Sledování hodnot ph u trombocytů z buffy-coatu

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd Sledování hodnot ph u trombocytů z buffy-coatu (bakalářská práce) Hradec Králové, 2010 Eva Csapková

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové, dne Eva Csapková 2

3 Děkuji tímto prim. MUDr. Řeháčkovi za vedení mé bakalářské práce, Mgr. Kofránkové za podporu při psaní bakalářské práce a kolektivu sester na úseku výroby TO FNKV. 3

4 Abstrakt Teoretická část bakalářské práce je zaměřena na seznámení s druhy trombocytárních přípravků. V hrubých rysech nastiňuje odběr přípravků a požadavky kontroly kvality. Praktická část, jejímž cílem je zhodnotit kvalitu přípravků trombocytů z buffy-coatu a zvážit důležitost výběru dárce pro jejich výrobu, obsahuje výsledky měření a jejich následné vyhodnocení. 4

5 Abstrakt Theoretical part of this bachelor thesis is specialized on introduction with sorts of thrombocytes preparations. This thesis is drawing out in a rough line taking off a preperations and requirements of quality control. Practical part, which goal is evaluation of quality of preparations of thrombocytes from buffy-coat and consider the significance of a selection the donator for their production, contains results of measurement and their consequential interpretation. 5

6 Obsah 1 Úvod zadání práce Teoretická část Trombocytární přípravky Použití trombocytárních přípravků Druhy trombocytárních přípravků Druhy trombocytárních přípravků v TO FNKV Způsoby získávání trombocytárních přípravků Kontrola kvality Kritéria kvality Kontroly kvality Skladování trombocytárních přípravků Experimentální část Cíl práce Popis práce Použitý materiál Biologický materiál Roztoky a činidla Pomůcky Přístroje Pracovní postup Vlastní výpočty Přepočet trombocytů na transfuzní jednotku Výpočet leukocytů s následným přepočtem na transfuzní jednotku Přehled výsledků Přehled výsledků exspirovaných TB Přehled výsledků čerstvě vyrobených TB Diskuze Závěr Seznam obrázků:

7 1 Úvod zadání práce Transfuze krve je nezbytnou součástí moderní péče o zdraví. Při správném používání může zachránit život a zlepšit zdravotní stav. Transfuze je proces, během kterého je do krevního oběhu příjemce vpravena krev, nebo její složky, od dárce. Léčení krví má dlouhou a zajímavou historii. O transfuzi krve v dnešním slova smyslu se mohlo uvažovat v době, kdy Angličan William Harvey v roce 1616 objevil krevní oběh. První ověřenou, a technicky úspěšnou, transfuzi u člověka provedl v roce 1667 Jean Babtiste Denis. K transfuzi použil krve jehněte. Jeho další pokusy s transfuzemi zvířecí krve člověku však nebyly úspěšné. Neúspěchy s transfuzemi zvířecí krve zdiskreditovaly tuto metodu, takže na sklonku sedmdesátých let 17. století byly v Anglii, Francii a Itálii pokusy s transfuzemi zakázány. Do začátku 19. století opadl zájem o otázky transfuze. Až v roce 1816 velmi odpovědně přistoupil ke studiu transfuze krve profesor fyziologie a porodnictví James Blundell. Svoji první transfuzi provedl v roce V roce 1824 vydal knihu o transfuzi krve, v níž zdůraznil správnou zásadu, že člověku lze převádět pouze lidskou krev. Při transfuzi doporučoval velkou opatrnost. Při jakýchkoliv nepříznivých příznacích u příjemce radil transfuzi přerušit, popřípadě použít krev jiného dárce. Hodnota krevního převodu byla posuzována velmi zdrženlivě, protože nebezpečí tohoto zákroku bylo značné. Hlavní příčinou neúspěchu transfuzí byla neznalost krevních skupin. K jejich objevu došlo až v prvních letech 20. století. Teprve po využití tohoto objevu se transfuze mohly stát přiměřeně bezpečným lékařským zákrokem. Nedůvěra k transfuzi byla však v době objevu krevních skupin tak hluboce zakořeněná, že nesmírný význam tohoto objevu si lékaři dost rychle neuvědomili. Trvalo skoro dvacet let, než poznatky o krevních skupinách vstoupily ve všeobecnou známost a než byly zajištěny předpoklady pro běžné vyšetřování krevních skupin a tím i pro široké využití transfuzí. V roce 1901 rozdělil Karl Landsteiner lidské krve podle aglutinačních vlastností do tří skupin. K tomuto závěru dospěl na základě vyšetření krví menší skupiny osob tím způsobem, že mísil vzájemně krvinky a séra všech vyšetřovaných. Je nutno poznamenat, že Landsteiner neobjevil čtvrtou skupinu pouhou náhodou, žádný z jeho vyšetřovaných totiž tuto skupinu neměl. První v českých zemích, kdo správně roztřídil podle aglutinačních vlastností lidskou krev do 4 skupin, byl Čech Jan Janský v roce 7

8 1907. Krevní skupiny označil I, II, III, IV. Podobný objev jako Janský učinil v roce 1910 W. L. Moss v Americe. Také tento badatel označil krevní skupiny římskými číslicemi, ale v obráceném pořadí. Toto různé označování krevních skupin byl pak po řadu dalších let příčinou mnoha nesrovnalostí. Proto v roce 1921 výbor amerických vědeckých společností doporučil na základě priority objevu klasifikaci Janského. Až ve 30. letech byly krevní skupiny všeobecně označovány velkými písmeny A, B, AB a 0 podle Landsteinera. Po objevu skupinového systému lidské krve AB0 byly postupně objevovány další antigenní vlastnosti červených krvinek. V roce 1941 byl objeven další skupinový systém erytrocytů. Byl nazván Rh podle opice Macacus rhesus, jejíž krvinky byly použity v pokusech, které vedly k objevu této vlastnosti. Vážnou překážku transfuzí, srážení krve, vyřešili v roce 1835 německý fyziolog T. L. W. Bischoff a ruský chirurg V. V. Sutugin tím, že základní surovinu v procesu krevního srážení, bílkovinu fibrinogen odstranili z krve vyšleháním kovovou metlou. Takto získaná nesrážlivá krev mohla být bez úhony přechovávána v chladném prostředí i delší dobu. V první světové válce, při velkém počtu raněných, vyvstala naléhavá potřeba nepřímé transfuze a tedy i konzervování krve. S tímto problémem si poradila trojice badatelů, dva Američané a jeden Belgičan, když v roce 1914 objevili protisrážlivý účinek citronanu sodného. Krev stabilizovanou citronanem bylo možné skladovat 7-9 dní. Poprvé byla podána v roce Hned v následujícím roce byl tento objev zdokonalen použitím citronanu sodného a glukózy. Krvinky glukózu metabolizují, získávají z ní energii, čímž se exspirace prodlužuje. Smutnou skutečností je, že po válce panovala jistá nedůvěra ke staré, to znamená konzervované krvi. Prakticky došlo k návratu k přímým převodům krve. Větší pozornosti se transfuze konzervované krve začaly těšit od roku Průkopníky na tomto poli byli sovětští lékaři. Již v roce 1926 byl v Moskvě založen Ústřední ústav krevní transfuze. První pracoviště, kde se prováděly transfuze, se nazývalo hemotéka. S rozvojem vědeckých poznatků se snižovala rizika pro dárce a příjemce krve. Byly vypracovány první testy k zajištění kompatibility. Ke zvýšení bezpečnosti krevní transfuze nemalou měrou přispělo i zavedení tzv. biologické zkoušky, kdy se pacientovi 8

9 převedlo malé množství krve. Teprve poté, co se neobjevily žádné nežádoucí účinky, se smělo v transfuzi pokračovat. Opět to byla válka, která prověřila akceschopnost transfuziologie i možnost konzervovat krev. V průběhu občanské války ve Španělsku v letech bylo provedeno 20 tisíc transfuzí konzervované krve. Za druhé světové války zvyšující se kvalitativní a kvantitativní požadavky na konzervovanou krev vyřešili američtí vědci. Do té doby používané skleněné lahve nebyly pro válku ideální a byly proto nahrazeny uzavřeným systémem plastových odběrových vaků, které se prakticky používají dodnes. Významným pokrokem bylo zdokonalení konzervace krve. Roztok citronanu sodného a glukózy byl obohacen kyselinou citronovou, která prodloužila skladovací dobu konzervované krve na 3-4 týdny. Přidáním adeninu se exspirace přípravku prodloužila na 35 dnů. Separace plazmy a následná lyofilizace mnohonásobně prodloužila její použitelnost. V době druhé světové války se také podařilo rozdělit plazmu na její jednotlivé složky v čisté a koncentrované formě. Frakcionace plazmy je dodnes důležitým nástrojem při výrobě krevních derivátů. Dnešní konzervační roztoky obsahují citrát sodný, kyselinu citronovou, dextrózu a fosfát. Fosfát zvyšuje ph a omezuje tak hemolýzu erytrocytů. Pro konzervační roztoky je důležité, že jejich složení musí nejen zabránit srážení krve, ale také v běžných léčebných dávkách nesmí být pro lidský organismus toxické. Po extrakci plazmy se ke krvinkám přidávají resuspenzní roztoky. Ty obsahují dextrózu, chlorid sodný, manitol a adenin. Tyto látky dodávají erytrocytům energii, prodlužují jejich životnost, takže resuspendované erytrocyty můžeme uchovávat při teplotě 2 6 C maximálně 42 dnů. Plazma se šokově mrazí při teplotě nižší než 30 C. Exspirace se uvádí 3 roky. Pro transfuzi ji lze použít po 6 -ti měsíční karanténě. 9

10 2 Teoretická část 10

11 2.1 Trombocytární přípravky Použití trombocytárních přípravků Trombocytární přípravky slouží ke korekci trombocytopenie a k léčbě krvácivých stavů. Cílem substituce je předejít nebo zastavit krvácení způsobenému trombocytopenií nebo trombocytopatií. U dospělých se nejčastěji používají z aferézy deleukotizované TAD. Obsah trombocytů > 2x10 11 /TU je adekvátní pro dospělého člověka. Děti a novorozenci potřebují malé objemy tekutin, může u nich docházet k oběhovému přetížení. Dávkování u dětí se provádí podle jejich hmotnosti. U dětí do 15 kg nejlépe poslouží z buffy-coatu (TB). Obsah trombocytů v jednom vaku je 0,5x10 11 /TU. Jedna terapeutická jednotka pro dospělého jedince obsahuje 4-6 vaků trombocytů z buffy-coatu. Každý z těchto vaků je získán od jiného dárce. Příjemce je tedy 4-6x více imunizován, než u trombocytárních přípravků z aferézy. Ten je totiž získáván jen z jednoho dárce Druhy trombocytárních přípravků Podle odběru a způsobu zpracování rozlišujeme tyto druhy trombocytárních přípravků: Trombocyty z aferézy, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná aferézou. Trombocyty z aferézy, deleukotizované, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná aferézou, ze které jsou odstraněny. Trombocyty ze standardního odběru, směsné, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jednotek z plné krve a spojením trombocytů získaných z těchto jednotek během oddělení nebo po něm. Trombocyty ze standardního odběru, směsné, deleukotizované, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jednotek plné krve a spojením trombocytů získaných z těchto jednotek během oddělení nebo po oddělení, ze které jsou odstraněny. 11

12 Trombocyty z jednotlivého standardního odběru a) Trombocyty z plné krve b) Trombocyty z buffy-coatu, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jedné jednotky plné krve. Trombocyty z jednotlivého standardního odběru, deleukotizované a) Trombocyty z plné krve, deleukotizované b) Trombocyty z buffy-coatu deleukotizované, kterými se rozumí koncentrovaná suspenze trombocytů získaná zpracováním jedné jednotky plné krve, ze které jsou odstraněny. Obrázek 1: Trombocyty z BUFFY-COATU a z Aferézy deleukotizované Druhy trombocytárních přípravků v TO FNKV V TO FNKV na oddělení výroby vyrábíme: Trombocyty z buffy-coatu TB, z jednoho odběru Trombocyty z aferézy TA Trombocyty z aferézy deleukotizované TAD 12

13 2.1.4 Způsoby získávání trombocytárních přípravků Trombocyty z buffy-coatu Trombocyty z buffy-coatu jsou získávány zpracováním odběru plné krve. Plná krev se pro transfuzi používá jen výjimečně, přednostně se jejím zpracováním vyrábějí erytrocytární přípravky, plazma a z buffy-coatu. K odběru se používá kompletně uzavřený systém. V TO FNKV používáme čtyřvakový systém. V jednom ze čtyř vaků je protisrážlivý roztok, ve druhém je resuspenční roztok, další dva vaky jsou prázdné. Plná krev se odebere do základního vaku, ve kterém je umístěn protisrážlivý roztok. Celá souprava se vloží do speciální odstředivky a při vysokých otáčkách asi 4000 za minutu se po dobu minut odstřeďuje. Odstředěná souprava vaků se vloží do tzv. krevního lisu. Stlačením se jednotlivé krevní součásti přemístí do dalších krevních vaků. Nejprve se do třetího z vaků, který je prázdný, vytlačí plazma. Po té se rozmezí mezi plazmou a krví, tzv. buffy-coat, vytlačí do čtvrtého vaku. K erytrocytům, které zůstaly v základním vaku, se přidá resuspenční roztok z druhého vaku, čímž se uvolnil pro vyrobené z buffy-coatu. Tento vak, v němž byl původně resuspenční roztok, slouží pro uchovávání trombocytů z buffy-coatu, pro něž má speciální úpravu. Je polopropustný pro kyslík. 13

14 Obrázek 2: Krevní lis Trombocyty z aferézy Trombocyty z aferézy jsou získány trombocytaferézou. Získávají se pomocí speciálního přístroje, díky kterému je zajištěn extrakorporální oběh dárce. Krevní separátor umožňuje odběr složek krve od dárců, terapeutickou aferézu nebo terapeutickou výměnu plazmy. Přístroj pracuje na principu diferenciální centrifugace. Odebírány jsou pouze a ostatní komponenty krve jsou vráceny zpět do krevního oběhu dárce. Tímto odběrem můžeme od jednoho dárce získat x10 9 trombocytů. Destičky jsou suspendovány ve ml plazmy a v náhradním roztoku pro. Podle počtu odseparovaných trombocytů můžeme získat až 3 transfuzní jednotky trombocytárního přípravku. Zařízení se ovládá prostřednictvím barevného monitoru 14

15 o vysokém rozlišení s ovládacími tlačítky po obou stranách. Monitor zobrazuje pouze tlačítka a pomocná hlášení pro uživatele, která jsou v příslušné fázi programu potřebná. Vždy jsou zobrazena aktuální data o separaci. K separační proceduře je nutný jednorázový set, jehož základními součástmi jsou separační komora, sety pump, kapkové komůrky a vaky. V závislosti na druhu procedury musí být použity i různé sety. Separace veškeré krve probíhá v separační komoře pomocí odstředivé síly. Detektor úniku krve uvnitř skříňky odstředivky zabraňuje nebezpečné ztrátě krve u dárce. Krev a její jednotlivé složky transportují čtyři peristaltické pumpy. Správné průtokové dráhy v setu otevírají a zavírají automatické výstřední klapky. Celý proces separace je nepřetržitě monitorován několika čidly, takže je vždy zajištěna bezpečnost dárce. V případě kritického stavu se na monitoru zobrazí varování nebo výstraha a zazní zvukový signál. Zařízení současně uzavře návratovou klapku a tím oddělí oběh dárce od oběhu přístroje. Separace se zastaví. V případě výpadku proudu je zajištěn nouzový provoz přístroje po dobu minimálně 10 minut na integrovanou baterii. Během této doby může být krev vrácena dárci. Všechny separační procedury musí být prováděny pod dohledem lékaře. Během celého separačního procesu musí být zajištěna řádná obsluha, monitorování aferézového systému a dohled nad dárcem. O přípravě, bezpečnostní kontrole a jednotlivých krocích separační procedury musí být vyhotoven záznam. Součástí odběrových setů jsou filtry, které odstraňují bílé krvinky z přípravku a snižují riziko nežádoucích reakcí příjemce. Odběr trvá přibližně 90 minut a jeho výhodou je vysoký obsah buněk. Také riziko přenosu infekce je sníženo na minimum díky jednorázovému setu. 2.2 Kontrola kvality Trombocytární přípravky jsou vyráběny podle zásad správné výrobní praxe s maximálním důrazem na jejich jakost a bezpečnost pro příjemce. Jejich výroba se řídí novelou zákona o léčivech č. 378/2007 Sb. a vyhláškou o lidské krvi č. 143/2008 Sb. Na každý trombocytární přípravek jsou kladeny jiná kritéria kvality a kontroly kvality. 15

16 2.2.1 Kritéria kvality Trombocyty z buffy-coatu, z jednoho odběru objem: 50 ml sterilní počet trombocytů: 0,5x10 11 /TU u 75% kontrolovaných přípravků počet leukocytů: <0,05x10 9 /TU u 75% kontrolovaných přípravků vizuální kontrola u každého přípravku na viabilnost trombocytů swirling fenomén a nesmí být přítomné růžové zabarvení přípravku ph: 6,5 až 7,4, kontroluje se 6. den výsledky vyšetření HIV Ag-Ab, HCV Ag-Ab, HBsAg, Syphilis total Ab: negativní vyšetření krevní skupiny v systémech AB0, Rh a Kell vyšetřené nepravidelné protilátky proti erytrocytům: negativní neporušenost obalu bez viditelné hemolýzy a agregátů Trombocyty z aferézy objem: > 40 ml na 60x10 9 trombocytů sterilní počet trombocytů: > 2x10 11 /TU u minimálně 75% kontrolovaných přípravků počet leukocytů: < 1,0x10 9 /TU u 75% kontrolovaných přípravků kontaminace erytrocyty: vizuální kontrola, přípravek nesmí mít růžové nebo červené zabarvení, bez agregátů ph: 6,5 až 7,4 neporušenost obalu vyšetření krevní skupiny v systémech AB0, Rh a Kell vyšetřené nepravidelné protilátky proti erytrocytům: negativní výsledky vyšetření HIV Ag-Ab, HCV Ag-Ab, HBsAg, Syphilis total Ab: negativní Trombocyty z aferézy deleukotizované objem: > 40 ml na 60x10 9 trombocytů sterilní 16

17 počet trombocytů: > 2x10 11 /TU minimálně u 75% kontrolovaných přípravků počet leukocytů: < 1,0x10 6 /TU u 75% kontrolovaných přípravků kontaminace erytrocyty: vizuální kontrola, přípravek nesmí mít růžové nebo červené zabarvení, bez agregátů ph: 6,5 až 7,4 neporušenost obalu vyšetření krevní skupiny v systémech AB0, Rh a Kell vyšetřené nepravidelné protilátky proti erytrocytům: negativní výsledky vyšetření HIV Ag-Ab, HCV Ag-Ab, HBsAg, Syphilis total Ab: negativní Kontroly kvality Trombocyty z buffy-coatu, z jednoho odběru objem u každého přípravku sterilita přípravků u každého vizuální kontrola u každého přípravku počet trombocytů a leukocytů u 1% přípravků neporušenost obalu, kompletnost a dobrá čitelnost finálního štítku u každého přípravku ph 6. den, minimálně 4 přípravky za měsíc Trombocyty z aferézy objem u každého přípravku počet trombocytů u každého přípravku sterilita u 3% přípravků vizuální kontrola u každého přípravku neporušenost obalu, kompletnost a dobrá čitelnost finálního štítku u každého přípravku Trombocyty z aferézy deleukotizované objem u každého přípravku počet trombocytů u každého přípravku sterilita u 3% přípravků 17

18 vizuální kontrola u každého přípravku neporušenost obalu, kompletnost a dobrá čitelnost finálního štítku u každého přípravku Skladování trombocytárních přípravků Destičkové přípravky jsou mimořádně citlivé na skladovací podmínky. Metabolismus destiček, životnost a jejich funkce je závislá na přiměřené dostupnosti pro kyslík, teplotě a ph destičkových přípravků. Uchováváme-li při 22 C trombocytární přípravek, 100x10 9 destiček v přípravku spotřebuje zhruba 10 µmol kyslíku za hodinu. Kyslík je ovlivněn také kontaminujícími. Jejich malá příměs v přípravku však neovlivňuje celkovou potřebu. Potřebný kyslík pro destičky může být ovlivněn různými způsoby třepání, měnícím se ph a teplotou. 18

19 Obrázek 3: Třepačka Pro uchovávání destiček je doporučované uzavřené zařízení s kontrolou teploty. Teplota v zařízení musí být trvale udržována v rozmezí 20 C až 24 C. Destičky by měly být uloženy na třepačce, která umožní dostatečné míchání vaků, stejně jako výměnu plynů skrz vak. Při třepání však nesmí docházet k pěnění přípravků. Vaky ukládáme do třepačky každý zvlášť. Není vhodné, aby se navzájem překrývaly, nebo ležely na sobě. Třepačka by měla být opatřena termografem a alarmem, který nás informuje o vychýlení teploty od stanoveného rozmezí. Rychlost třepačky je pravidelně testována podle doporučení výrobce a její selhání by mělo být zaznamenáno a sledováno. Použitím speciálních vaků propustných pro plyny, vhodnou teplotou a dostatečným třepáním v průběhu skladování jsou zajištěny všechny potřebné podmínky pro správné uchovávání přípravků. 19

20 3 Experimentální část 20

21 3.1 Cíl práce Hlavním cílem praktické části je zhodnotit kvalitu trombocytárních přípravků trombocytů z buffy-coatu. Dalším cílem je posoudit, jak výběr dárce pro výrobu těchto přípravků může ovlivnit jeho kvalitu. Výběr dárců pro tuto skupinu transfuzních přípravků je možný právě pro zmenšující se potřebu těchto přípravků a pro velký počet dárců, ze kterých se dá vybírat. Z možných kriterií jakosti byl hlavní důraz kladen na hodnoty ph. Mezi další kritéria k posouzení jsem použila objem přípravku, hodnoty trombocytů a leukocytů. Všichni dárci byli vyšetřeni na virologické markery, krevní skupinu, systém Rh a Kell. 3.2 Popis práce První skupinu hodnocených přípravků tvoří přípravky vyrobené pro účely klinického použití. Všechny získané výsledky od této skupiny byly získány až po uplynutí exspirace, tj. 6. den. Druhou skupinu přípravků tvoří čerstvě vyrobené z buffy-coatu. Tato skupina přípravků byla vyrobena pouze pro experimentální účely a v žádném případě nesloužila pro klinické použití. Dárci v této skupině byli vybíráni náhodně. Výsledky této skupiny byly získány hned druhý den po výrobě těchto přípravků. 3.3 Použitý materiál Biologický materiál 150 trombocytárních přípravků Trombocyty z buffy-coatu určených pro klinické použití na konci doby použitelnosti 150 trombocytárních přípravků z buffy-coatu vyrobených pro experimentální účely Roztoky a činidla Kalibrátor pro ph metr Hamilton Duracal Buffer 7,00 ± 0,01 (Hamilton Bonaduz AG, Switzerland) Destilovaná voda (TO FNKV) Fyziologický roztok (TO FNKV) Türkův roztok (lékárna FNKV) 21

22 3.3.3 Pomůcky Skleněné kádinky, plastové zkumavky s uzávěrem, plastové zkumavky bez uzávěru, Nageottova komůrka, krycí sklíčka, Pasteurova pipeta Lihový fix, nůžky, peány, stojánky na zkumavky, automatické pipety a špičky Přístroje ph metr ph ETMeter (Labo-ms spol. s. r. o) automatický hematologický analyzátor Celltac Auto mek-8118k (NIHON, KOHDEN) valivá třepačka mikroskop Pracovní postup Před celým zpracováním a měřením produktů je nutné si uvědomit, že žádný trombocytární přípravek nesmí dlouho ležet mimo třepačku Měření ph Před každým měřením ph musíme provést kalibraci ph metru. Pro kalibraci nám slouží pufr uchovávaný v ledničce kolem teploty 4 C. Před jeho použitím musí dojít k jeho vytemperování na teplotu, při které chceme měřit ph. ph měříme v laboratoři, kde je stálá teplota 22 C. Kalibrátor si tedy vyndáme z lednice a necháme v laboratoři přibližně jednu hodinu. V této době si můžeme připravit všechny potřebné pomůcky jednak pro měření ph a jednak pro měření počtu trombocytů hematologickým analyzátorem. Všechno musí být pečlivě označené. Máme-li vytemperovaný kalibrační roztok, připojíme ph metr ke zdroji, zapneme a provedeme kalibraci. Tímto je ph metr připraven k měření. S ohledem na skladování trombocytů není vhodné vyndat ze třepačky všechny přípravky najednou. Vzhledem k množství přípravků je vhodné si měření rozdělit na několik částí asi tak po pěti přípravcích. U každého přípravku nejprve otevřeme vak, přestřihnutím hadičky a do příslušné zkumavky odebereme vzorek na hematologické vyšetření. Při manipulaci se zkumavkou je dobré zavřít otevřený vak peánem. Zabráníme tak vylití přípravku. Zkumavky se vzorky ukládáme do stojánku. Po uložení zkumavky se vzorkem zbylý 22

23 obsah přípravku převedeme do kádinky a změříme jeho ph. Hodnotu si pečlivě zaznamenáme do připravené tabulky. Při první manipulaci s vakem rozhodně nesmíme zapomenut zaznamenat i objem přípravku. Zhruba po pěti přípravcích znovu provedeme kalibraci, tím kontrolujeme, že naše měření je správné. Po skončení měření, zkumavky umístíme na valivou třepačku po dobu 30 minut až jedné hodiny. Dosáhneme tím řádného promíchání vzorků. Prázdné vaky a případné zbytky trombocytárních přípravků likvidujeme podle odpadního řádu TO FNKV Měření na hematologickém analyzátoru a počítání leukocytů v Nageottově komůrce Po dostatečném promíchání, vzorky po jednom měříme na hematologickém analyzátoru. Neumisťujeme všechny do zásobníku pro uzavřený systém, neboť bychom poslední vzorky neměli dostatečně promíchané. Hodnoty trombocytů zapisujeme do tabulky a vzorky vracíme k dalšímu míchání zpět na třepačku. Po doměření si připravíme další sadu zkumavek a řádně označíme. V těchto zkumavkách ředíme vzorky Türkovým roztokem a zároveň zde dochází k rozpadu nežádoucích elementů a k obarvení jader leukocytů. Do zkumavky pipetujeme automatickou pipetou 380 µl Türckova roztoku a 20 µl vzorku. Všechny zkumavky v ruce několikrát protřepeme a necháme stát nejméně 10 minut při pokojové teplotě. Mezitím si připravíme mikroskop a Nageottovu komůrku. Na komůrku umístíme krycí sklíčko a před plněním komůrky Pasteurovou pipetou každý vzorek znovu promícháme. Leukocyty počítáme v celém jejím objemu, tj. 100 µl. Komůrka obsahuje v horní části 20 řad a dalších 20 řad v dolní části. 23

24 3.4 Vlastní výpočty Pro všechny následující výpočty je důležité převést všechny objemy přípravků z mililitrů na litry Přepočet trombocytů na transfuzní jednotku Přepočet trombocytů na transfuzní jednotku probíhá následovně: objem přípravku v litrech vynásobíme počtem trombocytů získaných z hematologického analyzátoru. Výsledek vyjádříme jako hodnotu v /TU. Např.: objem přípravku je 50 ml = 0,05 l Hodnota trombocytů získaná z analyzátoru je 845 x 10 9 /l 0,05 x 845 = 42,25 x 10 9 /TU = 0,4225 x /TU Výpočet leukocytů s následným přepočtem na transfuzní jednotku Nejprve je nutné zjistit počet leukocytů v jednom litru. To probíhá následovně: podíl počtu buněk z Nageottovy komůrky a objemu komůrky vynásobíme použitým ředěním. ( ) Např.: 800 leukocytů v komůrce Objem komůrky je 100 µ Ředění je 20x (800/100) x 20 = 160 x 10 6 /l Nyní, když víme, kolik leukocytů je v jednom litru, není problém spočítat, kolik leukocytů připadá na transfuzní jednotku. Výsledek vyjadřujeme jako hodnotu v 10 9 /TU. Např.: Počet leukocytů 160 x 10 6 /l Objem přípravku 0,05 l 160 x 0,05 = 8 x 10 6 /TU = 0,008 x 10 9 /TU 24

25 4 Přehled výsledků 25

26 4.1 Přehled výsledků exspirovaných TB číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 1 0,06 7, , ,4 0, ,052 7, , , ,065 7, , ,4 0, ,056 7, , , ,054 7, , ,8 0, ,051 7, , , ,059 7, , ,4 0, ,057 7, , , ,054 7, , ,6 0, ,052 7, , , ,051 6, , ,2 0, ,05 7, , , ,051 7, , ,6 0, ,06 7, , ,6 0, ,061 7, , ,4 0, ,063 7, , ,2 0, ,06 7, , ,2 0, ,07 7, , , ,05 7, , ,4 0, ,061 7, , ,2 0, ,075 7, , ,4 0, ,056 7, , ,8 0, ,063 7, , ,4 0, ,073 7, , ,2 0, ,064 7, , ,8 0, ,051 7, , , ,059 7, , ,4 0, ,068 7, , ,8 0, ,059 7, , ,4 0, ,058 7, , ,4 0, ,051 6, , ,8 0, ,05 7, , ,8 0, ,053 7, , ,4 0, ,059 7, , ,4 0, ,089 7, , ,6 0, ,052 7, , , ,053 7, , ,4 0, ,053 7, , ,4 0, ,064 7, , , ,065 7, , ,4 0,

27 číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 41 0,054 7, , ,6 0, ,053 6, , ,2 0, ,059 7, , , ,051 7, , ,8 0, ,069 6, , ,6 0, ,059 7, , ,4 0, ,053 7, , ,6 0, ,06 7, , ,2 0, ,08 7, , ,6 0, ,062 7, , ,2 0, ,058 7, , ,2 0, ,07 7, , ,6 0, ,064 6, , , ,056 7, , ,6 0, ,063 7, , , ,051 6, , ,2 0, ,065 7, , ,4 0, ,05 7, , ,4 0, ,059 6, , , ,063 7, , , ,055 7, , ,4 0, ,051 7, , ,2 0, ,05 7, , ,6 0, ,06 7, , ,6 0, ,064 7, , , ,055 7, , ,8 0, ,051 7, , ,6 0, ,054 7, , ,4 0, ,054 7, , ,2 0, ,055 7, , ,6 0, ,058 7, , ,6 0, ,05 7, , , ,054 7, , ,2 0, ,078 6, , ,2 0, ,051 7, , ,4 0, ,05 7, , ,4 0, ,061 6, , ,2 0, ,073 7, , ,8 0, ,058 7, , ,2 0, ,055 7, , ,4 0,

28 číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 81 0,05 7, , ,2 0, ,067 7, , , ,052 7, , , ,06 7, , ,8 0, ,051 7, , ,8 0, ,075 7, , ,2 0, ,064 7, , ,2 0, ,05 7, , ,8 0, ,055 7, , ,2 0, ,055 7, , ,6 0, ,07 7, , ,8 0, ,05 7, , ,6 0, ,056 7, , ,2 0, ,054 7, , ,4 0, ,054 7, , ,2 0, ,054 7, , ,2 0, ,061 7, , ,6 0, ,054 7, , ,2 0, ,056 7, , ,4 0, ,063 7, , ,8 0, ,058 7, , ,2 0, ,067 7, , ,4 0, ,068 7, , , ,069 7, , ,6 0, ,063 7, , ,6 0, ,051 6, , ,2 0, ,082 6, , ,2 0, ,067 7, , ,8 0, ,055 6, , ,2 0, ,068 7, , ,4 0, ,068 6, , , ,069 7, , , ,053 6, , , ,068 7, , ,6 0, ,064 7, , ,8 0, ,051 7, , ,6 0, ,053 7, , ,2 0, ,052 6, , ,2 0, ,059 7, , ,4 0, ,06 7, , ,8 0,

29 číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 6 /l x10 9 /TU 121 0,05 7, , ,4 0, ,065 7, , ,2 0, ,055 7, , ,8 0, ,058 7, , , ,056 7, , ,2 0, ,055 6, , , ,054 6, , , ,055 7, , ,4 0, ,056 7, , , ,063 7, , , ,075 7, , ,2 0, ,05 7, , ,6 0, ,064 7, , ,4 0, ,055 7, , ,8 0, ,051 7, , , ,054 6, , ,6 0, ,05 7, , ,2 0, ,07 7, , , ,066 6, , ,6 0, ,065 7, , , ,054 7, , ,4 0, ,05 7, , ,6 0, ,052 7, , ,2 0, ,05 7, , ,8 0, ,054 7, , ,2 0, ,063 7, , ,2 0, ,053 7, , ,8 0, ,053 7, , ,2 0, ,05 6, , , ,05 7, , ,2 0,

30 Ve skupině exspirovaných TB jsem provedla vyšetření u 150 přípravků. Posoudíme-li přípravky z celkového hlediska všech vybraných kritérií, požadovaných kontrolou kvality, ze 150 jich vyhovuje 116. Počet vyhovujících přípravků z hlediska ph je 132 a z hlediska počtu trombocytů 131. Požadovaný objem přípravku a počet leukocytů je vyhovující u všech vyšetřovaných přípravků. 155 Počet vyhovujících exspirovaných přípravků z hlediska kontroly kvality dle Vyhl. 143/2008 Sb. - O lidské krvi P o č e t p ř í p r a v k ů ph Trombo Leuko Objem 30

31 4.2 Přehled výsledků čerstvě vyrobených TB číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 1 0,051 7, , ,6 0, ,051 7, , ,6 0, ,064 7, , , ,051 7, , ,4 0, ,059 6, , ,2 0, ,051 7, , ,4 0, ,06 7, , ,8 0, ,058 7, , ,8 0, ,062 7, , ,6 0, ,061 6, , ,4 0, ,051 6, , ,2 0, ,051 6, , ,2 0, ,052 6, , ,2 0, ,067 6, , ,2 0, ,061 6, , ,2 0, ,05 6, , ,8 0, ,051 6, , , ,059 7, , ,6 0, ,05 7, , , ,05 7, , ,2 0, ,059 7, , ,6 0, ,051 7, , ,2 0, ,05 7, , ,8 0, ,066 7, , ,8 0, ,051 7, , ,4 0, ,076 6, , ,6 0, ,051 6, , , ,054 6, , , ,073 6, , ,8 0, ,051 7, , ,2 0, ,051 7, , ,6 0, ,051 7, , ,6 0, ,053 6, , ,2 0, ,059 6, , , ,05 7, , ,8 0, ,06 7, , , ,059 7, , , ,061 7, , ,8 0, ,06 6, , ,8 0, ,056 6, , ,

32 číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 41 0,05 6, , ,2 0, ,051 6, , ,2 0, ,061 6, , ,8 0, ,058 6, , , ,075 7, , ,8 0, ,05 7, , ,6 0, ,068 7, , , ,065 7, , ,2 0, ,064 7, , ,4 0, ,056 6, , ,6 0, ,059 6, , ,4 0, ,061 6, , ,8 0, ,05 6, , , ,06 6, , , ,06 6, , ,6 0, ,052 7, , , ,053 7, , ,8 0, ,073 7, , , ,057 7, , ,6 0, ,067 7, , , ,055 7, , ,6 0, ,069 7, , ,4 0, ,051 7, , ,4 0, ,05 7, , , ,069 7, , ,8 0, ,05 7, , ,2 0, ,05 7, , ,4 0, ,056 6, , , ,053 6, , ,4 0, ,05 7, , ,8 0, ,05 7, , , ,05 6, , ,2 0, ,05 6, , , ,054 7, , , ,058 7, , ,6 0, ,055 7, , ,8 0, ,054 6, , , ,06 6, , ,4 0, ,074 7, , ,8 0, ,068 7, , ,4 0,

33 číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 81 0,06 7, , ,8 0, ,056 7, , ,6 0, ,056 7, , ,8 0, ,061 7, , ,4 0, ,059 7, , ,6 0, ,052 7, , ,6 0, ,05 6, , , ,062 7, , ,4 0, ,058 7, , ,2 0, ,055 7, , ,2 0, ,051 7, , , ,05 6, , ,8 0, ,05 6, , ,2 0, ,054 7, , , ,063 7, , ,2 0, ,056 7, , ,2 0, ,055 7, , , ,05 7, , ,2 0, ,056 7, , , ,06 7, , , ,05 7, , ,2 0, ,05 7, , , ,054 7, , ,8 0, ,05 7, , ,8 0, ,05 7, , ,8 0, ,064 7, , ,6 0, ,05 7, , ,2 0, ,052 7, , ,4 0, ,055 7, , ,2 0, ,057 7, , ,8 0, ,055 7, , ,6 0, ,05 7, , , ,068 7, , ,8 0, ,05 7, , ,4 0, ,055 7, , ,8 0, ,056 7, , ,6 0, ,052 7, , ,2 0, ,065 7, , ,2 0, ,057 7, , , ,053 7, , ,6 0,

34 číslo dárce objem (l) ph výchozí x10 9 /l x10 9 /l x10 11 /TU v komůrce x10 9 /l x10 9 /TU 121 0,058 7, , ,2 0, ,06 7, , ,8 0, ,061 7, , ,2 0, ,058 7, , ,4 0, ,06 7, , ,6 0, ,05 7, , ,2 0, ,053 6, , ,6 0, ,052 7, , ,2 0, ,05 7, , ,2 0, ,053 6, , ,2 0, ,05 7, , ,8 0, ,05 7, , ,8 0, ,054 7, , ,4 0, ,066 7, , ,6 0, ,055 7, , ,8 0, ,053 7, , , ,057 6, , ,6 0, ,063 7, , ,8 0, ,066 7, , , ,062 7, , , ,06 7, , , ,059 7, , ,2 0, ,056 7, , ,8 0, ,058 7, , ,2 0, ,059 7, , ,8 0, ,059 7, , ,8 0, ,057 7, , ,4 0, ,055 7, , ,6 0, ,053 7, , ,4 0, ,058 7, , ,4 0,

35 Ve skupině čerstvě vyrobených TB jsem také vyšetřila 150 přípravků. Z hlediska požadavků na kontrolu kvality jich ze 150 vyhovuje pouze 85. Při posouzení jednotlivých kritérií jich z hlediska ph vyhovuje 133 a z hlediska počtu trombocytů 94. Požadovaný objem přípravku a počet leukocytů vyhovuje u všech vyšetřovaných přípravků. 160 Počet vyhovujících vyrobených přípravků z hlediska kontroly kvality dle Vyhl. 143/2008 Sb. - O lidské krvi P o č e t p ř í p r a v k ů ph Trombo Leuko Objem 35

36 5 Diskuze Z hlediska měření ph se ve sledovaném vzorku přípravků vyskytlo pouze cca 10% nevyhovujících přípravků. U žádného ze sledovaných přípravků se nejedná o snižující se hodnotu pod stanovenou dolní hranici ph 6,4. Ve většině případů dochází ke zvýšení ph nad stanovenou horní mez 7,4 pouze o několik setin. Ve 3 případech, z celkového počtu 300 přípravků obou skupin, došlo ke zvýšení ph až o několik desetin. V těchto případech došlo také ke značnému snížení počtu trombocytů v přípravcích bez ohledu na počáteční hodnoty dárce. Domnívám se, že tak markantní úbytek počtu trombocytů, ke kterému došlo v těchto případech, může mít přímou souvislost se zvýšenou hodnotou ph. Bohužel na základě 3 výsledků není možné vyvodit příslušné závěry. Bylo by vhodné pokračovat v dalším měření k nasbírání dostatečného počtu výsledků, na jejichž základě bude tato domněnka potvrzena, případně vyvrácena. Další měření bych také v konkrétních případech rozšířila o vyšetření na sterilitu přípravků. Vzhledem k chybějícím dalším výsledkům se mohu o příčině pouze dohadovat. Riziko bakteriální kontaminace není možné, za stávajících podmínek, vyloučit. Může být způsobeno bakteriemi z kůže dárce během odběru krve, bakteriémií přítomnou v krvi dárce během odběru krve, nesprávným zacházením při zpracování krve nebo poškozením konzervy. Záchyt bakteriální kontaminace je literárně u 1-2% destičkových přípravků. Následnou bakteriální kontaminaci nelze vyloučit ani u přípravků, u nichž se ph zvýšilo jen o několik setin. Pro potvrzení mých předpokladů čerstvě vyrobených TB je nutné sledovat hodnoty ph po celou dobu jejich použitelnosti. Toto měření musí probíhat v naprosto sterilním prostředí, které poskytuje pouze laminární box. Náklady na provoz tohoto zařízení pro výzkumné účely není možné přenášet na FNKV. Další nezanedbatelné náklady vyplývají z nutnosti použití přesných, kalibrovaných měřících přístrojů a z nutnosti skladovat v přesně definovaných podmínkách přípravky, které slouží pouze k výzkumným účelům a po skončení výzkumu jsou likvidovány. Z těchto důvodů se domnívám, že tato měření jsem schopna provádět pouze v rámci zadaného, dlouhodobého, výzkumu. 36

37 Z výsledků počtu trombocytů v TB, čerstvě vyrobených nebo exspirovaných, jednoznačně vyplývá souvislost s počátečními hodnotami trombocytů u dárce. Ve skupině exspirovaných přípravků byl kladen důraz na selekci dárců z hlediska počátečních hodnot trombocytů. U čerstvě vyrobených TB k této selekci nedošlo, a proto se zvýšil počet přípravků s nízkým počtem trombocytů. Měření tyto závěry jednoznačně dokazuje. Pro výrobu co nejvyšší výtěžnosti trombocytů v přípravku TB doporučuji provádět pečlivý výběr dárců, z jejichž plné krve se tyto přípravky vyrábějí. Navrhuji zpracovat podrobnou statistiku o potřebách těchto přípravků pro jednotlivá oddělení ve Fakultní nemocnici Královské Vinohrady i o jejich dalších prodejích jiným transfuzním stanicím v Praze. Z vlastní praxe se domnívám, že tato statistika by potvrdila můj předpoklad, že vhodná selekce dárců plné krve (dárci s vysokou hodnotou trombocytů) znamená úsporu jak z hlediska ekonomického (výrobní a skladovací náklady), tak i z hlediska kvality vyrobených přípravků. Počty leukocytů v přípravcích a objemy přípravků vyhověly ve 100% případů stanoveným požadavkům. Těchto výsledků je dosaženo především díky zpracování plné krve na automatických lisech a prováděním případné deleukotizace standardními filtry. 37

38 6 Závěr Hlavním cílem práce bylo zhodnotit kvalitu TB a posoudit, jak výběr dárce ovlivňuje kvalitu přípravků. Vyšetřila jsem 300 přípravků TB. Na základě získaných výsledků jsem dospěla k závěru, že souvislost výběru dárce a ph hodnoty přípravku se přímo neprokázala. Z výsledků také vyplývá, že výběr dárce ovlivňuje hodnoty trombocytů v TB a na to je potřeba se zaměřit při výrobě těchto přípravků. Jistou souvislost mezi ph a počtem trombocytů vidím ve 3 případech. U těchto přípravků došlo ke zvýšení hodnoty ph a snížení počtu trombocytů. Při potvrzení bakteriální kontaminace nelze přímou souvislost s dárcem jednoznačně vyloučit. 38

39 7 Seznam obrázků: Obrázek 1: Trombocyty z BUFFY-COATU a z Aferézy deleukotizované Obrázek 2: Krevní lis Obrázek 3: Třepačka

40 Použitá literatura Klinické použití krve (vydavatelství Grada) Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components Standardní operační postupy TO FNKV Vyhláška o lidské krvi, č. 148/2008 Sb. Novela zákona o léčivech č. 378/2007 Sb. 40