Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin. INHIBIČNÍ LÁTKY V MLÉCE Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin INHIBIČNÍ LÁTKY V MLÉCE Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Vypracovala: Hana Semorádová Brno 2009

2 Děkuji paní doc. Ing. Šustové za odborné vedení, rady a připomínky, které mi poskytla při vypracování této bakalářské práce.

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Inhibiční látky v mléce vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

4 ANNOTATION Mléko patří k nejdůležitějším potravinám pro obsah bílkovin, mléčného tuku, laktózy, minerálních látek, vitaminů a řady dalších látek. Ve výživě působí příznivě fyziologicky a má vysokou biologickou hodnotu. Jakost syrového kravského mléka charakterizuje soubor ukazatelů, z nichž nejvýznamnější je hygienická a senzorická jakost, obsah základních složek a výskyt nežádoucích, tj. cizorodých a inhibičních látek. Za inhibiční látky se označují ty látky, které mají tlumivý vliv na rozvoj a aktivitu mlékařských kultur. Jejich přítomnost v mléce způsobuje problémy při výrobě sýrů a při fermentačních procesech. Kromě technologických problémů představují inhibiční látky zdravotní riziko pro spotřebitele a negativně ovlivňují naše životní prostředí. Ohrožení lidí rezidui antibiotik v mléce souvisí s ovlivněním jakosti mléka zánětlivými onemocněními mléčných žláz nepřímo. Masově uplatňovaná terapie mastitid antibiotiky staví tento problém do popředí. Je tomu tak proto, že rezidua antibiotik ohrožují lidskou populaci jako významné alergeny. I nízké koncentrace některých antibiotik mohou u alergiků vyvolat dramatické klinické reakce. Je třeba si uvědomit, že většina antibiotik může zůstávat v mléce i po účinné pasteraci. Je proto absence reziduí antimikrobiálních látek významným jakostním znakem syrového mléka a kritériem způsobilosti syrového mléka pro mlékárenské zpracování k lidské výživě. Proto je třeba jednak definovat rezidua inhibičních látek v mléce v kontextu norem jakosti, norem národního práva a práva evropského společenství a jednak popsat jednotlivé metody, které se používají při jejich zjišťování a ověřování. Inhibitory Substances in milk. Milk is one of the most important foodstuffs for its content of proteins, milk fat, lactose, minerals, vitamins and series of other substances. It works highly physiologically in the nutrition and has a high biological value. The quality of raw cow's milk is characterized by the set of indexes, of which the most significant is the index of sanitary and sensorial quality, index of the content of constituent parts and index of the occurrence of undesirable, i.e. inorganic and inhibitory substances. The inhibitory substances are those, which have inhibitory effect in regards to the development and activity of the milk culture. Their presence in the milk causes problems during the production of cheese and during the fermentation processes. Apart of problems in technology, the inhibitory substances constitute a health hazard for consumers and affect the environment in a negative way. The risk to the human health by the residue of antibiotics in the milk relates indirectly to the quality of milk influenced by the inflammation of milk glands. The therapy of mastitis by antibiotics on a mass scale puts this problem into the forefront. This is due to the fact that antibiotic residues threat the human population as a very important allergen. Even low concentration of allergens could cause a very dramatic clinical reaction to some allergic. It is necessary to understand, that the majority of antibiotics could survive in the milk even after a very effective pasteurization. Therefore the absence of antimicrobial residue is a very important qualitative attribute of the raw milk and the criterion of the milk eligibility for dairy processing for the human consumption. For that reason, it is not just necessary to define the residue inhibitory substances in the milk, in the context of quality standard norms, national and the European Community law but also to describe the methods, which are used for recognition and checking these residues.

5 Obsah Obsah 1.0 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ ČÁST Mléko a jeho kvalita Kravské mléko Kvalita mléka Ověřování požadovaných kritérii Inhibiční látky v mléce Zákonné normy a předpisy Metody stanovování RIL v mléce Plošné monitorování Cílené vyšetřování Zhodnocení výsledků centrálních laboratoří ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK PŘÍLOHY...37

6 1.0 Úvod Výskyt reziduí inhibičních látek (RIL) v surovinách a potravinách živočišného původu představuje zdravotní riziko pro spotřebitele, přináší technologické problémy ve výrobě potravin a má negativní dopad na životní prostředí. Nálezy RIL v mléce souvisí s rozšířeným používáním veterinárních léčiv, s nedodržováním ochranných lhůt, se změnou metabolismu nemocného zvířete, popř. s nedůsledným vylučováním mléka léčených zvířat z dodávky. Jedním z problémů v humánní a veterinární medicíně je rostoucí rezistence patogenních mikroorganismů k antimikrobiálním látkám. Vzrůstající počet rezistentních kmenů bakterií je způsoben neuváženým podáváním antibiotik k léčbě infekcí v humánní i ve veterinární medicíně. Více než polovina celkové spotřeby antibiotik nachází využití právě v zemědělství. Důležitým krokem k prevenci přítomnosti antimikrobiálních látek v mléce jsou důsledná opatření v prvovýrobě mléka a využívání screeningových metod detekce RIL. Zdravotní nezávadnost, jakost a nutriční hodnota mléčných výrobků je podmíněna nákupem hygienicky nezávadné suroviny. Jakost syrového kravského mléka charakterizuje soubor ukazatelů, z nichž nejvýznamnější je hygienická a senzorická jakost, obsah základních složek a výskyt nežádoucích, tj. cizorodých a inhibičních látek. Jedním z hlavních kritérií hygienické jakosti syrového mléka je absence reziduí látek, které se do mléka dostávají v důsledku prevence a tlumení mastitid, a minimální kontaminace mléka látkami z vnějšího prostředí. Při tvorbě mléka, během dojení, při ošetřování mléka po nadojení, ale i při jeho dalším zpracování včetně balení mohou do mléka přecházet nežádoucí, tzv. cizorodé látky. Tyto látky nejsou přirozenou součástí potravin a jejich přítomnost v nich nebo obsažené množství může mít vliv na zdraví člověka. Do skupiny cizorodých látek zařazujeme látky přídatné (aditivní), znečišťující (kontaminující) a rezidua cizorodých látek úmyslně použitých v zemědělské a potravinářské výrobě. Závažným problémem je výskyt inhibičních látek, jejichž přítomnost v syrovém kravském mléce zvyšuje zdravotní rizika u spotřebitele, může mít negativní dopad na životní prostředí a rovněž přináší technologické problémy při zpracování mléka (NAVRÁTILOVÁ,2002). 1

7 Cíl práce 2.0 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo: 1. Prostudovat odbornou literaturu o problematice inhibičních látek v mléce 2. Seznámit se s metodami zjišťování inhibičních látek v mléce 2

8 3.0 LITERÁRNÍ ČÁST 3.1 Mléko a jeho kvalita Kravské mléko Kravské mléko je produkt mléčných žláz samice Tura domácího - krávy. Mléčné výrobky patří k základním potravinám člověka. Obsahují živiny potřebné pro rostoucí organismus dítěte a mladého člověka i látky potřebné pro výživu v dospělosti. Význam mléka spočívá především v obsahu hodnotných bílkovin (3,2 %). Mléko obsahuje tuk, který je velmi lehce stravitelný a je v mléce rozptýlen ve formě jemných kapének emulze. Mléčný cukr (4,4 %) má nejen energetickou hodnotu, ale též příznivě podporuje činnost některých střevních mikroorganismů a tím i využitelnost některých živin. Mléko je naším hlavním zdrojem vápníku, který je zde velmi dobře využitelný a z tohoto důvodu je ve výživě nemůže zcela nahradit maso. Obsahuje dále fosfor, draslík, hořčík, sodík, chlór, síru i řadu stopových prvků. Mléko má velmi málo železa, proto dlouhodobá výhradně mléčná strava by vedla vždy k chudokrevnosti. Mléko obsahuje i řadu vitamínů B2, A (i provitamín karoten), vitamín B1, B6, E, K i malé množství vitamínu D a C. Jejich obsah závisí na způsobu krmení dojnic a způsobu jejich života. Sladké mléko je lehce stravitelné. Ještě stravitelnější jsou podmáslí a kysané druhy mléka, zakvašené ušlechtilými kulturami mléčných baktérií (jogurt, acidofilní a kefírové mléko). Tyto formy mléka se doporučují lidem, kterým běžné mléko působí trávicí obtíže. V těchto kysaných mléčných produktech se činností mikroorganismů též podstatně zvyšuje obsah vitamínů B1 a B2. Stravitelnost mléka je závislá i na jeho tučnosti, snáze stravitelné je mléko s nižším obsahem tuku. Mléko se pasterizuje, aby se zničily eventuálně přítomné choroboplodné zárodky. Současně se zničí i přirozené baktérie mléčného kysání, takže mléko tak snadno nezkysne. 3

9 3.1.2 Kvalita mléka Hygienické požadavky na produkci syrového kravského mléka a kritéria pro syrové kravské mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování stanovují následující Nařízení Evropského parlamentu a Rady /ES/, ve znění pozdějších změn a doplňků: č. 178/2002 ze dne , kterým se stanoví obecné zásady a požadavky potravinového práva, zřizuje se Evropský úřad pro bezpečnost potravin a stanoví postupy týkající se bezpečnosti potravin č. 852/2004 ze dne o hygieně potravin č. 853/2004 ze dne , kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu č. 854/2004 ze dne , kterým se stanoví zvláštní pravidla pro organizaci úředních kontrol produktů živočišného původu určených k lidské spotřebě č. 882/2004 ze dne o úředních kontrolách za účelem ověřování dodržování právních předpisů týkajících se krmiv a potravin a pravidel o zdraví zvířat a dobrých životních podmínkách zvířat Požadavky na kvalitu mléka: syrové kravské mléko musí pocházet od výrobců, kteří splní požadavky na produkci a dodávku mléka pro lidskou výživu mléko musí pocházet od dojnic z chovů prostých tuberkulózy a brucelózy a ostatních onemocnění přenosných na lidi dojnice nevykazují příznaky poruch celkového zdravotního stravu, zjevné příznaky zánětů, poranění mléčné žlázy a kůže mléčné žlázy dojnice dojí nejméně 2 litry denně a není u nich zahájen proces zaprahování mléko nesmí být od dojnic, kterým byla podána krmiva ovlivňujících složení a jakost, které měly přístup k cizorodým látkám, u kterých je stanovena ochranná opatření při nákaze, po léčbě apod., do 5 dnů po otelení mléko musí být čerstvé, - při denním svozu ne starší než 20 hodin 4

10 - při obdenním svozu ne starší než 45 hodin teplota mléka - pokud není mléko svezeno do 2 hodin po skončení dojení, tak se musí zchladit na 4-8 C (při denním svozu), 4-6 C (při obdenním svozu) Požadavky na jednotlivé znaky jakosti Smyslové - barva - bílá, příp. s lehce nažloutlým odstínem - konzistence a vzhled - stejnorodá tekutina bez usazenin, vloček a hrubých nečistot - chuť a vůně čistě mléčná, bez jiných příchutí a pachů fyzikálně chemické znaky jakosti - obsah tuku a bílkovin, bod mrznutí, kyselost mléka dle SH celkový počet mikroorganismů (CPM) počet somatických buněk (PSB) rezidua inhibičních látek (RIL) Tab. 1 Požadavky na znaky jakosti Kritérium Jednotka Požadavek obsah tuku g/ 100 ml 3,6 obsah bílkovin % 2,8 (3,2) Kyselost SH mmol.l -1 ph 6,2 7,8 (6,2 7,8 ). 2,5 6,4 6,7 CPM v 1 ml do 100 tisíc PSB v 1 ml do 400 tisíc RIL % pozitivních vzorků 0 bod mrznutí C -0,520 5

11 Doplňkové znaky mikrobiologické znaky jakosti - počet psychrotrofních mikroorganismů do /1 ml - počet termorezistentních mikroorganismů do 2 000/1 ml - počet koliformních bakterií max /1 ml - sporotvorné anaerobní bakterie v 0,1 ml negativní látkový obsah volných mastných kyselin u mléčného tuku dle použitých metod: 3,0mmol/kg (stlukem), resp. 32,0 mmol/kg (extrakčně titrační) obsah nutričně významných složek: Ca (1,2 g/l), vitamín A (0,13 mg/l), vitamín B 1 (0,32 mg/l), vitamín B 2 (1,4 mg/l) mechanické nečistoty nejvýše II. stupeň kysací schopnost jogurtovou kulturou nejméně 25 SH obsah tukuprosté sušiny nejméně 8,5 % hmot (home.zf.jcu.cz) Ověřování požadovaných kritérií Plnění stanovených kritérií se musí ověřovat na reprezentativním počtu vzorků syrového mléka odebraných při namátkových kontrolách v zemědělských podnicích vyrábějících mléko. - klouzavý geometrický průměr za dvouměsíční období alespoň dva vzorky za měsíc /CPM/ - klouzavý geometrický průměr za tříměsíční období alespoň jeden vzorek za měsíc, pokud příslušný orgán neurčí jinou metodiku s cílem zohlednit sezónní variace v úrovni výroby /PSB/ Tyto kontroly mohou být prováděny jednak provozovatelem potravinářského podniku, který mléko vyrábí, nebo v jeho zastoupení, nebo provozovatelem potravinářského podniku, který mléko sváží, nebo zpracovává, nebo v jeho zastoupení, nebo skupinou provozovatelů potravinářských podniků, nebo v jejich zastoupení, nebo v rámci vnitrostátních nebo regionálních kontrolních programů. Pokud mléko nesplňuje požadovaná kritéria, musí provozovatel potravinářského podniku informovat příslušný orgán a přijmout opatření k nápravě. 6

12 Podkladem pro rozhodnutí orgánů veterinární správy musí být výsledek vyšetření ze Státního veterinárního ústavu, Národní referenční laboratoře (NRL), referenčních laboratoří nebo laboratoří, které byly pro požadovaný druh vyšetření akreditovány, a kterým Státní veterinární správa vydala povolení k provádění veterinární laboratorní diagnostické činnosti, anebo referenční laboratoří Evropského společenství. Referenční laboratoře Referenční laboratoř Společenství pro mléko a mléčné výrobky AfssaLergha, F Maison Alfort, Francie Referenční laboratoř Společenství pro antibakteriální látky AFSSA Sile de Fougerés, BP 9023, Francie Národní referenční laboratoře - pro mléko a mléčné výrobky SVÚ Praha - pro antibakteriální (inhibiční) látky a rezidua veterinárních léčiv SVÚ Jihlava - NRL VÚCHS Rapotín MILCOM a. s., Výzkumný ústav mlékárenský a jeho laboratoř, zapojená do systému mezilaboratorních testů v oblasti stanovení chemicko-fyzikálních znaků a mikrobiologické jakosti mléka a kalibrace přístrojové techniky Zkušební laboratoře Centrální laboratoř MADETA Agro a.s. České Budějovice Centrální laboratoř Bohušovická mlékárna a.s. Laboratoř pro rozbory mléka, Tuřany ČMSCH Laboratoř pro mléko, Buštěhrad ČMSCH Další laboratoře pro úřadní kontrolu, akreditované a schválené SVS ČR Všechny tyto laboratoře postupují podle metod a norem stanovených předpisy ES. Další kritéria na syrové mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování stanovuje - ČSN Syrové kravské mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování - ČSN Pravidla správné hygienické a výrobní praxe Mléko a mléčné výrobky z roku 2006, zpracovaná ve smyslu Nařízení EP a Rady /ES/ č. 852/2004 ke zpracování rozšiřování pravidel pro správnou praxi potravinářským sektorem. Uvedené normy doporučují kontrolovat následující kritéria: - senzorické znaky - fyzikálně chemické znaky (tuk, bílkovina, bod mrznutí mléka, kyselost mléka) - další znaky (doplňkové mikrobiologické znaky, podíl volných mastných kyselin). 7

13 Uvedená kritéria kvality mléka se kontrolují na základě dohody mezi výrobcem mléka a jeho zpracovatelem. Jsou využívány pro zajištění kvalitního zpracování mléka a kvalitu výrobků a případného využívání při zpeněžování mléka (KADLEC, 2007). 3.2 Inhibiční látky v mléce Zákonné normy a předpisy ČSN Syrové kravské mléko pro ošetření a zpracování požaduje ve svém článku : Stanovení reziduí látek inhibujících růst mlékárenských kultur musí být negativní. Za inhibiční látky v mléce se označují takové látky, které mají tlumivý vliv (baktericidní, bakteriostatický) na rozvoj a aktivitu mlékárenských kultur. Inhibiční látky v mléce spadají do širšího pojetí termínu hygiena mléka, a tak je je také třeba chápat. Jejich výskyt v mléce způsobuje obrovské problémy při jeho technologickém zpracování. Největší dopad však má jejich výskyt na lidský organismus. Rezidua inhibičních látek /RIL/ v potravinářských surovinách živočišného původu se ve světě sledují řadu let a u nás systematicky od roku Nepříznivý vliv reziduí antibiotik a sulfonamidů v potravinách se může projevovat několika způsoby. Přímý toxický efekt inhibičních látek působí na tělní buňky lidského organismu. Je dokonce uváděn i karcenogení efekt, senzibilizace organismu do té míry, že při terapii určitým antibiotikem může dojít k závažné alergické reakci, přestože pacient nebyl nikdy tímto antibiotikem léčen. Je známo, že rezidua penicilinu mohou vyvolat alergické reakce končící i smrtí. Největší ohrožení pro člověka představuje vznik resistentních saprofytických a patogenních mikroorganismů. Jsou známy případy, kdy na léčení onemocnění jsou indikována běžná antibiotika nebo sulfonamidy, ta se však ukážou jako zcela neúčinná. Důvodem je přenos rezistence ze saprofytických na patogenní mikroorganismy. Podle platné legislativy smí být v mléce, v surovinách a potravinách živočišného původu jen hodnoty maximálních reziduí původní substance nebo metabolitu, které jsou striktně stanoveny v příloze Nařízení rady (EHS) č. 2377/1990, ve znění pozdějších změn a doplňků. Maximální reziduální limit /MRL/ je definován podle typu a koncentrace rezidua, které je bez nebezpečí pro lidské zdraví, vyjádřeno na základě akceptovatelného denního příjmu /ADI/. V ČR byly požadavky na syrové kravské mléko plně harmonizovány s uvedenými předpisy EU. Jakost syrového kravského mléka k mlékárenskému ošetření a zpracování a mléka určeného k přímé spotřebě je sledována v souladu s vyhláškou MZe č. 287/1999 Sb., o 8

14 veterinárních požadavcích na živočišné produkty. Podle 42 této vyhlášky musí být z dodávky mléka k mlékárenskému ošetření a zpracování vyloučeno mléko s obsahem reziduí inhibičních, pesticidních a kontaminujících látek. Kritéria hodnocení jakosti mléka jsou obsažena i v nezávazné ČSN Syrové kravské mléko. V surovinách a potravinách živočišného původu smí být přítomny jen hodnoty maximálních reziduálních limitů (MLR) původní substance nebo metabolitu veterinárních léčiv. MLR se rozumí maximální množství (vyjádřeno v mg/kg suroviny) zbytků veterinárních léčiv a biologicky aktivních látek použitých v živočišné výrobě, které je přípustné v surovině živočišného původu nebo na ní. Při překročení nejvyššího přípustného množství reziduí veterinárních léčiv a biologicky aktivních látek používaných v živočišné výrobě se potravina nebo potravinová surovina nepovažuje za zdravotně nezávadnou ( 2 zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, 2 vyhlášky MZ č. 273/2000 Sb.). Podle zákona MZe č. 166/1999 Sb., o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů, který stanoví základní veterinární požadavky na živočišné produkty, mohou být zvířata, jimž byly podány doplňkové látky a léčiva zanechávající nežádoucí rezidua v živočišných produktech, využívána k získávání a výrobě produktů určených k výživě lidí až po uplynutí ochranné lhůty. Nebyla-li tato lhůta výrobcem stanovena, mohou být zvířata takto využívána až po uplynutí nejméně 60 dnů od skončení podávání doplňkových látek nebo léčiv, jde-li o maso, vnitřnosti a tuky, a nejméně 21 dnů od skončení podávání doplňkových látek a léčiv, jde-li o mléko a vejce. Ministerstvo zdravotnictví stanoví podle 19 odst. 1 písm. a) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, ve znění zákona č. 306/2000 Sb. a zákona č. 146/2002 Sb., nejvyšší přípustné zbytky veterinárních léčiv a biologicky aktivních látek používaných v živočišné výrobě, v potravinách a potravinových surovinách, které jsou uvedeny v příloze k Vyhlášce č. 273/2000 Sb., ve znění Vyhlášky č. 106/2002 Sb. a Vyhlášky č. 44/2004 Sb. (viz Příloha ). Tento právní předpis uvádí veterinární léčiva, která se s ohledem na charakter stanoveného maximálního limitu reziduí zařazují do skupin: a) skupina I, kde jsou maximální limity reziduí stanoveny, b) skupina II, kde nejsou s ohledem na zjištěnou neškodnost pro lidské zdraví maximální limity reziduí stanoveny, c) skupina III, kde mají maximální limity reziduí v Evropské unii pouze dočasnou platnost, d) skupina IV, kde jsou uvedena léčiva nebezpečná pro zdraví člověka, která nesmějí být používána pro zvířata určená k výrobě potravin. 9

15 Inhibiční látky lze rozdělit do dvou skupin, a to na přirozené zdroje a na kontaminanty. Literární část A. Přirozené zdroje. Zvláštní skupinu tvoří inhibiční látky, jež jsou součástí přirozeného ochranného systému mléčné žlázy, tj. specifické imunoglobuliny, lysozym, laktoferin a další. Dalším příkladem přirozených inhibičních látek je baktericidní fáze mléka. Její délka a razance záleží na zdravotní situaci dojeného stáda a trvá v průměru 0,5 4 hodiny po nadojení. Tyto látky jsou snadno degradovatelné záhřevem. Čerstvě nadojené mléko nelze rozborovat na RIL, protože z výše uvedených důvodů, mléko prosté RIL, se v prvé fázi po nadojení chová jako pozitivní. Rozbor lze provést až po záhřevu mléka. Zvláštní kategorii tvoří mléka, která obsahují vysoké počty psychotropní mikroflóry. Systematické přechlazování nebo mikrobiologická kontaminace v souvislosti se špatnou úrovní sanitace a nekvalitní vodou po stránce mikrobiologické jsou důvody vysokých počtů této kategorie. Enzymy, které produkují psychotropní mikroorganismy rozkládají tuky a bílkoviny, ph reakci mléka alkalizují a vytvářejí tak podmínky pro zhoršený rozvoj acidofilní mikroflóry, kam patří čisté mlékařské kultury. Ty se pak nemohou v alkalickém prostředí rozmnožovat, nebo se rozmnožují omezeně a takové mléko vlastně simuluje RIL, byť se jedná jen o změnu ph. V mlezivu a v mléce starodojném se vyskytují ve vyšších koncentracích některé bakteriostaticky účinné látky (lysozym, laktoferin), které mohou působit inhibičně. Ojediněle se mohou vyskytovat v mléce stresově zatížených dojnic dokonce gamaglobuliny, které rovněž mohou působit při určité koncentraci inhibičně. Mléko dojnic po vakcinaci obsahuje identifikovatelné množství přirozených obranných látek. Základním projevem nedostatků ve výživě je nežádoucí výskyt například močoviny, acetonů, dusičnanů. Tyto látky mohou mít za určitých podmínek inhibiční účinek na čisté mlékařské kultury. Jistým určitým podstupněm pozitivního nálezu reziduí inhibičních látek v mléce je náhlé snížení kysací aktivity mléka. Podprahové množství určité látky není detekovatelné jako RIL, ale v jednoduchém laboratorním testu se může projevit snížením hodnoty, která ovšem nemusí dosáhnout nestandardní úrovně (kysací aktivita). B. Kontaminanty Jejich nejvýznamnějším zdrojem jsou látky, které i v malých koncentracích mají značný inhibiční účinek. Patří sem zejména antibiotika a sulfonamidy, ale i řada dalších látek. Přitom nezáleží na tom, jak jsou tyto látky aplikovány. Podstatné je, že se dostávají do krevního oběhu a odtud přecházejí do mléka. Jejich vylučování mlékem trvá delší dobu i po skončené terapii. Délka této doby závisí na rozsahu postižené tkáně, rychlosti a schopnosti její restituce. Je prokázáno, že některé patologické procesy umožňují snadnější přechod léčiv do mléka. Při aplikaci antibiotik do jedné nebo více čtvrtí vemen, přecházejí antibiotika i do neléčených čtvrtí, a to i ve stejné 10

16 koncentraci, o jaké se aplikují do čtvrtí léčených. Dobu, po kterou je nutné mléko od dojnic léčených antibiotiky či sulfonamidy vyřazovat z dodávky do mlékárny, určuje takzvaná ochranná lhůta. Z problematiky ochranných lhůt ovšem vycházejí některé poznatky, které v provozu zemědělské prvovýroby jsou málo známé. Při vyšších dávkách antibiotik, než je uvedeno v návodu pro aplikaci, jsou rezidua v tkáních a produktech déle, než je stanoveno délkou ochranné lhůty. Podobná situace může nastat při opakovaném intramamárním ošetření mléčné žlázy. U vleklých onemocnění s velkým rozsahem poškozené tkáně je doba vylučování i přetrvávání reziduí v tkáních podstatně delší. Proto někdy výskyt reziduí v mléce může překračovat dobu stanovenou ochrannou lhůtou. Rovněž některé další látky mohou být vstřebávány organismem dojnic (antimon, arsen, jód, určité alkaloidy, glykosidy, aj.). I tyto látky se vyznačují inhibiční aktivitou. V praxi běžné zkrmování větších dávek řepky (obsahuje glykosidy) může způsobit identifikaci RIL. Obdobná je situace u řepkových pokrutin, jejichž denní příjem vzhledem k vysokému obsahu glykosidů by měl být množstevně omezen. Stejně působí i fytoncidy z hořčice a cibulovitých rostlin. Případy obsahu antikokcidik či antiparazitik v krmných směsích určených původně drůbeži, ale zkrmovaných dojnicím, jednoznačně mají za následek výskyt RIL. Obsah plísní v krmivech určených pro dojnice může iniciovat výskyt RIL v mléce. Zkrmovat takováto krmiva, ať objemná nebo koncentrovaná, může být velice riskantní. Kontaminované plísní mohou být rovněž různé manipulační a skladovací prostory pro obilí. Negativně mohou působit i zaplísněné stěny mléčnic Výskyt pesticidů, těžkých kovů a polychlorovaných bifenylů v mléce je v současné době jen teoretický, a proto z této strany výskyt RIL nehrozí. Velmi často jsou však v souvislosti s RIL v mléce uvažovány čistící a dezinfekční prostředky. Míra vlivu zejména čisticích prostředků je přeceněna, při normálním technologickém procesu prvovýroby se nemohou koncentrace, které by způsobily RIL vůbec vyskytnout. Závažnější je situace u dezinfekčních prostředků, které obsahují jako účinnou složku kvarterní amoniové sloučeniny. Jejich aplikace může za určitých okolností být důvodem pozitivity RIL v mléce. Problém nespecifikovaných inhibicí existuje i v zemích s nejvyspělejším zemědělstvím a její minimalizace je úzce spojena s vědeckým pokrokem. 11

17 Tab. 2 Důvody pozitivního nálezu inhibičních látek v mléce, SEYDLOVÁ, % 1. nedodržení ochranné lhůty při aplikaci antibiotik 2. záměna antibiotik určených k aplikaci v zprahlosti na léčení v laktaci 3. nedostatečné označení aplikovaných dojnic 31 % 1. krátké období stání na sucho, předčasné otelení 2. individualita vylučování antibiotik po ochranné lhůtě 6 % 1. injekční aplikace 2. ostatní ošetření 3. zbytky dezinfekčních prostředků 4. zbytky prostředků k hubení hmyzu či ochraně rostlin 2 % nespecifická inhibice Metody stanovování RIL v mléce Cílem stanovení reziduí inhibičních látek v mléce je zajištění zdravotní nezávadnosti mléka a zajištění kvalitní suroviny pro mlékárenské zpracování. Rozvoj moderních analytických technik umožňuje používat pro detekci stále citlivější metody, různě náročné na čas i přístrojovou techniku Systém zjišťování RIL v mléce lze rozdělit do dvou na sobě závislých kroků: 1. plošné monitorování kdy se používají testy umožňující rychlé stanovení přítomnosti inhibičních látek 2. cílené vyšetřování kdy se používají metody na identifikaci a kvantifikaci inhibiční látky 12

18 Plošné monitorování Screeningové testy a) selektivní rychlotesty b) širokospektrální rychlotesty c) plotnové metody a) Selektivní rychlotesty - jedná se receptorovou analýzu, která umožňuje velice rychlou detekci ß laktamových a tetracyklinových antibiotik, chinolonů a sulfonamidů. Většina těchto testů umožňuje detekci pouze jedné skupiny antibiotik. Jen některé umožňují detekovat dvě skupiny antibiotik současně. Výhodou těchto testů je jednoduchost provedení a rychlé stanovení inhibiční látky (analýza probíhá řádově 8-10 minut). Mezi selektivní rychlotesty patří: Beta Star test Delvo X Press test Snap testy Rosa testy Twinsensor Tyto testy umožňují pouze kvalitativní stanovení inhibiční látky (pozitivní x negativní výsledek). Beta Star test je test používaný k rychlému prokázání ß- laktamových antibiotik mléce. Detekuje se testovacím papírkem, ze kterého se odečítá výsledek. Delvo X Press test je screeningový test pro rychlé určení množství ß- laktamových reziduí inhibičních látek v mléce. Jeho činnost je založena na kvalitativní kompetitivní recepce enzymu na receptor speciálně vyvinutý pro detekci ß- laktamových antibiotik v kravském mléce. Používá se pro testování jednotlivých dodávek mléka při jeho příjmu. Snap test - je určen na rychlou, jednoduchou a spolehlivou kontrolu inhibičních látek v syrovém kravském mléce. Doba stanovení je 9 minut. Všechny reagencie jsou součástí testu. Na vyhodnocení testu se používá SNAP inkubátor. Testovací souprava detekuje beta-laktamová antibiotika v rozsahu platných tolerančních hodnot (MRL). 13

19 Tab. 3 Rozsah tolerančních hodnot antibiotik, Obr. 1 SNAP test Obr. 2 SNAP indikátor Obr. 3 SNAP reader 14

20 Rosa testy - test přítomnosti reziduí antibiotik v syrovém mléce představuje rychlý, přesný a selektivní způsob měření podle kodexu EU pro maximální reziduální úrovně (Maximum Residue Limit - MRL). Poměr denzit kontrolního a testovacího proužku není vyhodnocován vizuálně, ale přesným reflexním fotometrem. Vlastní testy jsou tvořeny patentními proužky. 1. Beta - test přítomnosti reziduí beta-laktamových antibiotik. Tato úroveň je např. pro Penicilin-G 4 ppb. 2. Tetra test přítomnosti reziduí tetracyklinových antibiotik. Tato úroveň je např. pro Tetracyklin 100 ppb. 3. Alfa - test přítomnosti reziduí mykotoxinů. Tato úroveň je např. pro aflatoxin 0,5 ppb. Vzorek mléka je napipetován do nalévací komůrky proužku, který je poté vložen do speciálního inkubátoru (dvou nebo čtyřmístného), který je temperován na přesnou kontrolovanou teplotu a sleduje čas. Po osmiminutové inkubaci je proužek odečten buď vizuálně okem, nebo automaticky čtečkou Reader či zobrazovačem Imager, který je příslušenstvím luminometru LUM-T ( Obr. 4 Beta test Obr. 5 Tetra test Obr. 6 Alfa test 15

21 Twinsensor BT - je nový rychlý test ve formátu ponorného proužku pro širokospektrou detekci antibiotik při jednom stanovení. Je to receptorová analýza umožňující současnou detekci každého ß-laktamového antibiotika a současně i tetracyklinových antibiotik v mléce. Nový test je jednoduchý při použití, spolehlivý a trvá pouze 6 minut. TwinsensorBT detekuje většinu léčiv na hladině nebo níže, než je MRL. Provedení testu: Obr. 7 Twinsensor BT test Tab. 4 Úroveň záchytnosti sledovaných látek Účinná látka Twinsensor BT MRL Ampicillin Amoxicillin Benzylpenicillin Cefazolin Cefoperazone Ceftiofur Cephapirin Cloxacillin Nafcillin Chlortetracycline Doxycycline Oxytetracycline Tetracykline

22 b) Širokospektrální rychlotesty - jedná se o princip agarové difúze spojené se změnou barvy indikátoru v důsledku změny ph půdy způsobené růstem textačního kmene (Bacillus stearothermophilus v.c. C 953). Umožňují detekci širokého spektra antibiotik, sulfonamidů i desinfekčních látek. Citlivost jednotlivých testů se liší vzhledem k MLR a je uváděna výrobcem. Výhodou je jednoduché provedení, časová náročnost jen 2 3 hodiny. Mezi širokospektrální rychlotesty patří: Delvo test SP-NT Eclipse 50 (100) test Charm Farm test Copan test BR test MaxSignal TM test Tyto testy umožňují rovněž pouze kvalitativní stanovení inhibiční látky (pozitivní x negativní výsledek). Tab. 5 Citlivost jednotlivých testů udávané výrobcem v mg/kg Léčivo Delvo SP-NT Eclipse MaxSignal MLR Penicilin 0,002-0,003 0,004 0,002-0,003 0,400 Ampicilin 0,006-0,007 0,005 0,002-0,004 0,400 Cefapirin 0,006-0,008 0,008 0,006-0,009 0,060 Tetracyklin 0,800 0,150 0,050-0,100 0,100 Oxytetracyklin 0,800 0,150 0,050-0,100 0,100 Neomycin 0,300-0,600 2,00 0,450-0,500 1,500 Gentamycin 0,200 neuvádí 0,100-0,150 0,100 Streptomycin neuvádí 3,00 0,100-0,200 0,200 Delvo test SP-NT - je jednoduchý, spolehlivý, přesný a mezinárodně uznávaný test pro stanovení přítomnosti RIL. Je citlivý na široké spektrum antibiotik, sulfonamidů a detergentních látek. Obr. 8 Delvotest SP - NT 17

23 Negativní Detekční limit Pozitivní Obr. 9 Delvotest čtení barev Eclipse - je širokospektrální screeningový test určený pro kvalitativní a kvantitativní stanovení antibiotik v mléku nacházející se ve vyšší koncentraci, jako jsou maximální přípustné množství antibiotik (MRL). Princip metody spočívá v inhibici mikrobiálního růstu. Vzorek se aplikuje na mikrodestičku, kde každá jamka obsahuje agarové médium potažené sporami Geobacillus stearothermophillus a ph indikátor. Vyklíčené spory produkují kyseliny, čím se mění ph agaru. V případě, že vzorky mléka obsahují antibiotika ve vyšší koncentraci než je detekční limit, mikroorganizmy nebudou růst a nebudou pozorovatelné ani barevné změny agaru. Obr. 10 Ukázka provádění Eclipse testu Charm Farm testy - jsou rychlé testy reziduí inhibičních látek pro zemědělské účely, detekující na úrovni MRL širokospektrálně především beta-laktamová a sulfonamidová léčiva. Vyrábějí se v provedení 960 (lámací destička) a Vial (mikroampule). Po napipetování a tříhodinové inkubaci při 65 C ve vodní lázni, biologickém termostatu nebo ve speciálním inkubátoru se odečítá okem podle barevného klínu. Obr. 11 Mikroampule Obr. 12 Inkubátor 18

24 Obr. 13 Vyhodnocení testu podle barevné škály Tab. 6 Detekční úroveň u jednotlivých antibiotik Léčivo Detekční úroveň EU-MRL Penicillin G 3 ppb 4 ppb Amoxicillin 6 ppb 4 ppb Ampicillin 5 ppb 4 ppb Cephapirin 10 ppb 10 ppb Ceftiofur 50 ppb 100 ppb Cloxacillin 30 ppb 30 ppb Gentamicin ppb 100 ppb Oxytetracycline ppb 100 ppb Sulfamethazine (Sulfadimidine) ppb 100 ppb Sulfadimethoxine 10 ppb 100 ppb Tylosin ppb 50 ppb Copan test je vysoce citlivý mikrobiální test, detekující tři skupiny antibiotik: beta-lactamová, tetracyclinová a sulfonamidová ( Obr. 14 Copan test 19

25 Tab. 7 Detekční limity antimikrobiálních látek Úrovně detekce pro několik antimikrobiálních látek je uvedena v této tabulce. Uváděné údaje jsou odvozeny od nejnovějších hodnotící studie provedené nezávislou laboratoří. Tento seznam slouží jako referenční bod a pouze pokud je pod neustálou aktualizací. Beta-lactamy MLR Copan Test detekční Antimikrobiální léky limity (ug / L) 1) (ug / L) Penicilin G-Na sůl Ampicilin <2 4 Amoxicilin Cloxacillin Dicloxacilin Oxacilin Naficillin Ceftiofur 2) ) Cefquinom 7) Cefapirin 2, Cefoperazon Cefalexin > Cefazolin Tetracykliny MLR Antimikrobiální léky Copan Test detekční limity (ug / L) Chlortetracicline 2) Oxytetracicline 2) Tetracyklin 2) Doxycyklin 2) 150 Sulfonamidy Antimikrobiální léky Copan Test detekční limity (ug / L) Sulfathiazol Sulfamethazine 5) Sulfadioxine Sulfadimethoxin Sulfadiazin Sulfamethoxazol <50 Sulfamonometossina <50 1) (ug / L) 100 4) 100 4) 100 4) 100 4) MLR 1) (ug / L) 100 6) 100 6) 100 6) 100 6) 100 6) 100 6) 100 6) Aminoglykosidy MLR Copan Test detekční Antimikrobiální léky limity (ug / L) 1) (ug / L) Streptomycin < Neomycin Gentamicin Spektinomycin > Makrolidy MLR Copan Test detekční Antimikrobiální léky limity (ug / L) 1) (ug / L) Erytromycin > Spiramycin > Tylosin Tylmicosin Jiná antibiotika MLR Antimikrobiální léky Copan Test detekční limity (ug / L) Dapson 2-4 1) (ug / L) 0 7) Trimethoprim Tiamfenicol > Chloramfenikol ) 20

26 BR test je test založený na principu růstu zárodku Bacillus tearothermophilus, var. Calidolactis, spojené se změnou redoxpotenciálu. Je velmi citlivý na penicilin. Průkazní hranice odpovídá koncentraci 4 ppb benzylpenicilinu. MaxSignal TM test je enzym-imunologický test pro kvantitativní analýzu antibiotik (streptomycinu) v mléce. Je to rychlá (10-40 minut) a nákladově efektivní metoda s vysokou výtěžností a citlivostí (0,25 ng / g nebo ppb) ( Obr. 15 MaxSignal TM test c) Plotnové metody - jsou metody agarové difúze na plotnách, založené na vizuálním posouzení testačního kmene a odečítání inhibičních zón. Představují složitější přípravu ploten a dlouhou dobu inkubace. Provedení testu je však jednoduché. Plotnové metody umožňují skupinovou identifikaci inhibičních látek a podle velikosti inhibiční zóny i přibližný odhad jejich koncentrace. 4 plotnová metoda je metoda, která je založená na zjišťování počtu vyrostlých kolonií na živné půdě testační kmen inhibiční zóna pozitivní vzorek negativní vzorek Obr. 16 Schéma plotnové metody 21

27 Principem je pronikání (difuze) ATB a SA do agarového média nasyceného kulturou mikroorganismů (testovací kmeny), citlivých na uvedené ATB. Testovací kmeny: Bacillus subtilis (30 o C/24 hod) Micrococcus luteus (37 o C/24 hod) Jde o metodu vhodnou pro skupinovou detekci ATB, neboť každá plotna má jinou citlivost pro různé IL. Postup: Spórová suspenze Bacillus subtilis se přidává do agarových médií, která mají ph 6, 7,2 a 8. K půdě s hodnotou ph=7,2 se přidává trimetroprim k potencování účinku sulfonamidů. Čtvrtá testovací půda o ph=8 obsahuje jako testovací kmen Micrococcus luteus. Tab. 8 Detekce inhibičníxch látek čtyřplotnovou metodou Plotna č Testovací kmen Bac. subtilis Bac. subtilis Micrococc. luteus Bac. subtilis ph ,2 Pomocná látka trimetroprim Testované ATB tetracykliny aminoglykosidy makrolidy a PNC sulfonamidy Inkubace 30 o C/24 hod 30 o C/24 hod 37 o C/24 hod 30 o C/24 hod Provedení: Na připravenou misku se vloží kousky vzorků tvaru krychle o délce hrany 7 mm. Pro kontorlu citlivosti kmene na ATB se může vložit i disk se známým množstvím ATB. Misky se pokládají dnem vzhůru. Po inkubaci se hodnotí inhibiční zóny. Za pozitivní se považuje velikost zóny větší než 2 mm. Kontrola citlivosti testovacích ploten se provádí pomocí disků napuštěných penicilinem, streptomycinem a sulfadimidinem. Pozitivní výsledek je inhibiční zóna o velikosti nad 2 mm. Mikrobiologickými metodami není možno prokázat chloramfenikol. 22

28 Plotna č. 1 Plotna č. 2 B. subtilis PH=6 30 C/24 hod B. subtilis PH = 8 30 C/24 hod Plotna č. 3 Plotna č. 4 Micrococcus luteus PH=8 37 C/24 hod B. subtilis PH = 7,2 trimetroprim Obr. 17 Testovací plotny čtyřplotnové metody Cílené vyšetřování a) fyzikálně chemické metody b) ELISA metody a) fyzikálně chemické metody ELFO CHARM II HPLC/DAD, HPLC/MS HPLC/MS/MS 23

29 ELFO gelová elektroforéza s mikrobiální detekcí Elektroforéza je soubor separačních metod, které využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při ní dělí nabité molekuly (ionty). Při separaci látek v kapiláře se zde vedle elektroforetického principu (pohyb nabitých molekul v elektrickém poli) uplatňuje též elektroosmotický tok (angl. electroosmotic flow, EOF), což je spontánní tok kapaliny v kapiláře v důsledku náboje (obvykle záporného) na vnitřní stěně kapiláry. Molekuly antibiotika dle své polarity a velikosti migrují v elektrickém poli a po skončeném dělení jsou detekovány mikrobiologicky. Mikrobiální testační kmen je volen podle výsledků plotnových metod. Vyhodnocení se provádí srovnáním se standardy. Metoda umožňuje identifikaci konkrétní inhibiční látky, ale je náročná na čas, přípravu a provedení. Obr. 18 Schéma elektroforézy CHARM II metoda, jež využívá efektu vazby detekované látky a látky značené 14 C nebo 3 H na vazebný receptor nebo specifickou protilátku. Množství navázané značené látky se měří analyzátorem v jednotkách CPM (count per minute). Příprava vzorku je jednoduchá a spočívá v odstředění vzorku mléka a odstranění tukové vrstvy. Vlastní analýza probíhá v několika krocích a trvá cca 20 minut. Analyzátor změří CPM vzorku, hodnotu porovná s CPM kontrolního bodu stanoveného antibiotika nebo sulfonamidu, který je nastaven na hladinu MLR a vzorek vyhodnotí. Metoda umožňuje stanovení antibiotik nebo sulfonamidů nad nebo pod MLR a archivaci výsledků. 24

30 Analyzátorem Charm II v mléce stanovujeme: ß laktamová antibiotika (PNC, AMOX, AMP, CLO, NAF, OXA, CEF tetracykliny (TC, OTC, CTC, DOX) kloxacilin oxacilin gentamicin + neomycin streptomycin chloramfenikol erytromicin + tylan sulfonamidy alkalická fosfatáza, aflatoxin M 1 a pesticidy ( JEŘÁBKOVÁ, 2006) Analyzátor CHARM II systém 6600 pracuje na principu RIA metody, což umožňuje vysoce citlivou detekci různých látek v mléce, nejen léčiv na bázi antibiotik (beta-laktámů, sulfonamidů, tetracyklinů, makrolidů, aminoglykosidů, novobiocinu, spektinomycinu, chloramfenikolu a analogů kyseliny folické), ale také aflatoxiny, pesticidy, alkalickou fosfatázu a rychlou bakteriální analýzu. Většina testů léčiv jednoho druhu trvá 8 minut, přičemž je využíván efekt vazby detekovaného léčiva na vazební člen, event. soutěž mezi označeným a neoznačeným léčivem. Vlastní detekce je prováděna ve vysoce citlivém detektoru na 3 H nebo 14 C, v množstvích pod hygienickými limity. Výsledky této metody jsou semikvantitativní výsledky ověřitelné na HPLC, se zlomkem provozních nákladů. Předpokládaná oblast použití je dohledávání druhu inhibiční látky jako druhý krok po plošném monitorování. Kromě již zmíněných stanovení v mléce lze systém (resp. jeho modifikaci) použít i pro jiné oblasti, jako např. potraviny, krmivo, sérum, tkáně atd. Popis zařízení Přístroj CHARM II 6600 je víceúčelový jednovzorkový scintilátor tekutých vzorků a luminometr v jednom. Měří tedy na kanálech 3 H, 14 C nebo světelná kvanta. Systém se skládá ze tří částí - vzorkové komory, displeje a klávesnice. Vzorek se umísťuje manuálně do komory ve středu horní části přístroje. Poté je z klávesnice zadán kanál, druh měření event. další instrukce, a na displeji odečten výsledek měření. Obr. 19 Charm II testr 25

31 Z výroby nastavené kanály: 1. Beta-laktámy 2. Tetracykliny 3. Sulfonamidy 4. Aminoglykosidy 5. Gentamycin 6. Streptomycin 7. Makrolidy 8. Novobiocin 9. Chloramfenikol 10. Stěry 11. Životnost 12. Filtrace 13. Aflatoxiny 14. Pesticidy 15. Alk. fosfatáza 16. H3 assay č H3 assay č C14 assay č C14 assay č LUM assay č LUM assay č Nulování 23. Tisk výsledků Obr. 20 Charm test Vzorkovnice Měřicí rozsah Účinnost Detektor Výstupy Napájení Rozměry borosilikátová zkumavka o 13 x 100 mm seznam a citlivost viz dokumentace 3 H 59 %, 14 C 90 % dva fotonásobiče pracující současně seriové rozhraní, výstupy počítač nebo tiskárna V, 50 Hz, 75 VA 52 x 31 x 34 cm, 22 kg HPLC/DAD, HPLC/MS, HPLC/MS/MS jsou metody kapalinové chromatografie v kolonovém provedení, jehož nejmodernější variantou je tzv. vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPCL High Performance Liquid Chromatogrphy). Vyrábějí se automatické vysokotlaké chromatografy s krátkými kolonami plněnými speciálními jemnými sorbety s chemickým povrchem. Toto uspořádání umožňuje dosahovat vysoké frakcionační kapacity a účinnosti dělení i u velmi složitých směsí látek. Tyto metody umožňují cílené stanovení inhibičních látek. Jsou časově i finančně náročné. Umožňují konfirmaci a kvantifikaci inhibičních látek. 26

32 Obr. 21 Kapalinový chromatograf HPLC b) ELISA metody ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), někdy také označovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci inhibičních látek. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to schopnost proteinů (tedy imunoglobulinů) vázat se na povrch umělých hmot a v druhé řadě pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty imunoglobulinových molekul. Pro průkaz specifických látek a antigenů existuje široké spektrum různých modifikací ELISA testu: Přímá ELISA - pro detekci antigenu. Nepřímá ELISA - pro detekci specifických látek. Přímá sendvičová ELISA - pro detekci antigenu. Nepřímá sendvičová ELISA - pro detekci specifických látek. 27

33 Základní složky ELISA testu 1. Antigen o o detekovaný v testovaném vzorku známý, komerčně připravovaný 2. Protilátka o o detekovaná v testovaném séru známá, komernčně připravovaná 3. Konjugát o jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotopu, na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) 4. Substrát o je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu Obr. 22 Ukázka ELISA destičky ELISA metody umožňují cílené stanovení penicilinu, tetracyklinů, gentamycinu, streptomycinu, entrofloxacinu, sulfonamidů, chloramfenikolu. Používá se zejména na stanovení streptomycinu, neboť ten není detekovatelný předchozími screeningovými metodami. Testy jsou vysoce specifické a velmi citlivé. Metody umožňují kvalitativní i kvantitativní stanovení inhibiční látky (dle použitého testu). Výsledky jsou odečítány pomocí speciálního spektrofotometru (JEŘÁBKOVÁ, 2006). 28

34 Za období byly porovnávány výsledky jednotlivých metod a bylo zjištěno, že nejčastěji jsou používaná beta-laktamová antibiotika samotná nebo v kombinaci s aminoglykosidovými. S postupujícím vývojem analytických metod a s jejich zvyšující se citlivostí budou téměř všechny vzorky specifikovány, pokud bude mít laboratoř k dispozici dostatečné množství vzorku. Z výsledků porovnání citlivosti testů jednoznačně vyplývá, že žádný test nedetekuje rezidua všech antibiotik s vyhovující citlivostí vzhledem k MLR, a proto je třeba používat více testů a metod a jejich vzájemné kombinace Zhodnocení výsledků centrálních laboratoří Výsledky jakosti mléka jsou centrálními laboratořemi předávány mlékárnám pro účely zpeněžování mléka a informačnímu centru Státní veterinární správy, odkud jsou dále předávány okresním veterinárním správám, které zajišťují výkon veterinárního dozoru nad výrobou a zpracováním mléka. Laboratoře pracují podle potřeb a požadavků svých zákazníků, kterými jsou především mlékárny, popř. i výrobci mléka. V souvislosti s bezpečností všech potravin zahrnující i vysokou hygienu a jakost získávání a zpracování živočišných výrobků, která patří mezi priority EU, je nutno i problematice jakosti syrového kravského mléka věnovat náležitou pozornost. Tab. 9 Průměrné ukazatele jakosti syrového kravského mléka Z tabulky je patrné, že jakost mléka, vyjádřená aritmetickými průměry v centrálních laboratořích zjišťovaných jakostních ukazatelů, vykazuje od roku 2000 mírnou tendenci k nárůstu počtu somatických buněk. Vysoké počty somatických buněk poukazují na výskyt subklinických mastitid a na značné ekonomické ztráty způsobené především snížením užitkovosti krav. I když tento ukazatel v počtu somatických buněk odpovídá požadavkům EU i ČR na jakostní mléko, není zcela v souladu s požadavky na zdravé stádo (do 200 tis. v 1 ml). 29

35 Podíl pozitivně reagujících vzorků mléka na inhibiční látky se snížil z 0,37 % v roce 2000 na 0,16 % v roce Přesto jej jejich podíl ve srovnání s mlékařsky vyspělými zeměmi, kde podíl pozitivních vzorků je nižší jak 0,1 %, stále vysoký. I přes uvedené dílčí nedostatky lze konstatovat, že hlavní jakostní ukazatele mléka stanovené předpisy EU (vážený průměr celkového počtu mikroorganismů 100 tis. a méně a somatických buněk 400 tis. a méně v 1 ml) byly v roce 2005 plněny. Průměrné hodnoty zjištěné v laboratořích dosáhly 37,8 % (celkový počet mikroorganismů) a 64,1 % (počet somatických buněk) maximálních hodnot stanovených pro mléko určené k dalšímu zpracování. Protože však vysoká jakost a bezpečnost potravin patří mezi priority EU, je z hlediska udržení konkurenceschopnosti čaských mléčných produktů na trzích unie nezbytné dosahované jakostní ukazatele syrového kravského mléka dále zlepšovat. Tab. 10 Celkový počet mikroorganismů v roce (MARŠÁLEK, ROČENKA, 2005) Tab. 11 Počet somatických buněk v roce (MARŠÁLEK, ROČENKA, 2005) 30

36 Graf. 1 Dynamika vývoje RIL v dodávaném mléce Zlepšení v RIL dosáhlo 66,7 % (z 0,48 na 0,16 %) 31

37 Závěr 4.0 ZÁVĚR Současný celosvětový trend zvyšování kvality potravin se týká i mléka a mléčných výrobků. Přímá závislost mezi ukazateli jakosti, nákupní cenou a možnostmi odbytu mléka vyžaduje věnovat náležitou pozornost všem faktorům, které mohou jakostní ukazatele syrového kravského mléka ovlivňovat. Jednou z nejčastějších příčin zhoršení jakosti mléka a přímých a nepřímých ekonomických ztrát chovatelů jsou mastitidy. Proto je jejich výzkumu, diagnostice, prevenci a léčení věnována trvalá pozornost ve všech chovatelsky vyspělých státech. Mastitidy jsou způsobovány několika faktory, z nichž mezi rozhodující patří infekční činitel (patogen), vnější prostředí a organismus dojnice. Výskyt mastitid, popř. jejich průběh a projev, ovlivňují v konkrétním prostředí především hygiena, ošetřování, výživa a krmení, dojení, stádium laktace, odolnost organismu dojnice a další. Vlastní onemocnění mastitidou je charakterizováno morfologickými změnami na postižených částech vemene a smyslovými, fyzikálními, chemickými a mikrobiálními změnami mléka. Z celé řady vědeckých prací a výzkumných sledování vyplývá, že ekonomické ztráty vyvolané mastitidami jsou způsobeny především: - snížením produkce mléka, - znehodnocením mléka (nutností jeho vyloučení z dodávky), - vyšším vyřazováním krav, resp. vyššími náklady na obměnu stáda dojnic, - snížením nákupní ceny mléka v důsledku snížení jeho jakosti, - náklady na léčiva a veterinární ošetření, - zvýšením spotřeby práce. Ve snaze snížit výskyt mastitid jsou v praxi používána speciální antibiotika, u kterých je nutno dodržovat stanovenou ochrannou lhůtu, než je možné mléko od léčených krav zařadit do mléka dodávaného mlékárně. Před předáním mléka od dodávky je nutné provést jeho vyšetření na obsah RIL a teprve po negativním zjištění je možno zařadit mléko do celkové dodávky. Ohrožení lidí reziduí antibiotik v mléce souvisí s ovlivněním jakosti mléka zánětlivými onemocněními mléčných žláz nepřímo. Avšak masově uplatňovaná terapie mastitid staví tento problém do popředí. Je tomu tak proto, že rezidua antibiotik ohrožují lidskou populaci jako významné alergeny. I nízké koncentrace některých antibiotik mohou vyvolat u alergiků dramatické klinické reakce. Je třeba si uvědomit, že většina antibiotik je vysoce termorezistentních, takže mohou zůstávat v mléce i po účinné pasteraci. Je proto absence reziduí antimikrobiálních látek významným jakostním znakem syrového kravského mléka a kritériem způsobilosti syrového mléka pro mlékárenské zpracování k lidské výživě. 32