Plynová chromatografie

Transkript

1 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 1 Plynová chromatografie Instrumentace Základní přednáška RNDr. Radomír Čabala, Dr. Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie

2 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 2 GC - Definice Plynová chromatografie fyzikálně-chemická metoda separace směsi látek na základě jejich rozdělování mezi dvě fáze, z nichž jedna je plynná a pohybuje se a druhá je pevná nebo kapalná a je nepohyblivá lze ji použít na separaci plynných látek nebo látek, které lze definovaným způsobem převést do plynného stavu

3 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 3 Blokové schéma plynového chromatografu tok nosného plynu signál řídící signály Zdroj nosného plynu Regulace průtoku nosného plynu Dávkovač Kolona Detektor Termostaty Vzorek dělič toku Regulace teploty Vyhodnocovací a řídící zařízení analytická informace

4 Plynový chromatograf GC PU 4500 klasický, s mechanickou regulací plynů 3 2. GC Shimadzu 2100 plně řízený PC s elektronickou regulací plynů 3. GC-MS Shimadzu QP5050 plně řízený PC s elektronickou regulací plynů ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 4

5 Nosný plyn Mobilní fáze v GC - nosný plyn (účastní se přenosu látek kolonou) Kritéria volby nosného plynu Používané plyny typ detektoru inertnost čistota (min. 99,99% až 99,9999%) hustota viskozita bezpečnost dusík helium vodík argon ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 5

6 Nosný plyn - vlastnosti Plyn Hustota Viskozita Tepená vodivost g.cm -3 µpa.s J.m -1.s -1.K -1 Vodík 0,0899 8,44 175,0 Helium 0,178 18,6 143,6 Dusík 1,250 16,58 23,86 Argon 1,784 21,2 16,75 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 6

7 Zdroj nosného plynu 3 3 A 2 B Tlakové láhve (1) Redukční ventily (2) A. vstupní tlak: atm B. výstupní tlak: 0,5-10 atm Rozvod plynů (3) Uchycení tl. lahví (4) ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 7

8 Běžně používané čistoty Čistota nosného plynu 99,99% (4N) až 99,9999% (6N) nedostatečně čisté plyny lze dočišťovat Odstraňování stopových nečistot voda molekulová síta kyslík v N 2 : Cu za zvýšené teploty v H 2 : na Pt katalyzátoru za laboratorní teploty stopy organických látek aktivní uhlí katalytické spalování na CO 2 a jeho sorpce zbytkové koncentrace řádově ppb v závislosti na znečištění ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 8

9 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 9 Čištění nosného plynu Systémy indikačních adsorbérů: -vícestupňový (1) - pro více druhů plynu (2) Indikační adsorbér (kyslík a voda) Katalytický čistič (kyslík a voda) 1 2

10 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 10 Čištění nosného plynu Systém adsorbérů pro GC Unicam 4500 v laboratoři 114A

11 Regulace a měření průtoku nosného plynu P i Dávkovač (Injektor) F opl Fi Dělič (Splitter) F c P i P 0 - tlak na vstupu - tlak na výstupu F spl Fi = Fc + Fspl + Fopl Kolona F i -průtok injektorem F spl -průtok děličem F opl -průtok oplachu septa F c -průtok kolonou F d -průtok detektorem F mg -průtok pomocného plynu Množství vzorku na koloně, m c Fc Fc mc = ma = ma F + F + F F c spl opl i F mg Detektor m a - dávkované množství analytu Fd = Fc + Fmg P 0 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 11 F d

12 Regulace a měření průtoku nosného plynu Konstantní tlak na vstupu Izotermální analýza (teplota kolony konstantní) průtok plynu na výstupu kolony konstantní Analýza s teplotním programem (nárůst teploty kolony s časem podle definovaného programu) s rostoucí teplotou klesá průtok (roste viskozita plynu) Konstantní průtok kolonou Izotermální a teplotní program změny viskozity plynu kompenzovány regulátorem průtoku ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 12

13 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 13 Redukční ventil - princip funkce f - napětí pružiny P 1, P 2 - vstupní a výstupní tlaky S1 - průřez jehlového ventilu S2 - plocha membrány atm ( ) f + P S = PS + P P S Úkol: snížit tlak a udržovat konstantní výstupní tlak nezávisle na průtoku Princip - tlak je regulován proměnným odporem toku tvořeným jehlou v kuželovém v sedle - jehla se pohybuje nahoru a dolu vlivem kombinace mechanického napětí pružiny a tlaku působícího na membránu - výstupní tlak je nastavován napětím pružiny

14 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 14 Regulátor průtoku - princip funkce Diferenciální regulátor průtoku (mass-flow controller) Elektronický regulátor průtoku Úkol: udržovat konstantní průtok nezávisle na vstupním a výstupním tlaku Princip - udržuje konstantní tlakový spád (P2-P3) na jehlovém ventilu (V) - tlaky P2 a P3 jsou regulovány proměnným odporem toku tvořeným jehlou v kuželovém v sedle - jehla se pohybuje nahoru a dolu vlivem kombinace mechanického napětí pružiny a tlaku působícího na membránu -průtoková rychlost je nastavována ventilem V - velikost jehly a kuželového sedla určuje rozsah průtokových rychlostí

15 Úkoly Dávkování vzorků reprodukovatelně a rychle převést kapalný či tuhý vzorek do plynné fáze beze změny jeho relativního složení zavedení malého definovaného objemu plynné fáze vzorku do kolony Podmínky nesmí se měnit tlakové a teplotní podmínky v systému dle teorie je pro dosažení maximální účinnosti je nutno dávkovat objem vzorku odpovídající objemu jednoho HETP Dávkovaná množství vzorku náplňové kolony: až 100 µg v 1-10 µl rozpouštědla kapilární kolony: max. 1 µg ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 15

16 Dávkování vzorků Plynné vzorky dávkovací smyčky a ventily "headspace" "purge and trap" Kapalné vzrorky a roztoky Náplňové kolony přímo do kolony (on-column) Kapilární kolony s děličem toku (split/splitless) přímo do kolony (on-column) s programovanou teplotou (PTV) velkoobjemové (LVI) termodesorpce (TDI) pyrolýza ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 16

17 Dávkování vzorků - plynné vzorky Dávkovací smyčky a ventily dvoupolohové šesticestné ventily s dávkovací smyčkou 1. Plnění smyčky 2. Dávkování vzorku Sample in Waste Sample in Waste Column mf Column mf ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 17

18 Náplňové kolony Dávkování vzorků - Náplňové kolony dávkované objemy: 1-10 µl koncentrace: 5-10 % (v/v) Metoda - přímo do kolony (oncolumn) celý dávkovaný objem vzorku stříkačkou zaveden přes septum přímo na začátek kolony nebo "lineru" "liner" skleněný a deaktivovaný zabraňuje styku vzorku s horkým kovovým povrchem a zabraňuje tak jeho rozkladu zadržuje netěkavé složky vzorku aby nekontaminovaly kolonu R.P.W.Scott - Gas Chromatography ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 18

19 Liner Dávkování vzorků - Linery skleněný, křemenný či kovový, deaktivovaný s náplní (A) a bez náplně (B,C) umožňuje zplynění vzorku zabraňuje styku vzorku s horkým kovovým povrchem a zabraňuje tak jeho rozkladu zadržuje netěkavé složky vzorku aby nekontaminovaly kolonu A B C Restek Restek Restek ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 19

20 Dávkování vzorků - Kapilární kolony - Split Kapilární kolony dávkované objemy: 0,1-2 µl koncentrace: 5-10 % (v/v) Dávkování s děličem toku (Split) celý dávkovaný objem vzorku stříkačkou zaveden přes septum do lineru pouze část objemu vzorku je zavedena do kolony zbylá část objemu vzorku odchází děličem do atmosféry Dělící poměr udává jaká část vzorku je zavedena do kolony F i F F opl spl F c Dávkovací parametry celkový průtok ( ml/min) průtok kolonou (0,1-2 ml/min) objem lineru (100 µl - 1 ml) F c /F i rozsah: 1/500-1/10 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 20

21 Dávkování vzorků - Kapilární kolony - Split Dávkování s děličem toku (Split) Výhody pro relativně koncentrované vzorky pro poměrně "špinavé" vzorky lze automatizovat velmi ostrá zóna vzorku na kokloně Nevýhody může docházet k rozkladu vzorků diskriminační efekt (diskriminace vysokých M r ) "backflash" nelze sledovat stopová množství ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 21

22 Dávkování vzorků - Kapilární kolony - Splitless Dávkování bez děliče toku (Splitless) celý dávkovaný objem vzorku stříkačkou zaveden přes septum do lineru v momentě dávkování uzavřen dělič, celý tok mf jde do kolony F i = F c +F opl velká část objemu vzorku je zavedena do kolony po definovaném čase je otevřen dělič, F i = F c +F spl +F opl zbytky vzorku odchází děličem do atmosféry Dávkovací parametry celkový průtok F i ( ml/min) průtok kolonou F c (0,1-2 ml/min) objem lineru (100 µl - 1 ml) objem par vzorku/rozpouštědla po jeho odpaření nesmí překročit 50% objemu lineru (nebezpečí vzniku "backflash") ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 22 F i F spl F c F opl

23 Dávkování vzorků - Splitless - Čas dávkování Čas dávkování (Hold time) doba uzavření děliče, kdy páry vzorku vstupují na kolonu liner se chová jako logaritmický zřeďovač (koncentrace klesá exponenciálně s časem) po jeho uplynutí se zbytky vzorku vypláchnou mf do atmosféry, pík rozpouštědla nechvostuje ID kolony (mm) Půtoková rychlost He (ml/min) Přibližná doba dávkování Teplota kolony 0,18 0,3 3 min 0,25 0,7 1,5 min 0,32 1,2 45 s 0,53 2,6 30 s 2 µl CH 2 Cl 2, 68,94 kpa, 250 C musí být min. 20 C pod bodem varu použitého rozpouštědla vhodná jsou rozpouštědla s bv nad 60 C (chlazení termostatu kolony pod 40 C je dlouhé) ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 23

24 Dávkování vzorků - Splitless Dávkování bez děliče toku (Splitless) Výhody pro velmi zředěné vzorky, stopová analýza pro poměrně čisté vzorky lze automatizovat použití stejného injektoru jako s děličem Nevýhody může docházet k rozkladu vzorků vzhledem k delší době pobytu vzorku v lineru "backflash" potřeba refokusace zóny vzorku (bez něj jsou píky velmi rozmyté a silně chvostují) nutná optimalizace (čas, objem vzorku, refokusace) ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 24

25 Známky výskytu backflash Dávkování vzorků - Backflash špatná reprodukovatelnost ploch píků chvostující píky "ghost" píky nelineární závislost plochy píků na dávkovaném objemu vzorku typické pro splitless a on-column dávkování Dávkovaný objem (µl) Objem par (µl) H 2 O CS 2 CH 2 Cl 2 Hexan Isooktan 0, , , , Objem lineru 1 ml, teplota 250 C, tlak 68,95 kpa ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 25

26 Dávkování vzorků - Kapilární kolony - On column Dávkování přímo do kolony celý dávkovaný objem vzorku stříkačkou zaveden přes septum (a příp. i liner) do kolony relativně velký objem par rozpouštědla způsobí velké rozmytí píků rozmytou zónu vzorku nutno opět zakoncentrovat ("refocusing") Podmínky kompatibilita polarity vzorku/rozpouštědla a sf nutná refokusace R.P.W.Scott - Gas Chromatography ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 26

27 Dávkování vzorků - Refokusace Metoda "Retention Gap" Průběh dávkování A - retention gap = počáteční část kolony bez sf, teplota kolony (většinou nízká na začátku teplotního programu) B - dávkování kapalného vzorku C - rozdělení kapalného vzorku na části D - odpaření všech částí vzorku E - začátek akumulace na sf F - vzorek bodově zakoncentrován na sf A B C D E F mf R.P.W.Scott - Gas Chromatography ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 27

28 Dávkování vzorků - Refokusace Metoda "Solute Focusing" Průběh dávkování A - obě zóny chlazeny B - dávkování kapalného vzorku do zóny 1 C - rozdělení kapalného vzorku na části D - odpaření a odstranění těkavého rozpouštědla, složky vzorku rozprostřeny v zóně 1 E - začátek ohřevu zóny 1, odpaření složek vzorku, akumulace na sf chlazené zóny 2, vzorek zakoncentrován v úzkém pásy sf F - začátek ohřevu zóny 2 a migrace složek vzorku, začátek analýzy A B C D E F Zóna 1 Zóna 2 R.P.W.Scott - Gas Chromatography ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 28

29 Seaparační kolona Separační kolony srdce celého GC systému místo průběhu separace parametry separace účinnost selektivita doba analýzy volba kolony druh SF rozměry Špatná volba kolony zaručeně zkazí analýzu! ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 29

30 Náplňové Náplňové kolony Trubice plněné náplní tvořenou adsorbentem (GSC) nebo nosičem pokrytým kapalnou stacionární fází (GLC) Analytické (HETP 1 mm) klasické materiál: sklo, nerez, teflon, Al délka: 30 cm - 5 m průměr (ID - internal diameter): 2-4 mm mikronáplňové materiál: sklo délka: 50 cm - 4 m ID: 1 mm Preparativní délka: 2-6 m ID: mm ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 30

31 Kapilární kolony Kapilární (HETP 0,3-0,5 mm) Trubice pokryté na vnitřní stěně stacionární fází (SF) materiál: tavený křemen (fused silica) potažený ochrannou vrstvou polyimidu délka: m ID: 0,53 mm (Megabore), 0,32 mm, 0,25 mm, 0,1 mm (Fast GC) druh a způsob umístění SF WCOT (Wall Coated Open Tubular) kapalná polymerní SF zakotvená na vnitřní stěně kapiláry tloušťka filmu SF (d f ): 0,001-5 µm SCOT (Support Coated Open Tubular) částice nosiče pokryté kapalnou fází zachyceny na vnitřní stěně kapiláry tloušťka SF: 1-5 µm PLOT (Porous Layer Open Tubular) adsorbent (SF) zachycen na vnitřní stěně kapiláry ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 31

32 Vlastnosti nosiče SF Náplňové kolony - Nosiče SF inertnost, chemická stabilita úpravy pro zvýšení inertnosti kyselé praní (acid wash - AW) alkalické praní silanizace povrchu dimethyldichlorsilanem (DMCS) nebo hexamethyldisiazanem (HMDS) mechanické vlastnosti tvrdost: nesmí se drobit malý specifický povrch: 0,5-20 m 2 /g (nesmí vykazovat adsorpční vlastnosti) zrnitost: 0,1-0,2 mm, Mesh porozita: ID pórů 0,1-1,5 µm, specifický objem pórů 1 ml/g ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 32

33 Materiál nosičů Náplňové kolony - Nosiče SF křemelina (křemičitany a hlinitokřemičitany) Chromosorb (AW, AW DMCS), Gas-Chrom, Chromaton, Inerton, Celite pálené cihly (podstatně tvrdší ne křemelina) Chromosorb P, Diatoport P, Anakrom P, Chezasorb, Rysorb skleněné kuličky (silanizované) teflonové kuličky (max. do 250 C) ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 33

34 Adsorbenty pro GSC Stacionární fáze - Adsorbenty relativně veliký specifický povrch (1-100 m 2 /g) molekulová síta na bázi aktivního uhlí (Carbosieve B) - permanentní plyny, voda, uhlovodíky grafitizovaný uhlík (graphitized carbon, Carbopack B a C) - karboxylové kyseliny, aminy, alkoholy silikagel (SiO 2, Porasil, Spherosil) - permanentní plyny, COS, H 2 S, CS 2, SO 2, thioly alumina (Al 2 O 3 ) - nižší uhlovodíky molekulová síta (3A - permanentní plyny, CO 2, 4A - H 2 S, SO 2, 5A - HCl, Cl 2 ) polymery polystyren (Chromosorb 103) - aminy, amidy, alkoholy, aldehydy, ketony styren-divinylbenzen (Chromosorb 102, Porapak P) - permanentní plyny, voda, alkoholy ethylvinyl-divinylbenzen (Porapak Q) - uhlovodíky, vodné roztoky org. látek, NO x polyvinylpyrolidon (Porapak R) - voda, HCl, Cl 2, C 1 -C 6 alkany polyvinylpyridin (Porapak S) - alkoholy 2,6-difenyl-p-fenylenoxid (Tenax) - alkoholy, glykoly, ethanolamin ethylenglykol-dimethylakrylát (Porapak T) - formaldehyd, voda ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 34

35 Kapalné stacionární fáze Požadavky na kapalné SF dobrá ale rozdílná rozpustnost pro separované látky (rozdělovací konstanta, podobné se rozpouští v podobném) nízká těkavost (1-10 Pa za pracovních podmínek) teplotní stálost (min do 200 C) teplotní rozsah: dolní mez - teplota tání, horní mez - teplotní stabilita+těkavost+citlivost použitého detektoru) chemicky inertní (nesmí reagovat se separovanými látkami) nízká viskozita při pracovní teplotě (nesmí téci) dobrá smáčivost nosiče Dosud popsáno více než 1000 druhů kaplaných SF ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 35

36 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 36 Stacionární fáze - kapacitní poměr Kapacitní poměr β poměr objemu MF a SF v koloně β = V V MF = SF K k D V MF - objem MF, V SF -objem SF, K D - distribuční konstanta, k - separační faktor s rostoucí tloušťkou filmu df klesá β a roste retence na koloně pro kapilární kolony β = r c 2d f r c - poloměr kolony, d f - tloušťka filmu SF

37 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 37 Selektivita Kapalné stacionární fáze - selektivita schopnost SF rozdělit dvě látky vyjádření selektivity separační faktor α 12 p γ logα log log = p1 γ1 r,1 D,1 r,1 první člen udává relativní těkavost látek a závisí jen na teplotě druhý člen vyjadřuje rozdíly interakcí látek se SF - selektivní interakce α 12 t K V = = = t K V r,2 D,2 r,2

38 Kapalné stacionární fáze - polarita Polarita kapalných SF Lze ji výjádřit ve formě příspěvků jednotlivých mezimolekulárních sil k interakci molekula látky - molekula SF Látka Orientační J/mol Indukční J/mol Disperzní J/mol Součet J/mol Dipólmoment C/m Polarizovatelnost /cm Ar 0,0 0, ,00 1,63 CO 0,4 8, ,40 1,99 HI ,27 5,40 HBr ,61 3,58 HCl ,44 2,63 NH ,01 2,21 H 2 O ,15 1,48 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 38

39 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 39 Kapalné stacionární fáze - polarita Klasifikace SF dle polarity Rohrschneider a McReynolds využití Squalanu jako referenční SF (100 C, 10% pokrytí nosiče) McReynoldsovy indexy I tl = I tl -I sq, kde I - Kovatsův index sada testovacích látek benzen ( I = X) - disperzní, indukované dipóly, π-π butanol ( I = Y) - H-můstky, donor e-páru 2-pentanon ( I = Z) - orientační, akceptor el.páru nitropropan ( I = U) - donor el.páru, pyridin ( I = S) - H + -akceptor polarita SF: P = X+Y+Z+U+S příspěvky nosiče k P I log t r log t n = n log t log t n+ 1 n

40 Kapalné stacionární fáze - polarita Příklady komerčních SF Název SF Pracovní teplota, C McReynoldsovy indexy X Y Z U S P Apiezon L směs vyšších uhlovodíků OV-17 fenyl-methylsilikon OV-210 kyanopropyl-methylsilikon Carbowax 20M polyethylenglykol DEGS diethylenglykolvínan OV-275 dikyanoalkylsilikon ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 40

41 Plnění kolon náplní Příprava náplňových kolon použitím přetaku použitím vakua použitím ultrazvuku skleněná či křemenná vata slouží k zachycení po malých dávkách náplně, ~ 0,5 ml rovnoměrnost plnění sklo - vizuální kontrola ocel - kontrola v GC ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 41

42 Příprava kapilárních kolon Předúprava kolon - příprava vnitřního povrchu odmaštění detergenty organická rozpouštědla vyhřátí na vysokou teplotu v proudu inetrního plynu zvýšení smáčivosti (zvýšení drsnosti povrchu) kovové kolony -většinou není třeba skleněné kolony plynný HCl, HF nebo methyltrifluorchlorethyleter vodný roztok HCl při zvýšené teplotě křemenné kolony vodný roztok HCl při zvýšené teplotě ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 42

43 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 43 Příprava WCOT kolon - dynamická metoda Dynamická metoda roztok SF v těkavém rozpouštědle protlačován kolonou konstantní rychlostí 0,5-10 cm/s přetlakem inertního plynu za laboratorní teploty objem roztoku SF je asi 10% objemu kolony nelze kontrolovat homogenitu filmu SF rychlá metoda zjištění tloušťky filmu obtížné, empirický odhad d f = r c 2 u ηr γ r d f - tloušťka filmu SF, r c - poloměr kapiláry, u -střední rychlost toku, γ r - viskozita roztoku SF, η r - povrchové napětí roztoku SF

44 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 44 Příprava WCOT kolon - statická metoda Statická metoda celá kapilára naplněna zředěným roztokem SF v těkavém rozpouštědle jeden konec kapiláry se uzavře a druhý se připojí k vakuu za laboratorní či zvýšené teploty zdlouhavá metoda dobře definovaná tloušťka filmu SF rc c d d f = f - tloušťka filmu SF, r c - poloměr kapiláry, c - koncentrace roztoku SF v % 200

45 Příprava PLOT kolon obtížná příprava v laboratoři Chemická příprava leptáním vnitřního povrchu skleněné kolony plynný HCl, HF nebo methyltrifluorchlorethyleter vodný roztok HCl při zvýšené teplotě křemenné kolony vodný roztok HCl při zvýšené teplotě Ze suspenze adsorbentu zakotvení na vnitřní stěně kapiláry ze stabilní suspenze adsorbentu nebo nosiče SF statický způsob dynamický způsob ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 45

46 Chemicky vázané fáze Chemicky vázané (imobilizované) SF snížené těkání SF z kolony za vyšších teplot (bleeding) zvýšení teplotního rozsahu kolony vazby na povrchové silanolové skupiny skla či křemene ~Si-O-C- ~Si-O-Si- ~Si-C- kolony lze proplachovat rozpouštědly při jejich čištění ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 46

47 Termostaty Termostaty plynového chromatografu požadavky přesnost ±0,2 C izotermálně, ±0,5 C s programovanou teplotou minimální tepelná kapacita minimální tepelná vodivost vnitřních částí minimální tepelná vodivost izolací minimální odpor převodu tepla od zdroje druhy udržující konstantní teplotu - kontaktní ohřev nástřikový systém: laboratorní teplota C (400 C) detektory: C (400 C) s programovatelnou teplotou - teplovzdušné kolonový systém: laboratorní teplota C (450 C) rychlý a reprodukovatelný ohřev a chlazení - 0,5-20 C/min lineární (exponenciální, logaritmický) nárůst teploty (temperature ramp) speciální pro velmi rychlé ohřevy C/min - PTV, flash-gc ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 47

48 Úkoly Detektory detegovat v nosném plynu složky opouštějící kolonu Požadavky rychlá odezva velká citlivost stabilita základní linie velký lineární dynamický rozsah nulová odezva na MF zanedbatelný šum ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 48

49 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 49 Detektory - charakteristika Charakteristika měřícího zařízení LOD, LOQ Šum Citlivost Linearita Selektivita RMR Koeficient linearity Lineární dynamický rozsah Chyba linearity

50 Hlediska klasifikace Detektory - Klasifikace Časová závislost odezvy ve frontální a eluční chromatografii integrální detektor(b, e) diferenciální detektor(c,f) Vstupní koncentrační profil Integrální detektor Diferenciální detektor J.Novák: Quantitative Analysis by Gas Chromatography, M. Dekker Inc., NY, 1988 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 50

51 Hlediska klasifikace Detektory - Klasifikace Typ odezvy koncentrační detektor (Flow sensitive, a) hmotnostní detektor (Mass sensitive, b) Snížení průtokové rychlosti Snížení průtokové rychlosti Zastavení průtoku MF N. Dyson:Chromatographic Integration Methods, RSC Chromatography Monographs, UK, 1996 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 51

52 Hlediska klasifikace Destrukce analytu destruktivní Detektory - Klasifikace analyty jsou chemicky změněny lze je umístit jen na konec měřící sady detektorů nedestruktivní analyty zůstávají nezměněny lze je řadit libovolně za sebou ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 52

53 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 53 Signál detektoru, S Detektory - Signál změna hodnoty analytické vlastnosti látek, které do detektoru vstupují k - konstrukční konstanta měřícího zařízení a a - konstanta specifická pro analyt a efektivní objem detektoru prostor, ve kterém probíhá měření nemusí být shodný s geometrickým objemem detektoru v efektivním prostoru detektoru se mohou nacházet i jiné látky vykazující stejnou analytickou vlastnost celkový měřený signál S: S = S + S + S eluované látky S S, nosného plynu S C a přítomných nečistot S I signál základní linie (základní proud - basic current, bc) C bc = S C + S I S I S = k a c a

54 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 54 Odezva detektoru, R koncentrační detektor Detektory - Odezva signál je lineární funkcí koncentrace analytu S = k a c c m - hmotnostní koncentrace (= m/v) je konstantní t2 t2 m R= S dt = kc aa cm dt = kc aa ( t2 t1) t1 t1 V V kc aa m průtoková rychlost F F = R= t F odezva R je přímo úměrná hmotnosti analytu m a nepřímo úměrná průtokové rychlosti F nutnost analýzy za konstantního průtoku MF c a m

55 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 55 Odezva detektoru, R hmotnostní detektor Detektory - Odezva signál je lineární funkcí hmotnostního toku analytu člen dm/dt - hmotnostní tok je konstantní t2 t2 dm R = S dt = km aa dt = km aa m t1 t1 dt A e = s S dt v mezích s-e (start-end) S = k a je roven ploše píku A integrovaného m a dm dt odezva R je přímo úměrná hmotnosti analytu m a nezávislá na průtokové rychlosti F

56 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 56 Detektory - Odezva Specifická odezva, k i odezva detektoru vztažená na jednotkovou hmotnost analytu Molární odezva, MR i odezva detektoru vztažená na jednotkové látkové množství analytu k i R A = i i i i MRi = m m n n i i R i A i R... odezva, A... plocha píku, m... hmotnost analytu ve vzorku R... odezva, A... plocha píku, n... látkové množství analytu ve vzorku

57 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 57 Detektory Citlivost S = k a c odpovídá směrnici závislosti odezvy na koncentraci (koncentrační d.) k c a = a hmotnostním toku (hmotnostní d.) k m cm, S c m S a aa = dm dt c S Citlivost Signál (a.u.) 12 S = a*c + b 10 y = x R 2 = Koncentrace (mmol/l) % 10-5% S = a*c + b 2 Citlivost: a = (S - b) / c 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Koncentrace (mmol/l)

58 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 58 Linearita koeficient linearity, l Detektory k a - konstrukční konstanta měřícího zařízení a a - konstanta specifická pro analyt a směrnice funkční závislosti určení l logaritmické souřadnice lineární měřící zařízení má l =1 S a = k a a a c log S = log( k a ) + l log c a a a a y = a x+ b l a log( S) = f (log c)

59 Detektory Linearita 40 Vliv linearity na signál 2500 Vliv linearity na signál 1000,00 Vliv linearity na signál Signál ,5 Signál ,5 Signál 100,00 10,00 1,00 0,10 1 0,5 1, , Koncentrace Koncentrace 0, ,01 0, Koncentrace vliv linearity na signál ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 59

60 Lineární dynamický rozsah (LDR) Detektory rozsah koncentrace (množství) analytu v němž je koeficient linearity l konstantní v rámci zvolené chyby linearity měřící zařízení může mít více LDR podle hodnoty chyby linearity citlivost detektoru je v něm konstantní Chyba linearity předem dohodnutá hodnota odchylky koeficientu linearity, zpravidla do 5% určuje lineární dynamický rozsah detektoru s její rostoucí hodnotou roste LDR detektoru 16 l LDR log (k a a a ) Chyba linearity log c J.G.K.Ševčík: Plynová chromatografie a její aplikace v organické analýze Citlivost Chyba liearity +5% -5% S = a*c + b Citlivost: a = (S - b) / c 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Koncentrace (mmol/l) ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 60

61 Detektory Šum nechtěné výchylky signálu detektoru kolem základní linie původ chemický elektronický vlastnosti frekvence, f n amplituda druhy bílý součet + a - výchylek je nulový v intervalu našeho měření náhodný drift součet + a - výchylek není nulový součet + a - výchylek vykazuje časovou závislost druhy krátkodobý - f n >1 Hz srovnatelný s velmi úzkými píky dlouhodobý - f n = Hz srovnatelný s píky Chyby způsobované šumem záměna šumu za signál analytu nesprávné určení začátku a konce píku rozštěpení píku na dva zdánlivé píky ŠUM ROZHODUJE O LIMITECH DETEKCE A STANOVITELNOSTI ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 61

62 Detektory Poměr signálu a šumu (S/N) určuje nejmenší pík, který je možno jdenoznačně odlišit od šumu porovnání výšky píku a šumu v jeho blízkosti Mez detekce (limit of detection, LOD) určuje minimální výšku píku, která je odlišitelná od šumu pro S/N = 3 pod tuto mez nelze jednoznačně rozhodnout, zda je analyt přítomen Mez stanovitelnosti (limit of quantitation, LOQ) určuje minimální výšku píku, jehož výšku či plochu lze změřit s dostatečnou přesností při S/N = 10 pod tuto mez nelze určit množství analytu, pouze jeho přítomnost ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 63

63 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 64 Detektory Signál analytu 0 LOD LOQ Analyt není detegován S/N < 3 Analyt je detegován nelze ho stanovit 3 < S/N <10 Analyt lze stanovit S/N > 10 0 S bc S bc + 3σ S bc + 10σ Signál měřícího zařízení

64 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 65 Detektory Selektivita, Γ 12 vlastnost měřícího zařízení vyjadřující poměr citlivostí dvou analytů Γ = k a kde k 1 a 1 > k 2 a 2, k a index 2 - standard 2 2 je vždy závislá na volbě standardu Relativní molární odezva detektoru (RMR) RMR 1 1 kde a je analytická vlastnost analyt 12 MR a = = MR a 2 2 poměr molárních odezev analytu (1) a standardu (2)

65 Detektory Zkreslení signálu detektoru skoková změna koncentrace látky v detektoru vyvolá změnu signálu až po určité době analogový signál zkreslen objemem detektoru zesilovačem signálu systémem zpracování signálu každý z dějů zkreslujících signál charakterizován časovou konstantou celková časová konstanta měřícího zařízení je kombinací časových konstant jednotlivých dějů dílčí časové konstanty prakticky nezjistitelné čas odezvy měřícího zařízení ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 66

66 Detektory Zkreslení signálu detektoru časová konstanta detektoru τ signál je exponenciální funkcí času 3τ - doba dosažení 96% konečné hodnoty signálu reálné systémy se zřídka chovají takto exponenciálně ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 67

67 Čas odezvy měřícího zařízení Detektory odpovídá času dosažení 90% konečné hodnoty signálu složen z zpoždění - čas dosažení 10% konečné hodnoty signálu intervalu vzrůstu/poklesu - čas odpovídající nárůstu z 10% do 90% konečné hodnoty signálu nárůst a pokles signálu bývají často nesymetrické (např. biosenzory) J.G.K.Ševčík: Plynová chromatografie a její aplikace v organické analýze ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 68

68 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 69 Detektory - TCD Tepelně vodivostní detektor (TCD, katarometr) Typ: nedestruktivní, koncentrační, neselektivní (univerzální) Princip odvod tepla od elektricky vyhřívaného odporového vlákna (Pt, W, Ni), termistoru nebo tranzistoru efluentem kolony čistá MF - konstantní odvod tepelné energie - konstantní odpor čidla ve Wheastonově kompenzačním můstku - ten je vyvážen - nulová linie signálu MF s analytem - mění se tepelná vodivost efluentu a současně i odvod tepelné energie - čidlo mění teplotu a odpor - rozvážení W. můstku - signál analytu Ochlazení vlákna - hustota tepelného toku ψ úměrná tepelné vodivosti prostředí λ [ J/m.s.K] a teplotnímu gradientu dt/dx [K/m] ψ = dt λ dx Tepelná vodivost plynů λ aditivní vlastnost x... látkový zlomek λ = λ x + λ x AB A A B B

69 MF Odezva vhodné plyny s vysokou tepelnou vodivostí - H 2 a He Detektory - TCD všechny látky mající rozdílnou tepelnou vodivost od nosného plynu Citlivost TCD roste s rozdílem teploty čidla a stěn detektoru roste se žhavícím proudem čidla - ale roste i šum a klesá životnost čidla vysoká citlivost pro plyny s nízkou molekulovou hmotností oproti FID a ECD nízká závisí velmi na tlaku a průtoku okolo 1 µg/ml Lineární dynamický rozsah lineární dynamický rozsah asi 500 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 70

70 Detektory - FID Plamenoionizační detektor (FID) Typ: destruktivní, hmotový, málo selektivní Princip měření vodivosti plamene - čistý plamen H 2 -vzduch obsahuje velmi málo iontů (10 7 /cm 3 ) - je nevodivý (zákl. proud asi 10 pa, šum asi 0,1 pa) v přítomnosti stop uhlovodíků počet iontů a elektronů silně roste a tudíž i vodivost plamene vzrůstá Mechanismus ionizace MF tepelná energie hoření štěpí chemické vazby organických látek (velmi nízká ionizační účinnost - 0,002% ~ 2 ionty na molekul) vznikají radikály reagující v redukční části plamene s H 2 za vzniku CH CH v oxidační části plamene oxidují CH + O = CHO + + e - dále vznikají i neutrální částice CH + O 2 = CHO + O CH + O 2 = CO + OH ionty také zanikají rekombinací CHO + + OH - = CHO + OH CHO + + H 2 O = CO + H 3 O + H 3 O + + e - = H 2 O + H tyto reakce silně ovlivňují heteroatomy - halogeny, P, S, N N 2, H 2, He ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 71

71 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 72 Odezva Detektory - FID závisí na počtu efektivních C atomů v molekule - poskytují CH Atom Typ vazby Počet efekt. atomů C C jednoduchá v alifatických uhlovodících 1,0 C násobná v aromatických uhlovodících 1,0 C násobná v alkenech 0,95 C násobná v alkinech 1,30 C C=O 0,0 C -C N 0,3 O C-O-C -1,0 O C-OH v primárních alkoholech -0,6 O C-OH v sekundárních alkoholech -0,75 O C-OH v terciárních alkoholech -0,25 Cl C-Cl v alifatických uhlovodících -0,12 Cl C-Cl v alkanech 0,05

72 Detektory - FID Odezva RMR lze považovat za aditivní: RMR = a RMR + b RMR +... a b a -počet funkčních skupin A, b -počet funkčních skupin B, RMR -příspěvek funkční skupiny nedávají látky neposkytující termickým štěpením radikál CH -H 2 O, CO 2, CS 2, permanentní plyny heteroatomy většinou snižují Citlivost závislá na konstrukci průtocích H 2, vzduchu a MF ionizačním napětí ( V) Funkční skupina Příspěvek RMR -CH 2 -OH 55 -CO-CH CH 2 -CO CH=O 0 -CO-CO- 90 -CO-CH 2 -CO O-CH 2-0 primární -OH -45 sekundární -OH -65 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 73

73 Citlivost Detektory - FID závislá na konstrukci průtocích H 2, vzduchu a MF ionizačním napětí ( V) řádově 10 pg/s LDR je jeden z největších známých až 6 řádů je zapotřebí několika zesilovačů ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 74

74 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 75 Detektory - AFID Termoionizační detektor (TID, AFID, NPD) Typ: destruktivní, hmotnostní, selektivní Princip měření vodivosti plamene - v blízkosti plamene H 2 -vzduch je umístěna elektroda z halogenidu alkalického kovu (CsBr) účinkem tepelné energie se halogenid rozpadá * CsBr Cs + Br excitovaný atom alkalického kovu deaktivuje nebo ionizuje * Cs Cs + h ν * + Cs Cs + e MF v přítomnosti stop látek obsahujících heteroatomy (N, P, S, Cl) se tvoří v plameni radikály, které specificky reagují s ionty alkalického kovu - dochází ke změně proudu jako u FID Odezva silně závislá na průtocích plynů pozici halogenidové elektrody

75 Citlivost asi 1 pg P/s, 10 pg N/s Selektivita Detektory - AFID P(110) > N(10) > S(5) Cl(5) > As(1) Bi(1) LDR 1000 (F a N) až (Cl) Linearita od -1 do 1 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 76

76 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 77 Detektory - ECD Detektor elektronového záchytu (ECD) Typ: nedestruktivní, hmotový, selektivní Princip pokles ionizačního proudu detektoru při průchodu eluované látky detektorem průtok čisté MF mezi sběrnými elektrodami prochází ionizační proud (1-10 na, šum asi 1 pa) je daný ionizací N 2 β částicemi emitovanými 63 Ni (poločas rozpadu 120 let, max. energie β-částic je 67 kev) 3 H ( poločas rozpadu 12,3 let, max. energie β-částic 18 kev) N N + e β N + e N + 2e N + e N + 2e N + e N + 2e + 2 n 2 t proud generovaných elektronů (primárních - 1, sekundárních - 3,..., termální - t) mezi elektrodami se měří v pravidelných intervalech pomocí napěťových pulsů (2-100 V)

77 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 78 Princip Detektory - ECD průtok MF s analytem obsahujícím elektronegativní skupiny záchyt pomalých (termálních elektronů) a tvorba podstatně těžších aniontů e + AB AB t těžké anionty nepřispívají k měřenému proudu protože v krátké době napěťového pulzu nestačí doletět ke sběrné elektrodě (anodě)

78 MF Detektory - ECD hlavně N 2, ale i He a směs 10% CH 4 v Ar Odezva závislá na délce, frekvenci a amplitudě napěťových pulsů Citlivost LDR nejcitlivější detektor (mimo MS), 0,1 pg/s pro halogenované sloučeniny v pulzním režimu od do Linearita od 0,5 do 1 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 79

79 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 80 Detektory - PID Fotoionizační detektor (PID) Typ: nedestruktivní, hmotový, neselektivní Princip měření změn ionizačního proudu mezi elektrodami ionizace fotony o energii od 10 do 20 ev zdroj fotonů doutnavý výboj plynu (Ar, He, H 2 ) za nízkého tlaku (0,01-1 kpa) proud fotonů optickým systémem veden do měřící cely se sběrnými elektrodami kudy prochází nosný plyn z kolony použité fotony nejsou schopny ionizace nosného plynu vstupem eluované látky do detektoru dojde k její fotoionizaci vzniklé nabité částice jsou zachytávány v elektrickém poli na sběrných elektrodách, čímž vzniká měřený proud hν + A A + e

80 MF N 2, He Odezva PID poskytuje negativní signál pro převážnou většinu organických látek. Citlivost LDR necitlivý na malé změny průtokové rychlosti nosného plynu základní proud detektoru velmi nízký ( pod 10 pa, šum pod 0,1 pa) Detektory - PID ionizovat lze pouze takové látky, které mají ionizační potenciál nižší než je energie fotonů (11,2 ev, většina organických látek) běžné nečistoty nosného plynu (voda a kyslík) nevadí - jejich ionizační potenciál je vyšší než energie fotonů kolem 4 řádů koncentrace snižuje se s růstem koncentrace elektronegativních látek v důsledku rostoucího vlivu elektronového záchytu ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 81

81 ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 82 Detektory - HeD a ArD Heliový a argonový detektor (HeD, ArD) Typ: nedestruktivní, hmotový, neselektivní Princip měření změn ionizačního proudu ionizace analytů metastabilními stavy He a Ar atomy plynu převáděny do metastabilního stavu srážkami s částicemi β, elektrickým výbojem nebo fotochemicky energie metastabilního stavu He je 20,6 ev, Ar 11,8 ev Odezva He* je schopno ionizovat prakticky všechny látky, kromě Ne He + e He + e Ar* dovoluje detekci pouze těch látek s ionizačním potenciálem pod 11,8 ev ionizace primárními elektrony radioaktivního zdroje přispívá k ionizačnímu proudu + * 1 2 * + He + A He + A + e A + e A + 2e 1 2

82 MF Detektory - HeD a ArD vysoce čisté He a Ar (99,9999%) Citlivost HeD velmi citlivý na přítomnost nečistot v nosném plynu nejvyšší ze všech ionizačních detektorů, 0,1 pg/s HeD je univerzální detektor ArD není schopen detegovat jen málo organických látek LDR a linearita silně závislé na experimentálních podmínkách ZS2008 Kat.anal.chem. PřF UK Praha Plynová chromatografie 83