PREDNÁŠKA Č. 8 AMINOKYSELINY & PEPTIDY VLASTNOSTI, PRÍPRAVA A REAKTIVITA

Transkript

1 PREDNÁŠKA Č. 8 AMINOKYSELINY & PEPTIDY VLASTNOSTI, PRÍPRAVA A REAKTIVITA 1

2 AMINOKYSELINY Štruktúrna klasifikácia V závislosti od pozície aminoskupiny voči karboxylovej skupine na uhlíkovom reťazci sa aminokyseliny vo všeobecnosti štruktúrne klasifikujú ako a-, b-, g-aminokyseliny... CO 2 H H 2 N a R H a-aminokyselina 1-Aminocyklopropánkarboxylová kyselina Rastlinný prekurzor biosyntézy eténu H 2 N a b CO 2 H R H b-aminokyselina 3-Aminopropánová kyselina (b-alanín) Štruktúrna podjednotka koenzýmu A H 2 N g a b CO 2 H g-aminokyselina R H 4-Aminobutánová kyselina (GABA) Neurotransmiter CNS u cicavcov 2

3 AMINOKYSELINY Vesmírne molekuly H 2 N CO 2 H L-Alanín Izolovaný z antarktického meteoritu CR EET H 2 N CO 2 H H 2 N CO 2 H Glycín Izolovaný z prachu kométy 81P/Wild 2 Izovalín Izolovaný z austrálskeho meteoritu Murchison 3

4 AMINOKYSELINY Medikamenty L-DOPA (Sinemet ) Zvyšuje hladinu dopamínu Antiparkinsonikum N-Acetylcysteín (Solmucol ) Antidotum paracetamolu Mukolytikum, antioxidant L-Tryptofán (Tryptan ) Zvyšuje hladinu serotonínu Antidepresant, hypnotikum Gabapentín (Neurontin ) Štruktúrny analóg GABA Analgetikum, antipsychotikum 4

5 a-aminokyseliny Nutričné molekuly Proteinogénne L-aminokyseliny Esenciálne: Lyzín (Lys, K) Metionín (Met, M) Histidín (His, H) Izoleucín (Ile, I) Leucín (Leu, L) Treonín (Thr, T) Tryptofán (Trp, W) Fenylalanín (Phe, F) Valín (Val, V) Nové : Pyrolyzín (Pyl, O) Selenocysteín (Sec, U) Neesenciálne: Alanín (Ala, A) Arginín (Arg, R) Asparagín (Asn, N) Kys. asparágová (Asp, D) Cysteín (Cys, C) Kys. glutámová (Glu, E) Glutamín (Gln, Q) Glycín (Gly, G) Prolín (Pro, P) Serín (Ser, S) Tyrozín (Tyr, Y) 5

6 a-aminokyseliny Gastromolekuly L-Treonín Príjemne sladký L-Metionín Sírna pachuť L-Izoleucín Nepríjemne horký Kyselina L-asparágová Trpko-kyslá Glutaman sodný (E 621) Slaný, umami 6

7 a-aminokyseliny Potenciálne jedy Caramboxine Neurotoxín Egrešovec oblý (Averrhoa carambola) Pacienti trpiaci chronickým renálnym zlyhaním sa môžu intoxikovať požitím karamboly (star fruit). Ovocie obsahuje neurotoxín karamboxín, ktorého nahromadenie v organizme spôsobí otravu. Typické príznaky zahŕňajú neovládateľnú štikútku, dezorientáciu, kŕče, záchvaty a prípadne aj smrť. (N. Garcia-Cairasco et al.: Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 13067) 7

8 Triviálne názvy ne/proteinogénnych a-aminokyselín (IUPAC: Pyrolyzín (Pyl, O) MW Selenocysteín (Sec, U) MW

9 Štruktúra a chiralita a-aminokyselín a-aminokyseliny majú sp 3 -hybridizovaný tetraédrický uhlík. Proteinogénne chirálne a-aminokyseliny majú výlučne L-konfiguráciu, v bázických podmienkach však relatívne ľahko podliehajú racemizácii. Všetky L-aminokyseliny majú (S)-konfiguráciu okrem cysteínu (R=SH), ktorý je podľa CIP (R)-konfigurovaný. R H 2 N (S) CO 2 H = H 2 N (S) CO 2 H R L-Aminokyselina = (S)-Aminokyselina 9

10 Chiralita a-aminokyselín Popis a grafické reprezentácie Porovnanie jednotlivých typov grafických reprezentácii konfigurácie aminokyselín: perspektívna, Fischerova, projekčná. Popis absolútnej konfigurácie a-aminokyselín pomocou D/L-systému je analógiou cukornej nomenklatúry: L-glyceraldehyd vs. L-serín. 10

11 Racemizácia a-l-aminokyselín Mechanizmus Prvým krokom racemizácie a-aminokyselín je kyslo-katalyzovaná enolizácia za vzniku achirálneho enolu. Následná reprotonácia prochirálneho b-uhlíka však vedie k racemizácii za vzniku opačného enantioméru. Pri bázicky-katalyzovanej racemizácii dochádza najprv k deprotonácii kyslého a-vodíka L-aminokyseliny. Následná reprotonácia prochirálneho b-uhlíka opäť vedie k racemizácii za vzniku opačného enantioméru. 11

12 Racemizácia a-l-aminokyselín Biologické konzekvencie Starnutím ľudského organizmu dochádza k spontánnej racemizácii a-l-asp zvyškov peptidov. Dehydratácia a-l-asp poskytne cyklický sukcínimid, ktorého enol forma je pro- aj achirálna. Následnou stericky-kontrolovanou reprotonáciou dochádza k inverzii konfigurácie na a-d-asp. 12

13 a-d/l-aminokyseliny Aplikácie Drvivá väčšina pozemských proteínov pozostáva z chirálnych a-l-aminokyselín. Je však známy aj prírodný výskyt a-d-aminokyselín vo forme peptidoglykánov. Napríklad D-alanín je súčasťou bunkovej steny rôznych druhov baktérií, ako aj účinnou zložkou niektorých peptidových antibiotík. D-alanín (R)-2-Aminopropánová kyselina L-alanín (S)-2-Aminopropánová kyselina Prirodzená racemizácia a-aminokyselín sa využíva ako metóda archeologického datovania (AAR). V prípade L-izoleucínu dochádza postupom času k epimerizácii na diastereomérny D-alloizoleucín. Ten sa však v proteínoch bežne nevyskytuje a tak určením pomeru L-Ile/D-allo-Ile vo vzorke sa dá pomerne presne zistiť jej vek. Takto bolo uskutočnené datovanie škrupiny vajca austrálskeho vtáka, ktorý vyhynul pred približne rokmi. Rádiouhlíková 14 C analýza je presná iba do ± rokov. 13

14 Fyzikálne vlastnosti a-aminokyselín Zwiterióny Fyzikálne vlastnosti aminokyselín naznačujú, že sa jedná o polárne molekuly: sú to kryštalické látky, majú vysoké body topenia (často sa pri nich rozkladajú) a na rozdiel od organických zlúčenín sú vo vode výborne rozpustné. Všetky tieto vlastnosti sú prejavom existencie ich zwiteriónovej formy. Aminokyseliny sú amfotérne, čiže obsahujú ako kyslú (-NH 3+ ), tak aj bázickú (-CO 2- ) subštruktúru. V kyslom prostredí prevláda katiónová forma, v bázickom naopak aniónová forma aminokyseliny. 14

15 Fyzikálne vlastnosti a-aminokyselín Zwiterióny Glycín Tautomerizácia aminokyselín, t.j. interkonverzia medzi zwiteriónom (ZW) a neutrálnou formou (NE), môže v princípe prebiehať dvoma spôsobmi v závislosti od toho, v akom prostredí sa nachádzajú. Teoretické štúdie glycínu naznačujú, že v rovnovážnom vodnom roztoku sa uplatňuje intermolekulový transfer protónu s participáciou molekuly H 2 O (Schéma B), v ostatných prípadoch je preferovaná skôr priama intramolekulová výmena H + medzi karboxylátovým aniónom a amóniovou soľou (Schéma A). 15

16 Fyzikálne vlastnosti a-aminokyselín Izoelektrický bod Dôkazom acido-bázických vlastností a-aminokyselín a existencie zwiteriónov je ich titračná krivka. Glycín je v silne kyslom prostredí (ph<2) vo forme katiónu amóniovej soli. Zvyšovaním ph dochádza k deprotonácii karboxylovej skupiny (pk a (RCO 2 H) ~ 5 vs. pk a (RNH 3+ ) ~ 9) až do izoelektrického bodu, t.j. pi, čo je ph s maximálnou koncentráciou zwiteriónu, ktorý je elektroneutrálny a nerozpustný. Zvyšovaním ph nad pi dochádza k deprotonácii amóniového katiónu zwiteriónu za vzniku karboxylátu. Titračná krivka glycínu: ph<pk a1 (2.3): majoritná forma H 3 N + CH 2 CO 2 H ph=pi (6.0): max. koncentrácia H 3 N + CH 2 CO 2 - pk a1 <ph<pk a2 : majoritná forma H 3 N + CH 2 CO 2 - ph>pk a2 (9.8): majoritná forma H 2 NCH 2 CO 2 - (Poznámka: pre jednoduché aminokyseliny pi=pk a1 +pk a2 /2) Acido-bázické vlastnosti aminokyselín s ionizovateľnými substituentami majú tri pk a hodnoty a vykazujú podstatne širšie rozpätie izoelektrických bodov, než je tomu u aminokyselín s nepolárnymi bočnými reťazcami (pi ~ ). 16

17 Príprava a-aminokyselín Aminácia a-brómkyselín Karboxylové kyseliny sa a-bromáciou (Hell/Volhard/Zelinskij) transformujú na a-halokyseliny. Tie následnou S N -reakciou s amoniakom poskytujú príslušné substituované a-aminokyseliny. Br 2 H 2 O Carl Magnus von Hell ( ) University of Stuttgart Jacob Volhard ( ) University of Stuttgart Aminácia a-brómkarboxylových kyselín ide na rozdiel od alkylhalidov iba do prvého stupňa, nakoľko nukleofilita dusíka v produkte je dostatočne znížená. Napriek tomu sa často volia iné metódy prípravy a-aminokyselín. Nikolaj Dimitrijevič Zelinskij ( ) University of Moscow 17

18 Príprava a-aminokyselín Modifikovaná Gabrielova syntéza Podobne aj ftalimid má dostatočne zníženú nukleofilitu dusíka na potlačenie polyalkylácie. Tento fakt sa úspešne využíva na monosubstitúciu s 1 a 2 alkylhalidmi - Gabrielova syntéza amínov. Draselná soľ ftalimidu je S N 2-reakciou alkylovaná s dietylbrómmalonátom. Následná deprotonácia kyslého a-vodíka poskytne nukleofilný C-anión, ktorý je taktiež alkylovaný za vzniku príslušného diesteru. Finálna bázická hydrolýza uvoľní oba dikarboxyláty a po okyslení reakčnej zmesi a termickej dekarboxylácii sa získa a-aminokyselina (spolu s recyklovateľnou kyselinou ftalovou). 18

19 Príprava a-aminokyselín Streckerova syntéza Kondenzácia aldehydu/ketónu s chloridom amónnym v prítomnosti kyanidu poskytne a-aminonitril, ktorého kyslou hydrolýzou sa získa a-aminokyselina. ( Adolph Strecker ( ) University of Giessen Na primárne vzniknutý imíniový katión z benzaldehydu sa nukleofilne aduje CN -. Tento atak je značne rýchlejší, než alternatívny na PhCHO. Hydrolýzou vzniknutého aminonitrilu sa získa neproteinogénna aminokyselina fenylglycín. Analogickou Streckerovou syntézou z acetaldehydu sa pripraví alanín. alanine 19

20 Reakcie a-aminokyselín Esterifikácia karboxylovej skupiny Aminokyseliny podliehajú všetkým typickým reakciám svojich funkčných skupín za toho predpokladu, že je správne nastavená príslušná hodnota ph. Esterifikácia prebieha obvykle v kyslých podmienkach, za ktorých amín existuje výlučne vo forme amóniovej soli a karboxylová skupina nie je disociovaná. Prvým príkladom je typická esterifikácia v metanole, ktorej primárnym produktom je stabilná amóniová soľ. Jej prípadná neutralizácia bázou však generuje nestabilný aminoester, nakoľko dochádza k jeho následnej acylácii - intermolekulovej adícii amínu na ester za vzniku príslušného amidu. Druhý príklad ilustruje benzyláciu oboch karboxylových skupín kyseliny asparágovej pomocou p-tsoh. Akonáhle dôjde k esterifikácii, zwitterión prestáva existovať a produkt nadobúda vlastnosti 1 amínu. 20

21 Reakcie a-aminokyselín Acylácia aminoskupiny Transformácia -NH 2 skupiny aminokyseliny na amid vyžaduje ph>10 (za účelom uvoľnenia amínu). Za týchto podmienok je -CO 2 H skupina úplne deprotonovaná, karboxylát však neinterferuje s acyláciou. V prvom prípade ako acylačné činidlo vystupuje acylchlorid. Výnimočná nukleofilita amínu je zrejmá hlavne v kontexte prítomnosti HO - a H 2 O ako kompetitívnych nukleofilov, nakoľko acylácia dominuje. Druhý príklad ilustruje využitie anhydridu (Boc 2 O) ako acylačného činidla, príslušný karbamát sa často využíva v syntéze peptidov. Nakoľko amidy sú veľmi slabo bázické (pk HA ~ -1), acylované aminokyseliny nevykazujú zwitteriónový charakter a môžu byť transformované na deriváty karboxylových kyselín. (Boc 2 O) (Boc = tert-butoxycarbonyl) 21

22 Reakcie a-aminokyselín Ninhydrínový test Všetky a-aminokyseliny (okrem prolínu) podliehajú špecifickej reakcii s ninhydrínom. Jedným z produktov tejto transformácie je fialovo sfarbený imín, ktorý je kvalitatívnym indikátorom prítomnosti (obvykle bezfarebných) aminokyselín najčastejšie v TLC. Vo forenznej chémii sa ninhydrínový test používa na detekciu odtlačkov prstov. Hydratovaný uhlík 2,2-dihydroxyindán-1,3-diónu je značne elektrofilný a je atakovaný nukleofilným amínom za vzniku imínu, ktorý dekarboxyláciou a hydrolýzou poskytne amino-1,3-diketón. Jeho kondenzáciou s ninhydrínom vzniká príslušný chromofór. 22

23 PEPTIDY Fyziologicky polyfunkčné biomolekuly Proteíny (peptidy) sú biomolekulami absolútne nevyhnutnými pre (pozemský) život. Majú množstvo biochemických funkcií a zúčastňujú sa kľúčových biologických dejov. 23

24 PEPTIDY Štruktúra a vlastnosti amidickej väzby Amidická väzba (O=C-NH) vzniká kondenzáciou -NH 2 skupiny jednej aminokyseliny s -CO 2 H skupinou druhej aminokyseliny. Vykazuje dve hraničné rezonančné štruktúry. Kvôli rezonancii má amidická väzba čiastočne násobný charakter, čo ju robí planárnou. Dôsledky: ~ 60% ~ 40% Kratšia C-N väzba (sp 2 -sp 2 ). Obmedzená rotácia okolo nej. C=O skupina menej elektrofilná. Prakticky všetky amidické väzby v peptidoch sú planárne a substituenty zaujímajú výhodnú trans-konfiguráciu. Ide o kľúčové faktory determinujúce konformáciu a 3D-štruktúru polypeptidu. 24

25 PEPTIDY Viacúrovňová hierarchia štruktúry 1 Primárna lineárna sekvencia jednotlivých aminokyselín v peptidovom reťazci. 2 Sekundárna lokálna konformácia atómov a skupín v hlavnom peptidovom reťazci. 3 Terciárna 3D-usporiadanie všetkých atómov všetkých reťazcov peptidu v priestore. 4 Kvartérna 3D-usporiadanie reťazcov podjednotiek kompletného polypeptidu. 25

26 PEPTIDY Biosyntéza Systém DNA-RNA-Ribozóm Venkatraman Ramakrishnan Cambridge (1952) Thomas A. Steitz (1940) Yale University N O B E L O V A C E N A Ada E. Yonath (1939) Weizmann Institute 26

27 PEPTIDY Biosyntéza Systém DNA-RNA-Ribozóm 27

28 PEPTIDY Syntéza Výzvy a potenciálne problémy Každý peptid má jednoznačne definovanú a unikátnu sekvenciu konkrétnych aminokyselín. N-terminus je ľavý koniec peptidu s -NH 2 skupinou, C-terminus je pravý s -CO 2 H skupinou. To znamená, že dipeptid LeuGly obsahuje amidickú väzbu medzi -CO 2 H leucínu a -NH 2 glycínu. Pre syntézu LeuGly je teda nutné aktivovať -CO 2 H leucínu pre Ad N -E reakciu s -NH 2 glycínu. Problémom však je prítomnosť ďalších nukleofilných skupín popri -NH 2 skupine glycínu... Na zabezpečenie požadovanej chemoselektivity je nevyhnutné ochrániť (=dezaktivovať) amino skupinu leucínu a hydroxylovú podjednotku karboxylovej skupiny glycínu. 28

29 Syntéza peptidov Využitie ochranných skupín Aké vlastnosti by mali mať ideálne ochranné skupiny vhodné pre využitie v syntéze peptidov? musia byť ľahko inštalovateľné a zároveň odstrániteľné za odlišných reakčných podmienok, ani ich zavedenie, ani odstránenie nesmie poškodiť (stereo)chemickú integritu substrátu. Aplikácia: Syntéza podjednotky hormónu oxytocínu (indukuje pôrod a následnú tvorbu mlieka). 29

30 Syntéza peptidov Ochrana karboxylovej skupiny Estery Prvým krokom syntézy oxytocínu je kapling (ang. coupling) -NH 2 skupiny Gly s -CO 2 H skupinou Leu. Najprv je nutné ochrániť karboxylovú funkciu Gly napr. vo forme esteru. Jednoduché metylestery a etylestery však nepodliehajú Ad N -E reakcii s amínmi len za toho predpokladu, ak tie sú ochránené. Etylester Gly musí byť na kapling použitý ako hydrochlorid vlastne v ochránenej forme amínu. Výhodnejšie je použitie stéricky viac bráneného (= menej reaktívneho) terc-butylesteru reakciou RCO 2 H s izobuténom v kyslom prostredí. Vincent du Vigneaud ( ) Cornell University Nobelova cena 1955 Hydrolýza terc-butylesterov prebieha lepšie v kyslom, než bázickom prostredí. 30

31 Syntéza peptidov Ochrana aminoskupiny Z-Karbamát V druhom kroku je nutné ochrániť -NH 2 skupinu Leu za účelom Ad N -E kaplingu s ochráneným Gly. Vhodná je napr. bázicky-stabilná benzyloxykarbonylová skupina (Z, Cbz), nakoľko báza je potrebná na uvoľnenie nukleofilného amínu z Gly. HCl. Karbamáty sa pripravujú reakciou benzylchloroformátu a sú nenukleofilné podobne ako amidy a sú rezistentné voči vodným roztokom slabých kyselín a báz. Odstránenie Cbz-skupiny je možné ako v silno kyslých podmienkach, tak hydrogenolyticky (H 2, Pd). 31

32 Syntéza peptidov Vznik amidickej väzby Na vznik -CONH- väzby musí byť -CO 2 H skupina Z-Leu aktivovaná - napr. vo forme p-nitrofenylesteru. Ten v prítomnosti slabej bázy reaguje s etylesterom Gly. HCl, čím sa z neho uvoľní nukleofilný amín, ktorý atakuje najelektrofilnejšiu z 3 prítomných C=O skupín nesúcu najlepšie odstupujúcu skupinu. Vznikol ochránený dipeptid, ktorého kyslou hydrolýzou (HBr/AcOH) sa získal hydrobromid LeuGly-OEt. Zvyšok cieľového nonapeptidu oxytocínu bol vybudovaný presne analogickým spôsobom - jednotlivé aminokyseliny boli zavedené vo forme N-ochránených a C=O aktivovaných N-Cbz-p-nitrofenylesterov. 32

33 Syntéza peptidov Ochrana aminoskupiny Boc-Karbamát Ďalšou často používanou N-ochrannou skupinou je terc-butoxykarbonylová (Boc), ktorá sa zavádza s pomocou terc-butoxykarbonylanhydridu (Boc 2 O). Je relatívne stabilná v silno bázickom prostredí. Odstránenie Boc-skupiny na rozdiel od Cbz-skupiny je možné aj v mierne kyslých podmienkach. Prvým krokom je protonácia, následná eliminácia t-butylového katiónu a finálna dekarboxylácia. Mechanizmus: 33

34 Syntéza peptidov Sumár ochranných skupín Ochrana karboxylovej skupiny: Ochrana aminoskupiny: 34

35 PEPTIDY Syntéza Lineárna vs. konvergentná Lineárna syntéza peptidov predstavuje sekvenčné pridávanie aminokyselín do reťazca. Konvergentná syntéza peptidov zahŕňa paralelné spájanie podjednotiek do reťazca. Lineárna syntéza: Konvergentná syntéza: Celkový výťažok: Y = Y i n n = 20, Y i = 98%, Y = = 66.8% n = 20, Y i = 90%, Y = = 12.2% n = 20, Y i = 80%, Y = = 1.2% Celkový výťažok = výťažok najdlhšej lineárnej sekvencie Syntéza 20-peptidu kondenzáciou dvoch dekapeptidov (Y i = 98%): Y = = 80.1% 35

36 PEPTIDY Syntéza Automatické sekvenátory Fluorenylmetyloxykarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Odbúrava sa bázickým piperidínom, čím nedochádza k interferencii s kyslo-labilnou peptidickou väzbou. 12-Kanálový mikrovlnný automatický peptidový syntetizér 36

37 Reaktivita tiopeptidov Redoxný pár cysteín/cystín Cysteín s -SH skupinou ako iné tioly ľahko podlieha oxidatívnej dimerizácii za vzniku disulfidu cystínu. Disulfidické väzby tohto typu sú často prítomné v mnohých peptidoch a bielkovinách (napr. v inzulíne). 37

38 Praktické využitie reaktivity tiopeptidov Trvalá ondulácia Silné disulfidické -S-S- väzby cystínu vo vlasových proteínoch vznikajú oxidáciou -SH skupín cysteínu. Tie sú počas ondulácie zredukované bázickým tioglykolátom amónnym na tioly. Mechanickou úpravou vlasov dochádza k vzájomnému posunu jednotlivých reťazcov cysteínu a vzniku požadovaného tvaru. Účes sa zafixuje oxidáciou peroxidom vodíka za opätovného vzniku disulfidických mostíkov cystínu. 38