CHLAMYDIA TRACHOMATIS LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA A INTERPRETACE

Transkript

1 CHLAMYDIA TRACHOMATIS LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA A INTERPRETACE Mgr. Jana Kolářová, Ph.D. Laboratoře Mikrochem a.s. Olomouc

2 Chlamydia trachomatis gramnegativní bakterie intracelulárně parazitující na hostitelské buňce (ATP) epitelové buňky urogenitálního traktu, dýchacího ústrojí, spojivek, elementární tělísko retikulární tělísko infekční forma metabolicky aktivní, dělení Beatty WL, Morrison RP, Byrne GI. Persistent chlamydiae: from cell culture to a paradigm for chlamydial pathogenesis. Microbiol Rev 1994; 58: Xq.magarticle.aspx

3 EPIDEMIOLOGIE výlučně lidský patogen SÉROTYP ONEMOCNĚNÍ PŘENOS VÝSKYT A, B, Ba, C D, Da, E, F, G, H, I, Ia, J, K L1, L2, L2a, L3 TRACHOM OKULOGENITÁLNÍ CHLAMYDIÓZA, U NOVOROZENCŮ KONJUKTIVITIDA A PNEUMONIE LYMPHOGRANULOMA VENEREUM přímý kontakt, kontaminované ruce, předměty, voda, hmyz pohlavní styk perinatální přenos pohlavní styk tropy a subtropy celosvětově hl. rozvojové země tropů, zřídka Evropa a Severní Amerika

4 TRACHOM Chronická keratokonjuktivitida vedoucí k ložiskovým nekrózám a jizvám na spojivce. Oční víčko se stáčí a řasy při mrkání poškozují rohovku. Dochází k jejímu zakalení a za let ke slepotě.

5 LYMPHOGRANULOMA VENEREUM Postižení lymfatických uzlin U neléčených pacientů - destruktivní zánět s následným zjizvením ve tkáni genitálu a konečníku, píštěle, elefantiáza genitálu

6 OKULOGENITÁLNÍ CHLAMYDIÓZA C. trachomatis nejčastější sexuálně přenosný bakteriální patogen světa Často asymptomaticky či s mírnými příznaky riziko: 1) přenos horizontální i vertikální 2) neléčená chlamydióza může u žen vést k poškození reprodukčních orgánů sterilita, mimoděložní těhotenství,

7 PŘÍZNAKY MUŽI ŽENY NOVOROZENCI uretritida cervicitida inkluzní konjuktivitida prostatitida endometritida pneumonie epididymitida salpingitida rinofaringitida proktitida periadnexitida mesotitida perihepatitida: Fitz-Hughův-Curtisův sy. artritida: Raynaudův syndrom infekční artritida reaktivní postinfekční artr. inkluzní konjuktivitida perihepatitida: Fitz-Hughův-Curtisův sy. artritida: Raynaudův syndrom infekční artritida reaktivní postinfekční artr. inkluzní konjuktivitida uretritida proktitida vulvovaginitida

8 INDIKACE K VYŠETŘENÍ Pacienti s výše uvedenými příznaky Sexuální partneři Rodiče infikovaných novorozenců Osoby s poruchou plodnosti Dárci spermatu Vzhledem k tomu, že infekce probíhá často bezpříznakově a může vést k trvalým následkům (sterilita) doporučuje CDC každoroční test na Chlamydii trachomatis všem sexuálně aktivním ženám ve věku do 25-ti let, starším ženám s rizikovým faktorem (které mají nového sexuálního partnera, nebo více sexuálních partnerů) a všem těhotným ženám.

9 DIAGNOSTIKA V NAŠÍ LABORATOŘI PŘÍMÝ PRŮKAZ: speciální odběrové soupravy lze vyžádat v naší laboratoři imunofluorescence PCR genová sonda (Přerov) NEPŘÍMÝ PRŮKAZ: ELISA imunoblot

10 IMUNOFLUORESCENCE ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: Stěr z cervixu, popř. výtěr z uretry Při odběrech z pohlavního ústrojí je nutno použít techniku dvou tamponů (prvním odstranit hlen, druhým provést abrazi epiteliálních buněk). Je třeba použít speciální podložní sklíčka vhodná pro imunofluorescenci a nátěr po zaschnutí fixovat přelitím 96% etanolem. Uchovávat do doby transportu v ledničce (max. 1 den), popř. zamrazit (více než den). Potřebné komponenty dodáváme.

11 IMUNOFLUORESCENCE V laboratoři se na sklíčko se vzorkem aplikují monoklonální protilátky konjugované s fluoresceinem (BIO RAD). Ty reagují s MOMP (major outer membrane protein) C. trachomatis. Fluorescenční mikroskop: Hledáme minimálně 10 elementárních tělísek - typická velikost, tvar a záření (barva). Toto vyšetření je vhodné pro akutní infekci. Při chronických infekcích již nemusí být elementární tělíska v místech odběru zachycena. Oproti PCR je imunofluorescence: - méně citlivá - nelze použít moč + levnější

12 PCR ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: Stěr z cervixu: odstraníme přebytečný hlen z osy cervixu a z okolí ektocervixu pomocí tamponu vnoříme kartáček 1-1,5 cm do osy cervixu tak, aby se zadní štětičky kartáčku dotýkaly ektocervixu kartáčkem 3x otočíme proti směru hodinových ručiček kartáček do cervikálního kanálu nezasunujeme úplně kartáček vložíme na dno přepravní zkumavky, nesmí se dotknout vnějších stěn přepravní zkumavky ani žádného jiného předmětu část tyčinky kartáčku, která vyčnívá ze zkumavky, ohneme o hranu zkumavky a zlomíme u vyznačené rýhy zkumavku pečlivě uzavřeme víčkem u těhotných žen (nepoužívat cervikální kartáček!) odstraníme přebytečný hlen z osy cervixu a z okolí ektocervixu pomocí jednoho ze dvou dodaných dakronových tamponů vnoříme další tampon do endocervikálního kanálu a 5x s ním otočíme o 180, pokaždé změníme směr otáčení setřeme důkladně celou oblast transformační zóny opatrně vyjmeme tampon, vyvarujeme se kontaktu s vaginální sliznicí tampon vložíme na dno přepravní zkumavky, odlomíme násadku u označené rýhy a bezpečně zkumavku uzavřeme

13 PCR ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: Výtěr z uretry: (hlavně muži) Při infekci ženského urogenitálního traktu je často vhodné k vyšetření odeslat výtěr cervixu spolu s výtěrem uretry. Obecně odběr uretrálních vzorků se provádí dakronovým tamponem šroubovitým vsunutím do hloubky 3-4 cm. Moč: Průkaz v moči je účinnou neinvazivní formou detekce chlamydií u mužů i žen, ale při chronických infekcích je zatížen rizikem falešné negativity z důvodu často velmi nízké koncentrace v tomto materiálu (chlamydie se při kolonizaci uretry mohou, ale nemusí do moči uvolňovat). Na vyšetření se odebírá prvních ml moče (není nutná ranní moč, ale 1-2 hodiny před odběrem nemočit), vzorek se do vyšetření uchovává v chladu (+4 C) přípustné až 3 dny; při delším uchování je možné moč zamrazit. Ejakulát Pro stanovení chlamydiové kontaminace spermatu je třeba vyšetřit min. 200 μl ejakulátu. Při odběru vzorků je třeba vždy dodržovat zásady sterility, vložit je do zkumavky bez transportního média a uchovat nebo transportovat při +4 C do 24 h. V případě delšího uchovávání zamrazit na -20 C. Oko: Je-li přítomen hnis nebo exudát, jemně očistit místo odběru vatovým tamponem. Poté vytřít dakronovým (nylonovým) tampónem malého objemu na plastové tyčince 2 až 3 tahy dolní a pak horní spojivku. Tampon vsunout-zalomit do prázdné sterilní zkumavky uzavřít. Pozor, na transport tampónu nelze použít žádné transportní půdy, pouze prázdná zkumavka, jinak dojde ke znehodnocení vzorku!!! Transport do laboratoře: co nejdříve do laboratoře (do 6 hodin), při chlazení 4-8 C: 3 dny

14 PCR METODA: RT-PCR (real-time polymerase chain reaction) Simultánní detekce genomové a plasmidové DNA Chlamydia trachomatis metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) a měření nárůstu koncentrace amplifikačního produktu v průběhu PCR pomocí fluorescenčně značené sondy. Detekce je cílená na multikopiovou sekvenci kryptického plasmidu umožňující vysokou sensitivitu vyšetření a zároveň na sekvenci genu kódujícího bakteriální 16S RNA jedinečnou pro Chlamydia trachomatis umožňující vysokou specificitu reakce. Referenční hodnoty: negativní = nepotvrzení přítomnosti nukleové kyseliny Chlamydia trachomatis pozitivní = potvrzení přítomnosti nukleové kyseliny Chlamydia trachomatis Test prokazuje viabilní i neviabilní baktérie, proto pozitivní nález nemusí vždy znamenat přítomnost viabilního patogenu a floridní infekce, protože prokázaná DNA může pocházet z již rozpadlých mikrobiálních agens vlivem předchozí ATB terapie nebo z období perzistující chronické infekce. PCR je vysoce citlivá a specifická metoda, která je obecně až o 20-30% citlivější než všechny dosud používané diagnostické metody.

15 ELISA, IMUNOBLOT ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: 5ml srážlivé krve, chladit V LABORATOŘI: Z krve se získá sérum, které se vyšetřuje na přítomnost IgA a IgG protilátek proti Chlamydia trachomatis. 1) Metodou ELISA (TestLine) Stanovuje protilátky proti MOMP. 2) Metodou Imunoblot (ALL.DIAG S.A.) Stanovuje protilátky proti více antigenům. Větší citlivost, konfirmace sporných výsledků. 4 rekombinantní antigeny (MOMP, OMP2, HSP60, MIP).

16 ELISA - INTERPRETACE IgA IgG hodnocení - - Negativní výsledek. Pozor falešná negativita v příliš časné fázi infekce /- + - Počínající infekce. + Dříve prodělaná infekce. Začínající reinfekce. Žádáme o druhý vzorek k posouzení dynamiky protilátkové odpovědi Nedávno proběhlá nebo probíhající infekce. Opakující se infekce. Chronická infekce (potvrzení chronicity opakovaným vyšetřením za 3 měsíce, popř. imunoblot, nutné klinické příznaky). - + Anamnestické protilátky po dříve prodělané infekci. Labor. nálezy je nutno vždy hodnotit s přihlédnutím k anamnéze a klinickému stavu pacienta.

17 IMUNOBLOT - INTERPRETACE antigen IgG IgA MOMP (major outer membrane protein) 6 6 OMP2 (outer membrane protein 2) 2 3 HSP60 (heat shock protein 60) 1 3 MIP (macrophage infectivity potentiator) 3 3 Na základě klinických hodnocení a matematické analýzy bylo vypracováno bodové hodnocení testu. celkový počet bodů hodnocení 3 negativní 4-5 hraniční 6 pozitivní Protilátky proti HSP60 mohou být interpretovány jako ukazatel závažnosti nebo chronicity infekce.

18 ELISA, IMUNOBLOT ÚSKALÍ INTERPRETACE Možnost zkřížené reakce s jinými druhy chlamydií (C. pneumoniae, C.psittaci). Na počátku infekce nejsou protilátky ještě vytvořeny. Lépe přímý průkaz. Protilátky IgA dlouho přetrvávají. Interpretace je omezena v rozlišení akutní infekce, rekurence, reinfekce, perzistence. Laboratorní nálezy je nutno vždy hodnotit s přihlédnutím k anamnéze a klinickému stavu pacienta.

19 TERAPIE MAKROLIDY TETRACYKLINY FLUOROCHINOLONY generace Při potvrzené nebo velmi suspektní infekci C. trachomatis by měl být současně léčen sexuální partner. U potvrzené infekce novorozence je nutná léčba i rodičů.

20 TERAPIE Doporučený postup Společnosti infekčního lékařství České lékařské společnosti J. E. Purkyně zdroj: Diagnóza Potvrzení diagnózy Terapie Lymphogranuloma venereum (LGV) NAAT z moči, uretry doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 21 dní nebo klaritromycin 1000 mg/d p.o. (2x/d) 21 dní Negonokoková uretritida (NGU) u muže Epididymitida kultivačně negativní leukocyturie NAAT z moči, uretry kultivačně negativní leukocyturie, pyurie NAAT v moči nebo z uretry azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7-14 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní u podezření na smíšené infekce kombinace se širokospektrými antibiotiky (např. ceftriaxon, metronidazol) Proktitida NAAT v moči nebo z uretry, z rekta doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7-14 dní levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní nebo Cervicitida Uretritida u ženy Salpingitida (PID) NAAT z moči nebo stěru z cervixu NAAT z moči nebo stěru z cervixu, z uretry NAAT v moči nebo z cervikálního stěru azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní

21 Diagnóza Potvrzení diagnózy Terapie Konjunktivitida dospělých polymorfonukleární leukocyty mikroskopicky ze stěru, NAAT, detekce Ag Konjunktivitida novorozenců polymorfonukleární leukocyty mikroskopicky ze stěru, NAAT, detekce Ag Pneumonie novorozenců RTG plic, NAAT nazofaryngeální stěr, MIF IgM sérologie azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní u inkluzní formy léčba dní klaritromycin 15 mg/kg/d p.o. (2x/d) 10 dní nebo azitromycin 1. den: 10 mg/kg/den p.o., další 4 dny 5 mg/kg/den léčba rodičů klaritromycin 15 mg/kg/d p.o. (2x/d) 10 dní nebo azitromycin 1. den: 10 mg/kg/den p.o., další 4 dny 5 mg/kg/den léčba rodičů Terapie chronických infekcí s možným podílem na imunitně mediované reakci evokované chlamydiemi: Diagnóza Potvrzení diagnózy Terapie Astma s potvrzenou nebo velmi suspektní akutní chlamydiovou infekcí Astma bez chlamydiové infekce Ateroskleróza a následné stavy Chronické neurologické nemoci s potvrzenou nebo suspektní akutní chlamydiovou infekcí Chronické neuropsychické nemocí (roztroušená skleróza, Alzheimerova nemoc, demence asociovaná s HIV infekcí, mentální nemoci atd.) RTG plic, NAAT sputum, nazofaryngeální stěr doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) dní nebo azitromycin 1,5 g/d p.o. (1x/d) 5 dní (u dětí 1. den: 10 mg/kg/d p.o., další 4 dny: 5 mg/kg/d p.o. (1x/d) nebo klaritromycin 1 g/d p.o (2x/d) 10 dní (u dětí 15 mg/kg/d p.o. [2x/d]) 10 dní nebo levofloxacin 500 mg/d i.v. nebo p.o. (1x/d) 7-14 dní nebo moxifloxacin 400 mg/d p.o. (1x/d) 10 dní antibiotika nejsou indikována antibiotika nejsou indikována NAAT nazofaryngeální stěr, z mozkomíšního moku doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7-14 dní nebo azitromycin 1,5 g/d p.o. (1x/d) 5 dní (u dětí 1. den: 10 mg/kg/d p.o., další 4 dny: 5 mg/kg/d p.o. [1x/d]) nebo klaritromycin 1 g/d p.o (2x/d) 7-10 dní (u dětí 15 mg/kg/d p.o. [2x/d]) 10 dní nebo levofloxacin 500 mg/d i.v. nebo p.o. (1x/d) 7-14 dní nebo moxifloxacin 400 mg/d p.o. (1x/d) 7-10 dní antibiotika nejsou indikována Reaktivní artritida sérologie, NAAT ze synoviální tekutiny azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní; dlouhodobá terapie antibiotiky není indikována!

22 Terapie gravidních žen U gravidních je doporučena u nongonoroické uretritidy terapie azitromycin jednorázově 1 g. Možnost je také amoxicilinem 500 mg 3 denně po dobu 7-10 dní. Doxycyklin a fluorované chinolony jsou v těhotenství kontraindikovány. Alternativní léčba by mohla být klindamycinem, který má pouze částečný profit u mužů s negonokokovou uretritidou (NGU), ale má větší efekt u těhotných i netěhotných žen. Prenatální screening s terapií a s následným bezrizikovým chováním je v 90% úspěšný v prevenci perinatální infekce novorozence.

23 ZÁVĚR V ČR jsou infekce C. trachomatis způsobeny sérotypy, které vedou k okulogenitální chlamydióze a k infekcím novorozenců. Infekce C. trachomatis probíhají často asymptomaticky, což má za následek neléčení a další přenos infekce.

24 ZÁVĚR PŘÍMÝ PRŮKAZ INFEKCE je vhodný především v časné fázi infekce. PCR je citlivější metodou. Imunofluorescence je levnější metodou. NEPŘÍMÝ PRŮKAZ detekce protilátek proti C. trachomatis je vhodná, pokud infekce probíhá již delší dobu (min. 3-4 týdny), nebo jde o infekci chronickou. ELISA je levnější metodou. Lépe ukazuje dynamiku Ab odpovědi. Imunoblot je citlivější a přesnější metodou (4 rekominantní Ag x 1 Ag u ELISA). Interpretace je omezena v rozlišení akutní infekce, rekurence, reinfekce, perzistence. Laboratotní nálezy je nutno vždy hodnotit s přihlédnutím k anamnéze a klinickému stavu pacienta.

25 ZÁVĚR Dobře provedený odběr (správná technika odběru, vhodná odběrová souprava) a dodržení podmínek skladování a transportu je předpokladem pro správný výsledek laboratorního vyšetření. LÉČBA: MAKROLIDY, TETRACYKLINY a FLUOROCHINOLONY generace. Je vhodné vyšetřit a léčit i sexuální partnery nemocných a rodiče infikovaných novorozenců.

26 DĚKUJI ZA POZORNOST