémového oběhu a je téměř kompletně resekretován do žluče. Při významnější portální hypertenzi se však významná frakce urobilinogenu dostává i do systémové cirkulace. Odtud je urobilinogen vylučován ledvinami do moči. Výpovědní hodnota urobilinogenu v moči je však malá nebot jeho koncentrace je ovlivněna celou řadou faktorů, jako jsou například stav střevní mikroflóry, ph moči či přítomnost interferujících látek v moči (porfobilinogen, sulfonamidy aj.). KAPITOLA 23 Aminotransferázy Aspartátaminotransferáza (AST) a alaninaminotransferáza (ALT) jsou nejčastěji používanými enzymy indikujícími hepatocelulární poškození. Oba enzymy katalyzují transaminační reakce, při kterých dochází k přenosu aminoskupiny z aminokyselin aspartátu, respektive alaninu, na ketokyselinu 2-oxoglutarát. Zatímco ALT je primárně lokalizovaná v játrech, AST je přítomna v řadě tkání, jako jsou srdce, kosterní svaly, ledviny, mozek, játra, pankreas či erytrocyty. AST se vyskytuje ve dvou izoformách, mitochondriální a cytosolové, ALT je přítomna pouze v cytosolu. Proto elevace AST je prognosticky závažnější než zvýšení aktivity ALT a signalizuje nekrózu buněk. Alkalická fosfatáza (ALP) ALP je enzym s nízkou substrátovou specificitou patřící do skupiny hydroláz katalyzující hydrolýzu fosfátových esterů v alkalickém prostředí. Celková aktivita ALP v séru je dána součtem aktivit několika izoenzymů, mezi něž patří izoformy jaterní, kostní, střevní a placentární. Jaterní izoenzym ALP slouží spolu s GGT jako marker cholestatických jaterních lézí. U zdravých osob je převážná část ALP v séru tvořena kostní a jaterní komponentou. V graviditě se významně zvyšuje aktivita placentární složky. Gama-glutamyltransferáza Gama-glutamyltransferáza (GGT, nikoli široce užívaná zkratka GMT, která označuje enzym glycin-sarkosin N-metyltransferázu) 260

261 Laboratorní markery onemocnění jater - příprava je enzym katalyzující přenos g-glutamylové skupiny; hraje důležitou roli v g-glutamylovém cyklu a metabolismu glutathionu. GGT je přítomna v membránách mnoha tkání s exkretorickou nebo absorpční funkcí, především ledvin, pankreatu, jater, ale také sleziny, srdce a mozku. Vyskytuje se také v prostatě, seminálních váčcích, což vysvětluje vyšší aktivitu GGT u mužů. GGT je přítomna také v placentě, což je příčinou vyšších aktivit GGT u novorozenců. V játrech je přítomna ve žlučových cestách, hepa tocytech, ve tkáni pankreatických vývodů, nejvyšší koncentrace je v epiteliálních buňkách žlučovodů. Existuje však také v induktibilní mikrosomální izoformě, která nabývá na klinickém významu zejména při abusu alkoholu. Zvýšení aktivit ALP i GGT v krevním séru při cholestáze je dáno dvěma faktory. Zaprvé detergentním účinkem žlučových kyselin akumulovaných ve žlučových cestách během cholestázy na bílkoviny asociované s buněčnými membránami, a dále otevřením těsných spojení mezi hepatocyty při přetlaku ve žlučových cestách vedoucích k paracelulárnímu úniku látek obsažených ve žluči do sinusoidálních prostor. KAPITOLA 23 Albumin Albumin je nejvýznamnější a nejhojnější bílkovinou krevního séra s celou řadou biologických funkcí. Udržuje onkotický tlak, zajišťuje transport mnoha nepolárních endogenních látek a xenobiotik, uplatňuje se v homeostáze acidobazické rovnováhy. Je významným markerem proteosyntetické funkce jaterní tkáně. Koagulační faktory V játrech je syntetizována řada koagulačních faktorů faktor I, II, V, VII, IX a X, z nichž většina je závislá na vitaminu K. Hodnocení koagulačních testů je proto významným markerem protosyntetických funkcí jater, k ovlivnění jejich syntézy však dochází i u cholestatických jaterních lézí. Žlučové kyseliny Žlučové kyseliny vznikají v játrech z cholesterolu. Uplatňují se zejména v trávení tuků, tvorbou micel významně zvyšují solubilizaci nepolárních žlučových lipidů, mají dokonce i důležité účinky na energetický metabolismus. Podléhají enterohepatální cirkulaci. Jejich hladiny v krevním séru jsou ovlivňovány řadou faktorů, včetně stavu střevní mikroflóry, portální hypertenzí, nebo poruchami energetického metabolismu jaterních buněk. I přes relativně jednoduchý způsob stanovení není jejich diagnostický potenciál správně využíván. Amoniak Amoniak (NH3) je produktem metabolismu aminokyselin a odráží úroveň syntézy urey v játrech (tzv. Krebs-Hesenleitův močovinový cyklus). Dalším zdrojem amoniaku v organismu je činnost ureáz a proteáz bakteriálního původu působících na střevní obsah. Diagnostické využití amoniaku je limitováno řadou preanalytických omezení. Metabolismus železa Železo, podobně jako měď jsou významnými stopovými prvky nezbytnými pro organismus. Při poruše jejich metabolismu vedoucí k akumulaci těchto kovů v organismu může dojít k ireverzibilnímu poškození jaterní tkáně, proto do diferenciální diagnostiky nemocí jater vždy patří i vyšetření na tyto nejčastější metabolické poruchy. K akumulaci železa vede onemocnění nazývané hemochromatóza. Příčinou primární hemochromatózy jsou mutace v řadě genů 261

262 Laboratorní markery onemocnění jater - příprava ovlivňujících metabolismus železa (HFE, hepcidin, hemojuvelin, transferinový receptor 2, ferroportin), které vedou k hromadění železa v organismu. K manifestaci příznaků onemocnění dochází k vyčerpání skladovací kapacity v orgánech, kde dochází k akumulaci. O sekundární hemochromatíoze hovoříme u klinických situacích doprovázených zvýšeným uvolňováním železa do systémové cirkulace (chronické hemolytické anémie, syndromy inefektivní erytropoézy, opakované krevní transfúze). Metabolismus mědi KAPITOLA 23 Nejvýznamnější poruchou metabolismu mědi Wilsonova nemoc (hepatolentikulární degenerace), jejímž podkladem je defekt genu ATP7B, jehož produkt je zodpovědný za biliární sekreci mědi. Mutace tohoto genu vedou k porušenému vylučování mědi do žluči a její akumulací v organismu, včetně jaterního parenchymu. K její manifestaci dochází opět po překročení skladovací kapacity v jednotlivých orgánech. Metabolismus porfyrinů Poruchy biosyntézy hemu jsou další významnou skupinou metabolických poruch, na které je nutno myslet v diferenciální diagnostice nemocí jater. Jedná se o heterogenní skupinu onemocnění, které se z klinického pohledu rozdělují na porfyrie akutní a chronické. Mezi nejběžnější příznaky akutních porfyrií patří ataky bolestí břicha napodobující náhlé příhody břišní, ataky neurologických nebo psychiatrických příznaků. Častá bývá fotosenzitivita. Mezi příznaky chronických porfyrií patří jaterní léze spolu s kožními příznaky způsobenými opět fotosenzitizujícím účinkem porfyrinů akumulovaných v kožních kapilárách. 262

263 Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text Klinickobiochemickávyšetřeníuonemocněníjater - text Autor: Prof. MUDr. Libor Vítek, PhD., Doc. MUDr. Milan Jirsa CSc. Recenzenti: MUDr. Milan Dastych KAPITOLA 23 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko V průběhu let se vytvořil standardní soubor biochemických vyšetření označovaných někdy jako jaterní testy nebo jaterní funkční testy, ačkoli se nejedná o funkční jaterní testy v pravém slova smyslu, ale spíše o markery nahrazující specifická funkční vyšetření jater. Biochemické testy můžeme rozdělit do několika skupin podle různých hledisek (viz následující tabulka): Testy odrážející integritu hepatocytů Testy odrážející poruchy na úrovni žlučovodů a kanalikulárního pólu jaterní buňky Testy měřící syntetickou činnost jater Testy měřící kapacitu jater transportovat organické aniony a odstraňovat endogenní a exogenní látky z cirkulace Testy měřící schopnost a kapacitu jater metabolizovat xenobiotika nebo endogenní látky Laboratorní vyšetření umožňující diagnózu specifických jaterních chorob ALT, AST ALP, GGT albumin, prealbumin, cholinesteráza, prothrombinový komplex/koagulační faktory bilirubin, žlučové kyseliny amoniak, CDT, lidokain, aminopyrin virové hepatitidy, hemochromatóza, Wilsonova nemoc, porfyrie, autoimunní jaterní nemoci, aj. Testy odrážející integritu hepatocytů: Aspartátaminotransferáza (AST) a alaninaminotransferáza (ALT) Sérové aktivity AST a ALT jsou zvýšeny u většiny jaterních chorob. S nejvyššími hodnotami se setkáváme u fulminantně probíhajících virových hepatitid, polékového a toxického poškození jater a u cirkulačního šoku. Velikost zvýšení odráží rozsah jaterního poškození, ale nekoreluje s prognózou. Pokles hodnot může odrážet jak ústup onemocnění, tak velmi masivní nekrózu. Poměr AST/ALT (de Ritisův index) je přínosný především u alkoholového poškození jater, kdy bývá vyšší než 2. Aktivita obou enzymů je ovlivňována řadou okolností, existuje korelace mezi tělesnou hmotností a aktivitou AST a ALT u silně obézních jsou hodnoty obou enzymů až o 40 % vyšší, nejčastěji v důsledku rozvoje nealkoholové steatohepatitidy (NASH). S tím souvisí i fakt, že asymptomatická elevace aktivit aminotransferáz koreluje také s celkovou mortalitou, podobně jako je tomu u zvýšené aktivity GGT (viz dále). Přitom asymptomatická elevace aktivit aminotransferáz má vysokou prevalenci, uvádí se, že postiženo je 10-20% celkové populace, právě v důsledku alkoholového poškození a/nebo nealkoholového ztukovatění jater. Testy odrážející poruchy na úrovni žlučovodů a kanalikulárního pólu jaterní buňky a. Alkalická fosfatáza (ALP) U jaterních onemocnění se s nejvyššími hodnotami setkáváme při cholestatických onemocněních. Je to způsobeno lokalizací ALP 263

264 Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text (ale i GGT) na kanalikulárním pólu hepatocytu a v apikální membráně epitelu žlučových cest. Aktivita ALP se zvyšuje při extrahepatální i intrahepatální cholestáze, někteří nemocní se zhoubnými nádory mají zvýšenou aktivitu ALP v důsledku ektopické produkce ALP v maligní tkáni (Reganův izoenzym). Mezi další mimojaterní příčiny elevace aktivity ALP patří většina kostních chorob, některá revmatologická onemocnění, vaskulitidy, hyperparathyreóza, hyperthyreóza, či akromegalie. b. Gama-glutamyltransferáza (GGT) GGT patří mezi nespecifické markery cholestázy, zvyšuje se však i po podání některých léků a při abusu alkoholu v důsledku indukce mikrosomální izoformy. Poločas elevace hodnoty GGT po přerušení konzumace alkoholu je dlouhý (26 dnů). V tomto případě je k potvrzení abusu alkoholu velmi vhodná kombinace stanovení aktivity GGT a hladiny karbohydrát deficientního transferinu (CDT), což je transferin, který nemá v postranním řetězci obvyklou sacharidovou komponentu. Glykosylace transferinu probíhá posttranslačně a je negativně ovlivňována abusem etanolu. Při onemocněních jater koreluje hodnota GGT s hodnotou ALP. Je považovaná za citlivější test hepatobiliárního onemocnění než ALP. Diagnostická cena GGT je limitována nízkou orgánovou specifitou - aktivita GGT stoupá i u celé řady mimojaterních chorob srdečního infarktu, renální insuficience, obstrukční choroby bronchopulmonální, diabetu, nebo u onemocnění pan kreatu. Také výrazná nadváha může zvyšovat hodnoty GGT až o 50%, není tedy překvapením, že vyšší aktivita GGT je asociovaná s vyšší kardiovaskulární morbiditou a mortalitou. KAPITOLA 23 Testy měřící syntetickou činnost jater Játra syntetizují prakticky všechny plazmatické proteiny s výjimkou imunoglobulinů. Měření jejich hodnot v séru umožňuje hrubý odhad jaterní syntetické kapacity. a. Albumin Albumin je kvantitativně nejvýznamnějším sérovým proteinem syntetizovaným v játrech. Poločas albuminu je dnů a proto albumin není vhodným parametrem pro posouzení proteinové syntézy u akutních jaterních chorob. Sérová hladina albuminu není ovlivňována pouze jeho syntézou, ale i nutričním stavem, ale i distribučním prostorem a jeho katabolismem. Sérový albumin je typicky snížený u nemocných s alkoholickou jaterní cirhózou a ascitem. Dalšími možnými příčinami poklesu je nefrotický syndrom, protein ztrácející enteropatie, popáleniny, katabolické stavy, léčba kortikosteroidy. Sérová hladina velmi dobře koreluje s prognózou, a proto je i jedním z kritérií Childova-Pughova skóre. U nemocných s ascitem může být sérová hladina významně snížena únikem albuminu do peritoneální dutiny. Vzestup hladiny albuminu je typický pro hemokoncentraci při dehydrataci a při terapii diuretiky. b. Prealbumin Prealbumin má poločas pouze 1,9 dne, proto se jeho hladina používá pro hodnocení stavu proteosyntézy jaterním parenchymem u akutních jaterních lézí. c. Změny γ-globulinů Polyklonální gamapatie je standardním nálezem u nemocných s jaterní cirhózou. Vzestup jednotlivých skupin gama-globulinů je typický pro některá jaterní onemocnění, vzestup IgM pro primární biliární cirhózu, IgG pro autoimunitní a kryptogenní jaterní cirhózu, IgA pro alkoholickou cirhózu. d. Koagulační faktory V játrech je syntetizována řada koagulačních faktorů faktor I (fibrinogen), II (protrombin), V, VII, IX a X. Syntéza koagulačních faktorů II, VII, IX a X je závislá na vitaminu K. Většina těchto faktorů v séru je v nadbytku a k poklesu dochází až při významné poruše jaterní proteosyntetické funkce. U jaterních chorob dochází ke koagulačním poruchám často, nejčastěji v důsledku poruch proteosyntetických funkcí jaterního parenchymu, nebo při cholestatických jaterních lézí, kdy je narušeno vstřebávání vitaminů rozpustných v tucích, včetně vitaminu K. 264

265 Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text K hodnocení stavu syntézy koagulačních faktorů tvořených játry užíváme nejčastěji stanovení protrombinového času (Quickův test), který zachycuje aktivitu zevního koagulačního systému měřením konverze pro trombinu na trombin v přítomnosti Ca2+ iontů a tkáňového tromboplastinu. Vzhledem ke krátkému poločasu protrombinu odráží změny velmi rychle a citlivě. Proto je významným vyšetřením především u akutních jaterních stavů nebo progrese chronického jaterního onemocnění do jaterního selhání. Výsledek vyšetření je udáván nejčastěji jako INR (International Normalized Ratio), což je poměr vyšetřovaného ku kontrolnímu protrombinového času. Za normální hodnoty je považováno rozmezí 0,75-1,25, hodnoty INR nad 1,5 jsou provázeny zvýšeným rizikem krvácení. Protrombinový čas je jednou z komponent posuzování funkční zdatnosti jater podle Childa-Pugha. KAPITOLA 23 Analyty měřící transportní a exkreční kapacitu jater a., b. Bilirubin a urobilinogen - viz kapitola 24 c. Žlučové kyseliny Stanovení sérových žlučových kyselin je senzitivním testem cholestatické jaterní léze. Pacienti s cholestatickými jaterními lézemi jsou často léčeni kyselinou ursodeoxycholovou, tato léčba musí být vysazena minimálně týden před plánovaným odběrem krve na stanovení žlučových kyselin. S nejvyššími hodnotami se setkáváme u primární biliární cirhózy, primární sklerozující cholangoitidy a u vrozených defektů v biosyntetické dráze žlučových kyselin nebo transportu žlučových pigmentů jaterní buňkou. Velký význam má stanovení žlučových kyselin v séru u žen s podezřením na intrahepatální cholestázu těhotných, u kterých již relativně malé zvýšení hladin žlučových kyselin (nad 40 μmol/l, při normálních hodnotách do 7 μmol/l) ohrožuje plod kardiodepresívními účinky. Testy měřící schopnost a kapacitu jater metabolizovat endogenní i xenogenní látky a. Amoniak U jaterních chorob se setkáváme se vzestupem hodnot především ve fázi jaterní insuficience. Vysoké hodnoty jsou přítomny rovněž při deficitu enzymů ureázového cyklu, při Reyově syndromu a při akutní i chronické jaterní encefalopatii a dále při krvácení do zažívacího traktu doprovázeného zvýšením produkce amoniaku střevní mikroflórou. Stanovení amoniaku má řadu preanalytických omezení. Korelace je lepší při odběru arteriální než venózní krve. Plazma musí být oddělena od erytrocytů do 1 hodiny, u nemocných s cirhózou je ideální separace do 15 minut. b. Karbohydrát deficientní transferin viz výše c. Dynamické testy Jedná se o testy měřící kapacitu jater metabolizovat cizorodé látky. Využívá se netoxických látek, které jsou metabolizovány pouze játry. Většina těchto látek je metabolizována mikrosomálními enzymy a proto provedené testy dobře charakterizují jaterní mikrosomální funkce. Nejznámější jsou antipyrinový a aminopyrinový dechový test s přímým měřením metabolizované látky nebo při použití substrátu značeného stabilním izotopem 13C s měřením vydechovaného značeného CO2. Přes jejich poměrně vysokou diagnostickou hodnotu se v klinické praxi příliš neuplatňují, zejména pro náročnost stanovení stabilních izotopů ve vydechovaném vzduchu. K dispozici jsou stále ještě chromoexkreční testy, které jsou však zatíženy potenciálním rizikem závažných anafylaktických reakcí. 265

266 Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text Laboratornívyšetřeníumožňujícídiagnózuspecifickýchjaterních chorob a. Laboratorní vyšetření při podezření na hemochromatózu KAPITOLA Saturace transferinu: fyziologické rozmezí 19-49%, pro hemochromatózu svědčí více než 60% u mužů, 50% u žen, 2. Plazmatické/sérové železo: fyziologické rozmezí 6-29 µmol/l, pro hemochromatózu svědčí hodnoty >30 µmol/l, 3. Feritin v séru: fyziologické rozmezí µg/l, pro hemochromatózu svědčí obvykle hodnoty vyšší než 1000 mg/l, 4. Železo v jaterní sušině: fyziologické rozmezí µg/g sušiny, pro hemochromatózu svědčí >2000 µg/g sušiny, 5. Genetické vyšetření: změna na krátkém raménku 6. chromosomu, u 80 % postižených homozygotní mutace C282Y nebo heterozygotní C282Y v kombinaci s H63D. b. Laboratorní vyšetření při podezření na Wilsonovu nemoc 1. Ceruloplazmin v séru: fyziologické rozmezí 0,2-0,6 g/l, pro Wilsonovu nemoc svědčí hladiny pod 0,2 g/l, toto snížení je přítomno u 90 % postižených, 2. Hladina mědi v séru: fyziologické rozmezí µmol/l, pro Wilsonovu nemoc svědčí hladiny > 24 µmol/l, mohou však být i v normě, 3. Volná měď v séru: fyziologické rozmezí 0-1,6 µmol/l, pro Wilsonovu nemoc svědčí zvýšení frakce nad 2,0 µmol/l, 4. vylučování mědi močí: fyziologické rozmezí 0,03-1,26 µmol/l, pro Wilsonovu nemoc svědčí zvýšení nad 1,5 µmol/l, k dispozici je i zátěžový penicilaminový test, 5. Měď v jaterní sušině: fyziologické rozmezí do 50 µg/g suché jaterní tkáně, u nemocných s Wilsonovou chorobou je pozitivním nálezem zvýšení nad 250 µg/g jaterní tkáně, vyšší hodnoty však nacházíme u cholestázy jakékoli etiologie, 6. Genetické vyšetření: nejčastější mutace H1069Q přítomna u 40 50% vyšetřených. c. Laboratorní vyšetření při podezření na porfyrickou nemoc Porfyrie řadíme do skupiny poruch biosyntézy hemu, jejichž charakteristickým rysem je značná rozmanitost klinického obrazu. Z klinického pohledu je dělíme na porfyrie akutní a chronické. Nejčastější chronickou porfyrií je v České republice porfyria cutanea tarda (PCT), nejčastější akutní porfyrií je akutní intermitentní porfyrie (AIP). 1. Stanovení porfobilinogenu v čerstvé ranní moči Význam: marker ataky akutní porfyrie, citlivější než kyselina δ-aminolevulová (ALA), Referenční rozmezí: <0,25 mg/dl 2. Stanovení kyseliny d-aminolevulové v čerstvé ranní moči Význam: Podobně jako PBG je i ALA markerem ataky akutní porfyrie. Stanovení ALA v moči je důležité i pro diagnostiku otravy olovem (olovo reverzibilně inhibuje enzym ALA-dehydratázu) a porfyrie z vrozeného deficitu ALA-dehydratázy (nesprávně plumboporfyrie). Referenční rozmezí: <0,45 mg/dl Vyšetření obou analytů se provádí z 10 ml čerstvé moči. Porfobilinogen (PBG) i ALA jsou citlivé na světlo, teplo, dobu skladování a výkyvy ph. Stanovení PBG má méně interferencí než ALA. 3. Stanovení celkových porfyrinů ve sbírané moči a ve stolici Význam: Odpad celkových porfyrinů močí je markerem akutní i chronické porfyrické choroby, stejně tak jako tzv. sekundární koproporfyrinurie (typicky v rozmezí µg/24 hodin. Referenční rozmezí: <200 µg/24 hodin. Podobně se stanovují i celkové porfyriny ve stolici (ze vzorku cca 5 g stolice). 266

267 Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text Referenční rozmezí: <200 ng/g sušiny. Existuje i soubor metod speciálních, které jsou v ČR k dispozici v Hepatologické laboratoři UKBLD VFN a 1. LF UK v Praze (pracoviště autora - LV). Mezi tyto metody řadíme stanovení emisního maxima plazmatických porfyrinů, frakcionaci porfyrinů v moči a ve stolici, vyšetření aktivit některých enzymů biosyntetické dráhy hemu, eventuálně molekulární diagnostika (zajišťována v ČR pracovištěm prof. Martáska na Klinice dětského a dorostového lékařství 1. LF UK v Praze). KAPITOLA 23 d. Laboratorní vyšetření při podezření na hepatocelulární karcinom α 1 -fetoprotein (AFP) Jedná se o glykoprotein syntetizovaný ve žloutkovém váčku, fetálních játrech a ve zhoubných epiteliálních nádorech jater. Jeho zvýšení doprovází hepatocelulární karcinom, ale i embryonální karcinomy, germinální tumory, rozštěpy nervové ploténky. e. Sérologická laboratorní vyšetření u jaterních chorob Sérologická vyšetření v hepatologii hrají největší roli v diagnostice virových hepatitid. Ty dnes představují jednu z hlavních příčin akutního i chronického onemocnění jater. Diagnostika je dnes opřena o kombinaci sérologických a molekulárně genetických metod. Hepatitida A Diagnóza se opírá o přítomnost protilátek proti viru hepatitidy A (antihav) ve třídě IgM = akutní hepatitida A ve třídě IgG (anamnestické protilátky) = prodělaná hepatitida A, očkování proti HAV Hepatitida B Akutní hepatitida B diagnózu akutní hepatitidy B je možné provést na základě serologických nálezů jen při znalosti základních anamnestických údajů, neboť serologické nálezy mohou být v určitých fázích chronické infekce shodné s nálezy akutní infekce virem hepatitidy B, pozitivita povrchového antigenu viru hepatitid B (HBsAg) a protilátek proti core antigenu (anti-hbc) třídy IgM, ekreční antigen (HBeAg) přetrvávání více jak 10 týdnů, pravděpodobný přechod do chronicity, objevení se anti-hbs protilátek znamená úzdravu z akutní infekce a při dostatečném titru nad 100 IU/ml i trvalou imunitu. U akutní infekce může vymizet HBsAg několik týdnů před objevením se anti-hbs protilátek (období nazývané diagnostické okno) jedinou sérologickou známkou infekce HBV je přítomnost anti-hbc protilátek. Chronická hepatitida B pozitivita HBsAg, specifické a senzitivní vyšetření, anti-hbs protilátky přetrvávají u většiny osob po prodělané hepatitidě B trvale, jsou rovněž známkou úspěšné vakcinace proti HBV, HBe antigen lze prokázat pouze tehdy, je-li současně přítomen HBsAg. Přítomnost HBeAg svědčí pro aktivní replikaci. Je negativní u tzv. pre-core mutací viru HBV. Replikaci je v takovém případě nutno potvrdit vyšetřením HBV DNA. přechod do chronicity je charakterizován přítomností HBsAg >6 měsíců, HBeAg (±) a HBV DNA (±) v séru, objevení se protilátek anti-hbe a vymizení HBeAg je označováno jako sérokonverze v HBe systému a znamená ukončení virové replikace, stanovení HBV DNA pomocí PCR. Hepatitida C průkaz infekce: serologické testy prokazující anti-hcv protilátky molekulárně genetické testy prokazují HCV RNA v krvi, umožňují kvantifikovat virémii a určit genotyp viru 267

268 Klinicko biochemická vyšetření u onemocnění jater - text K dispozici jsou i serologické testy na průkaz infekce viry hepatitidy D a E. f. Imunologická vyšetření v diagnostice jaterních onemocnění Vyšetření autoprotilátek jsou prováděna u všech onemocnění, kde předpokládáme podíl autoimunity, především při podezření na autoimunitní hepatitidu, primární biliární cirhózu a primární sklerotizující cholangoitidu. Autoprotilátky jsou však přítomny i u vysokého počtu nemocných s chronickou HCV infekcí. Protilátky jsou druhově nespecifické, mohou se přechodně vyskytnout i u zdravých osob. Autoimunitní hepatitida je laboratorně charakterizována především elevací aktivit aminotransferáz, charakteristická je výrazná hypergamaglobulinemie. Autoimunitní hepatitidy dělíme podle převažujícího typu autoprotilátek na typ I, II a III, jejich základní rozdělení je shrnuto v následující tabulce: KAPITOLA 23 protilátka AIH typ I AIH typ II AIH typ III ANA + ± ASMA + ± AAA + panca + LKM1 + LKM2 ± LKM3 ± AMA ± LCA ± SLA + dsdna + Pro primární biliární cirhózu je typická pozitivita antimitochondriálních protilátek (AMA, typ M2), které se vyskytují až u 95% všech pacientů s tímto onemocněním. U některých nemocných bývají přítomny i antinukleární protilátky (ANA), které korelují s prognózou onemocnění. Perinukleární ANCA (panca) protilátky se vyskytují u nemocných s primární sklerotizující cholangitidou, přítomny bývají opět antinukleární protilátky (ANA) i protilátky proti hladkému svalu (ASMA). 268

269 Laboratorní diagnostika žloutenek Laboratorní diagnostika žloutenek Autor: M. Jirsa, L. Vítek Recenzenti: KAPITOLA 24 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Klasifikace hyperbilirubinémií Hyperbilirubinémie může být způsobena buď převážně nekonjugo vaným nebo převážně konjugovaným typem bilirubinu, a to v závislosti na etiologii a patogenezi poruchy. Převážně nekonjugované hyperbilirubinémie (premikrosomální a mikrosomální typ - viz obr. 24.1, prehepatální žloutenky dřívější klasifikace), kdy podíl konjugovaného bilirubinu nepřevyšuje 20% celkového bilirubinu, jsou vyvolány nadměrným přívodem nekonjugovaného bilirubinu do jater, jeho nedostatečným vychytáváním nekonjugovaného bilirubinu či sníženou konjugační kapacitou. Poškození konjugace může být vrozené nebo získané. Obrázek 24.1 Schema jaterní konjugace a sekrece bilirubinu a dělení žloutenek. Z biochemického hlediska lze žloutenky klasifikovat na převážně nekonjugované (přímý bilirubin nepřesahuje 20% celkového) a převážně konjugované (přímý bilirubin přesahuje 20% celkového). Někdy se vyčleňuje zvlášť smíšená žloutenka s podílem přímého bilirubinu v rozsahu 20 50% celkového bilirubinu. ER - hladké endoplazmatické retikulum Příčinou převážně konjugovaných hyperbilirubinémií (postmikrosomální typ, obr. 24.1, zahrnuje hepatální a posthepatální žloutenky dřívější klasifikace), kdy podíl přímého bilirubinu přesahuje 50% celkového bilirubinu, je neschopnost sekrece konjugovaného bilirubinu z jater do žluče nebo překážka v odtoku žluče. S výjimkou vrozených poruch metabolismu bilirubinu je většina převážně konjugovaných i smíšených hyperbilirubinémií, kdy podíl bilirubinu činí 20 50% celkového bilirubinu, podmíněna kombinací více mechanismů, důsledkem bývá měnlivý poměr konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu. 269

270 Laboratorní diagnostika žloutenek Převážně nekonjugované hyperbilirubinémie Hyperbilirubinémie z nadprodukce nekonjugovaného bilirubinu (premikrosomální prehepatální žloutenky) Nejčastějšími příčinami převážně nekonjugované hyperbilirubi némie jsou stavy spojené s hemolýzou. Kapacita jater dospělého člověka pro vychytávání, konjugaci a sekreci biliru binu je velká. Hemolytický ikterus proto v dospělosti vzniká teprve při masivní a déletrvající hemolýze a koncentrace nekonjugovaného bilirubinu v krvi přitom obvykle nepřesahuje μmol/l. Výjimkou jsou akutní hemolytické krize doprovázející některé typy hemolytických anémií, kdy hladiny bilirubinu mohou být i významně vyšší. S nadprodukcí bilirubinu na podkladě hemolýzy se setkáváme u srpkovité anémie, hereditární sféro cytózy, u toxických nebo alergických reakcí na xenobiotika, při stavech spojených s inefektivní erytropoezou (talasemie) a u dalších hematologických onemocnění. Jiná je situace u novorozenců. Kromě hemolýzy zde hraje roli i nižší konjugační schopnost jater a absence střevní mikroflóry katabolizující bilirubin na netoxické urobilinoidy. Fyziologická novorozenecká žloutenka, icterus neonatorum, tak stojí na hranici mezi hemolytickým ikterem a hyperbilirubinémií na bázi nedostatečné konjugace bilirubinu. Tato žloutenka postihuje v prvních 5 dnech života témeř polovinu všech zdravých zralých novorozenců. Je spojena s nálezem hodnot nekonjugo vaného bilirubinu v séru okolo 70 až 80 μmol/l, jen vzácně vyššími až asi do 220 μmol/l. Tyto hodnoty se v průběhu 8 až 10 dnů vracejí k normě, která je ovšem u novorozenců vyšší než u dospělé populace. Patologická hyperbilirubinémie novorozenců je charakterizována výskytem v prvních 24 hodinách po narození, hyperbilirubinémií nad 220 μmol/l u donošených nebo nad 256 μmol/l u nedonošených, stoupající bilirubinémií o cca 85 μmol/l denně, podílem konjugovaného bilirubinu nad 10 % a přetrváváním ikteru jeden (u donošených) nebo dva týdny (u nedonošených). Patologická hyperbilirubinemie novorozenců je indikací k léčbě fototerapií, v extrémním případě k provedení exsanguinační transfuze. Kritéria pro zahájení léčebné intervence uvádí Hodrův-Poláčkův graf (Obr. 24.2), ve světě jsou k dispozici obdobná doporučení vydávaná Americkou pediatrickou akademií. K patologické žloutence novorozenců vedou zejména hemolytické stavy vyvolané Rh inkompatibilitou mezi matkou a plodem a inkompatibilitou v AB0 systému. Hemolytická žloutenka u novorozenců může být dále projevem vrozené poruchy, např. sférocytózy nebo srpkovité anémie, anebo důsledkem toxické či alergické reakce. Princip fototerapie spočívá v izomerizaci bilirubinu přítomného v kůži a podkoží při ozáření modrým světlem o vlnové délce 425 až 475 nm. V průběhu ozáření dochází jednak ke vzniku cis-trans izomerů na dvojných vazbách methenylových můstků, která má za následek přerušení intramolekulárních vodíkových vazeb mezi postranními propionylovými řetězci a pyrolovými dusíky, jednak k cyklizaci mezi kruhy A a B (Obr. 4). Fotoizomery mají polární charakter, jsou rozpustné ve vodě a vylučují se do žluče nekonjugované. Vzhledem k polárnímu charakteru fotoizomery neprocházejí hematoencefalickou bariérou a jsou netoxické pro centrální nervový systém novorozence. Z hlediska laboratorního vyšetřování je důležité, že v běžných testech na bilirubin jsou konfigurační izomery diazoreaktivní, cyklobilirubiny nikoliv. Stanovení sérového bilirubinu při fototerapii proto může být zkresleno. Kojení novorozenci mívají všeobecně vyšší koncentrace bilirubinu v séru. Je to způsobeno přítomností inhibitoru enzymu UG- T1A1 v mateřském mléce. Jeho vliv lze odstranit zahřátím mléka na 56 o C. Hodnoty sérového bilirubinu mohou v prvních 10 až 19 dnech života dosáhnout 250 až 450 μmol/l. Tato přechodná nehemolytická nekonjugovaná hyperbilirubi némie nebývá spojena s neurologickým poškozením, nicméně každá hyperbilirubinémie nad 340 μmol/l je považována za potenciálně velmi nebezpečnou. KAPITOLA

271 Laboratorní diagnostika žloutenek KAPITOLA 24 Obrázek 24.2 Hodrův Poláčkův graf. Nomogram v levé části Obr rozděluje postnatální vývoj hladiny bilirubinu do pěti pásem. Tabulka v pravé části znázorňuje indikaci terapeutické intervence nebo frekvenci vyšetřování bilirubinémie v závislosti na dosaženém pásmu, věku a příčině žloutenky. VT - výměnná transfuze, FT - fototerapie, B1x, B2x - bilirubinémie 1x či 2x denně Hyperbilirubinémie z nedostatečného vychytávání nekonjugovaného bilirubinu (premikrosomální hepatální žloutenky) Hyperbilirubinémie převážně nekonjugovaného typu se vyskytuje rovněž při toxic kém a virovém hepatocelulárním poškození, kdy vzniká hepatocelulární ikterus. Působí ho řada hepatocelulárních nox, jako jsou alkohol, chloroform, tetrachlormetan, acetaminofen aj. apod. U některých intoxikací jde o kombinaci poruchy konjugace s cholestázou. V takových případech se setkáváme se smíšenou nekonjugovanou i konjugo vanou hyperbilirubinémií (viz dále). Podle druhu a míry poškození jaterního parenchymu dále nalézáme příslušnou odezvu v jaterních testech a v reaktantech akutní fáze. 271

272 Laboratorní diagnostika žloutenek KAPITOLA 24 Obrázek 24.3 Chemická struktura fotoizomerů bilirubinu IXα a jejich fotokonverze. Převzato z McDonagh AF et al. Pediatrics 2009;123:67-79 Hyperbilirubinémiepřiporucháchkonjugacenekonjugovaného bilirubinu (mikrosomální hepatální žloutenky) Gilbertův syndrom (icterus intermittens juvenilis) je charakte rizován chronickým kolísajícím ikterem a mírným zvýšením nekonju govaného sérového bilirubinu. Jeho hladina obvykle nepřesahuje 85 μmol/l (výjimečně přes 100 μmol/l). Příčina syndromu spočívá ve snížené aktivitě jaterní UGT1A1, a to buď z důvodu snížení exprese enzymu následkem prodloužení TATA boxu promotoru (motiv umožňující rozpoznat místo začátku transkripce) genu UGTA1 ze sekvence A(TA) 6 TAA) na A(TA) 7 TAA nebo přímo mutacemi v kódujících oblastech genu UGT1A1, které mají za následek sníženou aktivitu normálně exprimovaného enzymu (Obr. 24.4). Odchylka je autosomálně dominantní s neúplnou penetrancí a postihuje kolem % populace. Rovněž byl popsán souběh defektu UGT1A1 s mírnou hemolýzou. Syndrom se s ohledem na nevýrazný klinický obraz mnohdy diagnostikuje pouze náhodně na základě biochemického vyšetření, při kterém s výjimkou nekonjugovaného bilirubinu bývají všechny jaterní testy v normě, a to opakovaně po dobu alespoň dvou let. Criglerův-Najjarův syndrom je familiární nehemoly tický ikterus, auto somálně recesivně dědičná porucha spojená s úplným (typ I) nebo částečným (typ II) defektem enzymu UGT1A1. U I. typu zcela chybí exkrece konjugo vaného bilirubinu a hladiny nekonjugovaného bilirubinu v krvi dosahují 300 až 800 μmol/l. Defekt se projevuje od narození a postižení novorozenci bez intenzívní fototerapie záhy umírají v důsledku postižení centrálního nervového systému. Podávání induktorů konjugace u tohoto typu poruchy není terapeuticky účinné. 272

273 Laboratorní diagnostika žloutenek KAPITOLA 24 Obrázek 24.4 Mutace v genu UGT1A1 asociované s Gilbertovým syndromem. V Evropě je zdaleka nejčastější je inzerce TA v TATA- -boxu promotoru UGT1A1 znázorněná na schematu dole. U II. typu je defekt konjugace neúplný a choroba má v důsledku toho mírnější průběh s koncentracemi nekonjugovaného bilirubinu v krvi μmol/l. Ve žluči pacientů trpících touto poruchou se nalézá bilirubin monoglukosiduronát. Sníženou konjugaci lze indukovat a průběh onemocnění příznivě ovlivnit podáváním fenobarbitalu. Obě formy jsou podmíněny mutacemi v genu UGT1A1. Převážně konjugované hyperbilirubinémie Smíšené hyperbilirubinémie při postižení jaterního parenchymu (postmikrosomální hepatální žloutenky) Žloutenka smíšeného je častým průvodním znakem akutních i chronických chorob jater. Může provázet virové hepatitidy, bakteriální infekce, toxické poškození jater, autoimunitní hepatitidy, metabolické nemoci jater a cirhózu jakékoliv etiologie. Příčinou žloutenky je současná neschopnost poškozených hepatocytů vychytávat nekonjugovaný i konjugovaný bilirubin z krve, nekonjugovaný bilirubin konjugovat a vyloučit jej do žluče. K tomu nezřídka přistupuje i postižení intrahepatálních žlučových cest. Mezi žloutenku a onemocnění jater a žlučových cest však nelze klást rovnítko. V řadě případů může závažná jaterní choroba hepatitida či pokročilá cirhóza probíhat skrytě, bez zjevné žloutenky a onemocnění odhalí až podrobné laboratorní vyšetření. Vzestup bilirubinu u nemocných s jaterní cirhózou naopak signalizuje progresi jaterní dysfunkce. Bilirubin byl proto spolu s ostatními analyty zařazen do skórovacích systémů (Child Pugh a MELD) (Tab. 24.1) sloužících k posouzení jaterní funkce a k predikci přežití nemocných s pokročilým jaterním onemocněním. 273

274 Laboratorní diagnostika žloutenek KAPITOLA 24 Tabulka 24.1 Skórovací systémy Child Pugh (vlevo) a MELD (vpravo). Ložiskové nemoci jater žloutenku většinou nevyvolávají. Pokud je přítomna, jde většinou o pozdní znak signalizující pokročilé onemocnění. Mechanismus žloutenky je komplexní, často se na něm podílí i obstrukce žlučových cest. Hyperbilirubinémie při poruchách sekrece konjugovaného bilirubinu (postmikrosomální hepatální žloutenky) Dubinův-Johnsonův syndrom je benigní autosomálně recesivně dědičná převážně konjugovaná hyperbilirubinémie, jejíž sympto ma tologie je kromě žloutenky nevýrazná a proto k diagnostice slouží především laboratorní vyšetření. V séru je zřetelná hyperbilirubinémie (obvykle 35 až 85 μmol/l, výjimečně 350 až 400 μmol/l), přes 50 % z toho připadá na konjugovaný bilirubin. Typické je dále zvýšené vylučování koproporfyrinu I močí, odpadu porfyrinů však není zvýšen. Ostatní laboratorní nálezy jsou v mezích normy. Játra postižených jsou makroskopicky tmavá a histologicky se v lysosomech hepatocytů prokazuje přítomnost černého pigmentu pravděpodobně příbuzného melaninu. Příčinou Dubin-Johnsonova syndromu je defekt sekrece konjugovaného bilirubinu z hepatocytu do žluče způsobený mutacemi v genu ABCC2. Podobně je postižena sekrece glutathionových konjugátů bromsulfoftaleinu a jiných aniontových barviv používaných dříve k funkčním testům jater. Ty byly v současnosti nahrazeny cholescintigrafií, vylučovanými anionty jsou radiofarmaka. Sekrece žlučových kyselin není porušena. Druhou vzácnou chronickou benigní převážně konjugovanou hyper bili rubinemií je Rotorův syndrom. Také zde jsou ostatní běžná hematologická a biochemická vyšetření v mezích normy. Játra však postrádají jakoukoli pigmentaci a močí se vylučuje až pětinásobné množství koproporfyrinu oproti normě, z toho přes 65 % připadá na koproporfyrin I. Cholefilní aniontová barviva jsou z krve vylučována jen velmi pomalu (Obr. 24.5). Onemocnění je opět familiární s autosomálně recesivní dědičností. Porucha je podmíněna současnou přítomností mutací v genech pro OATP1B1 a OATP1B3 a spočívá v absenci jaterního vychytávání konjugovaného bilirubinu a dalších organických aniontů, sekrece žlučových kyselin je však zachována. 274

275 Laboratorní diagnostika žloutenek KAPITOLA 24 Obrázek 24.5 Cholescintigram u Rotorova syndromu (A). Panel B ukazuje normální nález bez známek poruchy jaterní chromosekrece. Převzato z Hřebíček M, et al. Liver Int 2007;27: Hyperbilirubinémie při intrahepatálních a extrahepatálních poruchách odtoku žluče (posthepatální žloutenky) Překážky v odtoku žluči mohou být způsobeny mecha nickou obstrukcí nebo zánětem jaterních či mimojaterních žlučových cest. Hromadění žluči bývá spojeno s hyperbilirubinémií a s obstrukčním ikterem. Intra hepatální cholestázu vyvolává různými mechanismy řada léčiv, terapeuticky používaných hormonů, přírodních látek a dalších nox: estrogeny a C-17 alkylované steroidy (ethinylestradiol), tauro - a glykolitocholát, chlorpromazin, cyklosporin, kolchicin, faloidin a další. Estrogeny a progesteron se uplatňují v patogenezi těhotenské intrahepatální cholestázy. Uvedené látky ovlivňují expresi, lokalizaci a aktivitu jednotlivých kanalikulárních transportérů. U mnohých látek je předpokladem k jejich cholestatickému účinku genetická predispozice. Při intrahepatální cholestáze nebo biliární obstrukci přestupují do krve konjugovaný bilirubin, konjugované žlučové kyseliny, enzymy i další bílkoviny jaterních buněk. Neustálý byť limitovaný přestup těchto látek do krve zprostředkovaný přenašeči lokalizovanými v bazolaterální membráně hepatocytů se odehrává i za fyziologic kých podmínek. Při cholestáze se v basolaterální membráně exprimují i další přenašeče přebírající roli kanalikulárních transportérů (např. MRP3 příbuzný s kanalikulárním MRP2, jehož exprese klesá) a buňka ztratí původní transportní polaritu. Basolaterální přenašeče pak intenzivně zbavují hepatocyt toxických metabolitů směrem do krve. Přestup membránových bílkovin a enzymů, např. alkalické fosfatázy (ALP), gama-glutamyltransferázy (GGT) a 5 -nukleotidázy do krve při intrahepatální či extrahepatální cholestáze se vysvětluje poškozením membrán výstelky žlučových cest detergentním účinkem žlučových kyselina a následnou regurgitací žluče do krevního oběhu přes chemicky a mechanicky (tlakem) narušená mezibuněčná spojení. Způsob přestupu cytosolových a mitochondriálních bílkovin a enzymů z hepatocytu do krve je ještě méně jasný. Podílí se na něm patrně zvýšená permeabilita buněčných membrán způsobená primárním patologickým procesem. Familiární benigní rekurentní intrahepatální cholestáza je onemocnění diagnostikované nejčastěji v období dospívání. Postihuje však všechny věkové kategorie a je charakteristické atakami cholestázy se žloutenkou, mezi nimiž jsou asymptomatická období. V preikterické fázi vzrůstá v krvi koncentrace žlučových kyselin a zvyšuje se i aktivita alkalické fosfatasy. V ikterické fázi se v séru prokazuje zvýšený konjugovaný bilirubin, mohou být lehce zvýšeny aktivity aminotransferas a je prodloužen prothrombinový čas díky malabsorpci vitaminu K. Aktivita GGT je na rozdíl od většiny ostatních cholestatických onemocnění jater normální, důvodem je snížená sekrece žlučových kyselin. Mezi atakami jsou laboratorní nálezy v mezích normy. Příčinou onemocnění jsou u většiny postižených mutace v genu FIC1 (Familiární Intrahepatální Cholestáza 1. typu), jehož úloha v mechanismu biliární sekrece žlučových kyselin a žlučových pigmentů dosud není známa. Extrahepatální cholestáza (obstrukční ikterus) je u dospělých nejčastěji vyvolána kamenem zaklíněným ve žlučových cestách 275

276 Laboratorní diagnostika žloutenek nebo nádorem. Dále přicházejí v úvahu striktury (při primární či sekundární sklerózující cholangitidě, striktury vyvolané zánětem v okolí žlučových cest a v oblasti Vaterské papily, striktury pooperační ev. iatrogenní) a útlak žlučovodů (nádorem, uzlinou aj.). V novorozeneckém a kojeneckém věku je nutno pomýšlet na biliární atrézii. Laboratorní vyšetření v diferenciální diagnostice žloutenek KAPITOLA 24 Základní biochemické vyšetření zahrnující přímý a celkový bilirubin v séru, bilirubin a urobilinogen v moči, sérovou aktivitu aminotransferáz (ALT a AST) a cholestatických enzymů (ALP a GGT) představuje obvykle první krok v diferenciální diagnostice žloutenek následující po anamnéze a fyzikálním vyšetření. V případě převážně nekonjugované izolované hyperbilirubinémie, kdy hodnoty ALT, AST, ALP a GGT jsou v mezích normy, je třeba potvrdit či vyloučit hemolýzu. K tomuto účelu slouží vyšetření krevního obrazu a retikulocytů. Diferenciální diagnostika hemolytických anémií je pak doménou hematologie. Diagnózu dědičných poruch konjugace bilirubinu je možno potvrdit molekulárně genetickým vyšetřením. V případě nálezu svědčícího pro obstrukci žlučových cest následuje ultrasonografie a další zobrazovací (CT, MRCP) popř. endoskopické (ERCP) techniky zaměřené na diagnostiku ev. i léčbu onemocnění žlučových cest. U onemocnění jaterního parenchymu provádíme také sonografii žlučových cest. Je-li sonografický nález v normě, následují vyšetření zaměřená na etiologii jaterní choroby. Základní diferenciálně diagnostické schéma žloutenek na základě biochemických nálezů je uvedeno v Tab Tabulka 24.2 Laboratorní nálezy u jednotlivých typů žloutenek 276

277 Kostní metabolizmus - příprava Kostní metabolizmus - příprava Autor: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. Recenzent: KAPITOLA 25 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Cílem kapitoly je podání základního přehledu o struktuře kostí, procesu kostní remodelace, regulačních faktorech kostní remodelace a možnostech laboratorních vyšetření kostního metabolizmu. Klíčové informace přináší souhrn základních poznatků z této kapitoly. Funkce a struktura kostí Lidské tělo se skládá z 220 kostí, cca 15 % tělesné hmotnosti. Kost není jen základem muskuloskeletálního systému, ale jde o vysoce metabolicky aktivní tkáň, která se trvale odbourává (osteroresorpce) a novotvoří (osteoformace). Tento proces se nazývá kostní remodelace. Kostní remodelace zajišťuje náhradu a opravy poškozených částí kostí (mikrofraktury a, makrofraktury), jakož i tvarové přizpůsobení kosti dlouhodobé mechanické zátěži např. u sportovců) V lidském těle plní kost tyto 3 základní funkce: 1. Strukturální - biomechanická podpora končetin a ochrana tělesných dutin, místo úponů svalů a šlach 2. Hematopoetickou kost poskytuje prostorovou matrici pro krvetvorné buňky 3. Metabolickou - jako depozitum pro vápník, hořčík, sodík a fosfáty se podílí na regulaci kalciofosfátové homeostázy a fosfátových pufrovacích systémů 277

278 Kostní metabolizmus - příprava KAPITOLA 25 Existují dva základní typy kosti: a) kortikální kost b) trabekulární kost Kortikální (kompaktní) kost tvoří asi 80% celkové kostní hmoty a je složena z denzních vrstev mineralizovaného kolagenu (mineralizace dosahuje až 90%) a její hlavní funkcí je právě biomechanická podpora a strukturální funkce. Mikroskopicky je tvořena z pravidelných lamel koncentrických uspořádaných kolem cév tzv. Haversovy lamely. V centru se nachází Haversův kanálek s cévním svazkem. Lamely spolu s kanálkem tvoří základní strukturální stavební jednotku Osteom. Mezi osteomy jsou uloženy vzájemně propojené kostní buňky Ostocyty. Kortikální hlavní komponentou dlouhých kostí a u ostatních tvoří ochranný obal. Její remodelační aktivita je 10x nižší než u kosti trabekulární. Za 1 rok se v lidském těle remodeluje cca 25% trabekulární kosti a pouze 3 % kosti kortikální. Trabekulární (trámčitá)kost naopak tvoří jen necelých 20 % kostní hmoty, ale díky mnohem většímu povrchu se převážně podílí na celkové metabolické aktivitě kostí. Mineralizace je od 5-20%. Mikroskopicky je tvořena houbovitou strukturou složenou z jednotlivých propojených trámců. Orientace a tloušťka trámců závisí na dlouhodobé mechanické zátěži v daném místě. Trámčitá struktura výrazně zvětšuje celkový povrch, což umožňuje poměrně rychlou metabolickou výměnu. Zastoupení jednotlivých typů kostí je různé. Obratle v bederní páteři obsahují 70 % trabekulární kosti, pata 75 %, proximální femur %, distální rádius 25 % trabekulární kosti. Jestliže kortikoidy primárně tlumí aktivitu remodelační trabekulární kosti, dochází pak k patologickým kompresím především obratlů. U primární hyperparatyreózy dochází k významné demineralizaci kortikální kosti, což lze dokumentovat právě na RTG distálního rádia. 278

279 Kostní metabolizmus - příprava KAPITOLA 25 Složení kosti Kost se skládá z vody 8%, anorganické (70%) a organické (22%) složky. Základní součástí anorganické složky je hydroxyapatit Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) a minerální soli fosforečnan a uhličitan vápenatý a hořečnatý, zinek, fluorid, stroncium. Organická složka (osteoid) je z 90% tvořena kolagenem typu I, ale obsahuje i kolagen V, VI, VIII a XII a další nekolagenní molekuly např. osteokalcin 2 (20%), osteopontin, vitronectin, sialoprotein, heparan a chondritin sulfát atd.. Kolagen typu I Kolagen typu I obsahuje dva identické 1-řetězce a třetí odlišný 2-řetězec. Produkován je osteoblasty ve formě jednotlivých prořetězců (prokolagenů), teprve extracelulárně dochází odštěpení C a N terminálních konců a tvorbě typické trojité šroubovice stabilizované četnými meziřetězovými propojeními ve formě Pyridinolinu a Deoxypyridinolinu Ty vznikají sloužením hydroxylysinových nebo lysinových zbytků z řetězců a zajišťují stabilitu trojšoubovice. Odštěpené N a C terminální konce jsou uvolněny do séra a je možné je zde detekovat jako PICP nebo PINP. Degradace kolagenu I z kosti probíhá pomocí proteolytických enzymů Kathepsin K (osteklasty) nebo Matrixová Metaloproteináza 9, MMP9 (nádorové buňky). Při degradaci vznikají fragmenty kolagenních vláken, které se uvolňují do cirkulace. V plazmě či séru je pak můžeme detektovat jako CTX, NTX, ICTP Kostní tkáň obsahuje 3 typy buněk: 1. Osteoblasty, 2. Osteocyty, 3. Osteoklasty. 279

280 Kostní metabolizmus - příprava KAPITOLA 25 Osteoblast je základní buňka kostní novotvorby. Pochází z prekurzorových mezenchymálních buněk ( společná kmenová buňka pro myoblast, myocyt, adipocyt,chondrocyty a osteoblasty) v kostní dřeni. Diferencované osteoblasty vytvářejí novou kostní matrix (osteoid) a zahajují její mineralizaci. Část osteoblastů, které jsou zachyceny v nově tvořené kosti zde zůstává a vytváří osteocyty. Osteoblast je základní řídící buňka kostní remodelace, produkuje cytokiny stimulující osteoklasty (RANKL) a zároveň i jeho přirozený inhibitor (OPG). Na povrchu má receptory pro většinu systémových hormonů (PTH, estrogeny, androgeny, kortizol atd.) a výsledkem jejich aktivity je pak produkce RANKL a OPG v různém poměru. Dle toho v jaký typ molekuly je poměr posunut pak dochází buď ke stimulaci kostní resorbce či tlumení činnosti osteoklastů Osteocyty vznikají z osteoblastů a jsou usazeny mezi lamelami kortikalis a uvnitř trabekul. Syntetická aktivita osteocytů je minimální, ale pomocí cytoplazmatických výběžků vytvářejí vzájemně propojenou prostorovou síť. Jejich základní funkcí je, že působí jako mechanosenzory. Osteocyty aktivizuje k činnosti trvalá změna zátěže nebo mikropoškození jejich vzájemných spojení. Ty jsou zdrojem signálů, které spouští kostní remodelační proces v daném místě. Příkladem je dlouhodobá inaktivita - u ležícího pacienta se sníží mechanická zátěž a v odlehčených kostech probíhá velmi rychlá osteroresorbce, naopak pravidelná fyzická zátěž vede lokální remodelaci, jejíž výsledkem je zvýšení novotvorby kosti (přírůstek) a změna orientace trámců ve směru mechanické zátěže. Osteocyty jsou tak senzory spouštějícími kostní remodelaci. Osteoklasty jsou původem z hematopoetické myeloidní kmenové buňky (společná kmenová buňka pro erytrocyty, megakaryocyty, monocyty a granulocyty). Osteoklast vychází z monocytární řady a vlastně se jedná o specializovaný makrofág. Osteoklast je mnohojaderná buňka vniklá fúzí pre-osteoklastů z monocytární buněk. Po kontaktu s povrchem kosti vytváří osteoklasty zvláštně strukturovanou část plazmatické membrány nazývanou ruffled border. Tato zřasená část membrány vytvoří prostor, do kterého H-K ATPáza secernuje vodíkové protony. Kyselé prostředí s ph cca 4 spolu s dalšími enzymy (kathepsin K)vytváří tzv. extracelulární lysozóm, který odbourává přiléhající kost. Výsledkem je resorpční lakuna - prostor zbylý po kompletně resorbované kosti. Osteklasty nensou na svém těle receptor pro RANKL nazývaný RANK. Jejich činnost je řízena sekundárně skrze produkci RANKL osteoblasty. Jediným hormonálním receptorem, který mají na povrchu, je kalcitonin. Kalcitonin blokuje činnost 280

281 Kostní metabolizmus - příprava osteoklastů Kostní remodelace Kostní remodelace je kontinuální proces aktivace kostní resorpce a novotvorby, na kterém se podílejí všechny tři kostní buňky. Výsledkem je nová bílkovinná kostní matrix (osteoid), která je následně pasivně mineralizována. Osteocyty v kostní remodelace hrají roli mechanosenzory a zároveň spouštěče remodelačního cyklu. jejich mechanické poškození aktivuje remodelační cyklus v místě poškození (osteoresorbci) a následně dojde k aktivaci kostní novotovorby. Rovnováha mezi osteoresorbcí a norovotvorrbou je řízena osteoblasty KAPITOLA 25 Jedno místo v kosti, na kterém se odehrává remodelační cyklus se nazývá kostní metabolická jednotka (BMU, bone metabolic unit).v lidském těla jsou aktuálně přítomny milióny BMU a to v různé fázi aktivity. Remodelační proces trvá cca 180 dní a lze rozdělit na několik fází: A. Aktivační fáze - kostní buňky jsou v klidovém režimu. Vlivem různých stimulů (zátěž, poškození, hormonální signály) dojde k aktivaci osteocytů. Osteocyty sníží aktivitu osteoblastů pomocí Sklerostin a naopak začnou stimulovat tvorbu osteoklastů pomocí cytokínů M-CSF a RANKL. Tvorbu aktivních osteoklastů podporuje a indukuje i produkce RANKL v osteoblastech se současným snížením tvorby jeho přirozeného inhibitoru OPG. Tento efekt je výsledkem činnosti sklerostinu a dalších hormonálních vlivů. B. Fáze osteoresorbční, trvá cca dní, díky M-CSF a RANKL dochází k aktivaci diferenciace monocytárních buněk v preosteoklasty a osteoklasty a kost je resorbována. Regulátorem míry osteroresorpce je jeho přirozený kompetitivní inhibitor OPG (osteoprotegrin). Naopak kostní resorpci stimulují TNF-1, IL-1, Interferon gamma, prostaglandiny. Při kostní resorpci dochází k proteolýze a zároveň s tím k uvolnění a aktivaci TGFß1, který aktivuje činnost osteoblastů a přechod do další fáze. 281

282 Kostní metabolizmus - příprava C. Fáze kostní novotvorby. Jsou za ní zodpovědné osteoblasty, které produkují kostní bílkovinou matrix (osteoid), poté následuje pasivní děj primární mineralizace osteoidu (50% minerálu). Tento proces trvá cca 150 dní. D. Fáze klidová nově vytvořená kost po fázi primární mineralizace se postupně dále mineralizuje ( zvyšuje se % podíl krystalů) za předkladu dostatku minerálů a vitaminů. Tento proces se nazývá sekundární mineralizace a není známa doba potřebná pro dosažení 100% absorpční kapacity bílkovinné kostní matrix. V klidové fázi zůstává kost znovu, dokud není aktivován remodelační cyklus v daném místě. KAPITOLA 25 Regulace kostní remodelace Remodelační proces je regulován: Systémovými hormony ( parathormon, kalcitriol, kalcitonin, FGF23, estrogeny, IGF1, leptin, tyreoidálními hormony, kortizol) Systémovými cytokíny: IL 1, IL6, TNF, OPG, RANKL prostaglandiny atd.. Lokálními cytokíny - signálními molekulami, které jsou totožné se systémovými a specifickými jako Sclerostin, BMP s (bone morphometric proteiny) Mechanickou zátěží -(zátěž stimuluje novotvorbu a blokuje resorbci) Minerály (kalcium, hořčík, zinek) a vitaminy (K, C, B6, A) - dostatek je nezbytný pro správný průběh mineralizace osteoidu Osteocyty spouští remodelační cyklus produkcí RANKL a sclerostinu. RANKL aktivuje osteoklasty a sclerostin blokuje aktivitu osteoblastů. Hlavním regulátorem jsou však osteoblasty, skrze které působí jak osteocyty, tak ostatní hormony. Osteoblasty produkují RANKL a jeho blokátor OPG a to dle hormonálních signálů a výsledkem je pak odpovídající především v regulaci remode- 282

283 Kostní metabolizmus - příprava lačního procesu KAPITOLA 25 Osteoblasty a osteoklasty jsou pak klíčovými hráči v kostní remodelaci. Výsledek remodelace závisí na koordinaci jejich vzájemné činnosti. Pokud je regulace posunuta ve prospěch činnosti osteoklastů dochází k úbytku kostní tkáně. Tak se děje v případě osteoporózy. Naopak regulace ve prospěch novotvorby vede ke zvětšení kostní hmoty a je to fyziologický jev v období růstu. Maximální kostní hmota ( peak bone mass) je pak výsledkem nutričních, genetických, hormonálních faktorů spolu s mechanickým zatížením v období růstu s následnou sekundární mineralizací. Maximální peak bone mass dosahuje lidský organismus někdy mezi rokem věku. Osteoblasty jsou v regulaci nadřazené osteoklastům. Osteoblasty mají receptory pro hlavní klíčové systémové hormony, které se podílejí na regulaci kostního metabolizmu ( PTH, kalcitriol, estrogeny, kortizol, IGF1 atd ). Osteoklasty naopak mají receptory pouze pro kalcitonin. Koordinace činnosti osteoklast-osteoblast je řízena skrze osteoblasty Osteoblasty i osteoklasty se v kosti nacházejí v těsném sousedství. Jejich koordinace je založená na: A. Mezibuněčné komunikaci - tuto těsnou mezibuněčnou komunikaci zajišťují epinefriny B. Systém RANKL- OPG- RANK : je klíčovým regulačním mechanizmem aktivy remodelační jednotky. Skládá se z receptoru RANK na osteoklastech, jehož stimulací dochází k diferenciaci pre-osteoklastů na osteoklasty, dál udržuje metabolickou aktivitu osteoklastů. RANKL jeho aktivitu stimuluje a OPG je naopak kompetitivním inhibitorem. Jak RANKL tak OPG jsou produkovány osteoblasty a na jejich poměrném zastoupení závisí, zda budou osteoklasty aktivovány či utlumeny. Systémové hormony přenášejí svůj signál na kost pomocí indukce produkce RANKL a OPG a to různě. Estrogeny zvyšují produkci OPG a tlumí produkci RANKL, mají tedy anabolický efekt na kost. Kortikoidy zvyšují produkci RANKL a snižují produkci OPG a zvyšují kostní resorbci. Důležitým faktorem je i M-CSF startující a udržující tvorbu prekursorů osteoklastů. 283

284 Kostní metabolizmus - příprava KAPITOLA 25 RANKL a OPG jsou kromě osteoblastů produkovány i buňkami imunitního systému, což potvrzuje propojení mezi kostní remodelací a aktivitou imunitního systému. Stimulem osteoblastů je kromě nízké hladiny sklerostinu i TGFß1 uvolňovaný osteoresorbční aktivitou osteoklastů z kostní matrix. Kostní remodelace je výsledkem multifaktoriálních efektů hormonů, cytokinů atd., jejichž snahou je jemně vybalancovat systém tak, aby zůstával kostní hmota stabilní a přitom mohlo docházet k intenzivní výměně minerálních složek (Ca,Mg, fosfáty) s extracelulární tekutinou a reparačním procesům. Hormonální faktory v řízení kostní remodelace: Parathormon - jeho efekt je na osteoklasty je nepřímý zprostředkovaný skrze receptory pro PTH na osteoblastech, výsledkem je pak : A. Zvýšení produkce RANKL a snížení OPG s následnou zvýšenou osteoresorbcí, to vše za předpokladu trvalé kontinuální stimulace PTH jako je u primární hyperparatyreózy B. Intermitentní podávání PTH 1x denně vyvolá nejen stimulaci osteoresorbce, ale především větší stimulaci diferenciace osteoblastů. Vsledkem je anabolický efekt na kos, kdy je novotvorba stimulována více než osteoresorbce. Pohlavní hormony: Estrogeny - opět skrze osteoblasty tlumí produkci RANKL a stimulují sekreci OPG, zároveň působí i na mesenchymální buňky a tlumí produkci dalších cytokínů stimulujících osteoklasty jako M-CSF, IL1, IL6, TNF α., působí tedy ve fází iniciace kostní novotvorby- v období tvorby matrix 284

285 Kostní metabolizmus - příprava KAPITOLA 25 Androgeny působí především na kostní mineralizaci a podporují periostální kostní apozici. Rozdíly v koncentrací jednotlivých hormonů vede k rozdílné tvarové remodelaci kostí. U mužů jsou nosné kosti s větším průměrem tenčí kortikalis ( převaha periostální apozice) než u žen. IGF1 stimuluje diferenciaci osteoblastů Tyreoidální hormony stimulují kostní remodelace, ale více osteoresorbci Kortikoidy stimulují osteoresorbci skrze navýšení produkce RANKL a útlumu produkce OPG Kalcitonin jako jediný hormon přímo blokuje činnost osteoklastů a navozuje jejich apoptózu. Klíčové informace V lidském těle plní kost tyto 3 základní funkce:, strukturální - biomechanická podpora končetin a ochrana tělesných dutin, místo úponů svalů a šlach; hematopoetickou kost poskytuje prostorovou matrici pro krvetvorné buňky a metabolickou - jako depozitum pro vápník, hořčík, sodík a fosfáty se podílí na regulaci kalciofosfátové homeostázy a fosfátových pufrovacích systémů Kortikální (kompaktní) kost tvoří asi 80% celkové kostní hmoty a necelých 50% metabolické aktivity, Trabekulární (trámčitá)kost naopak tvoří jen necelých 20 % kostní hmoty, ale více než 50% metabolické aktivity Kost se skládá z vody 8%, anorganické (70%) a organické (22%) složky. Základem anorganické složky je hydroxyapatit Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) a minerální soli Ca, Mg, Sr, F, Zn. Organická složka (osteoid) je z 90% tvořena kolagenem typu I, a další 2 nekolagenní molekuly např. osteokalcin (20%). Kostní tkáň obsahuje 3 typy buněk: 1. Osteoblasty, 2. Osteocyty, 3. Osteoklasty. Osteoblast je základní buňka kostní novotvorby a buňka řídící proces kostní remodelace. Produkuje cytokiny stimulující osteoklasty (RANKL) a jeho přirozený inhibitor (OPG). Většina systémových hormonů (PTH, estrogeny, 285

286 Kostní metabolizmus - příprava androgeny, kortizol atd.) řídí kostní remodelaci skrze ovlivnění produkce RANKL a OPG v osteoblastech. Osteocyty vznikají z osteoblastů a jsou usazeny mezi lamelami kortikalis a uvnitř trabekul. Vytvářejí vzájemně propojenou prostorovou síť, jejíž funkcí jepůsobit jako mechanosenzory. Osteocyty jsou zdrojem signálů, které spouští kostní remodelační proces v daném místě. Osteoklasty vychází z monocytární řady a vlastně se jedná o specializovaný makrofág. Osteoklast je mnohojaderná buňka, která je schopna přilnout k povrchu kosti a kostní tkáň pod membránou odbourat. Ke své činnosti potřebuje RANKL, naopk blokuje ji OPG či kalcitonin jako jediný systémový hormon Kostní remodelace je kontinuální proces aktivace kostní resorpce a novotvorby, na kterém se podílejí všechny tři kostní buňky. Výsledkem je nová bílkovinná kostní matrix (osteoid), která je následně sekundárně mineralizována. Remodelační proces trvá cca 180 dní a lze rozdělit na několik fází: Aktivační fáze - vlivem stimulů dojde k aktivaci osteocytů následně osteoklastů a osteblasstů Fáze osteoresorbční, trvá cca dní, osteoklasty resorbují kost Fáze kostní novotvorby. Aktivní osteoblasty produkují kostní bílkovinou matrix (osteoid), poté následuje pasivní děj primární mineralizace osteoidu (50% minerálu). Tento proces trvá cca 150 dní. Fáze klidová nově vytvořená kost se postupně dále mineralizuje. Jde o tzv proces sekundární mineralizace a není známa délak jeho trvání Jedno místo v kosti, na kterém se odehrává remodelační cyklus se nazývá kostní remodelační jednotka (BRU, bone remodelation unit).v lidském těla jsou aktuálně přítomny milióny remodelačních jednotek a to v různé fázi aktivity. Regulace kostní remodelace: Osteocyty kostní remodelaci aktivují a osteoblasty řídí pomocí systému RANKL/OPG- -RANK. Systém RANKL- OPG- RANK je klíčovým regulačním mechanizmem aktivy remodelační jednotky. Skládá se z receptoru RANK na osteoklastech, jehož stimulací dochází k diferenciaci pre-osteoklastů na osteoklasty, dál udržuje metabolickou aktivitu osteoklastů. RANKL jeho aktivitu stimuluje a OPG je naopak kompetitivním inhibitorem. Jak RANKL tak OPG jsou produkovány osteoblasty a na jejich poměrném zastoupení závisí, zda budou osteoklasty aktivovány či utlumeny. Systémové hormony přenášejí svůj signál na kost pomocí indukce produkce RANKL a OPG a to různě. KAPITOLA 25 Literatura: 1. R.Eastell: Bone Markers, Martin Dunitz Ltd, London I.Sotorník, Š. Kutílek a kol.; Kostní minerály a skelet při chronickém onemocnění ledvin, Galén, Praha R. Rizzoli : Atlas of Postmenopausal Osteoporosis, 2nd Edition, Current Medicine Group, London C.J. Rosen;, Primer on Bone Metabolic Diseases and Disorders of Mineral Metabolism 7th Ed, ASBMR, Washington, V. Vyskočil: Osteoporóza a ostatní nejčastější metabolická onemocnění skeletu, Galén, Praha, L. de Groot, J.L.Jameson; Endocrinology 4th Edition, Vol2W.B Sounders, O. Růžičková : Ovlivnění signální cesty RANK/RANKL/OPG, Osteologický bulletin 17, 2012/1, M.Cirmanová, L. Stárka: Sklerostin- nový regulační marker kostního obratu a klíčový cíl v terapii osteoporózy, Osteologický bulletin 16, 2011/1,

287 Kostní metabolizmus Kostní metabolizmus Autor: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. Recenzenti: RNDr. Zdeněk Švagera, Ph.D., MUDr. Věra Ploticová KAPITOLA 25 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Možnostilaboratornídetekcekostníremodelace kostnímarkery Laboratorní metody poskytují řadu možností, jak vyšetřovat stav kostní remodelace. Kromě genetické analýzy, která pomáhá konfirmovat některé vrozené choroby ( např. Osteogenesis imperfekta, Ehlers-Danlos ch. atd), se jedná hlavně o stanovení molekul cirkulujících v plazmě (séru). Jejich koncentrace jsou pak úměrné aktivitě kostních buněk. Vyšetřování kostní remodelace se většinou provádí současně se stanovením parametrů kalciofosfátového metabolizmu, který je hlavním hormonálním regulačním mechanizmem kostní remodelace. V diferenciální diagnostice využíváme i stanovení systémových hormonů ( T hormony, kortizol, estrogeny, androgeny, IGF-1 atd). Na posouzení kostní remodelace používáme buď běžně užívané či výzkumné metody. Mezi výzkumné patří stanovení koncentrací cytokinů včetně RANKL, OPG, sklerostinu. Běžně užívané parametry kostní remodelace členíme na osteoresorbční či markery kostní novotvorby a jsou předmětem této kapitoly. Nomenklatura rutinně užívaných kostních markerů (zkratky) Markery kostní novotvorby: Osteokalcin (OC) Kostní izoenzym alkalická fosfatázy (kostní ALP nebo balp) N terminální propeptid prokolagenu typu I (PINP) Markery kostní resorbce: Telopeptidy kolagenu typu I (degradační produkty kolagenu typu I v kosti) 1. N-terminální cross-linking telopeptid kolagenu typu I (NTX-I) 2. C-terminální cross-linking telopeptid kolagenu typu I (CTX-I b, Crosslaps) 3. Telopeptid kolagenu typu I (ICTP) 287

288 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 Tartarát-rezistentní kyselá fosfatáza 5b (TRACP 5b) Klíčové informace: Markery kostní novotvorby jsou buď úměrné syntetické aktivitě osteoblastů (OC), syntéze kolagenu typu I (PINP), nebo jsou úměrné aktivitě osteoblastů (kostní ALP). Markery kostní resorbce jsou buď úměrné množství degradovaného kolagenu typu I ( CTx, NTx, ICTP) nebo jsou úměrné aktivitě osteoklastů ( TRACP5b). Stanovované parametry kostní remodelace v plazmě či séru, poskytují obraz o souhrnné aktivitě všech kostních remodelačních jednotek v celém těle, které se nachází v různé fázi kostní remodelace. Výsledkem je průměrná aktivita. Kostní markery reagují při kontrole efektu terapie prakticky ihned, zatímco zobrazovací metody (denzitometrické vyšetření) jsou schopny detekovat změnu zhruba po 12 měsících. Podle typu zvolené léčby pak lze očekávat odpovídající efekt na kostní markery (bisfosfonáty, denosumab a kalcitonin snižují kostní remodelaci, PTH zvyšuje kostní remodelaci, SERMy normalizují kostní remodelaci) Prediktivní hodnota - markery kostní remodelace slouží k odhadu míry rizika vzniku osteoporotické zlomeniny či kostních metastáz. Čím vyšší je hodnota markerů kostní resorpce mimo referenční rozmezí, tím větší je riziko vzniku události. V diferenciální diagnostice nejsou markery kostní remodelace příliš využitelné. Je to dáno jejich nespecifitou, kdy metabolická onemocnění skeletu vyvolávají kvantitativní, ale NE kvalitativní změny kostní remodelace. Ke stanovení parametrů kostní remodelace se prakticky výhradně používají imunoanalytické metody stanovení. Kostní markery vykazují významnou variabilitu v závislosti na věku, pohlaví, času odběru, požití stravy a užití někte- 288

289 Kostní metabolizmus rých léků (kortikoidy) a i konkrétní použité imunoanalytické metodě. Změny jsou v řádech desítek až stovek %. Standardní odběr je v dopoledních hodinách mezi , a to nalačno. Většina parametrů je po oddělení krevních buněk stabilní do 24 ho při teplotě 4-8 C. Osteoporóza je systémové onemocnění kostí, které je charakterizované nízkou kostní hmotou a poruchou mikroarchitektury kosti (minerál i osteoid ubývá proporcionálně). Osteomalácie je na rozdíl od osteoporózy porucha mineralizace osteoidu u dospělých, u dětí s neuzavřenými epifyzárními chrupavkami se diagnóza nazývá křivice (rachitis). Osteomalácie je charakterizována nedostatečnou mineralizací, ale množství osteiodu je v normě. Typické laboratorní nálezy - Osteporóza: Osteoporóza postmenopauzální z nedostatku estrogenů - Kostní markery: zvýšená osteoresorbce a normální či snížená novotvorba Involuční (senilní) osteoporóza- Kostní markery osteoresorbce i novotvorba jsou sníženy či v dolním kvartilu referenčních mezí. Osteoporóza indukovaná glukokortikoidy - Kostní markery: osteoresorbce zvýšena, novotvorba snížena ( PINP především), sekundární hyperparatyreóza Osteoporóza indukovaná tyreotoxikózou - Kostní markery: osteoresorbce zvýšena více než novotvorba Osteoporóza indukovaná imobilizací - Kostní markery: osteoresorbce zvýšena mnohem více než novotvorba, hyperkalciúrie Osteomalácie, křivice (rachitis) - Kostní markery- vysoce zvýšená kostní remodelace (novotvorba tak osteoresorbce). Dále přítomna porucha kalciofosfátového metabolizmu dle vyvolávající příčiny (nízký vitamin D, nízký či normální vápník, nízký fosfor, zvýšený PTH). Kostní a minerálová porucha při chronickém renální selhání (CKD-MBD) dříve renální osteodystrofie, renální kostní choroba - Kostní markery: Osteitis fibrosa : vysoká kostní remodelace, PTH II. generace často nad 300pg/ml, kostní mineralizace v normě Adynamická kostní choroba a Osteomalácie : nízká kostní remodelace, PTH II generace snížený či odpovídá hodnotám zdravých, porušená kostní mineralizace Smíšená kostní choroba : normální či mírně zvýšena kostní remodelace, PTH II generace středně zvýšený, porušená kostní mineralizace Hyperkalcémie u nádorových onemocnění - Kostní markery: míra změny kostní remodelace je přímo úměrná rozsahu metastatického postižení a samozřejmě i aktivitě nádorových a kostních buněk (solitární malá metastáza se na hodnotách kostních markerů většinou neprojeví). Příčinou hyperkalcémie je nadprodukce PTHrP (PTH related protein) Osteolytické metastázy - zvýšená osteoresorpce především ICTP, CTX, ICTP je více specifický pro kostní metastázy, neboť nádorové buňky častěji odbourávají pomocí MMP-9, jejíž produktem je ICTP. Osteoplastické metastázy - zvýšený PINP, méně bone ALP Smíšené metastázy - zvýšená kostní remodelace osteoresorbce i novotvorba Morbus Paget - Kostní markery: zvýšená kostní remodelace, především hodnoty ALP, kalciofosfátový metabolizmus je většinou normální. KAPITOLA 25 Stručný popis kostních markerů: MARKERY KOSTNÍ NOVOTOVRBY Osteokalcin Osteokalcin je nejvíce zastoupeným ne-kolagenním proteinem kostní matrice (osteoidu). Jeho syntéza probíhá v osteoblastech a následná karboxylace je závislá na vitaminu K. Osteokalcin uložený v kostní tkáni má vysokou afinitu pro Ca a podílí se mineralizaci kostní matrix. Jeho hodnoty v séru jsou úměrné jeho tvorbě osteoblasty. Nejnovější výzkumy přináší informace o osteokalcinu jako o systémovém hormonu uvolňovanému z kostí, který se zapojuje do regulace systému leptin-adiponektin, podílí na regulaci syntézy androgenů. 289

290 Kostní metabolizmus Kostní isoenzym alkalické fosfatázy (bone ALP, Osteáza) Alkalickou fosfatázu tvoří 4 isoenzymy: placentární, karcinoplacentární, střevní a skupina jaterní/renální/kostní. Tyto isoenzymy se liší ve své primární struktuře a jsou kódovány různými geny. U dospělého jedince tvoří kostní izoenzym méně než polovinu aktivity celkové ALP (většinu tvoří jaterní izoenzym). Kostní izoenzym je produktem osteoblastů a jeho stanovení kvantitativně je funkcí jejich aktivity. N- terminální prokolagen-i (PINP) Uvolňuje se do cirkulace při tvorbě kolagenu typu I. Osteoblasty produkují prokolagen, od kterého jsou extracelulárně proteolyticky uvolněny N a C terminální konec (PINP, PICP). Ty se pak dostávají do cirkulace a zde je kvantifikujeme. Hodnoty PINP či PICP poskytují informaci o míře produkce kolagenu typu I a to nejen v kostech, ale i ve všech tkáních s tvorbou kolagenu I (kůže, pojivová tkáň, cévy). Chrupavka obsahuje kolagen typu II. KAPITOLA 25 MARKERY KOSTNÍ OSTEORESORBCE N-terminální cross-linking telopeptid kolagenu typu I (NTX-I), C-terminální cross-linking telopeptid kolagenu typu (CTX-I) Degradace kolagenu typu I v kosti probíhá činností proteolytických enzymů osteoklastů. Hlavním z nich je Kathepsin K, který štěpí kolagenní vlákno na různé fragmenty. Fragmenty se odštěpují jak z C, tak z N terminálního konce molekuly kolagenu I. V cirkulaci je detekujeme jako N-terminální cross-linking telopeptid kolagenu typu I (NTX-I) nebo C-terminální cross-linking telopeptid kolagenu typu (CTX-I). Definitivně jsou vylučovány močí (kumulace u pacientů s chronickým renálním selháním). Jejich koncentrace pak udávají míru degradace kolagenu typu I. Telopeptid kolagenu I (ICTP). 290

291 Kostní metabolizmus Za některých patologických situací převládá jiný způsob degradace kolagenu typu I a to pomocí Matrixových metaloproteináz (MMP), v tomto případě MMP- 9. MMP-9 je produkována především nádorovými buňkami kostních metastáz a způsobuje lokální patologickou degradaci kolagenu typu I. Vytváří se jiný fragment než CTX nebo NTX, který se nazývá Telopeptid kolagenu I. (ICTP). Jeho koncentrace jsou ukazatelem míry patologické kostní degradace pomocí MMP-9. KAPITOLA 25 Tartarát rezistentní isoenzym kyselé fosfatázy 5b (TRAP5b) Jde o jeden ze 6 isoenzymů ACP. Je přítomen ve velkém množství v osteoklastech. Jeho kvantitativní stanovení v séru udává míru osteoklastické aktivity. Indikace stanovení kostních markerů Cílem je snaha posoudit míru kostní remodelace. Je však třeba si uvědomit, že stanovované parametry v plazmě či sérum poskytují obraz o souhrnné aktivitě všech kostních remodelačních jednotek v celém těle. Ty se nachází v různé fázi kostní remodelace. Výsledkem je tedy průměrná hodnota aktivity všech kostních remodelačních jednotek. Je tedy logické, že malé lokální procesy (solitární metastáza) se na hodnotách neprojeví, dokud jejich aktivita významně nepřevýší průměrnou aktivitu ostatních remodelačních jednotek (BMU). Velkou výhodou pro pacienty je minimální zátěž, neboť se jedná o klasický krevní odběr. 291

292 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 Parametry kostní remodelace jsou využívány k: 1. Sledování efektu terapie léčby kostních metabolických onemocnění 2. Prediktivní hodnota 3. Diferenciální diagnostice 4. Individualizace terapie?? Sledování efektu terapie léčby kostních metabolických onemocnění Jde asi o nejrozšířenější indikaci kostních markerů u postmenopauzální osteoporózy. Kostní markery reagují na podanou léčbu prakticky ihned, zatímco zobrazovací metody (denzitometrické vyšetření) jsou schopny detekovat změnu zhruba po 12 měsících. Podle typu zvolené léčby pak lze očekávat efekt na kostní markery: a. Bisfosfonáty(aledronát, ibandronát, risedronát, zolendronát, pamidronát) snižují kostní remodelace jak resorpci, tak novotvorbu, podporují sekundární mineralizaci. b. SERM (selektivní modulátory estrogenních receptorů-raloxifen, tamoxifen) navozují premenopauzální stav kostní remodelace. Výhodné jsou tak v léčbě časné postmenopauzální osteoporóz, kdy je zvýšená osteoresorbce, kterou pak nasazení SERMu normalizuje a současně snižují riziko vzniku hormonálně pozitivního karcinomu prsu. c. kalcitonin blokuje významně osteoresorbci maximálně po dobu cca 8-12 hodin, existuje 1/3 pacientů non-responderů, u kterých hladiny na podání kalcitoninu nereagují. d. parathormon podávaný intermitentně (1x denně s.c.) - intermitentní podávání PTH vede k jinému profilu produkce RANKL: OPG, než je u kontinuálně zvýšené hladiny PTH. Dochází jak ke stimulaci novotvorby, tak osteoresorbce. Více je však stimulována novotvorba (Vyšší % změna markerů oproti původní hodnotě před léčbou). Léčba má anabolický efekt na kost. 292

293 Kostní metabolizmus e. denosumab je s.c. podávaná humánní protilátka, která má stejný efekt jako OPG a vede k významné supresi kostní resorbce s následným poklesem i kostní novotvorby. Na kostní remodelaci má obdobný efekt jako bisfosfonáty f. stroncium je lék, který také patří mezi možnosti léčby osteoporózy, ale podávání stroncia kostní remodelaci nijak významně nemění, zřejmě je jeho efekt zprostředkován jiným mechanizmem skrze Calcium senzing receptor g. Humánní protilátka proti sclerostinu je teprve ve fázi klinického testování: Lze očekávat zvýšení především kostní novotvorby více než osteoresorbce, tedx významný anabolický efekt na kost. Obdobným způsobem lze sledovat změny kostní remodelace při úspěšné terapii jiných metabolických onemocnění skeletu (osteomalacie, morbus Paget, kostních metastáz atd). KAPITOLA 25 V některých případech pomáhá posoudit míru non-kompliance pacientky, místo očekávaného poklesu či nárůstu se parametry kostní remodelace nemění či mění proti předpokladu. Prediktivní hodnota Stanovení markerů kostní remodelace slouží k odhadu míry rizika vzniku osteoporotické zlomeniny či kostních metastáz. Je prokázáno, že čím vyšší je hodnota kostních markerů, tím je vyšší riziko vzniku události ( zlomenina, metastáza, progrese či relaps). U pacientek s karcinomem prsu negativně koreluje hodnota markerů kostní resorbce a délka přežití ( čím vyšší osteoresorbce, tím kratší přežívání). 293

294 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 Diferenciální diagnostika V diferenciální diagnostice nejsou markery kostní remodelace příliš využitelné. Je to dáno jejich nespecifitou. Metabolická onemocnění skeletu vyvolávají sice změny kostní remodelace, ale vyvolávající příčina je různá a změny jsou pouze kvantitativní. Například jak osteomalacie vyvolává zvýšení kostní remodelace velmi podobně jako mnohačetné kostní metastázy smíšeného charakteru, nebo jako primární hyperparatyreóza, či jako stav po hojících se zlomeninách. Samotné zvýšení kostní resorbce nelze interpretovat jako postmenopauzální osteoporózu, neboť důvodů může být i více např. osteolytické metastázy a primární hyperparatyreóza. Některé laboratorní nálezy nálezu jsou však poměrně typické, mohou zrychlit diagnostický proces, ale vyžadují vždy potvrzení diagnózy jinou metodou. Izolovaně zvýšená hodnota kostní ALP s hyper či normo kalcémii je typická pro Morbus Paget Zvýšené hodnoty ICTP jsou suspektní z osteolytických či smíšených metastáz, či osteomalacie Zvýšené CTX (NTX) a snížené PINP - typické pro podávání kortikoidů. Individualizace terapie Otázka individualizace terapie je velmi diskutabilní. V současnosti je hlavním způsobem ověření efektu léčby u osteoporózy léčba dle evidence based multicentrických prospektivních placebem kontrolovaných studií. Zde však není prostor na individualizaci terapie. Většina těchto studií se provádí u pacientů s normální hladinou vitaminu D či mírně deficitní. Je tedy možné zahajovat léčbu tam, kde je těžký deficit vitaminu D? Těžká hypovitaminóza D se týká cca % běžné populace s osteoporózou. 294

295 Kostní metabolizmus Smyslem individualizace je však najít optimální léčbu pro konkrétního pacienta na základě znalosti anamnézy, zhodnocení rizikových faktorů a samozřejmě i laboratorních vyšetření. Individualizace funguje u Morbus Paget choroby se hladinou ALP řídíme. Léčebně se podají bisfosfonáty ( zolendronát), dojde k normalizaci ALP a dokud hladina nevzroste, není důvod podat další dávku zolendronátu. Jasné je také například individuální dávkování vitaminu D, dle jeho vstupní a cílové hladiny, % tělesného tuku, slunění atd. Metody stanovení: KAPITOLA 25 Ke stanovení parametrů kostní remodelace se prakticky výhradně používají imunoanalytické metody stanovení. Většina metod kromě TRAP5b a ICTP jsou v současnosti k dispozici na plně automatizovaných přístrojích. TRAP5b a ICTP ve formě EIA na destičkách či radioizotopových soupravách. Pro stanovení osteokalcinu je důležité užívat metody stanovující intaktní formu a N-MID fragment, a tak je zajištěna větší stabilita a menší variabilita výsledků Preanalytika - stabilita vzorků, diurnální rytmy, strava, volba metodiky Kostní markery vykazují významnou variabilitu v závislosti na věku, pohlaví, času odběru, požití stravy a užití některých léků (kortikoidy) a použitou imunoanalytické metodě. Změny jsou v řádech desítek až stovek %. Zásadní je proto provádět náběry za standardizovaných podmínek a řídit se referenčními mezemi dle věku, pohlaví a rasy. Nejméně ze všech metod je ovlivněna TRAP5b (diurnální rytmus, strava, ledvinné funkce) Standardní odběr je prováděn v dopoledních hodinách mezi , nalačno. Zdroje biologické variability u kostních markerů: Neovlivnitelné : Věk - kostní remodelace je závislá na věku především u dětí. Kostní remodelaci je třeba hodnotit v korelaci s fázemi růstu individuálního pacienta (růstovou křivkou), ve středním věku jsou hadiny víceméně stabilní, stejně jako kostní hmota a mineralizace. Změny nastávající ve stáří ( napřed vzestup osteoresorbce a od 70. roku i pokles novotvorby) nejsou fyziologické a jsou velmi individuální. Diurnální rytmus - hlavním řídícím systémovým hormonem kostního metabolizmu je PTH. PTH má bifázický cirkadiánní rytmus s mírným zvýšením mezi hod, maximálními hodnotami mezi a nejnižšími hladinami mezi dopoledne. Stejný diurnální rytmus kopírují markery kostní remodelace. Pohlaví - hodnoty kostní remodelace se liší dle pohlaví, kde reflektují rozdílnou koncentraci estrogenů a androgenů. Rasa - hodnoty parametrů kostní remodelace se liší dle rasy. 295

296 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 Ovlinitelné : Fyzická námaha - zátěž ovlivňuje řízení kostní remodelace skrze tlumení produkce sklerostinu, musí být dlouhodobá opakovaná, extrémní jednorázové zatížení Strava - požití stravy vede k prudkému poklesu kostní resorbce a mírnému vzestupu novotvorby. Užívání chodroprotektiv obsahující kolagen typu I ovlivní hladiny degradačních kolagenních markerů CTX a NTX Během dne minimální diurnální rytmy, koncentrace jsou závislá na stravě, odběry provádět nalačno. Stabilita: Osteokalcin Intaktní osteokalcin je v séru poměrně rychle proteázami degradován na N-MID fragment o 43 AMK, je proto důležité užívat metody stanovující jak intaktní, tak MID fragment osteokalcinu, pak jsou hodnoty stabilní. Sérum,Li-heparinová a K3-EDTA plazma, Hemolýza vadí, erytrocyty obsahují proteázy, které rozkládají osteokalcin. Stabilita séra a heparinizované plazmy: 8 hodin při C, 3 dny při 2-8 C, 3 měsíce při -20 C. Zmrazit jen jednou. Stabilita EDTA plazmy: 2 dny při C, 3 dny při 2-8 C,3 měsíce při -20 C. Zmrazit jen jednou 296

297 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 PINP Sérum s nebo bez separačního gelu, Li-heparinová a K3-EDTA plazma. Stabilní 24 hodin při C, 5 dnů při 2-8 C, 6 měsíců při -20 C. Vzorky mohou být zmraženy a rozmraženy až 5krát bez nepříznivého vlivu. Bone ALP detekce antigenu, ne aktivity, sérum stabilní minimálně 14 dní při pokojové teplotě, není ovlivněno opakovaným zmrazením a rozmrazením do 5 cyklů CTX ( beta crosslaps) Stabilita séra: 8 hodin při C, 8 hodin při 4-8 C. Stabilita heparinované plazmy: 24 hodin při C, 24 hodin při 4-8 C. Stabilita EDTA plazmy: 24 hodin při C, 8 dní při 4-8 C. Sérum, heparinovaná a EDTA plazma jsou stabilní 3 měsíce při -20 C. Pro delší období skladujte při -70 C. Zmrazit jen jednou. Hemolyzované vzorky (Hb >0.5 g/dl) vyvolávají pokles koncentrace β-ctx ICTP Sérum, stabilita 5 dní při 4 C TRAP5b: 12 hodin v plné krvi při pokojové teplotě či 4 C, sérum 48 hodin při 4 C,1 měsíc při -20 C 297

298 Kostní metabolizmus Interpretace výsledků Referenční meze Referenční meze jsou závislé na věku, rase a pohlaví. KAPITOLA 25 Jsou ovšem závislé i na použité metodě stanovení, proto nejsou uvedeny Specifické poruchy kostního metabolizmu Osteoporóza: 1. Involuční (senilní) 2. Endokrinní: 1. Nedostatek estrogenů 2. Hyperparatyreóza 3. Tyreotoxikóza 4. Diabetes mellitus 5. Nadbytek glukokortikoidů 6. Hypogonadismy 3. Neendokrinní 1. Chronické hepatopatie 2. Revmatismus 3. Immobilizace 4. Iatrogenní: 1. Kortikoidy 2. Furosemid 3. Imunosupresiva 4. Chemoterapie 5. Ozařování 6. Nedostatek vitaminu K Kostní mineralizace a věk: Maxima kostní hmoty dosahují obě pohlaví kolem dekády života. V následujícím období do zhruba 50-ti let věku je kostní hmota relativně konstantní, a to za předpokladu fyziologického stavu - normální příjem vápníku, přiměřená fyzická aktivita, normální reprodukční status a nepřítomnost chorob či vlivů vyvolávajících sekundární osteoporózu. V stáří dochází k hormonálním změnám, které ovlivňují kostní mineralizaci, zároveň se zvyšuje frekvence sekundární hyperparatyreózy při deficitu vitaminu D a vápníku, v pozdějším věku se přidávají involuční změny např. snížení fyzické aktivity, pokles produkce hormonů atd. Vzniká onemocnění zvané osteoporóza. 298

299 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 Osteoporóza je dle WHO definována jako systémové onemocnění kostí, které je charakterizované nízkou kostní hmotou a poruchou mikroarchitektury kosti, což vede ke zvýšené kostní fragilitě a tím se zvyšuje riziko prodělání zlomeniny. Hodnocení kostní minerální density (BMD) je prováděno nejčastěji duální dvoufotonovou kostní denzitometrií (DXA). Naměřená denzita kostního minerálu je pak srovnávána s průměrnou hodnotou u mladých zdravých jedinců téhož pohlaví (tzv. T-skóre) a s průměrem u stejné věkové kategorie (tzv. Z-skóre). V případě osteoporózy nalezneme T-score nižší než -2,5 SD (minerál i osteoid ubývá proporcionálně). Nízká kostní hmota odpovídá hodnotě T score -2,5 SD a nižší měřené celotělovým rentgenovým denzitometrem. (minerál i osteiod ubývá proporcielně) 299

300 Kostní metabolizmus KAPITOLA 25 Osteomalácie je sice rovněž systémové postižení kostí, ale v tomto případě se jedná o poruchu mineralizace osteoidu. U dětí s neuzavřenými epifyzárními chrupavkami se o této poruše mluví jako o křivici (rachitis), (chybí minerál a množství osteiodu je v normě). Osteoporóza postmenopauzální z nedostatku estrogenů: Nedostatek estrogenů způsobený menopauzou vede ke snížení sekrece OPG a růstu produkce cytokínů (RANKL, M-CSF, IL6, IL- 11). To vede ke zvýšené aktivaci osteoklastů a tlumení činnosti osteoblastů. Zvyšuje se tedy kostní remodelace a to především složka osteoresorbční. Zvýšené množství uvolněného kalcia z kostí vede ke snížení sekrece PTH, tím ke zvýšení kalciurie a snížení produkce 1,25 (OH) 2 Vitaminu D. Celková denní ztráta kalcia ze zvyšuje asi na trojnásobek. Podání estrogenů normalizuje patofyziologický mechanizmus a zabraňuje ztrátě kostní hmoty. Postihuje ženy v období zhruba 10 let po menopauze. Lab: zvýšená osteoresorbce a normální či snížená novotvorba Involuční (senilní) osteoporóza Jde o multifaktoriální etiologii, kdy vzniká sekundární hyperparatyreóza při deficitu vitaminu D a jeho konverze v ledvinách, snížení fyzické aktivity, nedostatek androgenů i estrogenů ale i dalších anabolicky působících hormonů (IFG1), často poruchy stravy proteinové malnutrice a dále koincidující medikace a onemocnění. Lab: osteoresorbce i novotvorba jsou sníženy či v dolním kvartilu referenčních mezí Osteoporóza indukovaná glukokortikoidy (GIOP): Chronické podávání glukortikoidů per orálně či intravenózně (netýká se substituční terapie u adrenální insuficience) vede k 300

301 Kostní metabolizmus rychlé indukci osteoporózy. Ubývá především trabekulární kost (maximum zlomenin v axiálním skeletu-obratle), maximum úbytku je během prvních 12 měsíců léčby. Úbytek je závislý na dávce, typu léku, věku, pohlaví, BMD a individuální citlivosti. Mechanizmus indukce osteoporózy: A. Přímý efekt: 1. Snížení kostní novotvorby 1. Počet a diferenciace osteoblastů a jejich apoptóza 2. Snížení syntézy osteoidu (kolagenu I) 2. Zvýšení kostní resorpce KAPITOLA 25 B. Nepřímý efekt: 1. Indukce deficitu kalcia 1. Snížení resorpce kalcia ve střevě a zvýšení degradace 1,25 (OH) 2 D 2. Snížení renální tubulární reabsorpce - hyperkalciúrie 2. Snížení sekrece GH a IGF-1(anabolického efektu) 3. Snížení sekrece pohlavních hormonů Lab: osteoresorbce zvýšena, novotvorba snížena ( PINP především), sekundární hyperparatyreóza Osteoporóza indukovaná Tyreotoxikózou 301

302 Kostní metabolizmus Exces tyreoidálních hormonů vede ke zvýšení kostního obratu, negativní kalciové bilanci a úbytku trabekulární kosti. Lab: osteoresorbce zvýšena více než novotvorba Osteoporóza indukovaná imobilizací Zvýšení hladin sclerostinu vede ke zvýšení osteoresorbce na negativní kalciové bilanci a é bilanci, pokles kostní novotvorby Lab: osteoresorbce zvýšena mnohem více než novotvorba, hyperkalciúrie Osteomalácie, křivice (rachitis) KAPITOLA 25 Nejčastější příčinou je nedostatek vitaminu D s následnou malabsorpcí minerálů v tenkém střevě. Tento fakt vede k abnormální mineralizaci novotvořeného osteoidu, jeho zvýšené tvorbě a nedostatečné osifikaci. U dětí je kromě kosti postižena i epifyzární chrupavka a dochází ke vzniku kostních deformit. Příčiny osteomalacie: 1. Z nedostatku vitaminu D 2. Poruchy metabolismu vitaminu D (hereditární, antikonvulziva) 3. Malabsorpční syndrom 4. Renální acidóza (primární i sekundární) 5. Deplece fosfátů Lab: vysoce zvýšená kostní remodelace (novotvorba tak osteoresorbce). Dále přítomna porucha kalciofosfátového metabolizmu dle vyvolávající příčiny ( nízký vitamin D, nízký či normální vápník, nízký fosfor, zvýšený PTH) Ostatní vybrané, časté osteopatie: Hyperparatyreóza, hypoparatyreóza ( viz kapitola kalciofosfátový metabolizmus) Kostní a minerálová porucha při chronickém renální selhání (CKD-MBD) dříve renální osteodystrofie, renální kostní choroba Je nyní definována buď jako povrchu kalciofosfátového metabolizmu a kostní remodelace ( laboratorní komponenta) nebo kostní komponenta (histologické změny v kostní tkáni) a nebo kalcifikační komponenta ( přítomnost kalcifikací mimo skelet). Pro diagnózu CKD-MBD stačí splnění alespoň v 1 komponentě. Selhání ledvin vede v počáteční fázi ke zvýšeným nárokům na vylučování fosfátů, zvyšuje se tedy produkce FGF23, která vede k poklesu tvorby aktivního kalcitriolu v ledvinách, následně poklesu vstřebávání vápníku (hypokalcémie, či dolní kvartil normy) a rozvoji sekundární hyperparatyreózy. Tento nález pak patří k histologickému obrazu osteopatie s vysokým kostním obratem (osteitis fibrosa). Naproti tomu existuje přibližně stejně velká skupina pacientů s adynamickou kostní chorobou. Zde nalézáme většinou nízké hladiny PTH, kostní remodelace a histologicky buněčně chudá kost bez známek remodelace. Zbylých 10 % přestavuje smíšený typ vysokobratové a nízkoobratové kostní choroby. Prakticky zanedbatelný je dnes výskyt osteomalácie z deficitu vitaminu D s typicky nízkou kostní remodelací. U CKD stádia 3-5 je přibližně následující zastoupení jednotlivých forem: Osteitis fibrosa 32%, Mild disease 6%, normální kostní remodelace 16 %, osteomalacie 8%, adynamická kostní choroba 18 %, smíšená choroba 20% Lab: Osteitis fibrosa : vysoká kostní remodelace, PTH II. generace často nad 300pg/ml, kostní mineralizace v normě Adynamická kostní choroba a Osteomalácie : nízká kostní remodelace, PTH II generace snížený či odpovídá hodnotám zdravých, porušená kostní mineralizace Smíšená kostní choroba : normální či mírně zvýšena kostní remodelace, PTH II generace středně zvýšený, porušená kostní mineralizace Hyperkalcémie u nádorových onemocnění: Kostní metastázy se nejčastěji vyskytují u karcinomů prsu (73%), prostaty (68 %), štítné žlázy (42%), ledvin (35%) a plic (36%). V případě mnohačetného myelomu se jedná přímo o primární postižení kostní dřeně. Nejčastějším důvodem hyperkalcémie u nádorových onemocnění je nadprodukce PTHrP (parathormonu podobný protein), kte- 302

303 Kostní metabolizmus rý podobně jako PTH, trvale zvýšená hladina vede osteoresorbci a hyperkalcémii. Vznik metastáz je spojen se schopností primárního nádoru vytvářet a uvolňovat do krevního oběhu mikrometastázy. Kost pak poskytuje vhodné prostředí plné růstových faktorů. Metastazující nádorové buňky mají schopnost stimulovat osteoklasty či osteoblasty pomocí jimi produkovaných cytokinů, Výsledkem je zvýšená osteoresorbce vedoucí k osteolytickým metastázám či novotvorba vedoucí osteoplastickým metastázám. Na druhé straně stimulované kostní buňky uvolňují řadu růstových faktorů, které zpětně podporují růst nádoru (circulus vitiosus). Nádorové mikrometastázy nejsou vždy histologicky homogenní. Často vznikají smíšené metastázy složené jak z osteolytických tak osteoplastických ložisek. Lab: Míra změny kostní remodelace je přímo úměrná rozsahu metastatického postižení a samozřejmě i aktivitě nádorových a kostních buněk. ( solitární malá metastáza se na hodnotách kostních markerů většinou neprojeví) Osteolytické metastázy - zvýšená osteoresorbce především ICTP, CTX, ICTP je více specifický pro kostní metastázy, neboť nádorové buňky častěji odbourávají pomocí MMP-9, jejíž produktem je ICTP Osteoplastické metastázy - zvýšený PINP, méně bone ALP Smíšené metastázy - zvýšená kostní remodelace ( osteoresorbce i novotvorba) KAPITOLA 25 Morbus Paget Pagetova choroba je lokalizované kostní onemocnění, kdy je porušena regulace kostní remodelace. Dojde k poškození funkce osteoklastů, které lokálně začnou trvale resorbovat kost, kompenzatorně k tomu, je zvýšena novotvorba. Výsledkem je tvorba dezorganizované směsi trámčité a lamelární kosti. To způsobuje deformity a zvyšuje náchylnost k patologickým zlomeninám. 303

304 Kostní metabolizmus Lab: zvýšená kostní remodelace, především hodnoty ALP, kalciofosfátový metabolizmus je většinou normální. KAPITOLA 25 Literatura: 1. RE.Coleman et al: Handbook of Cancer Related Bone Disease,, BioScientifica, Bristol, 2010, UK 2. R.Eastell: Bone Markers, Martin Dunitz Ltd, London I.Sotorník, Š. Kutílek a kol.; Kostní minerály a skelet při chronickém onemocnění ledvin, Galén, Praha R. Rizzoli : Atlas of Postmenopausal Osteoporosis, 2nd Edition, Current Medicine Group, London C.J. Rosen;, Primer on Bone Metabolic Diseases and Disorfders of Mineral Metabolism 7th Ed, ASBMR, Washington, V. Vyskočil: Osteoporóza a ostatní nejčastější metabolická onemocnění skeletu, Galén, Praha, L. de Groot, J.L.Jameson; Endocrinology 4th Edition, Vol2W.B Sounders, S. Dusilová Sulková: Diagnostika, prevence a léčba kostní a minerální poruchy při chronickém onemocnění ledvin (CKD- -MBD):KDIGO doporučení a navazující iniciativy národních a nadnárodních pracovních skupin, Osteologický bulletin 17, 2012/1, M.Luchavová, V. Zikán: Cirkadiánní rytmus PTH a jeho role v kostním metabolizmu, Osteologický bulletin 15, 2010/3, KDIGO Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis, Evaluation, Prevention, Treatment of Chronic Kidney Disease Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD), Kidney International vol 76, supl 113, : 304

305 Funkční zkoušky ledvin Funkční zkoušky ledvin Autor: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. Recenzenti: Mgr. Radka Šigutová, MUDr. Věra Ploticová, MUDr. Marie Šolcová KAPITOLA 26 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Souhrn: Ledviny jsou metabolicky velmi aktivní orgán, který se významně podílí na udržování optimálního vnitřního prostředí. Některé ledvinné funkce testujeme i v běžné klinické praxi. Patří sem vyšetření glomerulární filtrace a některých tubulárních funkcí. Glomerulární filtrace zajišťuje očistu krve od odpadních látek. Přes filtrační póry glomerulární membrány (lze zjednodušeně přirovnat k otvorům v sítu) se neustále tlačí krev a na druhou stranu ( močovou ) se dostanou jen látky s malou molekulou 1. Přefiltrovaná tekutina ( ultrafiltrát plazmy neboli primární moč) je pak postupně vystavena účinku ledvinných tubulů, které zpět do krve vrací látky potřebné (např. vodu nebo minerály) a naopak odpadní látky dále do moči vylučují (např. vodíkové ionty). Vyšetření glomerulární filtrace (GF) Mluví-li se o ledvinných testech, často se (nepřesně) myslí pouze na způsoby určení glomerulární filtrace. Podle velikosti glomerulární filtrace upravujeme např. dávku některých léků vylučovaných ledvinami (např. antibiotikum gentamicin nebo nízkomolekulární hepariny), podání některých látek můžeme i kontraindikovat (obvykle nefrotoxické látky - např. rentgen kontrastní látky nebo protinádorový lék cisplatina), usuzujeme na vývoj ledvinné nedostatečnosti nebo indikujeme mimotělní očišťovací metodu ( dialýzu ). Glomerulární filtrace s věkem (po dosažení dospělosti) obvykle klesá, v těhotenství naopak asi o 50 % stoupá, referenční rozmezí se liší i dle pohlaví. Kreatinin v séru (S_krea) a výpočty od něj odvozené Kreatinin je tvořen ve svalech z kreatinu a kreatinfosfátu (molekuly, které svalu poskytují energii). Kreatinin má malou molekulu, glomerulárním sítem tedy projde beze zbytku. V tubulech je však částečně secernován (< 10 % u zdravého člověka) - tuto chybu 2 obvykle zanedbáváme, je třeba s ní však počítat zejména v pokročilejších stádiích renální insuficience (se stoupající koncentrací sérového kreatininu stoupá i procento vyloučené tubulární sekrecí do moče). Největším limitem použití kreatininu jako ukazatele GF je závislost na svalové hmotě. Produkce kreatininu je tedy různá u svalovce a kachektického pacienta, s věkem fyziologicky svalová hmota klesá, ženy mívají (oproti mužům) menší svalovou hmotu... Proto u pacientů, kteří nemají průměrnou svalovou hmotu 3 jsou odhady GF založené na sérovém kreatininu zatíženy velkou chybou. K odhadu GF pomocí sérového kreatininu můžeme použít: přímo sérovou koncentraci kreatininu - problémem tohoto přístupu je nepraktické hodnocení vůči referenčnímu rozmezí, které se liší dle věku a pohlaví. Pro lékaře je pak relativně obtížné kvantitativně si představit vztah mezi GF a aktuální hodnotou sérového kreatininu u daného pacienta. různé výpočty, které kromě sérového kreatininu zohledňují obvykle i věk a pohlaví (ev. rasu - afroameričané mívají větší 1 Orientačním limitem velikosti molekuly je 70 kda - jsou-li molekuly větší, zdravou glomerulární membránou neprojdou. Nicméně filtrace je závislá i na náboji filtrované molekuly a dalších faktorech (viz Úvod do tématu). 2 Ideální marker glomerulární filtrace je plně filtrován glomerulem a v tubulech není resorbován ani secernován. A samozřejmě je levný, snadno a spolehlivě měřitelný... 3 Adekvátní k věku a pohlaví. Neadekvátní (malou) svalovou hmotu budou mít např. lidé podvyživení, upoutaní na lůžko (např. po iktu), v těžkém stavu (operace, infekce, sepse, popáleniny). V takových případech budou odhady GF ze sérového kreatininu vyšší než skutečná hodnota (falešné nadhodnocení). Naopak neadekvátně velkou svalovou hmotu budou mít sportovci (zejména silové sporty). 305

306 Funkční zkoušky ledvin svalovou hmotu) a výsledek vyjádří v obvyklých jednotkách pro GF (ml/s). Kvantitativní interpretace je pak jednodušší. Jako příklad výpočtu může sloužit rovnice MDRD (Modification of Diet in Renal Disease). Aktuálně je nejrozšířenější její tzv. čtyřparametrická verze, která zahrnuje sérový kreatinin, věk, pohlaví a rasu (pouze pro afroameričany). Rovnice MDRD je doporučena jako screeningová populační metoda pro zachycení snížené GF. Rovnici nelze použít pro děti a těhotné 4. Druhým problémem (kromě závislosti na svalové hmotě) je u kreatininu metoda stanovení. Principem stanovení je reakce s kyselinou pikrovou v silně alkalickém prostředí 5. Je známo relativně mnoho interferujících látek (např. acetoacetát, protein, glukóza ), které většinou vedou k falešně vyšším výsledkům. Různými postupy se tyto interference daří (alespoň částečně) minimalizovat. Existuje snaha o prosazení enzymatické metody stanovení kreatininu, která těmito interferencemi netrpí. Je jisté, že výsledky této metody jsou systematicky nižší (oproti Jaffého metodě), nicméně není jasné, jestli to má význam pro klinickou praxi 6. KAPITOLA 26 Cystatin C v séru Cystatin C je nízkomolekulární protein (13 kd), fyziologický inhibitor cysteinových proteáz. Je tedy důležitou součástí rovnováhy mezi proteázami a antiproteázami. Proto je většinou exprimován v konstantním množství všemi jadernými buňkami. Zároveň je to mikroprotein, který proniká volně glomerulární membránou a je plně resorbován a degradován buňkami proximálního tubulu. Při poklesu GF je tedy (obdobně jako ostatní mikroproteiny 7 ) zadržován a jeho koncentrace v séru se zvyšuje a odpovídá poklesu GF. Existují také výpočtové vztahy, které koncentraci cystatinu C v séru vyjádří v jednotkách pro GF (ml/s). Výhody použití cystatinu C v séru jsou: časnější detekce počátečních forem glomerulárního poškození (u akutního ren. selhání reaguje o 1-2 dny dříve než S_krea) bez sběru moče, bez rozdílu mezi pohlavími bez analytických interferencí Nicméně podmínka, že je produkován v konstantním množství samozřejmě není absolutně pravdivá - je známo, že např. kortikoterapie, zvýšená funkce štítné žlázy nebo některé tumory zvyšují jeho produkci, obdobně i diabetes mellitus nebo pohlaví jistý vliv na produkci cystatinu C má. Je však také jisté, že tento vliv je mnohem menší než u S_krea. Odhad GF dle hodnot sérového cystatinu C se prosazuje zejména u dětí a těhotných. Někteří doporučují u hospitalizovaných pacientů měřit jak odhad GF dle MDRD, tak i dle sérového cystatinu C 8. Clearance kreatininu Někdy také nazývaná clearance endogenního kreatininu 9. Všechny metody založené na měření clearance 10 nějaké látky se snaží přiblížit ideálu, tedy že daná látka bude plně filtrovaná v glomerulech, nebude podléhat tubulární sekreci ani resorpci a že bude snadno měřitelná (a procedura nebude zatěžující pro pacienta). Kreatinin je plně filtrován, nicméně také částečně secernován v tubulech (viz kapitola Kreatinin v séru (S_krea) a výpočty od něj odvozené ). Teoreticky lze vzorec pro clearance kreatininu odvodit ze vztahu 11 : 4 Existuje mnoho dalších rovnic - pro děti se používá Schwarzova rovnice = 0,6 * výška (cm)/ * S_krea (µmol/l) [faktor 0,6 je jen orientační - pro přesnější výpočet se liší dle věku a pohlaví], nověji pro děti od 1 roku a dospělé rovnice Lund-Malmö, CKD-EPI Všechny jsou založeny na S_krea a obvykle se liší pouze populací, na které byly validovány (a pro kterou jsou tedy platné). U těhotných výpočtové vztahy založené na S_krea nepoužíváme - vhodné jsou však další možnosti: cystatin C v séru a clearance kreatininu. 5 Tzv. Jaffého reakce, látky reagující s činidlem se nazývají také Jaffé pozitivní chromogeny. 6 Není zřejmé u jakého procenta lidí by došlo k chybné klinické klasifikaci snížení GFR. Pozitivní bias stanovení kreatininu Jaffého metodou, které nacházíme zejména u sérových koncentrací < 140 µmol/l, může být minimalizován rekalibrací na referenční metodu ID-MS. Stále je asi největším zdrojem chyb ovlivnění svalovou hmotou a vylučování v tubulech. 7 Např. β 2 -mikroglobulin, amyláza nebo myoglobin. 8 Podle ev. diskrepance mezi jednotlivými odhady a anamnézy můžete pak usuzovat, který z výsledků se přibližuje realitě. Např. u kachektického člověka bude asi odhad z MDRD významně nadhodnocen a naopak u člověka na kortikoterapii bude odhad GF ze sérového cystatinu C podhodnocen (viz také dále). 9 Aby se zdůraznilo, že jde o látku vzniklou v těle, ne exogenně dodanou (jako je tomu např. u inulínu). 10 Clearance je virtuální objem plazmy očištěný od dané látky za jednotku času (jednotka je např. ml/s). 11 To, co do glomerulu vchází se rovná tomu, co vyloučíme. V případě kreatininu víme, že je vylučován tubuly do moči, tedy jeho koncentrace v moči je oproti ideálu vyšší. Proto je i odhad GF odvozený z clearance kreatininu lehce nadhodnocený. Toto nadhodnocení se zvyšuje se zvyšující se koncentrací S_krea a nad 180 µmol/l by se clearance kreatininu neměla používat (je to i zbytečné). 306

307 Funkční zkoušky ledvin GF * S_krea = V * U_krea; tedy GF = V * U_krea/S_krea [hodnoty se přepočítávají na standardní povrch 1,73 m 2 ] Clearance kreatininu používáme hlavně v časné diagnostice snížení GF nebo při vyšetření GF v těhotenství. V pozdějších stádiích snížení GF je vhodnější používat sérový kreatinin a výpočty na něm založené. Největší nevýhodou clearance kreatininu je nutnost sběru moče - obvykle 24 hodin. Chyby sběru (neúplný sběr) jsou velmi časté a výrazně znehodnocují výsledek vyšetření 12. Proto je obecně odklon od metod, které sběr moče vyžadují. KAPITOLA 26 Praktický přístup k hodnocení GF Zejména v nemocniční praxi je vhodné použít k odhadu GF jak postupy založené na S_krea, tak i odhad z hodnot sérového cystatinu C. Máme pak 2 nezávislé odhady a mohou nastat 3 situace: 1. oba odhady jsou (přibližně) shodné - hodnotu odhadů považujeme za reálnou 2. odhad GF z cystatinu C << MDRD a. příčinou diskrepance je snížená svalová hmota u pacientů upoutaných na lůžko, trpících chronickými chorobami, katabolickými stavy. MDRD odhaduje svalovou tkáň jen z věku a pohlaví (ev. rasy), úbytek svalů zmíněný výše neumí zohlednit. Snížená produkce kreatininu tak vede k relativně nižší hladině S_krea, ze kterého MDRD odvodí falešně vysokou hodnotu GF. Odhady založené na S_krea výrazně nadhodnocují, řídíme se odhadem z cystatinu C. b. pacient bere kortikosteroidy nebo má hypertyreózu - produkce cystatinu C je tedy zvýšená a koncentrace v séru je vyšší, než by odpovídalo GF. Odhad GF z cystatinu C tedy podhodnocuje a řídíme se odhadem z S_krea 3. odhad GF z cystatinu C >> MDRD - příčinou je buď nezvykle velká svalová hmota pacienta (vyšší než očekávaná produkce kreatininu -> vyšší S_krea -> falešně nižší odhad GF z MDRD) nebo GF v pásmu nad 1,5 ml/s. V tomto pásmu odhady založené na S_krea obvykle nejsou validovány a jejich přesnost klesá. Kazuistika 1 86 letá žena byla přivezena sanitkou z domova s pečovatelskou službou, kde byla dlouhodobě upoutána na lůžko pro septické teploty (3. den opakovaně nad 40 C). Chronická medikace: antihypertenzivum (perindopril), furosemid; akutní medikace: Augmentin (empiricky). Při přijetí jsme v séru naměřili (výběr patologických výsledků) - S_krea: 160 µmol/l, urea 26 mmol/l, Na 131 mmol/l, K 5,8 mmol/l. V moči - U_ery: 96/µl, U_leuko: 670/µl, nitrity: +++, ph 8,6. Vyslovte hypotézu, jaká je diagnóza, vysvětlete pravděpodobnou příčinu (příčiny) naměřených patologických výsledků, navrhněte doplňující vyšetření. Je pravděpodobné, že pacientka má významně sníženou glomerulární filtraci (dle MDRD 0,45 ml/s). Vzhledem k disproporcionálně vysoké močovině se dá usuzovat na prerenální (a akutní) složku. Zároveň jsou jasné známky uroinfekce v močovém sedimentu (vysoké ph, leukocyty, poz. nitrity). Vzhledem k anamnéze je zřejmé, že pacientka má významně snížený objem svalové hmoty (dlouhodobá imobilizace, aktuálně katabolický stav). Indikujeme proto vyšetření cystatinu C. GF odhadnutá z cystatinu C byla 0,25 ml/s (tedy odhad dle MDRD byl pravděpodobně významně nadhodnocen). Příčinou stavu byla uroinfekce spojená s nechutenstvím a nedostatečným přívodem tekutin + kombinace s přetrvávajícím užíváním furosemidu. To vedlo k prerenálnímu akutnímu selhání ledvin, zadržování vody (hyponatrémie) a nedostatečnému vylučování draslíku (hyperkalémie) 13. Po antibiotické terapii uroinfekce (dle mikrobiologického zjištění patogena a jeho citlivosti na antibiotika) a adekvátní hydrataci se stav postupně zlepšil a pacientka byla propuštěna s GF dle cystatinu C 0,75 ml/s. Vyšetření tubulárních funkcí Hlavní funkcí tubulů je vstřebávání a sekrece různých látek (např. Na +, K +, Cl -, H +, HCO 3-, vody) - podrobnosti nejdete v úvodu do klinické biochemie ledvin. Metabolicky nejaktivnější je proximální tubulus, ale i další části nefronu jsou v tomto ohledu důležité. Sekrece a resorpce: Frakční exkrece nízkomolekulárních látek 12 Pacienta instruujeme, aby se ráno po probuzení vymočil, pak celý den sbíral do sběrné nádoby (nádob) a poslední vzorek (ráno dalšího dne) sebral taktéž do nádoby. Celý objem sebrané moči je nutné zamíchat (v jedné nádobě), změřit objem (s přesností na 10 ml) a odebrat reprezentativní vzorek. Je zřejmé i prakticky podložené, že tato procedura vede k častým chybám. 13 K hyponatrémii a hyperkalémii mohla částečně přispět i terapie ACEI. 307

308 Funkční zkoušky ledvin Frakční exkrece (FE) je ta část z celkového množství profiltrované látky, kterou najdeme v definitivní moči. Např. ledviny profiltrují cca 180 l primární moči (ultrafiltrát plazmy) denně a vymočíme cca 1,8 l denně. Předpokládáme-li, že moč (primární i definitivní) je hlavně voda, pak FE vody je 1,8 ze 180 = 1 %. Odvození vzorce pro výpočet FE si demonstrujeme na příkladu FE sodíku: 1. profiltrované množství sodíku v mililitrech za sekundu je glomerulární filtrace [GF; ml/s] * plazmatická koncentrace sodíku [P Na ; mmol/l] 2. vyloučené množství sodíku do moče v mililitrech za sekundu je objem moče [V; ml/s] * koncentrace sodíku v moči [U Na ; mmol/l] 3. FE = vyloučené množství/profiltrované množství KAPITOLA 26 dosadíme-li za GF clearance kreatininu (U krea * V / P krea ): Ze vzorce vyplývá, že pro výpočet FE nepotřebujeme 24 h sbíranou moč (objem V se vykrátí ), optimální je krátký sběr (např. 4 hod.) k vyrovnání krátkodobých efektů (příjem tekutin ). Místo koncentrace sodíku v séru a moči můžeme dosadit jakoukoli nízkomolekulární látku, jejíž FE chceme vypočítat (např. draslík, viz níže). FE vody se tedy vypočítá jako poměr plazmatické a močové koncentrace kreatininu (U x a P x ze vzorce nedosazujeme, protože podíl vody [ koncentrace vody] v primární moči i v definitivní moči je zhruba stejný). Je zřejmé, že přestože je FE známkou tubulárních funkcí, není na GF zcela nezávislá. Aby nedošlo k významné změně vnitřního prostředí, musí vést pokles GF ke kompenzačnímu zvýšení FE 14. Příklady použití FE: FE vody Referenční rozmezí (RR): 1-2 %; max.: 35 % zvýšení: zvýšený příjem tekutin, diuretika, diabetes insipidus, tubulopatie, tubulární kompenzace poklesu GF snížení: dehydratace... FE Na RR: 0,4-1,2 %; max.: % zvýšení: diuretika, zvýšený příjem, tubulopatie, tubulární kompenzace poklesu GF, hypoaldosteronismus, některé léky (léky blokující osu reninu - inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu [ACEI], spironolakton ) snížení: extrarenální ztráty, nedostatek Na, hyperaldosteronismus FE K RR: 4-19 %; max.: % 15 zvýšení: diuretika, zvýšený příjem, hyperaldosteronismus, katabolismus, tubulopatie, tubulární kompenzace pokleu GF snížení: extrarenální ztráty, nedostatek K, hypoaldosteronismus, léky (kalium šetřící diuretika, ACEI ), anabolismus FE bikarbonátu - při diagnostice proximální renální tubulární acidózy (II. typu) je zvýšená. 14 Jinak by např. po poklesu GF na polovinu (ze 180 l/den na 90 l/den) došlo (při zachované FE vody = 1%) k vyloučení polovičního množství vody definitivní močí (pokles diurézy z 1,8 l na 0,9 l) a voda by se v organismu hromadila. Patofyziologickým podkladem poklesu GF je snížení počtu funkčních nefronů, tyto zbylé - tzv. reziduální - nefrony pak musí vynaložit zvýšené úsilí, aby při menším počtu vyloučily tubuly stejné množství odpadních látek. 15 FE vyšší než 100 % znamená, že se vyloučí více látky než je profiltrováno v primární moči (způsobeno aktivní sekrecí v tubulech). 308

309 Funkční zkoušky ledvin FE amylázy - je-li < 1%, podezření na makroamylázémii (viz GIT). Koncentrační schopnost ledvin Hlavní fyziologická regulace vstřebávání vody je účinkem antidiuretického hormonu (ADH). Ten působí převážně v distálním tubulu a sběrných kanálcích na receptory otevírající akvaporinové kanály (kanály pro vodu). Hlavním stimulem pro sekreci ADH v hypotalamu je zvýšená osmolalita séra (ale reaguje i na pokles tlaku a jiné stimuly - např. zvracení, viz přípravy). Zjednodušeně můžeme rozlišovat tyto poruchy sekrece ADH: diabetes insipidus (DI) nedostatečná sekrece ADH (centrální DI - poruchou hypotalamu nebo neurofýzy) nedostatečný efekt ADH (nefrogenní DI - porucha funkce tubulů; vrozené nebo získané tubulopatie - např. tox. účinek kovů Cd, Hg, Li, Pt + dalších látek - furosemid, gemtamicin, RTG kontrastní látky a vliv těžkých iontových dysbalancí - hypokalémie a hyperkalcémie) SIADH - syndrom neadekvátní (inadekvátní) sekrece ADH: hypotalamus produkuje více ADH, než by mělo odpovídat aktuální osmolalitě séra. Vede to ke zvýšenému vstřebávání vody v ledvinách a naředění, které se manifestuje jako hyponatrémie. Příčinou může být onemocnění mozku nebo ektopická produkce při malobuněčném karcinomu plic, TBC či karcinomu pankreatu. KAPITOLA 26 Clearance bezelektrolytové vody (EWC) Clearance bezelektrolytové vody (Electrolyte free water clearance, EWC) je parametr citlivě posuzující poruchy osy ADH-ledviny (zda objem moči odpovídá efektivní osmolalitě a předpokládané sekreci ADH). Jde o rozdíl mezi objemem moči [V; ml/s] a clearance 16 hlavních osmoticky efektivních látek (tzv. elektrolytová clearance, Cl El ; ml/s): Pokud jsou v plazmě a v moči přítomny i jiné efektivní soluty (způsobující přesun vody mezi intracelulárním a extracelulárním prostorem; např. glukóza nebo manitol 17 ), je třeba je ve výpočtu zohlednit. Interpretace EWC: Zvýšená efektivní osmolalita (např. při hypernatrémii) vede ke zvýšení sekrece ADH v hypotalamu a ke zvýšenému vstřebávání vody v ledvinách (klesá objem moči, V). EWC by měla být < 0,005 ml/s. Pokud je vyšší, hypotalamus vylučuje méně ADH než by při dané efektivní osmolalitě měl (jako např. u diabetu insipidu). Snížená efektivní osmolalita (např. při hyponatrémii) vede ke snížení sekrece ADH v hypotalamu a ke zvýšeným ztrátám vody v ledvinách (stoupá objem moči, V). EWC by měla být > 0,116 ml/s. Pokud je nižší, hypotalamus vylučuje více ADH než by při dané efektivní osmolalitě měl (např. při SIADH) Koncentrační test Koncentrační schopnost ledvin chceme určit obvykle při diferenciální diagnostice nevysvětlené polyurie 18. Chceme-li testovat koncentrační schopnost ledvin, můžeme: nechat pacienta žíznit podat syntetický analog ADH (1-deamino-8-D-argininvazopresin = DDAVP) Vždy sledujeme osmolalitu moče (U_osm) jako odraz schopnosti ledvin vstřebat vodu. Obvykle volíme nějakou kombinaci obou postupů - např. pacienta necháme přes noc žíznit (normální stav: spí = nepije) a ráno změříme U_osm. Je-li vyšší než 800 mmol/ kg, nepokračujeme v dalším testování (koncentrační schopnost ledvin je dobrá). V opačném případě můžeme podat DDAVP (intranazálně) a sledovat osmolalitu moče (4 vzorky á 1 hodina). Dosáhne-li U_osm příslušné hodnoty (v tabulkách pro daný věk), 16 Clearance je dle definice virtuální objem očištěný od dané látky (v tomto případě od Na a K) za jednotku času. 17 Naopak urea nebo etanol volně přestupují mezi ICT a ECT, nezpůsobují tedy přesuny mezi těmito prostory a nepovažujeme je proto za efektivní soluty (neovlivňují efektivní osmolalitu). 18 Např. u dekompenzovaného diabetika s polyurií tedy nemá cenu pátrat po její příčině. 309

310 Funkční zkoušky ledvin ledviny reagují na ADH dobře - příčinou polyurie bude tedy nedostatečná sekrece ADH (porucha v hypotalamu nebo hypofýze). Při nedostatečné reakci ledvin se pravděpodobně jedná o nefrogenní DI. Acidifikace a alkalizace moče Tuto schopnost ledvin (viz také Úvod do poruch acidobazické rovnováhy) testujeme výjimečně, prakticky jedinou indikací je diagnostika renální tubulární acidózy (RTA). Obecně zjistíme-li hyperchloremickou acidózu, která není způsobena ztrátami bikarbonátu ze zažívacího traktu, myslíme na RTA. Nejprve bychom se však měli ujistit, že pacient nemá selhání ledvin, hyperparatyreózu a nedostává fyziologický roztok (časté příčiny hyperchloremické acidózy).. Kalémie pak může pomoci při určení typu RTA (Tabulka 1). Acidifikační test používáme k diagnostice renální tubulární acidózy I. typu (Tabulka 26.1). Principem testu je podání acidifikující látky (nejč. chloridu amonného; nelze podat u pacientů s významnou poruchou jaterních funkcí nebo poklesem GF) a následné sledování ph moče (8 x po hodině). Klesne-li ph moče v kterémkoliv vzorku moče (i před testem) pod 5,5, je acidifikační schopnost ledvin zachována (a diagnóza RTA I je nepravděpodobná). KAPITOLA 26 Jak RTA I i II se obvykle léčí podáním bikarbonátu a draslíku, RTA II však vyžaduje výrazně vyšší dávky bikarbonátu. Typ Příčina Poznámky K +<?> I (distální) špatné vylučování H + v distálním tubulu diagnostika acidifikačním testem, fosfátová urolitiáza II (proximální) - špatné vstřebávání HCO 3 v proximálním tubulu diagnostika FE bikarbonátu (alkalizační test <?> ); často spojeno do Fanconiho syndromu (v prox. tubulu se nevstřebá i glukóza, aminokyseliny, fosfáty) III kombinace I a II (vzácně; u nezralých novorozenců) IV špatné vylučování H + a K + v distálním tubulu také u hypoaldosteronismu Tabulka 26.1 Renální tubulární acidózy. Akutní selhání ledvin Akutní selhání ledvin je charakterizováno rychlým vývojem (hodiny až několik dní) zhoršení nebo ztráty funkce ledvin. Vzhledem ke kontinuálnímu přechodu mezi zhoršením funkce a ztrátou (selháním) je v moderní literatuře používán termín akutní poškození ledvin (acute kidney injury, AKI). AKI je velmi časté 19, zejména u pacientů v intenzivní péči, často se proto vyskytuje spolu s dalšími onemocněními (selhání srdce, sepse ) a mnohdy nasedá na chronickou renální insuficienci ledvin. Důležitým rozdílem (oproti chronickému selhání ledvin) je, že AKI je potenciálně reverzibilní (i když zdaleka ne vždy). Tradičně se akutní selhání ledvin dělí na: prerenální - nejčastější; obvykle způsobené selháním srdce, hypovolémii (ztráty krve a tekutin) nebo hypotenzí (sepse, léky), méně často s uzávěrem renální tepny -> nízký perfúzní tlak (často potencováno medikací ACEI nebo nesteroidními proti zánětlivými léky [NSAID]) renální - může být způsobeno např. glomerulonefritidou, nefrotoxiny (aminoglykosidy, těžké kovy, cisplatina, Li, NSAID) postrenální - bilaterální obstrukce (není-li jen jedna fungující ledvina) odvodu moče, nejčastěji tedy tumory prostaty, děložního čípku a močového měchýře, ev. retroperitonea; popř. oboustranná nefrolitiáza (viz Kazuistika 2). U pre- i postrenálního selhání ledvin se postupně vždy vyvíjí i poškození ledvin (renální selhání), nicméně zpočátku jsou tubulární funkce zachovány (koncentrační schopnost, tubulární resorpce ) a to nám pomáhá odlišit jej od renální příčiny (Tabulka 26.2). 19 Uvádí se kolem 7 % pacientů přijatých do nemocnice; mortalita u pacientů s AKI na jednotkách intenzivní péče bývá > 50 %. Čím časněji se AKI odhalí, tím lepší prognóza nemocného. 310

311 Funkční zkoušky ledvin Parametr Prerenální Renální U Na (mmol/l) < 20 > 40 FE Na (%) < 1 > 2 U osm (mmol/kg) > 400 < 350 U osm / P osm > 1,5 < 1,1 U urea / P urea > 10 < 5 Tabulka 26.2 Laboratorní rozlišení prerenálního a renálního selhání ledvin. KAPITOLA 26 AKI je tedy vždy provázeno poklesem GF a většinou i sníženou produkcí moče. Život ohrožující může být zejména hyperkalémie (doprovázená metabolickou acidózou). Nicméně při poškození tubulárních funkcí mohou převažovat ztráty iontů a vody (častější u postrenálních příčin AKI nebo poškození nefrotoxiny jako jsou těžké kovy nebo při reparaci AKI) vedoucí k polyurii a např. hyponatrémii, hypokalémii, hypomagnezémii a hypofosfatémii. Současné klasifikace (Tabulka 3) AKI vycházejí ze změn sérové koncentrace kreatininu a produkce moče. Oba parametry mají značně limitovanou výpovědní hodnotu (S_krea stoupá pozdě, ovlivnění svalovou hmotou, tubulární sekrecí ; sníženou produkci moče vykazují i pacienti bez AKI, normální nebo zvýšená produkce moče nevylučuje AKI), proto se hledají nové biomarkery, které by včas a specificky odhalily rozvíjející se poškození ledvin. Mezi nejnadějnější markery, které jsou dostupné pro klinickou praxi patří NGAL a cystatin C. Stádium RIFLE S_krea Produkce moče Risk > 1,5 x < 0,5 ml/kg/h po dobu 6 h Injury > 2 x < 0,5 ml/kg/h po dobu 12 h Failure > 3 x < 0,3 ml/kg/h po dobu 24 h Loss End-stage renal disease Kazuistika 2. Postrenální selhání ledvin. AKI nebo úplná ztráta ledvinných funkcí přetrvává déle než 4 týdny Úplná ztráta ledvinných funkcí déle než 3 měsíce Tabulka 26.3 Klasifikace akutního poškození ledvin RIFLE letý muž, chronicky léčený jen pro arteriální hypertenzi (monoterapie blokátorem kalciových kanálů), byl přijat pro bolesti v nadbřišku a asi 2 dny se zhoršující potíže s močením (neschopnost se vymočit) a viditelnou příměs krve v moči. Při přijetí (vybrané výsledky) S_urea 16 mmol/l, S_krea 192 µmol/l (GF dle MDRD 0,5 ml/s), S_Na 123 mmol/l, S_Cl 99 mmol/l, S_K 7,6 mmol/l, v moči záplava erytrocytů. Dle sonografického vyšetření je pravděpodobnou příčinou potíží hyperplázie prostaty kombinovaná s koagulem v měchýři, přítomna již oboustranná hydronefróza ledvin. Za celou dobu hospitalizace nebyla vyšetřena moč chemicky a močový sediment. Po odstranění prostaty se obnovilo spontánní močení, pacient měl polyurii (diuréza cca 4 l) a bylo nutné substituovat Na (významné ztráty močí při poškození tubulů tlakem při obstrukci) a částečně se zlepšily ledvinné funkce (GF dle MDRD při propuštění z hospitalizace 0,8 ml/s). Benigní hyperplázie prostaty může vést k oboustranné hydronefróze ledvin a selhání ledvin, které je často doprovázeno známkami poškození tubulárních funkcí (hyponatrémie, polyurie - zhoršená koncentrační schopnost ledvin). NGAL NGAL (neutrophil gelatinase associated lipocalin, lipocalin-2) je protein produkovaný v distálním tubulu nefronu a je považován za časný ukazatel poškození ledvin. Stoupá mnohem dříve než kreatinin (o 2-3 dny; zvýšení je patrné již po 2 hod po poškození ledvin), je tedy schopen predikovat rozvoj AKI a umožnit včasný terapeutický zásah. Jeho užitečnost byla prokázána u diagnostiky AKI např. po kardiochirurgických operacích nebo po podání kontrastní látky. Klinické algoritmy a rozhodovací meze však 20 Nověji existuje klasifikace AKIN (Acute Kidney Injury Network), která je založena na podobných parametrech jako RIFLE (S_krea a produkce moče), jen jinak kombinuje kritéria (přidává kritérium pro absolutní vzestup S_krea ) 311

312 Funkční zkoušky ledvin nejsou dostatečně validovány pro různé skupiny pacientů. Jsou komerčně dostupné soupravy na jeho stanovení umožňující statimové stanovení. NGAL lze měřit v séru i v moči. Přínosnější v diagnostice AKI se zdá měření v moči. NGAL je díky předpokládanému přínosu někdy přirovnáván k troponinu. Nicméně narozdíl od něj není orgánově specifický (NGAL je produkován i v neutrofilech, játrech, plicích, kostní dřeni a dalších orgánech; některé nádory jej také produkují a např. kortikoterapie také zvyšuje jeho expresi. Cystatin C KAPITOLA 26 Cystatin C (viz výše) může být měřen i v moči jako ukazatel tubulárních funkcí. Normálně je totiž veškerý profiltrovaný cystatin vstřebán v buňkách proximálního tubulu, kde je úplně rozložen. V případě jejich poškození se objevuje v moči (tubulární typ proteinurie, viz také Základní vyšetření moče). Rovněž koncentrace cystatinu C v séru se uvádí jako časnější ukazatel AKI (oproti S_krea). Chronické selhání ledvin Chronická renální insuficience (CRI) je nevratný progresivní děj, který se obvykle vyvíjí několik let až několik desítek let. Nejčastějšími příčinami CRI jsou diabetická a hypertenzní nefropatie nebo polycystické ledviny. Charakteristická je postupná ztráta všech ledvinných funkcí. Stádium chronické ledvinné nedostatečnosti se dle glomerulární filtrace klasifikuje do 5 stádií. stádium GF (ml/s) 1 > 1,5 + jiná patologie ledvin <?> 2 1,0-1,5 3 0,5-0,99 4 0,25-0,49 5 < 0,25 Tabulka 26.4 Klasifikace chronické ledvinné nedostatečnosti (dle KDOQI) Pokles GF je velmi dlouho kompenzován zvýšenou funkcí reziduálních nefronů (zvýšení frakčních exkrecí - viz výše), po vyčerpání těchto kompenzačních mechanismů dochází postupně ke změnám vnitřního prostředí (hyperkalémie, acidóza, hyperfosfatémie). Dále nacházíme anémii (snížená produkce erytropoetinu v ledvinách), onemocnění kostí (snížená aktivace = hydroxylace vitamínu D v poloze 1 -> snížené vstřebávání Ca 2+ ze střeva -> sekundární hyperparatyreóza) a významně zvýšené riziko kardiovaskulárních chorob. Literatura 1. Racek, J. (2006). (2nd ed.). Praha: Galén. 2. Marshall, W. J., & Bangert, S. K. (2008). Clinical Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects (2nd ed.). Churchill Livingstone. 3. Gaw, A., Murphy, M., Cowan, R., O Reilly, D., Stewart, M., & Shepherd, J. (2008). Clinical Biochemistry: An Illustrated Colour Text (4th ed.). Churchill Livingstone. 4. Soni, S. S., Pophale, R., & Ronco, C. (2011). New biomarkers for acute renal injury. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 49(8), doi: /cclm

313 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii Laboratorní diagnostika v gastroenterologii Autor. MUDr. Petr Kocna, CSc. Recenzent: MUDr. Milan Dastych KAPITOLA 27 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Laboratorní diagnostika v gastroenterologii zahrnuje cílené, diagnostické metody, specifické screeninové programy a neinvazivní funkční vyšetřovací programy využívající moderní metody detekce analytů ve stolici nebo pomocí dechových testů. Screeningové (vyhledávací) programy jsou zaměřeny na časnou diagnostiku onemocnění, které jinak zůstávají, v této časné fázi, nerozpoznány. Screeningové programy se provádějí u asymptomatických osob (bez příznaků onemocnění). U definovaných tzv. vysokorizikových skupin se jedná o programy dispenzární. Gastroenterologický screening v současné době zahrnuje dva základní programy - screening celiakie a screening kolorektálních nádorů. Funkční testy tvoří významnou složku klinicko-diagnostického procesu v gastroenterologii. Doplňují výsledky zobrazovacích technik o podstatnou informaci, kterou je funkce orgánu, resp. schopnost reagovat na stimulaci. Funkční test zahrnuje přesně definovanou stimulaci a výsledek je interpretován jako odpověď orgánu na stimulaci s přihlédnutím k bazálním hodnotám analytu před stimulací. U nepřímých funkčních testů je nutno navíc při interpretaci posuzovat funkci dalších orgánů nebo systémů, které se na procesu podílejí. Moderní, neinvazivní funkční diagnostika je zaměřena na dechové testy založených na měření koncentrace vodíku nebo 13C-uhlíku ve vydechovaném vzduchu. Aplikace H2-dechových testů pokrývají širokou oblast od diferenciální diagnostiky malabsorpčního syndromu k syndromu bakteriálního přerůstání v tenkém střevě (SBBO), stanovení motility gastrointestinálního traktu, orocékální transit time (OCCT), nebo kvalita přípravy tlustého střeva před endoskopickým vyšetřením. Doba pasáže gastrointestinálním traktem je důležitým údajem pro vyhodnocení a interpretaci jiných funkčních testů, a je proto často kombinován s dalšími dechovými testy, např. 13C/H2-laktózový test, kdy je hodnoceno enzymatické štěpení laktózy (markerem je 13C uhlík) a současně jako korekce motility, pasáže je použito bakteriálního štěpení v tlustém střevu (markerem je H2). Spolehlivost a vyhodnocení H2 dechových testů zvyšuje analýza nejen vodíku, ale kombinace se stanovením metanu, což umožňují jak GC (Gas Chromatography) analyzátory tak dnes i NDIRS (Nondispersive Isotope-selective Infrared Spectroscopy) technologie. 313

314 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii KAPITOLA 27 Laboratorní diagnostika patologií žaludku zahrnuje serologické testy stavu žaludeční sliznice - hladinu gastrinu-17, poměru pepsinogenů I a II (pepsinogenů A a C), infekce Helicobacter pylori, Hp-protilátek, CagA a VacA antigenů, funkční test žaludeční acidity - HCl a test motility žaludku dechový test - OABT. Diagnostika infekce Helicobacterem pylori zahrnuje testy invazivní, vyžadující odběr bioptického vzorku žaludeční nebo duodenální sliznice nebo testy neinvasivní. Kultivační test vykazuje nejvyšší sensitivitu i specificitu, nevýhodou je však značná citlivost bakterie Helicobacter pylori ke kyslíku, což vyžaduje speciální podmínky odběru a transportu. Rychlý ureázový (CLO) test je založen na chromogenní detekci aktivity ureázy (povrchový marker bakterie Helicobacter pylori) a je rutinním průkazem při endoskopii. Novější testy stanovují v biopsii Helicobacter pylori imunologickým průkazem - metoda irut. Molekulární biologie a metody PCR umožňují další moderní metody detekce Helicobacter pylori, v biopsiích i ve vzorcích stolice. Dechový test s 13C-značenou močovinou - UBT je zlatým standardem diagnostiky infekce Helicobacter pylori, test lze provádět i endoskopicky s podáním 20 mg značené močoviny a odběrem plynného obsahu žaludku bioptickým kanálem endoskopu. Spolehlivou variantou detekce Hp je neinvazivní test detekce Hp. antigenu ve stolici. 314

315 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii KAPITOLA 27 Vyšetřování žaludeční acidity je založeno na stimulaci parietálních buněk, odběru žaludeční šťávy a stanovení obsahu volné a celkové HCl. Ke stimulaci je nejvhodnější pentagastrin, použít lze i histaminu (Lamblingův test) nebo insulinu. Hodnocení funkčního testu je však závislé na typu stimulace tj. výsledek se liší po podání gastrinu, histaminu nebo insulinu. Hypochlorhydrie (hypoacidita) až achlorhydrie (anacidita) je signifikantním příznakem perniciózní anemie nebo podezření na malignity (karcinom žaludku vykazuje však v časných stádiích hyperaciditu i normoaciditu). Diagnosticky významné je stanovení žaludeční acidity při Zollinger-Ellisonově syndromu, kdy prokazujeme vysokou bazální i maximální sekreci (BAO>15, MAO>60), ve více než 50% případů Zollinger-Ellisonova syndromu je index BAO/MAO > Pentagastrinová stimulace testu je aplikovatelná i pro analýzu mucinu. Nejnovější studie používají pro stanovení hypochlorhydrie bqrt test (Blood Quininium Resin Test). Endoskopickou variantou funkčního testu je stimulace 4 µg tetragastrinu/kg váhy subkutánně s odběrem 10minutové sekrece (20-30 min po stimulaci) a titračně je stanovena acidita v meq/10min. Korelace s MAO-BAO je r=0.92, reprodukovatelnost testu CV=5.6%. Novinkou roku 2009 je také dechový test s podáním značeného calcium-carbonátu. Hladina gastrinu v séru stanovená RIA nebo ELISA imunochemickou detekcí je ng/l. U Zollinger-Ellisonova syndromu (gastrinom, tumor pankreatu s nadprodukcí gastrinu) prokazujeme násobné zvýšení hladiny gastrinu, která však výrazně kolísá i v průběhu dne; u 20-40% lze zachytit i normální hladinu gastrinu. Vzhledem k existenci tří forem gastrinu závisí výsledek stanovení na typu protilátky použité v testu. Metody stanovení gastrinu jsou standardizovány na syntetický gastrin G-17, stanovení forem G-34 a G-13 závisí na zkřížené reaktivitě s příslušnou protilátkou. Normální poměr forem G-13:G-17:G-34 je 8:2:1, na lačno je vyšší zastoupení formy G-34, po jídle forem G-17 a G-13. Stanovení gastrinu je součástí gastrinového stimulačního testu, kdy stanovujeme 90ti minutový profil (v 9 vzorcích séra) po stimulaci insulinem, sekretinem nebo Ca-glukonátem. Pepsinogen A je markerem slizniční atrofie a je používán v genetických studiích jako subklinický marker vředové choroby duodena. Pepsinogen C je používán jako marker stavu žaludeční sliznice (případně v poměru PG-A/PG-C) a rovněž jako marker eradikace infekce Helicobacter pylori. Elektroforeticky lze separovat v agarovém gelu 8 proteáz žaludeční sliznice, pepsinogeny PG1 - PG5 tvoří skupinu imunologicky identických proteinů - pepsinogen I (PG-I, PGA), pepsinogeny PG6 a PG7 tvoří skupinu pepsinogenu II (PG-II, PGC), posledním proteinem je katepsin E (SMP, Slow Moving Proteinase). Snížení hladiny pepsinogenu A 315

316 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii prokazujeme u nemocných s achlorhydrií např. u perniciózní anémie. Nejnovější studie prokazují významné snížení pepsinogenu-i a současně zvýšení hladiny IgA protilátek k Helicobacter pylori u karcinomu žaludku. Detekce pepsinu ve slinách-sputu je rovněž indikována jako jednoduchý screening GERD (gastroesophageal reflux disease) při extra-gastrických projevech onemocnění. Poměr PG-I:PG-II signifikantně klesá v závislosti na histologickém riziku, nebo přítomnosti vaca+ pozitivity Helicobacter pylori infekce. Kombinace stanovení hladiny pepsinogenu-i, gastrinu-17 a protilátek k Helicobacter pylori je testováno jako tzv. serologická biopsie, GastroPanel - v diferenciální diagnostice gastritid. Screeningové testování rizika atrofické gastritídy, resp. rizika karcinomu žaludku, ve spojení s pozitivitou Helicobacter pylori, je další oblastí screeningu nádorů gastrointestinálního traktu. Klinický význam má rovněž stanovení pepsinu při insulinovém testu. KAPITOLA 27 Dechový test s podáním 13C-oktanové kyseliny (kyselina kaprylová) je neivazivním testem gastrické evakuace, který lze použít v diferenciální diagnostice funkčních dyspepsií, refluxních onemocnění i pro indikaci některých moderních léků (prokinetika). Kyselina oktanová se nevstřebává v žaludku, ale poměrně rychle je vstřebávána duodenální sliznicí. Metabolickou aktivitou je v jaterní tkáni produkován 13CO2, který je pak stanoven ve vydechovaném vzduchu. Rozmezí normálních hodnot je minut pro solidní stravu a minut pro semi-solidni stravu. Vyšetření rychlosti evakuace žaludku dechovým testem s 13C- -oktanoátem vykazuje vysokou korelaci se scintigrafickou metodou. Laboratorní diagnostika malabsorpčního syndromu zahrnuje především funkční testy zaměřené na objasnění příčiny a stupně malabsorpce (primární, sekudární malabsorpční syndrom) a dále serologické testy týkající se screeningu a dlouhodobého sledování nemocných s celiakií. Funkční testy zahrnují zátěžové, toleranční testy s perorálním podáním D-xylózy nebo A-vitaminu, testy střevní permeability např. laktulózo/mannitolový - La/Ma test. Laktulózo/mannitolový test lze kombinovat i s podáním D-xylózy, sucralózy a dalších cukrů. Analýza jednotlivých cukrů je provedena technikou plynové chromatografie pro relativní indexy permeability. Průměrná hodnota LA/MA indexu je ± a LA/XY ± LA/MA testu střevní permeability lze využít při monitorování post-operační chemoterapie. K funkčním testům může být použito i jiných látek např. železo a vitamin B12 (Schillingův test) nebo testy sekreční funkce se značeným albuminem (51Cr-albuminový test). Pro odběr vzorků po podání testované látky a při interpretaci je nutno zvažovat 316

317 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii nejen dobu pasáže ale i rozdílnou lokalizaci v tenkém střevu (od duodena po terminální ileum), kde dochází ke vstřebávání testovaného substrátu. Neinvazivními dechovými testy je dechový test s 13C-laktózou nebo dechový test s 13C-xylózou vhodný pro detekci bakteriálního přerůstání v tenkém střevu. KAPITOLA 27 Komplexní vyšetření stolice, od makroskopického posouzení, stanovení objemu, struktury, ph, k analytickému stanovení laboratorních markerů je považováno za základní vyšetřovací proces při podezření na malabsorpční syndrom. Kvalitativní stanovení přítomnosti nenatrávených cukrů, tuků a proteinů - mikroskopicky hodnocené barvení stolice uvádějí i nejnovější publikace interní medicíny, gastroenterologie i klinické biochemie. ß-karoten a A-vitamin jsou rozpustné v tucích, ß-karoten je retinoid - prekursor vitaminu A a jejich hladina v séru je proto závislá na trávení a vstřebávání tuků. V cirkulaci je ß-karotén vázán z 80% na LDL, 8% na HDL a z 12% na VLDL lipoproteiny. Ze sérových karotenoidů tvoří ß-karoten asi 25%. Z klinického hlediska je významný velmi krátký poločas ß-karotenu resp. jeho rychlá konverze na A-vitamin. Klinický význam má stanovení ß-karotenu především jako screeningový test při podezření na malabsorpční syndrom. Zvýšená hladina ß-karoténu je popsána u hypothyreózy, diabetes mellitus, myxedému, nefrotického syndromu, hyperlipoproteinémií a u žen v těhotenství. Referenční hodnoty závisí na postupu stanovení, běžně je uváděno rozmezí pro extrakční metodu tj.stanovení celkových sérových karotenoidů, µmol/l, užší pásmo referenčních hodnot je µmol/l. Pro screening malabsorpčního syndromu u dospělých se uvádí pouze dolní hranice 0.93 µmol/l, pro HPLC techniku specificky stanovující pouze ß-karotén je popsáno referenční pásmo µmol/l. Zátěžový toleranční test s A-vitaminem je hodnocen vzestupem hladiny v séru za 3 a 5 hodin po podání testovací zátěže. Normální hodnoty za 3 hodiny jsou v pásmu µmol/l, za 5 hodin µmol/l. Patologický výsledek testu je při hodnotách < 3.6 µmol/l za 3 hodiny resp. < 7.2 µmol/l za 5 hodin. Toleranční test s D-xylózou je obvykle indikován k potvrzení střevní malabsorpce u gluténové enteropatie (céliakální sprue), tropické sprue. Výsledek výdeje močí je ovlivněn funkcí ledvin. Falešně pozitivní výsledek může být stanoven např. při zvracení, dehydrataci, myxedému, ascitu, edému. Celá řada léků snižuje exkreci D-xylózy ledvinami - např. kyselina aminosalicylová, acetylosalicylová, digitalis, indomethacin, neomycin a další. 14C-D-xylózový dechový test a 13C-D-xylózový dechový test je variantou 317

318 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii xylózového absorpčního testu, a je v posledních letech používán častěji než stanovení xylózy v moči.v dg. střevní malabsorbce. Hladina v séru za 1 hod po podání D-xylózy je mmol/l, za 2 hodiny mmol/l, za 3 hodiny mmol/l, za 4 hodiny mmol/l za 5 hodin mmol/l. Patologickým výsledkem je hladina za 2 hodiny u dospělých po podání 25g < 1.67 mmol/l u dětí po podání 5 g < 1.33 mmol/l. V 5ti hodinovém sběru moče je u dětí 5-12 let po podání 5g D-xylózy patologickým výsledkem hodnota < 0.8g/5hod (širší rozmezí normálních hodnot je g/5hod), u dospělých osob po podání 25g hodnota < 4g/5 hod (podle některých autorů je jako patologický hodnocen nález <5g/5 hod), u osob starších 65 let klesá hraniční hodnota na 3.5g/5hod. Při podání D-xylózy podle váhy (především u malých dětí) je normální rozmezí xylózy vyloučené močí za 5 hodin 10-33% podaného množství. Celiakální sprue (CS), celiakie - glutenová enteropatie je primárním malabsorpčním syndromem. Celiakie je onemocněním autoimunního charakteru s geneticky podmíněnou vazbu (HLA-DQ2/DQ8) a specifickou humorální odpovědí na spouštěcí faktor - peptidy pšeničného gliadinu (lepku) resp. zásobním proteinům (prolaminům) příbuzných obilovin, ječmene, žita a ovsa. Diagnostika celiakie je založena na histologickém, příp. histochemickém vyhodnocení bioptických vzorků sliznice tenkého střeva. Při celiakii prokazujeme zánětlivé změny sliznice, zvýšení počtu intraepiteliálních lymfocytů, léze sliznice tenkého střeva se snížením nebo vymizením klků, hypertrofií Lieberkühnských krypt, poruchou vyzrávání enterocytů a ústup těchto změn po bezlepkové dietě. Diagnostika celiakie je zaměřena především na screening celiakie a zahrnuje protilátky ke gliadinu třídy IgA a IgG (AGA-A, AGA-G), endomysiu (EmA) třídy IgA a IgG a protilátky ke tkáňové transglutamináze třídy IgA a IgG (attg-a, attg-g). Tkáňová transglutamináza je enzymem, který má klíčovou roli nejen v diagnostice, ale i ve vlastní patogenezi onemocnění. Gliadin, gliadinové fragmenty a peptidy obsahují velmi vysoké procento glutaminu (30-40% tvoří glutamin a prolin) a gliadin je proto velmi dobrým substrátem pro enzym tkáňovou transglutaminázu, která vytváří vazbu na substrát (gliadin), modifikuje tyto peptidy a vznikající neoepitopy se vážou s povrchovými glykoproteiny HLA-DQ2/DQ8 pozitivních imunokompetentních buněk a vyvolávají imunitní odpověď ve sliznici tenkého střeva. Studie z let doporučují detekci protilátek proti synteticky připraveným gliadin-specifickým nonapeptidům resp. deamidovaným peptidům gliadinu. Senzitivita a specificita ELISA testů proti deaminovaným gliadinům (DGP) je srovnatelná se spolehlivostí protilátek ke transglutamináze, DGP protilátky v kombinaci IgA a IgG jsou dokonce spolehlivější. Nejnovější studie doporučují testy v kombinaci IgA attg a IgG DGP. Metody molekulární biologie, PCR, umožňují detekci specifických markerů HLA-DQ2/DQ8. Význam screeningu je především u nemocných s jiným autoimunitním onemocněním. Riziko asymptomatické celiakie, bez klinických příznaků, je např. u diabetiků 1.typu 10x vyšší než v běžné populaci, tj. incidence není 1:200, ale 1:20. Zvýšené riziko je u dalších autoimunit podobné (autoimunní thyreopatie, hepatitída, revmatoidní artritída a další). KAPITOLA

319 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii KAPITOLA 27 Laktózový toleranční test je nepřímým měřením aktivity intestinální laktázy pro diferenciální diagnostiku malabsorpčního syndromu - laktózové nesnášenlivosti. Klasickým testem je hodnocení hladiny glykemie za 15, 30, 60 a 90 minut po perorálním podání 50g laktózy. Průkazem deficitu laktázy je vzestup glykemie o méně než 1 mmol/l. Laktózový test lze nověji hodnotit také dechovými testy a to jak H2 testem, kdy ve vydechovaném vzduchu stoupá koncentrace vodíku následkem bakteriálního rozkladu nerozštěpené laktózy v tlustém střevě, nebo detekcí uhlíku 13C po podání značené 13C-laktózy. Velmi přesné výsledky poskytuje kombinovaná metoda 13C/2H2-laktózový test. Diagnostiku laktózové intolerance lze již také doplnit DNA stanovením specifického genotypu - varianta T/C. Diagnostiku laktózové intolerance lze provést i rychlým rapid-testem z duodenální biopsie, který je obdobný CLO-rapid testu pro diagnostiku Helicobacter pylori. Inkubační médium v komůrce pro vložení biopsie zahrnuje enzymy glukózo-oxidázu a peroxidázu, a chromogenní oxidačně-redukční substrát, doba provedení testu je 20 minut. Akutní pankreatitida (AP) je onemocněním s variabilními klinickými projevy. Diagnostickou otázkou je časná diagnóza, stupeň závažnosti onemocnění, prognóza a monitorování průběhu léčby. U těžké formy AP lze rozpoznat dvě fáze. První fází je extensivní zánět pankreatu, případně i nekrotizující, s následným rozvojem syndromu systémové odpovědi - SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome), který může vést k syndromu mnohočetné orgánové dysfunkce - MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome). V další fázi dochází k bakteriální infekci pankreatické nekrózy a prohloubení systémových komplikací, selhání ledvin, poruchám koagulace a dalším projevům. Laboratorní diagnostika zahrnuje stanovení celé řady specifických a nespecifických markerů, pankreatických enzymů a jejich prekurzorů v séru nebo v moči, zánětlivé markery, a markery imunitních reakcí - cytokiny, interleukiny, TNF. Nejčastěji je používána hladina celkové sérové α-amylázy, jejíž zvýšené hodnoty se mohou po 3 5 dnech od počátku onemocnění normalizovat. Hladina celkové α-amylázy je spolehlivě zvýšena ve 100% onemocnění akutní pankreatitidou, zvýšena je však i v 80% všech případů akutních bolestí břicha. Podstatně větší diagnostický přínos má stanovení pankreatického izoenzymu (P-typu, P-AMS), jehož hladina je rovněž zvýšena ve 100% případů akutní pankreatitidy, u akutních bolestí břicha je zvýšena jen v 10%. Diagnostický přínos stanovení sérové hladiny pankreatické lipázy je podstatně vyšší než stanovení α-amylázy. Hladina lipázy v séru zůstává po atace akutní pankreatitidy zvýšena podstatně déle než hladina amylázy (popsána je zvýšená aktivita lipázy po 14 dnech). Vzhledem k tomu, že lipáza v séru má svůj původ především v buňkách pan- 319

320 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii kreatu, poskytuje její stanovení podstatně vyšší specificitu, srovnatelnou se specificitou pankreatického isoenzymu α-amylázy. Spolehlivým časným markerem akutní pankreatitídy je hladina pankreatické elastázy - 1, např. post-ercp, a karcinomu pankreatu, kdy elastáza-1 (stanovená ELISA technikou) má ze všech pankreatických enzymů pro karcinom pankreatu nejvyšší specificitu i sensitivitu. Nejčasnějšími markery pro rychlou diagnostiku akutní pankreatitídy je detekce aktivačních peptidů TAP a CAPAP v moči. V posledních letech je studován jako marker bakteriální infekce pankreatické nekrózy a sepse sérový prokalcitonin. KAPITOLA 27 Trypsinogen, trypsinogen aktivační peptid (TAP) & karboxypeptidázový aktivační peptid (CAPAP) lze detekovat jak v séru, tak i v moči. Klinicky je používána nejčastěji hladina trypsinogenu-2 v moči, hodnoty µg/l odpovídají těžké, závažné formě akutní pankreatitidy, hodnoty µg/l pak střední až mírné formě AP. V moči stanovujeme také produkt konverze trypsinogenu na aktivní trypsin - trypsinogen aktivační peptid - TAP. Klinicky signifikantní je zvýšená hladina TAP pro posouzení závažnosti akutní pankreatitidy, kdy hodnoty TAP v moči nad 15 nmol/l detekují středně těžkou pankreatitidu, hodnoty nad 40 nmol/l těžkou formu onemocnění. Aktivační peptid CAPAP je delší než ostatní peptidy uvolněné při aktivaci pankreatických proenzymů, je proto stabilnější a vhodnější pro laboratorní diagnostiku. Normální hladina CAPAP v séru metodou RIA je 0.8 nmol/l. Chronická pankreatitida (CHP) je definována jako pokračující zánětlivé onemocnění pankreatu s charakteristickými, ireversibilními, morfologickými změnami, způsobující charakteristické bolesti a trvalé ztráty funkce pankreatu. Zlatým standardem funkční diagnostiky je sekretin-pankreozyminový (sekretin-cck) test, jako referenční test je používáno i kvantitativní stanovení tuků v 72-hodinovém sběru stolice. Sekretin-CCK test poskytuje ze všech dostupných testů nejpřesnější informace o sekrečních poměrech pankreatu. Přes nestandardnost jeho uspořádání je považován za "zlatý standard" funkčních testů pankreatu ke zhodnocení především pankreatické insuficience. Normální hodnoty závisí na způsobu stimulace, odběru i analýze duodenálního obsahu. Uvedené hodnoty jsou jednou z variant. Objem sekrece stimulované sekretinem ml/hod, koncentrace HCO mmol/hod, aktivita trypsinu j/20 minut, aktivita amylázy j/20 minut. V zahraniční literatuře nalezneme variantu - tzv. Lundhův test, kdy stimulace pankreatu je provedena standardizovaným Lundhovým pokrmem. Nejnovější studie kombinují endoskopii, stimulaci CCK nebo sekretinem, a analýzu koncentrace lipázy, bikarbonátu a dalších enzymů v pankreatic- 320

321 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii ké šťávě odebrané při endoskopii, nebo doporučují stanovení jiných markerů - např. zinku, který je stabilnějším analytem, oproti pankreatickým enzymům. Technologický rozvoj zobrazovacích metod v gastroenterologii nabízí v současné době kombinaci morfologického zobrazení a současně vyhodnocení některých funkčních aspektů vyšetřovaného orgánu. Metody ERCP a MRCP lze provádět při současné stimulaci i.v.podaným sekretinem, nebo cholecystokininem a vznikají tak moderní kombinované vyšetřovací postupy S-MRCP, MRCPQ nebo epft (endoskopický pankreatický funkční test). KAPITOLA 27 Lidská pankreatická elastáza 1 je syntetizována acinárními buňkami pankreatu. Enzym je secernován pankreatickou šťávou do duodena a během střevní pasáže není degradována proteinová sekvence zvolená pro immunochemickou detekci. Stanovení elastázy vykazuje proto vyšší dg. přínos, na rozdíl od chromogenní metody stanovení chymotrypsinu ve stolici. Referenční hodnoty jsou µg/g stolice, hraniční pásmo je µg/g, závažná pankreatická insuficience je stanovena při hodnotách < 100µg/g stolice. Imunochemické stanovení elastázy-1 není ovlivněno pasáží tlustým střevem, substituční terapií ani jinými faktory, které ovlivňují enzymové stanovení chymotrypsinu ve stolici. Specificita metody je 93%, senzitivita dosahuje pro těžkou pankreatickou insuficienci hodnoty 100%, pro střední a lehké formy 87%. Tento test je běžně používán v pediatrii k průkazu cystické fibrózy se specificitou i senzitivitou téměř 100%. Falešná snížená hodnota může být způsobena zředěním (obsahem vody) při průjmu. Principem dechového testu s 13C-mixed triglyceridy je štěpení tohoto substrátu pankreatickou lipázou. 13C-MTG substrát je triglycerid s 13C-označeným octanoátem v poloze 2, a stearátem v poloze 1 a 3. Pankreatickou lipázou je triglycerid rozštěpen a 13C-octanoát je dále oxidován v játrech (beta-oxidace tuků) a ve vydechovaném vzduchu je množství 13CO2 stanoveno analyzátorem dechových testů. Klinický význam má 13C-MTG- test v diferenciální diagnostice malabsorpčního syndromu, jako funkční test exokrinní funkce pankreatu a pro dlouhodobé sledování nemocných s chronickou pankreatitídou. 13C dechové testy s mixed triglyceridy (MTG) nebo hioleinem patří mezi nepřímé funkční testy exokrinní funkce pankreatu a lze použít k monitorování úspěšnosti pankreatické substituční léčby. Laboratorní diagnostika patologií tlustého střeva je zaměřena především na screening kolorektálních nádorů - KRCA, testy okultního krvácení ve stolici, screeningový - guajakový Haemoccult test - gfobt, citlivější immunochemický test - ifobt, a kvan- 321

322 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii titativní stanovení hemoglobinu ve stolici - qi-fobt. Aktivitu zánětlivých onemocnění i tumorů lze monitorovat řadou markerů ve stolici, detekcí calprotectinu, lactoferrinu, M2-pyruvát kinázy a S100A12 proteinu. Rozvoj molekulární biologie umožňuje izolovat DNA ze vzorku stolice a stanovovat řadu genetických markerů. Riziko karcinomu tlustého střeva v populaci v České republice trvale narůstá, v roce 2010 dosahuje hodnot 80 na 100 tis. obyvatel a v evropském srovnání je nejvyšší hodnotou. Kolorektální karcinom (KRCA) vzniká malignizací adenomu sekvencí genetických mutací v průběhu průměrně deseti let a převaha nádorové tkáně je alespoň v počáteční fázi onemocnění lokalizována intraluminálně. Menší část kolorektálních karcinomů vzniká při přítomnosti rizikových faktorů, jako jsou nespecifické střevní záněty, familiární adenomová polypóza, hereditární nepolypózní kolorektální karcinom a další hereditární syndromy. Již v asymptomatické fázi onemocnění karcinom (a adenomový polyp) intermitentně krvácí. Screeningové programy zahrnují především laboratorní metody detekce okultního krvácení - FOBT (Fecal Occult Blood Test) - TOKS (Test okultního krvácení ve stolici), detekci genetických markerů a ze zobrazovacích metod se ve screeningu uplatňují sigmoidoskopie, kolonoskopie, irigografie, virtuální počítačová kolografie s použitím výpočetní tomografie (CT) či magnetické rezonance (MR). Rozvoj molekulární biologie a aplikace typu PCR v rutinní diagnostice otevírají zcela nové trendy i ve screeningu tumorů GIT. Nejnovější screeningové metody jsou založeny na detekci specifických mutací metodami PCR nebo biochipovou technologií v DNA izolované ze vzorku stolice. Pro detekci nádorů tlustého střeva lze ze vzorku stolice stanovovat mutace APC, K-ras, p53, mikrosatelitní instabilitu (MSI) a další genetické markery. Molekulárními markery kolorektálního karcinomu může být také detekce metylace specifických proteinů, např. vimentinu, a tyto DNA změny lze monitorovat jak ve stolici, tak i v séru nemocných s KRCA. KAPITOLA 27 Doporučeným testem pro screeningový postup byl mnoho let pouze guajakový test - Haemoccult. Pseudoperoxidázová reakce hemoglobinu je základem testu, který obsahuje testovací médium (papírek) impregnované guajakovou pryskyřicí nebo u starších testů, derivátem benzidinu např. dimethylbenzidinem (o-tolidin). Vzhledem k chemickému principu oxidační reakce jsou testy ovlivněny přítomností jiných oxidačních látek (vitamin C), přítomností hemoglobinu z potravy (maso, krev), falešně pozitivní výsledek může být způsoben i přítomností rostlinných peroxidáz (některé druhy kořenové zeleniny). V závislosti na uspořádání testu je proto doporučováno definované dietní omezení. Senzitivita gfobt testů první generace je velmi nízká, pro 322

323 Laboratorní diagnostika v gastroenterologii detekci karcinomu je v rozmezí 26-30%, gfobt testy však mají téměř nulovou falešnou pozitivitu. Kvalitativní imunochemické testy ifobt druhé generace mají senzitivitu dvojnásobnou, jejich specificita však výrazně klesla a falešná pozitivita je u některých testů téměř 25%. Třetí generace FOBT testů qifobt s kvantitativní detekcí Hb ve stolici umožňuje optimalizací cut-off hodnoty zajistit senzitivitu i specificit 90-95%. V současné době jsou proto doporučeny pro screening KRCA výhradně kvantitativní imunochemické testy - qifobt. Calprotectin je kalcium vazebný protein s antimikrobiální aktivitou molekulové hmotnosti 36.5 kd složený ze dvou těžkých řetězců a jednoho lehkého řetězce, odvozený především od monocytů a neutrofilů. Calprotectin jako marker stanovený ve stolici vykazuje nižší variabilitu než hemoglobin a je vhodným ukazatelem při diagnostice i monitorování terapie střevních zánětlivých onemocnění - ulcerózní kolitidy a Crohnovy choroby, nebo nekrotizující enterokolitidy u dětí. Stanovení koncentrace ve vzorku stolice s cut-off hodnotou 30 mg/l vykazuje specificitu 97% a senzitivitu 100% pro diferenciální diagnostiku mezi akutní Crohnovou chorobou a syndromem dráždivého tračníku - IBS (irritable bowel syndrome). Calprotectin ve stolici je rovněž testován jako marker kolorektálního karcinomu. Mezi markery zánětlivých onemocnění, které lze stanovit ve stolici, patří i lactoferrin, který má vyšší senzitivitu než calprotectin. KAPITOLA 27 Podrobnější informace o jednotlivých laboratorních metodách, provedení testů, odkazy na aktuální abstrakta NLM Medline a 100 barevných schemat a fotografií naleznete na on-line aktualizovaném GastroLabu na edukačním webu 1.lékařské fakulty

324 Diabetes mellitus - úvod do problému Diabetes mellitus - úvod do problému Autor: prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. Recenzenti: prof. MUDr. Zdeněk Rušavý, CSc., prof. MUDr. Richard Průša, CSc. KAPITOLA 28 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Inzulin, jeho vznik a účinek Inzulin je hormon, produkovaný β-buňkami Langerhansových ostrůvků pankreatu jako reakce na hyperglykémii. Vznik inzulinu Inzulin vzniká nejprve jako pre-proinzulin, který se po odštěpení signálního peptidu mění na proinzulin. Tento peptid obsahuje jeden řetězec tvořený obsahující celkem tři disulfidické vazby. Před sekrecí inzulinu je proinzulin hydrolyticky štěpen; produktem je vlastní inzulin a C-peptid, které jsou secernovány v ekvimolárním množství do krve. Molekula inzulinu je tvořena dvěma peptidickými řetězci (označovanými A, 21 aminokyselin a B, 30 aminokyselin), spojené dvěma disulfidickými můstky. C-peptid je jednoduchá peptidický řetězec o 31 aminokyselinách. Své jméno dostal od skutečnosti, že v molekule proinzulinu spojoval oba řetězce budoucího inzulinu (C = connecting, spojující). Molekula inzulinu se skladuje jako hexamer, přičemž jednotlivé molekuly inzulinu jsou spojeny atomem zinku; vlastní účinný inzulin je monomer. Vznik inzulinu je schematicky znázorněn na obr. 28p.1 324

325 Diabetes mellitus - úvod do problému KAPITOLA 28 Obrázek 28p.1 Vznik inuzulinu v buňce z prekurzorů. Účinek inzulinu Tvorbu inzulinu stimuluje hyperglykémie. Asi polovina secernovaného inzulinu představuje tzv. bazální sekrece, další část je vyplavována jako reakce na přívod sacharidů. Inzulin se váže na extracelulární část α-podjednotky mebránového receptoru; to způsobuje konformační změny receptoru s aktivací kinázové domény intracelulární části β-podjednotky receptoru. Autofosforylace tyrozinových zbytků zahajuje kaskádu reakcí, na jejímž konci je přechod glukózového transportéru GLUT4 do buněčné membrány - tím je umožněn vstup glukózy do buňky. Nejvíce se uplatňuje účinek inzulinu v buňkách kosterního svalu (potřeba energie pro pohyb) a v buňkách tukové tkáně (ukládání energie do zásoby). Některé buňky, jako např. erytrocyty či buňky CNS, inzulin pro vstup glukózy nepotřebují. Typy diabetu V podstatě rozlišujeme následující typy diabetu: diabetes mellitus 1. typu (DM1), dříve zvaný inzulin dependentní diabetes mellitus (IDDM); diabetes mellitus 2. typu (DM2), dříve zvaný inzulin non-dependentní diabetes mellitus (INDDM); gestační diabetes mellitus (GDM); 325

326 Diabetes mellitus - úvod do problému ostatní specifické typy diabetu, doprovázející jiné, definované onemocnění. Stručně charakterizujme jednotlivé typy diabetu. Diabetes mellitus 1. typu Onemocnění tvoří méně než 10 % všech případů diabetu. Postihuje většinou mladé jedince, často vzniká již v dětském věku. Příčinou je autoimunitní proces, kdy specifické cytotoxické T-lymfocyty působí destrukci β-buněk pankreatu; tento proces bývá též zván autoimunitní inzulitida. Současně prokazatelné autoprotilátky jsou dalším dokladem pro autoimunitní původ onemocnění, nemají však cytotoxický účinek. Postižení jedinci mají vrozenou dispozici, ke vzniku choroby jsou však nutné zevní podmínky, které spustí autoimunitní reakci. Může se jednat o modifikaci buněk Langerhansových ostrůvků infekčními vlivy (viry, např. Coxsackie), chemikáliemi, uvažuje se i vlivu časné expozice kravskému mléku či možnosti mimikrů, tj. podobnosti antigenů mikrobů a β-buněk, které se pak stávají cílem autoimunitního procesu. KAPITOLA 28 Protože výsledkem onemocnění je absolutní nedostatek inzulinu, je nemocný na jeho podávání celoživotně závislý. Diabetes mellitus 1. typu se někdy projeví až v dospělosti; mívá pak většinou pomalejší průběh. Pro tento stav se někdy užívá termín LADA, latent (late-onset) autoimmune diabetes of adulthood. Tito nemocní mohou být nesprávně diagnostikováni jako diabetes 2. typu. Obvykle nemívají nadváhu a mají laboratorní známky typické pro diabetes 1. typu (sníženou produkci C-peptidu, pozitivní autoprotilátky). Obtížně kompenzovatelný diabetes mellitus 1. typu se někdy označuje jako brittle diabetes (labilní diabetes). Tyto osoby jsou ohroženi rychlými změnami glykémie, střídáním hypo- a hyperglykémie; je u nich popsána větší reakce na stresové činitele. Diabetes mellitus 2. typu Sem patří většina diabetiků a jejich počet neustále narůstá. Onemocnění postihuje starší osoby, velmi často obézní, velmi často s obezitou abdominálního typu. Stav je charakterizovaný inzulinovou rezistencí, kterou se organismus zprvu snaží překonat zvýšenou produkcí inzulinu (hyperinzulinismus); v pokročilejším stadiu produkce inzulinu klesá. Glykémie nalačno zůstává zprvu normální, ale postprandiální glykémie je již zvýšené (viz obr. 28p.2). Protože (alespoň v počátečních stadiích a u nekomplikovaných nemocných) není třeba podávat inzulin, byl stav označován jako inzulin non-dependentní diabetes mellitus (INDDM). V pozdějších stadiích, kdy je již sekreční schopnost β-buněk Langerhansových ostrůvků vyčerpána, a při komplikacích (infekce, operace apod.) je i zde léčba inzulinem nezbytná. Těžký stupeň inzulinové rezistence může být způsoben některými typy mutace inzulinového receptoru. 326

327 Diabetes mellitus - úvod do problému KAPITOLA 28 Obr. 28p.2 Vývoj metabolických odchylek u diabetu 2. typu (x = časová osa, y = výše ukazatele; podrobnější vysvětlení v textu); IS = inzulinová sekrece; IR = inzulinová rezistence; FG = glykémie nalačno; PPG = postprandiální glykémie Obezita, metabolický syndrom a diabetes Obezita se v posledních desetiletích projevuje jako epidemicky se šířící onemocnění. Důvodem je vysoký energetický přívod a zejména klesající pohybová aktivitě, tedy nedostatečný energetický výdej. Odhaduje se, že asi 80 % dospělé populace v USA trpí nadváhou a 60 % osob je obézních. V České republice se obezita stává rovněž problémem, bohužel často je u mladých osob či dokonce u dětí. Tuk uložený centrálně a ve viscerání oblasti se nechová pasivně, ale produkuje množství cytokinů, z nichž mnohé mají prozánětlivé účinky a vyvolávají inzulinovou rezistenci. Metabolický syndrom, jehož pravidelnou součástí je inzulinová rezistence, představuje vysoké riziko pro rozvoj diabetu 2. typu, ale i kardiovaskulárních onemocnění včetně jejich závažných komplikací, jako je infarkt myokardu či centrální příhoda mozková. Vztah diabetu a obezity je někdy v anglosaské literatuře vyjadřován termínem diabesity. Podaří-li se nemocnému snížit tělesnou hmotnost, významně stoupne inzulinová senzitivita a upraví se i další metabolické odchylky, např. poruchy metabolismu lipidů. Klesne i riziko rozvoje kardiovaskulárních komplikací. Gestační diabetes Jako gestační diabetes je označena porucha tolerance glukózy vzniklá v těhotenství, která odpovídá kriteriím pro diabetes mellitus nebo pro porušenou glukózovou toleranci.. V současnosti je u nás toto onemocnění diagnostikováno asi u 3-4 % těhotných. Vyšetření na přítomnost gestačního diabetu se provádí u skupin pacientek s předpokládaným vyšším rizikem možného vzniku gestačního diabetu či poruchy glukózové tolerance v těhotenství. Celoplošně se tudíž nemusí vyšetřovat na gestační diabetes ženy: mladší než 25 let, které nejsou ani nebyly obézní či s nadváhou (BMI pod 25 kg/m 2 ), které nemají diabetes v rodinné ani osobní anamnéze, 327

328 Diabetes mellitus - úvod do problému které nemají komplikaci v porodnické anamnéze. U všech ostatních žen se provádí aktivní screening na gestační diabetes. Diagnóza gestačního diabetu se provádí u vysoce rizikových žen (přítomnost aspoň dvou z rizikových faktorů) co nejdříve v prvním trimestru gravidity, u ostatních pak mezi týdnem těhotenství vyšetřením glykemie na lačno a následně standardního ogtt po zátěži 75 g glukózy, pokud samotná glykemie na lačno v žilní plazmě není vyšší než 7,0 mmol/l. Je-li glykemie nalačno vyšší než 7,0 mmol/l, je třeba její vyšetření zopakovat následující den k potvrzení diagnózy diabetu. V ostatních případech je zapotřebí provést ogtt. V případě normálního výsledku ogtt na počátku gravidity se test opakuje mezi 24. a 28. týdnem těhotenství. Tab. 1 shrnuje diagnostická kritéria pro gestační diabetes; pro stanovení této diagnózy stačí, jestliže hladina glukózy v kterémkoliv odběru přesáhne uvedený limit. KAPITOLA 28 Tab. 28p.1. Diagnostika gestačního diabetu pomocí ogtt - kritérium podle České diabetologické společnosti a Ćeské společnosti klinické biochemie (ČDS - ČSKB) a Americké diabetologické asociace (ADA) Čas odběru ČDS - ČSKB ADA 0 (před zátěží) 5,6 mmol/l 5,1 mmol/l 1 h - 10,0 mmol/l 2 h 7,7 mmol/l 8,5 mmol/l Zvýšené riziko rozvoje gestačního diabetu mají ženy nad 30 let, s diabetem v rodině, nadváhou a ty, které porodily plod o hmotnosti nad g. Hyperglykémie v těhotenství vede transplacentární cestou k dlouhodobému překrmování plodu, který se rodí velký a je ohrožen nejen komplikacemi během porodu, ale v budoucnu tyto děti mají vyšší riziko rozvoje diabetu v dospělosti. Po porodu se může metabolismus glukózy matky upravit, tyto ženy mají však v budoucnu vyšší riziko rozvoje klasického diabetu 2. typu. Ostatní specifické typy diabetu Existuje řada jiných onemocnění, která mohou vést k destrukci β-buněk Langerhansových osrůvků pankreatu či vyvolat diabetes jiným mechanismem. Patří sem např. akutní pankreatitida, chronická pankreatitida, cystická fibróza či hemochromatóza, které ničí pankreas. Jinou příčinou může být nadprodukce kortikosteroidů (Cushingův syndrom) či častěji dlouhodobá terapie vysokými dávkami steroidních hormonů. Příčinou tzv. steroidního diabetu je stimulace štěpení jaterního glykogenu a zejména podpora glukoneogeneze, tedy tvorby glukózy z bílkovin (resp. glukogenních aminokyselin). Dědičné typy diabetu (MODY) Tyto vzácné typy diabetu jsou způsobeny mutací genu pro glukokinázu (MODY 2) či genů pro specifické transkripční faktory v jádře β-buněk (MODY 1, 3-9). Glukokináza plní v jádrech β-buněk funkci senzoru pro glukózu; proto mají nemocní s MODY 2 mírně zvýšenou glykémii i nalačno. Bývají bezpříznakoví a nejsou ohroženi diabetickými komplikacemi. Naproti tomu nemocní s dalšími typy MODY diabetu mají poruchu tvorby inzulinu, někdy i atrofii pankreatu. Mají typické příznaky diabetu a jsou ohroženi jeho pozdními komplikacemi. Vyžadují léčbu defiváty sulfonylurey (MODY 3) nebo inzulinem. Poruchy glukózové tolerance Je třeba si uvědomit, že není přesná hranice mezi normálním metabolismem glukózy a diabetem. Přechod mezi normální tolerancí glukózy a diabetem tvoří poruchy glukózové homeostázy: zvýšená (hraniční) glykémie nalačno (5,6-7,0 mmol/l); porušená glukózová tolerance (glykémie ve 120. minutě ogtt v rozmezí 7,8-11,0 mmol/l) Poruchy glukózové tolerance představují zvýšené riziko vzniku diabetu a zvyšuje se i riziko kardiovaskulárních onemocnění. 328

329 Diabetes mellitus - úvod do problému Genetika diabetu Diabetes mellitus 1. typu je typické multifaktoriální onemocnění s poměrně silnou genetickou složkou. I když se v poslední době našla řada genů, asociovaných s tímto typem diabetu, nejlépe jsou prozkoumány alely hlavního histikompatibilního systému (HLA) II. třídy, které se podílejí na % genetického rizika rozvoje onemocnění. Mezi dětmi s DM1 je asi 50 % jedinců s vysoce rizikovým genotypem HLA DR3/4-DQ8. Jedinci s tímto genotypem a s genotypem DR4/DR4, mající v rodinné anamnéze toto onemocnění, mají 20% riziko, že v průběhu dětství se u nich objeví autoprotilátky; u jedinců s tímto genotypem bez rodinné zátěže je riziko 5%. Další studium genů asociovaných s DM1 má značný význam zejména v souvislosti s budoucí preventivní léčbou. Diabetes mellitus 2. typu je komplexní onemocnění, v jehož etiopatogenezi se uplatňují genetické faktory i vliv prostředí. Asociační studie objevily asi 40 genů se vztahem k diabetu 2. typu. Osoby, mající jednoho z rodičů s diabetem 2. typu mají 40% pravděpodobnost, že se u nich během života vyvine toto onemocnění, potomci obou rodičů s DM2 onemocní dokonce se 70% pravděpodobností. Konkordance mezi monozygotními dvojčaty je 70 %, mezi dizygotními jen %. Je nesporné, že významný je i vliv prostředí, zejména nezdravý západní způsob života s nadměrným přívodem a nedostatečným výdejem energie. Podle jedné z hypotéz se DM2 objevuje jako následek genetické selekce typů uchovávajících energii v podobě zásobního tuku, což jim umožnilo přežití období nedostatku. Dnes však tento genotyp představuje zvýšené riziko obezity centrálního typu a s ní spojené inzulinové rezistence až diabetu 2. typu. KAPITOLA

330 Diabetes mellitus Diabetes mellitus Autor: prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. Recenzenti: prof. MUDr. Zdeněk Rušavý, CSc., prof. MUDr. Richard Průša, CSc. KAPITOLA 28 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Definice a incidence onemocnění Diabetes mellitus je metabolické onemocnění, mající dvě hlavní příčiny: absolutní nedostatek inzulinu, inzulinovou rezistenci (tj. tkáně na účinek inzulinu neodpovídají). Incidence diabetu jeví ve vyspělých, ale i v rozvíjejících se zemích stále rostoucí tendenci. Zatímco před 30 lety bylo v Československu asi 4 % diabetiků, dnes se jejich podíl na celkové populaci České republiky blíží 8 %; dalších několik procent osob má diabetes, aniž by o tom věděli. Odhaduje se, že během následujících 20 let vzroste počet diabetiků v rozvinutých zemích o dalších 20 %, v rozvíjejících zemích až o 70 %. Při zachování současného trendu bude např. v USA v r % populace trpět diabetem. Příčinou je zejména nezdravý životní styl a rostoucí podíl obézních osob. Trend ve vývoji počtu diabetiků ve světě v absolutních i relativních číslech a jeho aproximaci do r ukazuje graf

331 Diabetes mellitus KAPITOLA 28 Graf 28.1 Trend vývoje počtu diabetiků ve světě Diabetes mellitus je onemocněn velmi závažné z hlediska možných komplikací, které zkracují život nemocného a navíc nadměrně finančně zatěžují zdravotní systém. Nesmírně důležitá je včasná diagnostika onemocnění: odhaduje se totiž, že v současnosti % čerstvě diagnostikovaných nemocných má již pozdní komplikace diabetu. Protože ty se rozvíjejí postupně, po sedmi i více letech trvání onemocnění, mohl být diabetes u těchto osob rozpoznán již před řadou let a následně i adekvátně léčen. Klinické a laboratorní známky diabetu Klinické známky diabetu vycházejí především ze ztrát glukózy močí, doprovázených osmotickou diurézou. Nemocný má tedy polyurii (zvýšený objem moči), následně polydipsii (nadměrně pije) a ubývá na váze, neboť ztrácí energeticky bohaté látky (glukózu, mnohdy i ketolátky) močí. Laboratorní známky diabetu mohou být velmi snadno odvozeny ze znalostí účinku inzulinu (resp. podle absence jeho účinku): hyperglykémie (glukóza nemůže pronikat do buněk pro chybění inzulinu či inzulinovou rezistenci); glykosurie (při překročení tzv. renálního prahu pro glukózu převýší nabídka glukózy buňkám proximálního tubulu ledvin jejich absorpční maximum a glukóza se dostane do definitivní moči); ketonémie a ketonurie (buňkám chybí glukóza musí tedy získávat energii štěpením tuků resp. mastných kyselin; ty však nejsme schopni dokonale spálit, aniž by se současně nemetabolizovala glukóza. Výsledkem je tvorba ketolátek - kyseliny acetoctové, β-hydroxymáselné a acetonu. Uvedené kyseliny jsou příčinou metabolické (keto)acidózy. 331

332 Diabetes mellitus Stanovení glukózy v krvi (glykémie) Stanovení glukózy v krvi patří k základním vyšetřením u diabetika, užívaným v diagnostice i kontrole léčby. V podstatě užíváme dvojí biologický materiál: žilní krev; přídavek antikoagulantu (K 3 EDTA, Na 2 EDTA) brání sražení krve, zatímco fluorid sodný (NaF) slouží jako inhibitor glykolýzy a zajišťuje stabilní koncentraci glukózy po dobu nejméně 24 h. Protože fluorid inhibuje až konečné reakce glykolýzy, dochází i zde zpočátku k mírnému poklesu glykémie; ten není pozorován, je-li současně krev okyselena přídavkem citrátu. Plazma žilní krve je nezbytná pro diagnostiku diabetu. Někdy je stanovována koncentrace glukózy v séru žilní krve - obvykle tehdy, kdy jsou požadována další laboratorní vyšetření. Předpokladem pro tento způsob je včasné oddělení séra od erytrocytů; kapilární krev (obvykle z bříška prstu) slouží ke kontrole léčby diabetika. Pacient si může glykémii stanovit sám pomocí osobního glukometru, stejně tak se vyšetřuje glykémie v režimu POCT na jednotkách intenzivní péče, operačních sálech či na oddělení akutního příjmu nemocnic. Kapilární krev je možné též odeslat k vyšetření do laboratoře či shromažďovat doma při vyšetření glykemického profilu; v tomto případě se krev odebírá do špičatek ( eppendorfek ) z plastu, obsahujících antikoagulant a NaF; je třeba zajistit, aby byl odebrán patřičný objem krve, odpovídající přídavku konzervačního činidla, a po odběru obsah zkumavky promíchat. Jinou možností je odběr přesného množství kapilární krve (obvykle 20 μl) do krátké kapiláry a její převedení do malé zkumavky s lyzačním roztokem; tím je zajištěna stabilita glykémie při transportu do laboratoře. transdermální monitorování glykémie bez použití jehly je ve stadiu klinických studií; usnadnilo by péči o pacienty na jednotkách intenzivní péče, u kterých je nutný opakovaný odběr krve na stanovení glykémie. KAPITOLA 28 Diagnostika diabetu Jak bylo uvedeno v předchozí kapitole, podle doporučení České diabetologické společnosti a České společnosti klinické biochemie je pro diagnostiku diabetu jediným přípustným biologickým materiálem plazma žilní krve. Pro diabetes mellitus svědčí, je-li hladina glukózy v plazmě žilní krve: > 7,0 mmol/l, byl-li pacient nalačno; > 11,0 mmol/l, není-li jisté, zda se jednalo o odběr nalačno. Tato hodnota však musí být potvrzena z nového odběru krve, a to v jiný den. Je-li uvedená hodnota zjištěna jen jednou, pro stanovení diagnózy musí být navíc přítomny typické klinické známky diabetu. Jestliže je uvedená glykémie nalezena jen jednou a nemocný nemá klinické známky diabetu nebo je-li hladina glukózy v plazmě žilní krve nalačno v rozmezí 5,6-7,0 mmol/l (tedy mírně zvýšená), musí být diagnóza diabetu potvrzena (nebo vyloučena) pomocí zátěžového testu - orálního glukózového tolerančního testu (ogtt). Glukózový toleranční test (ogtt) Indikace k provádění ogtt jsou uvedeny v předchozích odstavcích. Důležité je nemocného poučit o přípravě k testu. Alespoň tři dny před testem by měl nemocný jíst normální stravu bez omezení sacharidů, od večera je nalačno. Vlastní test spočívá v zátěži 75 g glukózy, podané per os. Nemocný během minuty vypije roztok se 75 g glukózy, ochucený obvykle citrónem nebo kyselinou citronovou. Pak zůstává v klidu a po dvou hodinách následuje další odběr žilní krve. Podle hodnoty glykémie v plazmě žilní krve v tomto vzorku jsou testovaní zařazeni: glykémie < 7,8 mmol/l: normální glukózová tolerance; glykémie > 11,0 mmol/l: diabetes mellitus; glykémie 7,8-11,0 mmol/l: porušená glukózová tolerance; v tomto případě se doporučuje ogtt po několika měsících zopakovat. Algoritmus diagnostiky diabetu je zobrazen na obrázku

333 Diabetes mellitus KAPITOLA 28 Obrázek 28.3 Algoritmus diagnostiky diabetu Poznámky: 1. V USA je provádění ogtt méně běžné. Stav, který je pro nás indikací k provedení ogtt (tj. glykémie v plazmě žilní krve nalačno > 7,0 mmol/l nalezená jednou u osoby bez příznaků diabetu nebo glykémie v rozmezí 5,6-7,0 mmol/l) je nazýván hyperglykémie nalačno (impaired fasting glucose). Ta je spolu s porušenou glukózovou tolerancí (impaired glucose tolerance, glykémie v plazmě žilní krve ve 2. hodině ogtt v rozmezí 7,8-11,0 mmol/l) někdy označována jako prediabetes. Je nesporné, že tyto osoby mají vysoké riziko rozvoje diabetu. 2. Diagnostická kritéria diabetu se postupně měnila, resp. zpřísňovala. Původně platila pro diagnostiku diabetu hladina glukózy v plazmě žilní krve nalačno 7,8 mmol/l. Na základě zjištění, že se u významného procenta osob s hodnotou nižší než 7,8 mmol/l vyvine diabetická retinopatie, byl v r rozhodovací limit snížen na 7,0 mmol/l. Stejně tak se před několika lety snížil dolní rozhodovací limit pro hyperglykémi nalačno z 6,1 na 5,6 mmol/l. Cílem těchto změn je včas zachytit nemocné, ohrožené v budoucnu rozvojem diabetu a zejména jeho pozdních komplikací. 3. U těhotných se ogtt provádí stejně jako u netěhotných (tedy se zátěží 75 g glukózy p.o.), hodnocení výsledků je však odlišné, přísnější. Nalačno by glykémie neměla přesahovat hodnotu 5,5 mmol/l, 2 h po zátěži 7,7 mmol/l. Fakultativně je možno hodnotit i glykémii v 60. minutě testu; neměla by přesáhnout hodnotu 8,8 mmol/l. Podrobněji je o gestačním diabetu pojednáno v kapitole o laboratorním vyšetření v těhotenství. Laboratorní kontrola diabetu Je-li nemocnému diagnostikován diabetes mellitus, je zapotřebí jeho laboratorní kontrola. Podle doby, kterou laboratorní vyšetření pokrývá, rozlišujeme tři stupně kontroly: Jednorázová glykémie Vyšetření ukazuje aktuální koncentraci glukózy v krvi v době odběru. Má význam především při podezření na významnou hyper- či hypoglykémii. Nemocný si může vyšetření provést sám po odběru krve z prstu pomocí diagnostických proužků a výsledek 333

334 Diabetes mellitus odečíst na osobním glukometru; podle výsledku je možná okamžitá reakce (podání inzulinu či naopak sacharidů). Glykemický profil Informuje o změnách hladiny glukózy v krvi v průběhu 24 hodin. Krev je odebírána z prstu v předem daných časech (5-11 odběrů za den). Krev se odebírá před jídlem a po jídle a v indikovaných případech i ve 2 h v noci, abychom odhalili event. noční hypoglykémii, která by mohla být maskovaná následnou reaktivní hyperglykémií v ranních hodinách; tento jev je někdy označován jako fenomén úsvitu (dawn phenomenon). KAPITOLA 28 Nejedná se o vyšetření akutní, vzorky správně konzervované (fluorid sodný) lze uchovávat a do laboratoře odeslat najednou. Podle zjištěných hodnot je řízena léčba inzulinem (typ inzulinu, intervaly, dávky). Dlouhodobá kompenzace diabetu - glykovaný hemoglobin Ošetřující lékař potřebuje vědět, jaká byla kompenzace nemocného v delším časovém období. K tomu dnes slouží obvykle stanovení tzv. glykovaného hemoglobinu. Glykace - vysvětlení pojmu, princip Glykace je neenzymová vazba molekul sacharidů na volné aminokyseliny biomolekul. Nejčastěji se váže molekula glukózy svou aldehydovou skupinou na volnou aminoskupinu bílkoviny, zejména ε-aminoskupinu lyzinu. V kondenzační reakci vzniká tzv. Schiffova báze (chemicky aldimin). Reakce je plně vratná: při hyperglykémii probíhá reakce zleva doprava, při poklesu glykémie se molekula glukózy zase odštěpí, reakce tedy proběhne opačným směrem. Toto však platí jen tehdy, je-li hyperglykémie přechodná. Trvá-li dlouho (týdny), dochází k přestavbě molekuly aldiminu, hovoříme o intramolekulárním přesmyku (podle jeho objevitele se nazývá Amadoriho přesmyk). Tato reakce je již nevratná a dává vzniknout ketoaminu, což je vlastně derivát fruktosaminu. Fruktosamin zůstává vázán na molekulu bílkoviny až do její úplné degradace a eliminace z organismu. Schéma glykace znázorňuje obrázek Obrázek 28.4 Schéma glykace proteinu (vysvětlení v textu) 334

335 Diabetes mellitus Glykovaný hemoglobin jako ukazatel dlouhodobé kompenzace diabetu Zvolíme-li vhodnou bílkovinu, může intenzita její glykace vypovídat o dlouhodobé průměrné glykémii, tedy o stavu kompenzace diabetu. Takovou molekulou je molekula hemoglobinu. Beta-řetězec hemoglobinu A je snadno glykován, hemoglobin má velmi dlouhý biologický poločas a i když je uzavřen uvnitř erytrocytů, je i u diabetika dostupný glykaci - glukóza proniká do erytrocytů i bez účinku inzulinu. Stanovujeme tedy glykovaný hemoglobin, zkratkou obvykle označovaný jako HbA 1c či jen A1c. Glykovaný hemoglobin ukazuje kompenzaci nemocného (průměrnou glykémii) asi 2-3 měsíce před odběrem krve. Vyjadřuje se obvykle v procentech celkového hemoglobinu, horní referenční mez pro zdravé jedince jsou 4 %. U dobře kompenzovaného diabetika by podíl glykovaného hemoglobinu neměl přesáhnout 4,5 %, uspokojivá kompenzace je do 6 %, vyšší je již neuspokojivá. KAPITOLA 28 Uvedené hodnoty platí pro kalibraci stanovení glykovaného hemoglobinu za použití IFCC kalibrace; v ČR platí od r Řada dalších států (USA, ale i mnoho zemí v Evropě) však užívá NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program) kalibraci starší, kde vycházejí hodnoty asi o 2 % vyšší. V poslední době je tendence k vyjadřování koncentrace glykovaného hemoglobinu v SI jednotkách, vyjadřující množství molekul fruktosaminu navázaných na hemoglobinu; jednotkou je mmol/mol. Přibližný vztah je následující: HbA 1c 4,75 % (IFCC) = 6,5 (NGSP) = 47,5 mmol/mol (SI jednotky) V USA někdy doporučovaný výpočet průměrné glykémie (estimated average glucose, eag), není v našich podmínkách aplikován. Hodnota glykovaného hemoglobinu je při něm jednoduchým způsoben přepočtena na jakousi průměrnou hodnotu glykémie, která je nemocnému lépe srozumitelná; nebere však v úvahu individuální rozdíly v rychlosti glykace. Glykovaný hemoglobin v diagnostice diabetu Podle doporučení České diabetologické společnosti a České společnosti klinické biochemie (2012) je v případě pochybnosti rozhodující pro stanovení diagnózy diabetu výsledek glukózového tolerančního testu (ogtt). Stanovení glykovaného hemoglobinu se užívá pouze k hodnocení dlouhodobé kompenzace diabetu. V poslední době se však ve Spojených státech objevily snahy využít koncentraci glykovaného hemoglobinu i k diagnostice diabetu. Je pro to několik důvodů: lepší analytické parametry; vyšší stabilita analytu ve vzorcích biologického materiálu; nižší biologická variabilita HbA 1c (pod 2 %); vyšší komfort pro pacienta (odpadá nutnost lačnění a pití roztoku glukózy); minimální vliv stresu na výsledek; použití identického vyšetření k diagnóze i ke kontrole terapie. Skupina expertů z ADA (American Diabetes Association), EASD (European Association for the Study of Diabetes) a IDF (International Diabetes Federation) doporučuje jako cut-off hodnotu glykovaného hemoglobinu pro diagnostiku diabetu 6,5 % (NGSP); tomu odpovídá podle kalibrace IFCC hodnota 4,75 %. Hodnota od 5,7 do 6,5 % podle NGSP pak ukazuje na zvýšené riziko rozvoje diabetu resp. jeho pozdních komplikací. Bylo totiž zjištěno, že poměrně dobře koreluje hodnota glykovaného hemoglobinu a riziko pozdních komplikací, zejména diabetické retinopatie. Protože se jedná a spojitou funkci a nelze určit hodnotu, od které by riziko výrazněji stoupalo, je hodnota 5,7 % zvolena dohodou - aby bylo odhaleno dostatečné množství nemocných a současně jim mohla být poskytnuta kvalifikovaná péče. Opakovaně byla srovnávána diagnostika diabetu podle klasických kritérií (glykémie nalačno a postprandiální, výsledek ogtt) a podle nově zavedeného kritéria, hodnoty glykovaného hemoglobinu. Lze říci, že každé z kritérií zahrnuje poněkud odlišnou část populace a že se překrývají jen zčásti (obr. 28.5), přičemž glukózový toleranční test se zdá být citlivější v detekci diabetu než stanovení glykovaného hemoglobinu. Zařazení glykovaného hemoglobinu v diagnostice diabetu se uplatní zejména u osob, které nezaručují dodržení správné přípravy na ogtt. Podle doporučení České diabetologické společnosti je možné hodnotu glykovaného hemoglobinu použít v rámci screeningu poruch glukózové homeostázy, zejména ve vztahu k prediabetu, nikoliv však v diagnostice diabetu. 335

336 Diabetes mellitus KAPITOLA 28 Glykovaný albumin Obrázek 28.5 Diagnostická kritéria diabetu nezahrnují stejné jedince (podle Škrhy) Kdysi byl jako ukazatel střednědobé kompenzace diabetu stanovován tzv. glykovaný protein; test byl znám pod názvem fruktosamin. Stanovoval hlavně glykovanou molekulu albuminu. Protože se však jednalo o nespecifickou metodu s řadou interferencí, byla postupně opuštěna. V poslední době bylo vyvinuto několik specifických metod, stanovující výhradně glykovaný albumin. Slouží jako ukazatel kompenzace nemocného 2-4 týdny před odběrem krve a může být užit v případech, kdy glykovaný hemoglobin nedává spolehlivou informaci o dlouhodobé kompenzaci diabetu (zkrácené přežívání erytrocytů, hemoglobinopatie apod.). Point-of-care testing (POCT) a selfmonitoring diabetiků Existuje možnost kontroly diabetika v ordinaci lékaře, na operačním sále či doma samotným pacientem. Bez možnosti kontroly glykémie a okamžité reakce na zjištěnou hodnotu si již nedovedeme představit péči o diabetiky. Již desítky let jsou k dispozici osobní glukometry, které objektivně vyhodnotí glykémii stanovenou pomocí diagnostického proužku. Nejmodernější přístroje pracují na elektrochemickém principu a mají možnost uchovat v paměti množství výsledků. Pro správné měření je třeba edukovat nemocného (nebo nelaboratorní zdravotnický personál) a zajistit, aby byl glukometr zařazen do systému externího hodnocení kvality. Považuji za nutné zdůraznit, že glukometry slouží ke kontrole diabetika a nikoliv pro diagnostiku onemocnění; ve srovnání se sofistikovanými metodami stanovení glykémie v klinických laboratořích totiž vykazují výsledky významně horší reprodukovatelnost. Toto platí i o zamýšleném projektu České lékárenské komory České diabetologické společnosti, kdy by si měl pacient přicházející pro léky do lékárny v diskrétním koutě kontrolovat glykémii pomocí glukometru v plné krvi, kterou si sám odebral z prstu. Pojišťovny hradí všem dospělým preventivní prohlídky u praktického lékaře jednou za dva roky (u osob se zvýšeným rizikem diabetu dokonce jednou ročně), jejich součástí je i vyšetření hodnoty glykémie; mnoho lidí však tyto prohlídky bohužel zcela ignoruje a je dost sporné, zda by si sami došli do lékárny změřit glykémii. V poslední době jsou nabízeny i další možnosti vyšetřování diabetika formou POCT. Je to především stanovení glykovaného 336

337 Diabetes mellitus hemoglobinu; bohužel však řada přístrojů pro tento účel vyráběných nevykazuje přijatelné analytické parametry. Stanovení mikroalbuminurie speciálním proužkem (nikoliv proužkem pro průkaz proteinurie!) je rovněž možné; protože se však v žádném případě nejedná o vyšetření akutní, je vhodnější, aby toto vyšetření bylo svěřeno příslušné klinické laboratoři. Další laboratorní vyšetření u diabetika KAPITOLA 28 Mikroalbuminurie Zdravým glomerulem prochází jen minimální množství albuminu (glomerulární membrána má fyziologicky negativní náboj stejně jako albumin, což průniku většího množství albuminu brání) a jisté množství mikroproteinů. Tyto bílkoviny jsou téměř kompletně vychytány buňkami proximálního tubulu a zmetabolizovány. Resorpční schopnost proximálního tubulu však nemá velkou funkční rezervu a při zvýšeném průniku bílkovin glomerulární membránou jsou neresorbované proteiny prokazatelné v moči. Tak je tomu i v počáteční fázi diabetu, kdy přechodně pozorujeme glomerulární hyperfiltraci; podílí se i zvýšená propustnost glomerulu vlivem glykace ev. aseptického zánětu. V moči se pak najde zvýšené množství albuminu - větší než fyziologické, i když ještě neprokazatelné testačními proužky na průkaz bílkoviny. Tento stav nazýváme mikroalbuminurií; k jejímu průkazu je třeba použít citlivější, imunochemickou metodu. Schéma na obrázku č. 6 vysvětluje pojem mikroalbuminurie; v praxi se však vzhledem k závislosti koncentrace albuminu v moči na hydrataci nemocného nevydává výsledek v mg/l, ale v jednotkách beroucích tento fakt v úvahu (viz dále). Obrázek 28.6 Vysvětlení pojmu mikroalbuminurie U diabetiků slouží vyšetření mikroalbuminurie k časné predikci diabetické nefropatie. Pacienti s diabetem by měli být testováni na přítomnost diabetického onemocnění ledvin jednou ročně. Screening by měl začít u pacientů s diabetem 1. typu 5 let po stanovení diagnózy diabetu a u pacientů s diabetem 2. typu ihned po stanovení diagnózy. Screening zahrnuje stanovení poměru albumin/kreatinin v prvním ranním vzorku moči. Vyšetření albuminu v moči sbírané 24 hodin se nedoporučuje, je však možné vyšetřit albuminurii ve vzorku moči sbíraném během klidu na lůžku v noci; výsledek je pak vydáván v μg/min. V praxi se však dává přednost vyšetření v jednorázovém vzorku moči, výsledek se vztahuje ke koncentraci kreatininu v moči (ACR = albumin/ creatinine ratio; výsledek se vydává v mg/mmol kreatininu); hodnocení albuminurie shrnuje tab. 1. Vzhledem k vysoké intraindividuální variabilitě (až 30 %) by pro diagnózu mikroalbuminurie měly být pozitivní alespoň 2 ze 3 vzorků moče vyšetřených v průběhu 3 6 měsíců; vyšetření by nemělo být prováděno při současné infekci močových cest, po zvýšené fyzické námaze a při menses. Diabetické onemocnění ledvin je přítomno ve formě incipientní diabetické nefropatie vždy, je-li prokázána mikroalbuminurie. Zlepšení metabolické kompenzace diabetu, uspokojivá korekce hypertenze a léčba inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu (ACEI) snižuje riziko progrese postižení ledvin. Pacienti s mikroalbuminurií (i nediabetici) mají výrazně zvýšené kardiovaskulární riziko. Mikroalbuminurie je u těchto nemocných zřejmě markerem generalizované endotelové dysfunkce. V poslední době se ukazuje, že zvýšené renální i kardiovaskulární riziko mají i osoby s tzv. vysokou normální albuminurií. Měření koncentrace albuminu v moči je důležité i u nemocných s arteriální hypertenzí, kde rovněž může signalizovat počínající poškození ledvin. 337

338 Diabetes mellitus Typ vzorku Náhodný vzorek Sběr moči Mikroalbuminurie 2,6 29,9 mg/mmol kreatininu (muži) 3,6 29,9 mg/mmol kreatininu (ženy) mg/24 h μg/min Tabulka 28.1 Kritéria mikroalbuminurie KAPITOLA 28 Poznámka: Preferovaným kritériem je hodnota ACR (mg/mmol kreatininu) Stanovení autoprotilátek Diabetes mellitus 1. typu je autoimunitní onemocnění, způsobené destrukcí β-buněk cytotoxickými T-lymfocyty. Zároveň však u těchto nemocných můžeme prokázat v krevním séru různé typy s diabetem asociovaných autoprotilátek; ty sice nemají cytotoxický účinek, signalizují však probíhající autoimunitní proces. Velmi příhodně je účinek cytotoxických lymfocytů přirovnáván k ohni, zatímco autoprotilátky tvoří pouze kouř, který k ohni patří, ale sám nemá ničivý účinek. Autoprotilátky bývají prokazatelné měsíce až roky před propuknutím klinickým příznaků: musí být totiž zničeno více než % β-buněk, aby byla produkce inzulinu tak nízká, že vede k příznakům diabetu. Při dalším průběhu diabetu pak autoprotilátky často postupně mizí. V praxi se prokazují následující autoprotilátky se vztahem k DM1: autoprotilátky proti buňkám Langerhansových ostrůvků (islet cells autoantibodies, ICA); autoprotilátky proti inzulinu (insulin autoantibodies, IA); autoprotilátky proti glutamátdekarboxyláze (glutamic acid dexarboxylase autoantibodies, GADA); autoprotilátky proti intracelulární části tyrozinfosfatázy (insulinoma 2-associated autoantibodies, IA-2A); autoprotilátky proti specifickému transportéru zinku (zinc transporter 8 protein islet autoantibodies, ZnT8A) Kromě inzulinu jsou všechny antigeny, proti kterým se autoprotilátky tvoří, lokalizovány intracelulárně, musí proto probíhat destrukce β-buněk, aby se antigeny zpřístupnily imunokompetentním buňkám. ICA a GADA jsou prokazatelné u % osob s DM1 v době nástupu onemocnění, další typy autoprotilátek mají o něco menší senzitivitu. Nález autoprotilátek signalizuje zvýšené riziko rozvoje DM1 v budoucnu; riziko přitom roste s počtem typů detekovaných protilátek, popisuje se přibližně a 50% riziko u nálezu a 4 typů autoprotilátek. Riziko dále zvyšuje nález DM1 v příbuzenstvu nebo přítomnost rizikového HLA genotypu. Dá se předpokládat, že stanovení autoprotilátek bude mít velký význam u příbuzných osob s DM1 v době, kdy budeme schopni preventivní léčbou tlumit autoimunitní proces a oddálit tak nástup onemocnění. Jak bylo uvedeno, diabetes mellitus 1. typu je autoimunitní onemocnění. Protože se autoimunitní onemocnění často sdružují, doporučuje se pomýšlet na možnost DM1 i u osob s diagnostikovaným jiným autoimunitním onemocněním (celiakie, autoimunitní tyroiditida apod.). Naopak u nemocných s DM1 myslíme i na možnost přítomnosti jiných autoimunitních chorob. Kvantifikace inzulinové rezistence Inzulinová rezistence je typická nejen pro diabetes mellitus 2. typu, ale i pro tzv. metabolický syndrom. Zejména pro hodnocení léčebných opatření je někdy třeba objektivizovat inzulinovou rezistenci a hodnotit její stupeň. Slouží pro to několik způsobů, které však nepatří k rutinním vyšetřením. HOMA (Homeostatic Model Assessment) index se počítá ze sérové koncentrace glukózy a inzulinu nalačno: HOMA = (glukóza x inzulin)/22,5. Normální hodnota je do 1, inzulinová rezistence je pravděpodobná nad 2, velmi pravděpodobná nad 2,5. Inzulinová křivka - jde vlastně o orální glukózový toleranční test, prodloužený na tři hodiny po perorálním podání glukózy. Inzulinová rezistence se projeví nadprodukcí inzulinu, tedy hyperinzulinismem. 338

339 Diabetes mellitus Euglykemický hyperinzulinemický clamp je provedením nejsložitější. Testovanému je v i. v. infuzi podáván stále stejnou rychlostí inzulin a současně dostává infuzi s glukózou. Její rychlost se mění tak, aby se hodnota glykémie pohybovala mezi 5-5,5 mmol/l. Inzulinová rezistence se projeví sníženým množstvím glukózy, které je potřebné podat pro udržení euglykémie. Stanovení inzulinu a C-peptidu Jak inzulin, tak i C-peptid lze stanovit imunochemickými metodami za pomoci specifických protilátek, v praxi se však běžně neužívají. Protože β-buňky pankreatu secernují inzulin i C-peptid v ekvimolárním množství, lze považovat C-peptid za ukazatel endogenní sekrece inzulinu. Na rozdíl od stanovení inzulinu není hladina C-peptidu ovlivněna exogenním inzulinem event. přítomnými antiinzulinovými protilátkami. Stanovení C-peptidu má tedy význam pro posouzení reziduální sekrece inzulinu u nemocných s diabetem 1. typu, svůj význam má i u hypoglykémie nejasné etiologie. Vznik C-peptidu a inzulinu z proinzulinu znázorňuje obrázek KAPITOLA 28 Obrázek 28.7 Schéma štěpení proinzulinu na molekulu inzulinu a C-peptidu. Komplikace diabetu Diabetes mellitus je závažný především svými závažnými komplikacemi, které mohou být až život ohrožující. Mohou nastoupit rychle a rozvíjejí se během hodin až dnů, někdy dokonce během desítek minut (akutní komplikace diabetu), jindy je třeba desítky let trvání nemoci, aby se komplikace projevily (komplikace pozdní, chronické). V dalších odstavcích tyto komplikace stručně probereme, hlavně s ohledem na jejich vztah k laboratorním vyšetřením; na podrobnosti odkazujeme na interní medicínu. 339

340 Diabetes mellitus Akutní komplikace diabetu Tyto komplikace vznikají náhle a mohou bezprostředně ohrozit nemocného na životě. V podstatě rozlišujeme dvě akutní komplikace diabetu. Hyperglykemické kóma Příčinou je nedostatek inzulinu. Postihuje častěji diabetiky 1. typu, kde je absolutní nedostatek inzulinu, ale nevyhýbá se ani diabetikům 2. typu. Nemocný má významnou hyperglykémii, močí ztrácí velké množství tekutin, ale i minerálů (osmotická diuréza), může nastat až šokový stav. Roste osmolalita plazmy. Nemožnost buněk metabolizovat glukózu vede k oxidaci mastných kyselin a tvorbě ketolátek. Hyperglykemické kóma je proto často doprovázeno diabetickou ketoacidózou s významným poklesem ph krve, které je hlavní příčinou bezvědomí. V moči prokazujeme ketolátky. U nemocných v šokovém stavu může hypoxie tkání vést k redukci kyseliny acetoctové na kyselinu β-hydroxymáselnou, která s diagnostickým proužkem na průkaz ketolátek nereaguje; ty pak vycházejí falešně negativní. Kompenzace ketoacidózy se projeví velkým Kussmaulovým dýcháním, z dechu nemocného může být cítit aceton. U nemocných v šokovém stavu se na rozvoji acidózy podílí i nadprodukce laktátu v hypoxických tkáních. Laktátová acidóza může vzácně komplikovat léčbu diabetu biguanidy, vyskytne se i u těžkého nedostatku vitaminu B 1 (thiaminu). Po léčbě inzulinem jsou ketolátky metabolizovány na hydrogenuhličitan; z tohoto důvodu se nemocnému většinou nepodávají alkalizační infúze, hrozila by následně alkalémie. KAPITOLA 28 Hypoglykemické kóma Hypoglykemické kóma je obvykle vyvoláno předávkováním inzulinu (podání nadměrné dávky, nedostatečný přívod sacharidů či nezvyklá fyzická zátěž při normální dávce inzulinu). Příznaky jsou tím těžší, čím rychleji glykémie klesá. Pocení je vyvoláno aktivací sympatiku, následuje porucha vědomí až kóma - buňky CNS potřebují pro svou činnost glukózu. Léčba spočívá v přívodu glukózy per os či i.v. u nemocného v bezvědomí. Výjimečně se může těžkou hypoglykémií projevit i předávkování perorálních antidiabetik ze skupiny derivátů sulfonylurey. Pozdní (chronické) komplikace diabetu Pozdní komplikace ohrožují diabetiky 1. a 2. typu. Rozvíjejí se postupně, desítky let a zpočátku se neprojevují žádnými příznaky. Jak již bylo uvedeno v úvodu, % nově diagnostikovaných nemocných má již rozvinuté pozdní komplikace. Protože nejdůležitější je prevence pozdních komplikací, je jasné, jak velký význam má co nejčasnější stanovení diagnózy diabetu. Pozdní komplikace postihují zejména cévy, ale i oční čočku (katarakta); rozlišují se hlavní dva typy cévních komplikací. Diabetická makroangiopatie Postiženy jsou velké tepny a onemocnění se nijak neliší od aterosklerózy osob, které nemají diabetes. Rozdíl je jen v tom, že diabetici jsou v průměru 3x více ohroženi než osoby bez diabetu. Nemocný je ohrožen všemi známými komplikacemi aterosklerózy: různými formami ischemického onemocnění srdce včetně infarktu myokardu, cévní příhodou mozkovou i komplikacemi postižení velkých tepen dolních končetin. V etiopatogenezi aterosklerózy se uplatňuje především oxidační stres; nadprodukce volných radikálů u diabetiků doprovází hyperglykémii, glykace LDL částic usnadňuje jejich oxidaci a neschopnost vazby na LDL receptory. Diabetická mikroangiopatie Jedná se o komplikaci typickou pro diabetiky. Postiženy jsou drobné tepénky, jejich stěna zesílí a následují poruchy oxygenace tkání. Nejzávažnější je postižení cév očního pozadí (diabetická retinopatie, vedoucí až k slepotě), glomerulů (diabetická nefropatie, končící selháním ledvin), cév dolních končetin s následnými gangrénami. Postižení cév zásobujících nervy se podílí na vzniku diabetické neuropatie. U nejméně 40 % nemocných zařazených v chronickém dialyzačním programu je příčinou selhání ledvin 340

341 Diabetes mellitus diabetická nefropatie, diabetická retinopatie je nejčastější příčinou slepoty osob v produktivním věku. V etiopatogenezi této komplikace se uplatňuje glykace proteinů s dlouhým biologickým poločasem a následnou oxidací vzniklých sloučenin. Výsledkem je tvorba vysoce reaktivních aldehydů, zvané advanced glycation end-products (AGE látky). Ty reagují s dalšími bílkovinami a glukóza tak vytváří můstky mezi jednotlivými bílkovinnými molekulami. Zesítěné bílkoviny mají stimulační účinek na tvorbu cytokinů se zánětlivým a proliferačním účinkem; jejich působením se mění charakter a tloušťka cévní stěny a vzniká tak diabetická mikroangiopatie. Z etiopatogeneze procesu je jasné, že neúčinnější prevencí bude co nejlepší kompenzace diabetika, bránící nadměrné glykaci i nadprodukci volných radikálů. KAPITOLA 28 Možnosti léčby diabetu Cílem těchto odstavců není suplovat učebnici vnitřního lékařství, ale přinést stručný přehled možností léčby diabetika se zdůrazněním mechanismu účinku jednotlivých léků. Dieta U diabetiků se uplatňuje dieta s určitým omezením sacharidů, avšak jen v počátečních stadiích DM2. Dieta vedoucí ke snížení hmotnosti u nemocných s centrální obezitou významně zvyšuje citlivost k inzulinu, neboť omezí nadprodukci cytokinů tukovou tkání. Samozřejmou součástí terapie je i zvýšení tělesného pohybu. Potraviny obsahující sacharidy se dají dělit podle jejich glykemického indexu, který odráží rychlost nárůstu glykémie a délku jejího přetrvávání po perorálním příjmu příslušné potravy. Stanoví se průběh glykémie během dvou hodin po jídle obsahujícím 50 g sacharidů (v jakékoli formě) a stejně tak po podání 50 g glukózy per os. Poměr plochy pod křivkou u testované stravy a roztoku samotné glukózy vyjádřený v procentech je glykemický index. Potraviny s vysokým glykemickým indexem (ovoce, med, bílé pečivo) působí rychlý nárůst glykémie, zvýšenou sekreci inzulinu, zvyšují tkáňovou rezistenci na inzulin a stoupá po nich koncentrace triacylglycerolů. Naproti tomu potraviny s nízkým glykemickým indexem (rýže, tmavý chléb aj.) nemají výše uvedené metabolické účinky a jejich podávání diabetikům se proto jeví jako výhodnější. Medikamentózní terapie K dispozici je celá řada léků s různou indikací i odlišným mechanismem účinku. Inzulin Dnes se užívá výhradně humánní inzulin, vyráběný pomocí biotechnologických metod. Indikován je u nemocných s DM1 a v pokročilejších stadiích a při komplikacích u nemocných s DM2. Je k dispozici řada preparátů lišících se rychlostí nástupu a přetrváváním účinku. Běžné je podávání podkožní, často inzulinovými pery, v případě potřeby i inzulinovou pumpou. Existuje i preparát pro inhalační podání, vzhledem k vysoké ceně a řadě omezení se však v praxi prakticky neužívá. Inzulinová analoga Jedná se o zvláštně upravený inzulin, jehož molekuly se liší od humánního inzulinu v uspořádání aminokyselin. Změnou struktury inzulinu je dosažena změna rychlosti a délky účinku inzulinu. Krátkodobě působící mají kratší dobu působení, ale rychlejší dobu nástupu než klasický humánní inzulin. Používají se nejen injekčně, ale i do inzulinových pump. Dlouhodobě působící analoga mají výhodu v dlouhodobém působení (až 24 hodin). Biguanidy Užívají se u všech nemocných s DM2, kteří nemají kontraindikace a léčbu snáší. Zvyšují senzitivitu jater a svalové tkáně k inzulinu, tlumí glukoneogenezu i vstřebávání glukózy v tenkém střevě. Stimulací glykolýzy mohou vyvolat vznik laktátové acidózy. Základním představitelem této skupiny je metformin. 341

342 Diabetes mellitus Deriváty sulfonylurey Patří mezi tzv. inzulinová sekretagoga, zvyšují totiž sekreci inzulinu z β-buněk Langerhansových ostrůvků. Základním mechanismem účinku je blokáda ATP-senzitivních kaliových kanálů, vedoucí k depolarizaci buněčné membrány. Při předávkování mohou vyvolat hypoglykémii, zvyšují chuť k jídlu a někdy vedou k nárůstu hmotnosti. Příkladem v praxi užívaných derivátů sulfonylurey jsou glipizid a glimepirid. Inhibice vzniku glukózy ze škrobu v tenkém střevě KAPITOLA 28 Základním představitelem je akarbóza, inhibitor střevní α-glukosidázy. Tento enzym navazuje na činnost α-amylázy a dokončuje štěpení škrobu až na glukózu. Akarbóza tedy zpomaluje vznik glukózy z polysacharidů potravy a snižuje postprandiální hyperglykémii. Glitazony Glitazony (thiazolidindiony) aktivují prostřednictvím jaderného receptoru PPAR-γ transkripci genů, odpovídajících za metabolické účinky inzulinu, snižují tedy inzulinovou rezistenci. Užívá se pouze pioglitazon. Glinidy Glinidy stejně jako deriváty sulfonylurey blokují ATP-senzitivní kaliový kanál v membránách β-buněk. Působí rychle, takže jsou ideální k užívání s jídlem ke kompenzaci postprandiální hyperglykémie. Příkladem těchto látek je repaglinid a nateglinid. Léky modulující účinky inkretinů Inkretiny jsou peptidy uvolňované z trávicího traktu, které napomáhají dosažení glukózové homeostázy. Hlavními inkretinovými hormony jsou glukagon-like peptid-1 (GLP-1) a glukózo-dependentní inzulinotropní polypeptid (GIP). GLP-1 stimuluje sekreci inzulinu jako odpověď po příjmu potravy, inhibuje sekreci glukagonu a zpomaluje vyprazdňování žaludku. Vede tím k výraznému snížení výkyvů glykémie po jídle. V praxi se užívají syntetická analoga GLP-1, např. exenatid. Další možností jak zvýšit hladinu GLP-1 je zpomalit jeho odbourávání enzymem dipeptidylpeptidázou 4 (DPP4). Výhodou inhibitorů DPP4 (gliptinů) je možnost perorálního podávání, zatímco analoga GLP-1 je třeba podávat injekčně. Mezi jejich představitele patří sitagliptin a vildagliptin. Biologická léčba u diabetu 1. typu Cílem této léčby je zpomalit autoimunitní proces a tedy i zánik β-buněk Langerhansových ostrůvků. Ve fázi klinických studií je užití anti-cd3 monoklonálních protilátek, které modulují odpověď T-lymfocytů, nebo anti-cd20 protilátek s cílem ovlivnit vyzrávání B-lymfocytů a snížit tak prezentaci antigenů T-lymfocytům. Samozřejmě nejlepší by bylo ovlivnit autoimunitní proces co nejdříve, kdy ještě nejsou přítomny známky diabetu, tak daleko však současný výzkum ještě není. Transplantace buněk Langerhansových ostrůvků V podstatě je možná transplantace samotného pankreatu (výjimečně), kombinovaná transplantace ledviny a pankreatu u nemocného s diabetem a selháním ledvin nebo transplantace samotných buněk Langerhansových ostrůvků. Té předchází složitá separace těchto buněk, čištění a množení v tkáňové kultuře. Samotný výkon je již jednodušší - buňky se aplikují injekčně do hlavní žíly vedoucí do jater, není tedy třeba operace. V experimentu byly pokusným zvířatům intraperitoneálně aplikovány β-buňky enkapsulované v polymeru, umožňujícím průnik malých (glukózy) i středních molekul (inzulin), bránící však v přístupu protilátkám a imunokompetentním buňkám. Podařilo se tak kompenzovat experimentálně navozený diabetes mellitus po řadu měsíců. 342

343 Diabetes mellitus Stresem indukovaná hyperglykémie Inzulin je jediný hormon, snižující glykémii. Naproti tomu existuje množství hormonů, které mají opačný, tedy hyperglykemizující účinek. Při převaze těchto hormonů nad inzulinem dochází k hyperglykémii. Tak pozorujeme hyperglykémii u hyperthyreózy či Cushingova syndromu, nejčastější je však hyperglykémie vyvolaná nadprodukcí tzv. stresových hormonů. Při stresu je nutné zajistit dostatek snadno využitelné energie pro svalové i jiné buňky, tedy dostatek glukózy. Zajišťují to katecholaminy, resp. adrenalin, který podporuje štěpení jaterního glykogenu, a glukokortikoidy (kortizol), které navíc stimulují glukoneogenezu. Každý nemocný v těžkém stavu je ve stresu; patří sem nemocní po operacích, úrazech, na jednotkách intenzivní péče, po infarktu myokardu či iktu, s těžkým zánětlivým onemocněním apod. Proto u všech těchto nemocných lze očekávat hyperglykémii. Chceme-li u nich testovat glukózovou toleranci, je třeba počkat nejméně 6 týdnů po odeznění akutního stavu. KAPITOLA 28 U nemocných v těžkém stavu se stresovou hyperglykémií byl prokázán pozitivní efekt kontroly glykémie s cílem dosažení glykémie v rozmezí 6-10 mmol/l. Snaha o dosažení nižší glykémie vede k nárůstu hypoglykémií, které zvyšují mortalitu nemocných. Příčiny hypoglykémie Na závěr - pro úplnost - přinášíme kapitolu, která má vztah k diabetu jen v některých částech; probereme možné příčiny hypolykémie. K nejčastějším příčinám tohoto stavu patří: Delší lačnění, zejména u osob se sníženou zásobou glykogenu v játrech; nastává snadno především u novorozenců (hlavně nedonošených) a samozřejmě také u cirhotiků. Předávkování inzulínu, ať už příčinou byla aplikace příliš velké dávky vzhledem k příjmu glycidů či nezvykle velká fyzická námaha, která potřebu inzulínu snižuje. Předávkování perorálních antidiabetik, jmenovitě derivátů sulfonylurey. Intoxikace alkoholem - redukovaná forma koenzymu NADH, který vzniká při metabolismu alkoholu, inhibuje glukoneogenezi, což ve svém důsledku vede k hypoglykémii. Nezidiom pankreatu (= inzulinom) je nádor β-buněk Langerhansových ostrůvků, produkující inzulín. Vyplavení inzulinu může být náhlé, záchvatovité - v tom případě se projeví náhlou hypoglykémií. V laboratorním vyšetření dominuje vysoká hladina inzulínu a C-peptidu. Hereditární onemocnění, např. některé typy glykogenóz, poruchy metabolismu monosacharidů, defekty glukoneogeneze a defekty oxidace mastných kyselin. Nemocní s glykogenózou 1. typu mají těžkou hypoglykémii nalačno, nejsou totiž pro deficit glukóza-6-fosfatázy schopni štěpit jaterní glykogen. Naproti tomu pacienti s galaktosémií a intolerancí fruktózy mají hypoglykémii po příjmu příslušného cukru (v prvém případě po požítí mléka s obsahem laktózy, v druhém případě po sacharóze, jejíž součástí je fruktóza). Nejčastějí příčinou galaktosémie je deficit galaktóza-1-fosfáturidyltransferázy; hromadící se galaktóza1-fosfát inhibuje glykogenolýzu, mj. enzymy glykogenfosforylázu a glukóza-6-fosfatázu. U hereditární intolerance fruktózy se v organismu hromadí fruktóza-1-fosfát (pro deficit fruktóza-1-fosfátaldolázy); ten snižuje aktivaci jaterní fosforylázy a glukoneogenezu na úrovni fruktóza-1,6-bisfosfátu. Literatura 1. Friedecký B. Diagnostika a sledování diabetes mellitus. Společné doporučení České diabetologické společnosti a České společnosti klinické biochemie, 2003 (akt. 2005) [cit ]. Dostupný z www: php?pg=doporuceni--diagnostika-a-sledovani-dm 2. Sacks, D. B.: The diagnosis of diabetes is changing: How implementation of hemoglobin A1c will impact clinical laboratories. Clin. Chem., 55, 2009, č. 9, s Změna kalibrace hemoglobinu A1c a referenčních mezí, 2003 [cit ]. Dostupný z www: cskb.php?pg=doporuceni--zmena-kalibrace-a-referencnich-mezi-hba1c 4. American Association of Clinical Endocrinologists/American College of Endocrinology statement on the use of hemoglobin A1c for the diagnosis of diabetes. Endocrine Practice, 16, 2010, č. 2, s Selvin, E., Zhu, H., Brancati, F. L.: Elevated A1C in adults without a history of diabetes in the U.S. Diabetes Care, 32, 2009, č. 343

344 Diabetes mellitus 5, s Cowie, C. C., Rust, K. F., Ford, E. S., Eberhardt, M. S., Byrd-Holt, D. D., Li, C., Williams, D. E., Gregg, E. W., Bainbridge, K. E., Sydah, S. H., Geiss, L. S.: Full accounting of diabetes and pre-diabetes in the U.S. population of and Diabetes Care, 32, 2009, č. 2, s Diagnosis and classification of diabetes mellitus (American Diabetes Association). Diabetes Care, 32, 2009, Suppl. 1, s. S62 S67 8. International expert committee report on the role of the A1C assay in the diagnosis of diabetes. Diabetes Care, 32, 2009, č. 7, s Freidecký, B., Vávrová, J., Kratochvíla, J.: Změny v laboratorní diagnostice a při sledování diabetu. Klin. Biochem. Metab., 39, 2010, č. 1, s Lorenzo, L., Wagenknecht, L. E., Hanley, A. J. G., Revers, M. J., Karter, A. J., Haffner, S. M.: A1C between 5.7 and 6.4% as a marker for identifying pre-diabetes, insulin sensitivity and secretion, and cardiovascular risk factors. The Insulin Resistance Atherosclerosis Study (IRAS). Diabetes Care, 33, 2010, č. 9, s Zhang, X., Gregg, E. W., Williamson, D. F., Barker, L. E., Thomas, W., McKeever Bullard. K., Imperatore, G., Williams, D. E., Albright, A. L.: A1C level and future risk of diabetes: A systematic review. Diabetes Care, 33, 2010, č. 7, s Selvin, E., Steffes, M. W., Zhu, H., Matsuhita, K:, Wagenknecht, L., Pankow, J., Coresh, J., Brancati, F. L.: Glycated hemoglobin, diabetes, and cardiovascular risk in nondiabetic adults. New Engl. J. Med., 362, 2010, č. 9, s Lu, Z. X., Walker, K. Z., O Dea, K., Sikaris, K. A., Shaw, J. E.: A1C for screening and diagnosis of type 2 diabetes in routine clinical practice. Diabetes Care, 33, 2010, č. 4, s Malone, M.: Identifying pre-diabetes with hemoglobin A1c. Clin. Lab. Strategies, 28, Škrha, J.: Aktuality v diagnostice diabetes mellitus. Postgrad. Med., 13, 2011, č. 4, s Rollins, G.: Diabetes direction. NACB Guideline update captures latest evidence. Clin. Lab. News, June 37, č. 6, Clin. Chem., 57, č. 2, 2011, většina čísla věnována aktuální problematice diabetes mellitus KAPITOLA

345 Ischemická choroba srdeční Ischemická choroba srdeční Ischemická choroba srdeční (ICHS) je akutní nebo chronické onemocnění srdečního svalu, které vzniká na základě nedostatečného krevního zásobení při onemocnění věnčitých tepen. Postižení věnčitých tepen může být organické (stenóza), funkční (spasmus) nebo trombotické (nástěnný nebo obturující trombus). V praxi se setkáváme s kombinací všech těchto složek. ICHS je nejčastější příčinou úmrtí obyvatel České republiky. KAPITOLA 29 Etiologie a patogeneze ICHS Nejčastější příčinou vzniku ICHS je ateroskleróza věnčitých tepen. Růst aterosklerotického plátu bývá zpočátku provázen zvětšením průměru tepny (remodelací tepny) a onemocnění tak může probíhat desetiletí bez klinických projevů. Teprve, když plát zúží lumen tepny na více než 70%, stává se tato stenóza překážkou pro zvýšení koronárního průtoku při tělesné zátěži. Tak vzniká v řečišti za překážkou ischémie a její klinické projevy ve formě námahové anginy pectoris (bolest na hrudi při zvýšené fyzické námaze). Jiným mechanismem vzniku ischémie je spasmus hladké svaloviny stěny tepny. Dochází k němu na základě endoteliální dysfunkce. Vyvolávajícími podněty mohou být například chlad, tabákový kouř, tělesná a duševní zátěž. Dojde-li k ruptuře plátu, obnaží se tzv. trombogenní (subendoteliální) struktury cévní stěny a tím dochází k aktivaci krevních destiček a tvorbě krevní sraženiny, která může vyvolat až náhlý uzávěr věnčité tepny. Také krvácení do plátu může vést k náhlému zúžení tepny a prudkému snížení průtoku krve. Tyto stavy jsou příčinou akutních koronárních syndromů (viz kapitola Akutní koronární syndromy). Aterosklerózou mohou být postiženy všechny tři hlavní tepny stejnoměrně, častěji však postižení jedné z nich převažuje. Srdeční tepny nejčastěji postižené aterosklerózou: RIA, ramus interventricularis anterior (ventralis) arteriae coronariae cordis sinistrae (ACS) RCx, ramus circumflexus arteriae coronariae cordis sinistrae; ACD, arteria coronaria cordis dextra. Koronární ateroskleróza může postihovat obvod tepny stejnoměrně (koncentricky) poté reziduální lumen je v centru tepny. Plát ale může i zužovat lumen asymetricky (excentricky) pak bývá mimo střed. Stupeň aterosklerózy se hodnotí podle procenta zúžení průsvitu tepny sklerotickými pláty, viz Tabulka 29p.1, a to na základě koronarografie, intravaskulární sonografie (IVUS) nebo pitevního nálezu. Zúžení průsvitu tepny Stupeň koronární aterosklerózy 25 % I. stupeň 50 % II. stupeň 75 % III. stupeň nad 75 % IV. stupeň Tabulka 29p.1 Hodnocení stupně aterosklerózy Postižení věnčitých tepen jiným onemocněním než aterosklerózou je vzácné (např. Wegenerova granulomatóza, lues). Rizikové faktory koronární aterosklerózy jsou stejné jako u aterosklerózy obecně. Nevysvětlují přesně příčinu aterosklerózy, ale pomáhají odhadovat riziko komplikací aterosklerózy (kardiovaskulární riziko). Léčebně se ovlivňují za účelem prevence. Nejčastější příčinou vzniku ICHS je ateroskleróza věnčitých tepen. 345

346 Ischemická choroba srdeční Ateroskleróza Ateroskleróza je degenerativní postižení stěny tepen, charakterizované nahromaděním lipidů, zánětlivou infiltrací stěny cévy a zmnožením fibrózní tkáně. Po narození má člověk tepny hladké, elastické, které krvi nekladou velký odpor. Etiologie a patogeneze aterosklerózy KAPITOLA 29 Po řadu let se ateroskleróza považovala za mechanický proces typický hromaděním tuků v cévní stěně a později inkrustací vápníkem. V současnosti se přijímá multifaktoriální etiologie aterosklerózy. Je prokázáno, že k jejímu vzniku přispívají rizikové faktory. V literatuře se jich uvádí několik set, prakticky významných je jich asi deset. Přehled nejčastěji udávaných rizikových faktorů je uveden v tabulce 29p.2. Je známo, že první stadia aterosklerózy jsou způsobena zvýšeným průnikem a infiltrací aterogenními lipoproteiny a zánětlivými buňkami z krve přes endotel, přičemž dochází k jejich akumulací v subendoteliálním prostoru. V pozdějších stadiích se k procesu aterogeneze přidružují fibroproduktivní procesy, které jsou reakcí na depozici lipidů a zánětlivou infiltraci cévní stěny. Na vývoji těchto lézí se různým poměrem podílí poškození endotelu, zánětlivé mechanismy a aterogenní lipoproteiny. Všechny tyto faktory jsou v komplikované interakci a vzájemně se potencují. Neovlivnitelné rizikové faktory věk (u mužů > 45 let, u žen postmenopauzální věk nebo > 55 let) mužské pohlaví rodinná anamnéza předčasné ICHS (manifestace u mužů ve věku < 55 let a u žen < 65 let nebo jiné klinické manifestace u příbuzných 1. stupně (tj. rodiče, sourozenci a děti) Ovlivnitelné rizikové faktory kouření dyslipidémie, zvýšený celkový cholesterol v plazmě (především LDL- cholesterol), zvýšené triacylglyceroly, snížený HDL- cholesterol) hypertenze poruchy metabolismu glukózy (diabetes mellitus, hraniční glykémie na lačno, porušená glukózová tolerance) obezita (především androidního typu) Tabulka 29p.2 Rizikové faktory aterosklerózy Klinický obraz ICHS Klinické formy ICHS jsou uvedeny v následující tabulce 29p.3. Akutní formy Chronické formy nestabilní angina pectoris asymptomatická ICHS infarkt myokardu angina pectoris (námahová, smíšená, variantní) náhlá srdeční smrt stav po infarktu myokardu dysrytmická forma ICHS chronické srdeční selhání Tabulka 29p.3 Klinické formy ischemické choroby srdeční 346

347 Ischemická choroba srdeční Akutní koronární syndromy Akutní koronární syndrom je klinická manifestace kritické fáze vývoje ICHS, kdy se projevuje nepoměr mezi dodávkou kyslíku a nároky myokardu na zásobení a odstranění metabolických zplodin. Nejčastějším patofyziologickým podkladem těchto stavů je ruptura aterosklerotického plátu a vznik krevní sraženiny ve věnčité tepně s možnou účastí koronárního spasmu. Krevní sraženina vede k různě závažnému zúžení nebo uzávěru věnčité tepny a embolizaci do jejich periferních větví. KAPITOLA 29 Akutní koronární syndromy: Infarkt myokardu s elevací úseku ST (STEMI) Infarkt myokardu bez elevace úseku ST (NSTEMI) Nestabilní angina pectoris Klinický obraz Náhlý uzávěr nebo kritické zúžení věnčité tepny vyvolá ischémii a projeví se ve většině případů klidovou bolestí na hrudníku. Ta je v typických případech svíravá nebo pálivá, plošná, může se šířit do krku, dolní čelisti, levé horní končetiny a trvá déle než 20 minut. V některých případech může být lokalizována v zádech nebo nadbřišku. Bývá provázená dušností, pocením, nauzeou a nemocný musí přerušit činnost a čeká na úlevu. U menší části pacientů (cca 20 %) se infarkt myokardu projeví jen dušností, nikoliv bolestí. Může dojít ke zvýšení krevního tlaku a rozvoji srdečního selhání. Nemocný s akutním koronárním syndromem bývá alterován bolestí, je neklidný, anxiózní, kůže bývá bledá, opocená, cyanotická, tepová frekvence může být zvýšená, normální nebo snížená. Infarkt myokardu Podle definice Evropské kardiologické společnosti z roku 2007 je termín infarkt myokardu vyhrazen pro stavy s prokázanou nekrózou myokardu při klinických známkách ischémie myokardu. Nekróza má koagulační charakter, což je způsobeno vysokým obsahem proteinů. Asi 20 hodin po začátku ischémie mění tkáň barvu do žlutavé, a ztráta vody působí zmenšení objemu nekrotické tkáně. Plně vyvinutá nekróza je patrná po 3 dnech. Diagnostická kritéria infarktu myokardu Průkaz vzestupu a/nebo poklesu laboratorních známek nekrózy (především troponinu) s alespoň jednou hodnotou nad 99.percentilem horní hranice normy spolu s průkazem ischémie myokardu při alespoň jednom z následujících příznaků ischémie. Laboratorní vyšetření pomáhají stanovit diagnózu akutního IM. Příznaky ischémie - EKG změny svědčí pro novou ischémii (změny úseku ST-T nebo nově vzniklá blokáda levého Tawarova raménka) - vznik patologických kmitů Q na EKG - nová ztráta viabilního myokardu nebo nové lokální poruchy kinetiky myokardu, prokázané některou zobrazovací metodou. Náhlá a neočekávaná srdeční smrt včetně srdeční zástavy, často se symptomy svědčícími pro ischémii myokardu, velmi často doprovázené novými elevacemi úseku ST. Někdy dojde k průkazu čerstvého trombu při koronarografii a/nebo sekci, když k úmrtí došlo dříve než byl proveden odběr krve, než mohlo dojít k vzestupu laboratorních známek nekrózy. U pacientů s perkutánní koronární intervencí a normálními výchozími hodnotami laboratorních známek nekrózy je jejich zvýšení nad 99.percentil horní hranice normy známkou periprocedurální nekrózy myokardu. Za periprocedurální infarkt myokardu je podle dohody považován vzestup laboratorních známek nekrózy nad trojnásobek horní hranice normy včetně výskytu jednoho z níže uvedených projevů: - nově vzniklých patologických kmitů Q - blokády levého Tawarova raménka - angiograficky prokázaného nově vzniklého uzávěru bypassu nebo věnčité tepny - zobrazovací metodou prokázané nové ztráty živého myokardu 347

348 Ischemická choroba srdeční Klinicky se nyní užívá klasifikace infarktu myokardu na infarkt s elevacemi úseku ST a infarkt bez elevací úseku ST. Elevace úseků ST (STEMI) svědčí pro nekrózu všech vrstev stěny myokardu, proto je tento typ infarktu označován za transmurální. Na EKG dochází k postupnému vývoji kmitu Q, užívá se též označení Q-infarkt. Infarkt bez elevací úseků ST má většinou menší rozsah, postihuje subendokardiální vrstvy myokardu a nedochází u něj k elevaci úseků ST ani vývoji patologického kmitu Q. Z těchto důvodů se označuje jako non-q-infarkt nebo NSTEMI. Toto dělení se používá zejména při přijetí pacienta do nemocnice a slouží k rychlé stratifikaci pacientů. Zatímco STEMI patří rovnou na intervenční sál (zde nečekáme na výsledky dalších vyšetření), NSTEMI vyšetřujeme podrobněji a rozhodujeme se (pomocí výsledků dalších vyšetření), zda jde o infarkt myokardu, či nikoliv. KAPITOLA 29 Nestabilní angina pectoris Nestabilní angina pectoris není homogenní klinická jednotka, ale spíše syndrom, jehož název vypovídá více o akutnosti stavu. Klinická definice nestabilní anginy pectoris - kritéria nově vzniklá angina pectoris nebo náhlé zhoršení již přítomné anginy pectoris nebo vznik stenokardií v subakutní fázi myokardu Zhoršením se rozumí zvýšení frekvence anginózních záchvatů, (nakupené stenokardie), větší intenzita bolesti nebo změna charakteru záchvatů, klidové stenokardie nebo prodloužení jejich trvání (protrahované stenokardie). Od infarktu myokardu bez elevace úseků ST se odlišuje nepřítomností laboratorních známek nekrózy myokardu. Na EKG jsou přítomny pouze známky svědčící pro subendokardiální ischémii. Chronické formy ischemické choroby srdeční Námahová - stabilní angina pectoris Typickým klinickým projevem je bolest za hrudní kostí v situacích spojených se zvýšenou spotřebou kyslíku v myokardu. Stenokardie trvá zpravidla méně než 20 minut, vyzařuje do levé paže a krku, zad, obvykle není provázena vegetativními příznaky U stabilní anginy pectoris existuje také bezbolestná forma, která se manifestuje nejčastěji dušností. Vyvolávajícími momenty bývají tělesná námaha, objemné jídlo, emoce. Obtíže jsou výraznější za chladného počasí, u některých 348

349 Srdeční selhání pacientů ráno (poměrně typicky při přechodu z tepla na mrazivý vzduch). Přerušení námahy nebo podání nitrátu vedou během několika minut k úlevě. Variantní angina pectoris (Prinzmetalova vazospastická angína) Variantní angina pectoris je klinická jednotka, jejímž patofyziologickým podkladem jsou spasmy epikardiálních věnčitých tepen, vzniklé při endoteliální dysfunkci. Typickým klinickým projevem jsou stenokardie vznikající v klidu a provázené přechodnými elevacemi úseku ST a poruchami srdečního rytmu. Spasmy lze vyvolat během koronarografického vyšetření provokačními testy. Není-li spasmus při tělesné zátěži přítomen, je pacient většinou asyptomatický. Variantní angína se objevuje především u žen ve věku mezi lety s několika rizikovými faktory ischemické choroby srdeční. KAPITOLA 29 Koronární syndrom X Označení zahrnuje heterogenní skupinu nemocných s typickými námahovými stenokardiemi a průkazem ischémie na zátěžovém EKG nebo při thaliové scintigrafii myokardu, ale bez přítomnosti stenotických změn nebo spasmu na koronárních tepnách. Jako jedná z příčin se zvažuje mikrovaskulární dysfunkce na úrovni prearteriol s nemožností zvýšit koronární perfúzi při zátěži. Srdeční selhání Akutní srdeční selhání Akutní srdeční selhání je náhle vzniklá těžká porucha srdeční funkce nebo její náhlé zhoršení, při kterém není srdce schopno přečerpat krev z žilního oběhu do plic nebo z plic do tepenného oběhu. Důsledkem je městnání krve v některých orgánech, nedostatečná oxygenace tkání. Etiologie a patogeneze Akutní srdeční selhání bývá projevem celé řady kardiovaskulárních onemocnění. Akutní srdeční selhání je syndromem a nikdy by nemělo být samostatnou diagnózou! Podle toho, které klinické příznaky dominují rozlišujeme selhání pravostranné a selhání levostranné. Akutní pravostranné srdeční selhání Objemové přetížení Tlakové přetížení Snížení kontraktility trikuspidální regurgitace plicní embolizace infarkt pravé komory plicnicová regurgitace levostranné srdeční selhání kardiomyopatie pravého srdce zkratové vady stenóza plicnice perioperační poškození pravého srdce akutní defekt septa komor UPV, plicní hypertenze, chronická obstrukční plicní nemoc, plicní embolizace Tabulka 29p.4 Nejčastější příčiny pravostranného srdečního selhání 349

350 Srdeční selhání Klinický obraz Nejčastějšími subjektivními příznaky akutního pravostranného srdečního selhání jsou dušnost, nevýkonnost, únavnost a bolesti na hrudi. Akutní levostranné srdeční selhání Etiologie a patogeneze Vzniká jako důsledek náhlého poškození levé srdeční komory mechanickými vlivy, přímým poškozením nebo poruchou diastolického plnění. Akutní levostranné srdeční selhání vede k náhlému zvýšení plicního tlaku levé srdeční komory, který je zpětně přenášen do levé síně a plicního oběhu. Vzniká tak akutní plicní hypertenze a množství krve v plicích stoupá. Převýší-li tlak v plicních kapilárách tlak koloidně-osmotický v plazmě, prostoupí tekutina do intersticia a později do alveolů. Rozeznáváme proto vznikající intersticiální a intraalveolární otok plic. KAPITOLA 29 Mechanické vlivy Přímé poškození Porucha diastolického plnění tlakové (hypertenze, aortální ischemická choroba srdeční tamponáda srdeční stenóza) objemové (chlopenní regurgitace) kardiomyopatie arytmie myokarditidy exsudativní perikarditida Tabulka 29p.5 Příčiny akutního selhání levé komory Klinický obraz Typickými projevy akutního selhání levé komory jsou dušnost a edém plic. Plicní edém je projevem akutního levostranného srdečního selhání. Nemocný je extrémně klidově dušný, tachypnoický, úzkostný, neklidný, bledý, opocený a vykašlává zpěněné sputum. Asthma cardiale je stav těžké dušnosti vznikající většinou v noci, který probudí nemocného ze spaní, donutí jej nejprve k posazení, později k postavení a k dýchání se zapojením auxiliárního svalstva. Chronické srdeční selhání Chronické srdeční selhání je porucha výkonnosti srdce, u které přes dostatečné plnění srdečních komor klesá minutový srdeční výdej a srdce není schopno krýt metabolické potřeby periferních tkání. Podle toho, zda převládá městnání v plicním, nebo systémovém řečišti, se někdy rozděluje srdeční selhání na pravostranné a levostranné. To ale neindikuje, která ze srdečních komor je postižena více. Etiologie a patogeneze Chronické srdeční selhání se rozvíjí jako důsledek systolické a/nebo diastolické dysfunkce myokardu. Nejčastější příčinou je ICHS, méně časté jsou kardiomyopatie, myokarditidy a toxická poškození myokardu. Zhoršujícími faktory jsou hypertenze, některé arytmie, anémie, hyperthyreóza, popř. iatrogenní vlivy některých léků (antidepresiva). Základní patofyziologickou příčinou rozvoje chronického srdečního selhání je porucha systolické nebo diastolické funkce srdečních komor s následným poklesem tkáňové perfúze vyvolávající aktivaci sympatiku, systému renin-angiotensin-aldosteron, sekreci endotelinu a vazopresinu. V myokardu dochází k remodelaci (na úrovni komor se projeví dilatací) zhoršující kontraktilitu a relaxaci kardiomyocytů, v intersticiu dochází k přestavbě vaziva a zmnožení kolagenu. V cévním řečišti pak k poruchám endoteliálních funkcí a k mikrovaskulární fibróze. Srdce již není schopno zvýšit výkon při zátěži, přestože dilatace komor dlouho umožňuje zachovat tepový objem i při snížené srdeční frakci (EF je menší než 45%). Klinický obraz 350

351 Srdeční selhání Dominující klinické příznaky a objektivní výrazné známky dovolují rozlišit pravostranné a levostranné srdeční selhání. Selhání levého srdce Většina příznaků i známek je důsledkem městnání krve v plicích, a to námahová dušnost, paroxysmální noční dušnost (asthma cardiale), plicní edém. Objektivními známkami jsou inspirační vlhké chrůpky, které nemění charakter po zakašlání, dále jednostranný nebo oboustranný výpotek. Selhání pravého srdce Většina příznaků je důsledkem městnání krve před pravou srdeční komorou, zvýšená náplň krčních žil, pozitivní hepatojugulární reflux, hepatomegalie a periferní otoky. Ty začínají kolem kotníků, vytvářejí se ve dne, v noci se vyplavují (nykturie). Signalizují zvětšení objemu extracelulární tekutiny o 3-5 litrů. Extrémní retence tekutin se projeví hydrothoraxem, ascitem, anasarkou, hydroperikardem. KAPITOLA

352 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů KAPITOLA 29 Autoři: MUDr. Věra Ploticová; RNDr. Zdeněk Švagera, Ph.D. Recenzent: MUDr. Roman Cibulka, Ph.D. Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů Laboratornívyšetřeníužívanávdiagnosticeischemickéchoroby srdeční V devatenáctém století byl infarkt myokardu velmi vzácnou záležitostí. Každý případ byl považován za raritu. Avšak s přibývajícími léty se situace značně měnila. V roce 1912 byla popsána studie o následcích uzávěru tepen vyživujících srdeční svalovinu doktorem Jamesem Harrickem. Kromě náhlé smrti a anginy pectoris byly tehdy poprvé zmíněny i příznaky srdečního infarktu. O několik let později byl poprvé popsán a charakterizován EKG záznam průběhu akutního infarktu myokardu doktorem Heroldem Pardeem. Po druhé světové válce se stal infarkt myokardu jedním z nejčastějších příčin úmrtí u dospělých pacientů. Tehdy začal vzrůstat zájem o informace o této chorobě i o příčinách, které ji způsobují. Proto byla v roce 1960 vydána tzv. Framinghamská studie, obsahující hlavní příčiny vzniku tohoto onemocnění. Ještě v 80. letech 20. století byla první ataka akutního infarktu myokardu (AIM) považována za čekání na druhou ataku AIM, druhá na třetí a třetí ataka AIM končila většinou smrtí. S rozvojem jak laboratorní diagnostiky, tak intenzívní terapie v kardiologii, došlo k výraznému poklesu mortality na AIM. Obecně je diagnostika akutního koronárního syndromu (AKS) založena na stanovení intracelulárních bílkovin, které jsou uvolňovány z ischemického ložiska v myokardu do krevního oběhu. Problémem bylo vždy nalezení dostatečně citlivého a zároveň specifického parametru pro myokard, který by rychle, specificky a citlivě ukázal na AKS. Historicky bylo využíváno stanovení různých parametrů, které ovšem nebyly dostatečně kardiospecifické. V padesátých létech minulého století byla popsána změna koncentrace aspartátaminotransferázy (AST) u akutního infarktu myokardu. Následně se začíná používat vyšetření laktát-dehydrogenázy (LD), kreatin-fosfát kinázy (CK), myoglobinu a izoenzymů LD a CK. V osmdesátých létech minulého století bylo zlatým standardem pro diagnostiku AIM stanovení aktivity srdečního izoenzymu kreatin- -fosfát kinázy (CK-MB), které mělo svá omezení (nedostatečná senzitivita, ztráta aktivity v cirkulaci) a v dnešní praxi již nestačí. Vzhledem k nedostatečné specifitě těchto stanovení pro diagnostiku poškození srdečního svalu byly hledány nové markery a v devadesátých letech se pozornost obrátila ke strukturním proteinům srdečního svalu, a to k srdečním troponinům, které se staly zlatým standardem dneška a jsou již pevně zakotveny ve všech doporučeních kardiologických společností týkající se diagnostiky akutního koronárního syndromu (AKS). Diagnostika akutního infarktu myokardu Dle definice akutního infarktu myokardu (rok 2009) je akutní (vyvíjející se, popř. recentní) infarkt myokardu definován jako typický vzestup a/nebo pokles biochemických markerů nekrózy myokardu (kardiální troponin T či I, alternativně CK-MB) při současné přítomnosti alespoň jednoho z následujících kritérií: a) klinické příznaky ischémie; b) vývoj patologických vln Q na EKG; c) EKG změny svědčící pro ischémii (elevace ST či deprese); 352

353 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů d) souvislost s koronární revaskularizací (PCI, bypass); e) průkaz nové regionální poruchy kinetiky (echokardiograficky) nebo nové ztráty viabilního myokardu zobrazovací metodou. Z tohoto doporučení jednoznačně vyplývá význam stanovení troponinů jako markerů nekrózy myokardu. Srdeční troponiny KAPITOLA 29 Troponiny jsou strukturální proteiny příčně pruhovaných svalů, tzn. nachází se jak v kosterním svalstvu, tak i myokardu. Troponin T (TnT) zajišťuje vazbu troponinu C a I na tropomyozin, troponin I (TnI) inhibuje aktinomyozin - ATPázu, závislou na množství kalcia, vázaného na troponin C. Troponiny s tropomyozinem vytvářejí troponin - tropomyozinový komplex, který je součástí regulační a strukturální páteře kontraktilního aparátu příčně pruhovaného svalstva (viz animace) Animace - kontrakce!!! cs&u= student_view0/chapter10/animation action_potentials_and_muscle_contraction.html Pomocí molekulárně-genetických metod bylo zjištěno, že se primární struktura troponinu T a I v kosterním svalu a myokardu liší a lze ji pomocí imunochemických metod rozlišit. Tím byl splněn požadavek na kardiospecifickou metodu, která by umožnila stanovit pouze kardiální troponin T (ctnt) a I (ctni), a tím odlišit postižení myokardu od poškození kosterního svalu. V tabulce 29.1 je souhrn některých vlastností kardiálních troponinů T a I. Troponin I (ctni) Troponin T (ctnt) Původ myokard Molekulová hmotnost (Da) Biologický poločas (min.) < Nárůst po proběhlém AIM (hodiny) Maximum koncentrace v krvi (hod.) Přetrvání v krvi (dny) Použitelnost v diagnostice AKS srovnatelné srovnatelné Účinnost při stratifikaci kardiovaskulárního srovnatelné srovnatelné rizika Bifázický průběh při úspěšné a časné méně zřetelný zřetelný reperfůzi Použitelnost pro hodnocení reperfůze Ano Ano Diagnostika reinfarktu omezeně použitelné vzhledem k dlouhému přetrvávání v krvi omezeně použitelné vzhledem k dlouhému přetrvávání v krvi Eliminace ledvinami ANO Vzestup u pacientů s chronickým onemocněním významný méně významný ledvin stupně 5 (dle National Kidney Foundation) Násobek horní ref. meze v době maxima 300x 300x Odhad velikosti ložiska AIM Ano Časování odběrů v diagnostice AIM (doporučení ČSKB rok 2008) při přijetí, 6-9 hodin, pokud negativní pak hodin Výhody stanovení srdečních troponinů (ctn) v diagnostice AKS (AIM) Velmi vysoká specifita pro myokard - vzestup koncentrací ctn vždy souvisí s poškozením myokardu. Vysoká diagnostická senzitivita (schopnost metody odhalit nemoc) Mnohonásobný nárůst koncentrací u akutního infarktu myokardu 353

354 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů Vysoká citlivost umožňuje odhalit i minimální poškození myokardu. Možnost odhadu velikosti ložiska na základě vzestupu koncentrace Pozdní diagnostika IM vlivem dlouhodobějšího přetrvávání zvýšených hodnot Nevýhody stanovení srdečních troponinů při diagnostice AKS (AIM) Relativně pomalý nárůst po proběhlém AIM - v průměru 3-4 hodiny ( Tato nevýhoda bude v blízké budoucnosti eliminována zavedením nové generace metod stanovení troponinů - ultrasenzitivních). Omezené využití při diagnostice reinfarktu vlivem dlouhého přetrvávání v krvi. (Tato nevýhoda by měla odeznít zavedením ultrasenzitivních metod.) Rozdílné cut off hodnoty TnI mezi laboratořemi - existuje více výrobců setů pro stanovení TnI, které používají různé protilátky a z toho plynoucí různé cut-off hodnoty. Sety pro stanovení TnT dodává pouze jedna firma a tím je zajištěna jednotná cut off hodnota a porovnatelnost mezi laboratořemi V literatuře popsaná existence onemocnění se zvýšenou hladinou troponinu v séru z nekardiálních příčin (selhání ledvin, sarkoidóza, amyloidóza, kriticky nemocní s respiračním selháním nebo diabetem, akutní neurologická onemocnění, popáleniny, toxíny, hypotyreózy..). Zvýšení troponinu u těchto onemocnění bude mít jinou dynamiku, než je typická pro AIM. Navíc klinický stav pacienta a další vyšetřovací metody nepotvrdí diagnózu AIM. KAPITOLA 29 Klinický význam stanovení srdečních troponinů Srdeční troponiny jsou využívány v klinické diagnostice jako orgánově specifické (kardiospecifické) markery ischemického poškození myokardu u akutních koronárních syndromů (AKS) a také při poškození myokardu jiné etiologie a patogeneze. Přehled příčin, které mohou vést ke zvýšení troponinu v séru: Nejčastější příčinou je ischemická nekróza při snížení nebo přerušení perfuze nástěnným nebo okludujícím trombem v některé koronární arterii. Zvýšení koncentrace ctn v krvi však může být i projevem ischemického a/nebo neischemického poškození myokardu, které nebylo vyvoláno aterotrombózou, např. mechanické dysrupce kardiomyocytů při poranění myokardu, kumulativní účinek potenciálně kardiotoxických léků, působení bakteriálních toxinů, nebo důsledkem neurohumorální reakce. Mezi další příčiny patří záněty srdečního svalu, oběhové selhání různé etiologie (např. po polytraumatech, v sepsi s multiorgánovým selháním, po těžkých popáleninách apod.), kdy vlivem systémové hypotenze může dojít k ischemii myokardu a vzestupu troponinu, dále selhání ledvin, kdy jsou hodnoty ctn (zejména ctnt) mírně zvýšené a nesvědčí to pro infarkt. Za zmínku by stály i otravy (poměrně častá je stále otrava oxidem uhelnatým, kdy vlivem snížené transportní kapacity hemoglobinu pro kyslík může dojít k hypoxii myokardu a zvýšení troponinu). K nepochybnému a někdy i prognosticky závažnému poškození myokardu se vzestupem koncentrace ctn v krvi dochází iatrogenně, při diagnostických a terapeutických postupech spojených s katetrizací koronárního řečiště a při všech kardiochirurgických operačních výkonech. Při odpovídající klinické syptomatologii je vzestup koncentrace ctn považován za důsledek ireversibilní (definitivní) nekrózy myokardu a má být vždy hodnocen ve vztahu ke stanovení diagnózy onemocnění a současně pro stratifikaci rizika dalšího vývoje kardiovaskulárních onemocnění. Dlouhodobě a trvale zvýšené hladiny koncentrace ctn, především ctnt, jsou časté - bez klinické symptomatologie AKS - u nemocných v konečné fázi renálního selhání a významně korelují s rizikem jejich celkové mortality, koncentrace ctn má být u nich průběžně sledována. Další testy v diagnostice AIM Pro diagnostiku AIM se užívají také další pomocné testy, které mohou doplnit informaci získanou stanovením srdečních troponinů. Mezi tyto testy patří stanovení myoglobinu a stanovení hmotnostní koncentrace srdečního izoenzymu kreatin-fosfát kinázy (CK-MB mass). 354

355 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů Parametr Myoglobin CK-MB mass Původ Příčně pruhovaný sval - kosterní sval i myokard Izoenzym specifický pro myokard, v kosterním svalu do 5% celkové CK Molekulová hmotnost (Da) Biologický poločas (min.) Nárůst po proběhlém AIM (hodiny) Maximum koncentrace v krvi (hod.) Přetrvání v krvi (hod.) Použitelnost v diagnostice AKS pro časnou fázi po AIM tam, kde není možné stanovit ctn Použitelnost při hodnocení reperfůze Ano Ano Diagnostika reinfarktu Ano Ano Eliminace ledvinami Ano Ne Vzestup u pacientů s chronickým onemocněním ledvin stupně 5 (dle National Kidney Foundation) Násobek horní ref. meze v době maxima významný 20x méně významný Odhad velikosti ložiska AIM Časování odběrů v diagnostice AIM (doporučení ČSKB, rok 2008) 2-6 hodin po začátku onemocnění, po 12 hodinách již nemá smysl při přijetí, 6-9 hodin, pokud negativní pak hodin KAPITOLA 29 Klinický význam stanovení myoglobinu a CK-MB mass Myoglobin je časný, ale orgánově nespecifický marker AIM. K jeho zvýšení dochází vlivem poškození svalu různé etiologie, při kterém se vyplavuje do krve. Tento parametr je možno využít ve velmi časné fázi po objevení příznaků AKS (3-6 hodin) a to pro vyloučení diagnózy AKS. Stanovení myoglobinu v séru má vysokou negativní prediktivní hodnotu (což je pravděpodobnost, že osoba s negativním testem je skutečně zdravá - nemá danou nemoc). V praxi to tedy znamená, že pokud bude tento parametr zvýšený, tak nelze vyloučit přítomnost AIM (hospitalizace pacienta). Naopak jeho zvýšení neznamená, že musí být přítomen AIM, ale jeho zvýšení může být způsobeno poškozením svalu jiné etiologie. Stanovení CK-MB mass v současnosti představuje náhradní alternativu pro diagnostiku AIM v případech, kdy není k dispozici stanovení ctn. Je stále doporučovaným kardiomarkerem využívaným k detekci extenze myokardu /reinfarktu/ v době, kdy v krvi přetrvává vysoká koncentrace ctn. Zvýšení CK a CK-MB se může ale vyskytnout u stavů, které nemají původ v srdci, a to bez přítomnosti AIM. Jsou to například svalové dystrofie, chirurgické zákroky, traumata, nitrosvalové injekce, kolagenózy, hypotyreóza, hypertermie, křeče, enormní tělesná zátěž apod. Méně obvyklé kardiální markery Pro diagnostiku kardiálního poškození jsou hledány další parametry, jejichž význam by měl být především v možnosti sledovat velmi časné poškození srdce. Identifikace nemocného s vulnerabilním plátem či pláty v koronárních tepnách před rupturou a časná identifikace remodelace a dysfunkce LK je velkým cílem současné kardiologie. Současné znalosti a základní charakteristiky některých nových biomarkerů v akutní kardiologii mají potenciál kandidátů klinického použití pro rizikovou stratifikaci nemocných s AKS, časnou detekci rozvoje dysfunkce levé komory srdeční (LK) a možný monitoring této léčby. Tyto parametry je tedy možné rozdělit s ohledem na příčinu jejich vzniku na: 1. Markery zánětlivé změny cévní stěny (interleukin 6, interleukin 10, vysoce senzitivní CRP, fosfolipáza A2 asociovaná s lipoproteiny...) 2. Markery destabilizace, případně ruptury ateromového plátu (Solubilní CD40 ligand, myeloperoxidázy...) 3. Markery ischémie myokardu (ischemií modifikovaný albumin, volné mastné kyseliny..) 355

356 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů 4. Markery nekrózy kardiomyocytů (Vazebný protein pro mastné kyseliny, glykogenfosforyláza) Laboratorní vyšetření užívaná při srdečním selhání Laboratorní vyšetření je využíváno také při diagnostice srdečního selhání. Tak jak nás troponiny informují o poškození kardiomyocytu (poruše struktury), tak nás natriuretické peptidy informují o přetížení svalových buněk myokardu (poruše funkce). Natriuretické peptidy se tedy staly, kromě standardních anamnestických údajů, fyzikálního vyšetření, rtg srdce a plic a především echokardiografického vyšetření, nedílnou součástí diagnostiky srdečního selhání. KAPITOLA 29 Natriuretické peptidy Natriuretické peptidy jsou hormony bílkovinné povahy vylučované převážně myokardem, dále také endotelem, či ledvinami. V organismu působí protektivně, podílí se na ochraně kardiovaskulárního systému před tlakovým a objemovým přetížením (jak tlakové, tak objemové přetížení myokardu vedou ke zvýšené hladině BNP). Hlavním cílovým orgánem natriuretických peptidů je distální tubulus ledvin, kde inhibují zpětný transport sodíku (vyvolávají natriurézu, zvýšenou diurézu a inhibici systému renin angiotenzin aldosteron). Historie natriuretických peptidů sahá do roku 1981, kdy bylo popsáno, že extrakt ze srdečních síní způsobuje natriurézu a vazodilataci. V roce 1984 byla popsána chemická struktura atriálního natriuretického peptidu (ANP), v roce 1988 byl z mozku prasete izolován brain natriuretic peptid (BNP) a v roce 1990 central nervous system natriuretic peptid (C-natriuretic peptid, CNP). ANP je skladován ve formě sekrečních granulí v cytosolu síňových kardiomyocytů a jeho uvolnění je okamžité, řádově v desítkách sekund až v minutách. BNP není skladován analogickým způsobem a vzestup jeho koncentrace v krvi je dán rychlou aktivací jeho syntézy v kardiomyocytech komor. Vzestup koncentrace BNP v krvi je však velmi rychlý - řádově v minutách až desítkách minut. V krvi se objevuje také N-terminální propeptid BNP (NT-proBNP), který je odštěpen při metabolické aktivaci preprohormonu probnp za současného uvolnění BNP. Rutinně se stanovuje jak aktivní hormon BNP, tak i NT-proBNP. Výhody stanovení BNP či NT-proBNP nejsou zatím jednoznačně uzavřeny. Podle dosud zveřejněných mezinárodních doporučení poskytuje stanovení BNP i NTproBNP rovnocenné klinické informace, a to jak u nemocných s dominující klinickou symptomatologií dušnosti při diferenciaci její kardiální nebo extrakardiální etiologie, tak i u nemocných s podezřením na AKS při stratifikaci rizika jejich dalších kardiovaskulárních komplikací. Výhodou NT-proBNP vůči BNP může být delší stabilita v krvi ve srovnání s BNP. Klinický význam stanovení natriuretických peptidů V klinické praxi se natriuretických peptidů, především stanovení BNP a NT-proBNP, využívá jako indikátorů selhávání srdce jako pumpy (bez ohledu na jeho etiologii) a jako projev aktivace jednoho ze základních neurohumorálních systémů regulace srdeční výkonnosti. Hlavními oblastmi využití natriuretických peptidů jsou: diferenciální diagnostika akutní dušnosti, u které není jasný podíl srdečního selhání stratifikace rizika kardiovaskulárních komplikací u nemocných s podezřením na AKS Diferenciální diagnostika akutní dušnosti, u které není jasný podíl srdečního selhání U nemocných s klinicky dominující dušností se provádí odběr ihned při přijetí. Výsledek vyšetření přispívá především k diferenciální diagnostice kardiální a extrakardiální etiologie dušnosti (viz. schéma níže). 356

357 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů KAPITOLA 29 Ze schématu je patrné, že při nízké koncentraci natriuretických peptidů je dušnost nekardiálního původu a je nutné vyloučit plicní či jiné onemocnění. Při středně zvýšených koncentracích je srdeční selhání pravděpodobné, ale je nutné vyloučit septický šok, plicní hypertenzi, ARDS, akutní embolizaci nebo renální selhání. Při vysokých koncentracích natriuretických peptidů je srdeční selhání velmi pravděpodobné, ale je nutné vyloučit např. septický šok, kdy jsou rovněž zaznamenány vysoké hladiny BNP. Stratifikace rizika dalších kardiovaskulárních komplikací u nemocných s podezřením na AKS U pacientů s klinickými známkami srdečního selhání (především u nemocných s podezřením nebo diagnózou AKS) je doporučena doba odběru 2. až 3. den po přijetí a kontrolní vyšetření s odstupem 1 až 2 týdnů; výsledky vyšetření přispívají k stratifikaci rizika vývoje srdeční dysfunkce a/nebo selhání. Literatura 1. Racek, J. (2006). ( 2nd. ed.): Praha.,Galén 2. Diagnostika a léčba akutního infarktu myokardu s elevacemi ST. Cor Vasa 2009;51(10) 3. Tichý, M., Friedecký., B., Palička, V.,Horáček, J., Jebavý, L., Pudil, R. Současné názory na stanovení a klinické využití kardiomarkerů. Klin. Biochem. Metab., 13(34), 2005, No.2,p Engliš M., Šochman J. Srdeční torponiny v klinické praxi, Praha, TAC-TAC agency s.r.o., Zima, T. (2002). Laboratorní diagnostika (První vydání): Praha., Galén 6. Kettner,J. Nové biomarkery v akutní kardiologii. Interv Akut. Kardiol , 7(5): Friedecký, B., Engliš, M., Franeková, J., Jabor, A., Kratochvíla, J., Schneiderka, P., Tichý, M., Zima, T. Doporučení České společnosti klinické biochemie ke stanovení biochemických markerů poškození myokardu schváleno Kelley WE, Januzzi JL, Christenson RH. Increases of cardiac troponin in conditions other than acute coronary syndrome and heart failure. Clin Chem Dec;55(12):

358 Laboratorní diagnostika akutního infarktu myokardu a srdečního selhání - využití kardiomarkerů 9. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical Characteristics and Utilization of Biochemical Markers in Acute Coronary Syndromes, Circulation, April 3, 2007 vol. 115 no. 13 e356-e Žák, A., Petrášek, J. et al. Základy vnitřního lékařství, první vydání (2011): Praha, Galén 11. Doporučení pro diagnostiku a léčbu akutního srdečního selhání. Jindřich Špinar, Petr Janský, Jiří Kettner, Ivan Málek. Cor Vasa 2006;48(1):Kardio. K Jabor A. Natriuretické peptidy. Roche s.r.o., Praha 2010, ISBN Focused Updates: ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction (Updating the 2004 Guideline and 2007 Focused Update) and ACC/AHA/SCAI Guidelines on Percutaneous Coronary Intervention (Updating the 2005 Guideline and 2007 Focused Update) J Am Coll Cardiol, 2009; 54: , doi: /j. jacc KAPITOLA

359 Laboratorní známky zhoubného novotvaru - příprava (připomenutí pojmů) Laboratorní známky zhoubného novotvaru - příprava (připomenutí pojmů) Autor: prof. MUDr. Marta Kalousová, Ph.D. Recenzent: KAPITOLA 30 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Maligní nádor je genetické onemocnění somatických buněk. Dochází k mutacím genů, jejichž produkty regulují buněčnou proliferaci, vývoj, diferenciaci a zánik buněk (onkogeny a antionkogeny). Onkogeny a jejich význam u nádorů - příklady abl tyrosin-proteinkinasa (leukémie) erb B1, B2 receptory epidermálního růstového faktoru c-myc transkripční faktor (lymfomy) neu(erbb-2) receptor epidermálního růstového faktoru (CA prsu) NF1 nukleární faktor ras GTP-asu aktivující protein Antionkogeny a jejich význam u nádorů - příklady BRCA 1 a BRCA 2 opravy defektů DNA (CA prsu a ovaria) p53 regulace buněčného cyklu RB1 a RB2 regulace buněčného cyklu (retinoblastom) Základní laboratorní vyšetření Krevní obraz Vyšetření moče kvalitativní chemické vyšetření moče a močového sedimentu Biochemické parametry Na, K, Ca, dusíkaté metabolity (urea, kreatinin, kyselina močová), jaterní testy (bilirubin, ALT, AST, ALP, GGT), bílkoviny (celková bílkovina, albumin, elektroforéza), glykémie, Fe, transferin, sedimentace erytrocytů Hodnocení markerů Specificita = SN / (SN + FP) pravděpodobnost, že negativní test znamená negativní dg správná negativita u zdravých jedinců Senzitivita = SP / (SP + FN) pravděpodobnost, že pozitivní test vyjadřuje pozitivní dg správná pozitivita u jedinců s chorobou Pozitivní prediktivní hodnota = SP / (SP + FP) Negativní prediktivní hodnota = SN / (SN + FN) SP počet správně pozitivních vyšetření SN počet správně negativních vyšetření FP počet falešně pozitivních vyšetření FN počet falešně negativních vyšetření Ideální marker Vysoká specificita nevyskytuje se u jiných nenádorových onemocnění a u zdravých osob 359

360 Laboratorní známky zhoubného novotvaru - příprava (připomenutí pojmů) Vysoká senzitivita měřitelný na začátku onemocnění Orgánově specifický Korelace s nádorovou masou a s prognózou Pro hodnocení používáme také ROC křivky (receiver operating characteristic) a velikost plochy pod křivkou. Ideální a reálná situace při určení nějaké hraniční hodnoty a hodnocení markerů pomocí ROC křivky je znázorněno na obrázek 30p.1 a 2. KAPITOLA 30 Obrázek 30p.1 Hodnocení nádorových markerů - ideální a reálná situace při určení nějaké hraniční hodnoty 360

361 Laboratorní známky zhoubného novotvaru - příprava (připomenutí pojmů) KAPITOLA 30 Obrázek 30p.2 Hodnocení markerů pomocí ROC křivky (receiver operating characteristic) 361

362 Laboratorní známky zhoubného novotvaru Laboratorní známky zhoubného novotvaru Autor: Prof. MUDr. Marta Kalousová, PhD. Recenzenti: Doc. RNDr. Kristian Šafarčík, Ing. Vladimír Bartoš, PhD. KAPITOLA 30 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Laboratorní vyšetření u pacientů s nádorovým onemocněním zahrnují rutinní vyšetření podobně jako u jiných skupin nemocných a speciální vyšetření s ohledem na nádor. Běžná laboratorní vyšetření poskytují základní informace o stavu pacienta, jeho nutrici, postižení orgánů při prorůstání nádoru či metastazování s následnou poruchou jejich funkce, probíhající zánětlivé reakci či odrážení změny po nasazení účinné terapie. Speciální laboratorní vyšetření nazýváme též nádorové markery (pozn. název není zcela specifický, protože zvýšení hodnoty nádorového markeru nemusí vždy znamenat přítomnost nádoru). Výsledky se mohou v průběhu času měnit, jak vlivem kurativní operace, tak vlivem progrese nádorového onemocnění či nežádoucích účinků léčby. Základní vyšetření by mělo vždy zahrnovat krevní obraz, základní vyšetření moči a běžnou biochemickou analýzu séra. V rámci screeningu nádorových onemocnění je u pacientů nad 50 let při preventivních prohlídkách vyšetřována přítomnost krve ve stolici (vyšetření stolice na okultní krvácení). Již ve výsledcích běžných laboratorních vyšetření může být patrná řada změn: V krevním obraze mohou být známky anémie - následek krvácení, chronického onemocnění, malnutrice a deficitu železa a dalších faktorů, či dřeňového útlumu po chemo a radioterapii. Leukocyty mohou být zvýšeny nejen u nádorů z krevních buněk (leukémií), ale též v rámci nasedající infekce či nespecificky jako reakce na nádor, nebo mohou být naopak sníženy u dřeňového útlumu. Také v základní biochemické analýze séra mohou být různé změny: elevace zánětlivých parametrů při infekci či nespecificky provázející nádorový proces známky malnutrice snížený albumin, prealbumin a cholinesteráza elevace jaterních enzymů (ALT, AST, ALP, GGT) a bilirubinu při poškození jater, metastázách do jater a obstrukci žlučových cest zvýšení urey, kreatininu a kalia při poškození ledvin nebo jako následek obstrukce močových cest při jejich útlaku nádorem elevace kalcia u mnohočetného myelomu nebo při metastázách do skeletu zvýšení kyseliny močové jako známka nádorového rozpadu poruchy acidobazické rovnováhy při poškození ledvin či plic následky hormonální aktivity u endokrinně aktivních nádorů a další Při vyšetření moče můžeme zjistit hematurii, která může provázet nádory ledvin a močového měchýře, ale též glomerulopatie a infekce močových cest či bílkovinu např. u myelomu (paraprotein). V močovém sedimentu mohou být zachyceny atypické nádorové buňky. Nádorové markery definice, rozdělení Nádorový marker je substance přítomná v nádoru nebo produkovaná nádorem nebo hostitelem jako odpověď na přítomnost nádoru, která poskytne informaci a biologických vlastnostech a chování nádoru. Stanovení je možné buď kvalitativní, tj. při histopatologickém vyšetření ve tkáni nádoru (celulární nádorové markery), nebo kvantitativní, tedy stanovení koncentrace nejčastěji v séru (humorální nádorové markery), které je vhodné pro dynamické sledování. Historie nádorových markerů sahá do 30.let 20.století, kdy byl objeven lidský choriový gonadotropin (hcg), který je fyziologicky produkován placentou, u mladých mužů s nádorem varlete (Zondek). V 70.letech 20.století byl nejprve u nádoru jater u 362

363 Laboratorní známky zhoubného novotvaru myší (Tatarinov) a krátce nato u lidských hematomů popsán α1-fetoprotein, který je rovněž fyziologicky produkován placentou. Následoval intenzivní výzkum v oblasti těchto markerů a jejich následné využití v onkologii a prenatální diagnostice. Na základě dosavadních znalostí existují doporučení odborných společností u nás i ve světě pro racionální využití nádorových markerů v klinické praxi. Mezi nádorové markery patří: Solubilní markery klasické nádorové markery vyšetřované v klinické biochemii. Jedná se o látky s různou chemickou povahou enzymy, imununoglobuliny, hormony, cytokeratiny, glykolipidy, glykoproteiny, sacharidy a molekuly receptorové povahy. Celulární markery - molekuly receptorové povahy prokazované většinou histochemicky přímo v nádorové tkáni. Jsou důležité pro volbu a kontrolu léčby a pro určení prognózy onemocnění. Cirkulující buněčné elementy cirkulující nádorové buňky, cirkulující endotelové buňky a jejich prekurzory. Genetické abnormality mutace v onkogenech a tumor supresorových genech, proteinové produkty onkogenů a další změny. KAPITOLA 30 Tzv. klasické nádorové markery můžeme rozdělit do tří skupin: Onkofetální antigeny jsou látky produkované fyziologicky prenatálně fetoplacentární jednotkou (fetem či placentou), postnatálně se tvoří jen v souvislosti s nějakým onemocněním, zpravidla nádorovým. Antigeny, které se objevují brzy v průběhu ontogenze, jsou postnatálně charakteristické pro méně diferencované (tj. malignější) nádory. Do této skupiny patří alfa-1-fetoprotein (AFP), lidský choriový gonadotropin (hcg), karcinoembryonální antigen (CEA), placentární alkalická fosfatáza (PLAP) a některé další, v onkologii zatím málo využívané látky. Tkáňově či orgánově specifické antigeny - jde o látky, které se fyziologicky nacházejí ve zdravé tkáni či orgánu a mimo něj pronikají jen v minimálním množství. Za patologických stavů (nejčastěji při nádorovém onemocnění, ale v menší míře i při zánětech či traumatizaci) dochází k jejich uvolnění. Je to např. prostatický specifický antigen (PSA), neuron specifická enoláza (NSE), protein S-100, rozpustné fragmenty cytokeratinů (TPA, TPS, CYFRA 21-1), většina CA antigenů, definovaných pomocí monoklonálních protilátek (MAb), antigen karcinomů ze skvamózních buněk (SCC), thyreoglobulin (TG) a hormony a jejich prekursory u nádorů žláz, které je fyziologicky produkují (např. C-peptid u inzulinomu, kyselina vanilmandlová v moči u feochromocytomu nádoru dřeně nadledvin). Nespecifické antigeny jsou enzymy a hormony produkované nádory (u nádorů z orgánů, které je fyziologicky neprodukují paraneoplastický projev) a nebo látky, které souvisejí s přítomností nádoru markery buněčné proliferace, metabolismu či nespecifická reakce organismu. Do této skupiny řadíme ferritin, laktátdehydrogenázu (LD), thymidinkinázu (TK), beta-2-mikroglobulin (ß-2M), některé reaktanty akutní fáze (RAF), s lipidy asociovanou kyselinu sialovou (LASA) a řadu dalších, méně často užívaných markerů. Paraneoplastická hormonální produkce je charakteristická především pro malobuněčné plicní nádory. Vznikají pak různé endokrinní a metabolické syndromy s odpovídající manifestací typickou pro daný hormon (ACTH, parathormon, antidiuretický hormon atd.). Základní charakteristika vybraných nádorových markerů, jejich využití podle lokalizace a typu nádoru AFP (α1- fetoprotein) je glykoprotein podobný albuminu. Fyziologicky je produkován nejdříve žloutkovým vakem, později fetálními játry. V těhotenství je stanovení AFP využíváno v prenatálním screeningu vrozených vývojových vad v 2.trimestru. Patologicky se vyskytuje u nádorů obsahujících struktury produkující AFP ve fetálním období - hepatocelulární karcinom (ale ne cholangiocelulární karcinom), hepatoblastomu u dětí a germinálních nádorů varlete (neseminomy) a vaječníků. Může být zvýšen také u pacientů s jaterní cirhózou (pozor na přechod cirhózy do hepatocelulárního karcinomu!), dále u akutních a chronických aktivních hepatitid, kdy maximální zvýšení bývá v regeneračním období, či u toxického postižení jater atd. CEA (karcinoembryonální antigen): Jedná se o glykoprotein (molekulová hmotnost ) s vysokým obsahem sacharidů. CEA se nachází jak v embryonální tkáni (fetální střevo), tak v dospělé epiteliální tkáni. Je používán pro monitorování kolorektálního karcinomu a též nádorů jiných lokalizací (gastrointestinálního traktu, prsu, plic). Hladiny CEA jsou vyšší u kuřáků a časté je zvýšení u nemaligních onemocnění (starší osoby, snížená funkce ledvin, zánětlivá onemocnění střeva a plic). hcg, β hcg (lidský choriový gonadotropin): hcg je glykoprotein skládající se ze dvou podjednotek alfa a beta, které jsou 363

364 Laboratorní známky zhoubného novotvaru nekovalentně vázané. α podjednotka je identická s a podjednotkou dalších hormonů (LH, FSH a TSH) a je tedy možná zkřížená reaktivita. Podle indikace je potom stanovována buď celá molekula či jen β podjednotka. Pro použití hcg jako tumor markeru je nutné, aby použitá protilátka nereagovala křížově s ostatními proteohormony s podobnou strukturou. Proto je stanovována β podjednotka (specifické hcg). hcg se využívá pro monitorování germinálních nádorů varlete, choriokarcinomů a mola hydatidosa Dále kromě průkazu gravidity slouží též pro screening vrozených vývojových vad v I. a II. trimestru těhotenství. CA 125: Jedná se o antigen charakterizovaný pomocí monoklonálních protilátek. CA 125 je vhodný pro monitorování ovariálních karcinomů. Může být zvýšen u ovariálních cyst, zánětu adnex, postižení serózních blan, ascitu a pleurálního výpotku. CA 15-3 je glykoprotein patřící do rodiny mucinů. Je využíván především pro monitorování pacientek s metastazujícím nádorem prsu. CA 72-4 je antigen charakterizovaný pomocí monoklonálních protilátek používaný pro monitorování karcinomu žaludku. CA 19-9 je glykolipid nesoucí determinant krevní skupiny Lewis-a (cca 5% populace ho neprodukuje). CA19-9 má hlavní místo při sledování pacientů s gastrointestinálními nádory, především u karcinomu pankreatu a žlučových cest. CYFRA 21-1 je rozpustný fragment cytokeratinu 19. Není tkáňově specifický. Je vhodný pro monitorování pacientů s plicními nádory nemalobuněčného typu a pacientů s nádory močového měchýře. NSE (neuron specifická enoláza) je enzym charakteristický pro nervové a neuroendokrinní buňky (APUD buňky). Indikace pro stanovení NSE jsou neuroendokrinní tumory, malobuněčný plicní nádor a neuroblastom. Vyšší hodnoty se nacházejí také u metastazujícího karcinomu ledviny. NSE je zvýšena také u pacientů s postižením CNS a její zvyšování znamená špatnou prognózu těchto nemocných. NSE je přítomna i v erytrocytech a krevních destičkách a může se z nich uvolňovat, proto je nutné krev po odběru co nejrychleji zpracovat a separovat z ní sérum nebo plasmu, aby nedošlo k hemolýze a rozpadu krevních destiček, a tím k arteficiálnímu zvýšení NSE. PSA a fpsa (prostatický specifický antigen celkový a volný - free): PSA je glykoprotein s enzymatickou aktivitou (serinová proteáza), který je fyziologickou součástí seminální plasmy. Při uvolnění do krve se rychle navazuje na antiproteázy (hlavně antichymotrypsin). Je možné stanovit celkové PSA (tj. volné a vázané na antichymotrypsin) a volné PSA. Indikací k vyšetření PSA je karcinom prostaty. PSA může být ovšem zvýšen i u benigní hyperplazie prostaty či zánětu prostaty. Kromě celkového PSA se hodnotí také poměr fpsa/psa vyjádřený v procentech. U zdravých jedinců přestavuje fpsa více než 25% celkového detekovatelného PSA, u karcinomu prostaty klesá, často pod 10%. Je možné hodnotit také PSA velocitu (přírůstek PSA v čase) a PSA denzitu (vztažení koncentrace PSA k objemu žlázy). Vyšetření per rektum, sexuální aktivita, zhmoždění prostaty jízdou na kole či na koni může způsobit uvolnění PSA z prostaty a zvýšení jeho sérové koncentrace. Pro stanovení diagnózy je směrodatné histopatologické vyšetření vzorků získaných biopsií prostaty. SCC (antigen skvamózních buněk) je antigen karcinomu skvamózních buněk. Je velmi málo specifický, ale dobře se hodí pro monitorování různých typů karcinomů z dlaždicových buněk, zejména hlavy a krku, zevního genitálu a jícnu. TPA (tkáňový polypeptidový antigen) a TPS (tkáňový polypeptidový specifický antigen) patří mezi cytokeratiny, jsou blízce příbuzné s CYFRA TPA je směs rozpustných cytokeratinů 8, 18 a 19, TPS je rozpustný fragment cytokeratinu 18. Řadíme je spíše mezi nespecifické markery, zvýšené hodnoty jsou nalézány u pacientů s pokročilým karcinomem prsu, plic, kolorekta, hrdla děložního, ovaria a močového měchýře. TPS se jeví více specifický pro monitorování metastazujícího karcinomu prsu. Thymidinkináza (TK) je enzym syntézy DNA, tedy ukazatel buněčné proliferace. Extrémní zvýšení je typické pro leukémie, kde koreluje se závažností onemocnění. Určité zvýšení je možno pozorovat i u solidních nádorů. β 2 -mikroglobulin jeví významnou sekvenční homologii s imunoglobuliny a je identický s lehkým řetězcem HLA antigenů. Je vhodný pro monitorování pacientů s mnohočetným myelomem, nehodgkinskými lymfomy a chronickou lymfocytární leukemií z B buněk. Zvýšení β 2 -mikroglobulinu je možno pozorovat i u pacientů s chronickými zánětlivými a autoimunními onemocněními, u syndromu získaného selhání imunity (AIDS) a po transplantacích orgánů. Při interpretaci je nutno brát v úvahu funkci ledvin, protože β 2 -mikroglobulin je vylučován převážně ledvinami (zvýšení v séru při snížení glomerulární filtrace, zvýšení v moči při tubulární poruše, kdy vázne reabsorpce). Ferritin je vysokomolekulární protein sloužící k uskladnění železa, které je ve volné formě toxické. Indikací pro vyšetření ferritinu jsou hematologické malignity, zejména myeloblastická leukemie a M.Hodgkin. Ferritin je zvýšen také při poruchách metabolismu železa a nespecificky u řady nádorů hepatomy, karcinom pankreatu, germinální nádory, karcinomy mammy a plic. Kalcitonin (CT) je peptid skládající se z 32 aminokyselin secernovaný parafolikulárními C buňkami štítné žlázy. Je vhodný k monitorování medulárních karcinomů štítné žlázy a též pro screening v rodinách s výskytem medulárního karcinomu štítné žlázy (MEN syndrom). KAPITOLA

365 Laboratorní známky zhoubného novotvaru Thyreoglobulin (TG) je produktem štítné žlázy, slouží k syntéze a skladování hormonů. Využívá se k monitoraci pacientů s dobře diferencovaným karcinomem štítné žlázy. V diagnostice se neuplatňuje, protože TG může být zvýšený i u strumy. Chromogranin A (CgA) je kyselý glykoprotein vyskytující se v sekrečních granulích normálních i neoplastických neuroendokrinních tkání. Je využíván u nemocných s neuroendokrinními nádory. Paraproteiny: Jde o imunoglobuliny a jejich části produkované jedním proliferujícím klonem plazmatických buněk. Volné lehké řetězce jsou filtrovány ledvinami a procházejí do moči (Bence-Jonesova bílkovina). Testační proužky založené na proteinové chybě acidobazického indikátoru tyto globuliny bohužel nezachytí, tzn. nález bílkoviny v moči je negativní. Paraprotein se vyskytuje u mnohočetného myelomu, Waldenströmovy makroglobulinémie, amyloidózy, monoklonální gamapatie nejasného významu a různých lymfoproliferací. KAPITOLA 30 S-100B (protein S-100B) se fyziologicky vyskytuje v nervové tkáni. Slouží k monitorování pacientů s maligním melanomem. Estrogenní a progesteronové receptory jsou tkáňové nádorové markery. Stanovují se ve tkáni u karcinomu prsu většinou imunohistochemicky a pomáhají určit reakci nádoru na hormonální terapii a při odhadu prognózy onemocnění. HER2/neu: Produkt genu HER2/neu je transmembránový receptor s tyrosinkinázovou aktivitou. Je možné ho určit ve vzorku tkáně imunohistochemicky či molekulárně genetickou metodou FISH (fluorescence in situ hybridization) jako počet kopií genu pro HER2/neu. Je důležitým markerem u invazivního karcinomu mléčné žlázy, kde je asociován s horší prognózou. V případě prokázané amplifikace genu HER2/neu lze využít léčbu pomocí monoklonální protilátky proti extracelulární doméně tohoto receptoru (trastuzumab - HERCEPTIN). Kromě výše uvedených nejběžnějších nádorových markerů existuje celá řada dalších. Z méně častých nádorových markerů je možno uvést například kyselinu vanilmandlovou, která je postupně nahrazována katecholaminy a metanefriny (markery u feochromocytomu), či stanovení hladiny kyseliny 5-hydroxyindoloctové u karcinoidu. Mezi novější solubilní markery patří progrp (progastrin releasing peptide) pro malobuněčné plicní nádory a HE4 (human epididymis protein) pro monitorování karcinomu ovaria. Potenciální nové nádorové markery jsou proteiny a onkoproteiny produkty mutovaných genů, které mají význam pro přežití buněk, jejich dělení, diferenciaci a metastazování. Konkrétně zasahují do regulace buněčného cyklu (cykliny), apoptózy (např. produkt mutovaného genu p53), signální transdukce (HER2/neu, epidermální růstový faktor), adheze (adhezní molekuly ICAM- 1 a VCAM-1), angiogeneze (inhibitory angiogeneze angiostatin, angiogenin a trombospondin) či jsou spojeny se specifickými vlastnostmi nádorových buněk (matrix metalloproteinázy, aktivátor plazminové urokinázy upa a její inhibitor PAI-1). Přehled vhodných nádorových markerů u jednotlivých typů nádorů je uveden v Tabulce Tabulka 1. Přehled nádorových markerů u jednotlivých typů nádorů Gastrointestinální trakt Jícen - horní třetina SCCA, CYFRA 21-1; dolní třetina - CA 72-4, CEA, CA 19-9 Žaludek - CA 72-4, CEA Kolon CEA, CA 19-9 Játra - hepatocelulární - AFP, CEA; cholangiocelulární - CA 19-9 Pankreas - CA 19-9, CEA Plíce - malobuněčný nádor - NSE; nemalobuněčný nádor - CYFRA 21-1, CEA, SCC Gynekologická oblast Mléčná žláza - CA 15-3, CEA, TPA/S, steroidní receptory Ovarium - nemucinózní - CA 125; mucinózní - CA 19-9, CA 72-4; germinativní - AFP, hcg Cervix uteri - epidermoidní - SCCA, CYFRA 21-1; adenokarcinomy - CEA Corpus uteri - CA 125, CEA Vulva SCCA Chorion (choriokarcinom, mola hydatidosa) hcg Urogenitální oblast Ledviny - TPA/S, CEA, NSE Močový měchýř - TPA/S, CYFRA

366 Laboratorní známky zhoubného novotvaru Prostata - PSA, fpsa, chromogranin Testes - seminomy - hcg, AFP, NSE; neseminomy - hcg, AFP Hematologické malignity Leukemie - thymidinkináza, ferritin, laktátdehydrogenáza Lymfom - hodgkinský - b2-mikroglobulin, ferritin, laktátdehydrogenáza; non-hodgkinský - thymidinkináza, b2-mikroglobulin, laktátdehydrogenáza Mnohočetný myelom - b2-mikroglobulin, paraproteiny KAPITOLA 30 Další Hlava, krk - SCCA, CYFRA 21-1 Karcinoid - 5-hydroxy, 3-indoloctová kys., NSE Štítná žláza diferencovaný karcinom thyreoglobulin, CEA; medulární - CT, CEA (NSE); anaplastické TPA/S Melanom S-100B, NSE, thymidinkináza CNS - neuroblastomy NSE; gliomy CEA; astrocytomy - thymidinkináza Stanovenínádorovýchmarkerů,jejichindikaceainterpretace Proces stanovení nádorových markerů zahrnuje indikaci vyšetření, preanalytickou fázi, vlastní stanovení a náležitou interpretaci výsledků. Z hlediska preanalytiky kromě obecně platných zásad je třeba brát v úvahu specifika některých nádorových markerů (viz výše), především vliv manipulace s prostatou na PSA, ovlivnění NSE hemolýzou a vliv sekretů (slin) na hladinu SCC. Nádorové markery je převážně proteinové povahy a jsou stanovovány imunoanalytickými metodami s různým značením (radioimunoanalýza, enzymoimunoanalýza, fluorescenční analýza, chemiluminiscence). Je třeba používat stále stejnou metodu a diagnostickou soupravu od jedné firmy, protože výsledky získané různými technikami se mohou lišit, event. je třeba provést rebaselining (určení nové hladiny). Z hlediska analytiky může být problémem zkřížená reaktivita strukturálně podobných molekul, hook efekt způsobený vysokou koncentrací markeru či interference heterofilních protilátek a lidských anti-myších protilátek (HAMA human anti-mouse antibodies), které mohou vznikat např. při biologické léčbě. Z hlediska indikace a interpretace nádorových markerů je potřeba vědět, že jsou určeny primárně pro monitorování nemocných s nádorových onemocněním, tzn. vyšetření je indikováno převážně onkologem. Důležitá je dynamika změn nejdříve určení tzn. individuální hladiny, tj. koncentrace ve stabilizovaném stavu po operaci po odstranění nádorové masy, a následné opakované sledování, zpočátku častěji, následně v intervalu cca 3-6 měsíců. Jako významný je brán vzestup ve 3 po sobě následujících odběrech a nárůst markeru o více než 25%, Zvýšení markeru, i když v referenčních mezích tak může upozornit na recidivu dříve než zobrazovací metody a je podnětem k indikaci dalších diagnostických i léčebných postupů. Vhodné je sledování více markerů najednou, protože je vyšší pravděpodobnost záchytu recidivy (většinou 2 markery nejvhodnější pro danou oblast). Nádorové markery nejsou přímo vhodné pro diagnostické účely, ale mohou v diagnostickém procesu pomoci. Diagnostickou cenu má pozitivní nález tumor markerů, negativní nález nemusí znamenat nepřítomnost nádoru. Pro diagnózu je vždy rozhodující histopatologické vyšetření doplněné o průkaz tumor markerů. Zvýšení nádorového markerů ale nemusí znamenat vždy nádor, může být způsobeno zánětem, benigní lézí, traumatem, nasazením účinné terapie či postižením jater nebo ledvin u markerů, které jsou takto eliminovány. Pro screening je využíváno pouze vyšetření krve ve stolici (okultní krvácení), další markery pouze u specifických skupin (kalcitonin v rodinách s medulárním karcinomem štítné žlázy, CA 15-3 u mutací BRCA). Využití dalších markerů pro screening t.č. není doporučováno (ani PSA). Hodnocení nádorových markerů U nádorových markerů hodnotíme jejich specificitu (správnou negativitu u zdravých jedinců) a senzitivitu (správnou pozitivitu u jedinců s chorobou), případně pozitivní a negativní prediktivní hodnotu (správnou pozitivitu u všech pozitivních a správnou negativitu u všech negativních). Pro hodnocení markerů používáme ROC křivky (receiver operating characteristic) a velikost 366

367 Laboratorní známky zhoubného novotvaru plochy pod křivkou. Laboratorní diagnostika v onkologii neustále nabývá na významu. Stanovování nádorových markerů hraje významnou roli především v monitorování pacientů s nádorovým onemocněním a může odhalit recidivu onemocnění dříve než zobrazovací metody nebo než se nemoc klinicky projeví. Laboratorní vyšetření poskytuje informace také o stavu nutrice, přítomnosti zánětu či o selhávání funkce orgánů postižených nádorovým procesem. Vybraná vyšetření mohou pomoci také v diferenciálně diagnostickém procesu u pacientů s podezřením na nádorové onemocnění. V budoucnu je možné počítat s využitím dalších parametrů, jejichž stanovení by mohlo umožnit efektivní cílenou terapii nádorových onemocnění. KAPITOLA 30 Literatura 1. Zima T. Laboratorní diagnostika. 2.doplněné a přepracované vydání. Galén Karolinum Praha 2007, 906 s. 2. Kalousová M. a kol. Patobiochemie ve schématech. Praha Grada Publishing 2005, 264 s. 3. Doporučení České společnosti klinické biochemie 4. Doporučení European Group on Tumour Markers 5. Doporučení National Academy of Clinical Biochemistry 6. Doporučení American Society of Clinical Oncology M.Kalousová je členkou Evropské pracovní skupiny pro nádorové markery (European Group on Tumour Markers). 367

368 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Autor: doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. Recenzent: MUDr. Ing. David Zeman, Ph.D. KAPITOLA 31 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Vyšetření mozkomíšního moku Vyšetření mozkomíšního moku patří v neurologii k základním vyšetřovacím metodám. Význam likvorologického vyšetření neustupuje ani před moderními zobrazovacími technikami a v řadě indikací představuje nepostradatelnou diagnostickou metodu. Za objevitele a průkopníka lumbální punkce je považován německý profesor vnitřního lékařství Heinrich Quincke. Quincke provedl lumbální punkci u nemocného hydrocephalem s cílem dosáhnout snížení nitrolebečního tlaku. Jeho odborné sdělení o tomto výkonu je z roku Provedení lumbální punkce nevzbudilo dlouho žádnou pozornost. Sám Quincke potřeboval několik let času k tomu, aby si uvědomil přínos analýzy takto získaného moku a zavedl postupně do praxe vyšetřování i dnes hodnocených parametrů, jako je koncentrace celkové bílkoviny, počtu buněk, koncentrace glukózy a mikrobiologické vyšetření. Provádění lumbální punkce se však ještě dlouhou dobu nestalo rutinním vyšetřením a řada lékařů před ním varovala.teprve po několika desetiletích se objevují v literatuře pochvalná sdělení, která Quinckeho objev docenila. Anatomie a fysiologie Mozkomíšní mok je čirá bezbarvá tekutina, která vyplňuje mozkové komory a subarachnoideální prostor mozku a míchy.tvoří se v krevních cévách chorioideálního plexu mozkových komor (50-70%), dále ultrafiltrací krevní plazmy cév pia mater a přestupem z mozkových buněk. Mok za normálních podmínek odtéká z postranních komor mozkových přes foramen Monroi do třetí komory mozkové a poté přes aqueductus Sylvii do čtvrté komory mozkové. Ze čtvrté komory vytéká Magendieovým otvorem a dvěma Luschkeho otvory do subarachnoideálního prostoru. Část likvoru obtéká mozkový kmen a míchu. Celkové množství likvoru je u dospělého člověka ml. Je produkován rychlostí ml za 24 hod. Vstřebává se převážně do velkých nitrolebečních venózních sinusů přes arachnoideální klky a Pacchionské granulace. Durální vény a sinusy umožňují přechod mozkomíšního moku přímo do venózní krve. Funkce Mozkomíšní mok obklopuje mozek a míchu ze všech stran a tím jej chrání před otřesy, změnami teploty a tlaku. Podílí se na udržování homeostázy, zajišťuje optimální prostředí pro buňky CNS (stálé složení iontů, ph, osmolality). Zajišťuje odsun produktů katabolismu, např. laktátu a CO 2 a dodává mozkovým buňkám různé bioaktivní látky. Podílí se na ochraně CNS před patogenními mikroorganismy. Bariéry Stálý transport látek mezi krví, mozkomíšním mokem a mozkovými buňkami je závislý na funkci hematoencefalické bariéry. Hematoencefalická bariéra zahrnuje rozhraní mezi krví, mozkem a likvorem. Bariéra umožňuje selektivní průnik látek oběma nebo jen jedním směrem. Hematoencefalická bariéra zabezpečuje optimální prostředí pro funkci mozku, chrání mozek před škodlivými látkami a umožňuje zásobování mozku látkami potřebnými pro jeho metabolismus. Rozlišujeme hematoencefalickou, encefalolikvorovou a hematolikvorovou bariéru. Hematoencefalická bariéra vytváří přechod mezi mozkovými kapilárami a mozkovou tkání. Je tvořena z krevní strany vrstvou endotelu mozkových kapilár, bazální membránou a z mozkové strany vrstvou astrocytů. Endotelové buňky mozkových kapilár jsou spojeny těsnými kontakty. Přestup látek z krve do mozku se uskutečňuje na podkladě jejich rozpustnosti v tucích nebo po- 368

369 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku mocí přenašečových systémů. Snadno prostupuje voda a látky dobře rozpustné v lipidech (např etanol, nikotin, plyny - O 2, CO 2, N 2 O). Hydrofilní látky jsou přenášeny pomocí specifických transportních systémů ( např. glukóza). Hematolikvorová bariéra odděluje krev a mozkomíšní mok. Je tvořena epitelem chorioideálních plexů, ve kterých se tvoří likvor. Epitelové buňky jsou propojeny pevnými spoji, které jsou ale prostupnější než těsné spoje v mozkových kapilárách. V chorioideálním plexu přechází látky do likvoru difuzí a aktivním transportem. Hematolikvorová bariéra je permeabilnější a umožňuje přestup proteinů z plazmy do likvoru pinocytózou nebo specifickými přenašeči. Porucha hematolikvorové bariéry se projeví zvýšenými koncentracemi proteinů v likvoru. KAPITOLA 31 Encefalolikvorová bariéra je tvořena vrstvou gliových vláken na povrchu mozku a ependymem komor. Tato bariéra je propustnější než hematolikvorová bariéra. Průnik látek se děje mezibuněčnými štěrbinami. Indikace k odběru likvoru Vyšetření mozkomíšního moku je důležitou součástí diagnostiky onemocnění centrálního nervového systému. Onemocnění můžeme rozdělit do čtyř hlavních kategorií. 1. Infekční onemocnění, jako je zánět mozkových blan (meningitis) a zánět mozku (encephalitis) vyšetření pomáhá určit původ onemocnění bakteriální,virový, tuberkulózní nebo způsobený kvasinkami. 2. Onemocnění, která způsobují zánět neinfekční, tzv. autoimunitní onemocnění, např. sclerosis multiplex, při kterém dochází k poškození myelinových obalů. Dále je to např. Guillain-Barrého syndrom, sarkoidóza. 3. Subarachoideální krvácení, které není prokazatelné zobrazovacími metodami. 4. Onkologická onemocnění centrálního nervového systému nebo průkaz metastáz. Lumbální punkce může být indikována u akutních i chronických onemocnění. Lumbální punkce Likvor se nejčastěji k vyšetření získává lumbální punkcí v místě bederní páteře mezi obratli L4 a L5. Mícha u dospělých většinou nepřesahuje úroveň třetího bederního obratle, nejčastěji končí ve výšce prvního bederního obratle. Nemocný je při lumbální punkci buď v poloze vsedě s flektovanou páteří nebo v poloze vleže na boku s maximální flexí páteře. Pacient musí být o výkonu náležitě poučen. Místo odběru se znecitliví a desinfikuje. K odběru se používají speciální jehly u dospělých v délce asi 9 cm. Výhody vykazují tzv.jehly atraumatické, jejichž použití snižuje komplikace po odběru likvoru. Nedochází k velkému poranění okolních struktur a zpětné prosakování likvoru po odběru je minimální. Při lumbální punkci jehla postupně proniká těmito anatomickými vrstvami: kůží, podkožní tkání, ligamentum supraspinale, ligamentum interspinale, ligamentum flavum, epidurálním prostorem obsahujícím žilní pleteň, tvrdou plenou mozkovou a arachnoideou. Vstup do páteřního kanálu je umožněn přes interlaminární okénko, jehož rozměr se zvětšuje při flexi páteře. Po zavedení jehly do subarachoideálního prostoru se vytáhne mandrén z jehly a nechá se odkapávat likvor. Komplikací odběru likvoru je poranění epidurálního žilního plexu a arteficiální příměsi krve. V těchto případech se odebírá mok do několika zkumavek a k vyšetření likvoru se použije porce s nejnižší příměsí krve. Množství odebíraného likvoru by mělo být co nejmenší, maximálně 3-4ml. Po provedení lumbální punkce je doporučován klid na lůžku, u nekomplikovaných odběrů je doporučován klid 4-8 hodin po punkci. Komplikace lumbální punkce Suchá punkce může být způsobena nesprávnou polohou jehly např. u obézních pacientů nebo v důsledku anatomických odchylek spondylartrózy, kyfoskoliózy, stenózy páteřního kanálu. Jako traumatická lumbální punkce se značí stav, kdy jehla poraní epidurální žilní pleteň a v následně získaném likvoru je příměs krve. Krví kontaminovaný mozkomíšní mok přináší řadu těžkostí při dalším zpracování. Je obtížné stanovit stupneň pleocytózy při předpokládané meningitidě. K alespoň přibližnému odhadu množství buněk pocházejích z krve slouží různé metody. Vycházejí z předpokladu, že poměr leukocytů a erytrocytů u zdravého člověka je v periferní krvi 1: Traumatická lumbální punkce může komplikovat stanovení diagnózy subarachnoideálního krvácení. Kontraindikace lumbální punkce Provedení lumbální punkce je kontraindikováno u nemocných s hemokoagulačními poruchami, dále u nemocných se zánětlivými afekcemi kůže nebo dekubity v oblasti bederní páteře. Významnou kontraindikací lumbální punkce je přítomnost většího nitro- 369

370 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku lebního expanzivního procesu (po odběru likvoru může dojít k tlakovým změnám v nitrolebním prostoru a uskřinutí mozkové tkáně - konusu). Proto musí být před lumbální punkcí provedeno vyšetření očního pozadí (vyloučení městnání) a u pacientů s ložiskovým neurologickým nálezem nebo poruchou vědomí zobrazovací vyšetření CNS (CT nebo MR). KAPITOLA

371 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Autor: doc. MUDr. Milan Dastych, CSc. Recenzent: MUDr. Ing. David Zeman, Ph.D. KAPITOLA 31 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Vyšetření mozkomíšního moku Cytologie mozkomíšního moku Kvantitativní stanovení počtu elementů v mozkomíšním moku se provádí ve Fuchs-Rosenthalově komůrce. V nativním preparátu se stanoví počet erytrocytů, po obarvení kyselým fuchsinem se znázorní jádra leukocytů, které se rovněž spočítají. Za normální nález se považuje 0-3 elementy/μl. Objem komůrky je 3,2 μl, proto se zjištěný celkový počet buněk dělí třemi. Obrázek 31.1 Fuchs-Rosenthalova komůrka 371

372 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku KAPITOLA 31 Obrázek 31.2 Nebarvený (nativní vlevo) a barvený (vpravo) likvor ve Fuchs-Rosenthalově komůrce Morfologická diferenciace leukocytů na mononukleáry a polynukleáry je ve Fuchs-Rosenthalově komůrce málo spolehlivá. K přesnější diferenciaci elementů je potřeba zhotovit trvalý cytologický preparát. Základní barvicí metodou je barvení podle Pappenheima. Trvalý cytologický preparát se připraví cytosedimentační nebo šetrnou cytocentrifugační metodou. Preparát slouží k cytologické diagnostice, umožňuje hodnocení zastoupení jednotlivých buněčných typů a určení jejich funkčního stavu. Fyziologicky jsou přítomny v likvoru pouze mononukleáry, převažují elementy klidové. Patologický je výskyt erytrocytů, polynukleárů (výjimkou je arteficiální příměs krve či novorozenecký likvor), plasmocytů a fagocytů. Typy buněk v mozkomíšním moku Lymfocyt Klidový lymfocyt je buňka o velikosti 8-10μm, má úzký plazmatický lem a kompaktní jádro, které vyplňuje téměř celou buňku. Tyto buňky najdeme v normálním mozkomíšním moku. Lymfoidní buňky se po setkání s antigenem transformují a jejich vzhled se mění. Aktivovaný lymfocyt (reaktivní) je lymfoidní buňka μm s výraznou bazofilní cytoplazmou a s velkým jádrem. Vývojová řada T-lymfocytů končí u lymfoidních buněk, v plasmocyty se vyvíjejí pouze B-lymfocyty.T-lymfocyty jsou odpovědné za cytolýzu a aktivaci makrofágů. Plasmocyty jsou největší lymfoidní buňky o velikosti až 21 μm s bazofilní plazmou. Kulaté nebo oválné jádro s patrnými jadérky bývá uloženo excentricky.typické je perinukleární projasnění plazmy. Obrázek 31.3 neco 372

373 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Plazmocyt Plazmocyty jsou konečným stadiem B-lymfocytů po imunologické stimulaci a produkují imunoglobuliny. Vyskytují se patologicky v mozkomíšním moku, nejčastěji u pacientů se záněty virového původu. Monocyt Monocyty jsou buňky velké μm. Jádro mívá nepravidelný tvar, nejčastěji podkovy nebo fazole. Plazma se barví světleji než u lymfocytů. Jsou to buňky morfologicky velmi proměnlivé. Aktivované monocyty se odlišují od klidových větší velikostí a vakualizovanou plazmou. Jsou schopny fagocytózy jiných buněk nebo nebuněčných částic. Aktivované monocyty s pohlceným materiálem se nazývají makrofágy. Podle fagocytovaného materiálu lze rozlišit různé typy, např. erytrofágy, hemosiderofágy, lipofágy apod. Monocyty jsou součástí normálního buněčného obrazu, aktivované monocyty nebo makrofágy však svědčí pro patologický děj. KAPITOLA 31 Neutrofilní polymorfonukleár Obrázek 31.4 neco Neutrofilní polynukleáry jsou buňky o velikosti μm. Za normálních okolností se vyskytují v mozkomíšním moku pouze ve zralé, segmentované podobě. Charakteristická morfologie s děleným jádrem a granuly v plazmě odpovídá krevním neutrofilům. V mozkomíšním moku jsou z granulocytární řady leukocytů nejčastější a provázejí akutní záněty nervového systému, zejména záněty bakteriální. Granulocyty mají také schopnost fagocytózy, pohlcují např. bakterie. Nejsou však schopny fagocytovat jiné leukocyty nebo erytrocyty. Eosinofilní granulocyty jsou o něco větší než neutrofily. Jádro bývá nejčastěji rozděleno na dvě části a v plazmě je množství načervenalých granulí. V mozkomíšním moku jsou spíše vzácným nálezem jejich výskyt může svědčit pro chronicitu procesu, dále je můžeme vidět u parazitárních onemocnění. 373

374 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku KAPITOLA 31 Nádorové buňky Obrázek 31.5 neco Nádorové buňky v mozkomíšním moku mnohem častěji pochází z extrakraniálních nádorů než intrakraniálních. Cytologické vyšetření mozkomíšního moku a pátrání po nádorových buňkách je významné zejména u pacientů s metastatickými tumory, u leukémií, lymfomů, primárních mozkových nádorů a u meningeálního dráždění neznámého původu. Mezi všeobecně uznávaná kritéria malignity buněk patří vysoký nukleoplazmový posun ve prospěch jádra, velká jadérka, časté dělení buněk, značná velikost buněk, tendence k buněčným shlukům. Obrázek 31.6 neco Typy cytologických likvorových nálezů Podle početně převažující řady dělíme pleocytózu nebo patologickou oligocytózu na granulocytární, lymfocytární, monocytární 374

375 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku nebo tumorózní. Granulocytární pleocytóza s převahou neutrofilů se vyskytuje u hnisavých zánětů, výskyt eosinofilů je častý u onemocnění parazitárních, mykotických nebo u chronických patologických procesů. KAPITOLA 31 Obrázek 31.7 neco Granulocytární oligocytóza je častá v počáteční fázi nehnisavých zánětů nebo mozkové ischémie. Lymfocytární pleocytóza se vyskytuje u nehnisavých zánětlivých onemocnění (infekce virové, dále infekce způsobené borreliemi, leptospirami nebo bacily tuberkulózy) Obrázek 31.8 větší buňky se světlejším jádrem jsou aktivované lymfocyty Lymfocytární oligocytóza se často nachází u roztroušené sklerózy. Monocytární pleocytóza nebo oligocytóza s nálezem aktivovaných monocytů je nespecifickým nálezem charakteristickým 375

376 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku pro neinfekční onemocnění kompresivní syndrom, autoimunitní onemocnění. Nález je také charakteristický pro konečnou fázi zánětu. Tumorózní pleocytóza nebo oligocytóza svědčí pro maligní onemocnění. KAPITOLA 31 Obrázek 31.9 neco Normální cytologický nález v likvoru je oligocytóza (počet buněk do 3-5/μl), jsou přítomny lymfocyty, monocyty, aktivované formy do 10 %. Biochemické vyšetření mozkomíšního moku Vzhled likvoru čirý a bezbarvý (normální nález) sangvinolentní (s příměsí krve) vzniká patologickou nebo arteficiální příměsí krve. xantochromní (nažloutlý) může být známkou staršího krvácení do likvorových cest nebo se vyskytuje při těžké poruše hematolikvorové bariéry. zkalený nacházíme u purulentních meningitid. Celková bílkovina - hladina celkové bílkoviny je za normálního stavu asi 200x nižší než v séru. Za normálních okolností je 80 % celkové bílkoviny sérového původu, zbývajících 20 % je mozkového původu. Fyziologická hodnota celkové bílkoviny je při lumbální punkci g/l. V mozkových komorách je hodnota celkové bílkoviny výrazně nižší. Novorozenci mají v likvoru vyšší hodnotu celkové bílkoviny pro nezralost hematolikvorové bariéry. Nejvyšší podíl v zastoupení celkové bílkoviny má albumin, v likvorovém prostoru jsou modifikovány dále některé sérové proteiny např. prealbumin, transferin. Imunoglobuliny přestupují do likvoru z krve nebo vznikají intratékální syntézou v likvorových prostorách. K zánětlivým markerům dále patří haptoglobin, C-reaktivní protein, C3 a C4 složky komplementu, antitrombin III a α1-antitrypsin. K tumorovým markerům řadíme orosomukoid. Klinický význam má zvýšení celkové bilkoviny, které nastává u zánětů (u bakteriálních zánětů výrazné zvýšení až na desítky gramů), poruchách cirkulace likvoru např. výhřezu meziobratlové ploténky nebo u intratékální syntézy imunoglobulinů při aktivaci imunitního systému. Glukóza je základním energetickým zdrojem pro nervovou tkáň, hladina glukózy v likvoru závisí na hladině glukózy v séru, tvoří asi 60 % sérové hodnoty. Vyšší výpovědní hodnotu má poměr CSF glukóza/s glukóza, který je za normálních poměrů 0,6. Klinický význam má snížení hladiny glukózy v likvoru nebo poměru glukózy v likvoru a séru. Doprovází bakteriální záněty, nádorové meningeální infiltrace, subarachnoideální krvácení. 376

377 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku Laktát hladina laktátu v likvoru nezávisí na plazmatické koncentraci, laktát prakticky neprochází přes hematolikvorovou bariéru. Fyziologická hodnota laktátu je 1,2 2,1 mmol/l. Laktát vzniká při metabolismu glukózy bez přístupu kyslíku, klinický význam má jeho zvýšená hladina. Ke zvýšení dochází u zánětů, lehké zvýšení doprovází virové nebo tuberkulosní meningitidy. Výrazné zvýšení nastává u bakteriálních zánětů. Diskriminační hodnota pro rozlišení typu meningitidy je asi 4 mmol/l. Koncentrace laktátu bývá zvýšena u ischemických vaskulárních lézí. Chloridy fyziologická hladina je mmol/l, od jejich stanovení se upouští. Ke snížení chloridů dochází u výraznějších poruch hematolikvorové bariéry zejména u specifických zánětů jako je tuberkulózní meningitis. Albumin je syntetizován v játrech, do likvoru se dostává jedině přestupem přes hematolikvorovou bariéru. Slouží k posouzení funkčnosti této bariéry. Pro vyhodnocení poruchy funkce hematolikvorové bariéry má koncentrační kvocient CSF/sérum albumin vyšší senzitivitu než absolutní koncentrace albuminu v likvoru. Z koncentrace albuminu v likvoru a séru vypočítáváme tzv. albuminový kvocient Qalb.= CSFalb./Salb. Hodnoty albuminového kvocientu závisí nejen na propustnosti (permeabilitě) bariéry v užším slova smyslu, ale i na obratu (cirkulaci) likvoru. Je výrazně vyšší u novorozenců. Normální hodnota Qalb je do 7,4.10-3; přesněji vzato závisí poněkud na věku podle rovnice Qalb. 4 + (věk v letech/15). Mírně porušenou bariéru nacházíme u chronických neuroinfekcí nebo roztroušené sklerózy. Střední poruchu bariéry můžeme vidět např. u virových infekcí a těžká porucha bariéry je typická pro bakteriální meningitidy, polyradikuloneuritidu Guillain-Barrého typu, maligní meningeální infiltraci nebo herpetickou encefalitidu. Imunoglobuliny zdrojem imunoglobulinů je buď sérum, odkud přecházejí při poruše bariéry, nebo intratékální syntéza v likvorovém prostoru při onemocnění CNS spojeném s imunitní reakcí. KAPITOLA 31 Vyšetření intratékální syntézy imunoglobulinů Intratékální syntéza protilátek v centrálním nervovém systému pochází z perivaskulárních infiltrátů lymfocytů B, které lokálně proliferují, dozrávají v plazmocyty a produkují příslušné protilátky. Na rozdíl od známé a charakteristické reakce v séru, kde dochází k přechodu z protilátkové tvorby ve třídě IgM do třídy IgG v subakutní nebo chronické fázi nemoci, není takový přechod v intratékální syntéze přítomen. Tvorba protilátek ve třídě IgG/IgM/IgA je přítomna již na počátku onemocnění a zůstává relativně konstantní. Intratékální protilátková odpověď nemusí znamenat vždy akutní onemocnění, ale může být přítomna u zánětlivého onemocnění CNS, které se manifestuje zvýšeným počtem buněk v likvoru, dále u zbytkové intratékální syntézy po proběhlém onemocnění nebo u chronického zánětlivého autoimunitního procesu v CNS. Moderní likvorová diagnostika roztroušené sklerózy je dnes založena především na průkazu intratékální syntézy imunoglobulinů. Kvantitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů Zvýšení koncentrace imunoglobulinů v likvoru může být důsledkem jejich zvýšené koncentrace v séru, poruchy hematolikvorové bariéry nebo obou těchto faktorů. Dominantním transportním mechanismem přes hematolikvorovou bariéru je difúze proteinů ze séra do likvoru. Dle fyzikálních zákonů difúze prostupují větší molekuly pomaleji (např. IgM) než menší molekuly (např. IgG a albumin). Důsledkem zvýšení koncentrace určitého sérového proteinu je zvýšení koncentrace téhož proteinu v likvoru, avšak gradient vyjádřený poměrem koncentrace proteinu v likvoru a séru zůstává konstantní. Při porušené hematolikvorové bariéře dochází k patologickému zvýšení koncentrace proteinu v likvoru, proto je třeba stanovit albumin a příslušné imunoglobuliny současně v séru i v likvoru. Pro klinickou diagnostiku má nejvyšší význam stanovení intratékální syntézy IgG, IgM a IgA. K průkazu intratékální syntézy imunoglobulinů se v současné době doporučuje používat rovnici dle Reibera, která popisuje vztah mezi Q albuminu a Q příslušného imunoglobulinu. Tento vztah není lineární, ale hyperbolický. Hranice mezi lokální syntézou imunoglobulinů a jejich pasivním přestupem je znázorněna modrou čárou. Hodnoty nad touto linií znamenají intratékální syntézu a rozsah je vyznačen přerušovanou čárou a vyjádřen v procentech. Vertikální přerušovaná čára odděluje normální a porušenou hematolikvorovou bariéru. 377

378 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku KAPITOLA 31 Obrázek Reibrův diagram Interpretace patologických nálezů s ohledem na funkci hematolikvorové bariéry a intratékální syntézu: Oblast 1 normální nález Oblast 2 porucha funkce HLB bez intratékální syntézy Oblast 3 porucha funkce HLB s intratékální syntézou imunoglobulinů Oblast 4 intratékální syntéza se zachováním funkce HLB Oblast 5 oblast analytických chyb Z diagnostického hlediska lze na základě přítomnosti intratékální syntézy jednotlivých imunoglobulinů rozlišovat stavy Bez průkazu intratékální syntézy Ig: časná bakteriální a virová meningitida, Guillainův-Barrého syndrom Intratékální syntéza s převahou IgG: roztroušená skleróza, neurolues, chronická HIV encefalitida. Intratékální syntéza s převahou IgA: neurotuberkulóza, mozkový absces Intratékální syntéza s převahou IgM:neuroborrelióza Kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů Kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů spočívá ve stanovení oligoklonality imunoglobulinů pomocí izoelektrické fokusace (IEF). Současně je analogickým způsobem vyšetřeno sérum naředěné na koncentraci odpovídající mozkomíšnímu moku. Pro intratékální syntézu svědčí průkaz dvou a více oligoklonálních pásů v likvoru, které nemají analogii v séru. Metoda izoelektrické fokuzace slouží k rozdělení látek amfoterní povahy (mají kyselé i bazické skupiny) a dělí se v gradientu ph podle svého izoelektrického bodu. Na základě mezinárodního konsensu je stanoveno pět typů rozdělení při IEF likvoru a séra. 1. typ: normální stav bez průkazu oligoklonálních pásů (OP) 2. typ: OP v likvoru, které nejsou v séru (zejména u roztroušené sklerózy) 3. typ: OP v obou materiálech a navíc OP přítomné v likvoru (neuroborrelióza,mozkomíšní skleróza) 378

379 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku 4. typ: identické OP v likvoru a séru (paraneoplastické syndromy,sle) 5. typ: monoklonální pásy v likvoru a séru (monoklonální gamapatie) KAPITOLA 31 Základní typy rozdělení při IEF Obrázek neco U pacientů s diagnózou roztroušené sklerózy je stanovení oligoklonálních pásů pozitivní až v 98%. Oligoklonální pásy nacházíme i u infekčních procesů, u autoimunitních nebo systémových onemocněních. Významné výsledky v likvorové diagnostice roztroušené sklerózy přineslo zavedení specifické reakce MZR (morbilli, rubeola a varicella zoster), která umožňuje detekovat některá chronická onemocnění CNS již v době prvních klinických příznaků. Jako reakce MZR se označuje intratékální syntéza specifických protilátek třídy IgG proti neurotropním virům spalniček, zarděnek a planých neštovic.přítomnost reakce MZR je vysvětlována moderní teorií imunitní sítě, ve které každá imunologická reakce indukovaná konkrétním antigenem postihuje celou imunitní síť.kromě specifických protilátek proti vyvolávajícímu agens je zvýšena produkce mnoha dalších protilátek a autoprotilátek tzv. polyspecifická imunitní odpověď. Koncentrace jednotlivých specifických protilátek v likvoru a séru jsou měřeny a jejich poměr se vztahuje k poměru celkových protilátek téže třídy jako tzv. protilátkový index (AI). Hodnoty nad 1,4 jsou patologické a indikují intratékální syntézu specifických protilátek.reakce MZR je specifická pro chronická autoimunitní zánětlivá onemocnění nervového systému, především pro roztroušenou sklerózu. Spektrofotometrie likvoru Provádí se při podezření na intermeningeální krvácení. Je přínosné v časných stadiích, kdy ještě nejsou změny v cytologickém obrazu. Spektrofotometrie je 10x citlivější než lidské oko, pozitivní nález můžeme získat i u napohled bezbarvého likvoru. Provádí se registrací absorbance v oblasti viditelného světla ( nm), detekuje se přítomnost oxyhemoglobinu a bilirubinu. Nález oxyhemoglobinu může značit čerstvé krvácení objevuje se za 4-8 hod po začátku krvácení. Maximum absorbance má při 415 nm, 2 minoritní vrcholy jsou při 540nm a 580 nm. U bilirubinu je maxima dosaženo 3. den po začátku krvácení, přetrvává 3 týdny, maximum absorbance je při 450 nm. Mikrobiologické vyšetření a detekce patogenních agens Mezi základní postupy patří kultivace se stanovením citlivosti, mikroskopické a bakteriologické vyšetření nátěru. Specifické protilátky se vyšetřují v séru i v likvoru, prokazuje se jejich intratékální syntéza. Specifickou a velmi citlivou metodu představuje 379

380 Cytochemické vyšetření mozkomíšního moku polymerázová řetězová reakce (PCR) pro průkaz detekce DNA patogenních agens (nejčastěji se používá pro stanovení borrelií a herpetických virů). Perspektivy vývoje likvorologického vyšetření V současnosti se obrací zájem k novým možnostem v diagnostice degenerativních a metabolických onemocnění centrálního nervového systému a také prionových infekcí. Zatím se jedná spíše o experimentální výzkum. Např. pro diagnostiku Creutzfeldtovy-Jakobovy choroby svědčí zvýšená koncentrace proteinu v likvoru, který je v současné době považován v likvoru za obecný marker značné tkáňové destrukce. Likvorová diagnostika Alzheimerovy choroby se opírá o stanovení β-amyloidu,τproteinu a fosfo- τ-proteinu. Protein β-amyloid je součástí amyloidových plak, které se akumulují v mozku. Protein τ se vyskytuje v cytoskeletu CNS. U Alzheimerovy choroby se nachází snížené hodnoty β-amyloidu a zvýšené hodnoty τ-proteinu.dále se hodnotí jejich vzájemný poměr, index τ/ β-amyloid, který bývá zvýšený. Dalším parametrem, který může přispět k diagnostice neurodegenerativních onemocnění, je cystatin C. Cystatin C patří mezi inhibitory cysteinových proteáz, v systémovém oběhu je poměrně stabilní a v klinické praxi je znám jako ukazatel odhadu glomerulární filtrace.u pacientů s neurodegenerativními chorobami CNS nacházíme zvýšené hodnoty cystatinu C v likvoru. Strukturální protein S-100 patří do rodiny proteinů vážících vápník. Zvýšená hodnota S100 (S100B) je známkou strukturálního postižení tkáně CNS; protein S100 (S100B) lze měřit i v séru za účelem odhadu prognózy a monitorování stavu pacienta bez nutnosti lumbální punkce. β2 mikroglobulin patří k proteinům, které jsou přítomny ve všech tělních tekutinách.vzestup jeho koncentrace v likvoru nacházíme u stavů obecně spojených s aktivací a zmnožením lymfocytárních a makrofagických elementů. U pacientů s roztroušenou sklerózou byla zkoumána přítomnost neuronálních protilátek v likvoru byly nalezeny protilátky proti molekulám myelinového obalu. Jde především o myelinový bazický protein (MBP) ze skupiny strukturálních proteinů, který je základem myelinu. Protilátky proti MBP odrážejí míru myelinové destrukce. KAPITOLA 31 Průkaz likvorey Někdy je důležité určit, zda u pacienta po úrazu hlavy je sekret vytékající z nosu jen zánětlivý exsudát z nosní sliznice nebo mozkomíšní mok. V tomto případě se jedná o závažný stav s komunikací likvorových cest a nosní dutiny, ohrožující pacienta přestupem bakteriální flóry na meningy. Detekce likvoru je možná stanovením parametru specifického pro likvor. K dispozici je stanovení beta trace proteinu enzymu, který je syntetizován v buňkách chorioideálního plexu. V likvoru se nachází v koncentracích 20-30x vyšších než v séru. Dalším parametrem je β2 transferin. Ze sérového transferinu se v likvorových prostorách odštěpí zbytky kyseliny sialové (mozkovou neuraminidázou), vzniká asialotransferin, který lze detekovat pomocí elektroforézy s imunofixací v β2 zóně globulinů. Literatura: KALA, Miroslav; MAREŠ, Jan. Lumbální punkce a mozkomíšní mok. první. Praha : Galén, s. ISBN ADAM, Pavel, et al. Proteinologie mozkomíšního moku. Praha : Medica News Publishers,s.r.o,, s. ISBN GLOSOVÁ, L. Cytologický atlas mozkomíšního moku. 1. vydání. Praha : Galén, ISBN RACEK, J, et al.. První vydání. Praha : Galén Karolinum, ISBN 380

381 Příprava Dědičné poruchy metabolismus-laboratorní diagnostika Příprava Dědičnéporuchymetabolismus-laboratorní diagnostika Intermediární metabolismus KAPITOLA 32 Pro všechny funkce organismu (růst,vývoj,reprodukce atd.) je nezbytný přísun energie a látek z okolí. Tyto dvě nezbytné podmínky pro existenci organismu jsou získávány ze živin Živiny podléhají vysokému počtu chemických reakcí, při nichž dochází k energetickým a látkovým přeměnán. Souhrn těchto reakcí, které jsou propojené vzájemnými vztahy a velmi organizováné, se nazývá intermediární metabolismus. Nejedná se však o význačně komplikovaný a složitý děj, neboť v rámci metabolismu probíhá poměrně malý počet typů reakcí (hydrogenace, dehydrogenace, dekarboxylace, hydratace, dehydratace, hydrolýza atd.). Tyto děje jsou reprezentovány souborem na sebe navazujících (řetězových), enzymově katalyzovaných reakcí, provázených vznikem různých chemických meziproduktů látkové přeměny, tzv.metabolitů. Uvedených reakcí se účastní přibližně sto druhů molekul (aminokyseliny, karboxylové kyseliny, sacharidy, puriny, pyrimidiny atd.). Jednotlivé reakce jsou prostřednictvím meziproduktů propojeny do metabolických drah. Rozlišujeme tři typy metabolických drah. Anabolické dráhy zahrnují syntézy sloučenin, které jsou podstatné pro tělesnou strukturu. Příkladem je syntéza bílkovin. Dále se jedná o výstavbu biomakromolekul (sacharidů, lipidů, nukleových kyselin) a buněčných struktur. Tyto anabolické (asimilační) děje, jako je tvorba peptidové, esterové, glykosidové vazby a též tzv. redukční syntézy (tj.tvorba vazeb maximálně hydrogenovaných uhlíkových atomů) vyžadují přívod energie. Jedná se o tzv.endergonické děje. Volná energie potřebná pro tyto pochody je využita z dalšího typu metabolických drah. Katabolické dráhy- slouží k energetickému využití. Zahrnují hydrolytické štěpení a zejména oxidaci metabolitů. Příkladem je dýchací řetězec a oxidativní fosforylace. Jedná se o exergonické děje. Amfibolické dráhy- mají více než jednu funkci,vyskytují se na křižovatkách metabolismu, čímž působí jako spojky mezi anabolickými a katabolickými drahami. Příkladem je citrátový cyklus. Některé jeho mezizplodiny mohou být využity k biosyntetickým dějům i k oxidačním pochodům. Veškerý život na Zemi závisí na biochemických reakcí; pokud ustanou dochází ke smrti. Zdraví závisí na harmonickém fungování biochemických reakcí a procesů, které probíhají ve zdravých buňkách a zajišťují stálost vnitřního prostředí ( koncentrace elektrolytů, ph, osmolalita atd.). Nemoc je výsledkem poruchy struktury (např. DNA u genetických onemocnění), nebo množství některých biomolekul či narušení důležitých biochemických reakcí a procesů. Tyto poruchy lze vyrovnat kompenzačními mechanismy zpravidla jen pouze omezenou dobu.tento zjednodušený pohled na nemoc by neměl zakrýt komplexní charakter postiženého organismu. Chorobný proces odráží též změny života pacienta, včetně sociálních a jiných faktorů. Lékař musí přistupovat k pacientovi komplexně a neopominout psychologické, sociální a další faktory. Způsobygenetickéhopřenosudědičnýchmetabolickýchporuch U dědičných metabolických poruch se setkáváme se všemi známými způsoby mendelovské dědičnosti. Jsou-li alely daného genu získané od obou rodičů identické, jedná se o homozygota; jsou li odlišné, jde o heterozygota pro příslušný gen. Při umístění genu na chromosomu X muže, není na párovém chromosomu Y homologní alela a jedinec je pro daný gen hemizygot. Dominance znamená, že k manifestaci znaku stačí pouze jediná alela určitého páru a znak se tak projeví již u heterozygota. Pokud se znak projeví pouze za nepřítomnosti dominantní alely (u homozygota či hemizygota), jedná se o recesivitu. Alelická výbava pro určitý znak je označována jako genotyp. Pozorovatelný projev genotypu nazýváme fenotyp. 381

382 Příprava Dědičné poruchy metabolismus-laboratorní diagnostika Projeví-li se fenotypicky obě alely heterozygota pro daný gen, jedná se o kodominanci. Způsoby přenosu: Autosomálně dominantní dědičnost Fenotypické projevy choroby jsou manifestní již u heterozygota, který má jednu z alel mutovanou. Děti postiženého jedince mají 50% pravděpodobnost, že mutovanou alelu zdědí a projeví se u nich onemocnění. KAPITOLA 32 Autosomálně recesivní dědičnost K fenotypickým projevům choroby dochází pouze u homozygotů, kteří mají obě alely alelického páru mutované.rodiče postiženého jedince jsou heterozygoty pro daný gen a nemají fenotypické projevy. Jejich děti mohou být: a) zdraví homozygoti (AA, jedna čtvrtina); b) heterozygoti jako rodiče (Aa, jedna polovina) ; c) postižení hymozygoti (aa, jedna čtvrtina). Tímto způsobem dědičnosti se dědí většina dědičných metabolických poruch. Gonosomálně dominantní dědičnost Jedná se o přítomnost abnormálního genu dominantního charakteru na chromosomu X. Postižení muži jsou hemizygoti a postižené žené ženy jsou heterozygoti. Onemocnění se manifestuje u všech dcer postiženého muže, všichni jeho synové jsou zdrávi. K přenosu dochází na polovinu dětí postiženého muže - výhradně na dcery. Vzhledem k tomu, že žena předává chromosom X jak dcerám, tak svým synům, dochází mezi dětmi postižené ženy k polovině postižených jedinců bez ohledu na pohlaví. Gonosomálně recesivní dědičnost Jedná se o přítomnost abnormálního genu recesivního charakteru na chromozomu X. Fenotypicky se projeví u hemizygotů- -můžů. Klinické projevy však mohou mít i heterozygotní ženy (inaktivace chromozomu X s normální alelou příslušného genu) Multifaktoriální dědičnost Fenotypický projev onemocnění závisí na polygenně (nejméně tří nealelické geny) určené vnímavosti postiženého a na vlivu prostředí. Jedná se o choroby s vysokou incidencí v populaci (např. diabetes mellitus). 382

383 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Autor: MUDr. Ivan Šebesta CSc., Doc. MUDr. Viktor Kožich CSc. Recenzent: Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. KAPITOLA 32 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Charakteristika DMP Dědičné metabolické poruchy (DMP, původně označované též jako vrozené poruchy metabolismu ) představují rozsáhlou skupinu více než 800 onemocnění, jejichž společným jmenovatelem jsou geneticky podmíněné změny v tvorbě proteinů, nejčastěji se jedná o postižení enzymů. Mezi vzácnými nemocemi (tj. onemocněními s populačním výskytem nižším než 1:2 000) tvoří DMP přibližně 10-15% všech známých nosologických jednotek. Výskyt Incidenci lze zjistit pouze u onemocnění, pro které je provedeno vyšetření u každého narozeného jedince - čili pokud je proveden tzv. celopopulační novorozenecký screening. V současném systému screeningu DMP v ČR je očekávaný výskyt pro deset vyhledávaných DMP (viz dále) přibližně 1: Pro defekty, které nejsou zařazené do screeningového programu, nelze incidenci spolehlivě stanovit, neboť není známý podíl pacientů, kteří stanovení správné diagnosy uniknou tím, že nebylo podezření na DMP vzato do diferenciálně diagnostické úvahy a nebyla provedena speciální vyšetření. V poslední dekádě se v ČR zachytilo selektivním screeningem každý rok kolem stovky nových pacientů s jednotlivými DMP (viz.obr.1). Dle dat ze zahraniční literatury je předpokládaná kumulativní incidence všech známých DMP nejméně 1:500 narozených dětí. Je třeba zdůraznit fakt, že skutečný výskyt je s vysokou pravděpodobností daleko vyšší a znamená, že každý lékař jakékoliv odbornosti se ve své praxi s pacienty s DMP setkává. V posledních letech se ukazuje, že s neustále se rozšiřující nabídkou stále dokonalejších laboratorních vyšetření přibývá počet pacientů s první klinickou manifestací metabolického onemocnění až v dospělém věku. Jedná se např.o mitochondriální poruchy energetického metabolismu nebo metabolické urolitiázy (cystinurie, dědičná xantinurie, 2,8-dihydroxyadeninová litiáza), postižení ledvin (familiární juvenilní hyperurikemická nefropatie a další). DMP tak v žádném případě nejsou jen záležitostí dětských lékařů. 383

384 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika KAPITOLA 32 Patofyziologie Základní příčinou uvedené skupiny onemocnění jsou mutace v nukleárních nebo mitochondriálních genech, které vedou ke snížené produkci a/nebo změněné funkci genového produktu (nejčastěji enzymu, transportního či regulačního proteinu, receptorů, krevních bílkovin neenzymové povahy). Tyto změny na úrovni proteinů následně způsobují nahromadění substrátů a nedostatečnou tvorbu produktů v příslušných metabolických drahách. Kombinací obou těchto mechanismů dochází k postižení různých orgánů a vzniku klinických příznaků, které lze vysvětlit na základě znalosti několika typických základních mechanismů 384

385 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika KAPITOLA 32 Akumulace substrátů a chybění produktů Snížená až nulová aktivita některého z enzymů vede k metabolickému bloku s hromaděním fyziologických nebo atypických metabolitů ve tkáních nebo tělesných tekutinách. Dochází k hromadění substrátů enzymové reakce před blokem a chybění produktů za blokem; (analogické změny lze nalézt při postižení transportu látky mezi dvěma kompartmenty oddělenými membránou). Je nutné upozornit, že toto hromadění substrátu je výrazné (koncentrace příslušného metabolitu jsou často o několik řádů vyšší než u zdravého jedince) viz schematické znázornění na obr.2. Tohoto výrazného nahromadění určitého metabolitů (může se jedná i o atypický metabolit, který se ve zdravém organismu nevyskytuje) se pak s výhodou využívá při diagnostice. Většina speciálních biochemických vyšetření je zaměřena na rychlý průkaz hromadících se metabolitů. U některých DMP je převažujícím patogenetickým mechanismem hromadění látek (např. hyperamonemické kóma u pacientů s poruchami v cyklu močoviny, ataka metabolické acidosy s bezvědomím u pacientů s organickými aciduriemi ) zatímco u jiných nemocí vznikají příznaky hlavně v důsledku chybějícího produktu (např. hypoglykemické kóma u pacientů s poruchami v beta-oxidaci mastných kyselin ). Dalším faktorem, který způsobuje klinický obraz nemoci jsou fyzikálně-chemické vlastnosti látek postižené metabolické dráhy. Nemoci malých molekul Nemoci malých molekul jsou způsobeny poruchami metabolismu látek přiváděných exogenně potravou (např. sacharidy, aminokyseliny, mastné kyseliny nebo puriny). Nejčastěji se manifestují akutně v novorozeneckém období nebo opakovanými metabolickými atakami v pozdějším věku. Ataky z hromadění vysoce toxických malých molekul se typicky projevují postupně progredující poruchou vědomí ústící většinou do kómatu a jsou vyvolané buď zvýšeným přívodem aminokyselin potravou nebo mnohem 385

386 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika častěji zvýšenou nabídkou aminokyselin při katabolickém stavu jako je např.horečnatý infekt. Vyvolávajícím momentem může být též zvýšený přívod bílkovin či sacharidů jako fruktosy a galaktosy ve stravě DMP s akutními projevy mohou připomínat sepsi, intoxikaci či meningoencefalitis. Někteří pacienti s hromaděním organických kyselin mohou mít v anamnéze opakované ataky acetonemického zvracení a/nebo metabolické acidózy. Řada DMP malých molekul může probíhat i subakutně až chronicky. Mezi nemoci malých molekul patří i nedostatečná tvorba meziproduktů energetického metabolismu (např. uvolňování glukózy z glykogenu u jaterních forem glykogenóz či nedostatečná tvorba ketolátek u poruch beta-oxidace mastných kyselin) s rozvojem klinických projevů hypoglykémie ať již na lačno nebo až po delším hladovění. Klinicky obzvláště nebezpečné jsou situace při zvýšených energetických nárocích organismu, zejména při horečce nebo při zvýšené svalové námaze. Nemoci komplexních molekul Nemoci komplexních molekul jsou způsobené poruchou tvorby,odbourávání nebo transportu endogenně syntetizovaných složitých makromolekul (jako jsou například mukopolysacharidy nebo komplexní glykosfingolipidy) nebo snížením jejich synthesy s následnou poruchou tvorbou buněčných membrán a organel (jako např.plasmalogenů u peroxisomálních nemocí ). Tyto genetické defekty se často projevují abnormalitami buněčných membrán a organel, zejména lysosomů a peroxisomů. Při postupném hromadění neodbouraných komplexních molekul je průběh nemoci velmi často chronický a nemoc nastupuje až po různě dlouhém bezpříznakovém období v trvání měsíců až desítek let. Někteří pacienti mohou být sledováni pro neurodegenerativní onemocnění nejasné etiologie,též mohou připomínat hematoonkologická onemocnění či jiná nádorová onemocnění. U některých DMP hraje významnou úlohu v patofysiologii nemoci porucha v syntéze komplexních molekul a buněčných membrán; tyto nemoci se mohou projevovat již při narození jako vrozené vývojové vady a mohou imitovat chromosomální aberace. Na rozdíl od nemocí malých molekul, mají tyto choroby progresivní průběh bez závislosti na exogenních podnětech a nebývají ovlivněné katabolismem či horečnatými stavy. Pacienti s nemocemi komplexních molekul mívají poměrně často strukturální postižení orgánů s kraniofaciální dysmorfií, organomegalií nebo postižení CNS dokumentovatelné vyšetřením MR. V tabulce 1 jsou uvedeny typické vlastnosti dvou základních typů metabolitů-malých a komplexních molekul a též charakteristické známky jednotlivých poruch. KAPITOLA 32 Malé molekuly Komplexní molekuly Typická relativní molekulová hmotnost < 1500 > 1500 Charakter látek Malé jednoduché molekuly s reaktivními funkčními skupinami Složité molekuly nebo makromolekuly obvykle obsahující sacharidy a lipidy Příklady látek Aminokyseliny, amoniak, karboxylové kyseliny, jednoduché lipidy, monosacharidy včetně glukosy a jejich fosfoestery, pyrimidiny a puriny včetně ATP a další Glykosaminoglykany (mukopolysacharidy), glykoproteiny, složité glykolipidy, plasmalogeny, glykogen a další Akutní manifestace nemoci Běžná u vysoce toxických metabolitů Nebývá přítomná Původ metabolitu Převážně exogenní Převážně endogenní Závislost příznaků na přívodu stravy a/ Běžná u vysoce toxických metabolitů Nebývá přítomná nebo katabolismu Chronická toxicita a/nebo chronická progrese nemoci Může být u málo toxických metabolitů Typický příznak Lokalizace primární poruchy v buňce Cytosol, mitochondrie Membrány, jiné organely (lysosomy, peroxisomy) Lokalizace příznaků v organismu Příznaky lokální v místě enzymového deficitu i systémové ve vzdálených orgánech Typicky pouze ve tkáních a orgánech postižených enzymovým deficitem Přítomnost dysmorfických rysů, vývojových vad Vzácně Častý příznak Postižení CNS Kvalitativní poruchy vědomí, psychomotorická retardace spíše stacionární, epilepsie Typicky bez kvalitativních poruch vědomí, progredující psychomotorická retardace, běžné jsou abnormality při MRI mozku či elektrofysiologických vyšetřeních 386

387 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Organomegalie Abnormality v běžných laboratorních vyšetřeních Léčba Poměrně častá isolovaná hepatomegalie s hepatopathií Běžné Dietou a/nebo farmakologickými dávkami vitaminů většinou účinná Tabulka 32.1 DMP s abnormálním metabolismem malých a komplexních molekul Poměrně častá hepatosplenomegalie bez hepatopathie, kardiomyopathie Vzácné Dietou a vitaminy neúčinná; enzymová náhradní therapie a transplantace jsou možné u některých nemocí KAPITOLA 32 Klasifikace DMP a charakteristika základních skupin Dělení DMP odráží historii poznávání těchto nemocí. Tato onemocnění jsou obvykle klasifikovana podle typů metabolitů (např. poruchy metabolismu aminokyselin či sacharidů) nebo typické diagnostické metody (např. organické acidurie nebo hyperamonemie) či podle postižené organely (nemoci peroxisomální,mitochondriální a lysosomální). Poruchy cyklu močoviny Skupina několika nemocí, při nichž je snížená schopnost organismu přeměňovat amoniak na močovinu; hlavním patogenetickým mechanismem je akumulace amoniaku vedoucí k edému mozku a kómatu. Tato onemocnění s perakutním i intermitentním průběhem jsou obtížně léčitelná dietou a podáváním látek detoxifikujících amoniak. Jiné poruchy metabolismu aminokyselin Skupina několika desítek nemocí malých molekul s variabilním klinickým obrazem podle charakteru hromaděného metabolitu,většinou s chronickým průběhem. Většina těchto nemocí je poměrně dobře léčitelných dietou s omezeným přísunem příslušné aminokyseliny nebo podáváním vitaminových kofaktorů. Organické acidurie Nepřesně ohraničená skupina několika desítek onemocnění, při nich je v moči prokazatelné zvýšená koncentrace karboxylových kyselin pocházejících většinou z uhlíkaté kostry aminokyselin. Jedná se o typická onemocnění malých molekul s akumulací vysoce toxických látek s encefalopathií a obvykle i s metabolickou acidosou, průběh bývá perakutní v novorozeneckém věku a s atakami dekompenzací v pozdějším věku. Poruchy beta-oxidace mastných kyselin Skupina více než 10 nemocí z poruchy transportu karnitinových derivátů mastných kyselin nebo v jejich mitochondriální beta- -oxidaci; jedná se o DMP malých molekul, u nichž je dominantním mechanismem především nedostatečná tvorba ketolátek při delším hladovění s následnou hypoglykemií či intolerancí svalové námahy, u některých nemocí se mohou přidávat toxické projevy některých hromaděných nezpracovaných mastných kyselin pod obrazem myopatie či kardiomyopatie. Poruchy glukoneogenese Skupina několika nemocí v metabolismu sacharidů a glukogenních aminokyselin a projevujících se při hladovění hypoglykemií. Poruchy metabolismu monosacharidů Poruchy ve zpracování galaktózy a fruktózy se projevují jako akutní DMP malých molekul především hepatopatií a generalizovanou tubulopatií. Jaterní glykogenosy Skupina 7 typů GSD s poruchou degradace glykogenu, glukoneogeneze a syntézy glykogenu Svalové glykogenosy Skupina 9 typů GSD s projevy myopatie a/nebo kardiomyopatie Poruchy metabolismu purinů a pyrimidinů Skupina více než 15 chronicky probíhajících nemocí malých molekul s převážně neurologickými a psychiatrickými příznaky, u části nemocí je akumulace málo rozpustných urátů Lysosomální onemocnění-mukopolysacharidosy a glykoproteinosy 387

388 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Tyto nemoci s obvykle chronickým průběhem jsou způsobené hromaděním komplexních glykokonjugátů v lysosomech a představují jednu z nejčastějších skupin DMP. Klinicky se projevují jako multisystémové onemocnění s postižením pojivové tkáně, hepatosplenomegalií, typickou faciální dysmorfií (gargoylismus) a různou mírou postižení CNS. Průběh některých mukopolysacharidos lze zpomalit pomocí enzymové substituční terapie, u části pacientů lze zvažovat transplantaci hematopoetických buněk. Lysosomální onemocnění-lipidosy a další Tyto nemoci z lysosomálního hromadění komplexních glykolipidů představují jednu z nejčastějších skupin DMP. Klinicky se projevují obvykle jako multisystémové onemocnění s chronickým průběhem, u některých lipidos převažují postižení parenchymatosních orgánů (sleziny a jater u m.gaucher a ledvin u M.Fabry), u jiných naopak dominuje různé postižení centrálního i periferního nervového systému-od psychitrických příznaků až po epilepsii. Část pacientů s lipidosami může být úspěšně léčena pomocí enzymové substituční terapie nebo pomocí substrát-redukující terapie. KAPITOLA 32 Peroxisomální onemocnění Skupina DMP, která je způsobená poruchou biogenese peroxisomů s generalisovaným postižením peroxisomálních funkcí (nemoci komplexních molekul typu Zellwegerova syndromu) nebo izolovanou poruchou některé peroxisomální funkce (např.x-vázaná adrenoleukodystrofie).. Poruchy mitochondriálního energetického metabolismu Klinicky i biochemicky heterogenní skupina nemocí způsobených poruchou funkce enzymů dýchacího řetězce. Mitopatie jsou prototypem nemocí z deficitu produkce malé molekuly ATP, na jejich patogenezi se podílí i zvýšená tvorba volných radikálů a reaktivních forem kyslíku. Poruchy glykosylace (CDG syndromy) Tzv. CDG (carbohydrate deficient glycoprotein) syndromy jsou heterogenní skupinou multisystémových nemocí velkých molekul, při nichž vázne glykosylace proteinů a u nichž lze nalézt řadu somatických změn při fyzikálním vyšetření. Klinické projevy a indikace k vyšetření DMP Klinické projevy DMP jsou velmi pestré a nespecifické. První klinické příznaky se mohou projevit v jakémkoliv věku (od novorozeneckého období přes dětský věk až do dospělosti, ale mohou se projevit i prenatálně hydrop- 388

389 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika KAPITOLA 32 sem plodu) - obr.3. Dědičné metabolické poruchy se mohou projevit abnormální funkcí a poruchou struktury téměř všech orgánů a tkání, navíc v rozmanitých kombinacích obr

390 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika KAPITOLA 32 Z tohoto důvodu se tak s klinickými projevy setkávají nejen dětští lékaři a internisté, ale také lékaři celé řady různých specializací (neurologie, nefrologie, hematologie, oftalmologie, dermatologie, gynekologie, psychiatrie a další). Průběh DMP může být stacionární, progredující nebo akutní (s perakutním či intermitentním charakterem). Z uvedených faktů zcela jednoznačně vyplývá, že podezření na DMP lze vyslovit až po důkladném zhodnocení anamnesy, klinického stavu a běžných laboratorních a zobrazovacích vyšetření. V současné době neexistují jednoduchá vodítka, která by pomohla ošetřujícímu lékaři indikovat specializované laboratorní vyšetření. Tabulka 2 uvádí bez nároku na úplnost příklady některých nejběžnějších klinických situací, které typicky vyžadují diferenciální diagnostiku zaměřenou na DMP, tabulka 3 navíc uvádí laboratorní nálezy, které mohou být indiciemi pro přítomnost DMP u pacienta. Souvislost příznaků s výživou zhoršení při přívodu bílkovin, fruktózy či galaktózy Manifestace příznaků při zvýšené energetické zátěži- zejména při hladovění a zvýšené svalové práci Souvislost příznaků s horečnatým infektem, kdy se zvyšuje katabolismus bílkovin Multisystémovost příznaků Indicie pro hromadění neobvyklého metabolitu abnormální zbarvení moči abnormální zápach moči a potu nerozpustnost látky v moči - krystalurie, urolithiasa Vybrané odchylky při běžném laboratorním vyšetření-viz Tabulka 4 Tabulka 32.2 Některé podpůrné známky zvyšující podezření na DMP 390

391 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Vyšetření moči Abnormální zápach může svědčit pro přítomnost malých těkavých molekul: zpocené nohy (isovalerová acidurie), karamel/javorový sirup (leucinosa), vařené zelí (hypermethioninemie), rybina (trimethylaminurie), myšina (fenylketonurie Abnormální zbarvení moči nebo plen: červenooranžové (uráty-poruchy metabolismu purinů), černohnědé po delším stání (alkaptonurie), hnědočervené (myoglobinurie), modré (Hartnupova nemoc), zelené (4-OH-butyrátová acidurie) cystinu, 2,8-dihydroxyadeninu, xanthinu, urátů, oxalátů Krystalurie: pro DMP může svědčit přítomnost krystalů ph moči: zvýšené ph v nepřítomnosti močové infekce (renální tubulární acidosa) Ketolátky: zvýšené vylučování ketolátek při současné metabolické acidose, zejména u novorozence (organické acidurie), absence ketonurie/jen mírná ketonurie při těžké hypoglykémii (poruchy beta-oxidace mastných kyselin) Kyselina močová: zvýšené denní vylučování (poruchy metabolismu purinů) snížené denní vylučování (deficit xanthinoxidasy) Myoglobin: ponámahová myoglobinurie (poruchy beta-oxidace mastných kyselin a svalové glykogenosy) Vyšetření krve Glykemie: hypoglykemie na lačno s ketonurií (jaterní glykogenózy, poruchy glukoneogenese, mitochondriální nemoci), hypoketotická hypoglykemie při delším hladovění a katabolickém stavu (poruchy beta-oxidace mastných kyselin), hypoglykemie po požití fruktózy/sacharózy/sorbitolu (intolerance fruktózy) Amoniak: hyperamonemie (poruchy cyklu močoviny, některé organické acidurie, porucha ATP syntázy) Vyšetření acidobasické rovnováhy (Astrup): metabolická acidóza (při hromadění organických kyselin - organické acidurie, laktátová acidóza u mitochondriálních poruch, při ztrátách bikarbonátu při generalisované tubulopatii), respirační alkalóza (hyperventilace při hyperamonemii u poruch cyklu močoviny) Aminotransferázy/bilirubin: hepatopatie je nespecifická známka postižení jaterního parenchymu u řady DMP typu nemocí malých molekul KAPITOLA

392 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika Kreatinin: snížená koncentrace se může vyskytovat u poruch biosyntesy kreatinu, zvýšená koncentrace u DMP postihujících renální funkce Cholesterol: snížená koncentrace se může nacházet u Smith-Lemli-Opitzova syndromu a deficitu mevalonátkinasy zvýšené koncentrace se nacházejí u řady DMP Triacylglyceroly: pseudotriacylglycerolemie (bez odpovídajícího nálezu v elektroforese lipoproteinů) svědčí pro deficit glycerolkinasy, zvýšené koncentrace triacylglycerolů se vyskytují sekundárně u řady DMP Alkalická fosfatáza snížení (hypofosfatasie) zvýšení (sekundárně u hepatopathií nebo při tubulopathii provázející některé DMP) Kyselina močová: snížená koncentrace (isolovaný nebo kombinovaný deficit xanthinoxidázy,dědičná KAPITOLA 32 renální hypourikémie), zvýšená koncentrace (poruchy metabolismu nebo ledviného transportu purinů) Kreatinkináza a myoglobin: zvýšené koncentrace (mitochondriální onemocnění, glykogenosa II.typu), ponámahové transitorní zvýšení (některé poruchy beta-oxidace mastných kyselin, svalové glykogenózy a některé poruchy metabolismu purinů) Laktát: zvýšená koncentrace při dodržení podmínek preanalytické fáze a při absenci hypoxie může být známkou mitochondriálních onemocnění a některých glykogenóz Homocystein: hypohomocysteinemie se vyskytuje u deficitu sulfitoxidasy, výrazná hyperhomocysteinemie u remethylačních a transsulfuračních forem homocystinurie Krevní obraz: makrocytární anemie (poruchy metabolismu homocysteinu, kys.listové a kobalaminu, orotová acidurie), thrombocytopenie (Gaucherova nemoc) Hemokoagulace: prodloužený prothrombinový čas (poruchy glykosylace-cdg syndromy), těžká hypoprodukční koagulopathie (některé DMP postihující játra) Vyšetření likvoru Glykorhachie: hypoglykorhachie (porucha transportu glukosy) Celková bílkovina: výrazná hyperproteinorhachie (některé lysosomální nemoci typu lipidos) Laktát: zvýšená koncentrace (mitochondriální poruchy energetického metabolismu) Tabulka 32.3 Indicie DMP při běžných laboratorních vyšetřeních Diagnostika DMP Vzhledem k velmi pestrým a nespecifickým klinickým projevům je diagnostika DMP možná pouze pomocí speciálních laborator- 392

393 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika ních vyšetření, které provádí specializované biochemicko-genetické laboratoře. Pro efektivní diagnostiku existují dva zásadně odlišné přístupy: a) novorozenecký screening celé populace asymptomatických novorozenců b) selektivní screening malé vybrané skupiny symptomatických pacientů s podezřením na DMP. Novorozenecký screening Novorozenecký screening se provádí u každého novorozence narozeného v ČR v době hodin po narození. Vyšetřuje se suchá krevní kapka z novorozenecké screeningové kartičky metodou tandemové hmotnostní spektrometrie. (Návod pro odběr krve, činnost laboratoří a zajištění následné péče určuje Metodický návod k zajištění celoplošného novorozeneckého laboratorního screeningu a následné péče - viz Věstník MZ ČR 2009, částka 6). Tímto postupem se v ČR vyhledává deset různých DMP z cca 800 známých DMP, viz obr. 5. Je nutné vzít v úvahu i fakt, že ikdyž většina pacientů trpících některou ze skrínovaných DMP je tímto vyšetřením zachycena, mírné formy nemoci nemusí být použitými screeningovými metodami několik dnů po narození detekovatelné. Je proto důležité pomýšlet na možnost DMP i u pacienta s negativním výsledkem screeningu, pokud by se později začaly projevovat klinické příznaky pro příslušné onemocnění. KAPITOLA 32 Selektivní screening DMP Novorozenecký screening zachytí jen malou část pacientů s DMP. Většina pacientů se všude na světě diagnostikuje v systému tzv. selektivního screeningu. V efektivním využití hrají roli dva faktory. Prvním je dostupnost vyšetřovacích metod. Zkušenosti zahraničních pracovišť ukazují na účelnost sdružovat metody do specializovaných center, ve kterých jsou dostupná jak screeningová 393

394 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika vyšetření, tak i následná cílená vyšetření enzymová a molekulární. Druhým faktorem je účelná indikace specializovaných vyšetření. Tím nejkritičtějším krokem v selektivním screeningu je vyslovení suspekce na DMP lékařem prvního kontaktu či odborným lékařem v rámci jeho diferenciálně diagnostické rozvahy. Na tuto skupinu chorob se často pomýšlí až po vyloučení jiných příčin onemocnění, takže správná diagnóza DMP se stanovuje pozdě. Indikací k selektivnímu screeningu jsou dva zásadní aspekty: a) pozitivní rodinná anamnéza b) klinické příznaky (včetně dostupných laboratorních vyšetření) Problémem je často nespecifický klinický obraz u některých metabolických poruch a jejich relativně nízká incidence v populaci. Proto nepřekvapuje, že současné klinické znalosti o metabolických onemocněních často pokulhávají za úrovní poznatků z biochemie a genetiky. Z těchto důvodů je též zcela běžné, že pracovníci specializovaného pracoviště (biochemicko-genetická laboratoře pro DMP) poskytují ošetřujícímu lékaři intepretace metabolických vyšetření včetně kompletní konzultace s návrhem dalšího vyšetřovacího a léčebného postupu. Také výzkum a objevy nových defektů této skupiny chorob probíhají ve specializovaných laboratoří. Vzhledem k velké klinické variabilitě DMP neexistují žádná jednoduchá kritéria, jejichž splnění by jasně vedlo k podezření na tato onemocnění. Přesto existují některé klinické situace, kdy podezření na DMP by mělo být součástí časných fází standardní diferenciálně diagnostické rozvahy! Některé vybrané běžné situace jsou uvedené v tabulce 2 a 3, podrobnější informace o projevech DMP lze nalézt v literatuře (viz Doporučená literatura). Ohledně anamnézy je třeba upozornit na fakt, že nemusí vždy pomoci v indikaci - jedná se o případy prvního dítěte s DMP, u kterého je autosomálně recesivní typ dědičnosti. K diagnóze DMP se obvykle dojde postupně v několika etapách specializovanými vyšetřeními metabolitů v krvi a moči, enzymových aktivit v buňkách krve či v kultivovaných fibroblastech nebo vyšetřením mutací v příslušných genech. Laboratorní diagnostika probíhá na úrovni metabolitů, enzymů/proteinů, tkání/buňky a DNA. Vyšetření metabolitů zahrnuje metody semikvantitativní, kvantitativní a profilové. Enzymatická vyšetření screeningová je možné indikovat i bez předchozí dohody. Konfirmační cílená enzymatická a molekulárně genetická vyšetření se provádějí pouze po předchozí dohodě se specializovanou laboratoří. Vyšetření tkání probíhá též jen po předchozí dohodě. Nejčastěji jsou odebírány vzorky krve (krevní nátěr), kostní dřeně (nátěr kostní dřeně), kůže (i pro kultivaci fibroblastů), jater nebo svalu, vzácněji i myokardu, spojivky nebo jiných tkání. Biopsie jako invazívní výkon by měla být provedena až po důkladném diferenciálně diagnostickém rozboru, vyčerpání neinvazívních vyšetření a po konzultaci s laboratoří, kde bude bioptický vzorek vyšetřován. ( Jen tak je možné se vyvarovat opakovaným biopsiím.) Indikací k biopsii/autopsii je kožní biopsie/autopsie pro kultivaci fibroblastů (odběr a transport v kultivačním médiu nebo v nouzi ve sterilním fyziologickém roztoku), získání materiálu pro enzymatické vyšetření (není-li možné či spolehlivé vyšetření z buněk periferní krve), histologické, histochemické a elektronmikroskopické vyšetření (je-li nutné pro diagnostiku), molekulárně genetické vyšetření (mitochondriální poruchy, jaderné geny, není-li možné či spolehlivé vyšetření z buněk periferní krve), biopsie choria nebo odběr plodové vody pro prenatální diagnostiku DMP a též postmortální odběr vzorků tkání (autopsie) je nezbytný při podezření na DMP u náhlého, neočekávaného nebo neodvratitelného úmrtí. Základní podmínkou pro kvalitní vyšetření vzorku tkání je správné zpracování vzorku po odběru a jeho správný transport do laboratoře Možnosti léčby a prevence DMP V souvislosti s rozvojem poznání se neustále rozšiřuje počet úspěšně léčitelných dědičných metabolických poruch. Nějaká forma léčebného zásahu je dnes možná u zhruba jen jedné třetiny pacientů s DMP, u řady dalších DMP je léčba ve fázi výzkumu. Tento poměrně vysoký podíl onemocnění bez možnosti kauzální léčby je dán tím, že u těchto defektů i přes znalosti klinických projevů a molekulárně genetických příčin není dosud známa patogeneze. K eliminaci toxických produktů v akutní fázi DMP se používá hemodialýza nebo hemodiafiltrace. K dlouhodobému udržení metabolické kompenzace u poruch metabolismu aminokyselin je používána dietoterapie se sníženým přívodem bílkovin suplementovaná směsí vybraných esenciálních aminokyselin dietním preparátem. U poruch beta-oxidace mastných kyselin se doporučuje frekventní strava s omezeným obsahem tuků, naopak u poruch pyruvátdehydrogenázy se používá dieta s omezeným obsahem cukrů. V terapii některých DMP se uplatňuje podávání vysokých dávek specifických vitaminů nebo farmakologických chaperonů ke stabilizaci mutantních enzymů. Část pacientů s lysosomálním onemocněním reaguje příznivě na parenterální podávání rekombinantního enzymu, v léčbě dalších lysosomálních poruch se uplatňuje transplantace hematopoetickými kmenovými buňkami nebo orgánová transplantace jater, ledvin či srdce. Efektivita léčby je u jednotlivých pacientů i onemocnění rozdílná, účinná léčba s minimálními vedlejšími efekty umožňuje pacientovi normální život (např.podávání vitaminů u vitaminsensitivních DMP). KAPITOLA

395 Dědičné poruchy metabolismu- laboratorní diagnostika U řady pacientů s DMP malých molekul se po stránce terapeutické uplatňuje dietní omezení látek, které pacient neumí zpracovávat či zvýšený přívod látky, kterou pacient neumí v těle produkovat. Někteří pacienti mohou příznivě reagovat na podávání vitaminů, které působí jako kofaktory enzymatických reakcí. V akutní atace nemoci je život zachraňující metodou eleminační léčba pomocí hemodialýzy nebo hemodiafiltrace.vzhledem ke genetické příčině DMP není primární prevence u postiženého jedince možná. Velký význam však má prevence sekundární, která spočívá ve včasné diagnostice konkrétního typu onemocnění se včasně zahájenou léčbou (pokud je dostupná). Klasickým příkladem úspěšné sekundární prevence jsou novorozenecké screeningové programy. S výjimkou nemocí s mitochondriální dědičností je naprostá většina DMP diagnostikovatelná v rizikových rodinách prenatálním vyšetřením, v blízké budoucnosti lze očekávat i rozvoj preimplantační diagnostiky. KAPITOLA 32 Literatura: 1. Fernandes, J., et al. Diagnostika a léčba dědičných metabolických poruch. 4.vydání. Praha : Triton, ISBN Hoffmann, G. F., et al. Dědičné metabolické poruchy. 1.vydání, Praha : Grada, ISBN Kožich V. Dědičné metabolické poruchy v praxi praktického lékaře. Bulletin Sdružení praktických lékařů ČR, 2010, roč. 20, č. 3, s ISSN: Kožich V a Šťastná S. Laboratorní vyšetření dědičných metabolických poruch. In: Průša R. (ed.) Průvodce laboratorními nálezy. ISSN , Raabe, srpen 2010, C 2.9, s Nyhan, W.L., Barshop, B.A., Ozand, P.T. (Eds): Atlas of Metabolic Diseases, 2nd ed. London, Hodder Arnold, ISBN (v angličtině) 6. Šebesta I, Zeman J. Laboratorní diagnostika dědičných poruch metabolismu v T.Zima, Laboratorní diagnostika, kapitola 34, str , druhé, doplněné a přepracované vydání,2007, Galén, Karolinum, Praha. 7. Šťastná S, Mašková V et al. Metabolická příručka 2010, Všeobecná fakultní nemocnice Praha 2010, 70 s. ISBN Šťastná S et al. Přehled vyšetření metabolitů pro diagnostiku dědičných metabolických poruch, Reproservis Praha 2008, 92 s. ISBN Internetové zdroje informací Webový portál pro novorozenecký screening: Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi: Lékařské repetitorium online: heslo Dědičné metabolické poruchy Databáze DMP : 395

396 Laboratorní vyšetření u urolitiázy Laboratorní vyšetření u urolitiázy Autor: RNDr. Jiří Zadina, CSc. Recenzenti: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Licence: KAPITOLA 33 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Charakteristika močových konkrementů Urolitiáza představuje onemocnění, které je charakterizováno tvorbou konkrementů v ledvinách a močových cestách. Na vznik konkrementů mají podstatný vliv biochemické a fyziologické faktory (dlouhodobě nedostatečný přívod tekutin, složení stravy), faktory genetické zejména u mladých jedinců, v řadě případů je tvorba močových kamenů ovlivněna infekcí močových cest nebo některými onemocněními (hyperparatyreóza, nádorová onemocnění). Proces litogeneze je výsledkem interakce řady faktorů: vysoká koncentrace kamenotvorných látek v moči: hyperkalciurie, hyperaxalurie, hyperurikosurie, hyperfosfaturie, cystinurie přítomnost organických složek vytvářejících krystalizační jádra ph moči koncentrace inhibitorů litogeneze: především hořčík a citrát Látky, které se vyskytují v močových konkrementech jsou uvedeny v tab. 1. Vzhledem ke krystalické povaze konkrementů se používá mineralogické názvosloví. sloučenina: kyselina močová kyselina močová. 2H 2 O urát amonný urát sodný. H 2 O šťavelan vápenatý. H 2 O šťavelan vápenatý. 2H 2 O fosforečnan vápenatý (čistý) fosforečnan vápenatý (struktura apatitu) karbonátapatit hydrofosforečnan vápenatý. 2H 2 O fosforečnan hořečnato-amonný. 6H 2 O bílkovina xanthin cystin 2,8-dihydroxyadenin artefakt / podvrh neznámého původu mineralogický název: uricit whewellit weddellit whitlockit apatit dahllit brushit struvit Tabulka 33.1 Složky močových konkrementů a jejich mineralogické názvy 396

397 Laboratorní vyšetření u urolitiázy Močové konkrementy se většinou vyskytují ve formě směsi. Převažují konkrementy dvousložkové, kterých je okolo 50 %, méně je konkrementů jednosložkových (asi 30 %) a třísložkových (zhruba 20 %). Močové konkrementy třídíme do několika skupin: kalciumoxalátové konkrementy jsou nejčastějším typem konkrementů (v naší populaci okolo 60 %). Jsou tvořeny směsí whewellitu a weddellitu (40 %), samotným whewellitem (15 %) nebo směsí oxalátu a kyseliny močové (5 %). Mezi příčiny jejich tvorby patří hyperkalciurie, hyperoxalurie, hyperurikemie, hyperurikosurie, hypocitraturie a primární hyperparatyreóza. kalciumfosfátové konkrementy (asi 10%) se většinou vyskytují v kombinaci apatitu s oxaláty Čisté apatitové nebo brushitové konkrementy se vyskytují ojediněle. Příčinou tvorby těchto kamenů může být hyperkalciurie, hyperfosfaturie, primární hyperparatyreóza nebo renální tubulární acidóza. urátové konkrementy (zhruba 15 %) jsou složeny především z kyseliny močové (anhydrid a dihydrát), vzácně se vyskytují další uráty. Jsou důsledkem hyperurikemie a hyperurikosurie, nízké diurézy a kyselého ph moči. infekční konkrementy (okolo 15 %) jsou tvořeny struvitem, dahllitem a ojediněle urátem amonným. Vyskytují se u vleklých infekcí močových cest způsobených bakteriemi štěpícími močovinu a s tím spojenou alkalizací moči. cystinové konkrementy (méně než 1 %) se vyskytují u homozygotních pacientů s cystinurií. Cystin krystalizuje zejména v kyselé moči. zastoupení jednotlivých typů litiázy se liší v různých geografických oblastech. Podobně jako u nás jsou v Německu převažujícím typem kalciumoxalátové konkrementy, proti tomu ve Francii, Švédsku a USA jsou nejvíce rozšířeny kalciumfosfátové konkrementy. KAPITOLA 33 Laboratorní diagnostika při urolitiáze Biochemická vyšetření jsou zaměřena na vyhledávání rizikových faktorů tvorby konkrementů, dále slouží ke sledování lékové a dietní terapie a stanovení rizika recidiv. V séru jsou vyšetřovány tyto analyty: Ca, Mg, anorganický fosfát a kyselina močová. Prvním krokem vyšetření moči je hodnocení močového sedimentu a moče chemicky. Kvantitativní analýza odpadů v moči zahrnuje tyto analyty: Ca, Mg, anorganický fosfát, kyselinu močovou, kreatinin, oxalát, případně citrát. Vzorky moči pro analýzu Ca, fosfátů, oxalátů a citrátů je třeba okyselit přidáním HCl, aby nedošlo k vysrážení solí a tím k nesprávně nižším nebo negativním nálezům. Ze stejných důvodů je nutno alkalizovat vzorky moči určené ke stanovení kyseliny močové. Podle typu zjištěné poruchy se provádějí další speciální vyšetření na hyperparatyreózu, na renální tubulární acidózu nebo zátěžový test na rozlišení hyperkalciurií. Analýza močových konkrementů Pro zjištění metabolického podkladu urolitiázy je důležitá znalost složení konkrementu. Dříve používané metody chemické analýzy byly nahrazeny přesnějšími fyzikálními metodami - infračervenou spektroskopií, rentgenovou difrakcí a polarizační mikroskopií. Vyšetření v polarizačním mikroskopu je založeno na rozdílných optických vlastnostech různých krystalických látek v polarizovaném světle. Metodou infračervené spektroskopie se identifikují sloučeniny podle spekter, která se kvantitativně vyhodnocují porovnáváním s knihovnou známých spekter močových konkrementů za pomoci počítačového programu. K analýze stačí velmi malé množství konkrementu (30 mg). Přesnost stanoveni je zatížena chybou přibližně 10%, přitom analytická chyba 10 15% je mimo klinickou závažnost. V odůvodněných případech je třeba analyzovat jednotlivé vrstvy konkrementu, aby bylo možno objasnit genezi konkrementu. 397

398 Laboratorní vyšetření u urolitiázy Kazuistiky kazuistika 1 Pacientka, 61letá žena, dlouhodobě hospitalizovaná na LDN s anamnézou etylické encefalopatie, polyneuropatie a hepatomegalie; inkontinentní. Gynekologické vyšetření indikované pro výtok prokázalo, že se jedná o výtok primárně urologické etiologie. Pacientka nalezla ráno v posteli předmět velikosti a tvaru malého slepičího vejce, který byl odeslán na biochemické oddělení k vyšetření močového konkrementu. Výsledek vyšetření: Močový konkrement šedobílé barvy, hladký povrch, oválný tvar, velikost 47 x 36 x 29 mm, tvrdost značná. Celkové složení: struvit 100 %. Hodnocení: Jedná se o močový konkrement infekčního původu, který byl lokalizován v močovém měchýři. Ochablost svěrače a močové trubice umožnily samovolný průchod a vypuzení předmětu značné velikosti. Vzhledem k anamnéze a nepohyblivosti se u pacientky neprojevovaly potíže. KAPITOLA 33 kazuistika 2 Pacient, 57letý muž, první nález cystinového konkrementu ve 23 letech v pravé ledvině, kámen byl odstraněn operativně pyelolitotomií. Později recidiva konkrementu vlevo, ale pacient nešel na operaci, ani neměl zavedenou metafylaxi litiázy. V současnosti komplikovaná odlitková litiáza vlevo. Pacient absolvoval opakované perkutánní extrakce konkrementu. Odstraněné konkrementy byly analyzovány na biochemickém oddělení. Výsledek vyšetření: 1. analýza: Velké množství podobných kousků světle hnědé barvy, mírně krystalický povrch, nepravidelný tvar, velikost od 10 x 8 x 3 do 5 x 4 x 2 mm, tvrdost značná. Celkové složení: dahllit 80 %, whitlockit 20 %. 2. konkrement: Velký počet kousků světle hnědé barvy, místy krystalický povrch, nepravidelný tvar, velikost od 10 x 7 x 7 do 3 x 3 x 3 mm, tvrdost střední. V polarizačním mikroskopu jasně patrné jednotlivé krystaly cystinu. Celkové složení: dahllit 40 %, whitlockit 30 %, cystin 30 %. Hodnocení: Cystinová metabolicky podmíněná litiáza. Při nedodržování vhodného dietního a pitného režimu došlo k recidivě, kdy rezidua cystinových krystalků byla zárodkem pro krystalizaci dalších složek Na tvorbě konkrementu se podílela též přítomnost infekce. Při prvním instrumentálním zásahu se nepodařilo odstranit oblast s cystinovými krystaly, takže cystin nemohl být detekován. kazuistika 3 Pacientka, 63 letá žena, silně obézní. Mnohaleté potíže s urolitiázou, první konkrement byl diagnostikován v levé ledvině před 15 lety. Opakovaně absolvovala litotrypse extrakorporální rázovou vlnou. Pacientka je v dlouhodobé péči na metabolické jednotce pro urolitiázu, dodržuje metafylaxi, má dostatek pohybu, ale přejídá se. Výsledek vyšetření: Hodnoceno 5 fragmentů, které odpovídají původně oválnému konkrementu o velikosti cca 14 x 9 x 8 mm, který byl zřetelně vrstevnatý. Pomocí polarizačního mikroskopu byly analyzovány jednotlivé vrstvy: a) jádro: 5 x 4 x 3 mm, šedo-oranžové, složení uricit (možná s příměsí whewellitu nelze rozlišit) b) střední vrstva: cca 2 3 mm, tmavě hnědá až černá, po rozdrcení oranžová, značná tvrdost, složení whewellit 398

399 Laboratorní vyšetření u urolitiázy c) obal: cca 1 mm, oranžový, tvrdost nízká, složení uricit Celkové složení: whewellit 50 %, uricit 50 % (vyjadřuje průměrné zastoupení v celém konkrementu). Hodnocení: Oxalátový konkrement vzniklý přesycením moče litogenními látkami následkem nadměrného přívodu potravou, což potvrzují výsledky doplňujících biochemických vyšetření: Sérum glykemie 7,0 mmol/l, ostatní analyty vyhovují. KAPITOLA 33 Moč diuréza 1840 ml/d, ph 5,1, hyperkalciurie 9,35 mmol/d (norma do 7,2), hypernatriurie 364 mmol/d (norma do 220), vyšší odpady chloridů 381 mmol/d (norma do 270), mírná hyperoxalurie 546 umol/d (norma do 500), přitom korigovaná clearance kreatininu 1,86 ml/s/1,73 m2 je v normě. Podrobná analýza jednotlivých vrstev může přispět objasnění vzniku a průběhu tvorby konkrementu, zde pravděpodobně odráží změny dietních zvyklostí pacientky. Kontrolní otázky: (správné odpovědi) 1. Název whewellit se používá pro močový konkrement, který má složení: a. šťavelan vápenátý. 2H 2 O b. hydrofosforečnan vápenatý. 2H 2 O c. šťavelan vápenatý. H 2 O d. fosforečnan hořečnato-amonný. 6H 2 O 2. Jaké ph moči převažuje při tvorbě fosfátových konkrementů: a. ph 5 b. ph 6 c. ph 7 d. ph 8 3. Infekce močových cest vede k tvorbě infekčních konkrementů. Mezi které zařazujeme: a. struvit b. bruslit c. karbonátapatit d. weddellit 399

400 Laboratorní vyšetření v těhotenství Laboratorní vyšetření v těhotenství Autorka: Ing. Drahomíra Springer, Ph.D. Recenzent: prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. Licence: KAPITOLA 34 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Prenatální diagnostika se stává v posledních letech samozřejmou součástí péče o těhotnou ženu. Tato skutečnost je ale významná nejen z hlediska jednotlivců, ale i z pohledu celé společnosti v oblasti ekonomických a sociálních dopadů. Je v zájmu rodičů, ale i odborné veřejnosti, aby byli o možnostech nejrůznějších preventivních programů dobře informováni a na základě těchto informací si uvědomovali, co jim může dnešní medicína nabídnout a také aby se dokázali alespoň v základních principech preventivní péče orientovat. Prenatální diagnostika zahrnuje celou řadu vyšetření, prováděných za účelem odhalení možných vývojových vad dosud nenarozeného lidského jedince. Tato diagnostika je mezioborovou spoluprací odborníků z oborů lékařské genetiky, gynekologie a porodnictví, ultrazvukové diagnostiky, klinické biochemie a dalších. Laboratorní vyšetření v těhotenství Těhotná žena je přijata do poradenské péče, která je organizována v rámci praxe jejího ošetřujícího gynekologa. Prováděná vyšetření jsou dána zdravotním stavem těhotné, délkou těhotenství a musí splňovat nepodkročitelné minimum přijatého odborného doporučení. Česká gynekologicko-porodnická společnost ČLS JEP má definovánu základní frekvenci kontrol a rozsahu péče u žen s fyziologicky probíhajícím těhotenstvím. Z anamnestických údajů a aktuálního klinického nálezu je těhotenství ohodnoceno stupněm rizika pro těhotnou nebo vyvíjející se plod a frekvence i typy vyšetření se tomu přizpůsobují. Rodinná zátěž diabetem, vrozené vady vyskytující se v rodině, předchozí výsledek těhotenství, vysoký krevní tlak a podobně mohou naznačit možná budoucí rizika pro těhotenství, která je třeba sledovat. Některá vyšetření se provádějí při každé návštěvě v těhotenské poradně měření krevního tlaku, detekce vitality plodu, chemická analýza moči apod. Další vyšetření se označují jako nepravidelná, provádí se v určeném týdnu těhotenství a spadají sem vyšetření krevní skupiny, RhD nebo sérologická vyšetření specifických protilátek. Frekvence a typ vyšetření jsou uvedeny v tabulce. č.1. Screening gestační cukrovky (GDM), která je spojena s perinatálními krátkodobými i dlouhodobými komplikacemi, se provádí podle přijatého schématu u všech zdravých těhotných mezi týdnem těhotenství, a to provedením orálního glukózo tolerančního testu (ogtt). Podle Doporučení ČDS a ČSKB se používá zátěže 75 g glukózy a hodnotí se koncentrace glukózy v plazmě před zátěží a po dvou hodinách po zátěži. Gestační diabetes je laboratorně diagnostikován, je-li hladina plazmatické glukózy opakovaně FPG 5,6 mmol/l nebo po 2 hodinách po zátěži 7,7 mmol/l. Týden těhotenství Doporučené laboratorní testy Krevní skupina, RhD, krevní obraz, screening nepravidelných antierytrocytárních Ab, HBsAg, HIV, syfilis, glykémie na lačno. Vhodné je i vyšetření ft4, TSH, antitpo Screening VVV v 1.trimestru (PAPP-A, free β hcg, NT) Screening VVV ve 2.trimestru (AFP, hcg, ue3) 24 Screening gestační DM 28 screening nepravidelných antierytrocytárních Ab u Rh neg. žen, krevní obraz, protilátky proti syfilis Detekce vaginální infekce Tabulka 34.1 Přehled prováděných laboratorních testů dle týdne těhotenství 400

401 Laboratorní vyšetření v těhotenství Mezi nepravidelná vyšetření patří i vyšetřování rizika postižení plodu vrozenou vývojovou vadou (VVV). Podmínky pro provádění screeningu a jeho rozsah Zásadním požadavkem, při vyšetřování vrozených vývojových vad, je pochopení rozdílu mezi screeningem a diagnostickým testem. Screeningová vyšetření jsou vždy statistickým modelem a jsou určena k odlišení části vyšetřovaných, která má zvýšené riziko výskytu VVV plodu, diagnostický test pak definitivně určí, který plod je postižen vývojovou vadou a kterou. Pozitivní výsledek screeningu tedy není v žádném případě roven přítomnosti VVV. Podmínkou provedení screeningového testu je informovaný souhlas s prováděným vyšetřením, těhotná by měla přijmout možnost falešné pozitivity i negativity testu. Vyšetření ultrazvukových parametrů provádí certifikovaný odborník na odpovídajícím přístroji. Odběry krve jsou plánovány podle ultrazvukově zjištěné délky gravidity a biochemické markery stanovuje laboratoř, která se může prokázat účastí v externí kontrole kvality pro stanovované markery. Pro stanovení rizika se užívá vhodný a validovaný software. Předpokladem je návaznost screeningového centra na pracoviště lékařské genetiky a fetální medicíny. KAPITOLA 34 Ve spolupráci odborných společností genetické, biochemické, imunoanalytické a gynekologické vzniklo roku 2002 Doporučení o laboratorním screeningu vrozených vývojových vad v prvním a druhém trimestru těhotenství, které prochází pravidelně aktualizacemi a které je k dispozici nejen pro laboratoře na webu ČSKB ČLS JEP. Při screeningovém vyšetření v 1. a 2. trimestru se používají biochemické metody pro výpočet rizika postižení plodu trizomií 21. chromozomu Downovým syndromem. Pro tuto vadu je jasně definováno riziko v populaci i falešná pozitivita (FP) a výtěžnost (DR) jednotlivých screeningových postupů. Zároveň je možné ze stanovených hladin biochemických markerů odhadnout i riziko postižení plodu dalšími chromozomálními vadami (trizomie 18. chromozomu - Edwardsův syndrom nebo trizomie 13. chromozomu - Pataův syndrom), defekty neurální trubice, rozštěpy břišní stěny, případně vadami metabolismu (Smith-Lemli-Opitzův syndrom - vada metabolismu cholesterolu). Ultrazvukové metody se pak užívají pro zásadní vyšetření šíjového projasnění plodu (NT) v 1. trimestru, ve 20. týdnu těhotenství se pak provádí podrobné vyšetření morfologie plodu. Nejčastější vrozené vady Nejčastější vady, které lze pomocí prenatálního biochemického screeningu ve spojení se specializovaným ultrazvukovým vyšetřením odhalit, jsou vady chromozomální nebo rozštěpové defekty plodu. Chromozomální vady Chromozomální odchylky (aberace) jsou způsobené chyběním nebo přebýváním části chromozomu (případně celého chromozomu, nebo dokonce více chromozomů). Člověk má v každé buňce kompletní genetickou výbavu 46 chromozomů. Z nich je 44 tzv. somatických chromozomů a dva tzv. pohlavní chromozomy X a Y, které se podílejí na určení pohlaví člověka. Žena má dva X chromozomy (46,XX), muž má jeden X a jeden Y chromozom (46,XY). Chyba v počtu chromozomů znamená pro jedince vždy závažné problémy. Většina těchto onemocnění není spojena s rodinným výskytem a vzniká zcela náhodně. Aberace somatických chromozomů Downův syndrom Jednou z nejčastějších a nejznámějších chromozomálních aberací je tzv. Downův syndrom (ve starší literatuře mongolismus). Popsán byl poprvé už v roce 1866 J.L.H. Downem, po kterém byl později pojmenován. Jedná se o charakteristickou tělesnou a duševní poruchu způsobenou trizomií 21. chromozomu. Karyotyp u takového dítěte je 47, XX, + 21 nebo 47, XY,

402 Laboratorní vyšetření v těhotenství KAPITOLA 34 Obrázek 34.1 Karyotyp Downův syndrom Incidence Downova syndromu v naší populaci je asi 1: živě narozených dětí. Těhotenství je většinou bez komplikací, děti se rodí donošené s normální porodní váhou. Jedinci s Downovým syndromem mají malou zavalitou postavu (konečná výška je cm), IQ 25-50, přičemž variabilita dovedností je velká, jsou sociálně adaptabilní, muzikální, většinou velmi přátelští. Typický je vzhled obličeje, krátké prsty, opičí rýhy na rukou. Třetina dětí má srdeční vadu, poruchy funkce štítné žlázy a některé další vrozené vývojové vady. Ditě s Downovým syndromem se může narodit každé rodičce, nicméně riziko jeho narození se zvyšuje se stoupajícím věkem matky. Věk v termínu porodu Riziko DS v termínu (1:n) Tabulka 34.2 Riziko vývoje plodu s Downovým syndromem v závislosti na věku matky Edwardsův syndrom Edwardsův syndrom je způsobený nadpočetným 18. chromozomem. Jedná se o těžký malformační syndrom. Těhotenství bývá komplikováno zaostáváním růstu plodu, častá je i intrauterinní smrt. Prognóza pro život je špatná, většina dětí umírá v novorozeneckém věku, jen asi 12 % přežívá kojenecký věk. Patauův syndrom Těžký malformační syndrom způsobený nadpočetným 13. chromozomem. Těhotenství často končí samovolným potratem nebo předčasným porodem. Více než 90 % dětí umírá do jednoho roku. Ostatní chromozomální aberace somatických chromozomů jsou vzácnější. Léčba je vždy pouze symptomatická, již vzniklou chromozomální aberaci vyléčit nelze. 402

403 Laboratorní vyšetření v těhotenství Aberace pohlavních chromozomů Aberace pohlavních chromozomů, které mají vliv zejména na vývoj pohlavních orgánů, jsou poměrně časté, nemusí být ale nijak fenotypicky výrazné. Klinefelterův syndrom Klinefelterovým syndromem je postižen muž s nadpočetným X chromozomem (47,XXY). Vyskytuje se u 1 chlapce z 670 novorozenců mužského pohlaví. Puberta je opožděná, bývá přítomen hypogenitalismus, prakticky vždy se vyskytuje aspermie, tzn. sterilita, gynekomastie a ženské rozložení tuku, typické jsou dlouhé dolní končetiny. Turnerův syndrom Žena trpící Turnerovým syndromem má pouze jeden X chromozom (45,X). Postižení se vyskytuje u 1 dívky z 2000 novorozenců ženského pohlaví. Novorozenec se rodí v termínu, v dětství je patrný trojúhelníkovitý obličej, pokles víček a vadný skus, nedochází k rozvoji puberty. Maximální výška v dospělosti je cm, IQ je většinou normální. KAPITOLA 34 Defekty plodu nekryté kůží Porucha uzávěru nervové trubice (rozštěp páteře) vzniká nedokonalým uzavřením páteřního kanálu v časných fázích vývoje embrya. Tato vada se může vyskytnout v kterémkoliv místě páteře, pokud postihne hlavovou část, vzniká tzv. anencefalus (téměř úplné chybění mozku a lebního krytu). Rozštěp břišní stěny může být dvojího typu: omfalokéla, kdy břišní orgány embrya nejsou uloženy správně v dutině břišní, ale zůstávají ve vaku v místě úponu pupečníku nebo gastroschíza, která vzniká vytvořením štěrbiny v již vytvořené břišní stěně, kterou mohou vyhřeznout břišní orgány. Screening vrozených vad Neinvazivní metody Vyšetřování pomocí neinvazivních metod zahrnuje vyšetření odebrané krve pomocí imunoanalytických metod nebo vyšetření pomocí ultrazvuku. U každého screeningového systému jsou uváděné základní parametry: senzitivita (záchyt postižených těhotenství) a falešná pozitivita (procento nesprávně označených zdravých plodů jako pozitivní). Cílem je stav, kdy bude prováděn screening s maximální možnou dosažitelnou senzitivitou (> 90% ) a minimální falešnou pozitivitou (3 4 %). Imunoanalytické metody Odběr krve ke stanovení markerů screeningu lze provést i v průběhu dne, u stanovovaných látek je diurnální variabilita minimální. Požadavek odběru krve na lačno je opodstatněn pouze v případě užívání radioimunoanalýzy, kdy chylozita séra může ovlivnit precipitaci komplexu antigen protilátka. Stanovení je prováděno v séru nebo v plazmě imunochemickými metodami, jejichž reprodukovatelnost je zásadním požadavkem provádění screeningu. Využívají se metody luminiscenční, radioimunoanalytické nebo fluorescenční, metody enzymoimunoanalýzy nejsou pro svoji nedostatečnou přesnost doporučovány. Screening v 1. trimestru těhotenství V posledních 10 letech dochází k postupnému rozvoji screeningu v 1. trimestru těhotenství. Nejčastěji prováděný způsob je označován jako kombinovaný test. Spočívá ve společném vyhodnocení výsledků biochemického vyšetření (PAPP-A, resp. volné beta podjednotky hcg) a ultrazvukového vyšetření. Vyšetření se provádí v týdnu těhotenství. Tento způsob má krom výhody časnější odpovědi i vyšší senzitivitu (asi 85%) při falešné pozitivitě kolem 4-5%. Prvotrimestrální screening lze doporučit ženám, které chtějí mít včasný výsledek a nechtějí se účastnit druhotrimestrálního testu. Výhodou kombinovaného testu je vysoká spolehlivost spojená s minimálním rizikem pro těhotnou, přesné určení stáří těhotenství, samostatné vyhodnocení u vícečetného těhotenství, stanovení termínu porodu i časné odhalení větších malformací plodu. Snížená hladina PAPP-A upozorní na možné ohrožení plodu a to jak chromozomální odchylkou, tak i hrozícím potratem. Biochemické markery pro screening v 1. trimestru PAPP-A 403

404 Laboratorní vyšetření v těhotenství Patří do skupiny tzv. Pregnancy Associated Plasma Proteins, které byly imunochemicky detekovány v séru těhotných. Celkově existují 4 typy těchto proteinů: A - metaloproteináza závislá na Zn, její úloha je štěpení IGFBP, které mají roli při regulaci lokálních proliferačních reakcí. Štěpení IGFBP vede k aktivaci IGF. B - jeho funkce zatím není známá C - SP1 protein, dříve využívaný ve screeningu, umožňoval přesnější dataci délky těhotenství. D - lidský placentární laktogen (hpl) KAPITOLA 34 Nejvyšší koncentrace PAPP-A je na konci těhotenství, po porodu okamžitě klesá, biologický poločas rozpadu je 3-4 dny. Jeho hladina je snížena u většiny chromozomálních aberací, u Downova syndromu je snížen jen v 1. trimestru. Velmi nízké hladiny PAPP-A se najdou u ohrožených těhotenství, která končí spontánním abortem. Volná β podjednotka hcg Ve screeningu v 1. trimestru je požíváno měření volné β podjednotky choriového gonadotropinu. Je to problematický marker, co se preanalytiky týká, pro správné stanovení se musí materiál rychle v chladu transportovat do laboratoře, nejlépe ihned separovat sérum. Stabilita v séru nebo plazmě je maximálně 6 hodin při +20 až 25 C nebo 1 den při +4 až 8 C. V případě zmražení na -20 C je stabilita volné β hcg 1 rok. Screening ve 2. trimestru těhotenství Ve druhé polovině 80. let se zjistilo, že matky, které nosí plod s Downovým syndromem, mají odchylné hodnoty některých látek v krvi. Jde především o alfa 1 fetoprotein (AFP), který je asi o 25% snížen proti obvyklé střední hodnotě a lidský choriový gonadotropin (hcg), který bývá téměř dvakrát vyšší. Screening Downova syndromu u matek ve 2. trimestru těhotenství se provádí v České republice od počátku 90. let minulého století, je dostupný každé těhotné a je placen z všeobecného pojištění. Vlastní provedení je organizačně velmi jednoduché a spočívá v odběru krve ve 2. trimestru těhotenství (nejlépe v týdnu) a vyšetření dvou nebo tří biochemických parametrů: AFP, hcg resp. volného estriolu (ue3). Tento test, který bývá také označován jako double resp. triple test, je vyhodnocen pomocí sofistikovaného počítačového programu, který k výpočtu individuálního rizika pro každou těhotnou vyžaduje navíc věk těhotné, její hmotnost a délku těhotenství určenou UZ. Výsledkem je pravděpodobnost vyjádřená poměrem 1 : X. a existuje hranice (zpravidla 1: ), od které výsledky považujeme za pozitivní. Kontrola všech výsledků (i negativních) genetikem je samozřejmou součástí vyšetření. Tento způsob screeningu má senzitivitu kolem 65-70% a falešnou pozitivitu asi 6-7%. Každé těhotné s pozitivním výsledkem screeningu je nabídnut invazivní diagnostický postup, odběr plodové vody nebo choriových klků, který po kultivaci odebraného materiálu jednoznačně určí karyotyp plodu. Z dnešního pohledu rozvíjející se ultrazvukové i genetické diagnostiky se samostatně prováděný screening ve 2. trimestru jeví jako překonaný, ale jeho zachování má svůj význam. Prvním důvodem je skutečnost, že určité procento žen přijde ke gynekologovi později a na časná vyšetření je pozdě. Další důvod souvisí se stanovením AFP, který je jediným biochemickým markerem defektu neurální trubice. Tento defekt je obvykle odhalen ultrazvukovým vyšetřením ve 20. týdnu těhotenství, ale na riziko této vady upozorní AFP měřené v 16. týdnu o měsíc dříve. Nezanedbatelným a snad i hlavním důvodem k zachování vyšetřování ve druhém trimestru je jeho možné začlenění do integrovaného testu. Biochemické markery pro screening ve 2. trimestru AFP (α-1-fetoprotein) AFP je onkofetální glykoprotein, produkovaný v embryonálním žloutkovém vaku a ve fetálních játrech. V séru matky, kam přechází přes placentu, je důležitým ukazatelem fyziologického vývoje těhotenství. Významná je především jeho role transportní, jeho koncentrace je během těhotenství stoupající. Nejvyšší koncentrace AFP v séru matky je kolem 30. týdne těhotenství, po porodu jeho hladina prudce klesá. hcg (lidský choriový gonadotropin) HCG v raném těhotenství stimuluje syntézu progesteronu ve žlutém tělísku. Je to glykoprotein tvořený dvěma rozdílnými podjednotkami: α a β. Podjednotka α je stejná jako u LH, FSH a TSH, jako specifická pro hcg se tedy považuje β podjednotka. Pro hcg je typická strmě stoupající koncentrace v počátku těhotenství, po 10. týdnu začíná hcg naopak klesat. ue3 (nekonjugovaný estriol) Jde o estrogenní hormon produkovaný placentou. Jeho koncentrace vyjadřuje spolupráci plodu s placentou. ue3 je labilní struk- 404

405 Laboratorní vyšetření v těhotenství tura, velmi snadno se rozpadá a při nevhodném transportu nebo skladování může dojít k ovlivnění jeho měřené koncentrace. Vzhledem k dalším problémům při jeho stanovení, jako je vliv lipémie či rozdílná afinita protilátek podle provenience diagnostické soupravy, mnohé laboratoře od jeho stanovování upustily. Právě nízký estriol může výsledek screeningu často změnit v pozitivní, aniž by to bylo způsobeno vrozenou vadou plodu. Nicméně vyšetření volného estriolu může odhalit riziko některých vzácnějších vad: Smith-Lemli-Opitzův syndrom, kde je ue3 velmi nízký, u Edwardsova syndromu jsou nízké všechny tři markery screeningu. Volný estriol upozorní i na poruchu placenty s rizikem komplikací na konci těhotenství. KAPITOLA 34 Obrázek 34.2 Průběh hladin markerů během 2. trimestru: U těhotných s DS se dynamika opožďuje, hcg je vyšší, AFP a ue3 jsou nižší než u zdravé populace. Inhibin Dimerický inhibin-a je čtvrtým markerem, který je ve světě užíván ve screeningu Downova syndromu ve 2. trimestru hovoří se pak o quadruple testu. Inhibin je glykoprotein placentárního původu podobný hcg. Hladiny inhibinu v mateřském séru jsou v týdnu těhotenství poměrně stálé. U plodů postižených Downovým syndromem jsou hladiny inhibinu asi dvojnásobné oproti nepostiženým plodům. V České republice se vyšetření inhibinu běžně neprovádí. Násobky mediánu Vzhledem k tomu, že celý biochemický screening je založen na statistickém hodnocení naměřených parametrů, je nezbytné mít k dispozici základní soubor, se kterým je možné výsledky srovnávat. Každá laboratoř musí mít vyšetřeno minimálně 50 žen v každém posuzovaném týdnu těhotenství ( týden) a z naměřených hodnot stanovit mediány pro každý parametr. Medián je střední hodnota souboru a ve screeningu se užívá proto, že aritmetický průměr zahrnuje i velmi odlehlé hodnoty, se kterými se můžeme setkat a které mohou průměr ovlivnit. Výsledky se pak nevydávají v absolutních číslech, ale v tzv. MoM (multiplies of median násobcích mediánu). MoM je číslo, kterým je třeba násobit příslušný medián, aby vyšla hodnota naměřená v séru těhotné. Pokud je medián pro 16. týden těhotenství např. 30 ku/l a naměřená hodnota je 60 ku/l, je MoM 2,0. Výpočty provádí specializovaný hodnotící software. Použití MoM umožní srovnat i různé metody a v externí kontrole kvality je obvykle požadována nejen hodnota absolutní, ale také MoM. Pro zvýšené riziko riziko výskytu Downova syndromu svědčí, pokud je MoM hcg vyšší než 2,5; MoM AFP nižší než 0,5 u volné β hcg je MoM vyšší než 2,0 a u PAPP-A je MoM nižší než 0,4. Integrovaný, sekvenční test, sérum integrovaný test Další možností při hodnocení rizika vývoje plodu s Downovým syndromem je provádění hodnocení po spojení výsledků vyšet- 405

406 Laboratorní vyšetření v těhotenství ření v 1. a 2. trimestru. Klasický integrovaný test je popsán jako statistické vyhodnocení všech dat - tedy prvotrimestrálního biochemického (PAPP-A, free β hcg) i ultrazvukového (NT) screeningu po provedení druhotrimestrální biochemické (AFP, hcg, ue3) části screeningu. To má své výhody i nevýhody. Nejčastější námitkou je stres pro těhotnou při odkládání zprávy o výsledku. Vhodnou modifikací integrovaného testu je proto sekvenční test, při kterém je v případě vysokého rizika pozitivní výsledek ženě oznámen již po provedení prvotrimestrální části testu. Jde o nález nízké hladiny PAPP-A nebo vysoké NT. Neztrácí se tak výhoda časného výsledku. Těhotné ženě je samozřejmě nabídnuto okamžité invazivní vyšetření nebo vyčkání do 2. trimestru na celkový výsledek testu. Pokud je výsledek kombinovaného testu v 1. trimestru negativní, žena pokračuje biochemickým screeningem ve druhém trimestru a integrací výsledků máme k dispozici screeningový systém, která má nejen senzitivitu vysoce převyšující 90%, ale také velmi nízkou falešnou pozitivitu blížící se 1-2 %. Vzhledem k tomu, že k správnému měření NT je potřeba nejen kvalitní ultrazvukový přístroj, ale zároveň i vyškolený specialista s certifikátem vydaným Fetal Medicine Foundation (FMF) z Londýna, není možné v současné době nabídnout všem ženám kvalitní měření nuchální translucence. Hodnota tohoto parametru má ve výpočetním algoritmu velmi silnou váhu a může značně posunout výsledné riziko. Existuje i možnost provádění sérum integrovaného testu, který zahrnuje v prvním trimestru pouze biochemické vyšetření PAPP-A, případně i free beta hcg. Tento systém je možné s výhodou využít i v místech, kde se provádí svoz vzorků a žena sama nemusí nikam cestovat. Jediným problémem zůstává horší stabilita free β hcg, která se musí řešit striktním dodržováním požadavků preanalytické fáze. Tento test má nejen malou falešnou pozitivitu (5%), u části těhotných s nižším PAPP-A pod 0,35 MoM (jen 2-3 % žen) umožňuje doplnit NT. V případě vysokého rizika (vyšší než 1:30 - asi 1 žena z 200) je možné provést odběr choriových klků (CVS) a následně karyotypizaci. Z výsledků současných velkých světových studií, ale také z praxe některých center v České republice, lze sekvenční formu integrovaného testu považovat za screeningový systém, který na jedné straně splňuje odborné požadavky a na druhé straně dává těhotným ženám vyšší míru jistoty v průběhu sledování jejich těhotenství z pohledu vrozených vývojových vad. KAPITOLA 34 Ultrazvuková diagnostika Zobrazovací metody - jako například ultrazvuk - nejsou invazivní a mohou upozornit na řadu chorob či vad. UZ část vyšetření obsahuje minimálně změření šíjového projasnění u plodu - nuchální translucence (NT). Některé systémy zahrnují i vyšetření přítomnosti nosní kůstky (NB), u plodu postiženého Downovým syndromem není tato kost vidět. Jedná se diskutabilní marker, pokud něco není vidět, neznamená to, že to neexistuje. Pro měření NT musí být ultrazvukista certifikován u FMF a podléhá pravidelnému auditu. Vyšetření nuchálního projasnění, (nuchální translucence -NT) se provádí v týdnu těhotenství. Pomocí ultrazvuku je změřeno nahromadění tekutiny v podkoží v oblasti krku plodu. Přítomnost většího množství tekutiny v tomto prostoru je často spojena s výskytem srdeční vady nebo chromozomální aberace. Asi 70% plodů s Downovým syndromem má významný otok na šíji způsobený nahromaděním tekutiny. Vyšetření je většinou možné provést přes stěnu břišní. Vedle změření šíjového projasnění se provádí i komplexní ultrazvukové vyšetření plodu stanovení četnosti těhotenství, v případě vícečetného těhotenství stanovení chorionicity, ověření resp. korekce datace těhotenství podle CRL, kontrola morfologie plodu. Na velmi dobře vybavených pracovištích, jak po stránce přístrojové, tak personální, je možné provést měření dalších UZ markerů, které mohou senzitivitu výsledku zvýšit. Možnost markerů trizomie 21 nosní kosti, trikuspidální regurgitace, průtoku ductus venosus (ev. dalších) vyžaduje certifikaci a pravidelný audit při obnovování licence pro každý marker (NT, NB, TR, DV) zvlášť. Sonografista je ve screeningu oprávněn použít pouze ty markery, pro něž má platnou licenci. Ultrazvukem lze na konci 1. trimestru vyloučit většinu závažných morfologických vad plodu (kontroluje se na tvar lebky, šířka mozkových komor, obličej plodu, tvar hrudníku a trupu plodu, základní srdeční anatomie, velikost močového měchýře, struktura horních i dolních končetin, uzávěr neurální trubice a přední stěny břišní). V běžné screeningové praxi je tento rozsah ovšem stěží dosažitelný. Prenatální diagnostika běžného těhotenství je ukončena ultrazvukovým vyšetřením ve 20. týdnu těhotenství. Falešná pozitivita při 85% výtěžnosti Výtěžnost při 5% falešné pozitivitě 1. trimestr kombinovaný test 3,8-6,8% 85% PAPP-A, free β hcg + NT 2. trimestr AFP, hcg + ue3 9,3-14 % 69% 406

407 Laboratorní vyšetření v těhotenství integrovaný test PAPP-A (free β hcg) + AFP, hcg (ue3) sérum integrovaný test PAPP-A (free β hcg) + AFP, hcg (ue3) 0,8-1,2% 94% 2,7-5,2% 85% Tabulka 34.3 Srovnání falešné pozitivity a výtěžnosti jednotlivých testů (zdroj: studie SURUSS a FASTER) KAPITOLA 34 Invazivní metody Při pozitivním výsledku screeningu vrozených vad v těhotenství je těhotná informována o možnosti využití invazivních vyšetřovacích technik. Vzorek genetického materiálu plodu pro vyšetření (ať již cytogenetické či molekulárně-genetické), které je mnohdy zcela zásadní a umožňuje potvrdit, nebo vyvrátit podezření na přítomnost chromozomálních vývojových vad plodu, je prozatím třeba získat standardními invazivními metodami. Klasicky používanými metodami jsou amniocentéza (odběr plodové vody), odběr choriových klků (CVS - Chorionic villus sampling) a kordocentéza (punkce pupečníku). Invazivní prenatální diagnostika je prováděna pouze v indikovaných případech pod kontrolou ultrazvuku. Problémem všech invazivních metod je riziko výskytu komplikací, které mohou vést ke spontánnímu potratu a o kterých by měla být těhotná předem informována. Riziko ztráty těhotenství v souvislosti s amniocentézou či odběrem choria je asi 0,5-1 %. Amniocentéza (AMC) Amniocentéza je odběr plodové vody za účelem její chromozomální a biochemické analýzy, obvykle se provádí mezi 15. a 17. týdnem těhotenství. Je to nejběžnější metoda invazivní prenatální diagnostiky v České republice. Tento test se dříve automaticky nabízel ženám starším 35 let, protože od tohoto věku výrazně stoupá riziko genetických vad v populaci (Tabulka 2). Dnes je preferováno stanovisko, že věk je jen jeden z markerů při posuzování rizika postižení plodu. Odběr plodové vody se provádí obvykle přes břišní stěnu těhotné, kdy se pod ultrazvukovou kontrolou do amniového vaku zavádí velmi tenká jehla a odebírá se 20 ml plodové vody. Celkové riziko komplikací spojené s výkonem se odhaduje na 0,5-1,0%. Výsledky kultivace jsou k dispozici do 2 týdnů po odběru, výsledek PCR nebo FISH analýzy je znám do 48 h, čímž se významně snižuje stres těhotné, ale tato vyšetření odhalí jen nejběžnější chromozomální vady, vždy je nutné znát výsledek celkové karyotypizace plodu. Obrázek 34.3 Způsob odběru plodové vody 407

408 Laboratorní vyšetření v těhotenství Odběr choriových klků (CVS) Odběr choriových klků se obvykle provádí mezi 11. a 13. týdnem těhotenství, často v návaznosti na pozitivitu prvotrimestrálního screeningu. Choriové klky jsou součástí placenty. Biopsii je možno provést abdominálně (břišní stěnou) či vaginálně. Riziko potratu v souvislosti s tímto zákrokem je obdobné jako u amniocentézy; do 1%. Cytogenetické metody KAPITOLA 34 Buňky plodu získané amniocentézou nebo odběrem choriových klků jsou podrobeny kultivaci, která odhalí veškeré odchylky počtu a skladby chromozomů. Používá se k vyšetření cystické fibrózy, svalové dystrofie, hemofilie a dalších genetických vad vyskytujících se v rodinné anamnéze. Tímto testem se také bezpečně zjistí pohlaví dítěte. Nové metody genetické analýzy Buňky plodu jsou nejčastěji testovány metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Tato molekulárně cytogenetická technika je vhodná v případě vyšetření aneuploidií embryí, určení pohlaví embryí či zjištění nosičství strukturálních aberací. Fluorescenční in situ hybridizace je založena na principu hybridizace krátké fluorescenčně značené sekvence DNA (tzv. sondy) s odpovídajícími úseky cílové sekvence DNA vyšetřované buňky embrya. Výsledek této hybridizace je odečten za pomocí fluorescenčního mikroskopu. Získáme pak přehled o počtu kopií vybraného úseku DNA, reprezentujícího určitý chromozom, v jádře vyšetřované embryonální buňky. Pro detekci monogenních chorob se využívá molekulárně genetická metoda - tzv. polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR byla vyvinuta v 80. letech minulého století a dnes představuje jednu z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky. V roce 1997 byly publikovány informace o možnosti zachytit volně cirkulující DNA plodu v krvi matky. Testování fragmentů DNA plodu v krvi matky je metoda bezpečná pro plod, která dokáže odhalit celou řadu genetických onemocnění. Objev fetální DNA cirkulující v krvi matky byl zajisté významným přínosem pro prenatální diagnostiku. Klinické využití tohoto objevu však dosud naráží na řadu nepřekonaných překážek. Nejprve bylo třeba dokázat, že v krvi matky se nachází celý genom plodu. V krvi se nachází pouze fragmenty DNA, které jsou navíc obklopeny násobným množstvím fragmentů mateřské DNA. Separace těchto fragmentů se provádí srovnáním s otcovskou DNA. Tímto způsobem je možné vytvořit mapu genomu plodu, který přichází od otce. Těžší je oddělit mateřskou DNA, která tvoří až 90% fragmentů v plazmě, od fetální DNA pocházející od matky. Nicméně existuje rozdíl mezi průměrnou velikostí fragmentů DNA matky a DNA plodu. Vyřešením tohoto problému se otevřela cesta k využití této technologie k neinvazivní diagnostice genetických vad plodu. V této oblasti stále probíhá intenzivní výzkum a stále přicházejí nové, dílčí objevy. Ačkoliv je dosud metoda poměrně finančně náročná, s rozvojem technologií dojde nepochybně k jejímu zlevnění a tedy ke zpřístupnění pro široké spektrum diagnostiky. Závěr Všechny uvedené algoritmy provádění screeningu vrozených vývojových vad jsou v naší republice dostupné, i když ne ve všech regionech stejně. Tento screening je typickým příkladem mezioborové spolupráce, na které se podílí kromě gynekologů i biochemická laboratoř a genetické pracoviště. Jedině jejich dobrou spoluprací a vstřícností, bez preferování té či oné složky, je možné zajistit rychlé a kvalitní vyšetření těhotné. Možnosti stanovení rizika vývojových vad plodu jsou stále dokonalejší, ale se zvyšováním požadavků na kvalitu jednotlivých součástí screeningového procesu se mnohdy stávají hůře dostupnými pro určitou část gravidní populace. Se vzrůstající informovaností těhotných o této problematice by lékaři, ale i ostatní zdravotničtí pracovníci, měli mít přehled, jaké možnosti jsou těhotné k dispozici. Svoji roli hraje také ekonomické hledisko, protože v návaznosti na invazivní procedury (CVS, amniocentéza) se provádí další laboratorní vyšetření, která jsou velmi drahá a jejich nadbytečné provádění na základě nekvalitního screeningu je neefektivní a neekonomické. Postoj společnosti vůči interrupcím se ve 20. století poměrně dramaticky změnil. V jednotlivých státech je ovlivněn tradicemi, kulturou, náboženstvím a historií. Jen těžko je možné tvrdit, že oficiální stanovisko, prezentované přijatou právní úpravou, zastá- 408

409 Laboratorní vyšetření v těhotenství vají všichni obyvatelé dané země. Postoj každého člověka vůči interrupcím bývá silně individuální. Česká republika patří mezi státy s liberální právní úpravou, kde je interrupce dostupná na písemnou žádost těhotné ženy, jejíž těhotenství nepřesáhlo 12 týdnů, pokud provedení zákroku nebrání zdravotní důvody. Svědčí-li pro umělé přerušení těhotenství genetické důvody, lze uměle přerušit těhotenství nejpozději do dosažení dvaceti čtyř týdnů těhotenství. V roce 2010 byla přijata Parlamentním shromážděním Evropské unie Rezoluce č. 1763, která obsahuje i následující principy: 1. Žádná osoba, nemocnice nebo instituce, nesmí být nucena, postihována nebo diskriminována pro odmítavý postoj k interrupcím, euthanasii nebo jinému jednání, jehož důsledkem je usmrcení lidského plodu nebo embrya KAPITOLA Každý má právo na výhradu svědomí, povinností státu je však zaručit přístup každého k lékařské péči v přiměřené časové lhůtě. Kazuistiky Kazuistika 1 Screening v 1.trimestru věk v termínu porodu 31 let UZ v normě, naměřené CRL 53,8 mm odpovídá délce těhotenství 12+1 NT 1,7 mm 1,2 MoM free β hcg 91,8 ng/ml 2,13 MoM PAPP-A 1,53 miu/l 0,58 MoM riziko DS odhadované z věku 1:823 riziko DS (NT+věk+biochemie) 1:919 Závěr screeningu v 1. trimestru byl negativní, i když hcg bylo mírné zvýšené a PAPP-A byl nižší než by se u daného týdne těhotenství předpokládalo. Screening ve 2. trimestru AFP: 29,4 ng/ml 1,02 MoM Total hcg: 146,67 kiu/l 3,93 MoM Délka gestace při odběru dle UZ riziko DS vypočtené z markerů pro 2. trimestr: 1:70 Závěr screeningu ve 2. trimestru byl pozitivní. Hladina hcg byla téměř 4x vyšší než medián pro daný týden těhotenství. Po spojení výsledků vyšetření v 1. a 2. trimestru bylo vyhodnoceno integrované riziko DS: 1:190 Závěr integrovaného testu: Screening pozitivní Byl proveden odběr plodové vody a ze získaného materiálu se pomocí PCR techniky potvrdila trizomie 21. chromozomu. Po kultivaci byla potvrzena přítomnost Downova syndromu u vyšetřovaného plodu. Těhotenství bylo na žádost těhotné ukončeno ve 20. týdnu. Kazuistika 2 Screening v 1. trimestru věk v termínu porodu 35 let, UZ v normě, naměřené CRL 56 mm odpovídá délce těhotenství 12+3 NT 2,1 mm 1,6 MoM 409

410 Laboratorní vyšetření v těhotenství free β hcg 7,6 ng/ml 0,2 MoM PAPP-A 0,1 miu/l 0,15 MoM riziko DS odhadované z věku 1:286 riziko DS (NT+věk+bioch.) 1:14 riziko T18 a T13 1:19 Závěr screeningu v 1. trimestru byl pozitivní, riziko vrozené vývojové vady bylo velmi vysoké i pro další trizomie. Doporučena karyotypizace plodu, za tím účelem byl proveden odběr choriových klků ve 12. týdnu. Kultivací byl potvrzen normální nález 46 XX. Těhotenství přesto skončilo spontánním abortem v 16. týdnu. Bylo to po 4 týdnech od provedení CVS, takže abort nemohl souviset s CVS. Je vhodné sledovat všechna těhoteství s nízkou hladinou PAPP-A, která může ohlašovat blížící se potrat KAPITOLA 34 Kazuistika 3 Kombinovaný test - test v 1. trimestru těhotenství věk v termínu porodu 29 let Ultrazvuk v normě podle CRL 55,0 mm byla délka těhotenství 11+4 NT 1,7 mm 1,2 MoM free β hcg 18,0 ng/ml 0,327 MoM PAPP-A 0,35 miu/l 0,231 MoM riziko DS z věku 1:987 riziko DS (NT+věk+bioch.) 1 : riziko DS (věk+bioch.) 1 : 550 riziko T13 a T18 1 : 150 Závěr vzhledem k nízké naměřené nuchální translucenci byl screening přes vyšší riziko vrozených vad T13 a T18 vyhodnocen jako negativní. Žádné další vyšetření nebylo nabídnuto, ačkoliv biochemické výsledky jsou alarmující. Těhotenství skončilo porodem dítěte s Downovým syndromem v 38. týdnu těhotenství. Nízká hladina free hcg ovlivnila i výpočet rizika. Ne všechny plody postižené trizomií 21. chromozomu mají zvýšenou hodnotu NT, jak plyne i z první kazuistiky. Seznam použité literatury 1. Canick JA, Lambert-Messerlian GM, Palomaki GE, Neveux LM et al: First and Second Trimester Evaluation of Risk (FAS- TER) Trial Research Consortium. Comparison of serum markers in first-trimester down syndrome screening, Obstet Gynecol Nov;108(5): Nicolaides KH, Spencer K, Avgidou K, Faiola S, et al.: Multicenter study of first-trimester screening for trisomy 21 in pregnancies: results and estimation of the potential impact of individual risk-orientated two-stage first-trimester screening. Ultrasound Obstet Gynecol Mar;25(3): Rozenberg P, Bussieres L, Chevret S, Bernard JP et al: Screening for Down Syndrome using first-trimester combined screening followed by second trimester ultrasound examination in an unselected population. Gynecol Obstet Fertil Mar 8; 4. Second International Conference on The Integrated Test in Prenatal Screening for Down Syndrome: Present Practice and Future Prospects, March 30-31,2007, Brown University, Providence, Rhode Island Sborník 5. Wald NJ, Rodeck C, Hackshaw AK, Walter J et al: First and second trimester antenatal screening for Down s syndrome: the results of the serum, urine and ultrasound screening study (SURUSS). 2003, Health Technol Assess 7: Wald N, Rodeck C, Rudnicka A, Hackshaw A: Nuchal translucency and gestational age Prenat Diagn 24: Calda P., Víšková H., Bezdíčková D., Zima T.: Prenatální diagnostika v prvním trimestru gravidity v klinické praxi, Časopis lékařů českých (7), str Stejskal, D., Nedvěd, R, et al.: Integrace prenatálního screeningu Downova syndromu v prvním a druhém trimestru (návrh screeningového protokolu). Čes. Gynek. 67:138,

411 Laboratorní vyšetření v těhotenství 9. Gregor V., Šípek A. (2009) Efektivita prenatální diagnostiky v České republice. Actual Gyn 1: Gregor V., Šípek A., Šípek A. jr. et al. (2009) Prenatální diagnostika chromozomálních aberací Česká republika: Čes. Gynek. 74(1): Lo Y. M. (2005) Recent advances in fetal nucleic acids in maternal plasma. J Histochem Cytochem. 53(3): Lo Y. M., Corbetta N., Chamberlain P. F. et al. (1997) Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 350(9076): Tabor A., Alfirevic Z. (2010) Update on procedure-related risks for prenatal diagnosis techniques. Fetal Diagn Ther. 27(1): Y. M. Dennis Lo, K. C. Allen Chan, Hao Sun, Eric Z. Chen, Peiyong Jiang, Fiona M. F. Lun, Yama W. Zheng, Tak Y. Leung, Tze K. Lau, Charles R. Cantor, and Rossa W. K. Chiu. Maternal Plasma DNA Sequencing Reveals the Genome-Wide Genetic and Mutational Profile of the Fetus.Science Translational Medicine, 2010: Vol. 2, Issue 61, p. 61ra91.DOI: /scitranslmed Česká gynekologicko-porodnická společnost ČLS JEP. Zásady dispenzární péče ve fyziologickém těhotenství, verze 6 ( ) 16. Lojková J. Výhrada svědomí zdravotnických pracovníků v případě provádění interrupcí. Actual Gyn. 2011;3: Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, de Feo E, Heilek G, Burke J and Rava RP: Optimal Detection of Fetal Chromosomal Abnormalities by Massively Parallel DNA Sequencing of Cell-Free Fetal DNA from Maternal Blood. Clin Chem 2011; 57: Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol 2011;204:205.e American College of Obstetricians and Gynecologists. ACOG Committee on Practice Bulletins. ACOG practice bulletin no. 77: screening for fetal chromosomal abnormalities. Obstet Gynecol 2007;109: Down s Syndrome.. Accessed 29. August Frequency of Down syndrome per maternal age Accessed 29. August O'Leary P, Breheny N, Dickinson JE, et al. First-trimester combined screening for Down syndrome and other fetal anomalies. Obstet Gynecol 2006; 107: NICE clinical guideline 62, June 2010, Available at: Accessed 29.August Springer D, Zima T, Arnostová L. Stability of Free β-hcg in the Routine Screening of Down Syndrome in the First Trimester of Pregnancy Prague Medical Report 2008;109: FMF Certification of Biochemical Laboratories Available at: Accessed 29.August American College of Obstetricians and Gynecologists. Diagnosing birth defects (ACOG Patient Education) Apr: Washington, DC, USA : American College of Obstetricians and Gynecologists. Available at: Accessed 29.Juli KAPITOLA

412 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku Autor: Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. Recenzenti: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Licence: KAPITOLA 35 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Metabolické odlišnosti Děti jsou po stránce biochemické a metabolické unikátní skupina, nejedná se o miniatury dospělých. Například novorozenci a nedonošení mají nezralé jaterní, renální a plicní funkce. To také ovlivňuje významně farmakokinetiku podávaných léků. Ve většině případů se jejich referenční meze biochemických a hematologických vyšetření výrazně liší od starších dětí a dospělých. Je nutné také respektovat novorozence podle gestačního věku (zralý a nezralý) a podle porodní hmotnosti (nízká, velmi nízká). Týká se to např. i referenčních mezí pro kreatinin. Postnatální věk Jednotka Gestační věk 28 týdnů Gestační věk 32 týdnů Gestační věk 36 týdnů Gestační věk 40 týdnů S-kreatinin S-kreatinin S-kreatinin S-kreatinin 2 dny umol/l dnů umol/l dnů umol/l dnů umol/l dnů umol/l Tabulka 35.1 Referenční hodnoty sérového kreatininu u novorozenců v závislosti na věku novorozence a gestačním věku V novorozeneckém období je spotřeba kyslíku ml/min/m2 a kg hmotnosti, zatímco u 10 let starého dítěte to je ml/min/m2 a kg hmotnosti. Již tak vysoká srdeční akce a vysoký srdeční výdej jsou limitujícími faktory. Snadné vyčerpání kyslíkové rezervy u novorozenců a kojenců je příčinou rychlého vývoje kardiorespirační insuficience v důsledku vyšší potřeby kyslíku při prochlazení, infekci, stresu, bolesti nebo přímo při plicním či srdečním onemocnění. Mimořádný význam u dětí má monitorování vodní a iontové rovnováhy. Malé děti snadno podléhají dehydrataci vzhledem k relativně velkému kožnímu povrchu (poměr povrch/hmotnost). U nezralých a nedonošených novorozenců je kůže vysoce permeabilní, riziko dehydratace obrovské. Navíc tato skupina díky nezralosti tubulárních renálních funkcí vykazuje mimořádné solné ztráty, neschopnost ledvinami kompenzovat hemokoncentraci způsobenou insenzibilními ztrátami. U dětí do 1 roku věku snadno vzniká metabolická acidóza v důsledku nedostatečně účinné acidifikace moči a nízkého renálního prahu pro reabsorpci bikarbonátu. U dětí je často zjištěna hypoglykemie. Děti mají malé zásoby glykogenu a nezralou glukoneogenetickou kapacitu. Epizody stresu vedou rychle k hypoglykemii. Fyziologická hyperbilirubinemie novorozenců a diferenciální diagnostika patologické hyperbilirubinemie u dětí je běžnou oblastí pediatrické laboratorní diagnostiky. Další oblastí jsou dědičné metabolické poruchy, jejichž diagnostika vyžaduje specializované laboratoře. Novorozenecký screening hypothyreózy, kongenitální adrenální hyperplazie, fenylketonurie a cystické fibrózy je založen na biochemických vyšetřeních z kapky suché krve (stanovení TSH, 17-hydroxyprogesteronu, fenylalaninu a jeho poměru k tyrosinu, imunoreaktivního trypsinogenu). K základním vyšetřením v pediatrické biochemické laboratoři patří také stanovení chloridů jako součást potního testu pomocí pilokarpinové iontoforézy při podezření na cystickou fibrózu. 412

413 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku Nejvíce je pediatrická laboratorní diagnostika charakterizována odlišnostmi danými růstem a vývojem kojenců, odběrem pediatrických biologických vzorků, referenčními mezemi pro dětský věk a výběrem přístrojů a metod ke zpracování velmi malého množství biologického vzorku (5-10 ul/test). Zvláštní požadavky jsou kladeny na monitorování hladin léčiv pro odlišnou farmakokinetiku podávaných léků u dětí. Odběr biologického materiálu u dětí KAPITOLA 35 Odběr krve z vpichu. U mladších dětí a novorozenců je méně traumatizující píchnutí do prstu nebo patičky. Jiný možný, třebaže méně vhodný, je odběr z palce na noze nebo z ušního lalůčku. Laterální nebo mediální část povrchu chodidla nebo patičky jsou preferovaná místa u novorozenců, prsty jsou preferovány u kojenců a mladších dětí. Možnou komplikací vpichu do patičky může být osteomyelitida calcaneu. Riziko poškození calcaneu vpichem je větší u nedonošenců (nezralých novorozenců), protože vzdálenost mezi povrchem kůže a periostem roste až s nabýváním kojence na hmotnosti. Avšak ani u nedonošenců nehrozí poškození perichondria calcaneu, pokud není vpich hlubší než 2,4 mm. Poněvadž vzdálenost od povrchu kůže po perichondrium je menší v zadním zakřivení paty, nedoporučuje se používat toto místo k odběru krve. Obrázek 35.1 Vhodná a nevhodná místa na patičce pro odběr krve ze vpichu Postup pro odběry krevních vzorků u novorozenců a kojenců určených k diagnostickým účelům: Velice důležité je před vpichem kůži zahřát, poněvadž získaná krev je směs krve arteriální, venózní a kapilární a obsahuje také intersticiální a intracelulární tekutinu (platí hlavně pro vzorky určené k analýze krevních plynů). Nejjednodušším způsobem je použít tkaninu např. ručník namočený do horké lázně (38 42 C). Bylo prokázáno, že zahřátím kůže v místě vpichu může vzrůst průtok krve až sedmkrát. Primárně roste průtok krve arteriální. K prevenci nosokomiálních infekcí si musí osoba provádějící odběr odložit veškeré šperky na rukou, umýt si ruce a předloktí až k loketním ohbí a použít nový pár latexových rukavic. Po zahřátí kůže musí být místo odběru očištěno 75% vodným roztokem izopropanolu. Poté je místo nutno osušit sterilní gázou, aby reziduální alkohol nezpůsobil hemolýzu. Betadin bychom neměli používat vůbec, protože může vést k vzestupu koncentrace draselných iontů, fosfátu nebo kyseliny močové ve vzorku. Měla by být použita zkrácená, sterilní lanceta nebo automatické zařízení, které nezpůsobuje vpich hlubší než 2,4 mm. Po výběru místa vpichu a po jeho provedení musí být první kapka krve otřena, protože často obsahuje velké množství tkáňové tekutiny. Po odběru krve z patičky nebo prstu by měla být končetina zdvižena nad úroveň srdce a místo vpichu stlačeno sterilní gázou, dokud se nezastaví krvácení. Nedoporučuje se používat adhezivní bandáže (náplast) pro vysokou citlivost kojenecké kůže. Kromě toho hrozí nebezpečí strhnutí a následné aspirace náplasti. Pata novorozence nebo kojence by měla být uchopena pevně mírným stiskem s umístěním ukazováčku v klenbě nohy a palcem pod místem vpichu na kotníku. Vpich by měl být proveden plynule, opatrným pohybem, kolmo k povrchu kůže. Tlak palce by měl být uvolněn v momentě, kdy se kapky krve formují a odtékají do připravené sběrné nádobky. Měli bychom se vyhnout silnému masírování místa odběru z důvodu možného vzniku hemolýzy nebo vytlačení intersticiální tekutiny do vzorku, což může vést k vzestupu hladiny draselných iontů a hořčíku ve vzorku. Oproti odběru krve ze žíly jsou hladiny některých analytů u této metody rozdílné, např. hladina glukózy je o 10 % vyšší než při odběru ze žíly. 413

414 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku Odběr ze žíly. Tato technika se používá u starších dětí, protože mají větší a lépe viditelné žíly a jsou také méně psychicky zatíženy pohledem na jehlu. Obecně lze říci, že k získání krve se nejčastěji používá v. cephalica. Manžeta musí být aplikována ve středu vzdálenosti mezi loktem a ramenem dítěte tak, aby stlačovala žílu, nikoliv tepnu. Jehla by měla být zavedena v ose žíly a svírat s kůží úhel 15 stupňů. Manžetu odstraňujeme v momentě, když krev začne proudit do injekční stříkačky. Po vyjmutí jehly se musí místo vpichu zatlačit sterilní bavlněnou gázou do zastavení krvácení (asi 3 min) a přelepit náplastí. K dispozici jsou krémy a náplasti (např. EMLA 5 %), které jsou velice vhodné k potlačení bolesti při odběrech krve u dětských pacientů. Jediná nevýhoda je, že anestezie místa vpichu nastupuje asi za hodinu po aplikaci. Krém i náplast obsahují lidokain (2,5 %) a prilokain (2,5 %). Obtížnost odběru krve vede k užívání neinvazivních transkutanních metod (např. pulsní oxymetrie, transkutánní bilirubinometr). Objem vzorku. Přestože mnoho moderních analyzátorů používá malé reakční objemy a analyzátory mají nízkou spotřebu vzorků, velikost vzorků zůstává primární záležitostí v pediatrické laboratoři. Je to proto, že se zvyšuje počet nedonošených a nezralých novorozenců (stoupl zejména počet dětí s porodní hmotností pod 1000 g). Objem plazmy zůstává v průběhu života relativně konstantní 4 5 % tělesné hmotnosti. Třebaže celkový krevní objem zdravého novorozence je přibližně 85 ml/kg, u nedonošence to může být o mnoho méně. KAPITOLA 35 Obrázek 35.2 Podíl vzorku 10 ml krve na celkovém objemu krve v závislosti na věku 1 ml krve novorozence o hmotnosti 1 kg odpovídá přibližně 70 ml krve dospělého. Důsledkem jsou nutné transfuze, pokud objem odebraných vzorků krve přesáhne během 3 dnů více než 10 % celkového objemu krve. Například u dítěte o hmotnosti 750 g 414

415 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku může vést k nutnosti provést transfuzi už odběr 8 ml krve. U nedonošenců a všech dětí vůbec se dobrým plánováním požadovaných laboratorních testů vyhneme excesivním ztrátám krve nosokomiální anémii. Je nezbytné monitorovat hematokrit a hemoglobin, popř. hradit ztráty. U dětských pacientů o hmotnosti do 2,5 3,5 kg nesmí překročit jednorázově odebrané množství krve 2,5 ml, za celou dobu hospitalizace (kratší než 1 měsíc) by celkové množství nemělo překročit 23 ml. Doporučené maximální objemy vzorků krve vzhledem k hmotnosti dětí (jednorázové odběry a celkem během hospitalizace) jsou uvedeny v tabulce Hmotnost pacienta (kg) Maximum na 1 odběr (ml) Maximum za 1 měsíc (ml) 0,5-0, ,9-1,8 1,5 12 1,8-3, , , KAPITOLA 35 Tabulka 35.2 Maximální povolené množství odebraného vzorku krve při jednorázovém odběru a množství celkem v průběhu hospitalizace (pozn.: doporučení ÚKBP ve Fakultní nemocnici v Motole, Praha) Vypařování vzorku může být hlavním problémem u malých objemů. Zahuštění nezakrytého vzorku séra jsou znatelné již po první hodině. Hodnoty se mohou při pokojové teplotě za dvě hodiny změnit až o 20 % u objemu vzorku 0,1 ml, u větších vzorků (5 ml) je tato změna menší (obrázek 3 a 4). 415

416 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku KAPITOLA 35 Obrázek 35.3 Evaporace vzorku séra (objem vzorku 0,1 ml) při pokojové teplo Obrázek 35.4 Evaporace vzorku séra (objem vzorku 5 ml) při pokojové teplotě Velké zahuštění evaporací hrozí v letních měsících. U malých pediatrických zkumavek bývá obtížné jejich dostatečné označení. Pro odběr séra nebo plazmy jsou u novorozenců přes svoji nákladnost preferovány zkumavky typu mikrotainer. Tyto zkumavky mají separátor séra a pojmou 600 µl krve. Je snadné nalepit na ně štítek. Oddělení séra od buněk nastává po jednoduché krátké centrifugaci. Navíc separátor séra neovlivňuje hladiny běžně stanovovaných analytů. Plazma může být získávána pomocí zkumavek typu mikrotainer s heparinátem litným. Jestliže jsou pro určité analýzy požadována větší množství krve, např. pro vyšetření hormonů, mohou být k odběru použity zkumavky typu vakutainer o objemu 2,5 ml. Nepoužívají se příliš často, protože vény u malých dětí snadno kolabují. Ačkoli většina laboratoří používá pro stanovení analytů v klinické biochemii sérum, doporučuje se plazma. To proto, že se zrychlí TAT (doba odezvy), poněvadž není nutné čekat, až proběhne koagulace, a dále proto, že celkově méně často nastává hemolýza. Pro většinu rutinních vyšetření není rozdíl ve výsledcích získaných ze séra nebo z plazmy. Plazma by měla být používána pro stanovení koncentrace draselných iontů, zejména u pacientů, kteří mají vysoký počet trombocytů nebo buněk bílé krevní řady. Je důležité ujistit se, že použitý antikoagulační přípravek neovlivňuje přímo analyt, který chceme změřit. Sběr moči. Správný sběr moči u kojenců je jedním z nejobtížnějších úkolů v pediatrické praxi. Poněvadž 24hodinové sběry moči 416

417 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku mohou být opakovaně nepřesné, je dobré znát předpokládaný objem moči u dětí různých věkových kategorií a mít tak představu o odpovídajícím objemu. KAPITOLA 35 Obrázek 35.5 Množství moči za den v závislosti na věku Obrázek ukazuje očekávané objemy moči u zdravé dětské populace. Vzorky pro analýzu moče musí být uchovávány v chladničce. Odběr stolice. Pacient a rodiče by měli být informováni, že vzorek stolice nesmí být kontaminován močí. Referenční rozmezí Správná interpretace laboratorních dat závisí na dostupnosti vhodných referenčních rozmezí (normální hodnoty) pro příslušný stupeň věku a vývoje dítěte. Je velmi obtížné získat dostatečně velký vzorek populace zdravých dětí ve věkových skupinách od 1 dne do 18 let, které by mohly darovat vzorky, a získat informovaný souhlas od rodičů. Proto se s výhodou používá Hoffmannovy metody. Normální referenční meze se stanovují pro nemocniční dětskou populaci nemocných dětí. Ke konstrukci referenčních mezí (2,5 a 97,5 percentil) se použijí Chauventova nebo Dixonova kritéria a procentuální kumulativní četnost versus laboratorní hodnoty (nebo versus logaritmus laboratorních hodnot, pokud distribuce dat nemá normální rozložení; viz kapitola Bartoš: Referenční rozmezí). Tato metoda má tu výhodu, že respektuje např. skutečnost, že hospitalizovaní pacienti mají běžně vyšší hodnoty thyroxinu a nižší hodnoty cholesterolu. Samozřejmě je nutno pamatovat, že referenční meze jsou závislé na použité 417

418 Zvláštnosti laboratorního vyšetření v dětském věku analytické metodě pro příslušné biochemické vyšetření. Podrobné pediatrické referenční hodnoty pro klinicko biochemické a hematologické testy pro věk a pohlaví přibližně u 240 analytů udávají publikace Soldina a kol. nebo Meitese a kol. (SOLDIN, SJ., BRUGNARA, C., HICKS, JM: Pediatric reference ranges. Washinton: AACC Press, 2003, 248 p., MEITES, S. Pediatric clinical chemistry. Reference (normal) values. Washington: AACC Press, 1989, 330 p.) Laboratorní hodnoty séra získaného z pupečníkové krve se často blíží hodnotám séra mateřského a mohou se také rychle měnit. Například hodnoty T4 v pupečníkové krvi jsou v rozmezí nmol/l a stoupají v 1 3 dnech věku na nmol/l. Sérové proteiny, zejména imunoglobuliny, také podléhají významným změnám při vývoji dítěte od období novorozeneckého k dospělosti. KAPITOLA dnů 16 dnů-3 měsíce 4 m-1rok 1-6 roků 6-15 roků 5,7-12,7 2,3-6,6 2,2-11,2 5,5-14,7 6,7-15,0 Tabulka 35.3 Příklad závislosti referenčních mezí na věku. Referenční meze pro imunoglobulin G v séru (g/l) podle věkových skupin Analyt, který vykazuje markantní změny s věkem, je alkalická fosfatáza. Během růstu se u novorozenců a dětí zvyšuje hladina alkalické fosfatázy na hodnoty, které se považují za patologické u dospělých. Tyto referenční hodnoty jsou také odlišné pro obě pohlaví u stejné věkové kategorie. Věk ph po2 0 min 7,11-7,35 1,07-3,2 5 min 7,09-7,30 4,41-10,0 10 min 7,21-7,38 4,13-11,3 30 min 7,26-7,49 7,2-10,7 60 min 7,29-7,45 7,2-12,7 2 dny 7,36-7,45 11,1-14,4 Tabulka 35.4 Příklad závislosti referenčních mezí na věku. Referenční meze pro ph a po2 (kpa) v krvi podle stáří novorozence Normální hodnoty krevních plynů a ph se významně liší u novorozenců a starších dětí (ph 7,18 7,51 versus 7,35 7,44). Totéž platí pro kationty sodné, draselné a kalcium. Např. hodnoty ionizovaného kalcia u novorozenců do 1 měsíce věku jsou 1,0 1,5 mmol/l, zatímco u dospělých je to 1,18 1,32 mmol/l. Velmi významně se mění s věkem sérové referenční hodnoty enzymů, např. amylázy, GMT a AST. Nejmarkantnější změny v novorozeneckém období se týkají kyseliny močové a bilirubinu, renální clearance látek a jejich exkrečních frakcí. Pohlavní dospívání dětí přináší s sebou mimořádné změny v referenčních hodnotách hormonů a ve vývoji pohlavních diferencí referenčních mezí řady dalších analytů (prebubertální a postpubertální referenční meze). 418

419 Základy toxikologie v klinické laboratoři Základy toxikologie v klinické laboratoři Autor: Ing. Václav Senft Recenzent: MUDr. Michaela Králíková KAPITOLA 36 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Toxikologie je velmi široký obor, který čerpá poznatky z mnoha základních věd a vědeckých disciplín (chemie, fyzika, biologie, matematika, statistika, medicína, farmacie, ekologie, aj.) a nalézá uplatnění v celé řadě oblastí lidské činnosti (zdravotnictví, hygiena, soudnictví, legislativa, kriminalistika, zemědělství, veřejné zdraví, životní prostředí, pracovní prostředí, odpady, aj.). S problematikou toxikologie přichází do kontaktu i pracovníci v laboratořích klinické biochemie, i když ne v celé šíři, ale jen v určitých vybraných oblastech. Některé zásady a postupy laboratorní práce jsou obdobné v biochemii i v toxikologii, některé způsoby, pojmy a hodnocení jsou ale odlišné (např. horní referenční mez v biochemii oproti nejvyšší přípustný limit v toxikologii, aj.). V tomto textu jsou uvedeny základní informace, definice a termíny z toxikologie, především se zaměřením na oblasti, které se vyskytují v praxi klinických laboratoří. Toxikologie Definice, historie Historie toxikologie je velmi dlouhá. Odedávna se člověk setkával v přírodě s toxickými látkami (bolehlav, durman, otrušík,...) a vedle nechtěných událostí (otrav) je i využíval k lovu a k boji. Toxikologie (název je odvozen od řeckého slova toxikón, které označovalo jed, do kterého se namáčely hroty šípů) je věda, která se zabývá negativními účinky látek na živé organizmy. S toxikologií se setkáváme stále i v dnešní době. Nyní již nejde jen o přírodní, ale především o uměle vyrobené látky a přípravky, které na jedné straně cíleně využíváme, na druhé straně s nimi máme problémy. Například: Maminku, jejiž malé dítě nedopatřením vypilo Diavu (leštěnku na nábytek) jistě velmi zajímá toxicita tohoto přípravku a odpovídající první pomoc. Všichni se obáváme kontaminace potravin těžkými kovy, herbicidy aj. škodlivými látkami zavlečenými do životního prostředí. I když v širším pohledu se může jednat i o fyzikální vlivy (např. elektromagnetické záření nebo požití rozdrceného skla ), pozornost se soustřeďuje obvykle jen na chemické látky. Podobory toxikologie Toxikologie je velmi široký obor, podle zaměření na jednotlivé oblasti se vyvinula celá řada podoborů. Například: Tab. č Podobor Ekotoxikologie Stručná anotace Každého zajímá toxicita v domácím i životním prostředí. 419

420 Základy toxikologie v klinické laboratoři Průmyslová Mnoho lidí pracuje v prostředí s toxickými riziky. Klinická Ve zdravotnických zařízeních se zabývají intoxikovanými pacienty (náhodné záměny, sebevraždy, zneužívané látky). Forenzní Nejen v detektivkách se lidé setkávají s kriminálními činy travičů. Vojenská Armády celého světa se zabývají toxickými bojovými látkami, účinky, nasazením, ochranou před nimi. Farmaceutická Téměř každá aplikace léku s sebou nese riziko toxicity, ať již ve formě nežádoucích účinků, tak při event. předávkování. Experimentální Provádí se množství pokusů pro odhalení event. toxických vlastností látek. Predikční Snaha předpovědět toxicitu bez pokusů na zvířatech pomocí počítačových programů. KAPITOLA 36 Tabulka 36.1 Toxikologické indikace v klinických laboratořích V závislosti na organizaci laboratorních oborů v konkrétním zdravotnickém zařízení se vyskytují různé indikace. V menších laboratořích to bývá jen jednoduché imunochemické monitorování zneužívání drog, ve velkých konzolidovaných (integrovaných) zařízeních přichází i speciální požadavky z výzkumu aj. Například: Tab. č Podobor Požadavky přichází od Důvody indikace (příklady) Klinická Anesteziologicko resuscitační klinika (ARK), emergency, úrazová chirurgie, interna, psychiatrie Průmyslová Pracovní lékařství, hygiena, praktičtí a závodní lékaři Náhodné i úmyslné intoxikace, toxikologický screening u bezvědomí neznámé etiologie, kontrola event. předávkování léčivy, kontrola abstinence u osob závislých na drogách, aj. Kontrola expozice při pracovní činnosti, dodržování limitů, zjištění následků expozic, nemoci z povolání. Ekotoxikologie ARK, emergency, hygiena Náhodné intoxikace v domácím i životním prostředí, nejčastěji u dětí. Forenzní ARK, emergency, psychiatrie, soudní lékařství Průkaz zneužívaných látek (alkohol, drogy), např. po silničních nehodách. Tabulka 36.2 Příčiny intoxikací Příčiny intoxikací lze pro ilustraci rozdělit například na: 1. Dobrovolné nevědomé. Lze sem zařadit například osoby s návykem na drogy (feťáci), ale třeba také sportovce aplikující různou formu dopingu. Zmiňovaní si neuvědomují, že se intoxikují a drogy či dopingové látky užívají dobrovolně, bez ohledu na následky. 2. Dobrovolné vědomé. Určitě sem patří například sebevražedné pokusy. 3. Nedobrovolné. Náleží sem především různé nehody, tj. náhodné otravy, ke kterým dochází např. v důsledku záměny nebo nečekané kontaminace či koncentrace látek. Nehody se vyskytují nejen v soukromí, ale i při profesionální činnosti. Do určité míry lze do této skupiny zařadit i nedobrovolné oběti trestních činů. 420

421 Základy toxikologie v klinické laboratoři KAPITOLA 36 Obrázek 36.1 znázorňuje relativní zastoupení skupin 2) a 3), tj. případů zachycovaných v různých statistikách. Frekvence skupiny 1), tj. počet osob zneužívajících drogy či sportovců aplikujících doping samozřejmě takto exaktně evidován není, k dispozici jsou jen orientační odhady. Jedy Definice Jed je látka vyvolávající negativní efekty v živém organizmu již v malém množství. Téměř všechny látky mohou působit negativně, liší se jen dávkou potřebnou k nástupu toxicity. Proto se např. za jed nepovažuje destilovaná voda, které by člověk musel vypít velké množství. Mezi jedy se obvykle nepočítají látky působící fyzikálně (vařící voda, rozemleté sklo apod.). Zdroje a formy toxických látek S přírodními jedy (např. bolehlav, houby, hadí toxiny, rostlinné alkaloidy, atd.) se člověk setkával odedávna. V současnosti ale existuje obrovské množství uměle vyrobených látek (léčiva, herbicidy, pesticidy, insekticidy, bojové látky, čistící prostředky, rozpouštědla, sloučeniny těžkých kovů, syntetické drogy, atd.), které se většinou objevily v průběhu posledních sto let. Vyskytují se v nejrůznějších formách (anorganické, organické, pevné, kapalné, plynné, aerosoly, aj.), a to samostatně i ve směsích s dalšími látkami. Různé formy toxických látek vykazují různou toxicitu. Sloučenina niklu Forma Toxicita Ni Lesklý kov Alergie na nikl, niklová dermatitida NiO Černý, ve vodě nerozpustný prášek Potenciální karcinogen NiSO 4, Ni(NO 3 ) 2 Zelené, ve vodě rozpustné krystaly Nefrotoxicita Ni(CO) 4 Plynná sloučenina Prokázaný karcinogen Tabulka 36.3 Sloučeniny niklu 421

422 Základy toxikologie v klinické laboratoři Částečky prachu Příklad profese Následek vdechování jsou biologického původu (prach z rostlin, srsti zvířat,... obsahují částečky azbestu Pracovníci v zemědělství Pracovníci v azbestových dolech, ve výrobě brzdových obložení, ve stavebnictví,... Alergie, postižení plic (farmářská plíce, bronchiální astma,...) Azbestóza, zvýšené riziko nádorů plic a pohrudnice,... obsahují částečky křemene Horníci v lomech a uhelných dolech Silikóza, uhlokopská pneumokonióza, KAPITOLA 36 Tabulka 36.4 U časté expozice vdechování prachu záleží na tom, o jaký typ prachu se jedná. Existují xenobiotika, která působí negativně v jakékoliv dávce, resp. negativní efekt je úměrný dávce. např. organofosfáty. Existují ale i xenobiotika, která jsou v určitém optimálním rozmezí dávky pro organizmus užitečná, ale když je jich nedostatek, je to špatné a naopak při předávkování se objevují toxické efekty. Typickým příkladem je selen, který je na jedné straně užitečným antioxidantem, na druhé vysoce toxickým jedem. Obrázek 36.2 schématicky zachycuje závislost velikosti negativních efektů na dávce selenu. Životní prostředí Kontaminovaná jedovatými látkami může být voda, vzduch, půda, potraviny, rostliny, živočichové, aj. Rozptýlené ve velkém prostoru, čili nižší koncentrace. Domácí prostředí Barvy, čistící prostředky, desinfekční látky, impregnační látky (formaldehyd), léky, rostliny, aj. V uzavřeném prostoru, dlouhodobý kontakt. Pracovní prostředí Různé technologie používají organická rozpouštědla, insekticidy, aditivní látky, chemické sloučeniny, aj. Vysoké koncentrace při nedostatečném zabezpečení pracoviště (odsávání) a pracovníků (ochranné prostředky). Nehody Záměny, náhodné úniky při haváriích, produkty hoření při požárech, aj. Koncentrace mohou být extrémně vysoké. Tabulka 36.5 Zdroje toxických látek jsou v životním, pracovním i domácím prostředí. Rychlost a intenzita účinků toxických látek Rychlost a intenzitu účinků toxických látek ovlivňuje řada faktorů. Mezi nejvýznamnější patří: Tab. č

423 Základy toxikologie v klinické laboratoři Časový průběh expozice Způsob expozice, resp. cesta vstupu jedu Způsob účinku jedu Místo účinku Způsob biotransformace (metabolizmu) Způsob vylučování jedu z organizmu Dávka jedu Forma jedu Zesilování či rušení účinku jedů Návyk na jed Rezistence (vnímavost) Zdravotní stav Akutní (kratší než 24 h), chronická (delší než 3 měsíce). Požitím, vdechnutím, transdermálně, šňupáním, intravenózně, či intramuskulárně injekce, aj. Lokálně působící (žíraviny), celkově působící (kancerogeny, mutageny). Hepatotoxické působí až po proniknutí do jater, obdobně nefrotoxické do ledvin, tlumící CNS do mozku, zatímco dráždivé působí již při kontaktu s kůží či plícemi a krevní již při průniku do krevního řečiště. Většinou proces, ve kterém se lipofilní látky mění na hydrofilní, lépe z organizmu vylučovatelné a to vesměs ve dvou fázích: Fáze I: Metabolická transformace zahrnuje oxidaci, redukci, hydrolýzu. Fáze II: Konjugace, např. s kyselinou glukuronovou. Přímo jako jed nebo ve formě různých metabolitů a to močí, stolicí, vydechovaným vzduchem, žlučí, potem, vlasy, mateřským mlékem, aj. Účinek je vesměs přímo úměrný dávce jedu. Záleží na fyzikálně chemických vlastnostech, jako je např. rozpustnost apod. Viz Tab. č. 3 s příklady různých forem niklových sloučenin. Velká část otrav není způsobená jedním jedem, ale směsí látek, které se navzájem ovlivňují. Návyk a nutnost zvyšovat dávky, aby bylo dosaženo stejného účinku, je podstatou toxikománie. Děti jsou vesměs vnímavější k účinkům jedů, než dospělí. Ženy bývají citlivější než muži. Pokud je jedinec současně s expozicí jedu oslabený jinou nemocí, jsou negativní dopady způsobené jedem závažnější. Např. porucha ledvin omezí možnost vyloučení jedu z organizmu. Tabulka 36.6 Nejvýznamnější faktory ovlivňující rychlost a intenzitu účinků toxických látek KAPITOLA 36 Legislativa Česká republika je součástí Evropské unie, proto v řadě oblastí, mimo jiné právě v oblasti chemických látek, nastupují nařízení Evropského parlamentu, Rady a Komise: V roce 2009 vstoupilo v platnost nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008. Nařízení stanoví pravidla pro klasifikaci látek a směsí jako nebezpečných a pravidla pro označování a balení nebezpečných látek a směsí. Evropské dokumenty mají přednost před základními legislativními dokumenty ČR zabývajícími se toxickými látkami: Zákon 350/2011 Sb., částka 122, Zákon o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů. Lze nalézt např.: Vyhláška 402/2011 Sb., částka 140 a přílohy, Vyhláška, kterou se provádějí některá ustanovení zákona o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů, týkající se klasifikace, balení a označování nebezpečných chemických látek a chemických přípravků. Téměř 700 stran textu. Lze nalézt např.: Závažná je kategorie látek označená jako T+, tj. zvlášť nebezpečné látky. Mezi tyto látky patří například azid sodný, který je obvyklou součástí komerčně dodávaných setů pro celou řadu rutin- 423

424 Základy toxikologie v klinické laboratoři ních biochemických stanovení. Častou otázkou je, zda v tom případě považovat dodávané kity za zvlášť nebezpečné látky T+. Je to specifikováno v příloze 2. zákona, kde se uvádí, že pokud je koncentrace zvlášť nebezpečné látky v přípravku nižší než 2,5 %, nepovažuje se přípravek za zvlášť nebezpečný. Pozn.: Obvyklá koncentrace azidu sodného jako konzervačního přípravku je v setech cca 1%, čili komerční kity se nepovažují za zvlášť nebezpečné přípravky. Důležité pojmy související s jedy KAPITOLA 36 Například: Tab. č. 7 Dávka toxická Dávka letální Dávka terapeutická Terapeutická šíře Biologický poločas Xenobiotika Biogenní látky Výstražné symboly Nejmenší množství jedu, schopné vyvolat příznaky otravy. Obvykle se udává jako tzv. LD50, tj. taková dávka, která vyvolá smrt 50% postižených. Vyjadřuje se tím individuální citlivost organizmu k jedu. Tyto dávky jsou velmi rozdílné, např. u morfinu je to 900 mg/kg, u botulinu jen 0,00001 mg/kg. Jednotlivá a denní se užívá u léků, vyjadřuje, jaká dávka je terapeuticky účinná, ale ještě toxikologicky únosná. Rozdíl mezi dávkou terapeutickou a toxickou. Bezpečnější jsou léky s velkou terapeutickou šíří (např. atropin), než léky s malou terapeutickou šíří (např. digoxin, lithium). Doba potřebná k tomu, aby se množství jedu v organismu snížilo na polovinu. Problém je v tom, že někdy jsou metabolity vznikající z jedu mnohem toxičtější než původní jed. Např.: alkohol acetaldehyd, ethylenglykol kyselina štavelová Obecně cizorodé látky, které se normálně v organizmu nevyskytují vůbec nebo jen v mizivých množstvích a do organizmu se dostávají záměrně (např. léky) nebo nechtěně (kontaminanty, záměny, aj.). Některé z těchto látek jsou biologicky neaktivní, ale většina biologicky aktivní je a může ovlivňovat organizmus pozitivně i negativně. Pro organizmus užitečné cizorodé látky, u kterých mohou negativní efekty nastat nejen z důvodu předávkování, ale i z důvodu nedostatku (např. selen, jód a jiné stopové prvky). Označení nebezpečných vlastností látek na obalech a v katalozích lze realizovat piktogramy nebo písmeny: E VÝBUŠNÉ O OXIDOVADLA F+ VELMI VYSOCE VZNĚTLIVÉ F VYSOCE VZNĚTLIVÉ T TOXICKÉ T+ VELMI TOXICKÉ Xn ŠKODLIVÉ C KOROZIVNÍ Xi DRÁŽDIVÉ N NEBEZPEČNÉ PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ Viz Příloha č. 4 Vyhlášky 402/2011 Sb. Lze nalézt např.: start.aspx 424

425 Základy toxikologie v klinické laboratoři R věty S věty NPK Nejvyšší přípustný limit Standardní věty, označující specifickou rizikovost látky (Risk), které se musí uvádět na baleních chemikálií. Je celkem 68 druhů základních R-vět, které se mohou uvádět v kombinacích. Např. R26/28 znamená, že látka je vysoce toxická při vdechování a při požití. Poznámka: V současnosti se postupně mění označení R- vět na tzv. H-věty (Hazard). Viz Příloha č. 5 Vyhlášky 402/2011 Sb. Lze nalézt např.: Standardní pokyny pro bezpečné (Safety) zacházení s chemikáliemi. Základních S-vět je celkem 64, mohou se rovněž používat v kombinacích. Např.: S24/25 znamená, že se má zabránit kontaktu uvedené látky s kůží a očima, čili, že se musí používat ochranné rukavice a brýle. Poznámka: V současnosti se postupně mění označení S- vět na tzv. P-věty (Prevention). Viz Příloha č. 6 Vyhlášky 402/2011 Sb. Lze nalézt např.: Nejvyšší přípustná koncentrace toxické látky. Vyhlašuje se většinou pro koncentraci noxy v ovzduší, vodě, potravinách apod. Např.: U toluenu v pracovním ovzduší je to 200 mg/m3. Nejvyšší koncentrace, která je ještě přípustná, např. při profesionálním zacházení s toxickou látkou, z hlediska vzniku negativního působení jedu. Určení velikosti ovlivňuje celá řada faktorů (ekonomika, zdravotní politika, znalost toxicity látky). Např.: U olova v krvi při profesionální expozici je to 400 µg/l, ale u profesionálně neexponovaných dětí jen 100 µg/l. Tabula 36.7 KAPITOLA 36 Označování chemikálií Chemikálie musí být řádně označené včetně vyznačených rizik. Příklady výstražných symbolů nebezpečnosti dle Nařízení Evropského parlamentu Rady (ES) č / 2008: Žíravý pro kůži - Hořlavý - Karcinogenní - Akutně vysoce toxický Akutně toxický - Nebezpečný pro - Oxidující - Plyny pod tlakem vodní prostředí 425

426 Základy toxikologie v klinické laboratoři KAPITOLA 36 Obrázek 36.3 Příklad štítku na lahvičce s chemikálií a uvedenými výstražnými symboly a R a S-větami: Toxikokinetika - co organizmus dělá s noxou Děje probíhající při expozici organizmu toxickým látkám lze schematicky znázornit takto: Expozice Absorpce Distribuce (+ Exkrece) Biotransformace (metabolizmus) Molekulární terč Toxické působení (vyvolání negativního efektu) Expozice Expozice může být jednorázová, opakovaná, chronická. Podle situace a charakteru noxy mohou být různé cesty vstupu do organismu (požití jedu, inhalace - plíce, vstřebání kůží). Absorpce jedu do organizmu Noxa musí proniknout přes různé bariéry (membrány) například ve střevě nebo v plicích, dříve než se dostane do krevního řečiště. Rychlost absorpce je ovlivňována fyzikálně chemickými vlastnostmi jedu, rozpustností, koncentrací a způsobem expozice. Distribuce jedu v organizmu Po proniknutí do krevního řečiště probíhá distribuce jedu, tj. jed se dostává do různých orgánů a tkání. Biotransformace (metabolismus) jedu Cíl biotransformace (metabolizmu) lze stručně charakterizovat jako proces, ve kterém jsou lipofilní látky měněny na více hydrofilní látky, které jsou snáze vyloučitelné z organizmu. V první fázi probíhají různé oxidace, redukce, připojení či odebrání funkčních skupin (-OH, -COOH, -NH 2, apod.) V druhé fázi pak nastupuje konjugace s různými látkami jako je kyselina glukuronová, aj. Průběh biotransformace ovlivňuje např. zdravotní stav, funkce jater (nejdůležitější biotransformační orgán těla), věk aj. 426

427 Základy toxikologie v klinické laboratoři Vylučování (exkrece) jedu Po biotransformaci je většina látek eliminována z organizmu. Způsobů a možností jak vyloučit jed z organizmu je celá řada. Nejdůležitější pro vylučování jsou ledviny (pozor, při renálním poškození může dojít k zadržování jedu v organizmu). Častou cestou jsou plíce (vydýchání), něco jde z jater do žluče, zajímavé je ukládání nox do vlasů, významná je možnost vylučování jedu mateřským mlékem apod. Kumulativní jedy, biologický poločas KAPITOLA 36 Termín biologický poločas definuje dobu, za kterou koncentrace toxické látky v organizmu klesne na polovinu. Biologické poločasy různých látek jsou velmi rozdílné. Např. biologický poločas toluenu je 2-3 hodiny, zatímco biologický poločas kadmia je 20 let. Termín kumulativní jed označuje toxickou látku s dlouhým biologickým poločasem, která se z organizmu vylučuje pomalu, při další expozici v organizmu ještě přetrvává noxa z předešlé expozice a postupně tak dochází k hromadění, kumulaci jedu v organizmu. Obrázek 36.4 schématicky zachycuje rozdíl při opakované expozici látky s krátkým a s dlouhým biologickým poločasem. Problémem se někdy může stát uvolnění nahromaděné noxy z depa. Například: Žena krátce po porodu nasadí redukční dietu s cílem vrátit se rychle zpět na původní linii. Přitom ale dojde k uvolnění toxických látek nakumulovaných v tukových tkáních a může dojít až k ohrožení kojeného dítěte. Toxikodynamika - co noxa dělá s organizmem Místo, způsob a časový profil účinku 427

428 Základy toxikologie v klinické laboratoři Některé jedy působí cíleně na určité orgány (například olovo a jeho sloučeniny poškozují syntézu hemoglobinu, kadmium poškozuje tubuly ledvin, aj.), jiné toxické látky působí v celém organismu (např. karcinogeny, mutageny, aj.) Dávka - efekt Vztah mezi dávkou (množstvím toxické látky, kterým je člověk exponován) a velikostí (závažností) negativních toxických efektů nezávisí jen na velikosti dávky ale na řadě dalších faktorů a okolností. Například: Tab. č. 8 KAPITOLA 36 Časový průběh a doba trvání expozice Způsob expozice, resp. cesta vstupu jedu do organizmu Způsob účinku jedu Místo účinku Způsob biotransformace (metabolizmu) Způsob vylučování jedu z organizmu Forma jedu Zesilování či rušení účinku jedů Návyk na jed Rezistence (vnímavost) Zdravotní stav Akutní (kratší než 24 h), chronická (delší než 3 měsíce). Požitím GIT, vdechnutím plíce, transdermálně kůže, šňupáním, intravenózně, či intramuskulárně injekce, aj. Lokálně působící (žíraviny), celkově působící (kancerogeny, mutageny). Hepatotoxické působí až po proniknutí do jater, obdobně nefrotoxické do ledvin, tlumící CNS do mozku, zatímco dráždivé působí již při kontaktu s kůží či plícemi a krevní již při průniku do krevního řečiště. Většinou proces, ve kterém se lipofilní látky mění na hydrofilní, lépe z organizmu vylučovatelné a to vesměs ve dvou fázích: Fáze I: Metabolická transformace zahrnuje oxidaci, redukci, hydrolýzu. Fáze II: Konjugace, např. s kyselinou glukuronovou. Přímo jako jed nebo až ve formě různých metabolitů a to močí, stolicí, vydechovaným vzduchem, žlučí, potem, vlasy, mateřským mlékem, aj. Záleží na fyzikálně chemických vlastnostech, jako je např. rozpustnost apod. Velká část otrav není způsobená jedním jedem, ale směsí látek, které se navzájem ovlivňují. Návyk a nutnost zvyšovat dávky, aby bylo dosaženo stejného účinku, je podstatou toxikománie. Děti jsou vesměs vnímavější k účinkům jedů než dospělí. Ženy bývají citlivější než muži. Pokud je jedinec současně s expozicí jedu oslabený jinou nemocí, jsou negativní dopady způsobené jedem závažnější. Např. porucha ledvin omezí možnost vyloučení jedu z organizmu. Tabulka 36.8 Způsoby hodnocení (kvantifikace) Existují různé způsoby a termíny, které kvantitativně vyjadřují velikost toxicity a charakterizují konkrétní látku z hlediska toxicity. Například: Tab. č. 9 Dávka letální - obvykle jako LD50 Dávka toxická Terapeutická šíře u léků Nejvyšší přípustná koncentrace (NPK) Nejvýše přípustný limit u biologických expozičních testů (BET) Dávka, která usmrtí polovinu jedinců z exponovaného souboru Nejmenší množství vyvolávající otravu Rozdíl mezi dávkou toxickou a dávkou terapeutickou nutnou pro léčbu Nejvyšší koncentrace v ovzduší akceptovatelná na pracovišti Nejvyšší přípustná koncentrace v biologickém materiálu exponovaných organizmů Tabulka

429 Základy toxikologie v klinické laboratoři Rozdíly v toxicitě mezi látkami jsou řádové. Například: Tab. č. 10 Srovnání LD50 (mg/kg) známých látek: Alkohol NaCl Morfin 900 Paracetamol 142 Strychnin 2 Nikotin 1 Kurare 0,001 Botulin 0,00001 KAPITOLA 36 Tabulka Srovnání LD50 (mg/kg) známých látek: Toxikologická vyšetření Spektrum toxikologických vyšetření je velmi široké a rozmanité. V médiích se objevují informace o analýze podezřelých látek (odpadní skládky, kontaminované potraviny, dětské hračky, aj.), či o toxikologickém vyšetření prostředí (ovzduší venkovní, vnitřní, voda pitná, odpadní, půda kontaminovaná) aj. V klinických laboratořích se ale tyto indikace většinou nevyskytují. Toxikologická vyšetření v klinických laboratořích zahrnují věsměs analýzu různého biologického materiálu odebraného u z různých důvodů potenciálně intoxikovaných osob. Důvody toxikologických vyšetření Například: Tab. č. 11 Akutní otravy Chronické otravy Zneužívání drog (toxikománie) Profesionální intoxikace Trestné činy Náhodné (neoznačené, či špatně označené obaly ), úmyslné (sebevraždy, trestné činy), pacient v bezvědomí s akutními příznaky otravy. Např.: Etylenglykol v séru po požití Fridexu z lahve od limonády. Paracetamol nebo salicyláty v séru po intoxikaci dítěte nebo po sebevražedném pokusu. Diferenciální diagnostika příznaků po dlouhodobé expozici noxami. Např.: Kyselina delta- -aminolevulová a koproporfyrin III v moči po dlouhodobé expozici olovu. Zachycení nových toxikomanů, kontrola dodržování odvykací terapie, prověření osob v kontrolních skupinách výzkumů, zda neužívají drogy. Např.: Drogy a jejich metabolity (THC, metamfetamin - pervitin, opiáty, kokain, extáze, buprenorfin, benzodiazepiny), aj. v moči. Biologické expoziční testy, odškodňování nemocí z povolání. Např.: Kyselina mandlová v moči po profesionální expozici styrénu, či trichlorethanol a kyselina trichloroctová po expozici trichlorethylenu. Např.: Ethanol a osmolalita v séru u řidičů, či průkaz zneužívání drog v práci. 429

430 Základy toxikologie v klinické laboratoři Monitorování lékové terapie (TDM =Therapeutic Drug Monitoring) Experimentální intoxikace Kontrola podávání léků (především s úzkou terapeutickou šíří). Např.: Digoxin, metotrexát, tacrolimus, sirolimus, teofylin vankomycin, gentamicin, fenytoin, valproát, karbamazepin, cyklosporin A, fenobarbital, aj. v séru. Výzkumné pokusy na zvířatech. Např.: Stanovení Cd v tkáních po experimentální výzkumné intoxikaci souboru myší kadmiem. Tabulka KAPITOLA 36 Typy toxikologických vyšetření Neznámá intoxikace (toxikologický screening) Například ve dvě hodiny v noci se do nemocnice dostane nekomunikující člověk s akutními příznaky a je třeba co nejdříve zjistit, zda se nejedná o intoxikaci. To je z analytického hlediska jeden z nejsložitějších úkolů. Může se totiž jednat o libovolné toxické látky a v jakékoliv koncentraci. Spektrum nejčastějších otrav se postupně mění, tak jak se objevují nové léky a látky a mění se jejich dostupnost. Při úspěšném průkazu jedné látky je nutné mít na mysli, že se často vyskytují smíšené otravy více jedy a je pak třeba rozhodnout, která složka je dominující. Velmi důležité jsou proto jakékoliv dodatečné informace (např. předpokládaný čas intoxikace, obaly, zbytky, nalezené tablety, texty, léky podané v rámci první pomoci, aj.), které se podaří získat. Obecně je vhodné odebrat co nejširší spektrum materiálů (krev, moč, vlasy, ) v dostatečném množství. Obtížnosti zadání odpovídá i nezbytnost rozsáhlého vybavení laboratoře vhodnými analyzátory. U tohoto typu toxikologického vyšetření je velmi důležitá rychlost odezvy laboratoře. Nejdříve často klinikům stačí kvalitativní nález, který se může kvantifikovat až dodatečně. Monitorování známé expozice Například sledování lékové terapie před a po podání další dávky léku nebo profesionální expozice známou látkou, např. organickým rozpouštědlem toluenem, nebo analýza hladiny alkoholu u řidičů a pracovníků. V úvahu se musí brát biologický poločas monitorované noxy a podle toho volit vhodný materiál, ve kterém je možné jed zachytit. Je např. zbytečné odebírat moč na stanovení metabolitů toluenu týden po intoxikaci, když jeho poločas je cca 2-3 h., zatímco metabolity THC v moči lze u chronického zneužívání prokázat i několik týdnů po poslední aplikaci. Toto vyšetření lze předem naplánovat, příliš nerozhoduje rychlost odezvy, ale důležitá je kvantifikace s dostatečnou přesností, tj. pravdivostí i precizností (odkaz na Analytické vlastnosti metod). Materiály využívané pro toxikologická vyšetření Spektrum materiálů užívaných při toxikologických vyšetřeních v klinických laboratořích je široké. Například: Tab. č. 12 Krev, sérum Moč Vlasy, vousy, nehty Vydechovaný vzduch, sliny Ostatní (žaludeční obsah, tkáně, ) Invazivní odběr (problematické u velmi malých dětí), vhodné jen pár hodin po intoxikaci. Neinvazivní, jed bývá v moči koncentrován, v moči se objevuje později než v krvi, ale lze i několik dní, problémy s falšováním. Unikátní možnost nahlédnutí do historie (1 cm vlasu odpovídá cca 1 měsíci). Vlasy by pokud možno neměly být chemicky narušené a kontaminované (barvy, šampony,...). Vhodné pro průkaz požití etanolu či drog. V klinických laboratořích se příliš nevyskytují - je to doména soudního lékařství a patologie. Tabulka

431 Základy toxikologie v klinické laboratoři Zaměření toxikologických vyšetření Zaměření toxikologických vyšetření (cíl vyšetření) závisí mimo jiné na době, která uběhla od intoxikace do doby odběru vzorku biologického materiálu. Například: Tab. č. 13 Stanovení noxy Většinou v krvi (séru, plazmě) bezprostředně po intoxikaci. Stanovení metabolitů noxy Většinou v moči, lze i několik dní po intoxikaci. Stanovení následků (negativních účinků noxy) Cíleně dle druhu poškození, např. jater, krvetvorby, ledvin,... Např.: toluen, olovo, léky před a po podání další dávky,... Např.: Kys. hippurová, mandlová, metabolity drog,... Např. jaterní testy u otravy paracetamolem, porfyrie u Pb,... KAPITOLA 36 Forenzní problematika Pro forenzní účely se vesměs vyžaduje výsledek potvrzený minimálně dvěma metodami založenými na rozdílných principech (např. pro etanol plynová chromatografie a Widmarkova zkouška). Toxikologická vyšetření prováděná v klinicko biochemických laboratořích jsou většinou určena pro akutní klinické případy (např. nekomunikující člověk s známkami intoxikace vyžadujícími rychlý terapeutický zásah). Pro forenzní účely se nedají dost dobře použít, třeba i jen z důvodu nedostatečně zajištěného vzorku proti případným náhodným ale i záměrným zásahům (výměna vzorku, kontaminace, aj.). Analytické techniky Na přístrojové vybavení je toxikologická problematika velmi náročná a to nejen pro vlastní analýzu, ale již pro preanalytickou přípravu vzorků. Vlastní analýza vyžaduje přítomnost rozsáhlého spektra analyzátorů a zařízení založených na různých principech. Příklady: Tab. č. 14 Spektrální systémy Chromatografické systémy Imunochemické systémy Ostatní Spektrofotometrie UV, VIS, IR, plamenová fotometrie, AAS, ICP MS, aj. TLC, GC-MS, LC, HPLC-MS, aj. FPIA, MEIA, AMIA, CMIA, EIA, ELISA, aj. Homogenizace, lyofilizace, izolace, mineralizace, prekoncentrace, aj. Tabulka Volba vhodné analytické techniky závisí především na zadání, které je v toxikologii velmi rozmanité a většinou se nejedná o rozsáhlé série podobných vzorků, jaké jsou obvyklé např. v rutinní biochemii, ale o individuální situace. Pro toxikologický screening intoxikace neznámou látkou se často začíná aplikací jednoduchých imunochemických testovacích destiček. Tyto většinou pouze kvalitativní systémy mají sice do určité míry problematickou specificitu (zkřížené reakce) a jsou k dispozici jen pro určité omezené množství druhů látek (např. 10 základních typů klasických drog), ale jejich použití je velmi jednoduché a rychlé a lze je realizovat v jakoukoliv denní i noční dobu, protože nevyžadují přítomnost erudovaného specialisty. Kvalitativní výsledek, který v prvním období klinikům postačuje, se může v případě potřeby následně kvantifikovat např. pomocí vhodné chromatografické či spektrofotometrické metody. Chromatografické techniky (GC-MS, HPLC, TLC aj.) se sice vyznačují dobrou specificitou a umožňují stanovit prakticky jakoukoliv organickou látku, ale jsou zdlouhavé, složité a nezbytnou podmínkou je zkušený a erudovaný chromatografista. Pro screening anorganických látek (např. těžkých kovů) je nejvhodnější technika ICP- -MS, ale ta se v klinických laboratořích prakticky nevyskytuje. V indikovaných případech je nutná spolupráce specializovaných 431

432 Základy toxikologie v klinické laboratoři laboratoří. Při monitorování intoxikace známou látkou je situace jednodušší. Znalost látky umožňuje využít rovnou nejvhodnější analytickou techniku. Např. pro monitorování lékové terapie (TDM) se často používají různé komerčně dostupné kvantitativní imunochemické postupy (FPIA, MEIA, aj.). Pro biologické expoziční testy (BET) v průmyslové toxikologii a hygieně (tj. stanovení toxických látek přímo v biologickém materiálu exponovaných osob) se využívají nejrůznější techniky (např. cíleně AAS pro konkrétní těžký kov, aj.). Preanalytika (odběr, úprava vzorků) KAPITOLA 36 Vzhledem k rozmanitosti vzorků jsou před vlastní analýzou nutné různé úpravy vzorků: Pevné vzorky (například vlasy) se musí nejdříve dekontaminovat (mytí střídavě ve vodné a organické fázi a vysušení), zhomogenizovat (promícháváním, mletím, stříháním, vymrazováním), někdy je třeba vysušit do konstantní hmotnosti a vždy je nutné zvážit na analytických vahách množství vzorku braného k analýze. Potom je nutné vzorek převést do roztoku, tj. zmineralizovat (v současné době nejčastěji principem tlakové mikrovlnné mineralizace v uzavřeném systému s přídavkem mineralizačních činidel). Někdy je nutná prekoncentrace, aby se dosáhlo měřitelné koncentrace (tj. např. odpaření mineralizačního zbytku téměř do sucha a následné rozpuštění v malém objemu vhodného rozpouštědla). I kapalné vzorky se před toxikologickým vyšetřením musí často upravovat (např. úprava ph vzorku přidáním vhodného činidla). Některé látky (např. léky aj.) se před analýzou izolují ze složité organické matrice biologického vzorku například vyextrahováním do vhodného organického rozpouštědla nebo se provede chromatografická separace. Omezí se tím počet potenciálně interferujících látek a zjednoduší se identifikace. V poslední době se stále častěji realizuje extrakce na pevných fázích (silikagel, katexy, anexy). Plynné a těkavé látky se izolují např. destilací nebo technikou head space, při které se analyzuje rovnovážná plynná fáze nad kapalným vzorkem. Kontrola kvality Kontrola kvality toxikologických analýz je v některých ohledech specifická. Toxikologická vyšetření totiž většinou nepředstavují velké série víceméně shodných vzorků, obvyklé v rutinní klinické biochemii. Požadavky jsou často unikátní nebo se opakují až v dlouhých a nepravidelných časových intervalech. Někdy je problém získat vhodný referenční materiál se shodnou matricí. Nejsou běžně dostupné systémy mezilaboratorní kontroly. Nicméně kontrola kvality je důležitá a naprosto nezbytná a je nutná minimálně verifikace parametrů kvality použité metody (preciznost, pravdivost, přesnost, citlivost, specifičnost, recovery, ) (Odkaz na analytické vlastnosti metod). Je zřejmé, jaké negativní důsledky může pro vyšetřovaného mít např. falešně pozitivní (je nevinně zařazený do seznamu osob zneužívajících drogy) nebo naopak falešně negativní nález (neproběhne terapie proti pozdním následkům intoxikace způsobených nerozpoznanou látkou). Nejčastější intoxikace Poruchy funkce hemoglobinu Nejznámější i nejčastější jsou otravy oxidem uhelnatým (CO), ke kterým dochází při nedokonalém spalování uhlí nebo plynu (tzv. karmy v koupelnách) nebo při hromadění výfukových plynů v uzavřeném prostoru (garáže). V současnosti se frekvence otrav zvyšuje kvůli utěsňování prostor plastovými okny. Při intoxikaci (projevuje se bolestmi hlavy, slabostí, malátností, závratěmi) se CO naváže na hemoglobin za vzniku karbonylhemoglobinu (COHb). To, že COHb není schopen přenášet kyslík se u nejtěžších otrav projeví až hypoxií tkání včetně laktátové acidózy. Vazba CO na hemoglobin je sice reverzibilní, ale cca 200x silnější než vazba kyslíku. Léčba proto u závažnějších případů probíhá za zvýšeného tlaku kyslíku v hyperbarické komoře. Stanovení COHb umožňují analyzátory acidobazické rovnováhy. COHb je i v krvi neintoxikovaných osob, ale maximálně do 5%. U kuřáků lze ale nalézt koncentraci COHb vyšší než 432

433 Základy toxikologie v klinické laboratoři 10%. Při prověřování případné intoxikace CO je proto velmi důležitá informace o tom, zda je pacient kuřák či nekuřák. Další možnou otravu vyřazující transportní funkci hemoglobinu představuje oxidace Fe 2+ v hemoglobinu na Fe 3+ působením dusitanů, dusičnanů a některých léků, při níž vzniká methemoglobin (MetHb). Zvlášť nebezpečné je to u novorozenců, kteří mají nezralý systém redukující MetHb. Proto je hladina přípustné koncentrace dusičnanů v pitné vodě mnohem nižší než pro dospělé. Jsou i další, ale naštěstí již jen vzácně se vyskytující, možnosti, jako je například vznik sulfhemoglobinu (SulfHb) při otravě sirovodíkem nebo kyanhemoglobinu (CNHb) při otravě kyanovodíkem a kyanidy. KAPITOLA 36 Otravy těžkými kovy Existuje řada definic těžkých kovů. Některé určují těžké kovy podle hustoty, jiné podle atomové hmotnosti či podle toxicity. Těžké kovy používané člověkem zamořují životní i pracovní prostředí. Většinou mají dlouhý biologický poločas, proto se postupně hromadí v exponovaných organizmech. Mezi netypičtější těžké kovy patří olovo, kadmium, rtuť, měď, chrom, mangan, hliník, vanad, nikl, aj. Olovo je zřejmě historicky nejdéle používaný těžký kov (PbO jako sladidlo, vodovodní trubky, olovnatý benzín, akumulátory, barvy, ochrana před radiací, aj.). Pb má silnou afinitu ke kostem, kam se kumulativně ukládá. Pb má schopnost nahradit jiné biologicky důležité prvky (Ca, Fe, Zn) ve vazbě na skupiny -SH, -NH 2, - COOH,... v proteinech a dalších molekulách. Po navázání Pb tyto látky fungují jinak, což má za následek řadu negativních jevů (toxicitu). Například: Tab. č. 15 Inhibice d-ala - dehydratázy NMDA receptorů v mozku Tabulka Následek Poškození syntézy hemoglobinu Zhoršení dlouhodobé paměti Z historie je známá řada slavných intoxikací Pb: - Ludwig van Beethoven trpěl od mládí chronickými břišními bolestmi, v 2002 byly analyzovány kosti a vlasy s nálezem vysokých koncentrací olova. - Francisco Goya - malíř se intoxikoval olovnatými barvami. - Sir John Franklin - polární cestovatel zahynul s celou výpravou v Grónsku kvůli konzervám které byly uzavřeny olovem. S otravami olovem se ale setkáváme i v současnosti (u nás i ve světě) a to často v různých nečekaných souvislostech: - Zdravotnická rodina se akutně intoxikovala z keramické konvice s Pb glazurou, do které si připravovala čaj s citronem, protože nechtěla pít přímo chlorovanou vodu z vodovodu. - Mladá žena se otrávila Pb užíváním volně prodejného přípravku Femikalp. Sušené indické rostliny mající povzbuzovat životní funkce, které přípravek obsahoval, byly bohužel silně kontaminované olovem. - Rozsáhlá skupina příbuzných byla extrémně exponovaná olovu, protože si zaměnili červenou práškovou papriku za suřík, což je prášková základová barva (oxid olovnato - olovičitý), která má přesně barvu červené papriky. - Skupina restaurátorů se dostala do expozice Pb při restaurování 300 let starých nástěnných maleb v kláštěře Teplá. Staré historické barvy totiž obsahovaly Pb. Postupné zlepšování znalostí o toxicitě látek, zde konkrétně diskutovaného Pb a jeho sloučenin vede k postupnému snižování nejvýše přípustných limitů. Například nejvýše přípustný limit koncentrace Pb v krvi dětí klesl z hodnoty 600 µg/l v letech na současných 100 µg/l. Léčení intoxikovaných osob spočívá především ve vyloučení nakumulovaného olova z organizmu pomocí injekcí chelátu, které uvolní Pb z depa v kostech a vyloučí ho močí. Kadmium je spojováno s po celém světě známým syndromem itai-itai, což byl následek intoxika- 433

434 Základy toxikologie v klinické laboratoři ce Cd (odpady z továrny do moře a konzumace kontaminovaných ryb. Typické je poškození buněk proximálního tubulu ledvin - může dojít až k tubulární nekróze. Stanovuje se koncentrace Cd v séru, moči a vlasech, možností volby je např. stanovení beta-2-mikroglobulinů v moči jako indikátoru tubulárního poškození. Rtuť je obdobně spojována s japonským jménem Minamato jako synonymum otravy lidí z životního prostředí. Liší se toxické působení anorganických a organických sloučenin rtuti. Nejčastěji jsou uváděna neurologická poškození ale postiženy bývají i ledviny a plíce. Počáteční příznaky jsou nespecifické, slabost, únava, bolesti hlavy, později se objevuje charakteristický třes a tremor (doporučuje se provést zkoušku písma). Stanovuje se koncentrace rtuti v krvi, moči a vlasech. KAPITOLA 36 Otravy alkoholy V našich podmínkách je velmi rozšířené používání etanolu s všeobecně známými projevy. Požití větších dávek lze již ale označit za intoxikaci s akutními i chronickými následky. Etanol se (analogicky jako všechny alkoholy, které se obecně metabolizují na aldehyd a potom na kyselinu) metabolizuje působením enzymu alkoholdehydrogenázy za vzniku acetaldehydu a následně kyseliny octové. U otrav etanolem (analogicky i u dalších alkoholů) se nachází výrazně vyšší osmolalita v séru. Osmolalita se nechá jednak změřit, jednak vypočítat podle vzorce: 2 x Na + urea + glukóza. Hodnotí se rozdíl mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou (osmolální gap). Odkaz na kapitolu o osmolalitě. Relativně časté jsou intoxikace metanolem, ke kterým dochází při záměnách s etanolem. Metabolizuje se na formaldehyd a potom na kyselinu mravenčí. Je to silně toxická látka (letální dávka pro dospělého člověka je 50 ml metanolu), typickým trvalým následkem po otravě metanolem je poškození očního nervu vedoucí ke slepotě. Vzniká také těžká metabolická acidóza. Při léčbě se využívá analogického metabolizmu a jako antidotum se podává etanol. Enzym alkoholdehydrogenáza je potom zaměstnán přebytkem etanolu a formaldehyd odpovědný za poškození očního nervu vzniká v omezené míře. Obdobně při záměnách (neoznačené nádoby) nebo sebevraždách dochází k otravám etylénglykolem, obsaženým v nemrznoucích kapalinách (Fridex). Metabolizuje se až na kyselinu šťavelovou. Dochází k poškození ledvin. Vzniká těžká metabolická acidóza. V moči může být záplava krystalů štavelanu vápenatého. Významný je nárůst sérové osmolality. Obdobně i zde se jako antidotum podává etanol, samozřejmě vedle dalších zásahů, jako je u těžkých případů dialýza. Otravy léky K otravám léky dochází nejen ze sebevražedných úmyslů, ale i v důsledku záměn (dítě si myslí, že barevné pilulky jsou cukroví) a chyb (nedopatřením se podá další dávka nebo větší koncentrace léku apod.). Naměřená koncentrace léku v krvi se hodnotí v závislosti na době, která uběhla mezi intoxikací a odběrem vzorku. K tomu účelu existují různé nomogramy. Například z nomogramu k vyhodnocení významnosti nalezené koncentrace paracetamolu lze proložením určit, že koncentrace 50 mg/l paracetamolu naměřená ve vzorku odebraném 8 h. po intoxikaci vylučuje významné poškození jater. 434

435 Základy toxikologie v klinické laboratoři KAPITOLA 36 * * Obr.ázek 36.5 Nomogramy odnotící významnost pravděpodobných toxických účinků paracetamolu a salicylátů na naměřené hladině a času od intoxikace. Paracetamol (acetaminofen) obsažený v řadě léků, jako je např. Paralen může při předávkování těžce poškodit játra. Salicyláty (kyselina acetylsalicylová) např. lék Aspirin vyvolává metabolickou acidózu, po proniknutí do CNS dráždí dechové centrum, což má za následek respirační alkalózu. (Odkaz na kapitolu ABR.) Drogy Zřejmě po celou svou historii se lidstvo setkává s problematikou drog, tj. často zneužívaných a bohužel vesměs návykových látek. Jednotlivé společenské celky se časem jakž takž naučily základní pravidla zacházení se svojí drogou, takže situace byla celospolečensky únosná, i když samozřejmě docházelo k osobním tragediím. Problémy se celosvětově vyhrotily, když v rámci globalizace pronikly jednotlivé drogy na nová území. Například je z historie známo, jakou katastrofu způsobil alkohol (běžně používaný v Evropě) mezi Indiány v Americe. Naopak v Evropě způsobují velké problémy opiáty z Asie nebo kokain z Jižní Ameriky. V současné době se vše navíc komplikuje tím, že vedle přírodních dlouho známých drog se objevují nové - syntetické drogy, vyráběné za účelem zisku, bez ohledu na následky u závislých osob (zničené zdraví, kriminalita, negativní sociální dopady v rodině i ve společnosti). Klasické drogy Tzv. klasické drogy se dají v zásadě rozdělit do čtyř základních skupin, které se mezi sebou liší vzhledem, účinky, průběhem závislosti i mírou rizika pro uživatele. Některé z těchto látek se používají i terapeuticky (např. opiáty při tlumení bolesti), jiné jsou čistě zneužívané drogy (např. stimulační látky ze skupiny amfetaminů). Běžně se v laboratořích aplikují jednoduché prostředky (destičky) umožňující na imunochemickém principu detekovat přítomnost drog. 435

436 Základy toxikologie v klinické laboratoři KAPITOLA 36 Obrázek 36.6 Příklad screeningové destičky umožňující detekci 10 druhů zneužívaných látek v moči. Vyhodnocení je jednoduché: 2 čárky = negativní, 1 čárka = pozitivní Konopné drogy Zřejmě nejznámější je marihuana, což je směs listů, květů a stonků rostliny Cannabis sativa (indica). Aplikuje se kouřením (jointy), projevuje se poruchami vnímání, emocí, myšlení, poškozuje krátkodobou paměť. Označuje se také jako THC podle aktivní látky, tj. tetrahydrokanabinoidu. Počítá se mezi tzv. měkké drogy. Dlouhodobě se vede názorový boj mezi těmi, kdo chtějí tuto drogu zlegalizovat (v analogii k etanolu a nikotinu) a jejími odpůrci, kteří argumentují tím, že THC bývá často vstupní fází pro aplikaci tvrdých drog. Silnější účinky má hašiš, což je konopná pryskyřice s obdobnými, ale mnohem silnějšími účinky než marihuana. Opiáty Opioidy představují širokou skupinu alkaloidů s chemickou strukturou podobnou morfinu, který se spolu s dalšimi (kodein, thebain a papaverin) vyskytuje ve šťávě z nezralých makovic máku Papaver somniferum.vedle těchto ryze přírodních opioidů jsou běžné polosyntetické látky, jako je heroin (polosyntetický derivát morfinu) nebo buprenorfin (polosyntetický derivát thebainu), známý jako substituční lék SUBUTEX. Další při substituční odvykací léčbě podávanou látkou je syntetický preparát methadon. Opioidy se aplikují hlavně intravenózními injekcemi, ale i kouřením či šňupáním. Zpočátku aplikace přináší pocit euforie a útlum bolesti. Při intoxikaci větší dávkou dochází k útlumu, spavosti, zvracení, zúžení zornic až k zástavě dýchání (existuje klinicky používané antidotum - naltrexon). V důsledku návykovosti se po vysazení obvyklé dávky objevují abstinenční příznaky, jako je pocení, malátnost, úzkosti, deprese, nespavost, horečka. Postižený dělá vše pro to, aby získal další dávku, která ale musí být stále silnější. Stimulační drogy Nejznámější přírodní stimulační drogou je alkaloid kokain izolovaný z keře Erythroxylon coca rostoucího v Jižní Americe. Aplikuje se vdechováním prášku nebo jen žvýkáním listů. Silně stimuluje CNS, vyvolává euforii a pocit neúnavnosti. Způsobuje ale silnou psychickou závislost. Do této skupiny patří dále syntetická droga metamfetamin (Pervitin, známý jako perník ) s účinky podobnými kokainu. Mezi mládeží je velmi rozšířená extáze (taneční droga), což je derivát metamfetaminu, aplikovaný ve formě tabletek. Halucinogeny Existují přírodní, jako například psilocybin obsažený v houbách lysohlávkách (Psilocybe bohemica) nebo tryptaminy na kůži ropuch, ale i syntetické, jako například nejznámější kyselina lysergová (LSD). Jak název napovídá, látky této skupiny způsobují 436

437 Základy toxikologie v klinické laboratoři euforii a halucinace. Například se uvádí, že po olíznutí ropuchy může mít dotyčná dojem, že má před sebou prince (jev běžně uváděný v pohádkách). Bohužel ale současně dochází k depresím, paranoie, poškození jater a ledvin. Nové drogy V poslední době se objevují stále nové a nové, často plně syntetické drogy, na které zatím nejsou v rutinních laboratořích k dispozici žádné prostředky pro identifikaci. GHB (gama-hydroxybutyrát), tzv. kapalná extáze 1,4 - butandiol, tzv. bouřlivý nektar Ketamin, anestetikum veterinářů, častá příměs extáze Tryptaminy, látky podobné serotoninu, syntetické i přírodní KAPITOLA 36 Problematika falšování Při monitorování osob podezřelých z požívání návykových látek je nutno dávat pozor na snahy o falšování, tj. znemožnění průkazu požití drogy např. naředěním vzorku moče, nebo přilitím Sava, kyselin, zásad aj. Proto existují detekční destičky, kde vedle vlastního průkazu drog jsou pomocné testy umožňující prokázat nežádoucí zásahy do vzorku změnou zabarvení kontrolního políčka. Obrázek 36.7 Příklad screeningové destičky pro zachycení 5 zneužívaných látek, která je doplněná pomocnými kontrolními políčky na průkaz naředění vzorku moče (kreatinin a specifická hmotnost), na přidání kyselin či zásad (ph), na redukující látky (nitrity) a na oxidující látky (Bleach). Vyhodnocuje se podle změny barvy příslušného políčka. Ostatní otravy Jak bylo uvedeno v úvodu, člověk se může otrávit prakticky čímkoliv, záleží na dávce. Uvést vše by zdaleka přesahovalo rozsah tohoto textu. Proto jsou zde jen příklady: = Rozšířené jsou otravy organofosfáty. Organofosfáty se totiž nevyskytují jen jako bojové látky (sarin, soman, aj.), ale běžně se používají v zemědělství, při deratizaci apod. Při profesionální činnosti se jako nejvýše přípustný limit uvádí 30% pokles aktivity cholinesterázy. Akutně intoxikovaný umírá v křečích v důsledku inhibice enzymu acetylcholinesterázy na nervosvalové ploténce. = Časté jsou chronické ale i akutní intoxikace organickými rozpouštědly ( toluen, xyleny, benzen, trichloretylén, styrén, aj. ) používanými při barvení, natírání, laminování, rozpouštění, číštění aj. Běžně se stanovují metabolity v moči, například kyselina mandlová u styrénu, kyselina hippurová u toluenu, fenol u benzenu, trichloretanol a kyselina trichloroctová u trichloetylénu, aj. Dochází k poškozování jater, abortům, návyku, aj. = Existuje celá řada toxických rostlin v životním i domácím prostředí, které způsobují řadu otrav, nejčastěji u dětí. 437

438 Základy toxikologie v klinické laboratoři Například: Tab. č. 16 Rostlina Toxická látka (projevy) Obrázek (zdroj Internet -Wikipedie ) Bolševník velkolepý Fototoxické kumariny (při kontaktu s pokožkou obtížně léčitelné fotodermatitidy) KAPITOLA 36 Diffenbachie Kyselina šťavelová (acidóza, poškození ledvin) * Durman Alkaloid atropin (zneužíván - excitace, halucinace) * Rulík zlomocný Alkaloidy tropin a atropin (až smrt kvůli respirační paralýze) * Tis červený Alkaloid buxamin (křečový jed, zvracení, koliky,svalové bolesti) * * 438

439 Základy toxikologie v klinické laboratoři Pryšec (trnová koruna) Dráždivý latex (podráždění pokožky, sliznic a oka - až ztráta zraku) KAPITOLA 36 Muchomůrka zelená Cyklické peptidy amanitin a faloidin (poškození jater a ledvin až po 3-4 dnech) * Tabulka * = Existuje nepřeberné množství různých přípravků, které se běžně vyskytují i v domácnostech. Například: Tab. č. 17 Přípravek Manganistan draselný Chlornan sodný Jedy na myši Kyseliny Louhy Modrá skalice Komentář Je k dostání v podobě fialových krystalků jako HYPERMANGAN V čistících prostředcích, např. SAVO. Barevné granule (antikoagulancia). Přípravky na odstraňování vodního kamene Čističe potrubí Síran měďnatý, ochrana rostlin proti plísním, např. KUPRIKOL Tabulka Příčiny: Záměny, neoznačené nebo nevhodné obaly Jednou z nejčastějších příčin otrav jsou špatně označené či vůbec neoznačené nádoby. Dochází potom k záměnám s často tragickými konci. Například: V lahvi od koňaku uchovávaná nažloutlá koncentrovaná kyselina chlorovodíková. Do lahve od limonády přelitý trichlorethylen. Častá je i výrobci zvolená nevhodná forma obalů. 439

440 Základy toxikologie v klinické laboratoři Například: Tab. č. 18 Přípravek Čistič potrubí (KRTEK) - hydroxid sodný (obrázek krtka děti přitahuje a obsah dětem připomíná šuměnku) Obrázek KAPITOLA 36 Gelové svíčky jako nápoje (vzhled navozuje představu ovocného želé) Tabulka % dětských otrav se odehraje v domácnosti. Nejohroženější jsou batolata (1-3 roky), protože u nich dochází k rozvoji pohybových aktivit, dostanou se tam, kam se dosud nedostaly, jsou přitom zvědavé a nedílná součást poznávání je u nich vkládání předmětů do úst. 440

441 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Autor: MUDr. Tomáš Franěk Recenzenti: MUDr. Richard Pikner, Ph.D. KAPITOLA 37 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Vyšetřeníhormonůpřiovariálníchatestikulárníchporuchách Vyšetření hladin pohlavních hormonů případně jejich metabolitů tvoří neodmyslitelnou součást vyšetření v gynekologii, asistované reprodukci, urologii a endokrinologii. U žen se tato vyšetření používají zejména v diagnostice infertility, při poruchách menstruačního cyklu, a při diferenciální diagnostice hirsutismu a virilizace. U mužů jsou doplňkovým vyšetřením při nemocech gonád, při infertilitě a onkologických onemocněních mužského urogenitálního systému. V dětství je hlavní indikační skupinou diferenciální diagnostika hypogonadismu a hyperfunkční syndromy spojené s projevy předčasné puberty. Při vyšetřování pohlavních hormonů je nutné brát v úvahu několik specifických okolností charakteristických právě pro tuto skupinu. Je nutné si uvědomit, že hormony jsou vylučovány v cirkadiánním rytmu a často v pulzech. U žen je dále třeba brát v úvahu právě probíhající fázi menstruačního cyklu. Dále je třeba neopomenout i analytické rozdíly v referenčních hodnotách jednotlivých laboratoří, proto je velmi vhodné používat k vyšetření jednu laboratoř a následně pracovat pouze s předem daným neměnným referenčním rozmezí příslušné laboratoře. Vyšetření LH Úvod LH LH neboli luteotropin je glykoprotein o relativní molekulové hmotnosti asi 32 kda, který je secernován bazofilními gonadotropními buňkami předního laloku hypofýzy. Stejně jako FSH je tvořen α podjednotkou, společnou pro některé další hormony předního laloku hypofýzy a podjednotkou β, která je pro daný hormon specifická, určuje jeho biologickou i imunologickou specifitu a umožňuje rozlišení LH od ostatních glykoproteinových hormonů. Sekrece LH je řízena hypotalamickým dekapeptidem GnRH tvořeným v hypothalamu odkud se pulsativně (každých minut) vyplavuje portálním venózním systémem do hypofýzy. Jeho sekrece je regulována jednak centrálně neurotransmitery centrálního nervového systému a jednak periferně působením pohlavních steroidních hormonů. Sekrece LH je tak ovlivňována složitým mechanismem pozitivních a negativních zpětných vazeb. Receptory pro LH patří do skupiny receptorů spjatých s adenylátcyklázou aktivovanou přes proteiny G. Funkcí LH je působení na thekální buňky ovarií, kde dochází ke stimulaci syntézy steroidů, jež jsou následně, za přispění FSH, přeměňovány na estradiol. Dále je LH odpovědný za konečné zrání vaječníkových folikulů a vyvolává též ovulaci a počáteční vývoj žlutého tělíska s následnou sekrecí progesteronu. U mužů LH stimuluje syntézu testosteronu v Leydigových buňkách intersticiální tkáně varlat. Vyšetřením FSH a LH můžeme využít v rámci diferenciální diagnostiky mezi periferním a centrálním hypogonadismem. U periferního hypogonadismu jsou hodnoty LH a FSH zvýšené (tzv. hypergonadotropní hypogonadismus) a u centrálního hypogonadismu jsou normální nebo častěji snížené. Diagnostický význam má i stanovení LH a FSH u syndromu polycystických ovarií, kde hodnota FSH klesá nebo je normální a hodnota LH stoupá, takže poměr LH/FSH se na rozdíl od zdravých jedinců zvyšuje. Analytika vyšetření LH Nejvhodnějším materiálem k vyšetření LH je krevní sérum, proto je vhodné používat k odběru odběrové soupravy s akcelerátorem hemokoagulace. U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu, je proto vhodné uvést den cyklu. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, materiál musí být zpracován do 8 hodin po odběru, uchovává se dobře uzavřený při 7 ± 5 o C, a to maximálně 48 hodin. Pro delší skladování lze vzorky skladovat při -20 o C. Po rozmražení není vhodné vzorek znovu zmrazit. Nejčastěji používané metody ke stanovení jsou RIA a CMIA. Indikace k vyšetření LH 441

442 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch amenorhea, dysmenorhea, oligomenorhea, infertilita, primární a sekundární hypogonadismus, st.p. léčbě cytostatiky nebo po ozáření, atypie v pohlavním zrání u dětí, traumata a tumory hypofýzy, gonadální dysgeneze, vybrané chromozomální aberace, poruchy hypotalamo-hypofyzárně-gonadální osy, Referenční rozmezí 0 1 rok : 0,02 8 IU/l pro obě pohlaví 1 10 let: 0,04 3,9 IU/l pro obě pohlaví KAPITOLA 37 Muži let: 0,56 7,8 IU/l Muži nad 15 let: 1,2 10 IU/l Fertilní ženy: folikulární fáze cyklu 2-13 IU/l ovulační pík IU/l luteální fáze cyklu 1 19 IU/l Ženy v menopause: UI/l Interpretace zvýšené hodnoty primární insuficience vaječníků, Turnerův syndrom, climacterium praecox, gonadotropinomy, fyziologicky v menopauze, primární hypogonadismus u mužů snížené hodnoty traumata a tumory hypofýzy, mentální anorexie, sekundární insuficience vaječníků, pseudopubertas praecox vyšetření FSH Úvod k FSH FSH nebo-li follitropin (FSH) je glykoprotein o relativní molekulové hmotnosti asi 30 kda, který je secernován bazofilními gonadotropními buňkami předního laloku hypofýzy. Strukturálně se skládá ze dvou nekovalentně vázaných podjednotek α a β. Podjednotka α je společná pro všechny glykoproteinové hormony hypofýzy (TSH, LH). Podjednotka β je specifická pro daný hormon a určuje biologickou a imunologickou specifitu hormonu. Tvorba tohoto hormonu je řízena složitým mechanismem pozitivních a negativních zpětných vazeb. Sekrece se děje v pulsových vlnách vlivem sekrece LH-FSH releasing hormonu z hypotalamu. Inhibičně na produkci FSH působí inhibin, dimerický glykoprotein ze skupiny cytokinů. Receptory pro FSH jsou společné i pro LH, jedná se o receptory hadovitého typu spojené s adenylátcyklázou přes proteiny G. Funkcí FSH je stimulace růstu a dozrávání ovariálních folikulů, společně s LH podporují sekreci estrogenů a podílí se na změně endometria v proliferativní fázi menstruačního cyklu. V menopauze po vyhasnutí funkce ovariálních folikulů dochází k poklesu produkce steroidů a postupnému snižování zpětnovazebné inhibice sekrece FSH. To je důvod, proč koncentrace FSH jsou proto v klimakteriu výrazně vyšší než ve fertilním období. U mužů stimulací Sertoliho buněk pomáhá udržovat spermatogenní epitel, ovlivňuje syntézu inhibinu a vazebného proteinu pro androgeny (SHBG) v semenotvorných tubulech. Vyšetřením FSH a LH můžeme využít v rámci diferenciální diagnostiky hypogonadismu tj. rozlišení mezi periferní a centrální příčinou. U periferního hypogonadismu jsou hodnoty LH a FSH zvýšené (tzv. hypergonadotropní hypogonadismus) a u centrálního hypogonadismu jsou normální nebo častěji snížené. Diagnostický význam má i stanovení LH a FSH u syndromu polycystických ovarií, kde hodnota FSH klesá nebo je normální a hodnota LH stoupá, takže poměr LH/FSH se na rozdíl od zdravých jedinců zvyšuje. Analytika vyšetření FSH Nejvhodnějším materiálem k vyšetření LH je krevní sérum, proto je vhodné používat k odběru odběrové soupravy s akcelerátorem hemokoagulace. U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu, je proto vhodné uvést den cyklu. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, materiál musí být zpracován do 8 hodin po odběru, uchovávají se dobře uzavřené při 7 ± 5 o C, a to maximálně 48 hodin. Pro delší skladování lze vzorky skladovat při -20 o C. Po rozmražení není vhodné vzorek znovu zmrazit. Nejčastěji používané metody ke stanovení jsou RIA a CMIA. 442

443 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Indikace amenorhea, dysmenorhea, oligomenorhea, infertilita, primární a sekundární hypogonadismus, st.p. léčbě cytostatiky nebo po ozáření, atypie v pohlavním zrání u dětí, traumata a tumory hypofýzy, gonadální dysgeneze, vybrané chromozomální aberace, poruchy hypotalamo-hypofyzárně-gonadální osy, Referenční rozmezí KAPITOLA rok : 0,02 8 IU/l pro obě pohlaví 1 10 let: 0,04 3,9 IU/l pro obě pohlaví Muži let: 0,56 7,8 IU/l Muži nad 15 let: 1,2 10 IU/l Fertilní ženy: folikulární fáze cyklu 2-13 IU/l ovulační pík IU/l luteální fáze cyklu 1 19 IU/l Ženy v menopause: UI/l Interpretace Zvýšené hodnoty primární insuficience vaječníků, Turnerův syndrom, climacterium praecox, gonadotropinomy, fyziologicky v menopauze, primární hypogonadismus u mužů Snížené hodnoty traumata a tumory hypofýzy, mentální anorexie, sekundární insuficience vaječníků, pseudopubertas praecox Vyšetření sex hormone binding globulin SHBG Úvod SHBG neboli sex hormone binding globulin je protein o molekulové hmotnosti 90 kda, složený ze dvou podjednotek, tvořený v játrech s biologickým poločasem přibližně 7 dní. Při elekroforéze se pohybuje v oblasti β-globulinů. Hlavní funkcí SHBG je transport steroidních hormonů k cílovým buňkám v celém těle. Přenos v komplexu SHBG-hormon se uplatňuje zejména při transportu testosteronu, estradiolu, estriolu, estronu, dihydroepiandrosteronu (DHEA) a 5-dihydrotestosteronu (DHT). Díky vysoké afinitě hormonů k SHBG cirkuluje asi 98% hormonů vázaných právě na tento protein. Vzhledem k asi 100krát vyšší afinitě hormonů k SHBG než k albuminu, jsou však pro cílové buňky snáze dostupné převážně hormony vázané na albumin. Analytika Nejvhodnějším materiálem k vyšetření SHBG je krevní sérum, proto je vhodné používat k odběru odběrové soupravy s akcelerátorem hemokoagulace. Dále se doporučuje odebírat krev na lačno. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, materiál musí být zpracován do 8 hodin po odběru, uchovávají se dobře uzavřené při 7 ± 5 o C, a to maximálně 48 hodin. Pro delší skladování lze vzorky skladovat při -20 o C. Po rozmražení není vhodné vzorek znovu zmrazit. Nejčastěji používané metody ke stanovení jsou RIA, ECLIA elektrochemiluminiscence. Indikace Hyperandrogenní syndrom, dále je stanovení doporučováno v případech vysokých či nízkých hladin testosteronu, které jsou klinicky němé. Stanovení SHBG má význam pro výpočet indexu volného testosteronu (viz TFI index). 443

444 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Referenční rozmezí Muži let: 14,5 48,4 nmol/l Ženy let: 26,1 110 nmol/l Ženy po menopauze (bez hormonální substituce): 14,1 68,9 nmol/l Interpretace KAPITOLA 37 Zvýšené hodnoty hypertyreóza, užívání HAK a antiepileptik, fyziologicky v graviditě a u starších mužů, jaterní cirhóza, hepatitidy Snížené hodnoty obézní pacienti, hypotyreóza, při zvýšených hladinách androgenů, alopecii, polycystická ovaria, hirsutizmus TFI index Stanovení SHBG má význam pro výpočet indexu volného testosteronu (tzv. TFI index), který lépe informuje o možném zvýšení biologicky aktivní volné frakce testosteronu. TFI = Testosteron (nmol/l) / SHBG (nmol/l) Vyšetření testosteronu Úvod Testosteron je patří k nejvýznamnějším zástupcům mužských pohlavních hormonů. Molekulová hmotnost tohoto hormonu je 288,4 kda. Syntéza testosteronu začíná vytvořením pregnenolonu z cholesterolu, reakcí katalyzované 20α-hydroxylázou. Jeho tvorba u mužů probíhá pod vlivem luteinizačního hormonu v Leydigových buňkách varlat, u žen jsou hlavním producentem testosteronu ovaria a v menším množství i kůra nadledvin. U žen se však denně vytvoří asi pouze 5-10% z množství vytvořeného u mužů. V cirkulaci se testosteron vyskytuje ve třech různých formách. Jednak malá část se vyskytuje volně (1-2,5%), další frakce je vázaná slabou vazbou na albumin a poslední frakce vytváří pevnou vazbu s SHBG. Rozdílná pevnost vazby testosteronu k proteinům určuje i jeho biologickou dostupnost. Proto slabá vazba testosteronu k albuminu a volná frakce testosteronu vytváří tzv. biologicky dostupný testosteron. Hladiny testosteronu vykazují během vývoje velké výkyvy v závislosti na věku a pohlaví. U novorozenců mužského pohlaví je po porodu koncentrace testosteronu lehce zvýšená oproti novorozencům ženského pohlaví. Po dobu následujících tří měsíců dochází u chlapců k vzestupu a poté do konce prvního roku opět k poklesu, ačkoliv ve srovnání s děvčaty je hladina nepatrně vyšší. Ve věku 6-7 dochází k počátku puberty spojenému s počátkem nočních pulzů LH, které vedou k zvyšování hladiny testosteronu. V tomto období je zvýšení hladin testosteronu důležité pro správný rozvoj sekundárních pohlavních znaků a kostní denzity. Ve věku let dochází k ukončení puberty a stabilizaci hladin testosteronu, který přetrvává po celou dobu dospělosti. Přibližně ve věku 50 let dochází u mužů k postupnému poklesu, který však vykazuje velké interindividuální rozdíly. Tento pokles je zodpovědný za pokles sexuální aktivity a snížením fyzické výkonnosti. Tento stav lze nazvat tzv. andropauzou, stavem ekvivalentním k menopauze u žen. Stejně jako většina ostatních pohlavních hormonů vykazuje testosteron diurnální rytmus, kdy ranní hladiny jsou asi o 25-30% nižší než večerní. U mužů je testosteron zodpovědný za vývoj sekundárních pohlavních znaků, hlasu, ovlivňuje kostní denzitu a svalovou hmotu a má nezastupitelnou úlohu v sexuálních funkcích a libidu. U žen ovlivňuje růst pubického a axilárního ochlupení a stejně jako u mužů ovlivňuje libido. Patologicky snížená hladina testosteronu je zodpovědná za stav zvaný hypogonadismus, který zahrnuje 3 velké podskupiny. Jedná se o hypogonadotropní hypogonadismus, hypergonadotropní hypogonadismus a tzv. syndrom testikulární feminizace. Hypogonadotropní (sekundární) hypogonadismus je podmíněn sníženou funkcí intaktních gonád, způsobenou nejčastěji vrozeným či získaným panhypopituitarismem, GnRH deficiencí, hyperprolaktinémií, malnutricí či mentální anorexií. Typickým nálezem jsou snížené hladiny LH a FSH. Hypergonádotropní (primární) hypogonadismus je způsoben gonadální dysfunkcí a pacienti mají vyšší hladiny LH a FSH. Příčiny hypergonadotropního hypogonadismu jsou poškození gonád (radiace, choroby,vývojové vady, tumory, drogy), dále pak špatný vývoj gonád u pacientů s chromozomálními aberacemi a enzymatické defekty v syntéze androgenů. Syndrom testikulární feminizace je způsoben defektem v androgenním receptoru, postižení jedinci mají ženský vzhled, genitál tvoří slepě zakončená vagina s přítomností varlat. Hladiny testosteronu u těchto pacientů jsou normální nebo lehce zvýšené. U žen způsobují vysoké 444

445 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch hladiny testosteronu virilizaci, pro kterou je typické zvětšení klitorisu, zvýšený růst tělesného ochlupení spojený se zvýšenou proliferací a sekrecí z mazových žlaz. Dále je často přítomno akné, růst vousů a prohloubení hlasu. Analytika Nejvhodnějším materiálem k vyšetření testosteronu je krevní sérum, proto je vhodné používat k odběru čisté odběrové soupravy nebo odběrové soupravy s akcelerátorem hemokoagulace. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, materiál musí být zpracován do 8 hodin po odběru. Vzorky je možné uchovat 2 dny při 2 8 C, pro delší skladování (1 měsíc) lze zamrazit na -20 C. Po rozmražení se už nesmí znovu mrazit. Nejčastěji používané metody ke stanovení jsou RIA a CMIA. KAPITOLA 37 Indikace U mužů: hypogonadismus, infertilita, u chlapců dif. dg. pubertas praecox, monitorování substituce U žen: androgenní stavy, hirsutismus, poruchy menstruace, akné Referenční rozmezí Muži let: nmol/l Muži nad 60 let: 0 10 nmol/l Ženy nad 15 let: 0,15 2,6 nmol/l Interpretace Zvýšené hodnoty krátkodobá intenzivní fyzická zátěž, tumory testes a ovárií, hyperplázie a tumory nadledvin, užívání anabolik Snížené hodnoty enzymatické defekty syntézy testosteronu, primární a sekundární hypogonadismus, dlouhodobá fyzická zátěž, abusus drog, onemocnění jater, léky např. ketokonazol, Klinefelterův syndrom Vyšetření progesteronu Úvod Progesteron je C 21 steroidní hormon (molekulová hmotnost 314,5 kda), produkovaný žlutým tělískem, placentou a v malých množstvích i ovariálním folikulem a kůrou nadledvin. Je významným intermediárním produktem při biosyntéze steroidních hormonů ve všech steroidogenních tkáních a v malých množstvích přechází do krve ve varlatech a v kůře nadledvin. V cirkulaci se progesteron se vyskytuje jednak volný (asi 2% celkového množství) a jednak vázaný na albumin (18% celkového progesteronu) nebo na SHBG (80% celkového progesteronu). Progesteron má relativně krátký poločas rozpadu, prvním krokem inaktivace je chemická redukce při které mohou podle stupně redukce vznikat: 1) pregnandiony, 2) pregnanolony a 3) pregnanedioly. Tyto redukované sloučeniny se následně konjugují s kyselinou glukuronovou a jsou jako ve vodě rozpustné glukuronidy vyloučeny močí. Sekrece progesteronu je řízena zejména luteinizačním hormonem. V druhé polovině folikulární fáze menstruačního cyklu jsou hodnoty progesteronu nízké, avšak při luteální fázi dochází k prudkému zvýšení hladiny tzn. 6-8 dnů po ovulaci tj den menstruačního cyklu. Progesteron zde dosahuje svých vrcholových hodnot mezi nmol/l. Tento vzestup progesteronu je způsoben sekrecí ze žlutého tělíska. Pokud však nedojde k oplodnění, dochází následně k poklesu hodnot. V druhém případě, kdy dojde k oplodnění je sekrece progesteronu ze žlutého tělíska udržována lidským choriogonadotropinem. V dalším průběhu těhotenství dochází k tvorbě progesteronu i v placentě. Nejdůležitějšími cílovými orgány pro progesteron jsou děloha, prsy a mozek. V děloze progesteron stimuluje vaskularizaci endometria, endometriální žlázky se stáčejí a produkují serózní sekret. Jakmile žluté tělísko regreduje, hormonální stimulace endometria klesá a endometrium přechází do menstruační fáze. V buňkách myometria má účinek antiestrogenní, snižuje jejich dráždivost a citlivost na oxytocin, proto je nutný pro udržení těhotenství. V prsech progesteron stimuluje vývoj lobulů a alveolů. Podporuje diferenciaci tkáně vývodů, která je připravena estrogeny a podporuje v prsech sekreční funkci během laktace. Díky svému termogennímu efektu progesteron způsobuje i zvýšení bazální teploty. 445

446 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Analytika Nejvhodnějším materiálem k vyšetření progesteronu je krevní sérum, proto je vhodné používat k odběru odběrové soupravy s akcelerátorem hemokoagulace. U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu, je proto vhodné uvést den cyklu. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, materiál musí být zpracován do 8 hodin po odběru, uchovávají se dobře uzavřené při 7 ± 5 o C, a to maximálně 48 hodin. Pro delší skladování lze vzorky skladovat při -20 o C. Po rozmražení není vhodné vzorek znovu zmrazit. Nejčastěji používané metody ke stanovení jsou RIA a CMIA. KAPITOLA 37 Indikace infertilita, posouzení funkce žlutého tělíska, důkaz ovulačního cyklu Referenční rozmezí 0 10 let: 0,2 1,7 nmol/l pro obě pohlaví Muži let: 0,3 4,3 nmol/l Muži nad 15 let: 0,89 3,88 nmol/l Ženy let: 0,3 41 nmol/l Ženy nad 15 let: 0,48-89,14 nmol/l * U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu, je proto vhodné uvést den cyklu. Interpretace Hodnoty progesteronu dosahují svých maximálních hodnot den po ovulaci. Tento vzestup je podmíněn sekrecí progesteronu ze žlutého tělíska a tudíž je potvrzením proběhlé ovulace. V případě, že hladiny progesteronu jsou v tyto dny pod 25 nmol/l je to známka, že ovulace s velkou pravděpodobností neproběhla. Nižší hodnoty progesteronu produkovaným žlutým tělískem mohou být i příznakem nedostatečné luteální fáze (luteal phase deficiendy LPD), který je spojována s neplodností a časnými spontánními potraty. Ženy užívající perorální antikoncepci mají snížené hladiny progesteronu. Vyšetření estradiolu Úvod Estradiol patří mezi nejvíce biologicky aktivní látky ze skupiny ženských steroidních hormonů, které jsou odpovědné za vývoj a udržování ženských pohlavních orgánů a sekundárních pohlavních znaků. Ve spojení s progesteronem se účastní regulace menstruačního cyklu, vývoje prsů a dělohy a podílí se na udržení těhotenství, kdy koncentrace estradiolu pravidelně narůstá. Estrogeny se též podílejí na homeostáze vápníku s podpůrným vlivem na kostní denzitu. Dlouhodobý pokles estrogenů proto vede k snížení kostní denzity s následnou osteoporózou. Estrogeny mají i protektivní vliv na snížení kardiovaskulárního rizika protože zvyšují katabolismus cirkulujících LDL, pravděpodobně tím, že zvyšují počet LDL receptorů v játrech. U zdravých žen je většina estradiolu tvořena ovariálním foliklem a žlutým tělískem a v těhotenství i placentou. Malá množství estradiolu se také tvoří v kůře nadledvin a u mužů ve varlatech. Na rozdíl od varlat mají ovaria vysoce aktivní aromatázový systém, který rychle konvertuje androgeny jako např. testosteron na estrogeny. V dnešní době je známo více než 20 estrogenů, ale laboratorní stanovení je klinicky využitelné pouze u 17β-estradiolu a estriolu. Plazmatická koncentrace estradiolu má dva vrcholy sekrece. Jeden těsně před ovulací a druhý uprostřed luteální fáze. Sekreční rychlost estradiolu je 36 μg/d (133 nmol/d) v časné folikulární fázi, 380 μg/d těsně před ovulací a 250 μg/d uprostřed luteální fáze. Právě vysoké hodnoty před ovulací působí na úrovni hypofýzy ovlivnění sekrece LH, které k masivní sekreci LH, který spouští ovulaci Po menopauze klesá sekrece estrogenů k nízkým hodnotám. V krevní plazmě je minimálně 97% cirkulujícího estradiolu vázáno na plazmatické proteiny jako je SHBG a albumin. Hlavním místem inaktivace estrogenů jsou játra, kde probíhá hydroxylace, oxidace, redukce a metylace za vzniku estronu, který se dále konjuguje s kyselinou glukoronovou za vzniku ve vodě rozpustného glukuronidu a je vyloučen močí. Funkce estrogenů spočívá ve stimulaci proliferace endometria a děložní hlen se stává díky estrogenům řidší a alkaličtější, což jsou změny, které napomáhají přežívání a transportu spermií zvyšují hmotu děložního svalu a obsah kontraktilních proteinů. Vlivem estrogenů se 446

447 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch děložní sval stává aktivnějším a dráždivějším a v jednotlivých vláknech se zmnožují akční potenciály a děloha tak zvyšuje vlivem estrogenů svou citlivost na oxytocin. Analytika Zkumavka s akcelerátorem hemokoagulace nebo lithium-heparinem. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, a musí být zpracován do 8 hodin po odběru. Pokud nebudou vzorky zpracovány do 8 hodin po odběru, uchovávají se dobře uzavřené při 7 5 C, a to maximálně 48 hodin. Pro delší skladování se vzorky skladují při C. Po rozmražení se už nesmí znovu mrazit. Běžně používané metody stanovení jsou RIA a CMIA. KAPITOLA 37 Indikace U mužů: diferenciální diagnostika gynekomastie, lze využít i jako tumorový marker při germinálních tumorech varlat, choriokarcinomu, hepatomu a tumorech nadledvin produkujících estradiol U žen: monitorování indukce ovulace a ovariální hyperstimulace, dif. dg. ovariální insuficience, poruchy menstruačního cyklu, lze využít i jako tumorový marker při germinálních tumorech varlat, choriokarcinomu, hepatomu a tumorech nadledvin produkujících estradiol. Referenční rozmezí Muži: všechny věkové skupiny: pmol/l Ženy: Folikulární fáze: pmol/l Ovulační fáze: pmol/l Luteální fáze: Postmenopauzální: < 201 pmol/l Interpretace Zvýšené hodnoty tumory produkující estrogeny, mírné zvýšení u jaterní cirhózy a obezity Snížené hodnoty primární ovariální insuficience, anovulační cykly, insuficience corpus luteum Dehydroepiandrosteron sulfát DHEAS Úvod Dehydroepiandrosteron sulfát (DHEA-SO 4, DHEA-S) je steroidní hormon secernovaný za fyziologického stavu výhradně v nadledvinách, pouze u mužů malá část může pocházet z varlat. Vzhledem k výhradní produkci tohoto steroidního hormonu v nadledvinách jsou jeho zvýšené hladiny významným ukazatelem nadledvinové patologie. DHEAS má jen slabé androgenní účinky, může se však metabolizovat na silnější androgeny jako jsou androstendion a testosteron a tím být nepřímou příčinou hyperandrogenismu u hirsutismu nebo virilizace. Koncentrace DHEAS se začíná zvyšovat na počátku puberty, přibližně ve věku 6-7 let. Kdy celý komplex změn je iniciován přítomností nočních pulzů LH. Přibližně od 30 let dochází k postupnému snižování tvorby DHEAS. Zvýšené hodnoty DHEAS u žen se známkami virilizace nebo hirsutizmu nám dovolují rozlišit mezi adrenální a ovariální příčinou hirsutismu či virilizace. Vyšší hladiny DHEAS jsou zapříčiněny patologií v adrenálním systému např. tumory nadledvin, bilaterální adrenokortikální hyperplazie nebo kongenitální adrenální hyperplazie spojená s deficiencí 21-hydroxylázy, 11β-hydroxylázy či 3β-HSD. 447

448 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch Analytika Zkumavka s akcelerátorem hemokoagulace. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, po dodání do laboratoře co nejdříve centrifugován. Poté musí být zpracován do 8 hodin po odběru. Pokud nebudou vzorky zpracovány do 8 hodin po odběru, uchovávají se dobře uzavřené při 7 5 C, a to maximálně 48 hodin. Pro delší skladování se vzorky skladují při C, max. 2 měsíce. Po rozmražení se už nesmí znovu mrazit. Běžně používané metody stanovení jsou RIA a ECLIA. KAPITOLA 37 Indikace diferenciální diagnostika hirsutismu a virilizace, suspekce na tumory nadledvin, kongenitální adrenální hyperplazie Referenční rozmezí 0 7 den - obě pohlaví 2,93 16, den - obě pohlaví 0,86 11, den - obě pohlaví 0,09 3, let - obě pohlaví 0,01 0, let - obě pohlaví 0,08 2, let muži 0,66 6,70 ženy 0,92 7, let muži 1,91 13,40 ženy 1,77 9, let muži 5,73 13,40 ženy 4,02 11, let muži 4,34 12,20 ženy 2,68 9, let muži 2,41 11,60 ženy 1,65 9, let muži 1,20 8,98 ženy 0,96 6, let muži 1,40 8,01 ženy 0,51 5, let muži 0,91 6,76 ženy 0,26 6, let muži 0,44 3,34 ženy 0,33 4,18 Interpretace Zvýšené hodnoty tumory nadledvin, bilaterální adrenokortikální hyperplazie nebo kongenitální adrenální hyperplazie, syndrom polycystických ovarií Snížené hodnoty insuficience kůry nadledvin Vyšetření AMH Úvod Anti-Müllerian hormon je dimerní glykoprotein patřící do XVI. rodiny cytokinů, která zahrnuje další inhibinové a aktivinové glykoproteiny hrající důležitou roli při růstu a diferenciaci tkání. Molekula AMH obsahuje 2 monomerní jednotky, spojené disulfidickými můstky, které vytváří celek o molekulové hmotnosti 72kDa. Gen kódující lidský AMH se nachází na krátkém raménku chromozomu 19. U mužů se AMH tvoří v Sertoliho buňkách varlat a u žen probíhá tvorba pouze postnatálně v granulózových buňkách ovarií. Funkcí AMH je, jak již z názvu vyplývá, řízení sexuální diferenciace plodu mužského pohlaví. Konkrétní funkcí 448

449 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch tohoto hormonu je vyvolání a udržování fyziologické regrese Müllerových vývodů, která je dokončena přibližně v 9. týdnu intrauterinního vývoje. Při vývoji ženského embrya je právě absence AMH klíčovou substancí ve vývoji ženských pohlavních orgánů. U dospělých jedinců mužského pohlaví, nemá AMH již žádnou funkci proto jeho hladina zůstává poměrně nízká. Jiná situace je však u dospělých žen. Bylo prokázáno, že AMH hormon inhibuje tvrobu primordiálního folikulu a zároveň inhibuje vnímavost rostoucích folikulů na FSH. Bylo prokázáno, že hladina AMH je tak přímo úměrná počtu antrálních folikulů a je velmi dobrým indikátorem ovariální rezervy. Indikace KAPITOLA 37 diferenciální diagnostika intersexuálních stavů, tumory Sertoliho buněk testes, pohlavní dysgeneze gonád, tumory granulózových buněk ovarií, syndrom polycystických ovarií, poruchy metabolismu a tvorby testosteronu, dif. dg. a terapie infertility, vyšetření u IVF. Analytika Stanovení AMH je možno provádět z lidského séra nebo plazmy. Odběr proto provádíme do zkumavek bez aditiv nebo s gelovým separátorem, heparinem lithným nebo EDTA. Do laboratoře musí být vzorek transportován v den odběru, po dodání do laboratoře co nejdříve centrifugován. Poté je možno vzorky séra nebo plazmy skladovat při 2-8 C po dobu 24 hodin. Při delším skladování je nutné uchovávat vzorky zmražené při teplotě < -18 C. Metodika stanovení je např. enzymoimunoanalytické stanovení EIA. Referenční rozmezí Vzorek sérum Medián věku Referenční interval chlapci 4,8 3,8-160 dívky 5,0 ND 8,9 muži 38 1,3 14,8 ženy 30 ND 12,6 postmenopauzální ženy 71 ND Pozn. ND nelze detekovat, hodnoty byly převzaty z návodu k použití pro soupravu AMH gen II ELISA firmy Beckman Coulter. Interpretace zvýšené hodnoty tumory Sertolliho buněk testes, tumory buněk granulozy ovarií, syndrom polycystických ovarií, testikulární dysgeneze, testotoxikóza u chlapců, některé poruchy biosyntézy a syndromů necitlivosti na adrogeny snížené hodnoty kryptorchismus, anorchie, testikulární dysgeneze, předčasná menopauza. Vyšetření Inhibinů Úvod Úvod Inhibin A Inhibin B Inhibiny patří do XVI. rodiny cytokinů. Jedná se o glykoproteiny hrající nezastupitelnou úlohu v reprodukční fyziologii člověka. Základem molekuly obou typů inhibinů je glykosylovaná α-podjednotka s molekulovou hmotností a neglykosylovaná podjednotka β A v případě Inhibinu A a β B v případě Inhibinu B. Obě podjednotky β jsou spojeny podjednotkou α disulfidickými můstky. Inhibiny se vyskytují také v komplexu s vazebnými proteiny folistatinem nebo α2-makroglobulinem. Vazba aktivinu 449

450 Vyšetření ovariálních a testikulárních poruch s folistatinem ovlivňuje jeho biologickou i imunochemickou aktivitu. U žen jsou inhibiny tvořeny granulomatózními buňkami folikulu a u mužů jsou tvořeny v Sertoliho buňkách varlat. Inhibin A Molekula Inhibinu A je heterodimer tvořený ze dvou podjednotek tj. α a β A. Tento inhibin se tvoří převážně v buňkách granulózy ovarií, v těhotenství v placentě a v menší míře i v Sertoliho buňkách varlat u mužů.hlavní funkcí Inhibinu A je zpětnovazebná inhibice sekrece FSH, ačkoliv hlavním inhibitorem je Inhibin B. Klinické využití Inhibinu A je zejména diagnostika trisomie 21. chromozomu. Zařazení toho vyšetření do prenatálního screeningu spolu s AFP, hcg a nekonjugovaným E3 zvyšuje záchytnost m. Down až o 20%. Dalšími potencionálně užitečnými indikacemi vyšetření Inhibinu A je diagnostika preeklampsie, předčasného porodu a diferenciální diagnostika infertility. Inhibin A lze také využít jako marker úspěšného přenosu embrya při IVF. KAPITOLA 37 Inhibin B Molekula Inhibinu B je tvořena stejně jako molekula Inhibinu A pouze místo podjednotky β A obsahuje podjednotku β B. Hlavním místem tvorby tohoto hormonu u muže jsou Sertoliho buňky varlat, avšak nedávné výzkumy prokázaly, že i Leydigovy buňky jsou schopné produkovat podjednotky inhibinů, zejména po ukončení pohlavního zrání. Tuto skutečnost potvrzují i studie, kdy po podání rekombinantního FSH hypogonadotropním mužům dojde ke zvýšení hladiny Inhibinu B. Hlavní úlohou tohoto hormonu je řízení gametogeneze ovlivňované zpětnovazebným mechanismem pomocí FSH. U žen je Inhibin B tvořen převážně malými antrálními folikuly, což odráží skutečnost, že se jedná o citlivý marker aktuálního počtu folikulů tzv. ovariální rezervy. Z tohoto důvodu má stanovení Inhibinu B značný význam v diferenciální diagnostice infertility a je zároveň dobrým markerem předčasné menopauzy. Klinický význam stanovení Inhibinu B u mužů je rozlišení bilaterálního kryptorchismu a anorchie, v diagnostice tumorů ze Sertoliho buněk a v diferenciální diagnostice infertility a pubertas praecox. 450

451 Příprava - TDM Příprava - TDM Základní pojmy Terapeutické monitorování léků (Therapeutic Drug Monitoring - TDM) je multidisciplinární obor, který je jednou ze zásadních činností klinických farmakologů. K pochopení této disciplíny je třeba znát řadu pojmů nejen z fyziologie, farmakologie, ale také obecné biochemie a dalších disciplín. Je dobré ozřejmit si pojmy: Léčivo Účinná látka Lékové formy Způsoby aplikace léků Distribuce léčiva v organismu se liší při různých způsobech aplikace. Není jedno, zda lék byl podán intravenózně (biologická dostupnost 100%), subkutánně, intramuskulárně nebo perorálně, ve formě aerosolu, masti, pudru apod. Biologickou dostupností léčiva rozumíme tu část z podaného léčiva, která přejde v nezměněné formě do systémové cirkulace. Čím je tedy větší presystémová eliminace léčiva, tím je menší jeho biologická dostupnost v cílové tkáni. KAPITOLA 38 Obrázek 38p.1 Koncentrace léčiva po různém způsobu aplikace Osudy léčiva v organismu Prostup léčiva buněčnou membránou Před resorpcí musí léčivo překonat bariéry, které organismus ohraničují od jeho okolí (oddělení vnitřního prostředí od vnějšího). Pro resorpci ze střeva (enterální resorpci) představuje bariéru střevní epitel, v dýchacích cestách je to řasinkový epitel, v ústní sliznicí (při sublingvální nebo bukální) aplikaci je to nerohovějící dlaždicový epitel, u kůže rohovějící dlaždicový epitel. Součástí těchto tkání jsou celulární membrány, tvořené fosfolipidovou dvojvrstvou, které dovolují průnik především lipofilních látek. Tloušťka epitelu určuje intenzitu a rychlost resorpce. Prostup léčiva buněčnou membránou je umožněn prostou difúzí, zejména u lipofilních léků, ale může to být i jiná forma aktivního transportu, která vyžaduje energii. Transport léčiva krví Léčivo se krví transportuje do jednotlivých tkání. V krvi může být léčivo vázáno na řadu proteinů, zejména albumin, ale také beta- 451

452 Příprava - TDM -globulinů nebo kyselých glykoproteinů. Vazba na bílkoviny je reverzibilní a slabší než vazba léků na receptory. Biologický účinek mají léky volné. Z vazby může být lék vytěsněn jiným lékem (jedna z forem lékové interakce). Distribuce léčiva Koncentraci léčiva (c) určíme tak, že dávku (D) podělíme objemem (V) tekutiny, ve kterém je rozpuštěna. Známe-li koncentraci léčiva a dávku, můžeme vypočítat tzv. distribuční objem V D = D/c. Jde o zdánlivý distribuční objem (aparentní), poněvadž při výpočtu se vychází z předpokladu rovnoměrného rozdělení léčiva v organismu. Ve skutečnosti homogenní zastoupení léčiva není možné, zejména tehdy, kdy se léčivo váže na buněčné membrány, membrány organel apod. V těchto případech V D může nabývat větších hodnot, než je vodní objem organismu. KAPITOLA 38 Bariéra mezi krví a tkáněmi Aby léčivo dosáhlo místo svého působení, musí zase krevní řečiště opustit. Děje se to většinou v kapilárním řečišti, které představuje největší plochu a kde je doba možného přestupu nejdelší (vaskulární větvení a malá rychlost průtoku). Kapilární stěna vytváří bariéru mezi krví a tkání (endotel a bazální membrána kapiláry). Bariéra mezi tkáněmi je v různých místech kapilárního řečiště vyvinuta různě. Jsou lépe nebo hůře prostupné. Např. v tkáni pankreatu vytváří endotelové buňky okénka póry. V centrálním nervovém systému v tkáních mozku a míchy nemají endotelové buňky žádné póry. Mluvíme o hematoencefalické bariéře a průstup léčiva do nervové tkáně je možný jen tehdy, pokud léčivo může prostoupit luminální a bazální membránou endotelové buňky. V játrech neexistuje žádná bariéra pro výměnu látek mezi krví a intersticiem. Vazba léků na receptory Účinek léků často závisí na jejich zásahu do buněčných funkcí. Cílovým místem pro účinek léků bývají vazebná místa receptory. Tyto receptory jsou složité bílkovinné struktury, které jsou součástí biologické membrány nebo jsou v cytosolu buňky. Změna konformace receptorových bílkovin vede ke spuštění biochemických dějů, které zasahují do základních funkcí buňky. Jednotlivé receptory se liší svou strukturou a také tím, jakým způsobem po obsazení ligandem tento signál přeměňují na buněčnou odpověď (přenos signálu). Typy receptorů: receptory spřažené s G-proteinem (transmembránový receptor) ligandem řízený iontový kanál ligandem řízený enzym receptory řídící syntézu proteinů (intracelulární receptory např. pro steroidní hormony) Interakce léčiva s receptorem má nejčastěji povahu nekovalentní interakce (nevytváří se chemická vazba); interkace je založena na působení elektrostatických sil, interakcí dipolů, van der Waalsových sil a hydrofobních interakcí. Výjimečně je účinek léků založen na vytvoření kovalentních vazeb (alkylační cytostatika, organofosfáty). Agonisté a antagonisté Pokud má lék dostatečnou afinitu k receptoru a váže se tak, že vznikne stimul, označujeme jej jako agonistu. Agonista se tedy váže na inaktivní receptor, čímž vyvolá změnu jeho klidové konformace na aktivní stav. Naproti tomu antagonista se váže rovněž na receptor, avšak změnu na aktivní konformaci nevyvolá, nedojde ke změně buněčné funkce. Agonisté a antagonisté mohou soutěžit o stejná vazebná místa (receptory) jedná se o kompetitivní (soutěživou) inhibici. Eliminace léčiva Játra jsou hlavním orgánem biotransformace léčiv. Játry protéká jedna třetina minutového srdečního výdeje. Speciální struktura fenestrovaného endotelu jaterního sinu umožňuje neobyčejně těsný kontakt a intenzivní výměnu mezi krví a buňkou jaterního parenchymu. Hepatocyt je vybaven množstvím enzymů důležitých pro látkovou přeměnu. Enzymy hladkého endoplazmatického retikula jsou pro metabolismus léků nejdůležitější. Významnou součástí enzymového systému hydroxyláz a oxidáz se smíšenou funkcí je cytochrom P 450, jehož enzymy katalyzují hydroxylaci nebo oxidační štěpení vazeb -N-C- nebo -O-C-. Vznikající hydroxylované látky jsou hydrofilnější (1. fáze biodegradace). Vedle oxidáz se na hladkém ER vyskytují i reduktázy a glukoronyltransferázy. Ty konjugují kyselinu glukuronovou s hydroxylovými, fenolovými, karboxylovými či aminovými skupinami látek, 452

453 Příprava - TDM které vznikly v 1. fázi biotransformace (2. fáze biotransformace). Vzniklé látky pak mohou být transportovány z hepatocytu do krve nebo vyloučeny do žluče. Při dlouhodobém zatížení některého z enzymů ER jinými léky (fenobarbitalem, karbazepinem, rifampicinem) se zmnoží hladké ER a všechny enzymy. Indukce tvorby enzymů vede k urychlené biotransformaci (další z forem lékové interkace). Většina léčiv se vylučuje v chemicky nezměněné formě nebo jako metabolity močí. Ledviny umožňují vylučování v krvi rozpuštěných látek s Mr < 5000, což je většina léčiv. Ledvinami se vylučují především látky hydrofilní. Lipofilní látky mohou procházet biologickým membránami, dostávají se do buněk včetně metabolicky aktivních hepatocytů, kde se přeměňují na hydrofilní metabolity. Rychlost, s jakou vznikají hydrofilní metabolity, určuje dobu setrvání léčiva v organismu. Při velmi rychlé přeměně v játrech se jen část v nezměněné podobě dostává do systémové cirkulace, část je presystémově eliminována (first-pass efekt). KAPITOLA 38 Způsoby podání léčiva Jednorázové podání léčiva Procesy jako resorpce nebo eliminace léčiva mají exponenciální průběh. Oba procesy jsou závislé na koncentračním spádu přes biologickou membránu a ten se při přestupu léčiva přes membránu mění exponenciálně s časem. Exponenciální časový průběh znamená, že časový interval, v němž se koncentrace léčiva sníží na polovinu, je konstantní t 1/2 = ln2/k. Obrázek 38p.2 Plazmový poločas koncentrace léčiva Konstantnost popisovaného děje umožňuje výpočet objemu plazmy, který se očistí od léčiva za konstantní časovou jednotku nazývá se clearance. Časový průběh koncentrace léčiva je tedy závislý na resorpci, distribuci a eliminaci léčiva. Jednotlivé děje se časově překrývají. Probíhá-li resorpce a distribuce léčiva rychleji, plazmatická koncentrace léčiva zpočátku rychle roste (alfa fáze) a posléze začne pomalu klesat (beta fáze). Matematicky se dá vyjádřit pomocí Batemonovy funkce (s konstantami k 1 a k 2 pro resorpci a eliminaci): c = dávka/v D x k 1 /k 2 -k 1 x (e k1t e -k2t ) 453

454 Příprava - TDM KAPITOLA 38 Obrázek 38p.3 Batmanova rovnice pro průběh koncentrace léčiva po jednorázovém podání. Průběh koncentrace c v závislosti na čase (tvar křivky) je ovlivněn způsobem aplikace léčiva (intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, perorálně atd.). Plocha pod časovou křivkou plazmatické koncentrace léčiva (area under curve AUC) je biologická dostupnost léčiva F. Poměr stanovených AUC umožňuje posoudit různé lékové formy léčiva - biologickou ekvivalenci sledovaných přípravků. Opakované podávání léčiva Podává-li se léčivo opakovaně v pravidelných intervalech, závisí koncentrace léčiva na poločasu jeho eliminace. Je-li poločas eliminace kratší než interval mezi podáním opakované dávky, koncentrace v pravidelných intervalech stoupá a klesá (Obr.38-4). Při delším eliminačním poločase dochází ke kumulaci účinné látky a koncentrace postupně vzrůstá, až se dosáhne tzv. kumulačního rovnovážného stavu (cumulative steady state). 454

455 Příprava - TDM KAPITOLA 38 Obrázek 38p.4 Kolísání koncentrace léčiva v závislosti na poločasu eliminace léčiva U mnoha onemocnění může být farmakoterapie účinná jen tehdy, jestliže se koncentrace léčiva v krvi dlouhodobě udržuje na stabilní výši. To vyžaduje pravidelné užívání léčiva a takový rozpis dávek, který nedovolí, aby koncentrace léčiva klesala pod terapeutickou koncentraci, aniž by dosáhla minimální toxické koncentrace. Spolupráce pacienta (compliance) znamená striktní dodržování předepsaného léčebného režimu. Obrázek 38p.5 Požadovaná terapeutická koncentrace léčiva U každého dlouhodobě podávaného léčiva je nutné vzít v úvahu, že podmínky biotransformace a eliminace léčiva nemusí zůstat konstantní; tím dochází ke změnám plazmatických koncentrací léčiva a v některých případech mohou být překročeny minimální 455

456 Příprava - TDM toxické koncentrace nebo nemusí být dosaženo minimální terapeutické koncentrace. Proto je důležité terapeutické monitorování vybraných skupin léků (TDM). KAPITOLA 38 Obrázek 38p.6 Změny ke kterým může dojít v průběhu léčby Literatura Lüllmann H., Mohr K., Ziegler A., Bieger D.: Barevný atlas farmakologie, 2. přepracované a doplněné vydání, Grada Publishing 2002, ISBN X 456

457 KAPITOLA

458 Terapeutické monitorování léků Terapeutické monitorování léků Autor: doc. RNDr. Kristian Šafarčík, Ph.D. Recenzent: prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. KAPITOLA 38 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Úvod Působení léčiv se uskutečňuje na různých úrovních: na úrovni celého organismu, na úrovni jednotlivých orgánů a tkání i na úrovni buněčné a molekulární. Určujícím činitelem farmakologického působení je koncentrace léčiva v místě jeho účinku. Cílem je vytvořit objektivní základ pro racionalizaci dávkování léků, ale také pro individualizaci léčby, která přihlíží k odlišnostem jednotlivých nemocných. Snaha o individuální úpravu dávkování má velký význam při zajištění efektivnosti terapie a snížení frekvence nežádoucích účinků léků. Většina léků vykazuje charakteristický vztah mezi dávkou a účinkem. Při bližší analýze se dále ukázalo, že intenzita farmakologického působení léčiv koreluje lépe s koncentrací léčiva v systémové cirkulaci než s dávkou léčiva. Z těchto základních předpokladů vychází i terapeutické monitorování léčiv (TDM), které se snaží o klinické využívání stanovené koncentrace léčiva v organismu s cílem individuální úpravy dávkování. Individuální úprava dávky se opírá o dosažení specifické cílové koncentrace léčiva. Tím se snižuje hlavní zdroj variability koncentrací léčiva, který je způsoben individuálními rozdíly ve farmakokinetice na úrovni individuálního nemocného, tak v dané skupině nemocných. Cílem je přesnější pochopení farmakokinetiky a farmakodynamiky léku u individuálního nemocného (Obr. 38-1). Stanovení koncentrací léčiva není nutno provádět tam, kde účinek léčiva může být snadno monitorován klinicky (antihypertenziva, analgetika, hypnotika) nebo pomocí jednoduchých laboratorních testů (antikoagulancia, hormony, hypolipidemika). Obrázek 38.1 Procesy při podání léku Indikace ke stanovení hladin léků Charakteristickými rysy léčiv vhodných pro monitorování jsou tyto vlastnosti: malá terapeutická šíře nebezpečí toxicity velká interindividuální variabilita 458

459 Terapeutické monitorování léků strmá závislost mezi dávkou a účinkem vztah mezi koncentrací a účinkem je těsnější než mezi dávkou a účinkem farmakokinetika má nelineární průběh Z hlediska pacienta je TDM vhodné v těchto případech: vyloučení nespolupráce pacienta (non-compliance) změny při fyziologických stavech (těhotenství, dětství, stáří) změny v chorobných stavech (horečka, selhávání ledvin, jater, srdce) lékové interakce KAPITOLA 38 V současné době je pro kontrolu farmakoterapie využíváno TDM u těchto skupin léků: Antibiotika aminoglykosidy (gentamicin, amikacin), vankomycin Bronchodilatancia teofylin Antiepileptika fenobarbital, primidon, fenytoin, etosuximid, karbamazepin, kyselina valproová, klonazepam, lamotrigin, topiramát, levetiracetam Cytostatika metotrexát, busulfan Kardiaka amiodaron, digoxin Imunosupresiva cyklosporin A, takrolimus, sirolimus, everolimus, mykofenolát Psychofarmaka lithium, diazepam, antidepresiva, antipsychotika V některých případech je vhodné stanovovat základní metabolit mateřské látky: Karbamazepin 10,11 epoxykarbamazepin Primidon fenobarbital Amiodaron desethylamidaron Diazepam desmethyldiazepam Metoprolol hydroxymetoprolol TDM se provádí rutinně od poloviny 70. let 20. století a zapadá do vzniku koncepce klinické farmakologie jako nezávislého oboru spolu s fundamentálními principy farmakokinetiky a farmakodynamiky. V roce 1967 Baastrup a Schou demonstrovali vztah mezi koncentrací a farmakologickým efektem lithia a Buchtal v roce 1960 popsal vztah mezi plazmatickou koncentrací fenytoinu a četností záchvatů u pacientů léčených pro epilepsii. Praktické provedení TDM Praktické provedení TDM má tři základní části. Analytické stanovení koncentrace léčiva, které využívá většinou imunoanalytické nebo chromatografické metody. Imunoanalytické metody jsou využívány v širším rozsahu, a to jak homogenní (bez nutnosti separace vázaného indikátoru), tak nehomogenní, většinou kompetitivní metody stanovení. Imunoanalytické metody mají celou řadu výhod, jakou je jednoduchá manipulace se vzorkem bez nutnosti extrakce vzorku. Je možné využití běžné instrumentace biochemické laboratoře (homogenní imunoanalýzy lze provádět na biochemických analyzátorech s fotometrickou detekcí) nebo heterogenní imunoanalýzy na řadě imunoanalyzátorů různých výrobců. Stanovení koncentrací léků lze provádět v režimu random access, ale také celé série vzorků pro farmakokinetické profily. Nevýhodou imunoanalytických metod je určité nadhodnocování koncentrací léků v důsledku zkřížené reakce metabolitů, které zákonitě vznikají při metabolizaci podaného léků a jsou přítomny v systémové cirkulaci. Metabolity bývají často strukturně velmi podobné parentní látce, a proto se mohou vázat na detekční protilátku použitou v imunoanalytické metodě a tím vzniká nadhodnocení zjištěné koncentrace. V řadě případů ale tento fakt nevadí. Chromatografické metody využívají především plynovou (GC) a vysoce účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) s různými typy detekce, v poslední době především s detektorem založeném na hmotnostní spektrometrii, která umožňuje detekovat nejen parentní podanou látku, ale někdy také hlavní metabolity podaného léčiva. Následuje interpretace koncentrace léčiva, případně s farmakokinetickou analýzou. Laboratorní výsledek je interpretován klinickým farmakologem (klinickým biochemikem), číselný výsledek je doplněn o doporučení pro eventuální úpravu dávky nebo dávkovacího intervalu (schématu) klinikovi. 459

460 Terapeutické monitorování léků Zpětná vazba mezi klinikem a interpretací výsledku má zásadní význam, jelikož akceptance doporučení a další kontrola podle tohoto doporučení zajistí změnu dávkování, a tím i racionální farmakoterapii. Nevyužití doporučení a pouhé založení výsledku do chorobopisu je jen zbytečným zvyšováním celkových nákladů za léčbu. Údaje vyžadované pro TDM U léků, které vytvářejí stabilní hladiny, tj. u léků s dlouhým poločasem eliminace, je nejvhodnější odebírat krev před podáním další dávky. K takovým lékům patří např. Cyklosporin A. U digoxinu je však spíše doporučováno stanovení hladiny po 6-11 hodinách po podání, kdy jeho koncentrace v krvi lépe odráží hladiny v myokardu. V každém případě je nutno počkat, až bude dosaženo rovnovážného stavu. Ten nastává, uplynula-li od počátku podávání doba, rovnající se 4-5 poločasům eliminace. KAPITOLA 38 U léků, kde se hladina rychle mění (tj. s krátkým poločasem eleminace), se stanovuje koncentrace před podáním tzv. údolní (bazální) (trough value) t 0 a po podání, kdy je dosahováno maximální koncentrace (peak value) t max. Záleží ovšem i na způsobu podání léku po i.v. aplikaci bývá maximální koncentrace v krvi dosaženo do 30 minut, po i.m. aplikaci za hodinu, po perorálním podáním za ještě delší dobu, podle lékové formy podaného léčiva (tablety, tobolky, matricové tablety, potahované tablety s protrahovaným uvolňováním atd.). U i.v. aplikace se vstřebává vždy celá dávka, u perorálního podání to bývá různý díl, který závisí na druhu léku, jeho galenické formě i poměrech v GIT. Proto správná interpretace koncentrace léčiva vyžaduje řadu údajů, které je třeba vyplnit v žádance na laboratorní vyšetření : Údaje o druhu léku i jeho formě Dávková anamnéza, dávka, compliance, trvání terapie Pacientův stav (věk, hmotnost, výška, orgánové funkce) Čas podání dávky a čas odběru krve Druh biologického materiálu (krev, plazma, sérum) Léková anamnéza (léky podávané souběžně) Farmakokinetická analýza Farmakokinetika je nauka o osudech léků v organizmu, o jeho vstřebávání, distribuci, biotransformaci (metabolismu) a eliminaci. Tyto děje lze popsat matematickými metodami a farmakokinetickou analýzou určit farmakokinetické parametry. Na základě farmakokinetických údajů, získaných při registraci léčiva, ale i postupným doplňováním těchto údajů během dalších fází klinického zkoušení léčiva, jsou známé parametry farmakokinetické populační křivky pro daný lék a jeho lékovou formu. S těmito údaji je možno porovnat i jen jeden změřený údaj koncentrace léčiva u vyšetřovaného pacienta. Změřená koncentrace léčiva je vložena s údaji o druhu léku, dávce, času podání a času odběru biologického vzorku, hmotnosti, stáří pacienta event. dalšími údaji do speciálního počítačového programu, který vyhodnotí, zda změřená koncentrace odpovídá průměrné populační farmakokinetice. Při nálezu neočekávaných koncentrací je třeba uvažovat o použití nesprávné dávky, lékové interakci, nesprávném užití léku, poruchách vstřebávání, špatném času odběru, onemocnění ledvin a jater, změně vazebnosti na bílkoviny séra a o non-compliance pacienta (užití vyšší nebo nižší dávky). Cílové rozmezí koncentrace léčiva Nepohybují-li se naměřené hodnoty v určitém terapeutickém rozmezí a není-li pochybnosti o tom, že všechny vložené údaje jsou správné, dovoluje program simulaci změny dávky či dávkovacího intervalu tak, aby byly splněny požadavky na optimální způsob léčby. Koncentrace léčiva by se měla pohybovat v tzv. cílovém rozmezí (target range). Koncepce cílového rozmezí koncentrace léčiva (místo staršího názvu terapeutického rozmezí) vychází ze dvou konceptů - minimální efektivní koncentrace a maximální bezpečné koncentrace pro daný lék. Mezi těmito koncentracemi je u většiny pacientů maximální terapeutický účinek a zároveň minimální riziko toxicity a vedlejších účinků. Bohužel tato jednoduchá teorie nemusí být plně platná ve všech směrech a cílové rozmezí musí být vždy spojeno s klinickým posouzením stavu pacienta a nikoliv jeho náhradou. Není cílem dosáhnout cílové rozmezí, ale léčit zdravotní problémy pacienta. 460

461 Terapeutické monitorování léků KAPITOLA 38 Obrázek 38.2 Pacientovi (65 let) byl aplikován digoxin intravenózně v dávce 0,125 mg za 24 hodin. Hladina digoxinu před podáním byla nízká 0,36 ng/ml. 1 hodinu po podání byly hladiny digoxinu v normě. Zpracováno programem pro farmakokinentickou analýzu MVV-PHARM. ADTM (Advanced Therapeutic Drug Monitoring) Další vývoj v této oblasti vede k tzv. ADTM, která zavádí stanovení volné frakce léčiva (farmakologicky účinné), metabolitů léčiva, stanovení koncentrace léčiva v cílových tkáních (např. imunosupresiv v lymfocytech) a provádí se testování jednotlivých pacientů s ohledem na genetické a fenotypické predispozice při metabolizmu jednotlivých skupin léků. Biotransformace léčiv Součástí studia pohybu podané látky v organismu je i sledování pochodů, které mění strukturu léčiva. Počet používaných léčiv je velký, ale přesto se jejich biotransformační přeměna v organismu děje na základě relativně malého počtu reakcí. Jejich cílem je vytvořit hydrofilnější, polárnější metabolity vylučující se z organismu snadněji než původní lipofilní látka. Významná je znalost enzymů s biotransformační aktivitou lokalizovaných především v endoplazmatickém retikulu a cytosolu buňky. Převážná část biotransformačních oxidačních reakcí je katalyzována cytochrom P450 monooxygenázovým systémem. Přestože je u člověka popsáno více než 50 různých proteinů cytochromu P450, probíhá metabolismus léčiv převážně pěti až šesti hlavními enzymovými cestami. Hlavními formami cytochromu v lidských játrech jsou CYP2D6, CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2E1 a CYP3A4. Schopnost organismu léčiva metabolizovat a eliminovat je často ovlivněna genetickou vlohou organismu. Přibližně 40 % léčiv je přitom odbouráváno geneticky polymorfní cestou, přičemž nejvýznamnější je cytochrom P450 2D6 (CYP2D6). Polymorfismus metabolické cesty znamená, že můžeme v populaci nalézt jedince, u kterých je příslušná enzymatická aktivita neaktivní (tzv. pomalí metabolizátoři, PM), jedince s nekompletním deficitem aktivity enzymu (intermediární metabolizátoři, IM) i skupinu rychlých metabolizátorů (EM) s obvyklou aktivitou metabolické přeměny. U enzymu 2D6 cytochromu P450 známe také ještě skupinu tzv. ultrarychlých metabolizátorů (UM), což jsou lidé s neobvykle vysokou aktivitou metabolické cesty CYP2D6. Při podávání obvyklých dávek léčiv dochází u pomalých metabolizátorů ke kumulaci látek. Jejich vysoké koncentrace v cílových tkáních se mohou projevovat jako toxické a nežádoucí účinky léků. Naopak u ultrarychlých metabolizátorů nedochází k vytvoření ustáleného stavu a i koncentrace léčiv v cílových tkáních mohou být nižší než minimální účinné. Proto jsou tito lidé rezistentní k běžnému terapeutickému dávkování. 461

462 Terapeutické monitorování léků KAPITOLA 38 Obrázek 38.3 Schéma správného terapeutického monitorování léčiv. Farmakogenetika polymorfismus genotyp fenotyp Perspektivní jsou metody zaměřené na odhalování genetického polymorfizmu v metabolizmu léčiv, jehož podstatou jsou genové mutace. V podmínkách in vivo se provádí určování fenotypu a genotypu. Genotyp lze určit analýzou DNA pomocí metody PCR (polymerázová řetězová reakce). Analýza vychází z polymorfismu délky restrikčních fragmentů RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), na něž je DNA štěpena endonukleázami, a to v místě sekvence bází specifických pro každý enzym. Farmakogenetika se snaží tyto determinanty nejenom popsat, ale na základě jejich znalosti individualizovat terapii a predikovat metabolickou přeměnu i odpověď nemocných na konkrétní léčivo. Z dosavadních poznatků je zřejmé, že kromě vlastního genotypu jednotlivých forem cytochromu P450 rozhoduje o aktuální metabolické aktivitě - fenotypu i řada dalších zevních faktorů. Podílí se na nich procesy metabolické indukce a inhibice metabolizujících enzymů vyvolané současně podávanými jinými léčivy nebo složkami potravy. Významnou součástí vnitřních faktorů je chorobný stav, např. jaterní cirhóza, vedoucí ke snížení syntézy řady enzymů. Výsledná metabolická aktivita jednotlivých enzymů metabolický fenotyp léčiva se testuje pomocí tzv. modelových substrátů (Tabulka 1). Tabulka 38.1 Příklady specifických substrátů (modelových látek) pro stanovení metabolických poměrů. Princip stanovení fenotypu spočívá v podání látky, která je pro testovaný enzym vysoce specifickým substrátem. Rychlost biotransformace modelové látky musí záviset především na aktivitě studovaného enzymu, nikoli na průtoku krve játry. Podle metabolického poměru mateřská látka/metabolit se testovaný subjekt zařadí do odpovídající skupiny, kterou např. označujeme jako 462

463 Terapeutické monitorování léků pomalí metabolizátoři nebo rychlí metabolizátoři. O farmakogenomice a genetickém polymorfismu vybraných enzymů viz podrobněji kapitolu 39. Trendy v laboratorní medicíně oddíl 4.6. Farmakogene(o)mika. Personalizovaná farmakoterapie KAPITOLA 38 Klinická farmakologie využívá výsledky fenotypizace i genotypizace při odhalování interindividuálních rozdílů v metabolismu léčiv, což přispívá k optimalizaci léčby a snížení výskytu nežádoucích účinků. Pro stanovení aktuální aktivity jednotlivých cytochromů pro individualizované dávkování léčiv je důležitější fenotypizace než genotypizace, která má význam spíše pro kvalitativní než kvantitativní použití. Lze říci, že pro personalizovanou medicínu v oblasti individualizace dávkování léčiv je terapeutické monitorování hladin léčiv nezastupitelnou metodou, která ještě není mezi kliniky plně doceňována. Doplnění o prvky ADTM, fenotypizaci a eventuálně genotypizaci posunuje TDM ještě o kvalitu výše. 463

464 Terapeutické monitorování léků KAPITOLA 38 Tabulka 38.2 Obvyklé cílové terapeutické rozmezí léčiv. 464

465 Terapeutické monitorování léků Literatura 1. Buchthal F, Svensmark O, Schiller PJ. Clinical and electroencephalographic correlations with serum levels of diphenylhydantoin. Arch Neurol. 1960;2: Baastrup PC, Schou M. Lithium as a prophylactic agent. Arch Gen Psychiatr. 1967;16: Grundmann M. Kacířová I.: Význam TDM, fenotypizace a genotypizace pro správné dávkování léčiv. Čas.Lék. čes. 2010; 149: Hallworth M., Watson I.: Therapeutic drug monitoring. Interactiv Clinical Guide, Abbott diangostics 2010, Abbott Laboratorie IA _09_23773 V2 5. Perlík F.: Využití analytických metod ve farmakologii. Klinická a toxikologická analýza. Skripta VŠCHT Praha, 2008, ISBN: , str Komzáková I., Šafarčík K., Brozmanová H., Grundmann M.: Terapeutické monitorování cyklosporinu A. Čes. slov. Farm. 51,2002.No.4 p Šafarčík K., Komzáková I., Bartoš V., Grundmann M.: Imunoanalytické metody stanovení cyklosporinu A. Čes. slov. Farm. 51,2002, No.3, p Komzáková I., Brozmanová H., Šafarčík k., Grundmann M.: Stanovení cyklosporinu A metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC). Čes. slov. Farm. 51,2002.No.3 p KAPITOLA

466 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Autoři: Mgr. Alena Krnáčová, Mgr. Radka Šigutová; Mgr. Tomáš Karlík; Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D.; RNDr. Pavlína Kušnierová, Ph.D., Recenzent: prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. KAPITOLA 39 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko POCT (Point of care testing) Definice POCT POCT (Point-of-care-testing, Near patient testing, Bedside testing ) představuje vyšetření laboratorního charakteru, které se provádí v blízkosti nebo přímo u pacienta, s výsledkem vedoucím k možné změně péče o pacienta. Vyšetření se tedy provádí mimo laboratoř a pracovníky bez primárního laboratorního vzdělání. Mezi POCT je taky řazen self-monitoring (sebekontrola) pacientů v domácích podmínkách. POCT představuje zlepšení diagnostického procesu integrací měření, monitorování a fyziologického pozorování v místě péče o pacienta tam, kde je to potřebné a nezbytně nutné. V padesátých letech 20. století zaznamenal systém POCT, co se týče technologického rozvoje a rozšíření používání značný vzestup. Ukázalo se totiž, že jejich používání všude tam, kde není přístupná laboratoř, která by zajistila výsledky dostatečně rychle vzhledem k závažnosti léčby, je velmi výhodné. Zároveň s tímto vývojem ale byl vytvořen i systematický způsob sledování kvality těchto POCT analýz tak, aby nedošlo k výrazným rozdílům mezi výsledky měření centrálních klinických laboratoří a analýz POCT. Bohužel, mnoho států tento systematický způsob sledování kvality opomněly a v důsledku tržně-ekonomického rozvoje POCT se s problémem kvality stanovení POCT a jeho návazností na analytiku v oblasti laboratorní medicíny potýkají dodnes. Dnes POCT tvoří důležitou součást laboratorní diagnostiky a zaujímá pevné místo v organizačním uspořádání laboratorní medicíny. Přístroje POCT S prostředky a zařízeními pro POCT pracují většinou osoby, které nejsou primárně vzdělávány a kvalifikovány pro laboratorní práci. Tomuto faktu bývá přizpůsoben reakční princip, pracovní postup, celkové technické řešení a design přístroje. Mohou být přenosné i nepřenosné. Většinou se vyšetření provádí z plné krve, bez nutnosti centrifugace, které by čas na získání výsledku prodloužilo. Výhodou těchto přístrojů je tedy využití plné krve, minimální objem vzorku (mikroobjemy), krátký čas analýzy a tím zkrácení TAT (turnaround time doba odezvy čas od odběru vzorku k získání výsledku). Pro POCT přístroj by měla být dostupná vnitřní kontrola kvality i program nezávislé externí kontroly kvality (kontrolní séra, vzorky s deklarovanou hodnotou koncentrace měřeného analytu). Je ale pravdou, že mnohé systémy POCT nebývají dostatečně a spolehlivě ověřeny a jejich dokumentace je nedostačující, co se týče základních analytických znaků použité metody měření. Právě norská organizace pro kontrolu POCT systémů (NOKLUS/ SKUP) udává prostřednictvím výsledků měření, že z mnoha těchto analyzátorů nelze získat spolehlivá a v klinickém rozhodování použitelná vyšetření vzhledem ke srovnání s výsledky získanými klinickou laboratoří. Vzhledem k tomu, že se neustále rozvíjí a roste spektrum systémů POCT co do nejrůznějších technologií měření, je čím dál tím nutnější opírat se při pořizování a zavádění těchto přístrojů o normativní a jiné dokumenty, které doporučují jejich správné zavádění a používání. 466

467 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) POCT přístrojů je na trhu velké množství, ale jejich kvalita je velice rozdílná, a proto je nutné věnovat velkou pozornost výběru správného POCT přístroje. Z definice vyplývá, že POCT přístroje spadají do kategorie diagnostických zdravotnických prostřední in vitro, tak jako všechny laboratorní přístroje a proto pro ně platí směrnice EU 98/79/ES, popř. nařízení vlády č. 453/2004 Sb. a jeho doplňky. Základní povinností uživatele je v tomto případě verifikace výkonnostních charakteristik POCT systému, které deklaroval výrobce. Tuto verifikaci bez spolupráce s klinickou laboratoří nelze provést!!! Příklady POCT přístrojů (analyzátory na měření krevních plynů, iontů a metabolitů; přístroje na měření CRP, laktátu, glukózy, hemoglobinu, ACT, troponinu, alkoholu ) KAPITOLA 39 Pořízení a implementace POCT přístrojové techniky Kde je nejčastější uplatnění POCT přístrojové techniky? v rámci nemocnice jednotky intenzivní péče, metabolické jednotky, operační sály, pooperační místnosti, centrální příjmy decentralizovaná pracoviště nemocnic zdravotnické zařízení mimo nemocnic ambulance, různé ošetřovatelské ústavy, léčebny pro dlouhodobě nemocné u pacienta v domácí péči v terénu rychlá záchranná služba, policie Kdy se rozhodnout pro nákup POCT přístroje a jak na to? Přístroje POCT jsou nutné zejména na místech, kde stanovení důležitých parametrů je málo dostupné nebo nedostupné v potřebném čase. Zavedená technika musí vzhledem ke svému účelu pořízení prokazatelně přispívat ke zlepšení péče o nemocného a musí být analyticky přijatelná. TAT při práci v režimu POCT musí být kratší než TAT laboratoře. Podle povahy vyšetření a s ohledem na místní podmínky je nutné určit, jak velký časový rozdíl obou TAT je medicínsky a ekonomicky opodstatněný. Jedinou výjimkou z tohoto pravidla je situace, kdy výsledek vyšetření z laboratoře není k dispozici nepřetržitě (např. v odpoledních hodinách, v noci, v sobotu, v neděli a o svátcích,...) a požadované vyšetření má akutní charakter vede k bezprostřední a neodkladné reakci ošetřujícího lékaře. Při rozhodování o nákupu POCT přístroje je nutné odpovědět si na otázky: z hlediska klinického charakteru (lékař): 1. TAT, TTAT (doba odezvy a terapeutická doba odezvy) 2. Účel zavedení (diagnostika, monitoring, screening a jiné) 3. Paleta měřených testů 4. Očekávaný počet testů v časovém intervalu (frekvence) 5. Kritické meze a způsob reakce na výsledky, které je překračují 6. Vykazování provedených vyšetření plátcům zdravotní péče 7. Poměr mezi prospěchem pro pacienta a náklady Před nákupem POCT přístroje je nutné přístroj posoudit (analytik): a. z hlediska preanalytické fáze: určení způsobu požadování vyšetření (žádanka), identifikace a dokumentace požadavků typ odběrové soupravy druh antikoagulans a jiných přísad (možnost interference při měření) typ vzorku (kapilární, venózní nebo arteriální krev, sliny, moč ) počet kroků při manipulaci se vzorkem před samotnou analýzou (různé úpravy vzorků čím více kroků, tím je vyšší pravděpodobnost preanalytické chyby) rychlost přípravy vzorku pro samotnou analýzu (vliv času na výslednou hodnotu) 467

468 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) vhodnost použití daného POCT přístroje pro cílovou skupinu pacientů skladování reagencií b. z hlediska analytické fáze: dostatečný rozsah metody pro zamýšlený účel shodu jednotek měření u POCT přístroje a laboratorního přístroje srovnatelnost cut-off POCT a lab.přístroje posouzení vlivu kalibrace na plasmu nebo plnou krev a zahrnutí korekčních faktorů v elektronice přístroje posouzení vlivu interferujících látek verifikace základních analytických znaků metody měření - (LoD, LoQ, analytická citlivost, bias, preciznost, měřicí rozsah, kalibrační křivka, porovnání s rutinní laboratorní metodou, interference), nebo odkaz na relevantní nezávislé a renomované zdroje těchto informací řízení jakosti (interní kontrola kvality, externí kontrola kvality, porovnatelnost výsledků stejného vyšetření (pokud existuje) se spolupracující klinickou laboratoří, ). Pokud pro daný systém POCT není k dispozici nezávislý program externí kontroly, pak nelze daný systém doporučit k používání, protože není možné pravidelně ověřovat kvalitu poskytovaných výsledků měření. hodnocení podle principu správné laboratorní praxe c. z hlediska postanalytické fáze možnost napojení POCT přístroje na LIS a NIS (nemocnice) jednoznačná identifikace výsledků měření prostředky POCT za účelem odlišení od výsledků stejného vyšetření provedeného v laboratoři možnost vykazování pojišťovnám výrobcem udávaná nutnost použití korekčního faktoru (převod plná krev vs plasma nebo korekce na hematokrit) způsob vedení a archivace technické a laboratorní dokumentace (údržba, opravy, nálezy, výsledky ) KAPITOLA 39 *Nutná spolupráce s laboratoří, možnost požádání zástupce firmy o DEMO verzi přístroje na určitou dobu pro zhodnoceni pre-, post- a analytické fáze POCT přístroje. Implementace POCT přístroje a. anemocnice a jejich detašovaná pracoviště b. ambulance a jiná zdravotnická zařízení c. self-monitoring a) Nemocnice a jejich detašovaná pracoviště Vzhledem k tomu, že POCT tvoří nedílnou součást laboratorní diagnostiky a má pevné místo v organizačním uspořádání laboratorní medicíny je vhodné v nemocnici zřídit také multioborový POCT tým, kterého hlavním cílem je sjednocení, zkvalitnění a zefektivnění postupů v procesu laboratorní diagnostiky u lůžka pacienta. Pokud to lze, také sjednotit POCT přístroje v rámci zdravotnického zařízení. POCT tým by měl mít stálé členy a flexibilní členy. Mezi stále členy by měl patřit vedoucí POCT týmu (ideálně z řad pracovníků laboratoře), supervizoři pro jednotlivé laboratorní odbornosti (z řad pracovníků laboratoře), manažer kvality pro POCT (z řad pracovníků laboratoře), zástupce objednacího místa, zástupce pro techniku a provoz, zástupce financí a analýz, zástupce právního oddělení, zástupce pro výpočetní techniku a důležitou roli sehrává i lékař pro POCT a popřípadě jiní členové. Mezi flexibilní členy by měli patřit zástupci jednotlivých klinických pracovišť, kde je POCT přístroj umístěn. Příklad samotného nákupu a implementace POCT přístroje: Zájemce o POCT zástupce klinického pracoviště osloví vedoucího týmu POCT. Vedoucí POCT dá pokyn supervizorovi a společně s klinikem zhodnotí přínos zavedení POCT přístroje (diskuze o klinické, analytické, pre- a post-analytické stránce daného požadavku). Po shodě názorů supervizor zabezpečí demo verzi POCT přístroje a vypracuje technickou specifikaci pro VZ. Vedoucí POCT zkoordinuje zástupce pro techniku a provoz a zástupce právního oddělení a zrealizují nákup, zároveň dá pokyn zástupci pro výpočetní techniku, aby zabezpečil IT pro zapojení přístroje do sítě (pokud to POCT přístroj umožňuje). Zástupce objednacího místa je obeznámen s novým spotřebním materiálem. Supervizor společně se zástupcem pro techniku a provoz a zástupcem pro výpočetní techniku zabezpečí instalaci přístroje. Před uvedením do provozu supervizor zabezpečí verifikaci přístroje v klinické laboratoři, připraví potřeb- 468

469 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) nou dokumentaci. Manažer kvality POCT stanoví systém řízení kvality. Supervizor společně s obchodním zástupcem prokazatelně proškolí uživatele. Supervizor stanoví dobu zkušebního provozu a po jeho skončení dá povolení k řádnému užívání. Na klinickém pracovišti je zvolena osoba sestra koordinátorka, která za přístroj zodpovídá a komunikuje se supervizorem. Supervizor dohlíží na celý proces POCT během celé doby používaní POCT přístroje v nemocnici. Základem úspěšného využívaní POCT techniky ve prospěch pacienta je spolupráce lékaře (uživatele) s klinickou laboratoří!!! b) Ambulance a jiná zdravotnická zařízení KAPITOLA 39 Zájemce o POCT přístroj (lékař), po zodpovězení si otázek klinického charakteru by si měl zvolit klinickou laboratoř a požádat ji o spolupráci z hlediska preanalytické a analytické fáze. Po zakoupení přístroje a řádném zaškolení by jej měl odeslat spolupracující klinické laboratoři k verifikaci metody měření. Laboratoř vystaví verifikační protokol a doporučí systém řízení kvality (dle doporučení výrobce a odborné společnosti). Lékař zodpovídá za úspěšné provádění interní a externí kontroly kvality. Před zavedením metody v režimu POCT je pro uživatele POCT povinná účast v jednorázovém úvodním kurzu k dané problematice POCT, pokud takový kurz existuje. c) Self-monitoring POCT přístroj, který byl pacientovi zdravotnickým zařízením zapůjčen do domácí péče má být pravidelně a prokazatelně kontrolován pomocí interní kontroly (minimálně před zapůjčením a po vrácení) a ověřován ve spolupracující klinické laboratoři. Zdravotnické zařízení musí vést potřebnou dokumentaci k POCT přístroji. Pacient musí být řádně a prokazatelně proškolen. POCT přístroj, který byl pacientovi předepsán nebo ho pacient vlastní z jiných zdrojů. Lékař by měl ověřit, zda-li je pacient proškolen a s POCT přístrojem správně zachází. Měl by ho informovat o důležitosti měření interních kontrol a možnosti ověření POCT přístroje v klinické laboratoři v případě jakýchkoliv pochybností měření. Pravidelná edukace Je základem pro získání správného výsledku, zvlášť když obsluhující personál je bez specializované laboratorní erudice. Edukaci garantují supervizoři nebo speciální kurzy, které osahují: teoretické podklady příslušného vyšetření a použité technologie, charakter biologického materiálu, jeho odběr, uchovávání a způsob aplikace, získání a skladování potřebného spotřebního materiálu, činidel a náhradních dílů, obsluha zařízení, kalibrace a postup měření, sdělování výsledků, přenos do LIS/NIS, dokumentace a archivace, hodnocení výsledků a klinický význam vyšetření, zdroje chyb ve všech fázích procesu měření, řízení kvality, dokumentace a archivace výsledků interní a externí kontroly kvality uživatelská údržba a servis POCT přístrojů. Absence verifikace, vnitřní a externí kontroly kvality, nedostatečně proškolený uživatel a nedostatečná znalost preanalytické fáze vyšetření jsou nejčastější příčinou získávání nesprávných výsledků a možného poškození pacienta. Uživatel se nesmí uspokojit pouze se získáním nějakého výsledku, musí vyžadovat správnost výsledku! Literatura 1. ČSN EN ISO 22870:2006 Vyšetření u pacienta (VUP) Požadavky na kvalitu a způsobilost. 2. ČSN EN ISO 15189:2007 Zdravotnické laboratoře Zvláštní požadavky na kvalitu a způsobilost. 3. The Norwegian Quality Improvement of Primary Care Laboratoriem Doporučení ČSKB ČLS JEP Správné zavádění a používaní POCT (duben 2011) Program externího hodnocení kvality v oblasti klinické biochemie a nukleární medicíny, hematologie, transfůzní služby, alergologie a imunologie

470 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Automatizace a konsolidace Definice automatizace Použití řídících systémů k řízení zařízení a procesů. KAPITOLA 39 Historie V začátcích se v biochemických laboratořích používaly především klasické kvantitativní analytické techniky. Jedinými přístroji byly ph metry, polarimetry, jednoduché fotometry, teprve se rozvíjely chromatografické techniky. V 60. letech 20. století se rozvíjejí první multikanálové analyzátory, v letech 70. vznikají první mikroprocesory převádějící analytický signál na koncentraci analytu, objevuje se také první protokol, který umožňoval komunikaci analyzátoru s laboratorním informačním systémem. 80. léta znamenají důležitý mezník v automatizaci - objevují se první biochemické analyzátory pro zpracování většího počtu vzorků. Na začátku 90. let se objevuje trend tzv. decentralizace laboratorního vyšetřování, biochemické analyzátory se objevují u lůžka pacienta, na operačních sálech nebo v ordinacích lékařů (technologie POCT). Typy automatizace Úplná laboratorní automatizace znamená, že všechny procesy (od příjmu vzorků až po vydání výsledku) probíhají automaticky a jsou zařazeny do komplexní linky. Mezi hlavní přínosy úplné automatizace patří zpracování velkého množství vzorků definovanou rychlostí, snížení počtu chyb omezením vlivu lidského faktoru, zvýšení bezpečnosti obsluhy, snížení počtu pracovníků a s tím související snížení mzdových nákladů. Modulární laboratorní automatizace znamená automatizaci jen některých procesů v laboratoři. V podstatě jde o samostatně stojící preanalytické a analytické systémy. Automatizace preanalytická fáze Preanalytická fáze laboratorního vyšetřování je nejčastějším zdrojem chyb, způsobených převážně vlivem lidského faktoru. S cílem tyto chyby minimalizovat byly vyvinuty preanalytické moduly. Schopnosti preanalytického systému: Identifikace materiálu pomocí čárového kódu Rozlišení typu primární zkumavky Třídění vzorků Kontrola množství a kvality vzorku Odvíčkování zkumavek Vytváření alikvotačních zkumavek Zajištění přehledu o pohybu vzorků v laboratoři Dohledání vzorků (např. při požadavku na další parametry) Zavíčkování primárních zkumavek Archivace primárních zkumavek Zvýšení bezpečnosti pro pracovníky laboratoře (minimalizace vystavení personálu biologickým rizikům) Snížení nebezpečí záměny vzorků Úspora primárních zkumavek Rychlejší doba odezvy (TAT) Mezi automatizaci preanalytické fáze můžeme zařadit také tzv. potrubní poštu, což je transportní zařízení, které spojuje laboratoř s jinými odděleními nemocnice a zajišťuje automatickou dopravu materiálu. Největší předností potrubní pošty je rychlost transportu. Nevýhodou je vysoká pořizovací cena. 470

471 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Automatizace analytické fáze V současnosti nejlépe vyřešena, a to díky výkonným biochemickým i imunochemickým analyzátorům, jejichž stále větší počet je schopný také propojení s preanalytickým, příp. postanalytickým systémem. Automatické analyzátory jsou schopné provést až tisíce různých analýz za hodinu. Automatizovány jsou především tyto činnosti: Identifikace vzorku a pacienta Dávkování vzorků a reagencií Inkubace směsi Kalibrace metody Měření výsledného analytického signálu Záznam, analýza a uložení dat KAPITOLA 39 Analyzátory se dělí podle různých kritérií, základní dělení je na a) průtokové b) diskrétní. Podle způsobu uspořádání analýzy vzorku se analýzy dělí na sekvenční, sériové, paralelní a na analýzy v libovolném výběru, kdy může být zvolena jakákoli metoda v jakémkoli pořadí z libovolného vzorku. Výrazně se také snížila spotřeba vzorku a reagencií. Spotřeba vzorku v analyzátoru obvykle nepřesahuje 5 µl (rozsah 1-30 µl), celková spotřeba reagencií nepřesahuje 250 µl. Zpravidla jsou metody navrženy jako 1 nebo 2 reagenční. Automatizace analytické části vyšetření zajistila, že výsledky jsou přesné, srovnatelné a reprodukovatelné. Automatizace postanalytické fáze Postanalytická fáze má interdisciplinární charakter spolupráce: laboratoř - indikující lékař. Spočívá mj. v interpretaci výsledků ve vztahu k fyziologickým hodnotám, k výsledkům dalších vyšetření a ke klinickému stavu pacienta. Do postanalytické fáze vyšetření v klinické laboratoři patří způsoby uchovávání a skladování biologického materiálu po vyšetření, validace, vydání, interpretace a komentáře výsledků, konzultace, a edukace. Mezi nástroje automatizace těchto procesů patří např. počítačové programy ulehčující kontrolu výsledků, které jsou součástí laboratorního informačního systému a poskytují uživateli možnost přednastavení různých kritérií pro samotnou kontrolu výsledků (např. nastavení referenčních, patologických, varovných a kritických mezí pro každý parametr). Výsledky, které jsou do laboratorního systému převedeny po analytické kontrole laboratorním pracovníkem a splňují nastavená kritéria, jsou následně automaticky zkontrolovány tzv. lékařskou kontrolou a uvolněny pro žadatele. Výsledky, které nesplňují nastavená kritéria, uvolněny nejsou a musí být posouzeny lékařem nebo oprávněným VŠ pracovníkem. Teprve po tomto posouzení jsou z laboratoře uvolněny. Samotný přenos dat a informací mezi laboratoří a lékařem požadujícím vyšetření je nejčastěji zajištěn elektronickou komunikací mezi laboratorním a nemocničním informačním systémem. Pro externí žadatele je možné posílání výsledků poštou nebo zabezpečená elektronická komunikace. Hlavní výhody automatizace méně odběrových zkumavek - lepší využití biologického materiálu - šetrnější pro pacienta zkrácení doby odezvy eliminace chyb redukce nákladů zvýšení efektivity a produktivity práce zvýšení bezpečnosti práce Další vývoj směřuje k ještě většímu přesunu testů směrem k POCT, k miniaturizaci laboratorního vyšetření pomocí mikrofluidové a nanochipové technologii nebo k dalšímu rozvíjení molekulární biologie. 471

472 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Konsolidace spojování různých analytických technologií nebo strategií do jednoho přístroje nebo skupiny přístrojů - idea centralizované laboratoře integrace - spojování analytických přístrojů nebo skupin přístrojů s preanaytickými a postanalytickými zařízeními v rámci konsolidace se mohou sdružovat např. pracoviště biochemie, genetiky, hematologie, imunologie, molekulární biologie, mikrobiologie, parazitologie, virologie a in vitro metody nukleární medicíny nejedná se o likvidaci jednotlivých oborů, ale o mezioborovou spolupráci konsolidují se analytické části jednotlivých oborů, nikoliv interpretační - ta naopak konsolidací získá - komplexní pohled na pacienta (všechny výsledky vyšetření dohromady) a tím pádem komplexní interpretace výsledků výhodou je snížení provozních nákladů (společné nakupování reagencií a ostatního materiálu, snížení mzdových nákladů), jednotný příjem a zpracování materiálu, snížení počtu odběrových zkumavek a s tím související šetrnost pro pacienta, rychlejší doba odezvy, snížení počtu chyb, jednotné odběrové místo souvisí s ní i některé problémy - často končí pouze u společného příjmu a zpracování materiálu, někdy odlišný názor jednotlivých oborů na smysl konsolidace KAPITOLA 39 Literatura 1. Průša, R., a kolektiv: Kazuistiky a stručné kapitoly z klinické biochemie, ÚKBP, UK, FN Motol, Praha Racek J. a kol.. 2. vydání. Galén, Praha, Zima T. a kol. Laboratorní diagnostika. 2. vydání. Galén, Praha, 2007 EBM Úvod Evidence Based Medicine (EBM, medicína založená na důkazech) je "vědomé, zřetelné a soudné používání nejlepších současných důkazů při rozhodování o péči o jednotlivé pacienty". Současně je nutno dodat, že každý pacient je unikátní a unikátní je i náš genom. Genetická analýza je jako nejnovější součást moderního lékařství založena na zkoumání individuálních charakteristik jednotlivých genů. Díky personalizované medicíně se každému pacientovi dostane nejlepší vysoce efektivní léčby stanovené přímo pro něj, přičemž její vedlejší účinky jsou naprosto minimální. Výsledkem je zefektivnění procesu léčení a v neposlední řadě snížení utrpení. Individuální léčba je jedním z nejžádanějších zlepšení, které moderní medicíně přináší prediktivní genetika. Principy EBM Medicína založená na důkazech sjednocuje: externí poznatky (důkazy) z klinického výzkumu; jedná se zejména o zjištění vědeckého základu validity problému, který má být řešen (diagnóza, léčba, prognóza apod.) v souladu s nejnovějšími publikovanými a kriticky vyhodnocenými výsledky klinického výzkumu, klinické zkušenosti lékaře zahrnující odborné schopnosti lékaře správně využít nových znalostí a dovedností pro posouzení klinického stavu pacienta, očekávání pacienta, zejména respekt k pacientovým přáním, stanoviskům, preferencím a potřebám. Zdravotní péče založená na důkazu je součástí manažerského rozhodovacího procesu. Tento přístup vyžaduje pochopení rozporuplných výsledků a vyhodnocení kvality a přesvědčivosti důkazů (publikovaných nebo nepublikovaných). V konečné fázi musí pak lékař dokázat aplikovat tento přístup na konkrétního pacienta v kontextu daného zdravotního systému. Rozhodovací proces EBM je možno rozdělit do šesti vzájemně propojených kroků: transformace problému do klinické otázky, 472

473 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) využití interních důkazů pro odpověď na klinickou otázku, hledání externích důkazů pro odpověď na klinickou otázku, kritické hodnocení externích důkazů, integrace externích a interních důkazů, vyhodnocení rozhodovacího procesu, EBM prakticky navazuje na klinickou epidemiologii, protože lékař při svém rozhodování získává potřebný vědecký důkaz mj. z publikovaných epidemiologických studií. Při klinickém rozhodování je řada otevřených otázek v důsledku rozdílu mezi teorií jednotlivých lékařských oborů a klinickou praxí. Někdy je možno vzít v úvahu stanovisko kapacity, ale i tito lidé si někdy ve svých názorech vzájemně odporují. Jako další možnost se přirozeně nabízí hledat stanovisko v odborné literatuře, tj. posuzovat validitu výsledků výzkumu. Každý lékař, i když nechce sám výzkumně pracovat, by měl rozumět principům výzkumu, aby jeho výsledky mohl správně interpretovat. KAPITOLA Informační zdroje Lékaři používají pro zodpovězení otázek, které vznikají v souvislosti s ošetřováním pacientů (tzv. klinických otázek) různé zdroje informací: 1. vlastní zkušenosti, 2. zkušenosti svých kolegů, 3. odbornou literaturu. Nejznámější je celosvětová bibliografická databáze MEDLINE, která je volně dostupná na internetu v prostředí informačního portálu PubMed ( Jsou zde k dispozici nástroje ke kategorizaci vyhledaných článků podle typu studií, tzv. EBM filtry. Je např. možno vyselektovat přehledové články, kontrolované klinické pokusy, doporučené postupy, meta-analýzy apod. V systému byla pro účely EBM vytvořena metodika zpracování nového typu přehledových článků, tzv. systematického review. V pyramidě důkazu (obr.1) se řadí systematické přehledy mezi hierarchicky nejvýznamnější typy publikací, protože se snaží vyčerpávajícím způsobem odpovědět na konkrétní klinickou otázku. Systematické přehledy šetří vyhledávání, studium a vlastní kritické hodnocení velkého množství literatury. Obrázek 39.1 Hierarchické uspořádání vědeckých důkazů v biomedicíně Personalizovaná medicína Personalizovaná medicína je multidisciplinární vědní obor zabývající se optimalizací léčebných a diagnostických postupů u konkrétního pacienta s využitím moderních metod. Bývá často uváděna jako "správná diagnostika, správná léčba pro správného pacienta ve správném čase". Vyvinula se jako reakce na moderní vývoj léčiv a diagnostických/terapeutických postupů včetně například léků, které jsou často uvedeny na trh při splnění podmínky efektivity ověřené v klinických studiích fáze III se standardní souhrnnou signifikancí. Tyto postupy neřeší léčbu konkrétního pacienta a do vzniku personalizované medicíny nikoho víceméně nezajímalo, proč některé léky u zlomku procenta pacientů nezabírají. Tam, kde si klasická medicína klade za úkol vyléčit většinu pacientů (a smiřuje se například s účinností léku u 97 procent léčených), pokládá si personalizovaná medicína otázku "pokud chci zvýšit pravděpodobnost vyléčení konkrétního pacienta, jak to mám udělat?" 473

474 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Literatura 1. Sackett, D.L.; Rosengerg, W. M. C.; Gray, J. A. M., Hayes R. B.; Richardson W. S. Evidence based medicine: what it is and what it isn't. BMJ, 1996, roč. 312, čís. 7023, s Claridge, J. A.; Fabian, T. C.. History and development of evidence-based medicine.. J Word Surg, 2005, roč. 29, čís. 5, s Kniha v původním znění How to read a paper the basics of evidence based medicine vyšla již ve dvou vydáních (1997, 2001 v nakladatelství British Medical Journal). Získala cenu Prix du Livre Médical et Pharmaceutique 2000 La revue Prescire, Francie. Byla přeložena do pěti jazyků. Je hodnocena jako bestseller vynikající učebnice základů evidence based medicine celosvětového trendu v medicíně. 4. Janout V., Klinická epidemiologie základ pro medicínu založenou na důkazu. Časopis lékařů českých 2003, 142(2): Porzsolt F. et al., 2003, Evidence-based decision making the 6-step approach. ACP Journal ClubNov-Dec, 139:A Mihál V. et al., Application of evidence based medicíně process to undergraduate and postgraduate medical education. 3rd International Conference of Evidence-Based Health Care Teachers & Developers Building bridges between research and teaching.taormina (Italy), 2nd-6th November, Abstract Book, p.71, Online: 7. Greenhalgh, T.. Jak pracovat s vědeckou publikací. Praha : Grada, S Potomková J., Význam systematických přehledů pro medicínu založenou na důkazu. Pediatrie pro praxi 2004, č.2: Online: 9. Pritchard, D. J., Korf, B. R.: Základy lékařské genetiky, Galén, Nussbaum, R. L., McInnes, R. R., Willard, H. F.: Klinická genetiky, Thompson & Thompson, TRITON Murray, R. K., Granner, D. K:, Mayes, P. A., Rodwell, V. W., Harperova biochemie, Nakladatelství a vydavatelství H & H, KAPITOLA 39 OMIKY ÚVOD Vědecké týmy složené z genetiků, organických chemiků a biochemiků, počítačových odborníků a specialistů dalších oborů bádají intenzivně v oboru zvaném funkční genomika. Ten zkoumá současné působení stovek až tisíců genů a vyvíjí pro takové studie software. Jedním z podoborů funkční genomiky je strukturní genomika, jejímž cílem je určit strukturu většiny proteinů kódovaných určitým genomem. Trojrozměrné struktury bílkovin a jejich funkce jsou klíčem např. pro cílené návrhy léčiv. Transkriptomika je podobor stanovující zapojování a vypojování souboru mrna transkriptů v určitém typu buněk nebo tkání a změny exprese genů vyvolávané chorobami. Proteomika zjišťuje, které soubory proteinů jsou přítomny v buňce a jak působí na sebe navzájem. A konečně metabolomika analyzuje metabolom, úplný soubor malých molekul v buňce, a hledá jeho změny v čase. Obrázek 39.2 Genomika, proteomika, metaboliomika, transkriptomika 474

475 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) GENOMIKA Vědní obor, vycházející z molekulární genetiky, který se zabývá studiem genomů organismů. Spadá sem především získávání sekvencí DNA organismů, genetické mapování a anotace genomů, tedy hledání genů a dalších funkčních elementů (snaha určit význam sekvence) a intergenomický výzkum - snaha srovnávat genomy různých organismů za účelem lepšího porozumění procesu evoluce. V genomice jsou hojně využívány metody molekulární biologie a bioinformatiky. Členění genomiky: Strukturní genomika - výzkum struktury genů a především celých genomů (např. rozložení genů v rámci genomu). Funkční genomika - především anotace genomů, hledání genů a určování jejich funkce. Komparativní genomika - porovnávání genomů různých organismů. Populační genomika - porovnávání genomů v rámci konkrétní populace konkrétního organismu, výzkum vlivu konkrétních podmínek. Výpočetní genomika - práce s genomickými daty pomocí bioinformatických výpočetních metod. Osobní genomika - sekvenace genomů (nebo částí genomů) lidských jednotlivců a jejich analýza, snaha lékařům do budoucna poskytnout přesné informace o genetických predispozicích pacienta. KAPITOLA 39 Základní metody a přístupy genomiky jsou: Sekvenace - Sangerova metoda sekvence Bioinformatika TRANSKRIPTOMIKA Věda zabývající se expresí genů celého genomu (tzv. genome-wide expression profiling). Exprese genů se zjišťuje nepřímo z analýzou mrna převedené na komplementární cdna. Transcriptome genome-wide soubor messenger RNA (mrna), tj. tzv. "transcriptů," v jednom typu nebo populaci buněk, tkáně nebo organizmu. Podobně jako proteom, a na rozdíl od genomu, transcriptom je dynamický, mění se na základě vnějších vlivů. Genome-wide metody studia genové exprese jsou: cdna microarrays and oligo-microarrays SAGE (sériová analýza genové exprese) cdna-aflp (délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů) PROTEOMIKA Vědní obor zabývající se komplexním studiem (analýzou) exprese genetické informace na úrovni proteinů (proteomu) ve vzorku (organela, buňka, tkáň, tekutina atd.). Proteomika se dále zabývá třírozměrnou strukturou proteinů a interakcemi proteinů. Proteom souhrn všech proteinů v buňce (někdy míněno ve vzorku) za daných ex. podmínek. První proteomické studie pochází z roku 1975, kdy O'Farrell, Klose a Scheele začali pomocí dvojrozměrných gelů mapovat proteiny Escherichia coli a savců. Proteom můžeme šířeji chápat jako buněčný a kompletní. Buněčný proteom je soubor proteinů, který se právě nachází v určité buňce, nebo buněčném typu, za daných podmínek. Např. ve proteom dělící se hematopoetické buňky v anafázi. Kompletní proteom je potom proteom organismu, tedy suma proteomů všech buněčných typů. Do tohoto pojmu jsou zahrnuty i proteiny, které se v organismu pouze mohou vyskytovat, ale v danou chvíli syntetizovány nejsou. Proteom je větší než genom, zejména u eukaryot. Je to hlavně díky alternativnímu splicingu a posttranslačním modifikacím proteinů, jako fosforylace nebo štěpení peptidového řetězce. Genom je relativně stabilní, proteiny se v buňce naopak mění velmi rychle a různým způsobem. O to je analýza proteomu složitější. Všechny proteiny dané buňky jsou analyzovány současně. 475

476 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Typy proteomiky: Proteomika proteinové exprese přístup porovnávající změny v expresi proteinů mezi vzorky-např. při studiu příčin nemocí, studiu patogeneze nemocí, studiu faktorů virulence u mikroorganizmů atd. Strukturální proteomika - analýza exprese a funkce proteinů v subcellularních strukturách (např. organelách, komplexech). Funkční proteomika Post-translační modifikace fosfoproteom Interakce protein-protein (yeast two-hybrid assay - interactomics) Proteomika ve výzkumu léčiv KAPITOLA 39 Dva hlavní přístupy v proteomice: Klasická proteomika - 2D separační techniky separace proteinů identifikace (MALDI-TOF) Shotgun proteomika - separace (většinou ESI- HPLC) peptidů (fragmentů) proteinů po proteolýze komplexní proteinové směsi trypsinem, identifikace LC-MS/MS analýzou Separace v proteomice: gelová vs. negelové separace [HPLC, GC (plynná chrom., CE kapilární elektroforéza)] Identifikace v proteomice: MS-Mass Spectrometry (hmotnostní spektrometrie), tandemová MS (MS/MS, MSn) jednotlivé MS odděluje kolizní cely, ve které je vybraný fragment štěpen inertním plynem Kvantifikace: na gelu nebo MS/MS Ettan DIGE System - fluorescenční barvení dvou vzorků proteinů dvěma barvičkami současně na gelu vs. itraq pomocí MS METABOLIOMIKA Vědní obor studující metabolické (nízkomolekulární) profily specifických buněčných pochodů. Zabývá se dynamickými změnami přítomnosti (kvantitou) metabolitů v biologickém systému jako důsledek exogenních stimulů, patofyziologických změn nebo genetické dispozice tzv. metabolic fingerprint. Metabolom představuje (kvantitativní) soubor metabolitů (např. intermediátů metabolismu, hormonů, metabolitů biotransformace endogenních i exogenních látek, sekundárních metabolitů atd.) biologického vzorku (např. celého organizmu) analyzovaný danou metodou. Nejblíže reflektuje funkční stav biologického systému. V roce 2007 vědci University of Alberta kompletovali lidský metabolom v moči, krvi a cerebrospinálním moku. Katalogizovali 6500 metabolitů, 1500 léčiv, 2000 komponentů potravy (viz. the Human Metabolome Database (HMDB) na hmdb.ca) Metabolomické přístupy a analytické metody: 1. extrakce metabolitů z biologických vzorků 2. separační techniky 3. detekce 4. identifikace a kvantifikace Separační metody: Plynová chromatografie velmi účinná pro nízkomolekulární těkavé látky,především ve spojení s MS Vysokoučinná kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography, (HPLC) širší spektrum analytů Kapilární elektroforéza (CE) Detekční metody: 476

477 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry (MS) především ve spojení GC-MS, HPLC-MS. Nukleární magnetiká rezonance (NMR) Infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FT-IR) Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem (ESI-MS)] Farmakogene(o)mika KAPITOLA 39 Farmakogenomické postupy se zabývají expresí a sekvencí nukleových kyselin s cílem přispět k vývoji nových léčiv a identifikaci jejich mechanismů účinku. V současné době je popsáno mnohem širší spektrum příčin variability lékové odpovědi než jen variabilita metabolizujících enzymů, jako např. variabilita transportních mechanismů, receptorů i postreceptorových mechanismů pro léčiva, které se všechny podílí na farmakokinetických i farmakodynamických parametrech léčiva. Farmakogenetické postupy postihují stále komplexnější studium těchto jevů. Genetický polymorfismus Geneticky podmíněné změny aktivity enzymů metabolizujících léčiva představují významný zdroj odlišnosti farmakokinetických parametrů léčiv mezi jedinci, které mohou způsobovat odlišné terapeutické odpovědi pacientů. Individuální rozdíly mezi jednotlivci mohou být značné od selhání terapie až po projevy toxicity a výrazný výskyt lékových interakcí. Variabilita metabolické aktivity je způsobena přítomností několika typů alel pro daný enzym, které předurčují různou aktivitu kódovaného enzymu. V populaci se tak vyskytují alely, u jejichž nositelů můžeme předpokládat rychlý metabolismus substrátů daného enzymu (rychlí metabolizátoři, RM), a alely, které způsobují značné snížení metabolické kapacity enzymu u jejich nositele (pomalí metabolizátoři, PM). Alely pro fenotyp RM jsou dominantní, tzn. že fenotyp PM je vyjádřen jen u homozygotů pro defektní alely, ale u heterozygotů je enzymová aktivita buď normální, nebo jen lehce snížená (intermediární metabolizátoři, IM). Enzym je označován jako polymorfní, pokud se v populaci vyskytuje více než 1 % PM. Pokud je výskyt variantních alel v odlišných populacích různý, může být také enzym v jedné populaci polymorfní a v jiné nikoli. Frekvence výskytu jednotlivých alel v populacích je dána přirozenou selekcí. Podle darwinovského modelu je totiž z hlediska přežití a reprodukce výhodnější heterozygotní genotyp než homozygotní. Tak jsou alely udržovány v populaci na základě rovnováhy mezi výskytem výhodného a nevýhodného genotypu. Dobře známým příkladem je polymorfismus glukóza-6-fosfát dehydrogenázy, pro jehož variantní alely jsou hemizygotní muži a homozygotní ženy vystaveny značnému riziku těžkého poškození (nebo smrti) neonatální žloutenkou a hemolýzou, ale heterozygoté jsou více odolní vůči malárii. Polymorfismus některých enzymů Cytochrom P-450 Cytochromy P-450 patří mezi proteiny se zásadní úlohou v katabolismu většiny xenobiotik, metabolismu některých endogeních substrátů (tromboxanů, prostaglandinů) a také při biosyntéze steroidů. V lidském těle byly nalezeny cytochromy patřící do 14 rodin a 20 podrodin. Z hlediska metabolismu léčiv mají největší význam zástupci 4 rodin. Cytochromy jsou vázány v membránách hladkého endoplazmatického retikula a mitochondrií, zejména v játrech, ale i v ledvinách, plicích, sliznici tenkého střeva, mozku nadledvinách, pohlavních žlázách a dalších orgánech. Reakce, které cytochromy u člověka katalyzují, vedou ke snazšímu vyloučení xenobiotik z organismu, aby nedocházelo k jejich akumulaci. Kromě detoxikace organismu mají také význam v procesu karcinogeneze a případné aktivaci prokarcinogenů. Izoenzymy metabolizující léčiva a xenobiotika nejsou přísně substrátově specifické. U řady látek je popsáno několik metabolických cest katalyzovaných více cytochromy. CYP2D6 Tento izoenzym cytochromu P-450 patří mezi enzymy, u nichž je možný klinický dopad polymorfismu na farmakoterapii léčiv všeobecně uznáván, protože je katalyzujícím enzymem řady často používaných léčiv ze skupin včetně antidepresiv, antipsychotik, analgetik, beta-blokátorů a antiarytmik. CYP2C9 Polymorfismus CYP2C9 je významný zejména pro metabolismus hypoglykemizujících antidiabetik, která při zpomaleném metabolismu u PM mohou vyvolávat závažné hypoglykémie, a antikoagulancií (S-warfarin). 477

478 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) CYP2C19 Mezi substráty izoenzymu CYP 2C19 patří např. léčiva jako omeprazol nebo některá antidepresiva. U omeprazolu byly pozorovány dvanáctkrát větší hodnoty AUC (plocha pod křivkou) u PM než u RM. Protože je omeprazol induktorem jiného izoenzymu CYP-450 1A2, mohou být u PM při podávání omeprazolu značně zvýšené aktivity CYP1A2, a tak i zrychlený metabolismus léčiv a ostatních látek, které jsou pro tento enzym substrátem. Současně je CYP2C19 také enzymem, který katalyzuje přeměnu antimalarika proquanilu na vlastní aktivní metabolit, což může vést k nedostatečně efektivní terapii malárie, zejména v některých asijských populacích s až 20% zastoupením PM. CYP2E1 CYP2E1 je znám především pro svoji účast na metabolismu etanolu (jenž je zároveň jeho induktorem), ale podílí se také na metabolismu řady dalších xenobiotik. Z léčiv jsou pro tento izoenzym substrátem např. anestetika halotan, enfluran, izofluran a také je spolu s CYP3A4 jednou z cest vzniku reaktivních hepatotoxických metabolitů paracetamolu. Ostatní enzymy cytochromu P-450 Aktivita dalších dvou enzymů, které se významnou měrou podílejí na metabolismu léčiv (CYP3A4 a CYP1A2), je mezi jedinci výrazně variabilní. Spíše než genetický polymorfismus způsobuje pravděpodobně tuto variabilitu mnoho negeneticky podmíněných vlivů, ke kterým jsou oba proteiny poměrně senzitivní (indukce a inhibice léčivy, fyziologickými a patologickými pochody v organismu, stravou atd.). Cholinesteráza Cholinesteráza vykazuje polymorfismus významný u hydrolýzy sukcinylcholinu. Gen pro tento enzym má řadu poměrně vzácných alel, jejichž výskyt vede u asi 2 % lidí k expresi enzymu se sníženou aktivitou a u přibližně 1 % lidí není aktivita vůbec detekovatelná. Důsledkem této metabolické vady může být až na několik hodin prolongovaná apnoe. Glukuronyltransferázy Glukuronidace je nejčastější konjugační reakcí při metabolismu léčiv. Existují vrozené vady glukuronidace, příkladem je Gilbertův syndrom, při němž je postižen nejen metabolismus bilirubinu, ale je rovněž snížena clearance řady léčiv včetně tolbutamidu, acetaminofenu, rifampicinu a irinotekanu. Genetickým podkladem syndromu je u pacientů s mírnějšími projevy mutace nekódující oblasti genu vedoucí ke snížení exprese genu. Druhá forma se závažnějšími příznaky je pravděpodobně způsobena mutací kódující sekvence genu pro glukuronidázu. N-acetyltransferázy Byl popsán polymorfismus N-acetyltransferázy 1 (NAT1) a N-acetyltransferázy 2 (NAT2). Molekulární podstatou polymorfismu NAT2 je přítomnost více než 15 alelických forem, z nichž většina enzymovou aktivitu snižuje. Neschopnost acetylovat léčiva vede k nežádoucím účinkům, mezi něž patří např. periferní neuropatie u pacientů užívajících izoniazid nebo reakce přecitlivělosti po podání sulfonamidů. Naopak rychlí acetylátoři jsou ohroženi leukopenií po podání amonafidu, proléčiva užívaného při chemoterapii. Zvýšená aktivita polymorfního enzymu NAT1 vede ke zvýšení rizika karcinomu tlustého střeva, ale význam z hlediska metabolismu léčiv není zatím jasný. Glutathion S transferázy Polymorfismus glutathion S transferáz (GST) je velmi výrazně vyjádřený. GST představují důležité detoxikační cesty, jejichž polymorfismus je studován nejvíce ve vztahu k nádorové chemoterapii. Například nositelé jedné variantní alely (GST P3) jsou méně náchylní k cytotoxickým projevům léčby cisplatinou než ostatní pacienti. Metyltransferázy Jsou skupinou enzymů katalyzujících řadu reakcí, u nichž je přítomna variabilita nebo polymorfismus. Význam polymorfismu u této skupiny léčiv je stanoven např. pro thiopurin-s-metyltransferázy (TSMT), u které jsou popsány 4 typy alel. TSMT představuje důležitou katalytickou cestu cytotoxických látek 6-merkaptopurinu, 6-thiopurinu a azathioprinu. U pacientů s deficiencí TSMT byly opakovaně popisovány fatální myelosuprese způsobené vysokými koncentracemi léčiv. Také riziko sekundárních malignit (tumorů mozku a akutních leukémií) je zvýšeno u pacientů s některými variantami alel. KAPITOLA

479 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) Transportní proteiny P-glykoprotein (P-gp) je prvním popsaným a také nejznámějším proteinem velké skupiny membránových transportérů, jejichž aktivita je závislá na hydrolýze ATP a které jsou nazývány ABC proteiny. Jejich činností jsou přenášené substráty vylučovány z intracelulárního prostoru. Lokalizace P-gp v membránách buněk jater, ledvin a střeva vede k eliminaci substrátů do žluče, moči i ke snížené biologické dostupnosti léčiv z GIT. Dále je P-gp výrazně exprimován v endoteliálních buňkách v CNS, což brání penetraci substrátů přes hematoencefalickou bariéru. Zvýšená exprese P-gp v nádorových buňkách vede ke známému jevu mnohočetné lékové rezistence. Gen kódující P-gp je vysoce polymorfní. Řada alel sice nevede ke změně aktivity P-gp, ale pravděpodobně nejsou všechny varianty dosud známé. Navíc je také inducibilita P-gp variabilní a její míra je závislá na přítomnosti alelických variant. Efluxní systém P-gp pracuje v interakci s jinými cestami, které vedou k eliminaci xenobiotik z organismu. Příkladem může být CYP3A4, který má s P-gp řadu společných substrátů a má také vysokou aktivitu v některých podobných lokalizacích jako P-gp (játra, střevo). Všechny tyto faktory jsou příčinou toho, že klinický význam P-gp je stále velmi špatně popsán a poznání této oblasti je výhledem do budoucnosti, jež jistě přinese změnu některých terapeutických postupů. Přesto je už dnes známo, že indukce P-gp rifampicinem vede k signifikantnímu snížení biologické dostupnosti digoxinu. Rovněž biologická dostupnost cyklosporinu je závislá na aktivitě P-gp. Farmakogenetika v léčbě kardiovaskulárních chorob Zavádění poznatků farmakogenetiky do léčby kardiovaskulárních onemocnění přestoupilo z fáze teoretických předpokladů do fáze praktického využití, zejména to platí pro léčbu antitrombotiky. Podkladem interindividuálních rozdílů v účinku léků bývá polymorfismus transformačních enzymů, transportních systémů zajišťujících osud léků v organismu i receptorů, enzymů či signálních molekul ovlivňujících vlastní účinek léčiva. V léčbě antitrombotiky se klinicky významně uplatní zejména polymorfizmus efluxního glykoproteinu P (ABCB1 3435C T) v resorpci léku či polymorfizmus isoenzymu CYP2C19 v bioaktivaci klopidogrelu. Genotypizace glykoproteinu P (P-gp) má význam pro určení biologické dostupnosti klopidogrelu, genotyp 3435CC je spojen s nízkou aktivitou P-gp a s vyšší dostupností klopidogrelu, tedy i spolehlivějším antitrombotickým efektem, naopak varianta 3435TT je spojena s vysokou aktivitou a s nedostatečnou dosažitelností. Stanovení genotypu CYP2C19, konkrétně CYP2C19*2 nebo CYP2C19*3 má rovněž význam, u nositelů těchto alel probíhá bioaktivace klopidogrelu pomaleji a více proléčiva je degradováno esterázami. Podobně má u rizikových osob význam genotypizace reduktázy vitaminu K. Nositelé VKORC1AA konstituují subpopulaci warfarin-senzitivní a na druhém pólu stejná část jedinců s variantou VKORC1BB je k působení warfarinu méně citlivých, tj. subpopulace warfarin-rezistentní. Podobně existuje subpopulace s rozdílnou rychlostí biodegradace warfarinu isoenzymy CYP2C9 a CYP4F2. Výsledné kombinace odpovědi na úrovni vitamin K reduktázy a rychlosti metabolizmu jsou spoluzodpovědné za výslednou léčebnou dávku antivitaminu K. Vzhledem k velkému klinickému významu různých typů polymorfizmu na účinek léku je patrný trend k zavádění nových léčiv (např. prasugrel, ticagrelor) s farmakokinetikou nezávislou na rozdílné aktivitě metabolických a transportních systémů. KAPITOLA 39 Nádorová biologie V klinické praxi je zkoušena řada různých biomarkerů, s cílem individualizovat onkologickou léčbu. Jinými slovy na základě laboratorního vyšetření těchto biomarkerů vytipovat, zda bude další onkologická léčba pro pacienta přínosná ve srovnání s pouhým sledováním po radikální chirurgické resekci, jakou chemoterapii v rámci standardních možností vybrat se zohledněním potencionální toxicity chemoterapie a zda je či není indikovaná kromě chemoterapie i léčba biologická. Narůstající náklady na farmakoterapii nádorových onemocnění jsou dalším podstatným důvodem správně cílené léčby. Příklady některých používaných biomarkerů Podle výsledků řady studií je pozorován přínos adjuvantní chemoterapie na bázi fluoropyrimidinů pro stadium II. kolorektálního karcinomu s MSI (mikrosatelitní nestabilita). MSI a další biomarkery jako např. alelická dysbalance na chromozomu 18q jsou v současné době testovány v rámci prospektivního klinického hodnocení v indikaci adjuvantní chemoterapie. Další biomarkery se hledají k predikci toxicity chemoterapie. Jedním z nich je polymorfismus UGT1A1*28, který je provázen signifikantním snížením enzymatické aktivity a tím současně zvýšeným rizikem těžké neutropenie. V současné době je rutinně používaným biomarkerem stav mutace K-ras. Stanovení mutace K-ras je jednoznačným markerem absence odpovědi na léčbu inhibitory EGFR, tj.cetuximabem či panitumumabem. Dokonce jak vyplynulo z výsledků studie OPUS 479

480 Trendy v laboratorní medicíně (POCT, automatizace, konsolidace, EBM, omiky) zhoršuje kombinace cetuximab/folfox léčebné výsledky ve srovnání se samotnou chemoterapií v populaci s mutovanou formou K-ras. Stejné výsledky byly potvrzeny analýzou studií CRYSTAL a PACCE, kde byl místo oxaliplatiny použit irinotekan. Vyšetření na přítomnost mutace K-ras je nepodkročitelnou podmínkou zahájení léčby cetuximabem či panitumumabem. Karcinom prsu je celosvětově nejčastějším nádorovým onemocněním žen. Naštěstí se i přes vysokou incidenci tohoto onemocnění daří díky neustálému zlepšování diagnostiky a léčby stále více pacientek úspěšně léčit. Velkou nadějí je cílená biologická léčba schopná cíleně vyhledat nádorové buňky a zastavit jejich růst nebo případně nádorové buňky ničit. Jedním z těchto nových léků je i Herceptin, který jako specifická protilátka účinně pomáhá v léčbě karcinomu prsu se zvýšenou expresí epidermálního růstového faktoru 2 (genu HER2). U tohoto tzv. HER2-pozitivního typu nádoru Herceptin specificky blokuje právě HER2 receptor, což vede k zastavení růstu nádoru nebo dokonce jeho regresi. KAPITOLA 39 Sledování parametrických profilů pacientek s karcinomem prsu léčených Herceptinem je tak jedinečnou příležitostí pro popis epidemiologické situace HER2-pozitivních pacientek v České republice, která může odborné společnosti sloužit nejen pro modelování vztahu rizikových faktorů a dosahovaného přežití, ale také pro odhady ekonomického charakteru, jako například pro plánování nákladů protinádorové terapie. Literatura 1. Snustad, P.,D., Simmons, M., J.: Genetika, Brno: Masarykova univerzita, Nakladatelství, Šeda, O., Šedová, L. : Farmakogenomika a nutrigenomika: komplexní interakce genů s prostředím. Klin Farmakol Farm Proteomická sekce ČSBMB Co je proteomika? 4. Šeda, O., Liška F., Šedová, L., Aktuální genetika - Multimediální učebnice lékařské biologie, genetiky a genomiky, biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/ 5. OMICS: Transkriptomika, proteomika, genomika, metabolomika - komplexní přístupy studia funkce buňky

481 Monitorování antikoagulační léčby Monitorování antikoagulační léčby Autor: MUDr. Ivana Hadačová Recenzenti: MUDr. Jitka Šlechtová KAPITOLA 40 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Fyziologie srážení krve Hemostatický systém má dvě základní funkce: zastavení krvácení při poranění cévy udržení krve v tekutém stavu, tedy zabránění vzniku krevního koagula uvnitř cévy K udržení této rovnováhy slouží 4 systémy: systém primární hemostázy plazmatický koagulační systém koagulační inhibitory fibrinolytický systém Při traumatu se céva stáhne, tím se omezí průtok krve. Krevní destičky v místě poranění adherují na kolagen v subendotelovém vazivu poraněné cévy, shlukují se (agregace), uvolňuje se obsah cytoplazmatických granul vzniká primární hemostatická zátka. Současně je zahájeno srážení krve. Postupnou aktivací koagulačních faktorů dochází ke vzniku fibrinového koagula. Koagulační faktory jsou glykoproteiny, tvoří se převážně v játrech. Koagulační schopnost faktorů II, VII, IX a X je závislá na přítomnosti vitaminu K. Většina faktorů má charakter serinových proteáz, v plazmě jsou za klidových podmínek přítomné v neaktivní formě a při podnětu ke srážení se postupně aktivují aktivuje se koagulační kaskáda. K aktivaci koagulačního systému dochází dvěma možnými způsoby vnitřní cestou přes faktor XII a kalikrein a zevní cestou prostřednictvím faktoru VII. Oba systémy pak od faktoru X vytvoří společnou cestu. Pro správnou aktivaci je nutná přítomnost iontů vápníku a destičkových fosfolipidů. Cílem aktivace je vytvoření dostatečného množství faktoru II (trombinu). Trombin uvolňuje z fibrinogenu fibrinové monomery, ty se spojí v polymery. Ke zpevnění fibrinové sítě slouží faktor XIII vzniká definitivní fibrinové koagulum. Aktivace koagulačního systému zevní a vnitřní cestou odděleně probíhá hlavně v laboratorních podmínkách. Pro srážení krve in vivo je prioritní zevní cesta koagulace. Prostřednictvím vnější tenázy (FVIIa + tkáňový faktor) dojde k zahájení (iniciaci) srážení krve a k vytvoření malého množství trombinu. Trombinem je zpětnou vazbou aktivována prostřednictvím vnitřní tenázy (FIXa+FVIIIa) vnitřní cesta koagulace, dochází k posílení (amplifikaci) procesu a vzniku protrombinázy (FXa + FVa). Protrombináza štěpí neaktivní protrombin na aktivní trombin a takto vzniklý trombin je schopný přeměnit fibrinogen na fibrinové koagulum. Současně s aktivací koagulačních faktorů dochází k aktivaci regulačního systému systému inhibitorů koagulace. K hlavním inhibitorům koagulace patří antitrombin (AT), protein C (PC) a protein S (PS). Všechny tři se tvoří v játrech, funkční schopnost PC a PS je závislá na přítomnosti vitaminu K. Trombin vzniklý v procesu koagulace se váže na transmembránový glykoprotein trombomodulin na endotelu cév a tím dochází k aktivaci proteinu C. Komplex aktivovaného PC, PS, trombinu a trombomodulinu, navázaný na endoteliální protein C receptor, inhibuje aktivované faktory V a VIII ( Va, VIIIa) Aktivita AT je zaměřena proti aktivovaným faktorům II a X (IIa, Xa) a dále proti aktivovaným faktorům IX, XI a XII (IXa, XIa, XIIa). AT je pomalý inhibitor, jeho reakci s cílovými faktory výrazně urychluje přítomnost heparinu. Regulační funkci plní i systém fibrinolytický. Jakmile v cirkulaci vznikne koagulum, dochází k přeměně neaktivního plazminogenu na aktivní plazmin. Tato přeměna je zprostředkována tkáňovým aktivátorem plazminogenu nebo urokinázou. Vzniklý plazmin štěpí fibrin za vzniku degradačních produktů dochází k rozpuštění koagula. Vzniklý plazmin je odbouráván α2antiplazminem, současně probíhá inaktivace fibrinolytického systému pomocí inhibitorů aktivátorů plazminogenu (PAI). 481

482 Monitorování antikoagulační léčby Laboratorní testy Laboratorní testy v hematologii slouží k vyšetření krvácivých stavů, stavů s tendencí k nadměrnému srážení krve (trombofilních stavů) a ke kontrole antikoagulační léčby. Většina hemokoagulačních testů se provádí z plazmy. Plazma se získává z krve odebrané do protisrážlivého roztoku. Protisrážlivý roztok váže ionty kalcia v jejich nepřítomnosti nemůže probíhat koagulační proces. Pro většinu hemostatických testů se jako protisrážlivé činidlo používá 3,8% citronan sodný v poměru 1 díl citronanu na 9 dílů krve. Komerčně vyráběné odběrové zkumavky je nutné naplnit krví po rysku, aby byl tento poměr zachován. Principem koagulačních testů je měření času od aktivace koagulačního systému do vzniku fibrinového koagula, u chromogenních testů se využívá enzymatické schopnosti koagulačních faktorů - měří se množství barevného produktu, uvolněného z tzv. chromogenního substrátu. Testy pro kontrolu antikoagulační léčby Aktivovaný parciální tromboplastinový test (APTT) - koagulační test, závislý na hladině faktorů vnitřního systému (XII, XI, IX, VIII, prekalikrein, vysokomolekulární kininogeny), na nedostatek faktorů společné cesty (X, V, II, fibrinogen) je méně citlivý. Prodlužuje se při nedostatku výše uvedených faktorů, při přítomnosti specifických a nespecifických inhibitorů, štěpných produktů fibrinu a fibrinogenu ve vysokém titru a v přítomnosti heparinu. Používá se ke kontrole antikoagulační léčby standardním heparinem. Výsledek testu se udává jako čas pacienta s udáním času normální plazmy (normální plazma je směs plazmy zdravých dárců) nebo jako poměr (APTT-R), to je čas pacienta /čas normální plazmy. Protrombinový (Quickův) test (PT) koagulační test, závislý na hladině faktorů zevního systému a společné cesty (VII, X,V, II, fibrinogen). Prodlužuje se při nedostatku uvedených faktorů, vzácně při přítomnosti specifických nebo nespecifických inhibitorů. Stejně jako APTT se PT vyjadřuje jako čas pacienta s udáním času normální plazmy a jako poměr těchto časů. PT se vyjadřuje i jako tzv. mezinárodní normalizovaný poměr INR, ve kterém je započtena citlivost užité reagencie k poklesu K dependentních faktorů tzv. ISI konstanta tj. mezinárodní index senzitivity. Test vyjádřený hodnotou INR se používá pro kontrolu antikoagulační léčby antivitaminy K (warfarin). Anti Xa test chromogenní test, měří inhibici aktivovaného faktoru X v plazmě pacienta na léčbě heparinem. Výsledná hodnota se odečítá z kalibrační křivky a udává se v U/ml. Test se užívá ke kontrole antikoagulační léčby nízkomolekulárním heparinem, je možné ho užít i pro kontrolu léčby standardním heparinem. KAPITOLA 40 Laboratorní kontrola antikoagulační léčby Cíl: Dosáhnout takového snížení koagulační kapacity krve, které minimalizuje na jedné straně riziko trombózy a na druhé straně riziko krvácení, tedy dosáhnout terapeutické hladiny. Warfarin Mechanismus účinku: Interferuje se syntézou na K vitaminu závislých faktorů (II, VII, IX, X) a inhibitorů (protein C a S) a snižuje tak jejich funkční aktivitu. Indikace: Profylaxe a léčba žilní trombózy a plicní embolie. Dávkování: Dospělí Děti 5-15 mg/d; dávka se upravuje podle hodnoty INR 0,1-0,35 mg/kg/d; (maximální dávka 15 mg) dávka se upravuje podle hodnoty INR Laboratorní kontrola: INR Terapeutické a preventivní rozmezí: 2-3 2,5-3,5 pro pacienty s vyšším rizikem trombózy (mechanická srdeční chlopeň, opakovaná plicní embolie) 482

483 Monitorování antikoagulační léčby Standardní heparin Mechanizmus účinku: Působí prostřednictvím antitrombinu a brání tak přeměně fibrinogenu na fibrinové koagulum. Nemá vlastní trombolytickou schopnost, ale zabraňuje nárůstu fibrinového koagula. Indikace: Léčba žilní i arteriální trombózy, prevence srážení krve při mimotělním oběhu a při dialýze. Dávkování: (léčba trombózy) Dospělí Děti Bolus: 75 U/kg IV 75 U/kg IV Udržovací dávka: 18 U/kg/h IV - v KI U/kg/h IV - v KI dávka se upravuje podle hodnoty APTT dávka se upravuje podle hodnoty APTT/ anti Xa testu KAPITOLA 40 Laboratorní kontrola: APTT R anti Xa test (vhodnější pro děti) Tereapeutické rozmezí: 1,5-2,5 0,4-0,7 U/ml Nízkomolekulární heparin (LMWH) Mechanizmus účinku: Vazbou na antitrombinu zesiluje jeho inhibiční efekt na aktivovaný faktor X (Xa) a v menší míře i na faktor II (IIa). Indikace: Prevence a léčba žilní i arteriální trombózy. Dávkování: Dospělí Děti Prevence axa IU (20-40mg)/24h s.c. < 2 měsíce: 75 axa IU(0.75 mg)/ kg/12h s.c měsíců: 50 axa IU (0.5 mg)/kg/12h s.c. >12 měsíců: 100 axa IU (1mg)/kg/24h s.c. Léčba 100 axa IU (1mg)/kg/12h nebo < 2 měsíce: 150 axa IU (1,5mg)/kg/24h s.c. 150 axa IU( 0.75 mg)/ kg/12h s.c. >2 měsíce: 100 axa IU (1mg)/kg/12h. s.c. dávku je nutné upravit dle výsledku antixa testu Laboratorní kontrola: Preventivní rozmezí: Terapeutické rozmezí: Anti Xa test (1. odběr 4 hodiny po 2. dávce, při změně dávky 4 hodiny po následující dávce) 0,2 0,4 U/ml 0,5 1,0 U/ml 483

484 Monitorování antikoagulační léčby Otázky: (správné odpovědi) 1. Jaký je vhodný krevní vzorek pro vyšetření testů hemostázy? a. sražená krev b. žilní krev odebraná do 3,8% citronanu sodného (1 díl citronanu/9 dílů krve) c. žilní krev odebraná do heparinu d. krevní sérum 2. Jaký test se používá pro kontrolu antikoagulační léčby standardním heparinem? a. APTT b. vyšetření počtu trombocytů c. běžně APTT, lze ale použít i anti Xa test d. léčbu standardním heparinem není nutné kontrolovat 3. Co je INR? a. mezinárodní normalizovaný poměr b. způsob vyjádření PT, ve kterém je započtena ISI konstanta c. jeden z faktorů srážení krve d. koagulační čas normální plazmy 4. Jaké je terapeutické rozmezí při léčbě warfarinem? a. APTT R 2-3 b. anti Xa 0,2-0,4 U/ml c. INR 2-3 d. INR 2,5-3,5 5. Co je to anti Xa test? a. chromogenní test, měří inhibici aktivovaného faktoru X v plazmě pacienta na léčbě heparinem b. test ke kontrole antikoagulační léčby nizkomolekulárním heparinem c. test ke kontrole léčby standardním heparinem d. test ke kontrole léčby warfarinem KAPITOLA

485 Nutrice a metabolické bilance - příprava Nutrice a metabolické bilance - příprava Autor: MUDr. Milan Dastych; doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA Recenzent: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. KAPITOLA 41 Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko Klinická výživa - příprava Základy digesce (trávení) potravy Výživa organismu je zajištěna procesem trávení (digescí) a vstřebávání (absorpcí) živin z přijímané potravy za účasti gastrointestinálního traktu. Trávení je započato rozmělněním potravy v dutině ústní, slinná amyláza zahajuje štěpení škrobů. V žaludku dochází vlivem kyselé reakce žaludeční šťávy (aktivní sekrece H + protonovou pumpou v apikální membráně parietálních buněk) k denaturaci bílkovin. Z hlavních žaludečních buněk je secernován pepsinogen, který je v kyselém prostřední aktivován na pepsin. Tato peptidáza zahajuje štěpení bílkovin v potravě. Nízké ph žaludečního prostředí je významným ochranným prvkem před přemnožením bakterií v tenkém střevu. Rezervoárová funkce žaludku umožňuje nárazový příjem potravy s následným postupným propulzním dávkováním tráveniny pylorem do tenkého střeva. V duodenu se trávenina setkává s pankreatickou šťávou a žlučí. Pankreatická šťáva obsahuje lytické enzymy, které jsou schopny rozkládat jednotlivé živiny - cukry, tuky, bílkoviny. Významný je obsah proteolytických enzymů trypsinu, chymotrypsinu a elastázy, pankreatické amylázy rozkládající škroby, pankreatické lipázy trávící tuky. Žluč svými detergentními vlastnostmi působí emulgaci tuků (účinek fosfolipidů a žlučových kyselin) za vzniku micel a umožňuje působení pankreatické lipázy a vstřebávání tuků a v tucích rozpustných vitamínů (ADEK). Trávení proteinů a cukrů dokončují enzymy kartáčového lemu enterocytů. Po rozkladu tráveniny na základní složky - monosacharidy, mastné kyseliny, glycerol, aminokyseliny, dipeptidy, tripeptidy - dochází k jejich absorpci přes kartáčový lem enterocytů. Základy absorpce (vstřebávání) živin K vstřebávání dochází nejčastěji mechanizmem facilitované difúze nebo kotransportu (nejčastěji spřažení s Na + ). Monosacharidy jsou metabolizovány na glukosa-6 fosfát a tato molekula pak vstupuje do intermediárního metabolismu. Aminokyseliny jsou využity pro resyntézu proteinů, některé již v enterocytu, ale hlavní vstřebávaný proud směřuje portální žilou do jater, kde jsou využity pro proteosyntézu. Vstřebávání mastných kyselin (MK) závisí na délce C řetězce. MK se středním řetězcem (6-12 uhlíků, jejich zdrojem jsou Medium Chain Triglycerides (MCT)) jsou vstřebávány do enterocytu a dále předávány do krve a portální žilou se dostávají do jater. Zde slouží jako zdroj energie (β-oxidace, acetyl Co-A, Krebsův cyklus a dýchací řetězec s uvolněním ATP popřípadě po překročení kapacity K. cyklu dochází k tvorbě ketolátek jako alternativního zdroje energie pro periferní tkáně), nebo se využijí na syntézu TAG do VLDL. MK s delším uhlíkatým řetězcem jsou využity v enterocytu pro resyntézu triacylglycerolů a formují spolu s fosfolipidovou membránou enterocytů chylomikrony. Micely chylomikronů se dostávají do paracelulárních lymfatických prostor, které nakonec zformují ductus thoracicus. Chylomikrony se tak dostávají do systémového krevního řečiště (v. cava superior) a jsou metabolizovány v periferních tkáních tkáňovou hormon senzitivní lipázou. Uvedené živiny (cukry, tuky, bílkoviny) jsou vstřebávány v duodenu a proximální části tenkého střeva (jejunum). Na začátku tenkého střeva jsou taktéž vstřebávány K, Ca, Mg, Fe, vitaminy a stopové prvky. Sodík a voda jsou vstřebávány v průběhu celého tenkého střeva, významněji v ileu, kde sodík může být vstřebán proti koncentračnímu gradientu. Ileum je schopné převzít zcela funkci jejuna při vstřebávání živin a navíc plní speciální funkce - vstřebávání žlučových kyselin, vitamínu B 12. V tlustém střevu dochází k zahuštění tráveniny vstřebáním vody a sodíku a probíhá zde metabolizace rozpustné vlákniny (inuliny, guarová guma, pektiny, fruktooligosacharidy, glukomanany, galaktomanany) střevními baktériemi. Metabolizací rozpustné vlákniny vznikají MK s krátkým řetězcem (Short Chain Fatty Acid - SCFA, acetát, propionát, butyrát), které mohou být významným zdrojem energie (až 20% celkové energetické potřeby).vstřebané živiny se dostávají portální žilou do jater, kde jsou dále zpracovávány dle aktuálních potřeb organismu. 485

486 Nutrice a metabolické bilance - příprava Dávky energie a živin Denní celková energetická potřeba pro 80% dospělých jedinců se pohybuje kolem 2000 kcal, což odpovídá 8400 kj (1kcal = 4,2 kj). Jeden gram glukózy obsahuje 4 kcal, 1 g aminokyselin (AK) obsahuje 4 kcal, 1g tuku obsahuje 9 kcal, 1g ethanolu obsahuje 7 kcal. Jeden gram dusíku je obsažen v 6,25 g AK (bílkovin). Jeden gram bílkovin je obsažen v 5-6 g svalové tkáně. Vodní bilance KAPITOLA 41 Vodní bilance představuje rozdíl mezi příjmem a výdejem tekutin za 24 hodin. Do vodní bilance se započítávají ztráty potem, dýcháním (neměřitelné ztráty), stolicí, močí, píštělemi, stomiemi, odpady do drénů. Ztráty tekutin se zvyšují při zvýšení tělesné teploty a při hyperventilaci. Do příjmu tekutin počítáme perorální příjem tekutin, příjem tekutiny v potravě, metabolickou vodu, příjem tekutin infúzemi. Základní bilanci ukazuje tabulka č Příjem Tekutiny 1500ml Tekutiny v potravě 600ml Metabolická voda 200ml Celkem 2300ml Výdej Diuréza 1500ml Dýchání 350ml Pocením 350ml Stolicí 100ml Celkem 2300ml Tabulka 41.1: Vodní bilance za 24 hodin Katabolismus x anabolismus Při katabolismu dochází k odbourávání bílkovin - proteolýze, lipolýze a glykogenolýze. Proteiny jsou "zneužívány" jako energetický zdroj - po deaminaci slouží jejich uhlíkaté řetězce ke glukoneogenezi, nebo jsou rovnou katabolizovány v Krebsově cyklu. Bílkoviny přestávají plnit svoje funkce (signální, strukturální, transportní, obrannou), což je vysoce nevýhodné a při neodstranění příčiny katabolismu dochází k zániku organismu. Katabolismus bílkovin se projevuje zvýšenou syntézou močoviny z aminokyselin metabolizovaných proteinů. Zvyšují se její odpady do moči, zvyšují se tudíž odpady dusíku. Za hranici katabolismu se považují ztráty dusíku více jak 10 g/24 hod. Ke katabolismu vedou jednak stavy spojené s nízkou dostupností živin (mentální anorexie, poruchy polykání, chronická pankreatitida) a jednak stavy doprovázené metabolickým stresem (sepse, polytrauma, rozsáhlý chirurgický výkon, popáleniny, těžká akutní pankreatitida). V prvním případě dochází k adaptaci na hladovění, jejíž podstatou je maximalizace lipolýzy jako zdroje energie (ketolátky) s významným omezením katabolismu bílkovin. Adaptace na hladovění umožní organismu přežívání v řádech měsíců. V druhém případě dochází pod vlivem stresových inzultů k výrazné elevaci tzv. kontraregulačních hormonů : katecholaminů, glukagonu a kortizolu. Zároveň dochází ke snížení sekrece inzulinu a rozvoji periferní inzulinové rezistence. Tyto hormonální změny jsou zodpovědné za vznik tzv. stresového diabetu a zablokování lipolýzy. Jako zdroj energie a glukózy jsou preferenčně metabolizované svalové a plazmatické bílkoviny ("autokanibalismus"). Pokud nedojde k odstranění vyvolávající příčiny a adekvátní nutriční podpoře, vede tento stav k zániku organismu do dvou týdnů. Anabolismus probíhá pod vlivem anabolického hormonu - inzulinu. Je charakterizovaný syntézou bílkovin, glykogenu, mobilizací tekutin a doplněním obsahu zásobního tuku. Charakteristická je pozitivní bilance dusíku, zvyšování hladiny prealbuminu a albuminu, svalové síly a celkové zlepšování klinického stavu. Po přechodném váhovém poklesu (mobilizace tekutin), dochází k nárůstu tělesné váhy. Podvýživa v nemocnici Podvýživa je diagnostikována na základě anamnézy, antropometrie a laboratorních vyšetření. O podvýživě, nebo riziku podvýživy hovoříme u pacientů pokud: je pokles tělesné hmotnosti o 5 % za měsíc nebo 10 % za 2-6 měsíců je příjem potravy menší než ¾ porcí je BMI menší než 18,5 je albumin menší než 28 g/l, je přítomna anemie, je elevace CRP 486

487 Nutrice a metabolické bilance - příprava Pacienti v malnutrici jsou ohrožení jejími negativními dopady, které vystupují jako negativní rizikový faktor průběhu nemocí. Dochází ke snížení obranných a reparativních procesů a ke snížení svalové síly. Dopadem těchto změn jsou: vyšší náchylnost k nozokomiálním infektům (močové, plicní, rané), rozpady operačních ran a anastomóz s jejich sekundárním hojením a rizikem vzniku enterálních píštělí, imobilizace, obtížné odpojování od ventilátoru, vznik dekubitů. Tyto negativní dopady se projeví zvýšením morbidity a mortality, prodloužením hospitalizace, zvýšenou spotřebou antibiotik a zvýšením cenových nákladů. Včasné odhalení malnutrice a její adekvátní léčba může uvedeným dopadům zabránit. KAPITOLA

488 Nutrice a metabolické bilance Nutrice a metabolické bilance Autor: MUDr. Milan Dastych; doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA Recenzent: MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-neužívejte dílo komerčně-nezasahujte do díla 3.0 Česko KAPITOLA 41 Poruchy výživy obecně V klinické praxi se setkáváme se dvěma krajními typy poruch výživy. Na jedné straně podvýživa a na druhé straně obezita. Zatímco problematika obezity je z velké části doménou vyspělého civilizovaného světa, její protiklad podvýživa se vyskytuje jak v zemích s nízkým socioekonomickým standardem tak ve vyspělých zemích. V rozvinutých zemích je malnutrice většinou spojena se základní nemocí. V každodenní praxi se v nemocnici setkáváme s jedinci, kteří mohou být v riziku podvýživy nebo již malnutričtí jsou. Průběh nemoci je zhoršen a často bývá komplikován fatálními dopady malnutrice. V následujícím textu se budeme věnovat malnutrici hospitalizovaných nemocných, jejím příčinám, dopadům a možnostem ovlivnění. Příčiny podvýživy Obecně podvýživa vzniká při porušení rovnováhy mezi příjmem a potřebou živin. K této nerovnováze (negativní bilanci) dochází při: snížení příjmu potravy (mentální anorexie, onemocnění zubů a dutiny ústní, poruchy polykání, nádory jícnu, žaludku, slinivky, nechutenství, chudoba bezdomovců a tuláků spojená jak s malnutricí tak alkoholismem) porucha digesce a absorpce (gastrektomie, pankreatopatie, cystická fibróza, hepatopatie, biliární patologie, deficit laktázy, celiakie, stavy po resekcích střeva, syndrom slepé kličky, nespecifické střevní záněty, střevní píštěle) metabolické poruchy (jaterní a renální insuficience) zvýšené ztráty a katabolismus způsobený chorobou (píštěle, operace, sepse, nádory, trauma, infekce, absces) Výskyt podvýživy v nemocnici Už v roce 1885 Florence Nightingelová upozorňovala při výuce ošetřovatelství na to, že Tisíce pacientů zemřou hladem uprostřed hojnosti a blahobytu pro nedostatek pozornosti věnované vyhledávání způsobu, který by jim umožňoval přijímat potravu. Screeningové studie tento předpoklad potvrdily a do vztahu s podvýživou je dáváno cca % úmrtí v nemocnici. Malnutrice se vyskytuje u % pacientů v nemocnici. V tabulce č je uveden výskyt podvýživy u některých chorobných stavů. Geriatrie 50% Nespecifické střevní záněty 75% Nádory 20-80% Plicní choroby 45% Malnutrice vzniklá během hospitalizace 20-25% Celkově malnutrice v nemocnici 30-35% Tabulka 41.1: Výskyt podvýživy u vybraných nemocí 488

489 Nutrice a metabolické bilance Rizika a dopady podvýživy v nemocnici Podvýživa v důsledku katabolismu se zvýšením proteolýzy a glukoneogeneze vede ke snižování tělesné svaloviny a viscerálního proteinu. Důsledkem sníženého poolu bílkovin, resp. snížení funkční kapacity bílkovinného aparátu organismu je snížení obranné a reparativní imunitní odpovědi. Tato situace vede k nárůstu výskytu infekčních komplikací - močové, respirační, rané infekce a k významnému snížení hojení ran. Druhým zásadním dopadem je snížení svalové hmoty a svalové síly vedoucí k dlouhodobé imobilizaci, rozvoji dekubitů a respiračnímu selhání se závislostí na umělé plicní ventilaci. Výsledkem všech těchto změn je prodloužení doby hospitalizace, zvýšení morbidity a mortality, zvýšení nákladů na léčbu. Včasná diagnostika a léčba podvýživy může těmto dopadům předejít. KAPITOLA 41 Diagnostika podvýživy Anamnéza Z anamnestických údajů je zásadní dotaz na váhový úbytek za určité časové období. Klinicky významnému váhovému úbytku odpovídá úbytek 5% za jeden měsíc nebo 10% za 2-6 měsíců. Druhou důležitou otázkou je množství přijaté stravy v posledních deseti dnech. Příjem potravy pod ¾ porcí signalizuje riziko podvýživy. K doplňujícím otázkám patří rozbor dietních zvyklostí, dotaz na trávící potíže spojené s příjmem potravy, přítomnost či nepřítomnost průjmů, sociální situace, stav chrupu. Antropometrie a fyzikální vyšetření K základním antropometrickým údajům patří hmotnost (kg) a výška (cm). Z praxe je zřejmé, že asi 30 % pacientů přijatých do nemocnice není zváženo a měření výšky se provádí velmi zřídka. Tento chybný přístup přispívá k podceňování přítomnosti podvýživy a jednoduchými organizačními opatřeními jej lze odstranit. Z údajů o váze a výšce určujeme body mass index BMI = hmotnost [kg] / (výška [m] 2, který rozčleňuje pacienty (tabulka č. 41.2) a slouží k objektivnímu hodnocení stavu výživy. Malnutrice je definována u populace ve věku let jako BMI < 18,5, život ohrožující podvýživa při BMI < 12,5. U nemocných starších 70 let je již BMI < 20 považován za hranici podvýživy. BMI kg/m 2 Více jak 40 Obezita III. st Obezita II.st Obezita I.st Nadváha Norma Méně jak 18,5 podvýživa Méně jak 12,5 Život ohrožující podvýživa Tabulka 41.2: Hodnocení BMI Dalším užitečným indexem zjišťovaným na základě rozdílu výšky (cm) 100 je Brocův index, určující takzvanou ideální váhu. V praxi tento jednoduchý výpočet slouží pro určení dávky bílkovin a kalorií v enterální a parenterální výživě (př. pacient s váhou 120 kg a výškou 160 cm má Brocův index 60, to znamená jeho ideální váha je 60 kg. Na tuto váhu potom počítáme dávku energie a živin, jinými slovy neživíme tukovou tkáň těla). Měření obvodu paže (charakterizuje zásobu svaloviny) a kožní řasa nad tricepsem (charakterizuje tukovou tkáň) patří již ke speciálním vyšetřením a pro diagnostiku podvýživy nejsou standartně potřebná. Výjimkou je určení malnutrice u edémových stavů např. u jaterní cirhózy. Hodnoty mezi percentilem svědčí pro malnutrici i při normálním BMI, hodnoty pod 5. percentilem ukazují na těžkou malnutrici tabulka č

490 Nutrice a metabolické bilance muži Obvod paže (cm) Kožní řasa (mm) 15. percentil percentil 25 5 Ženy 15. percentil percentil Tabulka 41.3: Hraniční hodnoty obvodu paže a kožní řasy v hodnocení stavu výživy KAPITOLA 41 Při fyzikálním vyšetření pátráme po základních typech stavby těla astenik, normostenik, obezita, všímáme si přítomnosti otoků dolních končetin, ascitu, padání vlasů, stavu nehtů a kůže, hojení ran, hematomů, strumy. Laboratorní vyšetření K dispozici máme celou řadu laboratorních ukazatelů, ale pro diagnostiku podvýživy stačí některé základní biochemické parametry. Důležité je vyšetření sérových bílkovin (celková bílkovina, albumin, prealbumin) a jednoho z markerů zánětlivé reakce, nejlépe C-reaktivního proteinu. Hodnocení hladiny anabolickým proteinů (albumin, prealbumin, transferin) u jaterního selhávání je problematické. U těchto stavů jejich nízká hladina vypovídá spíše o snížení syntetické funkce jater než přímo o stupni malnutrice. Zhodnocení zánětlivého stavu organismu prostřednictím markeru zánětu (CRP) je zásadní pro diagnostiku stresové podvýživy. Biologický poločas albuminu je 21 dní a jeho hladina koreluje nejen s množstvím tělesných bílkovin, ale je významně ovlivňována zánětlivou reakcí organismu, vedoucí ke zvýšení permeability kapilár a úniku albuminu do třetího prostoru. Proto jeho rychlý pokles v krátkém časovém období je spíše výrazem velikosti stresové reakce (nová ataka sepse, krvácení) a závažnosti chorobného stavu, než pouze ukazatelem malnutrice. I když ta je ve své stresové podobě přítomna vždy. Hodnocení hladiny albuminu s ohledem na dlouhodobý stav výživy provádíme spíše v horizontu tří týdnů, neboť hodnocení výkyvů v kratších intervalech odpovídá tíži choroby, popřípadě intenzitě ztrát albuminu při proteinurii nebo exsudativní enteropatii. Z tohoto pohledu aktuální bílkovinný status organismu lépe charakterizují celkové bílkoviny. Při dlouhodobém sledování jsou hodnoty albuminu < 28 g/l považovány za ukazatel podvýživy. Prealbumin, protein anabolické fáze s biologickým poločasem 2-3 dny, je dobrým krátkodobým ukazatelem, který může být využit k hodnocení adekvátnosti zvolené nutriční intervence. Podobně jako albumin je hodnocení jeho hladiny limitováno na nestresové stavy, neboť ve stresovém metabolismu jeho hodnota klesá přímo úměrně s tíží choroby. Hodnocení hladiny prealbuminu je dále limitováno u pacientů s renálním selháním, kde nalézáme falešně vysoké hodnoty z důvodu snížení glomerulární filtrace. Z dlouhodobých ukazatelů stavu výživy je vhodné stanovení hladiny stopových prvků (Zn) a cholesterolu. Jejich hladiny klesají při dlouhodobém nepříznivém nutričním stavu. Krevní obraz je jednoduchým a levným indikátorem odhalujícím malnutrici, pro kterou je typická normocytární anémie a event. leukopenie. Dva krajní typy podvýživy Kachexie Charakteristickým prvním typem podvýživy je prostá kachexie marasmus (synonyma marantická malnutrice, proteinoenergetická malnutrice, podvýživa typu kost a kůže ). Tento typ podvýživy vzniká při nedostatečném příjmu energetických substrátů (cukry, tuky) a proteinů. Klinicky je tento stav charakterizovaný nízkou váhou, nízkým BMI. Laboratorní nález je chudý. Metabolicky je prosté hladovění charakterizováno využíváním tukových rezerv jako energetického zdroje. Cestou lipolýzy (beta oxidace) dochází k tvorbě aktivního metabolitu acetyl-coa. Acetyl CoA je metabolizován v Krebsově cyklu, jehož produktem jsou redukované koenzymy, které jsou dále zpracovávány v dýchacím řetězci s produkcí energie ve formě ATP. Acetyl-CoA je také využíván pro glukoneogenezi. Po překročení kapacity Krebsova cyklu jeho nadbytek vede k syntéze alternativních zdrojů energie ketolátkám (β-hydroxymáselná kyselina, acetooctová kyselina, aceton). Smyslem této metabolické změny je významné omezení katabolismu bílkovin a zachování jejich funkce. Při rozvinutém prostém hladovění je katabolismus bílkovin omezen na 490

491 Nutrice a metabolické bilance g/den. Jedná se zejména o pomalé odbourávání svalového proteinu. Uvolněné aminokyseliny slouží pro syntézu plazmatických proteinů, jejichž koncentrace zůstává normální. Pokud vezmeme v úvahu průměrný obsah tuku v těle (20-25%), pak tato zásoba u 70 kg jedince může být zdrojem kcal, což představuje energetickou rezervu na dní. Tento předpoklad odpovídá skutečným pozorováním v koncentračních táborech za II. světové války. Kwashiorkor Druhým typem podvýživy je kwashiorkor (název pochází z nářečí afrického kmene Ga nemoc staršího dítěte po narození mladšího dítěte ). V afrických podmínkách má příčiny exogenní viz pozn., v našich podmínkách tento typ podvýživy, který označujeme jako kwashiorkor like podvýživa, nebo proteinová malnutrice, neboli stresová podvýživa, má příčinu endogenní. Etiopatogeneze může být různá. Vzniká při nedostatečném příjmu bílkovin, zvýšených ztrátách (proteinurie, exsudativní enteropatie), zvýšeném rozpadu (katabolismus) nebo snížené syntéze (jaterní cirhoza), tedy při jejich absolutním nedostatku. Klinicky je tento typ malnutrice charakterizována retencí tekutin, otoky, ascitem, nárůstem váhy. V laboratorních vyšetřeních nalézáme výrazný pokles sérových bílkovin a albuminu a u pacientů se zánětlivou reakcí elevaci proteinů akutní fáze (CRP, orosomukoid, ceruloplasmin, α 1 -antitrypsin). V našich podmínkách je KW-like malnutrice nejčastěji spojena se stresovou reakcí (polytrauma, operace, sepse, akutní pankreatitida, popáleniny). Metabolické změny jsou řízeny hormonálním prostředím organismu. Ve stresu dochází k poklesu produkce inzulinu a zvýšení výdeje kontraregulačních hormonů kortizonu, glukagonu, adrenalinu. Výsledkem je blokáda lipolýzy, vystupňování proteolýzy a glukoneogeneze z bílkovin. Bílkoviny tak ztrácejí svoji fylogenetickou funkci (strukturální, signální, transportní, obrannou) a stávají se zdrojem energie pro na glukóze závislé tkáně ( mozek, erytrocyty, lymfocyty, dřeň ledvin) a v důsledku chybění ketolátek i pro ostatní tkáně zejména srdce a játra. Jejich uhlíkatý deaminovaný řetězec je rezervoárem energie, podobně jako uhlíkaté řetězce mastných kyselin triacylglyceridů. Organismus není schopen přežít při ztrátě více jak 50 % zásob v těle. Pokud bychom uvažovali o katabolismu bílkovin ve výši ztrát 30 g N (tj. cca180 g proteinu)/24 hod, pak při průměrném množství 20 kg bílkovinné tkáně v organismu je maximální délka přežití při tomto typu hladovění dní. Stresová podvýživa představuje, ve srovnání s prostým hladověním, závažnější klinický stav a rychlým průběhem a možným fatálním koncem. Čistá proteinová malnutrice vzniká u nefrotického syndromu. U pacientů s jaterní cirhózou, kde klesá syntetická funkce jater je podvýživa kombinovaná. U pacientů s exsudativní enteropatií bývá často přítomna i složka zánětlivá, ale pokles albuminu je výraznější, než by odpovídalo zánětlivé reakci. Základní rozdíly mezi dvěma typy podvýživy ukazuje tabulka č KAPITOLA 41 ukazatel Kachexie KW-like malnutrice Zánět není Přítomen Albumin Normální Snížen Obsah vody a Na v těle sníženo Zvýšeno Tělesná váha snížena Zvýšena REE snížen Zvýšen Tuk snížen Normální Nemoc Mentální anorexie, Crohnova nemoc, chrornická pankr. Polytrauma, sepse, operace pozn: Tabulka 41.4: Rozdíly mezi kachexií a stresovou podvýživou Kwashiorkor (KW) je v klasické "africké" podobě typický pro děti 1-4 roky staré, které matka přestane kojit a proto začnou být základem jejich jídelníčku škrobové potraviny s nedostatečným obsahem kvalitních proteinů (kukuřice, kasawa). V patogenezi rozvoje KW dochází k vysoké sekrece inzulinu a k šetření svalových bílkovin na úkor plazmatických proteinů ( pokles albuminu se vznikem otoků, pokles syntézy lipoproteinů v játrech s rozvojem jaterní steatózy). V našich podmínkách se setkáváme s klinicky obdobným stavem (hypoalbuminemie, retence tekutin s otoky, ascites) u osob s výraznou zánětlivou reakcí na stres (polytrauma, popáleniny, sepse, velká operace, těžká akutní pankreatitida). Pro klinickou podobnost tohoto stavu s klasickým KW bývá tato malnutrice označována jako KW-like malnutrice. Patogeneze stavu je odlišná a je vyvolaná elevací stresových hormonů (adrenalin, glukagon, kortizol) a vznikem inzulinové rezistence (stresový diabetes). Důsledkem je rychlý katabolismus zejména svalových proteinů, zvýšení kapilární permeability s únikem albuminu do intersticia a retence tekutin. Na rozdíl od klasického KW (týdny) vzniká tento stav rychleji v průběhu dní. 491

492 Nutrice a metabolické bilance Kdo vyžaduje nutriční intervenci? V nemocnici se můžeme setkat se dvěma typy pacientů vyžadující nutriční intervenci. Je to jednak primárně malnutriční pacient, u kterého rozpoznáme malnutrici při přijetí (BMI < 18,5, klinicky významný váhový úbytek, albumin < 28 g/l). Druhým případem bývá malnutrice vznikající až za hospitalizace. Typicky jde o nemocné, kteří mají 3-5 dní nulový nebo minimální perorální příjem, nejčastěji z důvodu nemoci a vyšetřovacích procedur (obtížné polykání cévní onemocnění mozku, dysfagie, bolesti břicha, náhlé příhody břišní). KAPITOLA 41 Typy nutričních intervencí co můžeme pacientům nabídnout poučení dietní sestrou fortifikace diety sipping enterální výživa parenterální výživa poučení dietní sestrou: konzultace s nutričním terapeutem často vede k zásadnímu ovlivnění příjmu potravy. Nutriční terapeut volí vhodný typ výživy dle individuálních potřeb (kulinářská úprava, složení,mechanická úprava), hodnotí množství přijaté stravy, vypočítává dávku přijatých živin, doporučuje zařazení enterálních přípravků. Poučuje pacienty o určitém typu diety. Fortifikace diety. Do pokrmů se přidávají práškové koncentráty bílkovin a oligosacharidů. Jsou neutrální chuti, minimálně mění chuťové vlastnosti pokrmů. K dispozici máme Protifar (bílkoviny - kasein) a Fantomalt (maltodextrin). Sipping Nejrozšířenější nutriční intervence. Znamená popíjení ochucených bilancovaných přípravků enterální výživy jako doplněk k přijímané stravě. Obvykle se jedná o příjem kcal/d t.j. 1-2 balení/d. K dispozici je celá řada přípravků které se liší energetickou denzitou, obsahem proteinů, přítomnosti vlákniny a podobně. Příkladem je Nutridrink, Fresubin, Resource, Ensure, Prosure. Enterální výživa Často se jako synonymum užívá pojem sondová výživa. Tato nutriční intervence znamená podávání bilancovaných přípravků enterální výživy sondou do gastrointestinálního traktu při nemožnosti nemocného přijímat potravu. Enterální výživa se podává do trávícího traktu pomocí nasogastrické nebo nasoojejunální sondy. Pro dlouhodobé podávání enterální výživy slouží jako vstupy do GIT výživná jejunostomie nebo gastrostomie. Roztoky enterálních přípravků jsou bilancovány tak, že při dodržení dávky energetické potřeby jsou zároveň dodány denní dávky všech živin. Prakticky to znamená, že při potřebě 2000kcal/d ( 75% všech pacientů na EV) je pacientovi podáno 2000ml enterálního přípravku s energetickou denzitou 1kcal/ml. Enterální výživa je preferovaným přístupem zajištění výživy pacientů neboť je fysiologická, nemá farmakologické nežádoucí účinky a ve srovnání s parenterální výživou je bezpečnější a levnější. Kontraindikacemi jejího použití jsou náhlé příhody břišní, krvácení do GIT, ileus. Parenterální výživa Tato nutriční intervence znamená podávání nutričních substrátů mimo trávící trakt - nitrožilně. Tento způsob zajištění výživy je nefysiologický, provádění je spojenou s celou řadou komplikací (spojených se zajištěním žilního vstupu - pneumotorax, krvácení, embolie, subakutních - žilní trombózy, kanylové sepse, hepatobiliární). V současné době je parenterální výživa podávaná formou all in one (AIO) vaků nejčastěji do centrální žíly (v. jugularis, v subclavia, v. femoralis).ve vacích AIO jsou používány roztoky aminokyselin, glukozy, lipidů, iontů, vitamínů, stopových prvků. Parenterální výživy je indikována k zajištění výživy v případě kontraindikace EV a selhání GIT v zajištění výživy. 492

493 Nutrice a metabolické bilance Monitorace nutričního stavu za hospitalizace Antropometrie Antropometrické sledování závisí na tíži stavu a způsobu nutriční intervence. K základním sledování patří tělesná váha. U pacientů hospitalizovaných na jednotce intenzivní péče s těžkým stavem (sepse, orgánové selhání, oběhová nestabilita) musí být váha sledována denně. Denní výkyvy váhy totiž dobře odrážejí především vodní bilanci a snadno odhalí případnou retenci tekutin. U stabilizovaných nemocných na enterální výživě dostačuje vážení 1x týdně. U pacientů se syndromem krátkého střeva a velkými ztrátami do stomií, píštělí nebo drénů je denní sledování váhy základní podmínkou správné rozvahy o dávce krystaloidů. K měření váhy slouží nášlapné, židlové a postelové váhy. U ležících pacientů na lůžkách následné péče, které často nedisponují postelovými váhami je vhodným antropometrickým markerem hodnotícím vývoj stavu výživy obvod paže. Kalkulací: obvod paže - 5 = BMI můžeme přibližně zjistit BMI a z něho při znalosti výšky pacienta i tělesnou váhu. KAPITOLA 41 Biochemické parametry Při zahájení nutriční intervence musíme mít na paměti možnost rozvoje refeeding syndromu a overfeeding syndromu. Podstatou refeeding syndromu je pokles plazmatických koncentrací draslíku, hořčíku a fosforu. Tyto látky se při anabolických dějích přesouvají intracelulárně, stávají se součástí syntetizovaných makromolekul proteinů. Pokles jejich hladin a snížení dostupnosti ve tkáních má za následek poruchu přenosu nervových a nervosvalových impulsů, relativní nedostatek ATP s vážnými klinickými dopady.u malnutričních pacientů jsou zásoby P, Mg a K sníženy. Při přívodu nutričních substrátů a nedostatečném hrazení uvedených iontů dochází k poklesu jejich plazmatických hladin velice rychle. Klinicky se uvedený syndrom projevuje svalovou slabosti, svalovými křečemi, parézami, dezorientací, poruchou vědomí a může končit úmrtím při srdeční arytmii nebo paréze bránice. Historickým příkladem tohoto syndromu s fatálním průběhem jsou úmrtí vězňů z koncentračních táborů po jejich osvobození. Z výše uvedeného vyplývá nutnost pravidelného sledování koncentrací K, Mg, P a důsledné hrazení jejich zvýšených potřeb. Overfeeding syndrom - přetížení nutričními substráty vzniká při špatném odhadu potřebné dávky živin u malnutričních nemocných. Laboratorně se projevuje vznikem hyperglykemie, elevací triacylglycerolů, nárůstem jaterních testů, rozvojem žloutenky a elevací urey. Z tohoto důvodu je nutné uvedené laboratorní markery opakovaně sledovat při zahájení nutričních intervencí zvláště u podvyživených pacientů. Klinicky se overfeeding projevuje subfebriliemi, rozvojem žloutenky s hepatomegalií, polyuriíí. U pacientů s diabetem, jaterní cirhózou, chronických etyliků a těžce podvyživených (např. mentální anorexie) bývá významný deficit thiaminu. Po zahájení nutriční intervence u těchto nemocných může dojít k rozvoji nekorigovatelné laktátové acidózy v důsledku snížení aktivity pyruvátdekarboxylazy, jejímž kofaktorem je thiamin. Zjištění metabolické acidózy a nárůstu hladiny laktátu při dobré tkáňové oxygenaci je neklamnou známkou tohoto stavu. Pro hodnocení účinnosti zvolené nutriční intervence a nástupu anabolismu slouží sledování hladiny prealbuminu. Nárůst jeho plazmatické koncentrace v průběhu 3-5ti dnů je ukazatelem probíhajícího anabolismu. Podobně sledování odpadů dusíku ukazuje na aktuální metabolickou situaci. Obecně při odpadech dusíku více jak 15g/d hovoříme o katabolismu. Pro praktickou představu jsou níže uvedeny četnosti konkrétních vyšetření u pacientů na JIP. Pozn.: Sledování biochemických ukazatelů, jejich rozsah a častost vyšetření závisí na klinickém stavu pacienta. U stabilizovaných pacientů s podvýživou na doplňkové či plné enterální výživě je indikováno v prvním týdnu vyšetření urea, kreatinin, ionty, P, Mg, celková bílkovina, albumin, CRP, glykémie. Po 3-4 dnech urea, kreatinin, ionty, P, Mg, glykemický profil a následně po 7-10 dnech výše uvedené parametry spolu s albuminem, CRP, celkovou bílkovinou, prealbuminem. Po 3 týdnech je vhodná laboratorní kontrola ve 4-6 týdenních intervalech. Kontroly hladiny vitamínů, stopových prvků, železa, triacylglycerolů, cholesterolu provádíme na začátku léčby a pak po 4-6 týdnech. U pacientů v intenzivní péči, často na parenterální výživě je sledování přísnější. Většinou denně monitorujeme ureu, kreatinin, ionty, P, Mg. Provádíme stanovení glykémie 4x denně, pokud je glykemický profil tři dny uspokojivý stačí jeho provádění 2x týdně. Dvakrát v průběhu týdne sledujeme bilirubin, jaterní testy, TAG, CRP, jedenkrát týdně albumin, celkovou bílkovinu, prealbumin, Zn, Se. Hladiny vitamínů se standartně nestanovují, pouze u komplikovaných stavů na metabolických JIP bývají sledovány vitamin D, vitamin 493

494 Nutrice a metabolické bilance C, vitamin A, acidum folicum, vit B12. Uvedené laboratorní testy slouží k posouzení nutričního stavu a monitoraci zvolené nutriční intervence včetně odhalení možných nežádoucích účinků ( refeeding syndrom, overfeeding, hepatopatie spojená s PV). Další laboratorní vyšetření závisí na konkrétní situaci nemocného - stav ventilace a respirace, krevní plyny, zhodnocení ABR, sledování vývoje zánětlivé reakce (prokalcitonin, CRP) a podobně. Dusíková bilance Pro posouzení metabolické situace organismu je zásadní stanovení dusíkové bilance. Dusíková bilance je definována jako rozdíl mezi příjmem a výdejem dusíku. Může být pozitivní, vyrovnaná nebo negativní. Odpady dusíku jsou stanoveny na základě odpadů močoviny za 24 hodin jako konečného metabolitu katabolismu aminokyselin (bílkovin). Mnohé práce ukázaly, že odpady močoviny do moči představují 80 % celkových ztrát dusíku. Proto při znalosti odpadů močoviny za 24 hodin jsme schopni s relativní přesností zjistit jednoduchým výpočtem odpady dusíku za 24 hodin (odpad močoviny mmol/24 hod * 0,0336 = odpad celkového dusíku/g/24hod). KAPITOLA 41 Obrázek 41.X: Příklad určení odpadu dusíku (k určení dusíkové bilance je třeba znát i příjem dusíku potravou, ev. enterální či parenterální výživou). Ve zdraví bývá dusíková bilance vyrovnaná, to znamená, že příjem dusíku (bílkovin) je v rovnováze s jeho ztrátami. V anabolických situacích (úzdrava z choroby, těhotenství, bodybuilding, trénink) bývá bilance dusíku pozitivní - organismus ve zvýšené míře vytváří bílkoviny (doplňuje ztrátu, vytváří nové tkáně). V chorobě pod vlivem akutní (např. sepse) nebo chronické (např. nádor, srdeční selhání) zánětlivé reakce organismu dochází ke stimulaci proteolýzy, potlačení proteosyntézy, zvýraznění glukoneogeneze a ovlivnění lipolýzy. Výsledkem bývá negativní dusíková bilance s převýšením ztrát bílkovin nad jejich příjmem. Je zajímavé, že i arteficiálním dodáváním čistých aminokyselin formou parenterální výživy (PV) nelze katabolismu endogenních proteinů zabránit, pouze omezit. Vlastní bílkoviny jsou využívány preferenčně (sval, albumin, imunoglobuliny). Toto pozorování vedlo k opuštění snah o dosažení vyrovnané dusíkové bilance v těžkém katabolismu. Zvýšená dodávka substrátů v PV významně zatěžuje intermediární metabolismus s nežádoucím účinky (jaterní selhání - ikterus, cholestáza, hyperglykemie, urémie, hypertriglyceridemie) zvyšující mortalitu. Proto zjištění katabolismu bílkovin (ztráty dusíku do moči více jak 15 g/24 hod = 90 g AK = 450 g svalu) má vést klinika k pátrání po jeho příčině a ke snaze o jeho odstranění ( léčba sepse, řešení abscesu, léčba autoimunitního onemocnění). Druhým základním postupem je zvolení nutriční intervence (EV nebo PV) se stresovým poměrem živin a s 494