Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 5

Transkript

1 Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 5 Karel Souček, Ph.D. Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská Brno ksoucek@ibp.cz tel.: K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

2 Data Analysis

3 Vícebarevné analýzy generují mnoho dat 4 color 5 color 3 color QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS QUADSTATS upraveno podle J.P.Robinson

4 Data Analysis

5 Analýza hlavních komponent Analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis, PCA) je v teorii signálu transformace sloužící k dekorelaci dat. Často se používá ke snížení dimenze dat s co nejmenší ztrátou informace. PCA je možno najít také jako Karhunen-Loèveho transformaci nebo Hotellingovu transformaci.

6

7 Kompenzace

8 Kompenzace fluorescenčního signálu NONE! FITC positive & negative PE negative beads K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

9 Kompenzace fluorescenčního signálu #2 FITC positive & negative PE negative beads K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

10 Kompenzace fluorescenčního signálu

11 Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

12 Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

13 Single Cell Mass Cytometry

14 Single Cell Mass Cytometry

15 flow cytometry data sharing and analyzing over the web

16 Aplikace průtokové cytometrie

17 ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN buněčný cyklus a ploidyta analýza zlomů DNA inkorporace BrDU exprese cyklinů analýza denaturace DNA ANALÝZA BUNĚČNÉHO FENOTYPU imunofenotypizace pomocí CD antigenů (detekce diferenciačních a nádorových markerů) detekce cytokinových receptorů CYTOGENETIKA analýza chromozómů STUDIUM BUNĚČNÝCH FUNKCÍ viabilita stanovení intracelulárního ph analýza organel a cytoskeletu stanovení membránového potenciálu oxidativní vzplanutí stanovení intracelulárního Ca2+ stanovení intracelulárních cytokinů Natural Killer ligace značených buněk analýza reportérových genů K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

18 Biologické aplikace průtokové cytometrie analýza DNA analýza buněčných funkcí fluorescenční proteiny K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

19 Co je důležité při přípravě vzorku a značení Postup přípravy vzorku a značení nelze zobecnit závisí na typu buněk a konkrétní analýze suspenze jednotlivých buněk vitální značení fixace (etanol, formaldehyd) permeabilizace (detergenty) difúze aktivní transport

20 Analýza buněčného cyklu jedna z nejstarších aplikací flow cytometrie, stanovení fáze buněčného cyklu podle množství DNA průtoková cytometrie je vhodná metoda pro rychlou a přesnou determinaci buněčného cyklu jednoduchým způsobem je DNA obarvena fluorescenční barvou specifickou pro DNA. Propidium iodide 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - dramaticky zvyšují fluorescenci po vazbě na DNA. Je nutná permeabilizace cytoplasmatické membrány. Hoechst Vybrant DyeCycle DRAQ5 Quaternary benzo[c] [c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska,, "Quaternary" benzo[c] [c]phenanthridine alkaloids-- --novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp , 708, mohou být používány pro značení viabilních buněk. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

21 Normal Cell Cycle G 2 M G 0 DNA Analysis G 1 s C o u n t G 0 G 1 s G 2 M - propidium iodide - DAPI - Hoechst AAD N 4N DNA content Purdue University Cytometry Laboratories

22 Analýza histogramu buněčného cyklu nepoužívá se běžná analýza pomocí úseček (regionů) v histogramu je nutné používat speciální software pro modelovaní analýzu distribuce jednotlivých fází

23

24

25 R1 FL-W vs. FL-A (BD) FL vs. AUX (Beckman Coulter) doublets R2 Analýza histogramu buněčného cyklu FL2-W R1 AND R FL2-A-Propidium Iodide (FL2-A) Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S File analyzed: LNCaP/- Date analyzed: 16-Oct-2006 Model: 1DA0n_DSD Analysis type: Manual analysis Diploid: % Dip G1: % at Dip G2: 0.15 % at Dip S: % G2/G1: 2.00 %CV: 4.90 Total S-Phase: % Total B.A.D.: 3.32 % Debris: % Aggregates: 0.06 % Modeled events: 3970 All cycle events: 3517 Cycle events per channel: 73 RCS: Channels (FL2-A-Propidium Iodide (FL2-A)) Channels (FL2-A-Propidium Iodide (FL2-A))

26 Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu Channels Channels Channels Channels Channels Channels Channels

27 Aneuploidie je významný diagnostický marker Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S An1 G1 An1 G2 An1 S File analyzed: SAMPLE2.FCS Date analyzed: 16-Oct-2006 Model: 2DA0n_DSD_ASD Analysis type: Automatic analysis Diploid: % Dip G1: % at Dip G2: 5.60 % at Dip S: % G2/G1: 2.00 %CV: 3.02 Aneuploid 1: % An1 G1: % at An1 G2: 5.87 % at An1 S: % G2/G1: 2.00 %CV: 5.02 DI: 1.33 Total Aneuploid S-Phase: % Total S-Phase: % Total B.A.D.: % Channels Debris: % Aggregates: 3.96 % Modeled events: All cycle events: Cycle events per channel: 190 RCS: 0.842

28 Analýza ploidity u vyšších rostlin Nicotiana tabacum e_american_tobacco_flower.jpg Alstroemeria caryophyllacea Zea mays mage:corntassel_7095.jpg endosperm 28 dní po opylení

29 Analýza inkorporace BrdU bromodeoxyuridin se inkorporuje do DNA namísto tymidinu během S-fáze po fixaci a částečné denaturaci DNA je možné BrdU detekovat pomocí specifické protilátky značené fluorochromem v posledním kroku můžeme obarvit DNA K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

30 Analýza inkorporace BrdU R4 R2 R5 R3 File: HL60 K/24h Region % Gated R R R R R K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

31

32 Analýza DNA a RNA Pyronin Y vs. Hoechst Pyronin interaguje s ds RNA a DNA ale jeho vazba na DNA je inhibována přítomností Hoechst Acridine orange -při interakci s RNA emituje červené světlo a při interakci s DNA zelené

33

34

35 Detekce intracelulárních proteinů v kombinaci s detekcí DNA

36 Detekce mitotických buněk Histone H3 je specificky fosforylován během mitózy dvojité značení DNA vs. H3-P identifikuje populaci buněk v M-fázi

37 Analýza buněčných funkcí Průtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou analýzu vitálních buněk

38 Detekce viability jedna z nejjednodušších analýz funguje na principu: detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D detekce fyziologického stavu buněk použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM ethidium monoazide lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat Pomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits

39 Detekce viability

40 Přenos signálu pomocí Ca 2+ Cytosol (koncentrace - klidová 100 nm vs [Ca 2+ ] c aktivuje proteinkinázu C interaguje s Ca 2+ - binding proteins 10 M M aktivovaná) Alberts, B. et.al. Essential Cell Biology, 1998 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

41 Přenos signálu pomocí Ca 2+ Jádro [Ca 2+ ] n interaguje s Ca 2+ - binding proteins Malviya, A. N. (1998) Cell 92: K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

42 Přenos signálu pomocí Ca 2+ Mitochondrie mitochondriální retikulum [Ca 2+ ] c => [Ca 2+ ] m <=> m => apoptóza K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

43 ionophor ionophor Ca 2+ influx - Fura-2 - Fluo-3 -Indo-1 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

44 Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca 2+ ] i standardizace barvení a kalibrace temperace vzorku po celou dobu měření standardizace způsobu přidávání induktoru - zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic -127) - inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) - pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

45 Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): , K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

46 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

47 Kalibrace (pro jednu vlnovou délku) Ca 2 K x F-F min d F -F max R1 Fluo-3 (Kd F min = 1.25 x F MnCl x F max Kd ~ 400nM, 22 C; 864 nm, 37 C) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

48 Detekce intracelulárního ph Fluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na ph SNARF-1, BCECF

49 Detekce intracelulárního ph Nutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin)

50 Detekce počtu buněčného dělení Nespecifické fluorescenční označení proteinů pomocí carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE nebo CFSE)

51 Detekce počtu buněčného dělení

52 Detekce reaktivních kyslíkových skupin Reaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů posttranslační modifikace proteinů regulace transkripce regulace struktury chromatinu přenos signálu funkce imunitního systému fyzický a metabolický stres neurodegenerace, stárnutí

53 4 e reduction to water e e e e O O 2 2 H 2 O 2 OH H 2 O Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzymebound Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc Simon Melov

54 Potential sites of intervention Neurodegeneration Oxidative Stress Mitochondrial Damage DNA Damage Energy Crisis Cell Death Oncogenesis Vascular Tone Cardiac Output Sensory Acuity Skin Thickness Bone Density Endocrine Function Immune Function Cancer Simon Melov

55 Hydroethidine HE EB H 2 N NH 2 O 2 - H 2 N NH 2 H N N+ Br - CH2 CH 3 CH 2 CH 3 NADPH Oxidase Phagocytic Vacuole NADPH NADP O 2 O 2 - HE O 2 - H 2 O 2 DCF SOD H2 O 2 OH - DCF Example: Neutrophil Oxidative Burst J. P. Robinson, Purdue University

56 DCFH-DA DCFH DCF 2,7 -dichlorofluorescin diacetate O O CH3-C-O O O-C-CH3 Cl H Cl COOH 2,7 -dichlorofluorescin HO O OH Fluorescent Cellular Esterases Cl Hydrolysis H Cl COOH 2,7 -dichlorofluorescein HO O O DCFH-DA H 2 O 2 Oxidation Cl H Cl COOH Neutrophils DCFH-DA DA DCFH H 2 O 2 Monocytes Lymphocytes counts Control PMA-stimulated PMN DCF log FITC 10 Fluorescence J. P. Robinson, Purdue University

57 -DCFH-DA - DHR-123 -HE Oxidative Burst (A) (B) (C) Key Name K/72h+PMA ATRA/72h+PMA DMSO/72h+PMA NaBT/72h+PMA vit. D3/72h+PMA K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

58 The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"

59 Fluorescenční proteiny bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca 2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. modré světlo excituje green fluorescent protein. Aequorea victoria Crystal jelly Renilla reniformis "Sea Pansy"

60 Fluorescenční proteiny Osamu Shimomura 1961 objevil GFP a aequorin

61 Fluorescenční proteiny Douglas Prasher Martin Chalfie Science Feb 11;263(5148): Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms.

62 Fluorescenční proteiny

63 in vivo molekulární vizualizace KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7: , 2000.

64 Fluorescenční proteiny Sergey A. Lukyanov Objevil GFP-like proteiny u nesvětélkujících korálů

65 Roger Tsien ~ 2002 mutace FP = barevné spektrum

66

67

68 Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu Channels Channels Channels Channels Channels Channels Channels

69 Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APC Cdh1 S, G2, M- SCF Skp2 Nature Methods - 5, 283 (2008)

70 Fucci

71 shrna for TTL shrna elements: TTL-1 tgcatcaaataagcatgagattccaagagatctcatgcttatttgatgc ttttttcacgtagtttattcgtactctaaggttctctagagtacgaata aactacgaaaaaagagct TTL-2 tggcaacgtttggattgcaattccaagagattgcaatccaaacgttgcc ttttttcaccgttgcaaacctaacgttaaggttctctaacgttaggttt gcaacggaaaaaagagct Ventura, Meissner, Dillon, McManus, Sharp, Van Parijs, Jaenisch and Jacks. PNAS 2004 Cre-lox regulated conditional RNA interference from transgene.

72 Pz-HPV-7 cells - shrna for TTL (Lentivirus infection)

73 in vivo molekulární vizualizace KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7: , 2000.

74 in vivo molekulární vizualizace

75

76

77 biarsenical tetracysteine system Nefluorescenční, membránově permeabilní biarsénová značka vytváří kovalentní fluorescenční komplex s jakýmkoliv intracelulárním proteinem obsahujícím krátký tetracysteinový motiv (CCPGCC)

78 biarsenical tetracysteine system

79 Click azide/alkyne reaction

80 Aplikace Click-IT (Invitrogen) Multiplex imaging with Click-iT RNA assays. NIH3T3 cells were incubated with 1 mm EU, formaldehyde-fixed, and permeabilized with Triton X-100. EU incorporated into newly synthesized RNA (red) in some cells was detectied using the Click-iT RNA Alexa Fluor 594 Imaging Kit. Tubulin (green) was detected with anti-tubulin mouse IgG9 and visualized with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG. Nuclei (blue) were stained with Hoechst

81 Aplikace Click-IT (Invitrogen) analýza syntézy DNA (proliferace)

82 3 H-thymidine Tritiated (3H) thymidine

83 3 H-thymidine Original method for measuring cell proliferation Radioactive Not compatible for multiplexed analyses

84 BrdU Br Br Br BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) Br

85 BrdU Br Br Br Br

86 Br Br Br Br Acid or DNase BrdU

87 BrdU Br Br Br Br

88 BrdU Br Br Non-radioactive Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-brdu access, can affect: Br Ability for other antibodies to bind Morphology Ability for dyes that require dsdna to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes Br

89 Click-iT EdU EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)

90 Click-iT EdU

91 Click-iT Edu Non-radioactive No DNA denaturation required Simplified protocol Small molecule detection Multiplex compatible, including Other antibodies Dyes for cell cycle analysis

92 Shrnutí přednášky analýza DNA analýza buněčných funkcí fluorescenční proteiny Na Na konci konci dnešní dnešní přednášky přednášky by by jste jste měli: měli: vědět vědět jakým jakým způsoben způsoben je je možné možné analyzovat analyzovat buněčný buněčný cyklus. cyklus umět umět navrhnout navrhnout další další parametr parametr kombinovatelný kombinovatelnýs s DNA DNA analýzou. analýzou znát znát příklady příklady buněčných buněčných funkcí funkcí které které je je možné možné analyzovat analyzovat na na průtokovém průtokovém cytometru. cytometru vědět vědět co co jsou jsou to to fluorescenční fluorescenční proteiny proteiny a a jaké jaké jsou jsou výhody výhody jejich jejich využití využití v v buněčné buněčné biologii. biologii co co je je to to click-it. click-it. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie