Přínos stanovení DNA C. pneumoniae, C. trachomatis a M. pneumoniae amplifikačními metodami

Transkript

1 Přínos stanovení DNA C. pneumoniae, C. trachomatis a M. pneumoniae amplifikačními metodami Marian Luhový Laboratoře Mikrochem a.s.

2 Analytický přístup Komponenty RNA DNA Přímý průkaz Kompletní mikroorganismus morfologie biochemie růstové vlastnosti Antigeny Protilátky Nepřímý průkaz

3 Diagnostické metody Chlamydia/Mycoplasma Metoda Specifikace Materiál Citlivost Původce Přímý průkaz Kultivace McCoy, HeLa výtěr 50-80% C. trachomatis, pneumoniae Detekce antigenu PPLO půda ELISA (Imunochromat.) výtěr, sputum pod 60% M. pneumoniae rutinně se neprovádí výtěr 50-80% Chlamydia, Mycoplasma MIF výtěr 50-80% Chlamydia, Mycoplasma NAT bez amplifikace výtěr Chlamydia + Neisseria NAAT s amplifikací (PCR ) výtěr, sputum, moč, punktát 80-99% Chlamydia, Mycoplasma

4 Diagnostické metody Chlamydia/Mycoplasma Metoda Specifikace Materiál Citlivost Původce Nepřímý průkaz sérologické metody Rodově specifické LPS, HSP Druhově specifické MOMP Specifické antigeny - kombinace ELISA IgG, IgA, IgM ELISA IgG, IgA, IgM sérum Interpretace? Chlamydia, Mycoplasma sérum Interpretace? C. trachomatis, pneumoniae, M. pneumoniae W. Blot IgG, IgA sérum Chlamydia, Mycoplasma

5 Vývojový cyklus chlamydií A: EB - elementární tělísko (metabolicky neaktivní, vstupuje fagocytózou či endocytózou) B: Endozom - vakuola, kterou EB vstoupilo do buňky (fagosom) Inkluze - přestavba membrány endozomu pro ochranu proti fúzi s lysozomy a destrukci RB retikulární tělísko (metabolicky vysoce aktivní ) C: T3SS sekretorní systém (injektisom) - sekrece efektorových bílkovin do cytoplasmy, ovlivnění signálových drah (blokace apoptózy - podněty proapoptotických stimulů) G: výstup EB z napadené buňky lýzou (zánikem) nebo exocytózou F1000Prime Rep. 2014; 6: 120.

6 Chlamydiová inkluze (IF a EM zobrazení) Infection and Immunity, 68, 2000,

7 Vývojový cyklus chlamydií v nepříznivých podmínkách perzistence Perzistence je navozená řadou exogenních a endogenních faktorů a po odstranění spouštěcího vlivu je zpravidla reverzibilní. Induktory perzistence Antibiotiky navozená: penicilin, ampicilin, chloramfenikol, kyselina nalidixová, sulfonamidy Imunologicky navozená: INF-gama (produkují T-helper buňky)- obrana proti intracelulárním infekcím Indukovaná deficitem: železo, aminokyseliny

8 Vývojový cyklus chlamydií s odvětvením na aberantní formu RB EB elementární tělísko ab-rb aberantní retikulární tělísko RB retikulární tělísko Y.M. AbdelRahman, R.J. Belland / FEMS Microbiology Reviews 29 (2005)

9 Perzistence chlamydií (in vitro, EM snímky) KONTROLA PERZISTENCE 7000 X 7000 X - velké inkluze se zvětšenými aberantními RB - RB se nedělí a nedozrávají do formy EB - je přítomná rozdílná sestava proteinů

10 Inhibice vývoje Chlamydií interferonem gama

11 Doporučená terapie infekcí Chlamydia trachomatis ATB Dávka/den dospělý délka léčby Doxycyklin 2x 100mg 7-10 dní Azitromycin 1x 1000mg 1-denní, 3-denní, prolongovaně (1x týdně 3-6 týdnů) Erytromycin 4x 500mg 7-10 dní Roxitromycin 2x 150mg 7-14 dní Klaritromycin 2x 500mg 7-14 dní Ofloxacin 2x 200mg dní Ciprofloxacin 2x 500mg dní, prolongovaně (1x 500mg 3-6 týdnů + aztromycin) GRAVIDITA Spiramycin 2-3 x 3x10 6 IU 7-10 dní Erytromycin 4x 500mg 7-10 dní Amoxycilin 3x 500mg 14 dní Azitromycin 1x 1000mg Od II. trim., 1 denní, 3-denní: 1x 500mg

12 Zranitelnost forem chlamydií během cyklu Neaktivní Narušení b. stěny NALC? Velmi snížená aktivita metronidazol Aktivní ATB

13 Tropismus a klinické projevy chlamydií Druh Sérotyp Lokalizace Akutní infekce Následné komplikace C. trachomatis C. trachomatis C. trachomatis C. pneumoniae A-C spojivky konjunktivitida slepota D-K L1,2,2a,3 anogenitální sliznice, uretra, cervix, rektum genitální sliznice, lymfocyty, monocyty respirační epitel konjunktivitida a pneumonie novorozenců uretritida, epididymitida, prostatitida, cervicitida, endometritida, salpingitida, akutní perihepatitida gen. ulcerace, lymfadenopatie Infekce HCD a DCD, pneumonie záněty pánevního dna tubární neplodnost karcinomy? ateroskleróza astma reaktivní artritida lymfogranuloma venerum C. psittaci respirace, systém pneumonie hepatitida? asociace s kardiovaskulárními nemocemi (ateroskleróza) astma neurologické nemoci (roztroušená skleróza, Alzheimerova nemoc)

14 Odpovídající vzorek: metoda amplifikační (RT-PCR) patogen: Chlamydia trachomatis Vzorek, lokalita stěr (děložní čípek) stěr (uretra) výtěr (spojivkový vak) Výpovědní hodnota vysoká vysoká vysoká Poznámky vysoká citlivost, snížená vypovídací schopnost při migraci infekce (vejcovody ) vysoká citlivost vysoká citlivost moč variabilní vysoká u mužů při správně provedeném odběru, méně vhodná u žen ejakulát vysoká hledání lokalizace punktát, výpotek variabilní vysoká v případě správné lokalizace

15 Odpovídající vzorek: metoda amplifikační (RT-PCR) patogen: Chlamydia pneumoniae Vzorek, lokalita nazofaryngeální výtěr BAL, sputum, tracheální aspirát, bronchiální sekret, pleurální výpotek Výpovědní hodnota vysoká vysoká Poznámky biopsie variabilní vysoká v případě správné lokalizace

16 Odpovídající vzorek: metoda amplifikační (RT-PCR) patogen: Mycoplasma pneumoniae Vzorek, lokalita nazofaryngeální výtěr BAL, sputum, tracheální aspirát, bronchiální sekret, pleurální výpotek Výpovědní hodnota vysoká vysoká Poznámky

17 PCR polymerázová řetězová reakce Krok 1: denaturace Čas: 30s t: 95 o C Krok 2: nasedání Čas: 30s t: 60 o C Krok 3: prodlužování Čas: 60s t: 72 o C

18 Výsledkem kopírování úseku DNA vymezeného primery je značný nárůst počtu kopií odpovídající ohraničené oblasti původní DNA molekuly vymezený úsek 2. cyklus 3. cyklus 4. cyklus Exponenciální amplifikace templátová DNA 1. cyklus 35. cyklus 2 2 = 4 kopie 2 3 = 8 kopií 16 kopií 32 kopií 2 36 = 68 biliónů kopií

19 Výsledkem procesu RT-PCR je rovněž kopírování úseku DNA vymezeného primery navíc s ekvivalentním nárůstem počtu fluorescenčních molekul vymezený úsek 2. cyklus 3. cyklus 4. cyklus Exponenciální amplifikace templátová DNA 1. cyklus 35. cyklus 2 2 = 4 kopie 2 3 = 8 kopií 16 kopií 32 kopií 2 36 = 68 biliónů kopií

20 Fluorescence Grafický výstup: fluorescence = f (cyklů) Opakovatelnost zkušený operátor Threshold Počet cyklů

21 RT-PCR cyklér (Rotorgene 6000)

22 Činnost: manipulace se vzorkem, zpracování vzorku Zařízení/postup: laminární box Cíl: ochrana pracovníka před mikroorganismem, omezení kontaminace (mezivzorkové, z pracovníka)

23 Činnost: manipulace se vzorkem, zpracování vzorku Zařízení/postup: mikrocentrifuga Cíl: centrifugací před každým otevřením nádobky zabránit kontaminaci z víčka (mezivzorková)

24 Činnost: záznamy o manipulaci se vzorkem, řazení, průběh Zařízení/postup: evidence Cíl: zpětná kontrola úrovně rizika, omezení vydání falešně pozitivního nálezu (mezivzorková kontaminace) OK

25 Činnost: záznamy o manipulaci se vzorkem, řazení, průběh Zařízení/postup: evidence Cíl: zpětná kontrola úrovně rizika, omezení vydání falešně pozitivního nálezu (mezivzorková kontaminace) OK

26 Činnost: záznamy o manipulaci se vzorkem, řazení, průběh Zařízení/postup: evidence Cíl: zpětná kontrola úrovně rizika, omezení vydání falešně pozitivního nálezu (mezivzorková kontaminace)!!!

27 Činnost: manipulace se vzorkem, zpracování vzorku Zařízení/postup: odměřování objemu, přesun alikvotu Cíl: ochrana mikropipety před kontaminací aerosolem, omezení kontaminace (mezivzorkové)

28 Činnost: dekontaminace povrchů od DNA a RNA Zařízení/postup: působení aktivních přípravků (SAVO) Cíl: ochrana pracovníka před mikroorganismem, omezení kontaminace obecně (mezivzorkové, z pracovníka, z jiných zdrojů)

29 Činnost: dekontaminace prostředí od DNA a RNA Zařízení/postup: UV lampy Cíl: ochrana pracovníka před mikroorganismem, omezení kontaminace obecně (mezivzorkové, z pracovníka, z jiných zdrojů)

30 Činnost: příprava čistých komponent do PCR Zařízení/postup: DNA stanice - box Cíl: omezení kontaminace (obecně z prostředí)

31 Činnost: dekontaminace DNA stanice k práci Zařízení/postup: UV lampy DNA stanice - box Cíl: omezení kontaminace (obecně z prostředí)

32 Správný vzorek pro amplifikační metody? Aby amplifikační DNA/RNA metody poskytovaly správné a odpovídající kvalitativní a kvantitativní údaje, je nutné respektovat podstatu těchto metod. PCR a RT-PCR jsou metodami přímého průkazu přítomnosti genetického materiálu (DNA či RNA). Odpovídající správný vzorek (odběrový materiál) je tedy takový, kde lze očekávat výskyt mikroorganismu případně jeho DNA-RNA (i částečně fragmentované).

33 Porovnání přínosu typu vyšetření pro stanovení patogena PCR (amplifikace NK) Přímý průkaz (kvalita odběru!) Nezávislost na dynamice imunitní odpovědi Vysoká citlivost a specifita Optimální pro akutní infekce (vysoké množství patogena v primárním ložisku) Nebezpečí falešné pozitivity při nedodržení zásad odběru a práce se vzorkem pro amplifikační metody Reinfekce - reaktivace je snáze zachytitelná (primární ložisko) Serologie Nepřímý průkaz (kvalita vyjádření imunitní reakce!) Závislý na dynamice hladiny tříd protilátek V kombinaci s WB (konfirmace) vysoká specifita V časné fázi primární infekce teprve počátek změny hladiny protilátek - 2 odběry pro sledování dynamiky Nebezpečí hrozí pouze při záměně vzorku Dynamika protilátek nemusí být výrazně vyjádřena

34

35