PRINCIP. B A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/l BAP) C obsahem chloridu horečnatého, síranu zinečnatého, povrchově

Transkript

1 Enzymový imunologický test pro stanovení koncentrace kostní alkalické fosfatázy (BAP) v lidském séru Pro in vitro diagnostické použití RYCHLÝ NÁVOD K PROVEDENÍ STANOVENÍ Přidejte 125 µl pufru pro stanovení. Přidejte 20 µl standardů, kontrol a vzorků, kroužením promíchejte. Nechte inkubovat 3 hodiny ± 10 minut při teplotě C. Propláchněte 4-krát, poprvé promývacím pufrem 1X. Přidejte 150 µl roztoku pracovního substrátu o teplotě C. Nechte inkubovat 30 ± 5 minut při teplotě C. Přidejte 100 µl ukončovacího roztoku a odečtěte hodnotu optické hustoty při 405 nm. POUŽITÍ Stanovení Metra BAP slouží k měření koncentrace kostní alkalické fosfatázy (BAP) v séru, jakožto ukazatele osteoblastické činnosti. Stanovení BAP se používa jako pomůcka při: léčbě postmenopauzální osteoporózy a Pagetovy choroby sledování stavu žen v postmenopauze podstupujících hormonální nebo bisfosfonátovou léčbu predikaci reakce kostí na hormonální léčbu žen v postmenopauze. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Kosterní, neboli kostní, izoforma alkalické fosfatázy představuje glykoprotein skládající se ze čtyř částí, který se nachází na buněčném povrchu osteoblastů. 1 Osteoblasty jsou buňky odpově dné za syntézu nové kostní matrix a její mineralizaci. Funkce BAP není zcela objasněna, ale byla prokázána její úloha při mineralizaci kostí. 1,2,3 V kostech se neustále odehrává metabolický proces zvaný remodeling přestavba kosti. 3,4 Tento proces zahrnuje degradaci vstřebávání kostní tkáně zprostředkovanou činností osteoklastů a stavební proces tvorbu kostí zprostředkovaný činností osteoblastů. 3,4 Remodeling je potřebný pro udržování kostí a jejich celkové zdraví a jeho dvě fáze jsou těsně svázané. To znamená, že vstřebávání a tvorba kostí jsou v rovnováze. 3,4 U abnormálního kostního metabolizmu se provázání těchto dvou fází kostní přestavby poruší. Když pak vstřebávání převýší tvorbu, dochází k osteoporóze 3,4 nebo k nepravidelnostem v kostní tkání pagetické léze. 5 Stanovení specifických produktů degradace kostní matrix pak poskytuje analytické údaje o míře kostního metabolizmu neboli přestavby kostí. 3,4 Osteoporóza je metabolické kostní onemocnění charakterizované abnormální přestavbou kostí. Jde o systémovou kostní chorobu charakterizovanou řídkou kostní hmotou a mikroarchitektonickým chátráním kostní tkáně s následnou zvýšenou náchylností ke zlomeninám. 6 Nejběžnější typ osteoporózy se vyskytuje u žen v postmenopauze a je zapříčiněn nedostatkem estrogenu v důsledku ukončení činnosti vaje čníků. 3 Obnova množství estrogenu typického pro období před menopauzou pomocí substituční terapie zabraňuje ztrátě kostní hmoty a osteoporóze. 3,6 Estrogeny a skupina sloučenin známá jako bisfosfonáty představují antiresorpční preparáty, které lze použít k prevenci ztráty kostní hmoty a léčbě osteoporózy. 3,6,7 Osteoporóza může rovněž být výsledkem vytvoření neadekvátní maximální kostní hmoty během období růstu. Jedná se o nerovnováhu přestavby kostí související s věkem, kdy dochází k čisté převaze resorpce. Osteoporózu můžou rovněž zapř íčinit četné klinické stavy nebo léčba, které vyvolávají ztrátu kostní hmoty nebo nerovnováhu přestavby kostí. 3 Dále to může být selhání ledvin, rakovina s kostními metastázemi, a také choroby zažívacího traktu související s výživou a metabolizmem minerálů, onemocnění pojivových tkání, vícečetné myelomy, chronická nepohyblivost, alkoholizmus nebo kouření a chronická heparinová nebo kortikosteroidní terapie. 3 Pagetova choroba kostí je ložiskovou poruchou, která se u symptomatických pacientů projevuje bolestmi a deformací kostí. 5 Pagetické léze se vyznačují kostní matrix s vysoce abnormální strukturou, která je způ sobená nadměrnou kostní přestavbou. Léze se objevují zejména na lebce, páteři, pánvi a dlouhých kostech a můžou zapříčinit zlomeniny a neurologická poškození. 5 Etiologie Pagetovy choroby není známá, existují ale přesvěd čivé hypotézy uvádějící genetické příčiny nebo virový původ. 5 V současné době se k redukci přílišné biochemické aktivity na normální úroveň používají bisfosfonáty a kalcitonin, které umožňují obnovu zdravé struktury kostí. 9 Stanovení koncentrace BAP jakožto markeru přestavby kostí poskytuje užitečné informace o p řestavbě kostí u pacientů s osteoporózou a Pagetovou chorobou a o změnách aktivity onemocnění v důsledku antiresorpční léčby U stanovení Metra BAP byla k získání monoklonální protilátky, která vykazuje specificitu vůči BAP, použita technologie protilátek. 10 Specificita monoklonální protilátky použité v stanovení umožňuje jednoduché, praktické, reprodukovatelné a přímé stanovení množství BAP v lidském séru. PRINCIP Metra BAP je imunochemická reakce probíhající formou mikrotitru na proužku, při které se k zachycení BAP ze vzorku používá monoklonální protilátka proti BAP nanesená na proužku. Enzymová aktivita zachycené BAP je detekována pomocí pnpp substrátu. DODANÝ MATERIÁL A REAGENCIE 96 testů ke stanovení koncentrace kostní alkalické fosfatázy Souprava Metra BAP EIA obsahuje: A BAP standardy A F položky 4395 až 4400 po 0,3 ml B A = 0, B = 2, C = 20, D = 50, E = 80, F = 140 U/l BAP) BAP purifikovaná z buněk osteosarkómu SAOS-2 v pufrovém roztoku s C obsahem chloridu horečnatého, síranu zinečnatého, povrchově D aktivního činidla, transportní bílkoviny, modrého barviva a azidu E sodného (0,05%) jako konzervačního prostředku. F L Vysoká/nízka kontrola položky 4401, 4402 po 0,3 ml BAP purifikovaná z buněk osteosarkómu SAOS-2 v pufrovém roztoku s H obsahem chlodiru horečnatého, síranu zinečnatého, povrchově aktivního činidla, transportní bílkoviny, modrého barviva a azidu sodného (0,05%) jako konzervačního prostředku. Potažené proužky položka 4660 po 12 ks Purifikovaná myší monoklonální IgG protilátka proti BAP adsorbovaná na proužkových zásobnících. Ukončovací roztok položka ml 1N NaOH Promývací pufr 10X položka ml Neiontový detergent v pufrovém roztoku obsahující azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek. Pufr pro stanovení položka ml Pufrový roztok s obsahem chloridu hořečnatého, síranu zinečnatého, povrchově aktivního činidla a azidu sodného (0,05%) jako konzervačního prostředku. Substrátový pufr položka x 10 ml Roztok 2-amino-2-metyl-1-propanolu s obsahem HEDTA, chloridu hořečnatého, síranu zinečnatého a azidu sodného (0,05%) jako konzervačního prostředku. Substrátové tablety položka x 20 mg p-nitrofenyl fosfát MATERIÁL DODÁVANÝ ZVLÁŠŤ Mikropipety na 20 µl a µl

2 Pomůcky vhodné k měření objemu v rozsahu ml Nádobka na ředění promývacího pufru Deionizovaná nebo destilovaná voda Sníma č proužků schopný snímat optickou hustotu při vlnové délce A 405 > 2,0 Software pro aproximaci kvadratické kalibrační křivky UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 1. Pro in vitro diagnostické použití. 2. Se vzorky nakládejte, jako by byly potenciálně infekční. Při práci se všemi komponenty a vzorky od pacientů se řiďte obecnými pravidly bezpečnosti práce. 3. Nádoby a jejich nepoužitý obsah likvidujte v souladu s federálními, státními a místními předpisy. 4. Dodané reagencie použijte jako ucelenou soupravu před datem expirace vyznačeném na štítku na obalu. 5. Reagencie skladujte v souladu s uvedenými pokyny. 6. V případě že je sáček propíchnutý, potažené proužky nepoužívejte. 7. Každý vzorek stanovte dvojmo. 8. 1N NaOH má korosivní účinek a může způsobit vážné popáleniny. Nepožívejte. Zamezte kontaktu s kůží, očima a oblečením. Zasažené místo opláchněte vodou. Po požití vyhledejte lékaře. 9. Jako konzervační prostředek byl použit azid sodný. Náhodné požití nebo kontakt s pufrem obsahujícím azid sodný může způsobit podráždění kůže, očí a úst. Pufry používejte pouze k určenému účelu a zamezte kontaktu s kyselinami. Azid sodný může reagovat s olovem nebo mědí za vzniku vysoce výbušných azidů kovů. Likvidovaný materiál proto spláchněte větším množstvím vody, aby se zabránilo nahromadění azidu. 10. K zajištění včasného přísunu reagencií se doporučuje použít pipety s více kanálky nebo opakovací pipetovací přístroj. 11. Aby stanovení vzorku proběhlo správně, je třeba přidávat přesné množství vzorku a standardu. Pipetujte pečlivě a používejte pouze kalibrované příslušenství. 12. Vzorky s koncentraci přesahující 140 U/l rozřeďte v pufru pro stanovení a stanovení opakujte. Zřeďovací poměr zahrňte do závěrečného výpočtu. 13. Toto stanovení je možné provést za použití jakékoliv schválené metody promývání. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Teplotu reagencií a materiálů nechte před stanovením ustálit na C. Po odebrání potřebného množství uskladněte zbylé reagencie a materiály při teplote 2 8 C. Potažené proužky Ze sáčku vyjměte stojánek s proužkovými zásobníky a požadovaný počet potažených proužků (viz tabulka v části POSTUP STANOVENÍ). Sáček s nepoužitými proužky poté důkladně uzavřete. Promývací pufr Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X (viz tabulka). Skladujte při teplotě C. Promývací pufr 1X spotřebujte do 21 dní od přípravy. Roztok pracovního substrátu Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě C vložte po jedné substrátové tabeltě (viz tabulka). Tabletey nechte rozpouštět minut. Lahve důkladně protřepejte, aby se obsah dokonale promíchal. Nespotřebovaný roztok pracovního substrátu zlikvidujte. SKLADOVÁNÍ Soupravu skladujte při teplotě 2 8 C. Nezmrazujte. Nepoužité reagencie skladujte při teplotě 2 8 C. Teplotu reagencií nechte před stanovením ustálit na C. Promývací pufr 1X (zředěný 10X) skladujte při teplotě C. ODEBÍRÁNÍ A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ Sérum odebírejte standardní venepunkcí. Vzorky odebírejte bez použití činidel proti srážlivosti a takovým způsobem, aby nedošlo k hemolýze. Krev nechte vysrážet a odstřeďte sérum. Sérum lze skladovat 5 dní při teplotě 2 8 C, 12 měsíců při teplotě nižší nebo rovné -40 C, nebo 36 měsíců při teplotě nižší nebo rovné -80 C. Vzorky opakovaně nerozmrazujte a nezmrazujte více než třikrát. Vysrážené sérum, sérum ze zkumavky se separátorem séra, Na heparinizovaná plazma a Li heparinizovaná plazma poskytují značně shodné výsledky. K př ípravě vzorků plazmy se nedoporučuje používat chelatační činidla jako např. EDTA nebo citrát. POSTUP STANOVENÍ Před zahájením stanovení si přečtěte celý návod. Před uskutečněním testu si přečtěte PŘÍPRAVU REAGENCIÍ. Podle počtu proužků, které budete používat, stanovte potřebné množství jednotlivých reagencií. Počet proužků Počet vzorků (stanovených dvojmo) Substrát (láhev) 1 1 2* 2* Promývací pufr 1X (ml) * Při použití více než jedné lahve nebo ampulky smíchejte před použitím jejich obsah a důkladně promíchjte. Inkubace vzorků 1. Těsně před použitím vyjměte ze sáčku stojánek s proužkovými zásobníky a požadovaný počet potažených proužků (viz tabulka). Plastový sáček obsahující nepoužité proužky poté důkladně uzavřete. 2. Požadovaný počet potažených proužků vložte do zásobníkového stojánku. Proužky označte, aby při jejich náhodném uvolnění ze stojánku nedošlo k jejich záměně. 3. Do každého zásobníku přidejte 125 µl pufru pro stanovení. 4. Do každého zásobníku přidejte 20 µl standardu, kontroly nebo vzorku. Nepromíchávejte s pufrem pro stanovení tím, že budete opakovaně pipetovat. Tento krok je třeba ukončit do 30 minut. Proužky jemně zamíchejte, aby se vzorek a pufr smíchaly. 5. Nechte inkubovat 3 hodiny (± 10 minut) při teplotě C. 6. Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě C vložte po jedné substrátové tabletě (viz tabulka). Tablety nechte rozpouštět minut. Lahve řádně protřepejte, aby se jejich obsah úplně promíchal. Promývání 7. Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X (viz tabulka). Skladujte při teplotě C. Promývací pufr 1X spotřebujte do 21 dní od přípravy. 8. Proužky ručně obraťte/vyberte. Do každého zásobníku přidejte alespoň 250 µl promývacího pufru 1X a proužky ručně obraťte/vyberte. Postup ještě třikrát zopakujte, aby promývání proběhlo celkem čtyřikrát. Po posledním promytí nechte proužky důkladně oschnout na papírových utěrkách. Inkubace substrátu 9. Do každého zásobníku přidejte 150 µl roztoku pracovního substrátu. Nespotřebovaný roztok pracovního substrátu zlikvidujte. 10. Nechte inkubovat 30 minut (± 5 minut) při teplotě C. Ukončení/Odečtení 11. Do každého zásobníku přidejte 100 µl ukončovacího roztoku. Ukončovací roztok přidávejte stejným způsobem a ve stejných časových intervalech jako roztok substrátu. 12. Odečtěte optickou hustotu při 405 nm. V zásobnících nesmí být žádné větší bublinky a spodek proužků musí být čistý. Proužky je nutno odečíst do 15 minut od přidání ukončovacího roztoku. 13. Výsledky testu Metra BAP je nutno zpracovat pomocí softwaru určujícího koncentraci pomocí rovnice aproximace kvadratické kalibrační křivky. Rovnice: y = A + Bx + Cx 2

3 Opti cká hustota (405 nm) KONTROLA KVALITY Certifikát analýzy přiložený k této soupravě je specifický pro danou šarži a slouží k ověření, zda jsou výsledky naměřené ve vaší laboratoři obdobné jako výsledky získané ve společnosti Quidel. Uvedené jsou hodnoty optické hustoty a mají sloužit pouze jako vodítko. Výsledky stanovené vaší laboratoři se mohou lišit. Rozmezí hodnot pro kontrolu kvality jsou rovněž uvedena. Kontrolní hodnoty mají sloužit ke kontrole správnosti křivky a hodnot naměřených ve vzorku. Každá laboratoř si má určit vlastní parametry přijatelného rozmezí výsledků stanovení. Pokud se kontrolní hodnoty nachází MIMO přijatelného rozmezí určeného vaší laboratoří, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodné a stanovení vzorku je třeba opakovat. Pokud je hodnota optické hustoty standardu F testu Metra BAP menší než 1,0, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodné a stanovení vzorku je třeba opakovat. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Výsledky stanovení vzorku se udávají v U/l a není třeba provádět jejich korekci zohledňující ředění (ledaže by ředění vzorku proběhlo před stanovením). Ve stanovení Metra BAP představuje 1 dílek 1 µmol pnpp hydrolyzovaného za minutu při teplotě 25 C v pufru 2-amino-2-metyl-1- propanolu. Typická kalibrační křivka Standardní koncentrace BAP: 0, 2, 20, 50, 80, 140 U/l OMEZENÍ METODY HAMA interference BAP (U/L) U některých jedinců se můžou vyskytovat protilátky proti myším protilátkám (HAMA), které mohou způsobit interferenci imunochemické reakce, která používá protilátky odvozené od myší. K chybným výsledkům může dojít zejména u pacientů, kteří při léčbě nebo diagnostické metodě dostali infuzi myší monoklonální protilátky. Proto by se výsledky stanovení vzorku od takového pacienta pomocí testu Metra BAP mě ly používat pouze ve spojení s výsledky n ěkteré další diagnostické metody a společně s informacemi obsaženými v klinické dokumentaci pacienta. Vzorky s podstatně zvýšenou aktivitou jaterní alkalické fosfatázy můžou při použití testu Metra BAP poskytovat abnormálně zvýšené hodnoty. Pacienti s Pagetovou chorobou v raném stadiu můžou mít stanovené množství kostní alkalické fosfatázy v rámci referenčního rozmezí pro test Metra BAP. HODNOTY NAMĚŘENÉ VE VZORCÍCH Referenční rozmezí stanovení koncentrace BAP byla určena pomocí vzorků od zdravých mužů starších 25 let (n = 126), zdravých žen před menopauzou ve věku od 25 do 44 let (n = 178) a zdravých žen v postmenopauzálním období (n = 107). Definice zdravého jedince pro účely stanovení referenčních rozmezí je: V zásadě zdravý člověk bez onemocnění kostí a bez endokrinní nebo chronické choroby Žena s pravidelným menstruačním cyklem (týká se žen před menopauzou) Netěhotná a nekojící žena (ženy) Osoba, která v současnosti neužívá žádné léky o kterých se ví, že ovlivňují kostní metabolizmus Naměřené hodnoty můžou být ovlivněny skutečnostmi jako jsou nízká produkce estrogenu, nízký přísun vápníku nebo nedostatečná fyzická aktivita. 8 Nedostatek estrogenu u žen v postmenopauze může způsobit zvýšenou přestavbu kostí. 3,4 Každá laboratoř by si měla vytvořit vlastní normální referenční rozmezí. Rozmezí jsou vyjádřena jako neparametrické referenční intervaly (90% interval spolehlivosti). Věk Rozmezí (roky) (U/l) Medián Ženy Premenopauzální 11,6-29,6 18,3 Ženy 45 Postmenopauzální 14,2-42,7 25,0 Muži 25 15,0-41,3 23,2 ZNAKY METODY Specificita protilátek Protilátka proti kostní alkalické fosfatáze vykazuje selektivní, vysokou afinitu vůči izoformě kostní alkalické fosfatázy, nízkou zkříženou reaktivitu s jaterní alkalickou fosfatázou a zanedbatelné vázání izoenzymů střev a placenty. Citlivost AP izoenzym Reaktivita Kosti 100 Játra 3-8 Placenta 0 Střeva 0,4 Minimální množství BAP zjistitelné pomocí testu Metra BAP je 0,7 U/l, stanovené horním limitem 3 standardních odchylek v studii přesnosti s nulovým standardem). Zpětná výtěžnost zpětná výtěžnost s přídavkem Zpětná výtěžnost s přídavkem byla stanovena přidáním známého množství purifikované BAP do vzorků séra s různým množstvím endogenní BAP. Charakteristické výsledky jsou uvedeny po přidání BAP o nízké, střední a vysoké koncentraci a trojitém stanovení. Endogenní Přídavek Naměřená Zpětná (U/l) (U/l) hodnota výtěžnost (U/l) 13,4 15,7 29, ,6 37,5 55, ,2 57,2 88,1 106 Zpětná výtěžnost - linearita Linearita byla určena sériovým řed ěním vzorků a porovnáním naměřených hodnot s hodnotami o čekávanými. Charakteristické výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Vzorek Poměr Naměřená Očekávaná Zpětná ředění hodnota hodnota výtěžnost (U/l) (U/l) 1 čistý 108, :2 51,1 54,2 94 1:4 25,8 27,1 99 1:6 18,0 18, čistý 39, :2 20,1 19, :4 10,3 9, :6 6,7 6, čistý 58, :2 29,9 29, :4 15,7 14, :6 9,7 9,7 100 Přesnost Přesnost v rámci stanovení byla určena pro 21 replikátů z 3 vzorků na 3 proužcích z každé ze 3 šarží souprav (celkem 9 proužků). Přesnost mezi jednotlivými stanoveními byla určena pro 3 vzorky stanovené na 6 samostatných proužcích z každé ze 3 šarží souprav (celkem 18 proužků).

4 Charakteristické výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

5 < of Population < of Population BAP Variační koef. Variační koef. (U/l BAP) v rámci mezi stanovení 1 stanoveními ,8 5,2 35 3,9 7, ,2 5,0 1 2 n=21 n=6 testů Interferující látky Látky z následující tabulky byly otestovány při uvedených koncentracích a bylo zjištěno, že se stanovením neinterferují. Látka Koncentrace Hemoglobin 500 mg/dl Bilirubin 25 mg/dl Triglyceridy 1420 mg/dl Celkový protein 6,0 g/dl Celkový protein 15,6 g/dl Celkový protein 6,0 g/dl Celkový protein 15,6 g/dl Protein s vodou Protein s BAP (koncentrace BAP = 43,6 U/l) Interference s léky Do t ří směsných vzorků séra obsahujících p řibližně 35, 70 a 105 U/l BAP byly přidány léky o různých koncentracích a vzorky byly následn ě stanoveny trojmo. Jednalo se tyto léky a nejvyšší testované koncentrace: Látka Etidronát Estrogen Ibuprofen Acetominofen Aspirin Kalcitonin - lidský Kalcitonin - lososí Kalcium Směs noretindron/etynil estradiol (orální antikoncepce) Vitamin D Správnost Nejvyšší koncentrace 350 µg/ml 100 µg/ml 150 µg/ml 350 µg/ml 350 µg/ml 80 µg/ml 80 µg/ml 500 µg/ml 3 mg/ml 400 IU/ml K vyhodnocení korelace mezi výsledky stanovení koncentrace kostní alaklické fosfatázy v séru (BAP) pomocí testu Metra BAP a výsledky získanými použitím tří komerčně dostupných stanovení k určení celkového množství alkalické fosfatázy nebo BAP byly provedeny porovnávací studie. Tyto proběhly na nezávislých výzkumných klinikách pomocí na vzorcích séra od 114 pacientů s Pagetovou chorobou a od 464 zdravých jedinců. První srovnávací metodou byla kolorimetrická metoda měření TAP. Korelační koeficient (r) této kolorimetrické metody a stanovení Metra BAP byl 0,99. Druhou srovnávací metodou byla elektroforézní metoda určení množství BAP v izoenzymech (r = 0,99). Třetí srovnávací metodou bylo imunoradiometrické stanovení množství BAP (r = 0,99). Z 114 pacientů s Pagetovou chorobou se u 101 pacienta vyskytly hodnoty nad horní hranicí referenčních rozmezí testu Metra BAP. Třináct pacientů mělo naměřenou koncentraci BAP nižší než horní hranice referenčních rozmezí. Počáte ční střední (± 1standardní odchylka) hodnoty koncentrace BAP (14,6 ± 5,4 vs. 14,6 ± 4,6, p = 0,900) a LSBMD (0,74 ± 0,10 vs. 0,75 ± 0,09, p = 0,751) byly obdobné pro skupinu ALN i CTL. Rozdělení koncentrace BAP naměřené na začátku studie u skupin ALN a CTL podle procenta jedinců s příslušnou koncentrací se nachází v následujícícm grafu. Rozdělení koncentrace BAP na začátku zkoušky Baseline CTL Baseline ALN Decreasing bone turnover U/L BAP Increasing bone turnover Hodnoty koncentrace BAP byly podstatně nižší u skupiny ALN než u CTL po 3 měsících (9,6 ± 3,5 vs. 13,4 ± 4,0, p<0,00001), po 6 měsících (8,0 ± 3,0 vs. 13,2 ± 3,8, p<0,00001) i po 12 měsících (7,8 ± 2,6 vs. 13,3 ± 3,9, p<0,00001). Rozdělení koncentrace BAP naměř ené po 12 měsících u ALN a CTL skupin se nachází v následujícícm grafu. 4 3 Rozdělení koncentrace BAP po 12 měsících léčby alendronátem (ALN) nebo vápníkem (CTL) 12 month CTL 12 month ALN KLINICKÉ STUDIE Použití testu Metra BAP ke sledování účinnosti antiresorpční léčby osteoporózy Spolehlivost a účinnost testu Metra BAP určeného ke sledování změn koncentrace BAP v séru v souvislosti s amino-bisfosfonátovou (alendronátovou) antiresorpční léčbou byla prokázána úspešnou kontrolovanou zkouškou s náhodným rozdělením provedenou na různých místech. Př edmětem zkoušky byly ženy v postmenopauzálním období ve věku 45 až 84 let (střední hodnota 64 ± 7 let) s diagnózou osteoporózy (stanovené na základě klinické prezentace nebo základní minerální hustoty kostí bederní páteře [LSBMD] vyšší než 2,5-krát standardní odchylka pod střední hodnotou pro dospělé ženy před menopauzou) vybraných ze širší studie účinnosti alendronátu v léčbě osteoporózy. 7 Na počátku byly vhodné osoby náhodn ě rozděleny do skupin, které dostávaly buď 10 mg alendronátu a 500 mg vápníku denně (ALN), nebo placebo a 500 mg vápníku denně (CTL). Vzorky séra byly od všech osob odebrány na začátku studie a pak po 3, 6 a 12 měsících. Decreasing bone turnover U/L BAP Increasing bone turnover Střední (± 1standardní odchylka) hodnoty BAP u osob v CTL skupině vůči výchozím hodnotám mírně poklesly na 5,4% (± 19,1%) po 12 měsících (p=0,00004), což může být způsobeno mírným antiresorpčním účinkem vápníku. 13

6 > 29 of Population < -70% to % to % to % to -30.1% to % to % to -0.1% 0.0 to 9.9% 10.0 to 19.9% > 29 of Population of Population Střední hodnoty koncentrace BAP u osob ze skupiny ALN se snížily po 3 měsících o 30,5 ± 24,6%, po 6 měsících o 42,8 ± 17,3% a po 12 měsících o 42,2 ± 19,2%. U osob ze skupiny ALN byla větší pravděpodobnost než u osob z CTL, že jejich ztráty BAP přesáhnou minimální procentrní změnu 14, přičemž u 68,5%, 83,9% a 86,1% osob ze skupiny ALN a 9,5%, 15,9% a 9,0% osob ze skupiny CTL došlo k poklesu o ubytek BAP 25% po 3, 6 a 12 měsících (v uvedeném pořadí). Rozdělení procentních změn koncentrace BAP po 12 měsících léčby vůči počáteč ním hodnotám BAP u skupin ALN a CTL se nachází v následujícícm grafu. Rozdělení procentních změn koncentrace BAP po 12 měsících léčby alendronátem (ALN) nebo vápníkem (CTL) HRT a CTL skupin v procentech jedinců s odpovídající koncentrací se nachází v následujícícm grafu. Rozdělení koncentrace BAP na začátku studie CTL HRT 12 month CTL 12 month ALN Decreasing bone turnover % Change Increasing bone turnover Decreasing bone turnover U/L BAP Increasing bone turnover Hodnoty koncentrace BAP byly po 12 měsících podstatně nižší u skupiny HRT než u CTL (13,3 ± 5,0 vs. 21,9 ± 7,9 U/l, p < 0,00001). Rozdělení koncentrce BAP naměřené po 12 měsících u HRT a CTL skupin se nachází v následujícícm grafu. Rozdělení koncentrace BAP po 12 měsících léčby estrogenem/progestinem (HRT) nebo podávání placeba (CTL) Ženy ze skupiny ALN měly po 12 měsících léčby hodnoty LSBMD srovnatelné s ženami ze skupiny CTL (p < 0,00001), jak ukazuje i následujícíc tabulka. Změny LSBMD (střední hodnota ± standardní odchylka) Počáteční Hodnota po n hodnota 12 měsících (g/cm 2 ) (g/cm 2 ) CTL 159 0,75 ± 0,09 0,74 ± 0,09-0,6 ± 3,4 ALN 121 0,74 ± 0,10 0,79 ± 0,10 5,5 ± 4,1 CTL HRT Tyto výsledky ukazují, že test Metra BAP je spolehlivý a účinný pro sledování antiresorpčního účinku léčby jedinců s diagnózou osteoporózy amino-bisfosfonátem (alendronátem). Použití testu Metra BAP ke sledování hormonální antiresorpční léčby a k př edpovědi reakce kostí na léčbu (minerální hustoty kostí) u žen v postmenopauze Sledování léčby: Spolehlivost a účinnost testu Metra BAP určeného ke sledování změn koncentrace BAP v séru v souvislosti s estrogenovou/progesteronovou antiresorpční léčbou byla prokázána úspešnou kontrolovanou zkouškou s náhodným rozdělením provedenou na r ůzných místech. Nadměrná přestavba kostí a značný úbytek kostní hmoty jsou často spojené s nedostatkem estrogenu v postmenopauzálním období. Nahrazení chybějícího estrogenu se ukázalo být účinným způsobem snižujícím přestavbu kostí a chránícím stávající kostní hmotu. 3,6 Předmětem zkoušek byly ženy v postmenopauzálním období ve věku 45 až 64 let (střední hodnota 56 ± 4 roky), které byly v průběhu posledních maximálně 10 let v přirozené, nebo chirurgickým zákrokem vyvolané, menopauze. Na začátku studie byly vhodné osoby náhodně rozděleny buď do skupiny aktivní léčby (HRT): Premarin (0,625 mg denně) s placebo progestinen, Premarin (0,625 mg denně) a aktivní progestin (Provera 2,5 mg/den nepřetržitě, Provera 10 mg/den periodicky, nebo mikromletý progesteron 200 mg/den periodcky), anebo do kontrolní skupiny (CTL): placebo estrogen a placebo progestin. Vzorky séra byly od všech osob odebrány na začátku a po 12 měsících. Střední (± 1standardní odchylka) počáteční hodnoty koncentrace BAP (20,7 ± 7,6 vs. 20,3 ± 6,8 U/l, p = 0,704) a LSBMD (0,97 ± 0,17 vs. 0,97 ± 0,15 g/cm 2, p = 0,970) byly obdobné pro skupinu CTL i HRT. Rozdělení koncentrace BAP naměřené na začátku zkoušky u Decreasing bone turnover U/L BAP Increasing bone turnover

7 LSBMD Percent Change to 12 months - < -70% 70.0 to -60.1% 60.0 to -50.1% 50.0 to -40.1% 40.0 to -30.1% 30.0 to -20.1% 20.0 to % to - 0.1% 0.0 to 9.9% 10.0 to 19.9% of Population Chan ge LSBMD to 12 months (+/- SEM) Střední (± 1standardní odchylka) hodnota koncentrace BAP u osob ze skupiny CLN se mírně zvýšily po 12 měsících na +9,8% (± 33,2%) (p = 0,08), zatímco koncentrace BAP u osob ze skupiny HRT se oproti počáteční hodnotě po 12 měsících snížily na 32,4 (± 21,5%) (p < 0,00001). Úbytek BAP p řesahující minimální procentní změnu 12 byl pravděpodobnější u osob ve skupině HRT než u osob ve skupině CTL. Úbytek o 25% po 12 měsících léčby vykázalo 73,3% jedinců ze skupiny HRT a 3,4% jedinců z CTL. Rozdělení procentních změ n koncentrace BAP po 12 měsících léčby vůči počátečním hodnotám BAP u skupin HRT a CTL se nachází v následujícícm grafu. Předpověď reakce kostí na léčbu: V následujícícm grafu je zobrazen procentní pokles koncentrace BAP po 12 mesících vůči počátečním hodnotám u osob ze skupiny HRT podle kvartilů. Osoby v nejvyšším kvartilu (Q1: největší % pokles) vykázaly nevyšší přířůstek LSBMD v důsledku léčby HRT. Skupina HRT hodnoty % změny BAP po 12 měsícícb rozdělené podle kvartilů a odpovídající % změna LSBMD po 12 měsícícb 6 p < Rozdělení procentních změn koncentrace BAP po 12 měsících léčby esstrogenem/progestinem (HRT) nebo podávání placeba (CTL) CTL HRT Q1 (-66.5 to -45.9) Q2 (-45.9 to -36.0) Q3 (-36.0 to -23.8) Q4 (-23.8 to 167.3) Quartiles by % Change in BAP to 12 months Decreasing bone turnover % Change Increasing bone turnover Osoby ze skupiny HRTdosáhly po 12 měsících léčby hodnoty LSBMD ve srovnání s jedinci ze skupiny CTL (p< ) jak ukazuje následující tabulka. Změny LSBMD (střední hodnota ± standardní odchylka) Počáteční Hodnota po n hodnota 12 mesících (g/cm 2 ) (g/cm 2 ) CTL 58 0,97 ± 0,17 0,95 ± 0,16-1,6 ± 2,8 HRT 262 0,97 ± 0,15 1,00 ± 0,15 +3,5 ± 2,8 Tyto výsledky ukazují, že test Metra BAP je spolehlivý a účinný pro sledování antiresorpčního účinku hormonální substituční léčby žen v postmenopauzálním období. V následujícícm grafu je zobrazena lineární regresní analýza (y = -0,060x + 0,011, r = - 0,51, p < 0,001) procentní změny koncentrace BAP po 12 měsících vůči výchozí hodnotě a percentní změna BMD po 12 měsících vůči výchozí hodnotě pro všechny osoby v rámci studie (léčené nebo dostávající placebo). Studie HRT lineární regrese % změny LSBMD a BAP po 12 měsících vůči počátečním hodnotám 15.0% y = x r = % 5.0% 0.0% -5.0% p < % -15.0% -60.0% -40.0% -20.0% 0.0% 20.0% 40.0% 60.0% B A P Percent C ha ng e to 12 Analýza pomocí kontingenční tabulky ukázala, že pokles hodnoty BAP po 12 měsících 25% významně doprovázel (p < 0,0001) pozitivní odezvu kostí na HRT (nárůst BMD) po 12 měsících. Binomické (aproximace druhého řádu) 85% intervaly spolehlivosti pro citlivost a specificitu použití 25% poklesu BAP hodnot pro předpověď odpovědi na HRT léčbu jsou: citlivost = 77% (95% interval spolehlivosti 75%, 82%), specificita = 61% (95% int. spol. 41%, 78%). Tyto výsledky ukazují, že % změny koncentrací BAP lze použít k předpovědi reakce kostí (BMD) na HRT léčbu. ODKAZY 1. Price CP. Multiple forms of human serum alkaline phosphatase:

8 detection and quantitation. Ann.Clin.Biochem. 1993;30: Whyte MP. Hypophosphatasia and the role of alkaline phosphatase in skeletal mineralization. Endocr.Rev. 1994;15: Riggs BL. Overview of osteoporosis. West.J.Med. 1991;154: Garnero P, Delmas PD. Clinical usefulness of markers of bone remodeling in osteoporosis. In: Meunier PJ (ed.). Osteoporosis: Diagnosis and management. London: Martin Dunitz, 1998: Singer FR, Roodman GD. Paget s disease of bone. In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA (ed.). Principles of bone biology. San Diego: Academic Press, 1996: Consensus Development Statement. Who are candidates for prevention and treatment for osteoporosis? Osteoporos.Int. 1997;7: Liberman UA, Weiss SR, Bröll J, et al. Effect of oral alendronate on bone mineral density and the incidence of fractures in postmenopausal osteoporosis. N.Engl.J.Med. 1995;333: Price CP, Thompson PW. The role of biochemical tests in the screening and monitoring of osteoporosis. Ann.Clin.Biochem. 1995;32: Meunier PJ, Vignot E. Therapeutic strategy in Paget s disease of bone. Bone 1995;17(Suppl.):489S-491S. 10. Gomez B, Jr., Ardakani S, Ju J, et al. Monoclonal antibody assay for measuring bone-specific alkaline phosphatase activity in serum. Clin.Chem. 1995;41: Pedrazzoni M, Alfano FS, Girasole G, et al. Clinical observations with a new specific assay for bone alkaline phosphatase: A cross-sectional study in osteoporotic and pagetic subjects and a longitudinal evaluation of the response to ovariectomy, estrogens, and bisphosphonates. Calcif.Tissue Int. 1996;59: Garnero P, Shih WJ, Gineyts E, Karpf DB, Delmas PD. Comparison of new biochemical markers of bone turnover in late postmenopausal osteoporotic women in response to alendronate treatment. J.Clin.Endocrinol.Metab. 1994;79: Reid IR, Ames RW, Evans MC, Gamble GD, Sharpe SJ. Long-term effects of calcium supplementation on bone loss and fractures in postmenopausal women: A randomized controlled trial. Am.J.Med. 1995;98: Fraser CG. Data on biological variation: essential prerequisites for introducing new procedures? [Editorial] Clin.Chem. 1994;40: Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001. TECHNICKÁ PODPORA S objednávkou, nebo žádostí o technickou podporu, se, prosím, obracejte na zástupce firmy Quidel na č ísle nebo , od pondělí do pátku mezi 8:00 a 17:00 (tichomořské časové pásmo). Objednávky lze také faxovat na číslo Mimo území Spojených států Vám služby poskytne Váš místní prodejce. KATALOGOVÉ Č. REF 8012 Metra BAP EIA Kit AUTORIZOVANÝ ZÁSTUPCE Quidel Deutschland GmbH Betrieb Marburg Emil-v.-Behring-Straße 76 Gebäude M Marburg QUIDEL CORPORATION Worldwide Headquarters McKellar Court San Diego, CA USA Další adresy poboček firmy Quidel najdete na webových stránkách. BIOVENDOR LABORATORNÍ MEDICÍNA A.S. Karásek 1767/1, Brno, Česká republika Tel: info@biovendor.cz L (2003/11)