Stanovení aktivity fytochelatinsyntázy v rostlinných buňkách

Transkript

1 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Fakulta veterinární hygieny a ekologie Stanovení aktivity fytochelatinsyntázy v rostlinných buňkách Diplomová práce Autor práce: Bc. Markéta Komínková Vedoucí práce: Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Brno, 2013

2 PROHLÁŠENÍ STUDENTA Prohlašuji, že jsem předkládanou diplomovou práci vypracovala zcela samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce a veškeré podkladové materiály, z nichž jsem vycházela, uvádím v Seznamu literatury. V Brně dne (podpis studenta)

3 Experimentální část této disertační práce byla realizována na výzkumné infrastruktuře vybudované v rámci projektu CZ.1.05/2.1.00/ Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace. Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky.

4 Poděkování: Tímto bych chtěla poděkovat Mgr. Ondřeji Zítkovi, Ph.D. za vytrvalé vedení mé práce, odborné konzultace, nespočetné rady i nekončící diskuse. Díky patří celé pracovní skupině prof. Ing. René Kizeka, Ph.D. za vytvoření příjemné pracovní atmosféry, bez které by tato práce nespatřila světlo světa. Velké díky patří mé rodině za podporu po celou dobu studia i za vytváření vhodné prostředí ke studiu i práci.

5 OBSAH 1. ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Těžké kovy Kadmium (Cd) Platina (Pt) Měď (Cu) Fytoremediace Antioxidační ochrana rostlin Thiolové sloučeniny Glutathion Fytochelatiny Fytochelatinsyntáza Detoxifikace kovů pomocí fytochelatinů Metody detekce thiolových sloučenin PRAKTICKÁ ČÁST Materiály Chemikálie Vzorky Suspenzní kultura a její příprava Kukuřice (Zea mays L.) a hrách (Pisum sativum L.) vliv platiny Kukuřice (Zea mays L.) - vliv mědi Přístrojové vybavení Metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí Mikrovlnný rozklad Stanovení kadmia Stanovení platiny Stanovení mědi Elektrochemické stanovení kovů Stanovení kadmia Stanovení platiny Stanovení mědi Stanovení esterázové aktivity Příprava buněk pro analýzu Příprava kukuřice (Zea mays L.) a hrachu (Pisum sativum L.) pro hodnocení toxicity platiny(iv) Příprava kukuřice (Zea mays L.) pro hodnocení vlivu mědi... 32

6 3.3. Optimalizace stanovení PCS Kalibrace Koncentrace substrátu GSH Doba inkubace Výsledky Vlastní stanovení aktivity PCS Stanovení obsahu kadmia v buněčné kultuře Stanovení esterázové aktivity Vyhodnocení aktivity PCS Stanovení Km Aplikace metody Hodnocení toxicity platiny(iv) u kukuřice (Zea mays L.) a hrachu (Pisum sativum L.) Hodnocení vlivu mědi na odrůdy kukuřice (Zea mays L.) ZÁVĚR LITERATURA ABSTRAKT... 60

7 1. ÚVOD Lidské úsilí vždy směřovalo k co nejpohodlnějšímu životu, čímž postupně docházelo k ovlivňování životního prostředí. Počátky vlivu člověka sahají k prvním osadníkům, kteří vypalovali lesnatá území pro získání orné půdy. S rostoucí lidskou populací a jejími zvyšujícími se životními nároky se z původních, ne příliš výrazných zásahů staly zásahy velké, které nejen že naprosto změnily ráz krajiny, ale v určitých oblastech došlo také ke změnám ve složení vod, půd a ovzduší. Za významný problém současnosti je považována kontaminace půd těžkými kovy, která je způsobena jak činností lidstva, tak i přirozenými procesy prostředí, které zvyšují mobilizaci těchto kovů. Vysoká koncentrace těžkých kovů v půdě omezuje možnosti jejího využití a při stále se zvyšujícím počtu obyvatel planety může potencionálně znamenat nedostatek ploch vhodných k produkci potravin, a tím pádem i nedostatek potravy jak pro zvířata, tak pro lidstvo. Organismy si v průběhu evoluce vypěstovaly množství mechanismů, pomocí kterých se brání působení nepříznivých vlivů, potažmo těžkých kovů. Jedním z těchto mechanismů je tvorba thiolových sloučenin jako jsou glutathion, cystein, fytochelatiny a další. Tyto sloučeniny se významně podílí na buněčné antioxidační aktivitě. Jejich množství v organismech může být dobrým indikátorem nerovnováhy redoxní homeostázy. Fytochelatiny interagují s těžkými kovy prostřednictvím thiolových skupin a zlepšují tak schopnost rostlin vyrovnat se se zvýšenou koncentrací těžkých kovů. Množství fytochelatinů, které je rostlina schopna syntetizovat ovlivňuje enzym fytochelatinsyntáza. Tento enzym nabízí možnost hodnocení tolerančních vlastností rostlin. Díky stanovení jeho aktivity jsme schopni hodnotit, zda je daná rostlina schopna se s vlivy prostředí vyrovnat, či pro ni budou mít fatální důsledky. 7

8 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Těžké kovy V literatuře se často setkáváme s pojmem těžké kovy, ten však po dlouhou dobu nebyl vůbec definován a autoři jej používali se širokou škálou významů. Toto nejednotné užívání tak vedlo ke značným zmatkům a nesprávné interpretaci některých zjištění. Z tohoto důvodu v roce 2002 Duffus (Duffus, J. H. 2002) zveřejnil přehledový článek, ve kterém byly navrženy možnosti jak pojem vymezit. Tato práce vznikla na pověření Mezinárodní unie pro čistou a užitnou chemii (International Union of Pure and Applied Chemistry, zkráceně IUPAC) (Duffus, J. H. 2002). Nejběžněji se těžké kovy označují na základě hustoty, která říká, že všechny těžké kovy mají hustotu vyšší než 5 g.cm -3 (Appenroth, K. J. 2010). Při použití termínu těžký kov je velmi často také hovořeno o toxicitě a ekotoxicitě těchto látek, to však vychází spíše z pocitu, než z vědeckého základu. Ze současného pohledu by bylo jistě vhodnější pro definování těžkých kovů používat mimo jiné i chemické vlastnosti a komplexní vlastnosti v živých buňkách, ale je zřejmé, že není možné očekávat jakoukoli predikci ke změně užívání tohoto pojmu. (Duffus, J. H. 2002), (Appenroth, K. J. 2010). Těžké kovy jako polutanty, můžeme rozdělit do tří skupin a to na toxické kovy (Hg, Cr, Pb, Cd, As, Co, Sn), vzácné kovy (Pd, Pt, Ag, Au, Ru) a radionuklidy (U, Th, Ra, Am) (Ahsan, N., Renaut, J. et al. 2009). Těžké kovy představují jeden z největších problémů v oblasti kontaminace prostředí cizorodými látkami anorganického původu (An, L. Y., Pan, Y. H. et al. 2011). Ve světě je stále rostoucím problémem kontaminace půdy, vody i ovzduší těmito látkami (An, L. Y., Pan, Y. H. et al. 2011), (Xian, J. A., Wang, A. L. et al. 2013). K té přispívá i lidská činnost, jelikož moderní civilizace je závislá na používání těžkých kovů, které jsou tak součástí každodenního života. Používání těchto látek se však v historii lidstva datuje tisíce let zpátky (Tiller, K. G. 1989). Na druhé straně je nutno si uvědomit, že mnohem větší měrou ke kontaminaci prostředí přispívají přirozené procesy jako geochemické zvětrávání hornin, sopečné výbuchy či kyselé deště (Rathod, P. H., Rossiter, D. G. et al. 2013), (An, L. Y., Pan, Y. H. et al. 2011), které zvyšují mobilizaci kovů v půdě (Zheng, S. A., Zheng, X. Q. et al. 2012). 8

9 Kadmium (Cd) Důležitým zdrojem kontaminace životního prostředí tímto těžkým kovem je spalování fosilních paliv, ale také v zemědělství používaných fosfátových hnojiv a pesticidů s obsahem tohoto prvku (Bencko, V., Cikrt, M. et al. 1995), (Jiao, Wentao, Chen, Weiping et al. 2012). Mezi další významné zdroje patří elektrárny, topné systémy, kovoobráběcí průmysl, spalovny, městský provoz a cementárny (Sanità di Toppi, L. and Gabbrielli, R. 1999). Z původců tohoto znečištění vyplývají i oblasti s nejvyšší kontaminací, jsou to zejména oblasti s velkou koncentrací průmyslu a v místě skládek (Bertoli, A. C., Cannata, M. G. et al. 2012). Právě tento prvek je jedním z nejvíce studovaných kontaminantů (Kah, M., Levy, L. et al. 2012) a i proto je známa celá řada jeho negativních účinků jak na lidské zdraví (Nordberg, G. F. 2004), tak na rostliny (Bertoli, A. C., Cannata, M. G. et al. 2012), (Kusznierewicz, B., Baczek-Kwinta, R. et al. 2012), (Bauddh, K. and Singh, R. P. 2012). Mezi důležité vlastnosti tohoto prvku patří dlouhý poločas rozpadu a tendence vytvářet sirné komplexy s peptidy a proteiny, které ji obsahují (Singh, B.R. and McLaughlin, J. 1999). V případě velkého příjmu vykazuje karcinogenní, mutagenní a teratogenní účinky pro velké množství živočichů (Sanità di Toppi, L. and Gabbrielli, R. 1999). Pohyb kadmia ke kořenům se děje difuzí a půdními toky v blízkosti rostliny (Cibulka, J. 1991), vliv má ovšem i ph půdy, obsah organických látek a oxidů a hydroxidů železa a manganu, které ovlivňují rozpustnost kadmia (Jiao, Wentao, Chen, Weiping et al. 2012). Příjem kadmia rostlinami je v lineární závislosti na obsahu volných iontů kadmia v půdě (Hart, J. J., Welch, R. M. et al. 1998). Do rostlin je přijímáno přes plazmatickou membránu kořene (Hussain, A., Larsson, H. et al. 2012) dvěma způsoby, a to aktivně (při tomto příjmu dochází ke spotřebě energie) anebo pasivně (difuzí iontů z půdy do endospermu rostlin). Po absorpci kořeny dochází k transportu xylémem a rozšíření po cévním systému rostliny zřejmě díky transpiraci z listů (Bertoli, A. C., Cannata, M. G. et al. 2012), (Lu, L. L., Tian, S. K. et al. 2008), (Yu, H., Xiang, Z. X. et al. 2012). Obecně platí, že kadmium se ukládá z větší části v kořenech a pouze část je transportována do nadzemní části, kde se hromadí v listech zejména jako esenciální kov (Hart, J. J., Welch, R. M. et al. 1998). 9

10 Rostliny v přítomnosti zvýšeného množství kadmia vykazují celkovou reakci. Negativní vlivy kadmia na rostliny se nejprve projevují na úrovni kořenů, které jsou vstupním místem do rostliny. V první řadě dochází k poškození buněk kořenové špičky, dochází ke snížení příjmu dusičnanů a jejich transportu do nadzemních částí, inhibici aktivity nitrátreduktázy, ovlivnění fotosyntetického aparátu, růstu kořenů i nadzemní části, změnám buněčné membrány, struktury chromozomů a dělení buněk, ovlivnění vodní bilance a činnosti některých enzymů. Dále kadmium inhibuje oxidativní fosforylaci mitochondrií, otevírání průduchů a vyvolává oxidativní stres (Sanità di Toppi, L. and Gabbrielli, R. 1999), (Hajduch, M., Rakwal, R. et al. 2001), (Ranieri, Annamaria, Castagna, Antonella et al. 2005) Zda je rostlina ještě schopna přijmout kadmium či ne, závisí na mnoha faktorech, jako jsou jeho koncentrace v půdě, biologická dostupnost, přítomnost organické hmoty, ph, redox potenciál, teplota a koncentrace dalších prvků (Sanità di Toppi, L. and Gabbrielli, R. 1999) Platina (Pt) Platina, stejně jako ostatní platinové kovy (palladium (Pd), rhodium (Rh), iridium (Ir), ruthenium (Ru) a osmium (Os)) se řadí do skupiny těžkých kovů. Jsou to mimo jiné ušlechtilé, chemicky málo reaktivní materiály a jejich mimořádná chemická odolnost a mechanické vlastnosti je předurčují k velkému množství aplikací. Zejména platina díky svým vlastnostem našla uplatnění v široké skupině odvětví. Mezi nejběžnějšími použitími je šperkařství, lékařství, kde se platina používá k léčbě nádorových onemocnění a automobilový průmysl, kde se platinové kovy používají v katalyzátorech ve výfukových potrubích (Sikorova, L., Licbinsky, R. et al. 2011), (Sobrova, P., Zehnalek, J. et al. 2012). Platinové kovy jako kontaminanty životního prostředí mají tendenci bioakumulace v organismech, což může znamenat vážnou hrozbu (Iavicoli, I., Bocca, B. et al. 2007). I když koncentrace těchto kovů v životním prostředí není výrazná, postupně dochází k jejímu zvyšování. Problémem však není platina nebo platinové kovy v kovové formě, ale ionty těchto kovů. Největší problémy vyvolávají zejména chloridy, schopnost senzibilizace roste s rostoucím počtem chloridů (Ravindra, K., Bencs, L. et al. 2004), (Ek, K. H., Morrison, G. M. et al. 2004), (Pan, S. H., Zhang, G. et al. 2009). 10

11 Z důvodu obav z možných zdravotních rizik je nezbytné množství platinových kovů sledovat. Jelikož jsou rostliny první trofickou úrovní, je důležité sledovat vliv těchto kovů právě na této úrovni (Barefoot, R. R. 1997). Platinové kovy, stejně jako ostatní těžké kovy, jsou přijímány rostlinami z půdy přes kořeny nebo prostřednictvím povrchu nadzemních částí (Clemens, S. 2001). Platinové kovy mohou dále interferovat v mnoha biochemických a fyziologických procesech včetně dýchání a fotosyntézy, dusíkovém a bílkovinném metabolismu a příjmu živin, a mohou tím působit buněčné poškození, včetně poškození důležitých makromolekul a buněčných membrán tím, že indukují tvorbu oxidativního stresu tvorbou lipidových peroxidů a reaktivních forem kyslíku (Touiserkani, T. and Haddad, R. 2012) Měď (Cu) Měď je stopový prvek, který hraje zásadní roli v biochemických pochodech organismů, je důležitý při syntéze buněčné stěny, hraje roli při fotosyntéze a dýchání mitochondrií, je nezbytný pro metabolismus uhlíku a dusíku a ochranu proti oxidativnímu stresu (Hänsch, Robert and Mendel, Ralf R. 2009). Ve své neoxidované formě má mnoho využití, zejména jako surovina pro výrobu vodivých součástek pro elektrická zařízení. Kovová měď je výborným vodičem tepla, využívá se tedy i v chladicích zařízeních. Velmi často se používá ve slitinách, nejznámější je bronz (slitina mědi s cínem), ale také mosaz (Johnson, P. E., Milne, D. B. et al. 1992). Ve vysokých koncentracích je však toxická, potencionálně může katalyzovat produkci volných radikálů a případně přispívat k poškození proteinů, DNA a dalších biomolekul (Vieira, L. R., Gravato, C. et al. 2009), (Hänsch, Robert and Mendel, Ralf R. 2009). Pro lidský organismus je měď esenciálním prvkem, je důležitá zejména pro krvetvorbu a oxidačně-redukční procesy. Její nadbytek se projevuje celou škálou poruch, z nichž nejběžnější je anémie. Akutní otravy z mědi však nejsou příliš časté díky regulačním mechanismům v organismu. Oproti tomu jsou daleko více zaznamenány chronické otravy, a to díky používání měděných nádob (Linder, M. C. and HazeghAzam, M. 1996). Nekontaminované půdy obecně obsahují koncentrace mědi menší než 20 mg.kg -1, ale v některých půdách je přirozená hladina až na úrovni 100 mg.kg -1. Za fyziologických podmínek existuje měď ve dvou oxidačních stupních Cu(I) a Cu(II), mezi kterými může přecházet. Většina iontů mědi je po absorpci do organismu vychytávána pomocí biosyntetizovaných proteinů 11

12 jako je metalothionein a peptidů jako jsou fytochelatiny, aby se zabránilo hromadění toxických forem (Hänsch, Robert and Mendel, Ralf R. 2009), (Zitka, Ondrej, Merlos, Miguel-Angel et al. 2012) Fytoremediace Fytoremediace ( fyto rostlina, remediace obnova) znamená využití zelených rostlin k odstranění kontaminantů z vody, půdy a vzduchu. I přes relativní novost těchto technologií jde již o nepostradatelnou součást ekologie i agrotechniky. (Shah, K. and Nongkynrih, J. M. 2007), (McCutcheon, S. C. and Jørgensen, S. E. 2008). Technologie fytoremediace je velmi intenzivně studována, jak je zřetelné z množství odkazů na vědecké databázi Web of science. Konvenčně používané remediační technologie jsou značně finančně nákladné a technicky složité. Výhodou fytoremediace je její fungování s minimální údržbou a celkově s nižšími náklady, a to v průměru až 10 krát, ve srovnání s odbagrováním a nahrazením kontaminované půdy za půdu novou (Rascio, N. and Navari-Izzo, F. 2011), (Trakal, L., Komarek, M. et al. 2012). Některé takto získané kontaminující látky je možno recyklovat a získat tak z kontaminantu hodnotnou surovinu (Rathod, P. H., Rossiter, D. G. et al. 2013), (Meier, S., Borie, F. et al. 2012), (Chaney, R. L., Malik, M. et al. 1997), (Salt, D. E., Smith, R. D. et al. 1998). Využívá všech biologických, chemických a fyzikálních procesů, které mají souvislost s růstem a výživou vyšších rostlin (Watanabe, M. E. 1997), (Chaney, R. L., Malik, M. et al. 1997). Využití fytoremediačních technik je omezeno klimatickými a geologickými podmínkami, teplotou, nadmořskou výškou, typem půdy a v neposlední řadě i dostupností terénu pro zemědělskou techniku (Peris, M., Recatala, L. et al. 2008). Jde také o časově náročnou metodu vyžadující často několik vegetačních období. Rostliny obvykle velmi dobře akumulují jednu látku, nebo skupinu látek, ale kontaminace v reálných podmínkách bývá různorodější. Některé druhy rostlin mají velmi dobrou schopnost akumulace, ale zpravidla rostou pomalu (Raskin, I., Smith, R. D. et al. 1997). Jak již bylo uvedeno výše, vysoké koncentrace toxických kovů inhibují růst rostlin, přesto existují rostliny, které dokáží v takto nevhodných podmínkách růst a dokonce akumulovat těžké kovy. Takovéto rostliny se nazývají hyperakumulátory. 12

13 Hyperakumulátor je rostlina, která dokáže akumulovat vysoké množství ( krát vyšší než běžné rostliny) jednoho nebo více těžkých kovů,transportovat je do nadzemní části rostliny, a také vynikají vysokou mírou tolerance k těžkým kovům (Rascio, N. and Navari-Izzo, F. 2011). Rostliny nemusí kontaminující látky pouze akumulovat, ale využívají pro svoji ochranu i další mechanismy, které jsou zaznačeny na Obr. 1. Fytovolatilizace Fytodegradace Fytotransformace Fytoakumulace Fytoextrakce Fytostabilizace Těžké kovy Obr. 1 Strategie remediace Obr. 1.: Fytoremediační strategie Schématické znázornění možného osudu kontaminujících látek během fytoremediačních postupů. Kontaminující látky mohou být akumulovány, degradovány, stabilizovány, přeměněny popřípadě odpařeny. Pro danou rostlinu a látku platí jen některé z postupů, nikoli všechny Antioxidační ochrana rostlin Organismy si v průběhu evoluce vytvořili celou řadu obranných mechanismů (Cadenas, Enrique 1997). Proti působení oxidativního stresu působí různé mechanismy, a to jak preventivní, tak opravné, ale také fyzická a antioxidační ochrana. Mezi enzymatické antioxidační ochranné mechanismy patří superoxidismutáza, glutathion peroxidáza, kataláza, superoxiddismutáza, Guajakol peroxidáza, askorbát peroxidáza či glu- 13

14 tathion reduktáza (Cobbett, C. and Goldsbrough, P. 2002), (Pal, R. and Rai, J. P. N. 2010), (Valko, Marian, Leibfritz, Dieter et al. 2007). Mezi neenzymatické antioxidanty se řadí kyselina askorbová (vitamin C), α-tokoferol (vitamin E), glutathion (GSH), karotenoidy, flavonoidy a další (Valko, Marian, Leibfritz, Dieter et al. 2007). Ochranu rostlin před nepříznivými vlivy ovlivňují mimo jiné i symbiotické organismy, jako jsou například arbuskulární mykorhizní houby, které jednak usnadňují přístup živin, ale také chrání rostliny před zvýšeným příjmem například těžkých kovů (Zitka, O., Merlos, M. A. et al. 2012). Tyto arbuskulární mykorhizní houby obsazují kořenovou kůru většiny druhů rostlin a i když současných poznatků o mechanismech jejich působení není mnoho, předpokládá se, že jejich detoxikační vlastnosti zahrnují jak enzymatické, tak neenzymatické antioxidační systémy (Ferrol, N., Gonzalez- Guerrero, M. et al. 2009) Thiolové sloučeniny Thiolové sloučeniny neboli thioly (ale také thioalkoholy, thiofenoly či sirné alkoholy) jsou látky obsahující vazebnou thiolovou (sulfanylovou) skupinu SH, vázanou na alkyl nebo aromatický kruh. Jsou tedy sirnou obdobou alkoholů nebo fenolů (obsahují skupinu OH). Thioly v přírodě vznikají rozkladem sirných aminokyselin cysteinu a methioninu. Charakteristickou vlastností thiolů s malou molekulovou hmotností je jejich nepříjemný zápach. (Svoboda, J. 2005). Atom síry je podobný atomu kyslíku, je tedy na místě srovnání thiolů, které mají funkční skupinu SH, a alkoholů, které mají funkční skupinu OH. Jelikož je síra méně elektronegativní než kyslík, je S H vazba méně polární než O H vazba. Atom síry je větší než atom kyslíku, také valenční orbitaly síry jsou difúzní a tak dochází k méně efektivnímu překryvu s atomem vodíku. Proto je vodíková vazba S H méně stabilní než vodíková vazba O-H. Intracelulární thioly (zejména glutathion, cystein, fytochelatiny a další) mají klíčovou roli v buněčné antioxidační aktivitě. Zvýšení nebo snížení hladiny thiolů signalizuje nerovnováhu v redoxní homeostáze (Hyman, Lynne M. and Franz, Katherine J. 2012), (Supalkova, Veronika, Huska, Dalibor et al. 2007). 14

15 Glutathion V roce 1888 de Rey-Pailhade (J, De Rey-Pailhade 1888) objevil v kvasinkách drcených s elementární sírou látku, která je odpovědná za vytváření sirovodíku. Následně tuto látku objevil také v hovězí svalovině, hovězích játrech, ovčím mozku, jehněčím tenkém střevě, svalovině ryb, vaječném bílku, čerstvé ovčí krvi, ale také v čerstvých hlavičkách chřestu. Také zjistil, že je tato látka stabilnější v zimě než v létě, a že je narušována reakcemi s chlorem, jodem a bromem. Pro tuto látku také navrhl název philothion (z řeckého milující síru ). De Rey-Pailhade věřil, že se jedná o látku s důležitou rolí v organismu, neboť se zdála být v živých buňkách všudypřítomná. Předpokládal, že philothion obsahuje labilní vodík. Tuto myšlenku rozšířil A. Heffter, který došel k závěru, že obsahuje cystein (Meister, Alton 1989). Na mnoha živočišných tkáních byly A. Heffterem a V. Arnoldem prokázány pozitivní nitroprusidové reakce, což ukazuje na přítomnost silného redukčního činidla, za které byl považován cystein se svojí thiolovou skupinou. Heffter také předpokládal, že ty látky, které obsahují thiolovou skupinu, snižují oxidační stres buněk. F. Hopkinsovi se podařilo tuto látku izolovat za pomocí vody, ale nesprávně určil, že se jedná o dipeptid kyseliny glutamové a cysteinu. Látku přejmenoval z philothionu na glutathion (Meister, Alton 1989). V roce 1927 byla publikována práce Huntera a Eaglese, kteří stejným postupem jako Hopkins izolovali stejnou látku, ale s nižším procentuálním zastoupením síry. Ti správně určili, že se jedná o tripeptid, ale Hopkins toto tvrzení zpochybnil. Tvrdil, že látku nezískaly čistou a trval na dipeptidovém složení. Glutathion se na několik následujících let stal kontroverzním tématem. Nakonec nezávisle na sobě Hopkins a Kendallem zjistili, že kromě cysteinu a kyseliny glutamové, glutathion obsahuje i glycin (Meister, Alton 1989). 15

16 Cys Cd 2+ GSH 1 y-ecs Glu GSH GSH-S y-glu-cys Gly Fytochelatiny GSSG NADPH GSR GSH-R Oxidace Redukce NADP y-glu-cys-gly GSH DEGRADACE PCS Konjugace X GST PCS GS-X GST Cd 2+ GluT GGT GGT Hydrolýza aa - pp y-glu-aa y-glu-aa Glu+Cys-Gly Cys-Gly + y-glu-pp Obr. 2 Syntéza a degradace glutationu v rostlinách Obr. 2.: Syntéza a degradace glutathionu v rostlinách. Glutation (GluT) je syntetizován v cytosolu a chloroplastech pomocí gama-glutamylcystein syntetázy g(ecs) kódované genem GSH1 a glutation syntetázy (GSH-S) kódované genem GSH. Jako antioxidant se glutation oxiduje na GSSG. Díky působení glutation reduktázy (GSH-R) kódované genem (GSR) se GluT vyskytuje především v jeho redukované formě (GSH) a to především v cytosolu, mitochondriích a chloroplastech. GluT má schopnost detoxifikovat xenobobiotika a to díky glutation-s-transferázy (GST), která zajišťuje vazbu mezi Glu a xenobiotikem za vzniku konjugátu GS-X. GST je kódována velkým množstvím GST genů, které mohou exprimovat i Cd ionty nebo H 2 O 2. Glutation je také substrátem pro enzym fytochelatinsyntetázy (PCS), která umožňuje tvorbu fytochelatinů. Degradace GluT se uskutečňuje pomocí gama-glutamyl transpeptidázy (GGT) kódované geny GGT1-4. Hydrolýza GluT probíhá až na kyselinu glutamovou (Glu) a dipeptid cysteinylglycin (Cys-Gly). Degradace GluT přes aminokyselinový nebo peptidový receptor (aa-pp) je uskutečňována za vzniku gama-glutamylové aminokyseliny a dipetidu Cys- Gly. Obrázek upraven podle (Foyer, C. H., Theodoulou, F. L. et al. 2001). 16

17 Glutathion ( -glutamylcysteinylglycin) jako jedna z nejvýznamnějších thiolových sloučenin je přítomný jak v rostlinných, tak i v živočišných buňkách, kde má řadu důležitých funkcí. V buňkách je nejvíce zastoupen v cytosolu (1 11 mm), jádře (3 15 mm) a mitochondriích (5 11 mm) a je hlavním antioxidantem v těchto buněčných komponentech. Tvorba glutathionu je znázorněna na Obr. 2. V organismech se vyskytuje ve dvou formách, a to jako redukovaný glutathion (GSH) a oxidovaný glutathion (GSSG). (Anderson, M. E. 1998), (Ogawa, K. 2005), (Valko, M., Leibfritz, D. et al. 2007). GSH GSH H 2 O 2 2 GSSG H 2 O Obr. 3.: GSH a tvorba GSSG - Spojením dvou molekul GSH přes atom S (žlutá barva), vzniká molekula GSSG vlivem vzniku disulfidické vazby (S-S). GSSG vzniká tvorbou disulfidických můstků mezi dvěma molekulami GSH, což je Obr. 3. GSH a tvorba GSSG uvedeno na Obr. 3. Společně s GSSG vznikají dva volné atomy H +, které se zapojují do askorbát-glutathionového cyklu (Obr. 4) a přispívají k odstraňování reaktivních forem kyslíku (ROS) (Paradiso, A., Berardino, R. et al. 2008). Spojením dvou molekul GSH přes atom S (žlutá barva), vzniká molekula GSSG vlivem vzniku disulfidické skupiny (S-S). 17

18 H 2 O 2 Askorbát NAD(P) Oxidovaný gluthation NADPH Askorbát peroxidása Monodehydroaskorbát reduktasa Dehydroaskorbát reduktása Glutathion reduktasa H 2O Monohydroaskorbát NAD(P)H Redukovaný gluthation NADP Dehydroaskorbát Obr. 4.: Askorbát-glutathionový cyklus (Halliwell Asada pathway). Překresleno dle (Piterkova, J., Tomankova, K. et al. 2005) Glutathion se v organismu podílí na celé řadě buněčných procesů, včetně ochrany proti ROS a těžkým kovům, udržuje redoxní rovnováhu buněk, umožňuje detoxifikaci Obr. 3. Halliwell Asada pathway xenobiotik a je prekurzorem vzniku fytochelatinů (Obr. 5) (Seth, C. S., Remans, T. et al. 2012), (Foyer, C. H., Theodoulou, F. L. et al. 2001). Mezi další funkce patří účast na metabolismu železa, podíl na syntéze oxidu dusného (Harbrecht, B. G., DiSilvio, M. et al. 1997), ale také podpora transportu aminokyselin přes buněčnou membránu (Young, J. D., Ellory, J. C. et al. 1976). 18

19 Fytoextrakce kovů Příjem a tolerance kovu Homeostáza kovu GSH Chelatace Antioxidant Signalizace Aklimatizace Detoxikace a opravy ROS produkce NADPH oxidásy Subcelulární organely Peroxisomy Mitochondrie Chloroplasty Antioxidační ochrana Enzymy Metabolity AsA-GSH cyklus Oxidační výzva Poškození Obr. 4. fytoextrakce těžkých kovů GSH Obr. 5.: Obecný model role glutathionu (GSH) v fytoextrakci kovu. Základní předpoklad, ovlivňující příjem kovů a jejich toleranci je homeostáza. V homeostáze kovů je GSH nezbytný jako chelatační metabolit a jako substrát pro formování fytochelatinů. Figuruje také jako antioxidant důležitý pro detoxikaci kovem indukovaného oxidačního stresu. Dohromady s celým antioxidačním obranným systémem eliminuje působení reaktivních forem kyslíku (ROS), vzniklých účinkem stresu, způsobeným kovy, který může vést k poškození organismu. V tomto smyslu je GSH schopný ovlivňovat buněčné dráhy, figurující v reparaci a obranných mechanismech, které se vyrovnávají s oxidační výzvou, indukovanou přítomností kovů v rostlinách. Růst, vývoj a tudíž i produkce biomasy jsou významně ovlivňovány právě efektivitou těchto procesů. Překresleno podle (Seth, C. S., Remans, T. et al. 2012) Poměr obou forem glutathionu je považován za indikátor působení stresových faktorů (Anderson, M. E. 1998), (Ogawa, K. 2005), (Valko, M., Leibfritz, D. et al. 2007). Tento poměr je ve fyziologických podmínkách obvykle konstantní, nezávisle na celkové koncentraci glutathionu v buňce. Při působení stresových faktorů dochází k oxidaci GSH na GSSG. Míra této oxidace závisí na trvání, intenzitě a formě stresoru a také na tolerančních schopnostech buňky. V důsledku dochází k poklesu poměru GSH/GSSG. Po ukončení působení stresového faktoru dochází ke zpětné tvorbě GSH z GSSG a 19

20 k opětovnému zvyšování poměru GSH/GSSG (Noctor, G., Veljovic-Jovanovic, S. et al. 2002), (Seth, C. S., Remans, T. et al. 2012). Naopak vysoký poměr glutathionů může být indikátorem oxidativního poškození a prekurzorem onemocnění jako jsou Alzheimerova choroba, amyotrofická laterální skleróza, bronchiální astma, cukrovka, idiopatická plicní fibróza, onemocnění kardiovaskulárního systému, Parkinsonova choroba, syndrom dechové tísně, retinopatie, revmatoidní artritida, Wernerův syndrom (Dostálek, Miroslav 2007) Fytochelatiny Fytochelatiny (PCs) jsou post-translačně syntetizované thioly se základní strukturou (γ-glu-cys) n -Gly, kde n je počet opakování gama-glutamylcysteinových jednotek, a to 2-11, ale obvykle 2-5 (Cobbett, C. S. 2000), (Kondo, Naoto, Imai, Kunio et al. 1984), (Grill, E., Winnacker, E. L. et al. 1985), (Grill, E., Loffler, S. et al. 1989), (Rea, Philip A. 2012). Poprvé byly fytochelatiny popsány v kvasince Schizosaccharomyces pombe, konkrétně PC2 a PC3, kdy byly publikovány pod názvem cadystin A a B, podle výskytu komplexu kadmia a cysteinu (Kondo, Naoto, Imai, Kunio et al. 1984). Tento název však byl zpochybněn, jelikož nebyl předpoklad, že by tento krátký peptid byl omezen pouze na kvasinky či kadmium (Zenk, M. H. 1996). Následně byl také prokázán i v rostlinách (Grill, E., Winnacker, E. L. et al. 1985), (Vernoux, T., Wilson, R. C. et al. 2000) a řasách (Hanikenne, M. 2003). Tyto thioly byly tedy pojmenovány dnes používaným názvem fytochelatiny. Obr. 6.: Struktura fytochelatinu I přesto, že je molekula fytochelatinů většinou ukončena aminokyselinou glycinem (Gly), existují i strukturní analogy, přítomné v určitých organismech, které mají místo glycinu (Gly) přítomnou jinou aminokyselinu jako je třeba β-alanin (Ala), serin (Ser), kyselina 20

21 glutamová (Glu), glutamin (Gln) (Kawakami, S. K., Gledhill, M. et al. 2006), (Cobbett, C. S. 2000), (Rauser, W. E. 2003), (Kubota, H., Sato, K. et al. 2000), nebo nepřítomností terminálního glycinu (Zenk, M. H. 1996) Fytochelatinsyntáza Je na kovu závislý trans-peptidový, rozpustný enzym se systematickým názvem - Glu-Cys dipeptidyl transpeptidáza (EC ), zkráceně PCS (Obr. 7) (Grill, E., Loffler, S. et al. 1989). Některé kovy indukují produkci fytochelatinů, a v přítomnosti substrátu reakce (GSH) katalyzuje fytytochelatinsyntáza biosyntézu fytochelatinů (Dai, Q. L., Huang, B. F. et al. 2010). PCS pro svoji činnost vyžaduje ionty kovů. O které konkrétní kovy se jedná, bylo popsáno díky in vivo a in vitro experimentům, jsou to podle míry indukce produkce zejména Cd 2+ > Pb 2+ > Zn 2+ > Sb 3+ >Ag + > Hg 2+ >As 5- > Cu + > Sn 2+ > Au 3+ > Bi 3+ (Zenk, M. H. 1996), (Grill, E., Winnacker, E. L. et al. 1987), (Simmons, D. B. D., Hayward, A. R. et al. 2009). Oproti tomu nejspíš Ni, Te, W a Se ionty neaktivují PCS vůbec, nebo tak málo, že nejsme tuto aktivitu schopni detekovat (Zenk, M. H. 1996). Substrát -glu-cys-gly -glu-cys-gly GSH Produkt PC2 -glu-cys-gly ( -glu-cys) n=2 -gly gly Fytochelatin syntáza PC3 PC4 PC5 -glu-cys-gly -glu-cys-gly ( -glu-cys) n=3 -gly ( -glu-cys) n=4 -gly ( -glu-cys) n=5 -gly gly gly gly Obr. 7.: Struktura PCS a tvorba PC z prekurzorové molekuly GSH (Struktura PCS převzata z 21 Obr. 6. Struktura PCS a tvorba PC Překreslit

22 Detoxifikace kovů pomocí fytochelatinů Fytochelatiny interagují s těžkými kovy prostřednictvím thiolových skupin (-SH), které jsou obsaženy ve struktuře cysteinu (Pal, R. and Rai, J. P. N. 2010). S rostoucí koncentrací intracelulárního kovu, který indukuje zvýšení vazebné stability M- fytochelatin (M iont kovu) komplexu, roste i stupeň polymerace ve struktuře fytochelatinu (Padmavathiamma, P. K. and Li, L. Y. 2007). Vytvoření komplexu M- fytochelatin souvisí s dostupností ligandů, kinetikou vznikajícího komplexu a sterickými faktory. Strukturní model komplexu Cd-fytochelatiny ukazuje, že vazebná stechiometrie atomů síry může být buď z jedné nebo více molekul fytochelatinu (4 až 1), a vytváří tak amorfní komplexy (Obr. 8) (Cobbett, C. S. 2000). S PC S S PC S Cd 2+ Cd 2+ S PC S S PC S S PC S Cd 2+ Cd2+ S PC S Cd 2+ S PC S S PC S Cd 2+ S PC S Obr. 8.: Interakce fytochelatinů s kademnatými ionty. Fytochelatiny váží Cd 2+ pomocí SH skupin aminokyseliny cysteinu. Obr. 7. Interakce PCs s kademnatými ionty. Na kovové toleranci rostlin se podílí schopnost tvorby M-fytochelatin komplexů (Sun, R. L., Jin, C. X. et al. 2010). Tento M-fytochelatin komplex je označován jako 22

23 LMW (nízkomolekulární komplex low molecular weight). Následně jsou tyto komplexy pomocí transportérů transportovány do vakuoly, kde se z jednotlivých LMW komplexů přes S-S tvoří HMW komplexy (vysokomolekulární komplex - high molecular weight). Pro přenos je nutno vynaložit energii rozložením ATP. HMW díky své velikosti pravděpodobně není schopen překonat tonoplast vakuoly (Mohanpuria, P., Rana, N. K. et al. 2008), (Ortiz, D. F., Ruscitti, T. et al. 1995), (Rauser, W. E. 2003), (Najmanova, J., Neumannova, E. et al. 2012), (Supalkova, Veronika, Huska, Dalibor et al. 2007) 2.5. Metody detekce thiolových sloučenin Aktivita PCS v buňkách, které byly vystaveny působení těžkých kovů, může být studována přes stanovení nasyntetizovaných fytochelatinů celou řadou metod od elektrochemických, které lze považovat za velmi citlivé a ve spojení s vhodnou separační technikou jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (Diopan, V., Shestivska, V. et al. 2010), (Zitka, O., Najmanova, J. et al. 2010), (Zitka, O., Krystofova, O. et al. 2011), (Zitka, O., Skutkova, H. et al. 2011), (Zitka, O., Krystofova, O. et al. 2010), (Zehnalek, J., Adam, V. et al. 2004), (Zehnalek, J., Vacek, J. et al. 2004), (Petrlova, J., Mikelova, R. et al. 2006), (Potesil, D., Petrlova, J. et al. 2005), (Vignaud, C., Rakotozafy, L. et al. 2004), (Minocha, R., Thangavel, P. et al. 2008), (Bramanti, E., Toncelli, D. et al. 2006), (Elviri, L., Speroni, F. et al. 2010), (Sadi, B. B. M., Vonderheide, A. P. et al. 2008), (Zitka, O., Najmanova, J. et al. 2010), (Shestivska, V., Krizkova, S. et al. 2010), kapilární elektroforéza (Fanguy, J. C. and Henry, C. S. 2002), (Minami, T., Ichida, S. et al. 2002) a nebo kapilární kapalinová chromatografie (Deng, Q., Kauri, L. M. et al. 2003), jsou rovněž selektivní. Mezi další metody stanovení fytochelatinů a dalších příbuzných thiolových sloučenin patří HPLC na reverzní fázi s post-kolonovou derivatizací Elmanovým činidlem a následnou UV-vis detekcí, anebo s derivatizací monobromobimanem, která se však provádí před samotnou analýzou (Sneller, F. E. C., van Heerwaarden, L. M. et al. 2000). Další variantou pro stanovení je hmotnostní detekce (ESI-MS) a tandemová hmotnostní spektrometrie (ESI-MS/MS) (Ranieri, Annamaria, Castagna, Antonella et al. 2005). 23

24 3. PRAKTICKÁ ČÁST 3.1. Materiály Chemikálie Standard oxidovaného a redukovaného glutathionu, cysteinu i standardy redukčních činidel byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Standardy fytochelatinů (PC2, PC3, PC4 a PC5) byly zakoupeny od firmy Clonestar (Brno, Česká republika). K přípravě standardních roztoků byla použita voda ACS čistoty (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) Vzorky Suspenzní kultura a její příprava Suspenzní kultura Nicotiana tabacum cv. BY-2 byla kultivována podle Nagata et al (Nagata, T., Nemoto, Y. et al. 1992) v médiu Murashige and Skoog (MS medium Micro and Macro elements, Duchefa, Holandsko) s přídavkem sacharózy (30 g.l -1 ), KH 2 PO 4 (0,2 g.l -1 ), thiaminu (1 mg.l -1 ) a 2,4-dichlorofenoxyoctové kyseliny (0,2 mg.l -1 ) (vše z Duchefa, Testováno na rostlinách, Holandsko). Suspenzní kultury o objemu 20 ml byly kultivovány v 50 ml Erlenmayerových baňkách při 27 C a třepání na 135 rpm (ES-20, Biosan, Lotyšsko). Subkultivace kultury probíhala tak, že po 3 a 4 dnech byly přeneseny 1 až 2 ml suspenzní kultury do čerstvého media o celkovém objemu 20 ml Kukuřice (Zea mays L.) a hrách (Pisum sativum L.) vliv platiny Semena kukuřice (Zea mays L.) a hrachu (Pisum sativum L.) byly vystaveny koncentračním dávkám PtCl 4 0, 5, 10, 25, 50 a 100 µm. Pro každou koncentraci bylo použito 100 semen a experimenty byly prováděny ve třech opakováních. Klíčící destičky byly umístěny v kultivačních boxech o objemu 500 ml. Finální objem aplikovaného roztoku 24

25 byl 300 ml. Klíčení probíhalo v temnu při teplotě 25±1 C a vzdušné vlhkosti 60±5 %. Vzorky byly odebrány přesně po 8 a 12 dnech Kukuřice (Zea mays L.) - vliv mědi Semena kukuřice (Zea mays L.) dvou kultivarů (kultivar 1 a kultivar 2) byla povrchově sterilizována a zaseta do mokrého vermikulitu, který byl autoklávován při 121 C po dobu 30 minut. Sazeničky byly přemístěny do nádob se sterilní směsí půdy/písku (1/3, v/v). Půda byla získána od firmy Sierra Nevada (Granada, Španělsko), proseta přes síta s oky o velikosti 2 mm, sterilována tyndalizací po dobu tří po sobě jdoucích dnů a sušena na vzduchu. Písek byl sterilizován v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 30 minut. Půda měla charakteristiky: ph 6,58; organická hmota 10,84 %, celkový N 0,45 %, celkový P 0,03 %, Ca 0,38 %, K 0,42 % a celková Cu 65,58 ppm. Soubor experimentálních rostlin byl rozdělen do dvou hlavních skupin, a to 1. rostlinky kukuřice bez mykorhizní houby a 2. rostlinky kukuřice inkubované s arbuskulární mykorhizní houbou Glomus intraradices (DAOM , Smith & Schenck Biosystematic Research Center, Ottawa, Kanada). Rostliny byly pěstovány ve skleníku (16 h fotoperioda, teplota den/noc 25/18 C, relativní vlhkost vzduchu 60 %) a zalévány třikrát týdně 30 ml Hoaglandovým živným roztokem s obsahem Cu(II). Rostliny byly sklizeny 9 týdnů po očkování. Kořeny a nadzemní části všech rostlin byly zmrazeny působením tekutého dusíku a skladovány při -80 C až do analýzy Přístrojové vybavení Při přípravě pufrů byly ph hodnoty měřeny pomocí přístroje InoLab ph 730 WTW (Weilheim, Germany). Centrifugace probíhala pomocí centrifugy Eppendorf 5804 (USA) Metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí HPLC-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA (ESA Inc., Chelmsford, MA) (pracovní rozsah 0,001-9,999 ml.min -1 ) a chromatografic- 25

26 ké kolony s reverzní fází Zorbax eclipse AAA C18 (150 4,6; 3,5 µm velikost částic, Agilent Technologies, USA) a dvanácti-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA), který byl složen ze tří průtočných analytických komůrek (Model 6210, ESA, USA). Každá komůrka obsahovala čtyři analytické cely. Jedna analytická cela obsahovala dvě referenční (hydrogen paladiové), dvě pomocné a jednu porézní grafitovou pracovní elektrodu. Elektrochemický detektor byl uložen v řídícím modulu, jehož celý prostor byl termostatován. Vzorek (20 µl) byl injektován automaticky pomocí autosampleru (Model 542, ESA, USA), který měl v sobě zabudován i termostatovaný prostor pro kolonu. Vzorky byly během analýzy uchovány v karuselu při teplotě 8 C. Jako mobilní fáze byly použity A: kyselina trifluorooctová (80 mm) a B: 100% metanol. Pro stanovení byla použita gradientová eluce 0 1 min (3 % B), 1 12 min (20 % B), min (98 % B), min (98 % B), min (3 % B) (Diopan, V., Stejskal, K. et al. 2010), (Petrlova, J., Mikelova, R. et al. 2006), (Potesil, D., Petrlova, J. et al. 2005). Schéma zapojení HPLC-ED je uvedeno na obr. 9. Kontrola Data Kontrolní module Coul Array Coulometrická cela 6210 Vstup Pracovní electroda: Výstup Frita Pomocná electroda Referenční electroda A B Chromatografické pumpy Chromatografická Regulátor Autosampler kolona C-18 pulsů Odpad Obr. 8 Schéma HPLC-ED Obr. 9.: Schéma zapojení HPLC-ED 26

27 Mikrovlnný rozklad Stanovení kadmia Buňky BY-2 (průměrná navážka 0,2 g) byly promyty 0,1 M etylen diamin tetraoctovou kyselinou (EDTA) a pak rozloženy pomocí mikrovlnného zařízení Multiwave 3000 (Anton Paar, Německo). Byl použit tříkrokový rozkladný postup ((i) 120 s, 250 W; (ii) 120 s, 0 W (120 C); (iii) 10 min 250 W (180 C)) s přídavkem 5 ml 35% HNO 3 a 3 ml vody. Čirý roztok byl kvantitativně převeden do nádoby a zředěn vodou na 8 ml Stanovení platiny Kořeny a nadzemní části kukuřice a hrachu byly sušeny v termostatu (UNB 300, Memmert, Německo) při 45 C po dobu 24 hodin. 100 mg takto připravených vzorků bylo naváženo do skleněných vialek MG5 se 700 µl kyseliny dusičné (60%, w/w) a 300 µl peroxidu vodíku (30%, v/v). Připravené vzorky byly uzavřeny a umístěny do rotoru 64MG5 a rozloženy pomocí mikrovlnného zařízení Multiwave 3000 (Anton-Paar, Německo) za následujících podmínek: výkon 150 W 10 min, výkon W 20 min., chladicí výkon 0 W 10 min. Pro elektrochemické stanovení bylo použito 15 µl mineralizovaného vzorku a 985 µl 0,2 M acetátového pufru o ph 5 (Hynek, D., Prasek, J. et al. 2011), (Majzlik, P., Strasky, A. et al. 2011) Stanovení mědi Do skleněných vialek MG5 bylo naváženo 10 mg vzorků a přidáno 700 µl kyseliny dusičné (60%, w/w) a 300 µl peroxidu vodíku (30%, v/v). Připravené vzorky byly uzavřeny a umístěny do rotoru 64MG5 a rozloženy pomocí mikrovlnného zařízení Multiwave 3000 (Anton-Paar, Německo) za následujících podmínek: výkon 150 W 10 min, výkon W 20 min., chladicí výkon 0 W 10 min. Pro elektrochemické stanovení bylo použité 100 µl mineralizovaného vzorku a 900 µl 0,2 M acetátového pufru o ph 5. 27

28 Elektrochemické stanovení kovů Stanovení kadmia Elektrochemická analýza byla provedena pomocí 747 VA Stand ve spojení s 746 VA Trace Analyzer a 695 Autosamplerem (Metrohm, Švýcarsko), za použití standardní cely s tříelektrodovým zapojením a chlazeným karuselem (4 C) pro vzorky. Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s povrchem kapky 0,4 mm 2 byla použita jako pracovní. Referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl elektroda a jako pomocná elektroda byla použita elektroda ze skelného uhlíku. Program GPES verze 4.9 dodaný firmou EcoChemie (Holandsko) byl použit pro ovládání celého systému. Acetátový pufr (0,2 M CH 3 COOH + 0,2 M CH 3 COONa) byl použit jako základní elektrolyt. Měření se provádělo při laboratorní teplotě. Vzorky byly před měřením pročištěny argonem (99,999%) nasyceným ve vodě po dobu 10 minut. Koncentrace kadmia byla měřena pomocí diferenční pulsní voltametrie. Anodické skenování bylo inicializováno na -0,7 V a zastaveno na -0,4 V. Kadmium bylo vylučováno na HMDE při potenciálu -0,7 V a dobou akumulace 120 s. Roztok byl během depozice míchán (1450 rpm). Ostatní parametry metody byly: modulační čas 0,02 s, časový interval 0,1 s, potenciálový krok 1,05 mv, rychlost snímání 10,5 mvs -1, modulační amplituda 49,5 mv (Krystofova, O., Trnkova, L. et al. 2010), (Klejdus, B., Zehnalek, J. et al. 2004) Stanovení platiny Stanovení platiny bylo provedeno pomocí 797 VA Computrace ve spojení s 813 Autosamplerem (Metrohm, Švýcarsko), za použití standardní cely s tříelektrodovým zapojením a chlazeným karuselem (4 C) pro vzorky. Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s povrchem kapky 0,4 mm 2 byla použita jako pracovní. Referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl elektroda a jako pomocná elektroda byla použita elektroda ze skelného uhlíku. Pro zpracování dat byl použit program 797 VA Computrace software (Metrohm, Švýcarsko). Software 4.9 dodaný firmou Metrohm byl použit pro základní korekce. Vzorky byly před měřením pročištěny argonem (99,999%) nasyceným ve vodě po dobu 120 s. Koncentrace platiny byla měřena pomocí adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie v přítomnosti 2 ml 0,36 M roztoku kyseliny sírové, obsahující 28

29 0,24 ml hydrazinu (10 mm) a 0,01 ml formaldehydu (37% vodný roztok). Po 2 min čištění vzorku byl Pt(II)-formazone-komplex, který je tvořen v roztoku elektrolytu, akumulován po dobu 15 s na visící kapkové rtuťové elektrodě (HMDE) (0 V vs. Ag/AgCl), s mícháním. Analyzovaný potenciálový rozsah byl -0,5 až -1,2 V při potenciálovém kroku10 mv.s -1. Objem vstřikovaného vzorku byl 20 µl, objem měřící buňky 2 ml (20 µl vzorku µl elektrolytu). Ostatní parametry metody byly: čas modulace 0,057 s, časový interval 0,1 s, potenciálový krok 1,95 mv, rychlost snímání 10 mv.s - 1, modulační amplituda 49,5 mv Stanovení mědi Stanovení mědi bylo provedeno pomocí 797 VA Computrace ve spojení s 813 Autosamplerem (Metrohm, Švýcarsko), za použití standardní cely s tříelektrodovým zapojením a chlazeným karuselem (4 C) pro vzorky. Visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s povrchem kapky 0,4 mm 2 byla použita jako pracovní. Referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl elektroda a jako pomocná elektroda byla použita elektroda platinová. Pro zpracování dat byl použit program 797 VA Computrace software (Metrohm, Švýcarsko). Software 4.9 dodaný firmou Metrohm byl použit pro základní korekce. Vzorky byly před měřením pročištěny argonem (99,999%) nasyceným ve vodě po dobu 120 s. Množství vzorku (500 μl) bylo doplněno 1500 μl acetátového pufru ph 5 (0,2 M CH 3 COOH + 0,2 M CH 3 COONa). Celkový objem měřící cely byl 2 ml. Parametry elektrochemického stanovení byly: potenciálový rozsah od -1,3V do + 0,2V, potenciálový krok 0,005 V, doba akumulace 120 s; potenciál akumulace -1,15, probublávání vzorku argonem 90 s, čas ekvilibrace 5 s Stanovení esterázové aktivity Kultivační medium bylo z tabákových BY-2 buněk odstraněno centrifugací (360 g, 5 min, 20 C, (Eppendorf 5804, USA). Buňky byly následně dvakrát promyty 50 mm fosfátovým pufrem (ph 8,7) µg promytých buněk bylo smíseno s extrakčním pufrem (250 mm fosforečnan draselný ph 8,7 na konečný objem 1 ml a byly homogenizovány pomocí homogenizátoru (Schuett-Biotec GmbH, Götingen, Německo) po dobu 2 minut. Redoxní stav získaného roztoku byl udržován přídavkem 1 mm tris(2- karboxyethylfosfinu) (TCEP). Homogenizované vzorky byly dále rozrušovány pomocí 29

30 ultrazvukového homogenizátoru (Sonoplus mini 20, Bandelin, Německo) po dobu 2 minut. Homogenát byl centrifugován po dobu 15 min, g, 4 C (Eppendorf 5417R, USA). Alikvoty 5 µl supernatantu byly smíseny s fosfáto-draseným pufrem o objemu 995 µl (1 M, ph 8,75). Reakce byla nastartována přidáním fluorescein diacetátu (FDA) o koncentraci 5 M. Konečný objem reakční směsi byl 1 ml. Jako slepý vzorek byl použit extrakční pufr. Po inkubaci v termomixeru (Thermomixer comfort 1,5ml, Eppendorf, USA) po dobu 15 min, při 45 C byly alikvoty reakční směsi (5 µl) přidány k fosfáto-drasenému pufru (ph 8,7, 1995 µl). U vzorků byla změřena fluorescence (λ excitation 490 nm a λ emission 514 nm). Zásobní roztok FDA byl připraven v acetonu. Množství acetonu v reakční směsi nebylo vyšší než 1 % (v/v). Esterázová aktivita v mezinárodních jednotkách (IU, 1IU = jeden mikromol fluoresceinu uvolněný za minutu, při stanovených podmínkách) byla přepočítána na relativní jednotky (100 % představuje nejvyšší naměřenou aktivitu) (Vitecek, J., Adam, V. et al. 2004), (Vitecek, J., Petrlova, J. et al. 2007) Příprava buněk pro analýzu Buňky tabáku linie BY-2 byly pěstovány 1 den v živném médiu s přídavky kadmia (0, 5, 10, 25, 50, 100 µm) kadmia (Cd(NO 3 ) 2 ). Kultivace pokračovala další tři dny při 27 C a třepání na 135 rpm. Z každé koncentrační varianty (celkem 5) bylo odebráno 10 ml živného média s obsahem narostlých BY-2 buněk. Tyto buňky byly centrifugovány (Eppendorf 5804, USA) při 2000 g, 24 C po dobu 20 min. Po vyjmutí z centrifugy bylo provedeno odstranění supernatantu a peleta byla promyta 20 mm fosfátovým pufrem o ph 7,5. Následovala opětovná centrifugace (20 min, 2000 rpm, 4 C). Promývací roztok byl stejně jako v předešlém kroku odebrán. Následovalo opětovné promývání fosfátovým pufrem (ph 7,5) a centrifugace (20 min, 2000 rpm, 4 C). Po centrifugaci byl odstraněn supernatant a bylo odebráno 200 µg buněk, které byly přesunuty do třecí misky. Buňky v třecí misce byly rozrušeny působením tekutého dusíku (nalití tekutého dusíku k buňkám v třecí misce a tření tloučkem po dobu přibližně 2 minut) a následně homogenizovány s 800 µl 20 mm fosfátového pufru (ph 7,5) s 1 mm tris(2- karboxyetyl)fosfinem (TCEP). Následně byly homogenáty centrifugovány (16400 g, 20 min, 4 C). Supernatanty byly dále analyzovány. Postup přípravy buněk je uveden na obr

31 N 2 (l) Fosfátový pufr s TCEP Sklizené buňky BY-2 Homogenizace Centrifugace Supernatant Obr. 10.: Schéma přípravy buněk sklizené buňky BY-2 byly rozrušeny v třecí misce působením tekutého dusíku. Poté došlo k přidání fosfátového pufru s redukčním činidlem. Tento homogenát byl přemístěn do mikrozkumavky a centrifugován. Obr. 9. Schéma přípravy buněk K analýzám byl dále používán supernatant Příprava kukuřice (Zea mays L.) a hrachu (Pisum sativum L.) pro hodnocení toxicity platiny(iv) Čerstvý rostlinný materiál získaný z kořenů a nadzemních částí kukuřice a hrachu (0,005 g) byl v třecí misce rozrušen působením tekutého dusíku. Následně bylo přidáno 250 µl 20 mm fosfátového pufru o ph 7,5 s 1 mm tris(2-karboxyetyl)fosfinem (TCEP). Vzniklé homogenáty byly centrifugovány ( g, 20 min, 4 C). Supernatanty byly rozděleny na dva alikvoty (kontrola a reakční směs). Kontrola byla připravena přidáním 50 µl 20 mm fosfátového pufru o ph 7,5 s 1 mm TCEP k 50 µl suprenatantu, reakční směs byla připravena přidáním 50 µl 5 mm GSH ve 20 mm fosfátovém pufru o ph 7,5 s 1 mm TCEP k 50 µl supernatantu, pro aktivaci enzymové reakce bylo k reakční směsi navíc přidáno 0,5 µl CdCl 2 (10 mm). Všechny varianty byly inkubovány při teplotě 35 C a 300 rpm (Thermomixer comfort 1,5 ml, Eppendorf, USA). Následovalo přidání 2 µl 5 mm 5-sulfosalicylové kyseliny, pomocí které došlo k zastavení enzymové reakce. Po přepipetování roztoků do jednotlivých vialek, které byly následně naskládány do autosampleru s chlazením na 8 C, bylo přistoupeno k analýze na HPLC-ED. Množství nasyntetizované PC2 koreluje s aktivitou PCS (Zitka, O., Skutkova, H. et al. 2011), (Zitka, O., Krystofova, O. et al. 2011). 31

32 Příprava kukuřice (Zea mays L.) pro hodnocení vlivu mědi Rostlinný materiál získaný z kořenů a nadzemních částí kukuřice (5 mg) byl v třecí misce rozrušen působením tekutého dusíku. Následně bylo přidáno 250 µl 20 mm fosfátového pufru o ph 7,5 s 1 mm tris(2-karboxyetyl)fosfinem (TCEP). Vzniklé homogenáty byly centrifugovány (16400 g, 20 min, 4 C). Supernatanty byly rozděleny na dva alikvoty (kontrola a reakční směs). Kontrola byla připravena přidáním 50 µl 20 mm fosfátového pufru o ph 7,5 s 1 mm TCEP k 50 µl supernatantu, reakční směs byla připravena přidáním 50 µl 5 mm GSH ve 20 mm fosfátovém pufru o ph 7,5 s 1 mm TCEP k 50 µl supernatantu, pro aktivaci enzymové reakce bylo k reakční směsi navíc přidáno 0,5 µl CdCl 2 (10 mm). Všechny varianty byly inkubovány při teplotě 35 C a 300 rpm (Thermomixer comfort 1,5ml, Eppendorf, USA). Následovalo přidání 2 µl 5 mm 5-sulfosalicylové kyseliny, pomocí které došlo k zastavení enzymové reakce. Po přepipetování roztoků do jednotlivých vialek, které byly následně naskládány do autosampleru s chlazením na 8 C, bylo přistoupeno k analýze na HPLC-ED. Množství nasyntetizované PC2 koreluje s aktivitou PCS. 32

33 GSSG PC 2 Výška píku (µa) Součet ploch píků (µc) GSH 3.3. Optimalizace stanovení PCS Kalibrace Kalibrace byla připravena pro PC2 a pro GSH a GSSG. Proložení záznamů a kalibrační křivky jsou uvedeny na (Obr. 11). Z této kalibrace je patrné, že se zvyšující se koncentrací thiolů se zvyšuje i intenzita signálu. Kalibrační křivky byly lineární v rozmezí 0, µg.ml -1 (GSH), 0,2-100 µg.ml -1 (GSSG) a 0,1-100 µg.ml -1 (PC2). Rozsah kalibrace zahrnuje koncentrace cílových molekul v reálném množství v buňkách, tyto hodnoty jsou srovnatelné s Diopan, et al (Diopan, V., Shestivska, V. et al. 2010). Kromě toho je detekční limit thiolů stanoven pro GSH na 6 nm, GSSG na 26 nm a u PC2 na 17 nm. V porovnání s podobnou metodou (Diopan, V., Shestivska, V. et al. 2010) dosahujeme nižších hodnot. Další analytické parametry jsou uvedeny v (Tab. 1). A B GSH GSSG PC 2 R² = R² = µg/ml 50 µg/ml 25 µg/ml 12.5 µg/ml 6.25 µg/ml 3.12 µg/ml 1.56 µg/ml 0.78 µg/ml 0.39 µg/ml 0.19 µg/ml µg/ml µg/ml R² = Koncentrace (µg/ml) Retenční čas (min) Obr. 11.: (A) HPLC-ED záznamy GSH, GSSG a PC2 při aplikovaném potenciálu 900 mv. Proložení chromatogramů kalibrační řady. (B) Závislost plochy HPLC-ED signálů GSH, GSSG a PC2 v závislosti na koncentraci. Podrobnosti analytického stanovení jsou popsány v části Materiály a metody. Obr. 10. kalibrace 33

34 Aktivita PCS (fkat) Celková aktivita PCS (fkat) Koncentrace substrátu GSH Přidáním substrátu enzymové reakce (GSH o koncentracích 5; 2,5; 1; 0,5; 0,3; 0,1; 0,05; 0 mm ve fosfátovém pufru (20 mm, ph 7,5) s 1 mm TCEP) a kovu pro aktivaci enzymu (50 µm CdCl 2 ) k supernatantu, byla připravena reakční směs vzorku. Souběžně s touto reakční směsí byl zhotoven kontrolní vzorek přidáním 20 mm fosfátového pufru o ph 7,5 s 1 mm TCEP k supernatantu. Takto nachystané vzorky byly 30 minut inkubovány při teplotě 35 C (Thermomixer comfort 1,5ml, Eppendorf, USA), následně byly přidány 4 µl 30% 5-sulfosalicylové kyseliny, čímž byla enzymová reakce zastavena. Supernatant byl vždy přefiltrován pomocí membránového filtru (0,45 μm, Millipore, Billerica, Mass., USA). Vzniklý PC2 byl detekován pomocí optimalizované metody HPLC-ED. Po vyhodnocení ploch píku získaných pomocí analýzy HPLC-ED byly tyto hodnoty přepočteny pomocí kalibrační křivky. Jak je vidět na (Obr. 12A) hodnoty nasyntetizované PC2 se s koncentrací substrátu enzymové reakce zvyšují. Pro další optimalizace byla tedy zvolena koncentrace GSH 5 mm. A 160 B min 30 min 45 min Koncentrace GSH (mm) PCS Activity 15 min 30 min 45 min Doba inkubace Obr. 12.: (A) Vliv doby inkubace buněčného extraktu z BY-2 buněk s CdCl 2 (50 µm) a substrátem enzymové reakce (GSH 0,1, 0,5, 1 a 5 mm) na aktivitu PCS. (B) Hodnoty rovnic lineární regrese získaných z předchozího grafu A. 34

35 Doba inkubace Přidáním substrátu enzymové reakce (GSH 5 mm ve fosfátovém pufru (20 mm, ph 7,5) s 1 mm TCEP) a kovu pro aktivaci enzymu (50 µm CdCl 2 ) k supernatantu byla připravena reakční směs vzorku. Souběžně s touto reakční směsí byl přidáním 20 mm fosfátového pufru (ph 7,5) s 1 mm TCEP k supernatantu a zhotoven kontrolní vzorek. Takto nachystané vzorky byly inkubovány při teplotě 35 C po dobu 15, 30 a 45 minut v termomixeru (Thermomixer comfort 1,5ml, Eppendorf, USA) a následně k nim byly přidány 4 µl 30% 5-sulfosalicylové kyseliny, čímž byla enzymová reakce ukončena. Supernatant byl vždy přefiltrován pomocí membránového filtru (0,45 μm, Millipore, Billerica, Mass., USA). PC2 byl detekován pomocí optimalizované metody HPLC-ED. Po vyhodnocení ploch píku získaných pomocí analýzy HPLC-ED byly tyto hodnoty přepočteny pomocí kalibrační křivky. Jak je vidět na (Obr. 12B) aktivita fytochelatinsyntázy má vzrůstající trend s delší dobou inkubace. Pro další analýzy byla tedy zvolena doba inkubace 30 minut z důvodu zanedbatelného rozdílu mezi časy 30 a 45 minut. Z praktického důvodu je vhodnější kratší doba inkubace. 35

36 3.4. Výsledky Vlastní stanovení aktivity PCS Reakční směs byla připravena přidáním substrátu enzymové reakce (GSH o koncentracích 0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5 a 5 mm ve fosfátovém pufru (20 mm, ph 7,5) s 1 mm TCEP) a kovu pro aktivaci enzymu (50 µm CdCl 2 ) k supernatantu získaného ze vzorku buněk. Souběžně byl přidáním 20 mm fosfátového pufru (ph 7,5) s 1 mm TCEP k supernatantu zhotoven kontrolní vzorek. Takto nachystané vzorky byly inkubovány v termomixeru při teplotě 35 C po dobu 30 minut 300 rpm (Thermomixer comfort 1,5ml, Eppendorf, USA) a následně k nim byly přidány 4 µl 30% 5-sulfosalicylové kyseliny, čímž byla enzymová reakce ukončena. PC2 byl detekován pomocí optimalizované metody HPLC-ED. Množství PC2 nasyntetizovaného během inkubace, odpovídá aktivitě enzymu. Metoda vykazuje 98% návratnost. Návratnost byla vypočítána metodou standardního přídavku, při které bylo k vzorku buněčného extraktu přidáno 50, 100 a 500 ng.ml -1 standardu PC2. Výsledky jsou uvedeny v (Tab. 2). Opakovatelnost metody byla okolo 105 % (Tab. 3). 36

37 Tabulka 1. Analytické parametry HPLC-ED pro detekci redukovaného (GSH) a oxidovaného (GSSG) glutathionu a fytochelatinu2 (PC2). Sloučeniny 1 Retenční čas Rovnice regrese Lineární dynamiký rozsah Lineární dynamiký rozsah R 2, 2 LOD 3 LOD LOD (fmol) LOQ 4 LOQ LOQ (nmol) RSD 5 (µm) (µg.ml -1 ) (nm) (ng.ml -1 ) na nástřik (nm) (ng.ml -1 ) na nástřik (%) GSH 5,13 y = 10,71x 0,154 0, , , ,2 GSSG 9,26 y = 1,187x 0,106 0, , , ,8 PC 2 10,66 y = 2,028x 0,021 0, , , ,3 1 studie thiolových sloučenin. 2 regresní koeficient. 3 limit detekce detektoru (3 S/N). 4 limit kvantifikace detektoru (10 S/N). 5 relativní směrodatná odchylka. Tabulka 2. Návratnost analýzy PC 2 ze vzorku suspenzních tabákových BY-2 buněk (n = 5). Sloučeniny Standartní přídavek Buněčný extrakt Buněčný extrakt + standardní přídavek Návratnost (ng.ml -1 ) (ng.ml -1 ) (ng.ml -1 ) (%) 500 ± ± ± PC2 100 ± ± ± ± ± ± Tabulka 3. Vnitro- a mezi-denní přesnost a správnost chromatografické metody. Sloučeniny PC2 Vnitro-denní Mezi-denní Přídavek Návratnost Návratnost (n=8) (n=3) (%) (%) (µg.ml -1 ) C.V. (%) C.V. (%) 10 7, , , , , ,

38 Stanovení obsahu kadmia v buněčné kultuře Pro analýzu kadmia byly použity buňky připravené dle kapitoly Na obrázku (Obr. 13A) jsou porovnány získané výsledky analýz. Je zde patrné, že koncentrace kademnatých iontů se v buňkách zvyšuje jak s koncentrací kadmia v živné půdě, tak s dobou expozice Stanovení esterázové aktivity Pro stanovení esterázové aktivity byly použity buňky připravené dle kapitoly Z výsledků vyplývá (Obr. 13B), že kadmium mělo nepříznivý vliv na růst buněk, který se zesiloval s dobou expozice. Se zvyšující se koncentrací kadmia v živné půdě, se zvyšoval i inhibiční efekt. A Koncentrace kadmia (µm) µm Cd(II) 5 µm Cd(II) 10 µm Cd(II) 25 µm Cd(II) 50 µm Cd(II) 100 µm Cd(II) Doba kultivace (dny) B 120 Relativní esterázová aktivita (%) µm Cd(II) 5 µm Cd(II) 10 µm Cd(II) 25 µm Cd(II) 50 µm Cd(II) 100 µm Cd(II) Doba kultivace (dny) Obr. 13.: (A) Vliv času kultivace buněk na celkový obsah kadmia, který byl v buňkách stanoven pomocí metody DPV (podle kapitoly 2.6). (B) Stanovená esterázová aktivita v průběhu třídenní kultivace (podle kapitoly 2.7). 38

39 PC 2 syntetizované PCS Aktivita PCS (fkat) Výška píku (µa) Celková aktivita PCS (fkat) Vyhodnocení aktivity PCS Aktivita PCS byla charakterizována rozdílem koncentrací PC2 kontrolního vzorku a vzorků z reakčních směsí s přidaným kovem. Tyto závislosti i s vlivem Cd(II) použitého při kultivaci buněk jsou znázorněny na (Obr. 14), i s příslušnými chromatografickými záznamy (Obr. 14C), které ukazují růst píku PC2 po přídavcích různých koncentrací substrátu (GSH) enzymové reakce u nejvyšší aplikované koncentrace Cd(II) která byla 100 µm. Výsledky byly přepočítány na fmol/s=fkat. A B Koncentrace Cd (µm) Cd 0 µm Cd(II) Cd 5 µm Cd(II) Cd 10 µm Cd(II) Cd 25 µm Cd(II) Cd 50 µm Cd(II) Cd 100 µm Cd(II) PCS Activity C GSH přidané k buněčnému extraktu Reálný vzorek buněčný extrakt s Cd 100 µm Přídavek GSH: 5.00 mm 2.50 mm 1.00 mm 0.50 mm 0.25 mm 0.10 mm 0.05 mm 0 mm Koncentrace GSH (µm) Retenční čas (min) Obr. 14.: (A) Porovnání vlivu obsahu použité Cd(II) a koncentrace substrátu enzymové reakce (GSH). (B) Vliv použité koncentrace Cd(II) na PCS aktivitu. (C) Proložení chromatogramů získaných pro homogenáty buněk BY-2 ovlivněných nejvyšší aplikovanou koncentrací Cd(II) (100µg/ml) s různými přídavky GSH (0 5 mm) jako substrátu enzymové reakce Stanovení Km Díky použití různých koncentrací kovu u experimentálního modelu buněk a následně inkubací homogenátů při různých koncentracích substrátu bylo možno dosáhnout určení konstanty Michales-Mentenové (Km), která charakterizuje maximální aktivitu enzymu PCS. Nejnižší určená Km ukazuje při jaké koncentraci je syntéza PCS 39

40 Aktivita PCS (fkat) Km [GSH (mm)] v rostlinných buňkách nejvyšší a rostlina je schopna odolávat. Charakterizace buněčné kultury z hlediska hodnot Km pro jednotlivé aplikované koncentrace kovu byla zjištěna přídavkem substrátu enzymové reakce v koncentracích GSH (0 5 mm). Tuto závislost znázorňuje (Obr. 15A). Dále byly provedeny výpočty převrácené hodnoty tvorby PC2 (1/v) a převrácená hodnota koncentrace substrátu (1/S), které jsou potřebné pro provedení linearizace dle Lineweaver-Burka a následný výpočet Km z rovnice Michaelis- Mentenové. Z hodnot Km v závislosti na aplikované koncentraci Cd(II) byl sestaven graf (Obr. 15B), který vyjadřuje schopnost kultury odolávat působení těžkého kovu. A 300 B 2.5 V max Cd 100 µm Cd(II) Cd 50 µm Cd(II) Cd 25 µm Cd(II) µm Cd(II) Cd 10 µm Cd(II) Cd 5µM Cd(II) ½ V max Km Cd Koncentrace GSH (mm) Koncentrace Cd(II) (µm) Obr. 15.: (A) Vliv aplikované koncentrace substrátu enzymové reakce na aktivitu PCS. (B) Zhodnocení schopnosti kultury odolávat těžkým kovům. Vyjádřeno pomocí konstanty Michaelis-Mentenové. 40

41 Výška píku (na) Výška píku (na) Výška píku (na) Aplikace metody Metoda optimalizovaná na úrovni buněk byla použita i pro reálné vzorky rostlinného materiálu, pro které má toto stanovení aktivity fytochelatinsyntázy potenciál Hodnocení toxicity platiny(iv) u kukuřice (Zea mays L.) a hrachu (Pisum sativum L.) Obsah platiny nahromaděné v experimentálních rostlinách po expozici byl hodnocen elektrochemicky, konkrétně diferenční pulsní voltametrií (DPV), která patří mezi levné, rychlé, nenáročné a velmi citlivé metody ve srovnání s ostatními, ke stanovení obsahu kovů v biologických vzorcích (Ensafi, A. A., Izadi, M. et al. 2013), (Adam, V., Zehnalek, J. et al. 2005), (Supalkova, V., Beklova, M. et al. 2008). Signál odpovídající Pt(IV) byl zjištěn při potenciálu -0,95 V. Výška píku byla přímo úměrná koncentraci Pt(IV). Pro tuto metodu byla získána kalibrační závislost v rozmezí 0,1 až 50 ng.ml -1, která je v tomto rozmezí lineární (y = 3,6282x, R 2 = 0,9935, Obr. 16A). Na Obr. 16B je zobrazeno proložení záznamů kořenů kukuřice o koncentracích 10 a 100 µm Pt(IV), které byly získány pomocí DPV. Tento záznam ukazuje, že zvolená metoda je vhodná pro analýzu těchto biologických vzorků. A B 50 na y = 3,6282x R² = 0, Koncentrace Pt(IV) (ng/ml) 50 na -1,05-1,0-0,95-0,9-0,85-0,8-0,75-0,7-0,65 Potenciál (V) Potenciál (V) Obr. 16.: (A) Diferenční pulsní voltamogramy kalibrační řady Pt(IV) v koncentračním rozmezí 0,1 až 50 ng.ml -1. Vložný graf: kalibrační křivka v koncentračním rozmezí 0,1 až 50 ng.ml -1 (B) Diferenční pulsní voltamogramy kořenů kukuřice Fig.16 41

42 Koncentrace Pt(IV) ve vzorku (%) Koncentrace Pt(IV) ve vzorku (%) Koncentrace Pt(IV) ve vzorku (%) Koncentrace Pt(IV) ve vzorku (%) rostoucí v prostředí 10 µm (červená křivka) a 100 µm (modrá křivka) Pt(IV), vše ředěno. Akumulace platiny do zvolených experimentálních vzorků je znázorněna na Obr. 17. Je zde patrné, že akumulace Pt(IV) je závislá jak na době expozice těžkého kovu, tak na jeho koncentraci. Mezi pokusnými rostlinami jsou však patrné rozdíly. Zatím co u kořenů kukuřice je koncentrace akumulované Pt(IV) největší v nejvyšší použité koncentraci (100 µm), a to jak v prvním (8. den), tak druhém (12. den) odběru. U kořenů hrachu se akumulovaná koncentrace u v 8. dni odběru zvyšuje až k aplikované koncentraci 50 µm, zatím co u odběru v 12. dni není ve zvolených koncentracích výrazný rozdíl. U nadzemních částí je však situace odlišná. Zatím co koncentrace akumulované Pt(IV) byla u kukuřice v odběru ve 12. dni postupně se zvyšující se aplikovanou koncentrací tohoto kovu, u 8. dne nebyly rozdíly výrazné. U nadzemních částí hrachu nebyly rozdíly v odběrech výrazné. A odběr 2 odběr B odběr 2 odběr C Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) 1 odběr 2 odběr D Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) 1 odběr 2 odběr Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) Fig.17: Obr. 17.: Celková koncentrace platiny v kořenech (A) kukuřice (B) hrachu, a nadzemních částech (C) kukuřice (D) hrachu. 42

43 Fytochelatinsyntázu a její aktivitu je možné použít pro hodnocení kovové tolerance rostlin (Sun, R. L., Jin, C. X. et al. 2010). Na Obr. 18 se ukazuje, že se zvyšující se koncentrací Pt(IV) se zvyšuje i aktivita PCS, zejména pak v nadzemních částech. Nejvyšší aktivity PCS však bylo dosaženo při aplikované koncentraci Pt(IV) 25 µm a to jak v kořenech, tak v nadzemních částech i v obou použitých časech akumulace. Po této koncentraci opět došlo ke snížení této aktivity, i přes to však zůstala vyšší, nežli před zjištěným maximem v koncentraci 25 µm. I přes to, že maximum aktivity PCS je u všech hodnocených variant shodné, jsou patrné rozdíly v aktivitách různých variant. Kořeny kukuřice vykazují v nižších koncentracích aplikovaného kovu vyšší aktivitu PCS než-li nadzemní části, oproti tomu u kořenů i nadzemních částí hrachu rozdíly patrné nejsou. Výsledky získané při porovnání rozdílu v aktivitě PCS mezi jednotlivými dobami expozice je možno chápat Jako rozdíly strategií ve vychytávání těžkých kovů u zvolených rostlin. Zatím co mezi aktivitami PCS u kukuřice není v kořenech ani u nadzemních částí výrazný rozdíl, u hrachu byla zjištěna po 8 denní akumulaci vyšší aktivita PCS u nadzemních částí, zatím co po 12 denní je patrná vyšší aktivita u kořenů (Obr. 18B a D). 43

44 A Aktivita PCS (%) odběr 2 odběr B Aktivita PCS (%) odběr 2 odběr 0 C Aktivita PCS (%) Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) 1 odběr 2 odběr 0 D Aktivita PCS (%) Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) 1 odběr 2 odběr Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) Koncentrace Pt(IV) v půdě (µm) Fig.18: Obr. 18.: Aktivita fytochelatinsyntázy (PCS) v závislosti na aplikovaných koncentracích platiny (vystaveny expozicím tohoto kovu 1 odběr po 8 dnech a 2 odběr po 12 dnech). Měřeno v kořenech (A) kukuřice (B) hrách, a nadzemních částech (C) kukuřice (D) hrách Hodnocení vlivu mědi na odrůdy kukuřice (Zea mays L.) V tomto experimentu nebyly oproti předchozímu porovnávány rozdíly v odběrech u dvou různých rostlin, ale byly porovnávány rozdíly mezi dvěma kultivary kukuřice (Zea mays L.), které byly pěstovány v prostředí s koncentracemi mědi (0, 100 a 250 µg). Oba tyto kultivary byly pěstovány ve dvou variantách, kdy jedna byla inkubována s arbuskulární mykorhizní houbou Glomus intraradices a druhá varianta bez ní. Pro porovnání byly použity odečty, kdy od výsledků nemykorhizních variant byly odečteny výsledky variant mykorhizních. Takto získané výsledky jsou zde prezentovány. Se zvyšující se koncentrací mědi v půdě se zvyšuje i koncentrace akumulované mědi v rostlinách (Obr. 19). Dále je patrný výrazný rozdíl v koncentracích naakumulované mědi v kořenech a nadzemních částech rostlin. V kořenech jsou tyto akumulované koncentrace výrazně vyšší. Mezi oběma kultivary jsou však patrné rozdíly v akumulaci a transportu tohoto kovu do nadzemních částí. Zatím co u kultivaru 1 je množství mědi 44

45 Koncentrace Cu ve vzorku (µm) Koncentrace Cu ve vzorku (µm) akumulované v kořenech při porovnání s kultivarem 2 nízká (kultivar 1. při kultivaci v prostředí 250 µg Cu dosahuje rozdílu akumulovaného kovu mezi variantou s a bez mykorhizy pouze 2,5 µm, zatím co kultivar 2 ve stejných podmínkách 17 µm (Obr. 19B)) u nadzemních částí je trend obrácený (rozdíl akumulace u kultivaru 1 je 1,2 µm oproti kultivaru 2 s 0,4 µm (Obr. 19A)). Z tohoto lze usuzovat, že mezi jednotlivými kultivary kukuřice jsou výrazné rozdíly v mechanismech vypořádávání se s těžkými kovy. A Orense Kultivar 1 Oropesa Kultivar 2 B Orense Kultivar 1 Oropesa Kultivar Koncentrace Cu v půdě (µg) Koncentrace Cu v půdě (µg) Obr. 19.: Rozdíly celkové koncentrace mědi u dvou kultivarů kukuřice v (A) nadzemních částech (B) kořenech. Odečteny jsou vždy koncentrace mědi mykorhizních rostlin od koncentrací mědi u rostlin nemykorhizních. Zatím co absorbovaná koncentrace Cu v kultivarech kukuřice je velmi rozdílná jak mezi kořeny a nadzemními částmi, tak mezi oběma kultivary, u aktivity PCS je situace odlišná. Rozdílnost akumulace mezi kultivary potvrzují výsledky získané z analýzy koncentrace mědi pomocí elektrochemie. To ukazuje rovněž na odlišnost mechanismů rostlin Obr. 19 pro vypořádávání se s těžkými kovy. Co je ale z výsledků stanovení aktivity PCS zajímavé, je shodný trend v porovnání kořenů i nadzemních částí (Obr. 20). Je zřejmé, že kultivar 1 vykazuje nejvyšší aktivitu PCS již při nižších koncentracích kontaminující mědi (zřejmě leží ještě pod hranicí zvolených 100 µg), zatím co kultivar 2 vykazuje zvyšující se trend. Je tedy zřejmé, že kultivar 2 je odolnější vůči působení mědi obsažené v půdě. 45

46 A Orense Kultivar 1 Oropesa Kultivar 2 B Orense Kultivar 1 Oropesa Kultivar 2 Aktivita PCS (%) Aktivita PCS (%) Koncentrace Cu v půdě (µg) Koncentrace Cu v půdě (µg) Obr. 20.: Rozdíl aktivit fytochelatinsyntázy (PCS) u dvou kultivarů kukuřice v (A) nadzemních částech (B) kořenech. Odečtena je vždy aktivita PCS stanovená u mykorhizních rostlin od aktivity PCS stanovené u rostlin nemykorhizních. Rozdíly jsou vyjádřeny procentuálně. Obr