Imunoanalýza nízkomolekulárních látek

Transkript

1 Imunoanalýza nízkomolekulárních látek ZS 2008 Aidi Avidin Y Ag Biotin Vítězslav Maier, Juraj Ševčík 1

2 Imunoanalýza nízkomolekulární látek Biochemické analytické metody založené na biospecifických interakcích mezi stanovovanou látkou (analytem) a specifickém činidle. Imunoalýza využití imunitních chemických (imunochemických) reakcí (interakcí) pro stanovení nízkomolekulárních i vysoko- Molekulráních látek Doporučená literatura: M. Ferenčík: Imunochémia, Afla, Bratislava (1989). J. Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, Nucleus HK, Pardubice (2004) s B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, VŠCHT, Praha (2008) V. Chromý, J. Fiścher, J. Havel, M. Votava, Bioanalytika, MU Brno, Brno (2002) V. Doležalová a kol.: Laboratorní technika v klinické biochemii a toxikologii, IDVPZ, Brno (1995). C.A. Burtis, E. Ashwood, D.E. Burns (Eds.): Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, 6th Ed., Sounders Elsevier, St. Louis, Missouri, i USA (20008). A. Johnstone, R. Thorre, Immunochemistry in Practice, 3rd Ed., Blackwell Science, Australia (1996). E.P. Diamandis, T.K. Christopoulos (Eds.): Immunoassay, Academic Press, San Diego, California, USA (1996). 2

3 Postavení Imunochemie v biovědách IMUNOCHEMIE MOLEKULOVÁ IMUNOLOGIE KLINICKÁ IMUNOLOGIE IMUNOPATOLOGIE IMUNOBIOLOGIE BIOLOGIE PATOLOGIE CHEMIE IMUNOLOGIE MIKROBIOLOGIE MIKROBIÁLNÍ IMUNOLOGIE BUNĚČNÁ IMUNOLOGIE TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE IMUNOLOGIE NÁDORŮ GENETIKA FARMAKOLOGIE PSYCHONEUROLOGIE HEMATOLOGIE IMUNOLOGIE STÁRNUTÍ IMUNOTOXIKOLOGIE EKOIMUNOLOGIE MEDICÍNA IMUNOFARMAKOLOGIE IMUNOGENETIKA PSYCHONEUROIMUNOLOGIE IMUNOHEMATOLOGIE 3

4 Významné objevy spojené s imunochemií 1906 F. OBERMAYER Modifikované proteínové antigeny E. PICK 1907 S. ARRHENIUS monografie imunochemie 1917 Karl LANDSTEINER hapteny 1929 Michael HEIDELBERGER kvantitatívní chemická serológie 1934 J. MARRACK reakce antigen-protilátka 1938 Elvin KABAT protilátky jako globulíny Arne TISELIUS 1958 Rodney R. PORTER struktura imunoglobulínů 1959 Gerald M. EDELMAN struktura imunoglobulinů K. ISHIZAKA studium IgE H. BENNICH S.G.O. JOHANSSON 4

5 Význam imunitního systému pro život Pro vznik života je potřebné: 1) Získávání volné energie a její přeměna do formy, která je využitelná pro uskutečňování biochemických reakcí (základní roli hraje ENZYM). 2) Přepis a přenos genetické informace (transkrice a replikace genů). 3) Získávání informací z vnější i vnitřního prostředí a jejich zpracování a převedení na koordinaci a regulaci životně důlěžitých procesů v živém organismu. Příjem a zpracování informací je i v současné době pro každou živou soustavu, buňku ň i jednotlivce podmínkou existence zabezpečuje č adaptaci na změny vnitřního i vnějšího prostředí. Chemický (humorální) Informační systémy živých soustav Elektrochemický ký (nervový) Imunochemický (imunitní) 5

6 Imunitní systém vývojově velmi starý I nejjednodušší mnohobuněční živočichové jako jsou houby mají schopnost rozpoznast vlasní od cizího. Důsledkem je odvrhnutí (nespojení) tkání nebo buněk geneticky různých jednotlivců. Příčinou je existence specifických znaků tzv. tkáňových antigenů na povrchu buněk a jsou produkty genů. Imunitní systém jde o difúzní orgán, který u dospělého člověka váží asi 1000 g. Skládá se z lymfocytů (specifický druh bílých krvinek) Z některých přídatných buněk (makrofágy, polymorfonukleární Leukocyty) z molekul l protilátek (imunoglobulinů) li a z dalších Milionů molekul různých výkonných a regulačních látek imunohormony, složky komplementu, mikrobicidní a cytotoxické látky. 6

7 Formy imunity NESPECIFICKÁ (přirozená, vrozená) realizace několik anatomických struktůr a fyziologické systémy fagocytóza, NK-buňky y( (buňkové mechanizmy) komplementový systém a mnohé cytokíny (humorální) podmínky není potřebný předchádzející kontakt s antigénem působí ihned po styku organizmu s antigenem nemají imunologickou paměť využití při očisťování tkání od cizorodých SPECIFICKÁ (získaná, adaptívní) realizace výkonné a regulační T-lymfocyty (buňkové mechanizmy) protilátky (humorální) podmínky reagují jen s antigenem, který jich aktivoval nepúsobí ihneď po styku organizmu s antigénem (po niekolika dnech) majú imunologickou paměť využití v antiinfekční a protinádorové obraně látek v antiinfekční a protinádorové obrane 7

8 Formy imunity PROSPEŠNÁ vznik imunity INERTNÍ imunologická tolerance ŠKODLIVÁ imunopatologické stavy (alergia, autoimunita) SYSTÉMOVÁ působí v celém organismu LOKÁLNÍ působí jen v určitých častech těla (sliznice nosní, střeva) AKTIVNÍ postinfekční, postvakcinační č PASÍVNÍ transplacentový a kolostrální přenos, injekovaní antitoxických sér a gama-globulínu 8

9 Antigeny Anti = proti Gen = tvořit Antigen makromolekulární látky, které imunitní systém rozpoznává jako cizí (přirozené i umělé). Po setkání s vhodným iniciátorem stimulují tvorbu protilátek, lymfokyninů A výkonných T-lymfocytů vznikne imunitní odpověď Antigen Kompletní (funkční) - imunogen Nekompletní (nefunkční) - hapten Imunogen má schopnost navodit imunitní odpověď (vznik protilátek, regulačních a výkonných lymfocytů) a zároveň je specifický má schopnost s těmito lymfocyty y y a protilátkami reagovat. 9

10 Látka má vlastnosti antigenu pouze tehdy splňuje li dva základní předpoklady: Látka musí mít složení odlišné od chemického složení organismu. Látka musí být komplexní makromolekula. Antigen tedy musí mít ve své molekule určité uskupení (část struktury, funkční skupiny, uskupení atomů), jimiž se odlišuje od všech struktur nalézajících se na površích imunokompetentních buněk tyto buňky antigen rozpoznají jako cizí. Antigenní molekula musí mít dostatečně velkou molekulovou hmotnost (velikost) a musí mít komplexní strukturu. Tuto podmínku velmi dobře splňují makromolekuly (např. biopolymery). Malé molekuly (s Mr < 5000 Da) obecně nebývají imunogenní, ale po konjugaci s větší makrokomolekulou (např. protein) získavají imunogennost. 10

11 Specifita je založena na skutečnosti, že antigen reaguje pouze s těmi lymfocyty a protilátkami jejichž tvorbu vyvolal. S ostatními lymfocyty a protilátkami obyčejně nereaguje. Hapten není schopen vyvolat imunitní reakci může pouze specificky reagovat S buňkami a protilátkami, které vznikly po interakci imunogenu s imunokompetentní buňkou. Hapten je součástí molekuly kompletního antigenu Imunogen se skládá z Makromolekulárního nosiče Nízkomolekulární determinantní skupiny (determinant) 11

12 Jaké látky mohou být imunogenem? Přesná odpověď není známá Látka může být imunogenem pouze tehdy má-li určité fyzikální, chemické a biologické vlastnosti. Imunogennost takové látky ale závisí i na genetické dispozici organismu a vyspělosti organismu, kterému se imunogen aplikuje a na způsobu aplikace. fyzikální Vlastnosti ti antigenu chemické biologické 1. Fyzikální vlastnosti molekulová hmostnost. Imunogeny patří mezi makromolekulární látky a mají většinou větší Mr než Imunogeny Nerozpustné (mikroorganismy, buňky, subcelulární struktury) Koloidní (rozpustné) 12

13 Snižováním rozpustnosti koloidních imunogenů se zvyšuje jejich imunogennost Koloidní imunogeny se před imunizací srážejí bentonitem nebo síranem hlinitodraselným.! Syntetické polymery (např. teflon, silon, nylon, PVC atd.) nevykazují imunogennost, i když mají dostatečně velkou molekulovou hmostnost. 2. Elektrický náboj Přítomnost elektrických nábojů na molekule imunogenu není podmínkou imunogennosti. Pokud má ale imunogen kladný náboj, bude mít vzniklá protilátka záporný náboj a naopak. 3. Tvar molekuly l (konformační č struktura) Konformace molekuly antigenu rozhoduje o přístupnosti determinantních skupin 13

14 Proteiny, ypolypeptidy ypp y Imunogeny Polysacharidy (imunogeny bývají pouze vyjímečně) Nukleoproteiny a jiné komplexy Imunogenní mohou být i některé RNA a jednovláknová (denaturovaná) DNA, ale Hlavně jejich komlexy s proteiny (nukleoproteiny). Lipidy jsou obyčejně pouze hapteny, ale v komplexech s proteiny nebo poly- sacharidy jsou dobrými imunogeny. Imunogenní schopnost mohou mít i některé syntetické a polosyntetické antigeny Nejsilnější imunogeny jsou: proteiny, polysacharidy a některé jejich komplexy. (neplatí ale obecně). Např. ř želatina je velmi slabý imunogen, ale sérový albumin je silným imunogenem 14

15 Co je podstatou rozdílu v imunogennosti mezi želatinou a albuminem? Albumin obsahuje na povrchu dostatečný počet determinantních skupin ve Vhodné konformaci a přístupnost pro receptory imunokompetentních buněk. V želatině je determinantních skupin málo. Jak želatinu převést na imunogen? Navázat na želatinu nízkomolekulární k lá í hapteny (dinitrofenol, it kyselina arsanylová ), které přeberou funkci determinantních skupin. Modifikovaná želatina pak může být dobrým imunogenem. 3. Biologické vlastnosti Podmínkou je druhová nepříbuznost. Čím větší bude rozdíl mezi organismem ze kterého imunogen pochází a organismem do kterého imunogen vniká tím vyšší bude jeho imunogennost. Pozor! Ne všechny tělu cizí látky jsou imunogenní Např. uhlík ve formě sazí je lidskému tělu cizí, ale nenavodí imunitní odpověď. Z těla je eliminován mechanismy přirozené imunity y( (fagocytozou). 15

16 Je tedy potřebné aby látka měla kombinaci všech uvedených vlastností fyzikálních, chemických a biologických! Chemická podstat antigennosti Pomocí uměle připravených antigenů (konjugát haptenu s bílkovinným nosičem) bylo zjištěno, že protilátky proti uměle připravenému antigenu reagují (tvoří precipitáty) p i s jinými bílkovinami (nosiči haptenu), pokud jsou konjugovány se stejným haptenem. Souhrn vlastností, které musí mít imunogen, aby došle k tvorbě protilátek Povrchová a strukturní stabilita molekuly. Struktura by měla být nahodilá a rozmanitá. Minimální molekulová hmostnost by se měla pohybovat aspoň kolem 5000 Da. Schopnost být metabolizována vživém organismu (není nezbytná podmínka pro uměle připrané imunogeny). Přístupnost části imunogenu, který svou strukturou odpovídá za tvrobu protilátek. 16

17 Pokud mají dva antigeny dva shodné nebo strukturně podobné antigenní determinanty, mají protilátky vytvořené proti jednomu z nich tendenci reagovat také s druhým antigenem. Taková reakce se označuje jako křížová. Antigen, který byl použit k vyvolání tvorby protilátek (imunogen) je nazývan jako homologní antigen a křížově reagující antigen je označován jako heterologní antigen. Příkladem antigenní specifičnosti je schopnost protilátek specificky rozlišovat mezi glukozou a galaktozou, které se od sebe liší pouze vzájemnou polohou hydroxylové skupiny a atomu vodíku navázaných na tentýž atom. Jiným příkladem může být vliv izomerie diastereoizomerů vinné kyseliny konjugované s bílkovinným nosičem. Antigen Protilátky Levovinná Pravovinná Mesovinná Levovinná +++ ± + Pravovinná Mesovinná ± Každá protilátka reaguje velmi silně se svým homologickým antigenem (antigem nesoucí stejný hapten), ale reaktivita mezi levovinnou a pravovinnou kyselinou se zřetelně neprojeví. Protilátka mesovinné kyseliny reaguje s levovinou i pravovinnou kyselinou. 17

18 Syntetické a konjugované antigeny Velké využití v imunoanalytické chemii Možnost přípravy cílených antigenů pro stanovené jakékoli nízkomolekulární látky Bohužel v mnoha případech poměrně ě ě pracné Syntetické antigeny jsou biopolymery se známou strukturou nosiče a determinantních skupin. Jde zejména o polypeptidy s lineárním nebo rozvětveným řetězcem. Kromě antigenů složených pouze z aminokyselin, lze syntetizovat i antigeny, které ve své molekule obsahují i sacharidy, nukloesidy a jiné látky. Konjugované antigeny představují komplexy, ve kterých ne přirozený nebo i Syntetický nosič jsou navázané chemicky definované determinantní skupiny (hapteny) 18

19 Konjugované antigeny Haptenem může být každá nízkomolekulární látka a po navázání na vhodný nosič se může stát imunogenem může vyvolat imunitní odpověď. Konjugace hapten + nosič -in vitro - in vivo In vivo konjugace nastává např. mezi léčivem a buňkami případně s makromolekulami přímo v organismu hostitele. Důsledkem je pak vznik alergických reakcí na tyto látky. Např. konjugace penicilinu nebo sulfonamidu s makromolekulami nebo buňkami vorganismu. In vitro konjugace konjugované antigeny připraveny in vitro je možné využít pro různé imunologické výzkumy, nebo se proti nim připraví protilátky, které jsou základem citlivého a specifického stanovení příslušných hapténů imunochomickými metodami 19

20 Příprava konjugovaných antigenů Co je k tomu potřeba? 1. Nosič velká molekulová hmotnost (nejčastěji vhodný protein) 2. Přítomnost vhodných reaktivních skupin v molekule nosiče, pomocí kterých je možné navázat hapten 3. Hapten Nejčastějši proteinové nosiče -sérové albuminy -globulinyg y -vaječný albumin -fibrinogen Např. bovine serum albumin (BSA) obsahuje 104 reaktivních skupin ε-aminoskupiny lysinových jednotek, α-aminoskupiny, p -OH skupina v tyrosinu, -SH skupina cysteinu, Imidazolová skupina histidinu. Hapten musí mít také vhodnou reaktivní skupinu. Konjugované vakcíny některé vakcinační č íimonogeny se chovají jíjako hapteny 20

21 Vznik vazby mezi haptenem a nosičem je možné realizovat velkým množstvím konjugačních reakcí. Reakce se smíšeným anhydridem H 3 C CH 3 CH H 3 C CH CH 3 R COOH HAPTEN H 2 C O H 2 C + O Cl C O + HCl O C C R O O H 3 C CH CH 3 R H 2 C O C O O C O + H 2 N- PROTEI N NOSIČ R C O H N PROTEIN H 3 C CH CH 3 + CO 2 + H 2 C OH KONJUGÁT Nosič např. BSA touto metodou se naváže na jednu molekulu 15 až 30 haptenových skupin 21

22 Reakce s karbodiimidem Jiná posloupnost reakcí: Nejdříve se naváže nosič (protein) na molekulu karbodiimidu a vzniklý meziprodukt reaguje s haptenem, který má volnou karboxylovou skupinu a vzniká O-acylmočovina. O-acylmočovinasemůže intramolekulárně přesmyknout na N-acylmočovinu. Oba deriváty močoviny reagují s aminoskupinami proteinového nosiče, přičemž vzniká konugát. R 2 R 2 H R 2 R 2 N C N H + N C N KARBDIIMID R 2 R 2 + R1 O R 2 NH OC R 1 H + N C N C OH N C O + H HAPTEN R 2 O-ACYLMOČOVINA 22

23 R 2 NH OC R 1 Přes myk R 2 NH OC R 1 C O C N N O R 2 R 2 N-ACYLMOČOVINA R 2 NH OC R 1 C N + H 2 N PROTEIN R 2 C NH PROTEIN O R 2 O NOSIČ R 2 + R 2 NH H N CO KONJUGÁT O-Acylmočovina může reagovat s karboxylovou skupinou dalšího haptenu, čímž vzniká anhydrid, který poté reaguje s aminokyselinou nosiče. 23

24 R 1 R 2 NH OC R 1 O N C R 2 O O- ACYLMOČOVINA C O + R COOH HAPTEN H 2 N C R 1 + PROTEIN R 1 CO R 1 C O C O ANHYDRID O O HN PROTEIN NOSIČ KONJUGÁT R 1 + R 2 NH R 2 H N CO + R 1 COOH R 1 Reakce probíhá ve vodném prostředí, pokud se použijí ve vodě rozpustné karbdiimidy, např. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochlorid. H 2 C CH 2 H 2 C N C N CH 2 N H 3 C H 3 C H CH 3 Cl 24

25 Uvedenými způsoby se mohou konjugovat nízkomolekulární látky jako jsou např.: -AMP -Morfin -LSD -Serotonin -Barbituráty -prostaglandiny Nízkomolekulární látky, na které si chceme vytvořit protilátky Stejných reakcí je možné využít pro vznik konjugátů protien-protein, namísto haptenu se analogicky v reakci použije protein Další reaktivní skupinou přes ktereou se mohou hapteny navázat na nosič je NH 2 skupina. Hapteny nesoucí aminoskupinu alifatické aromatické 25

26 Hapteny s aromatickou aminoskupinou Landsteiner klasická diazotační technika Reakce je založena na diazotaci aminoskupiny s HNO 2 a následnou kopulací dizoniové soli s tyrosionovými, histidinovými nebo lysinovými jednotkami v molekule proteinového nosiče. V některých případech mohou reagovat i argininové a tryptofanové jednotky. AsO 3H 2 AsO H AsO H 2 OH AsO 3 H 2 NaNO 2 HCl + HO NH 2 N Cl Cl N N CH 2 CH O C NH N N PROTEIN HAPTEN CH 2 CH NOSIČ OC NH PROTEIN KONJUGÁT (AZOPROTEIN) 26

27 Hapteny s alifatickou aminoskupinou Existuje několik metod pro vazbu alifatického aminu na nosič - reakce s karbodiimidem - reakce s glutaradehydem - reakce s heterobifunkčními imidestery Reakce s glutaraldehydem R + NH 2 O CH HC O R N C H CHO + H 2 O HAPTEN GLUTARALDEHYD R R N C H CHO + H 2 N PROTEIN NOSIČ - H 2 O N C H H C N PROTEIN 27

28 R N C H H C NaBH 4 N PROTEIN R HN C H 2 H 2 C NH PROTEIN KONJUGÁT Nevýhody glutaraldehydové reakce: - Vznik nežádoucích vedlejších produktů, homokonjugátů a různých polymerů Nyní je glutarladehydová konjugace nahrazena konjugací s heterobifunkčním i látkami typu maleinimid-n-hydroxysukcinimiddiestery, které tvoří můstky mezi haptenem a nosičem. 28

29 R NH 2 + O O O C R N O O R NH C R N O HAPTEN O N O R = -CH2-CH 2 -CH O OH N O O O O O O S PROTEIN R NH C R N + HS PROTEIN R NH C R N O NOSIČ O KONJUGÁT 29

30 Adjuvancita Látky, která zvyšují imunogennost antigenu (adujvantní = pomáhající). mechanismus působení adjuvantních látek není příliš znám, ale zřejmě jde o kombinaci postupného uvolňování antigenu, stimulaci fagocytózy a nespecifické aktivity lymfocytů. adjuvans významně potencuje působení antigenů na imunitní systém vakcinovaného jedince. Nejčastěji j používaná adjuvantní směs je Freundovo adjuvans (FA) Jeho složkami jsou minerální olej, emulzifikační činidlo a vodný roztok antigenu. Směs je připravována tak, že se tvoří emulze vody s olejem. Tímto způsobem je antigen rozptýlen na nejjemějších tukových kapénkách, z nichž je pomalu uvolňován. Kompletní FA obsahuje ještě i suspenzi mrtvých baktérií (např. mycobacterium tubercolosis) Látky, které jsou schopné zvyšovat imunogennost: Kamenec, fosforečnan hlinitý, hydroxid lithný, síran berylnatý, saponin, emulze minerálního oleje, syntetické nukleové kyseliny s dvoušroubovicí (např. poly A), lipopolysacharidy. 30

31 Protilátky Největší skupinou jsou IMUNOGLOBULINY Imunoglobuliny jsou proteiny živočišného původu, které mají protilátkovou aktivitu, ale i některé jiné proteiny s příbuznou chemickou strukturou a tím antigenovou specifitou. A. Tiselius, E. A. Kabat (30. léta minulého století) separace protilátek ze séra a popis jejich chemické struktury. Za pomocí volné elektroforézy frakcionoval sérové proteiny. Frakce sérových proteinů, která se pohybuje nejpomaleji (γ-globuliny) obsahuje většinu sérových protilátek. Bylo dokázáno, že protilátky jsou sérové proteiny globulinového typu. Imunoglobuliny heterogenní glykoproteinové molekuly Gama-globuliny 31

32 1950 Porter 1960 Edelman Studium struktury yprotilátek IMUNOGLUBULINY = Ig Molekuly protilátek se skládají z několika polypeptidových řetězců Model protilátky Molekula protilátky obsahuje 4 peptidové řetězce, kde dva a dva jsou identické. Polypeptidové řetězce jsou navzájem spojené disulfidovými vazbami. Všechny protilátky mají stejnou základní strukturu. Malé rozdíly, které pak mezi nimi existují jsou příčinou rozdílných fyzikálně chemických a biologických vlastností. 32

33 Dva těžké (H) řetězce jsou kovalentně spojeny disulfidickými můstky. Ke každému řetězci je cystinovým můstkem připojen jeden lehký (L) řetězec. Těžké řetězce se skládají ze 4 (u některých tříd 5) strukturně podobných domén. Každá doména je tvořena sekvencí 120 aminokyselin. Přibližná molekulová l hmostnost t L-řetězců ř ů je tedy 25 kda, težkých řetězců kda. Domény na N-konci těžkého i lehkého řetězce jsou vaiabilní a označují se V H a V L detaily jejich struktury se liší individuálně mezi molekulami prodkukovanými různými klony B-lymfocytů. Variabilní domény H a L řetězců vytvářejí společně č ě vazebné místo pro antigen Existuje 5 základních izotypů ů lidských imunoglobulinů li ů IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 33

34 V lidském organismu se IgD, IgG a IgE vyskytují jako monomery, IgA jako dimer a IgM jako pentamer. Přehled vlastností jednotlivých imunoglobulínů je uveden v tabulce. IgG Imunoglobulin Zastoupení v lidském organismu Poznámky ~ 75 % 4 podtřídy; nedostatek se projevuje respiračním onemocněním IgA ~ % IgM (makroglobulín) ~ 3 10 % IgD velmi nízká koncentrace IgE velmi nízká íkákoncentrace Je tvořen 5 podjednotkami a má tedy 10 vazebných míst pro antigeny y( (M r = 900 kda) Zvýšená hladina u některých chronických onemocněních Zvýšená hladina u některých alergiích 34

35 Interakce mezi antigenem a protilátkou Smícháme-li roztok antigenu s roztokem protilátky v přesném stechiometrickém poměr vzniká precipitát (sraženina). Studiem této interakce je možné zjistit údaje o: - Obsahu protilátky - efektivním počtu vazebních míst v molekule antigenu Stabilitu vznikých imunokomplexů určují mezimolekulové síly. Tj. Jde o stejné síly, které se podílejí na stabilizaci prostorové struktury proteinů a jiných makromolekul: vodíkové vazby, hydrofóbní interakce, elektrostatické síly, disperzní síly, prostorové odpudivé síly 35

36 Při interakci antigenu (reaguje vlastně ta část, která je hapetenem H) a vazebného místa protilátky (Ab) vzniká rovnovážný stav: K a [Ab] + [H] [AbH] K a asociační konstanta K K d disociační konstanta K d [ AbH ] K = [ Ab ][. H ] K...rovnovážná asociační konstanta Rovnovážná konstanta K charakterizuje efektivnost vazby a její hodnoty při reakci antigenů se specifickými protilátkami se pohybují v rozsahu 10 5 až mol/l. Jakým způsobem lze určit rovnovážnou konstantu? Smíchat roztoky haptenu a protilátky a po ustálení rovnováhy stanovit koncentraci volného haptenu a haptenu vázeného v komplexu s protilátkou. 36

37 Naměřené hodnoty se dosadí do Scatchardovy nebo Langmuirovy rovnice Schatchardova rovnice [ AbH ] nk [ H ] = r = Ab 1+ K[ H ] r...počet molů haptenu vázané jedním molem přítomné protiláty [H]...rovnovážná koncentrace volného haptenu n...valence (vaznost) protilátky r = nk rk H r/[h] Směrnice = -K Průsečík = n r 37

38 Uvažujeme-li systém, který se skládá z bivalentní protilátky (n = 2) a monovalentního haptenu a pokud se na přesně polovinu vazebných míst protilátky navázal hapten (r = 1) je možné rovnici přepsat: 1 H = 2K K = K [ ] 0 K 0 je vnitřní asociační konstanta K 0 se rovná převrácené hodnotě koncentrace volného haptenu, a to tehdy ypokud má komplex protilátka hapten molární poměr 1:1. Jednotkou je L/mol 38

39 Langmuirova rovnice Úpravou rovnice r H = nk rk Je možné dostat vztah 1 r = 1 n g [ H ] K n Tento vztah odpovídá Langmuirově izotermě. 1/r Směrnice 1/(n- K) Průsečík 1/n 1/[H] 39

40 Langmuirova i Scatcharodova rovnice charakterizuje nejen sílu vazby mezi haptenem a protilátkou, ale i vazbu jakéhokoliv ligandu na specifické vazebné místo. Afinitait Charakterizuje intenzitu s jakou se uskutečňuje interakce mezi vazebným místem protilátky a determinantem antigenu (haptenem). Afinita je termodynamickým vyjádřením přímé vazebné energie protilátky pro jeden determinant antigenu. G 0 = RTlnK Čím bude mít protilátka vyšší afinitu, tím zápornější bude hodnota G 0 Antigeny obsahují několik determinantů a proto se místo afinity zavádí pojem AVIDITA 40

41 Avidita Charakterizuje vazebnou energii mezi komplexním antigenem a protilátkou. Avidita zahrnuje afinitu, která je dána příspěvky všech vzniklých vazeb mezi antigenem a protilátkou a další nespecifické faktory, které ovlivňují vazbu mezi antigenem a protilátkou. Uplatňují se tedy multivalentní interakce a nejen specicická interakce mezi a vazebným místem a determinantní skupinou. Ve skutečnosti probíhá interakce podle obecného schématu: n Ab + mh Ab n H m 41

42 Klasická precipitační reakce Při interakce antigenu s protilátkou dochází k podobné situaci, jako při srážecích reakcích. Budeme-li přidávat antigen k určitém množství protilátky, bude nejdříve postupně docházet k narůstající tvorbě precipitátu (tj. Tvorbě komplexu antigen-protilátka). Přidáváním antigenu se po určité době dosáhne optima, za kterým vzniká méně precipitátu. V této fázi reakce už vznikají rozpustné komplexy antigenu a protilátky. Antigen ani protilátka nejsou Ekvivalentní bod přítomny v supernatantu m precipitát m antigenu 42

43 Z precipitační křivky lze vidět, že přidáváním stále většího množství antigenu se dosáhne určité optimum, za kterým vzniká už méně precipitátu. Analýzou precipitátu vytvořeného při nadbytku protilátky, kdy se vazebné místa na antigenu dostatečně nasytí, lze určit molární poměr antigenu a protilátky v komlexu a tedy i vaznost antigenu. 43

44 Grafické znázornění komplexů vytvořených mezi hypotetickým čtyřvalentním antigenem a divalentní protilátkou. V této oblasti existují rozpustné komplexy mezi Ag a Ab, které mají většinou následující molární poměry: Ag4Ab3, Ag3Ab2 a Ag2Ab 44

45 Pokud se roztok antigenu smíchá v přesných poměrech s roztokem obsahujícím protilátky, dochází k vytvoření precipitátu. p Pomocí kvantitativní analýzy interakce mezi antigenem a protilátkou získáme údaje o obsahu protilátky, o počtě valencí antigenů, tj. opočtu efektivních vazebných míst. Tyto údaje mohou být velmi rozdílné v závislosti na povaze antigenu jeho velikosti a původu protilátky. Například králíčí protilátka může vázat vaječný albumi prostřednictvím 10 vazeb, ale lidský tyreoglobulin může s králíčími protilátkami vytvářet až 40 vazeb. Antigenní determinanty nebo epitopy nejsou identické. 45

46 Měření afinity protilátek Mírou afinity je rovnovážná konstanta tvorby komplexu mezi protilátkou a antigenem. Prakticky se postupuje tak, že při několika koncentracích antigenu se změří po dosáhnutí rovnovážného stavu množství antigenu volného a vázaného na protilátku. rovnovážná dialýza spektrofotometricky zhášení fluorescence gelová chromatografie Rovnovážná dialýza polopropustná membrána umožňuje propuštět nízkomolekulární hapten a protilátku naopak nepropouští. Spektrofotometrická metoda pokud haptén navázaný na protilátku má jiné absorpční č spektrum než volný hapten, lze využít měření absorbance b při dvou vlnových délkách. 46

47 Fluorescenční metody Schopnost fluorescence může mít hapten. Po navázaní na protilátku se fluorescence haptenu sníží nebo zvýší. Schopnost fluorescence může mít protilátka. Po navázání nefluoreskujícího haptenu na protilátku dojde k přenesení fluorescence z protilátky na hapten a fluorescence komplexu se sníží. Gelová chromatografie Pokud má antigen a protilátka dostatečně velký rozdíl mezi molekulovými hmotnostmi je možné tuto metodu využít ke stanovení množství volného a vázaného antigenu. V dialyziačním i č sáčku je antigen (hapten) částečně tč ve volné forměě a částečně navázaný na protilátky v závislosti na konstantě afinity. Přes dialyzační membránu mohou pronikat pouze molekuly antigenu (haptenu), a proto jeho koncentrace mimo dializační sáček bude stejná jako koncentrace volného haptenu uvnitř dializačního sáčku. Stanovení celkového množství haptenu uvnitř dializačního sáčku umožní vypočítat množství haptenu, které se navázalo na protilátku. Opakováním tohoto pokusu při různých koncentracích hapténu se dá určit průměrná afinitní konstanta K. 47

48 Příprava protilátek 1. Polyklonální protilátky Jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů a proto jsou namířeny proti více epitopům ů určitého antigenu nebo směsi ě antigenů. ů Získávají se imunizací laboratorních zvířat antigenem (nebo jejich směsí). Při imunizaci organizmu dochází ke stimulaci různých B lymfocytů y a k jejich j proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky. Je produkováno spektrum protilátek proti různým epitopům příslušné bílkoviny s různou schopností se na ni vázat. Specifita polyklonálních protilátek velice závisí na imunizačním protokolu, resp. na tom, v jaké fázi imunitní odpovědi zvířete jsou z něj protilátky získávány. Časový průběh imunizace zvářete (myš, králík) 48

49 Ke stimulaci tvorby polyklonálních protilátek se využívají tzv. imunizační schémata. Zjednodušeně jde o postupnou vakcinaci zvířetei příslušným antigenem s FA. 1. den odběr předimunního séra z ucha zvířete a injekce první dávky (0,2 až 0,5 mg v objemu 1 ml subkutánně 30. den druhá injekce antigenu s FA (0,2 mg až 0,5 mg v objemu 0,5 ml) 40. den odběr séra a kontrola titru odebraného séra 50. den třetí injekce antigenu s FA (0,2 mg až 0,5 mg v objemu 0,5 ml) 65. den čtvrtá injekce intravenózně (0,2 mg až 0,5 mg v objemu 0,5 ml) 75. den kontrola titru séra, vykrvení a izolace antiséra. Nevýhody: Zdlouhavá příprava Protilátky jsou heterogenní a chovají se tak jako směs činidel a ve své kvalitě se liší. Při každé imunizace se získá směs protilátek o jiném složení Výhoda: Možnost přípravy protilátek proti zvolenému antigenu přímo v laboratoři bez složitých postupů Polyklonální protilátky mívají vyšší afinitu oproti monoklonálním 49

50 2. Monoklonální protilátky Jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, jsou specifické proti jediné antigenní determinantě. Fúzí normálních B lymfocytů pocházejících z imunizovaného živočicha a neoplastických myelomových buněk lze připravit tzv. hybridomy, což jsou klony buněk schopné produkce monoklonálních protilátek. Zatímco mateřský normální B lymfocyt (od imunizovaného dárce) je nositelem specifity produkované protilátky, myelomová buňka je nositelem vysokého až neomezeného proliferačního potenciálu, nesmrtelnosti. Hybridom tedy zdědí po myelomové buňce možnost nepřetržitého růstu a po aktivovaném B lymfocytu schopnost syntetizovat monoklonální protilátku namířenou proti jedné antigenní determinantě. 50

51 Schéma přípravy p monoklonálních protilátek 51

52 Výhodou monokolonálních protilátek jsou: stále stejné složení, tj. určitá standardnost při jejich použití umožňují prokázat přítomnost nebo nepřítomnost jediného konrétního antigenu umožňují provádět vysoce specifické stanovení antigenů Využití monoklonálních protilátek: Buněčná biologie, analytická chemie, genetika, onkologie, patologie, hematologie. Nevýhody: dražší a pracnější příprava nižší afinita oproti polyklonálním protilátkám, což snižuje citlivost stanovení při jejich ji využití žiív analytické chemii 52

53 3. Rekombinantní protilátky Využití poznatků molekulární biologie pro přípravu protilátek Zjednodušené d schéma přípravy rekombinantích protilátek: Izolace genů kódujících protilátky z hybridomů Klonování izolovaných genů Výhody: - rychlejší připrava oproti monoklonálním protilátkám - vyšší afinita a specifita - možnost další modifikace vazebých vlastností protilátek - větší počet vazebných míst, což je výhodné pro imunochromatografii a imunosenzory Exprese 53

54 Purifikace protilátek Protilátky se získají ze zvířete nejčastěji odběrem krve z ušních žil. Protilátky jsou přítomné v séru. 1. Krev se nechá srazit a krevní koláč se odstraní centrifugací při g. Tímto postupem je získání krevní sérum. 2. Dalším krokem je přečištění imunoglobulinové frakce séra a) precipitace síranem amonným b) konvenční chromatografické techniky (EIC, GPC ) c) afinitní chromatografie jako SF slouží imobilizované komponenty z buněčné stěny (proteinový nosič) baktérie Streptococcus aureus nebo z různých streptokovoých kmenů vážící IgG v konstantních Fc regionech. IgG se váže na nutrální proteinový nosič v neutrálním či slabě alkalickém prostředí a eluují se glycin-cl pufrem při ph 2.7 následuje okamžitá neutralizace eluátu. Takto se získají polyklonální protilátky, které se pak selektují a kříží s nádorovými buňkami a jsou produkovány monoklonální protilátky. 54