MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE Brno 009 Bc. Jana Tománková

2 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Genetická variabilita mikrosatelitů u různých plemen psů Diplomová práce Vedoucí práce: Vypracovala: Doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D. Bc. Jana Tománková Brno 009

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Genetická variabilita mikrosatelitů u různých plemen psů jsem vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. Dne. Podpis diplomanta.

4 Abstrakt Předmětem této studie bylo stanovit polymorfizmy vybraných mikrosatelitů u plemene hovawart a analyzovat strukturu populace. Následně zhodnotit výsledky s již publikovanými studiemi. Do studie bylo zahrnuto 10 jedinců. V panelu byly použity tyto mikrosatelity: FHC079, FHC054, FHC010, PEZ1, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ1, PEZ0. Byly stanoveny míry diverzity: heterozygotnost, polymorfní informační obsah (PIC) a F IS. Výsledky heterozygotnosti pro plemeno hovawart jsem porovnávala s plemeny český teriér, kavkazský pastevecký pes, hannoverský barvíř, rotwailer, zlatý a labradorský retriever. Nejnižší heterozygotnost a PIC byla zjištěna u plemene český teriér, naopak nejvyšší heterozygotnost a PIC byla zjištěna u kavkazského pasteveckého psa. Plemeno hovawart vykazuje druhé nejnižší hodnoty heterozygotnosti a PIC. Klíčová slova: diverzita, mikrosatelity, heterozygotnost, PIC, F IS

5 Abstract The purpose of the study was to determine polymorphisms of selected microsatellites of the Hovawart breed and to analyze the structure of the population. Subsequently, I compare the results with already published studies. The study included 10 individuals. The panel used the following microsatellites: FHC079, FHC054, FHC010, PEZ1, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ1, PEZ0. Degrees of diversity were stated as heterozygity, polymorphic information content (PIC) and F IS. The results were compared with the breed of Czech Terrier, Caucasian Sheepdog, Hanoverian Hound, Rottweiler, Golden and Labrador Retriever. The lowest heterozygity and PIC were found for the Czech Terrier breed, the highest heterozygity and PIC were found for the Caucasian Sheepdog breed. The Hovawart breed had the second lowest value of heterozygity and PIC. Keywords: diversity, mikrosatellites, heterozygosity, PIC, F IS

6 1T1.1T 1TÚvod1T 1T.1T 1TCíl 1T3.1T 1TLiterární 1T4.1T 1TMateriál Obsah... 6 práce1t... 7 přehled1t T3.1.1T 1TPes domácí (Canis familiaris)1t T T 1THistorie a domestikace1t T3.1..1T 1TDomestikační změny1t T T 1TNovodobá historie1t T3..1T 1THistorie plemene hovawart1t T3..1.1T 1TDědičnost zbarvení1t T3.3.1T 1TGenetika populací1t T3.4.1T 1TGenetická variabilita a diverzita1t T3.5.1T 1TMolekulárně genetické markery1t T T 1TGenetické markery1t T3.5..1T 1TMolekulární markery1t T3.6.1T 1TAnalýza panelu mikrosatelitu1t T3.7.1T 1TFragmentační analýza1t T T 1TStanovení velikosti fragmentů1t T3.8.1T 1TKapilární elektroforéza1t T T 1TKapilární zónová elektroforéza1t T3.8..1T 1TKapilární gelová elektroforéza1t... a metody zpracování1t T4.1.1T 1TOdběr vzorků1t T4..1T 1TAnalýza polymorfismu mikrosatelitu1t T4.3.1T 1TStatistické vyhodnocení dat1t T T 1TGenepop 4.0.1T

7 1T5.1T 1TVýsledky 1T6.1T 1TZávěr1T 1T7.1T 1TLiteratura1T 1T4.3..1T 1TVýpočet četnosti genotypů a alel1t T T 1THardy-Weinbergová rovnováha1t T T 1Testování vazbové nerovnováhy1t T T 1TPopulační diferenciace1t T T 1TFRISR a genetická diverzita1t T T 1TKonverze souboru1t T4.4.1T 1TPoužité testy softwarem Genepop1T T T 1TExaktní test1t T4.4..1T 1TAlgoritmy pro exaktní test1t T T 1TPřesná P-hodnota odhadnuta algoritmy Markovova řetězce1t T T 1TStatistický test1t T T 1TOdhad F- statistiky1t a diskuze1t

8 1. Úvod Chov zvířat je prastará činnost člověka. Jako věda se začíná formovat až v 18. století v Anglii. Chov psů byl v Anglii na vysoké úrovni, vyšší než kdekoliv jinde na světě a právě v Anglii se konala roku 1859 první výstava psů. V Anglii také vznikl v roce 1873 Kennel Club, organizace chovatelů čistokrevných plemen psů. Plemena psů se měnila podle potřeby a přání člověka. Neexistuje žádný jiný druh zvířat, kde by bylo tolik odlišností ve velikosti, zbarvení, osrstění, vzhledu, využití, mentalitě, rychlosti a dalších rozdílností, jak je tomu právě u psů. A tak dnes máme psy společenské a lovecké, psy pro dostihový sport, pro potřebu policie a armády, pro vyhledávání drog, psy záchranářské, slepecké, ovčácké, pastevecké, psy schopné táhnout těžká břemena, psy asistenční, psy do bytu či venkovního psince, do tvrdých podmínek severu a jihu a ve východní Asii dokonce i psy jedlé. Můžeme říci, že takové variability bylo dosaženo díky cílené genetické selekci. Hodně výzkumu bylo uděláno v oblasti co nejefektivnějšího zabezpečení plnohodnotné, zdravé výživy psa, mnoho víme o tom, jak úspěšně předcházet řadě chorob psů a jak proti některým chorobám psů chránit i sebe, ale stále je toho jen velmi málo, co víme o dědičnosti znaků a vlastnosti psa. Touha každého chovatele dosáhnout co nejlepších výsledků neustále vede k zamýšlení nad tím, co a jak udělat, kterým psem nakrýt tu či onu fenu, aby právě potomstvo z jeho chovatelské stanice vyniklo na výstavě či zvítězilo v té nejvyšší soutěži. 6

9 . Cíl práce Cílem práce je stanovit polymorfizmy vybraných mikrosatelitů u sledovaných populací plemen psů a na základě molekulárních dat analyzovat genetickou strukturu populací. Pro svou práci jsem si vybrala plemeno hovawart. 7

10 3. Literární přehled 3.1. Pes domácí (Canis familiaris) Zařazení psa domácího v zoologickém systému: Třída savci (Mammalia) Řád šelmy (Carnivora) Čeleď psovití (Canidae) Rod pes (Canis) Druhy Pes domácí (Canis familiaris) Historie a domestikace Před milióny let žili na zemi primitivní masožraví savci, zvaní Miacidové. Tento drobný savec měl chrup psovité šelmy, tělesnou stavbu podobnou lasici, pět prstů, částečně zatahovací drápy, protistojné palce na předních nohách, dlouhý, tenký ocas a malý mozek. Byl chytřejší, než ostatní šelmy žijící v té době a většinu času trávil na stromech. Miacis je považován za společného předka vlka, kojota a šakala. Mají také shodný počet chromozómů (78). Mezidruhovým křížením tak vznikalo plodné potomstvo, které se mezi sebou snadno pářilo. Obr. č. 1.: Miacid (Pokorná, 007) Před mil. let se z rodu Miacis vyvinula psovitá šelma Cynodictis, která již trávila většinu času na zemi. Byla to první skutečná psovitá šelma, ze které se vyvinul předek vlků (měl již stejný počet zubů jako vlk), psů a lišek Tomarctus. Tento prapředek psa se nejvíce podobal některým dnešním ovčákům. Tím, že žil již pouze na zemi, se mu končetiny lépe přizpůsobily běhu a začaly se prodlužovat. Chodidla se také prodlužovala a stala se kompaktnějšími. Pátý prst začal být nepotřebný a postupně zakrňoval. Ocas se začal zkracovat a celkové proporce se začaly přibližovat 8

11 vlkům. Tomarctus žil přibližně před 0 miliony lety, byl veliký asi jako liška. Na základě archeologických kosterních nálezů je považován za nejstaršího prapsa. Obr. č..: Cynodictis a Tomarctus (Pokorná, 007) Psi se poprvé objevili před 1 14 tisíci lety v Eurasii. Jde o dobu kamennou, kdy lidé žili v prvobytně pospolné společnosti a živili se lovem. V této době začalo pravděpodobně docházet ke sbližování člověka se psem. O tom vypovídají také archeologické nálezy, podle nichž lze s určitostí potvrdit přítomnost psa v blízkosti lidských příbytků. Z tohoto období se našlo při archeologických vykopávkách velké množství zachovalých koster různých druhů psů. Z toho lze odvozovat původ dnešních plemen. Evropští psi jižní jsou jiného původu než psi severní a obě skupiny zřejmě nepocházejí z Evropy. Podle vykopávek některých částí kostí se ukazuje, že v době kamenné bronzové bylo v Evropě šest typů psů: Canis familiaris palustris rutimer pes bažinný (rašelinný) Canis familiaris intermedires pes popelištní Obr. č. 3.: Canis aureus (Pokorná, 007) 9

12 Canis familiaris inostranzewi Obr. č. 4. Coyote Canis Latrans (Pokorná, 007) Canis familiaris decumanus Canis familiaris leineri Canis familiaris matris optimae pes bronzový O původu psů na americkém kontinentě je informací nejméně. Z archeologických nálezů i přes teorii o působení kojotů se ukazuje, že pes osídlil kontinent s člověkem ještě před jeho oddělením od Asie. Dnes je to dokládáno analýzou DNA. Přesto vznikla v Americe tři plemena nebo plemenné skupiny psů podobná jezevčíkům, boxerům a ovčákům. Nejpravděpodobnějším prapředkem velké většiny psů je vlk, který se vyskytuje v mnoha barevných rázech i velikostech, a který předal z 95 % genetickou informaci našemu psovi. Až v poslední době (Clutton-Brock, 1995) byly publikovány výsledky porovnání mitochondriální DNA 67 plemen psů, a ty ukázaly, že nejbližším příbuzným všech těchto plemen je jen vlk. (Pokorná, 007; Dostál, 007) Domestikační změny 1. Odlišnosti mezi psem a vlkem - Pes má oproti stejně velkému vlku až o 30 % menší hmotnost mozku. U psa tak došlo ke zmenšování smyslových center. - Pes je oproti vlkovi všežravec a nemá ocasní pachovou žlázu. - Většina plemen psů má skus nůžkový a většina vlků má skus klešťový. 10

13 - Pes má vyšší plodnost. Fena hárá obvykle dvakrát za rok. - Hlasový projev psa je štěkání. Vlci neštěkají, pouze kňučí a vyjí. - Pes nosí většinou ocas zdvižený, často také zakroucený, vlk nosí ocas svěšený volně dolů. - Pes má různou strukturu a délku srsti u jednotlivých plemen. - Čenich většiny psů je kratší. - Pes má jiný způsob pohybu, je těžkopádnější. Stopa vlka je delší a užší, než stopa stejně velkého psa. - Typické pro některá plemena psů jsou svislé ušní boltce. - Psi nemají tak kompletní repertoár vizuálních signálů. Častěji používají hlasové signály. - Spolupráci při lovu a společnou péči o mláďata lze pozorovat jen u vlků.. Podobnosti v chování při komunikaci psů a vlků - Podobně jako vlci umí identifikovat jednotlivce a tvořit pevné vztahy. - Spolu s jedinci téhož druhu tvoří smečky, sdílí s nimi potravu a místo pro odpočinek, který je zhruba 1 hod. spánku z 4 hod. dne Novodobá historie Plemena psů vznikala dlouho spontánně, ať přičiněním člověka nebo samovolně. Skutečná plemena s vypracovaným standardem a řízeným chovem vznikala nejprve v Číně a Japonsku, kde byly chovatelské záznamy vedeny po staletí většinou podle pokynů vládců. Cílené chovatelství se v evropských zemích začalo rozvíjet až v 17 století. Kolébkou chovatelství se stala především Anglie. V tomto období vznikala malá módní plemena. V 18. století dochází k rozmachu výcviku služebních psů. V Evropě se vytvářely chovatelské organizace až v 19. století, kdy začaly vznikat první plemenné standardy. Prvním chovatelským klubem byl britský Kennel Club, který uznává pouhých 189 plemen, převážně britského původu a řadí je do sedmi skupin podle použití (neshoduje se to s jinými organizacemi, především s mezinárodní kynologickou organizací, FCI). (Pokorná, 007; Dostál, 007) 11

14 3.. Historie plemene hovawart První zmínky se objevují už ve středověku. Poprvé to bylo např. ve spisech Sachsenspiegel a Schwabensiegel. Na počátku minulého století už však nikdo nedokázal jednoznačně potvrdit, jak onen popisovaný hovewart vlastně vypadal. Pan R. Grimmer (Německo) po 1. světové válce vyslovil názor, že hovawart představuje upevněný základní typ, který v místech, kde se udržel, tj. ve vysokohorských údolích, se výrazně při neřízeném křížení, prosazoval. Částečně je ale jeho historie opředena rouškou tajemství. Určité spekulace se vedou i ohledně znovu tvůrce hovawarta. Všeobecně je však za něj považován Kurt F. König, který cíleně započal s čistokrevným chovem hovawartů, i když v přípravné fázi spolupracoval i se svým otcem Bertramem Königem. Hovawart měl být odvážný, odolný a schopný i bez jakéhokoliv výcviku zcela přirozeně ochránit v případě potřeby jak majetek svého majitele, tak i jeho samotného. Nakonec tomu napovídá i jeho samotný název plemene. Hof znamená dvůr a warten hlídat nebo čekat. Plemeno prošlo třemi sériemi své rekonstrukce a to do roku 1914, od roku 1918 a od roku 195. Vzhledem k tomu, že König oproti vnějšímu vzhledu upřednostňoval upevnění a zachování žádoucí povahy, prosadil si zavedení tzv. zkoušky vloh před připuštěním zvířete do chovu. Skutečnost, že toto plemeno zůstalo dlouho bez širšího zájmu, mělo svoji výhodu ušlo tak šlechtění a chovatelskému přeformování a tím se udrželo ve své původní povaze. Počátek vlastního čistokrevného chovu začal roku 19. Významnými spolupracovníky Königa byli chovatelé Busch, Geiser, Krüter, a další, kteří spolu s ním téhož roku založili v německém Thale první chovatelský spolek hovawartů. Plemenná kniha byla založena v roce 1936 a následujícího roku byl hovawart jako plemeno oficiálně uznán FCI. V Německu bylo od stanoveno, že k chovu jsou připuštěni jen psi se zkouškou z výkonu. V r bylo plemeno uznáno za služební, když předtím více jak 100 hovawartů složilo různé druhy zkoušek. Ustanovení plemene jako služebního uvádí i standard FCI č. 190/b z aktualizovaný v roce Viz příloha č. 1. V roce 1984 byla, zejména z důvodu jednoduššího řízení chovu a toku informací, založena, Internationale Hovawart Föderation IHF (Mezinárodní federace 1

15 hovawartů). Do dneška bylo odchováno přes jedinců, ročně se počty zvyšují o cca 500 jedinců. (Hovawart club ČR, 009 [cit ]) Dnes můžeme s jistotou říci, že rozhodující pro dnešní vzhled a vlastnosti plemene hovawart, byla pečlivá chovatelská selekce a cílené podíly krevních linií při spojování tzv. typových psů (přibližně %), novofundlandského psa ve své tehdejší menší formě (8 15 %), kuvéze (10 50 %), leongergra (až 4 %), švýcarského salašnického psa (asi 1 %), flat coat retrievera (asi 1 %), původního dlouhosrstého německého ovčáka (15 75 %) a africké divoké feny (pária, saluki), a to zcela rozdílně v jednotlivých vrzích. První africkou fenu Tessi do plemene vkřížil F. König, u jejíchž potomků se projevovala nadměrná výška, plachost, štíhlost a nohatost. (Fábin, 003) Dědičnost zbarvení U hovawarta máme tři barevné rázy: psy černé, černé se znaky a psy plavé. Z genetického hlediska známe jen barvy dvě: světlou a tmavou. V daném znaku mohou být obě alely příslušné vlohy (genu) stejné pak mluvíme o čistokrevnosti (homozygotnosti) nebo jsou různé (tj. nečistokrevné, štěpitelné heterozygotní). Obr. č. 5.: Tři uznané varianty FCI (Hovawart club ČR, 008) Plaví hovawarti jsou vždy čistokrevní, tmaví mohou být čistokrevní nebo štěpitelní (pálení je určováno jinými alelami než barvy). Černí čistokrevní psi při spojení mají jen čistokrevně černé potomky. Plavý a černý mohou mít potomky černé, plavé i černé se znaky. Dědičná vloha pro černou barvu se prosazuje proti vloze pro barvu plavou, která je potlačována. Spojením dvou černých heterozygotů mohou předávat vlohu pro plavou barvu a mít i plavá štěňata, která budou s ohledem na plavou barvu čistokrevná, protože recesivní genetické znaky se mohou projevit pouze tehdy, když je jedinec získá od obou rodičů. I když nevíme, kdo je homozygot a kdo heterozygot, můžeme přesto při spojení hovawartů předpokládat: 13

16 1. Spojení plavých psů přinese vždy jedině plavé potomky.. Spojení plavého psa s tmavým (černým nebo černým se znaky) může přinést všechny tři barevné rázy. 3. Spojení černých psů a černých s černými se znaky může rovněž přinést všechny tři barevné rázy. 4. Spojení psů černých se znaky může přinést plavé psy nebo psy černé se znaky, ale nikdy ne černé psy. V chovu hovawartů existuje normální rozdělení barev. V evropských státech a v zemi původu Německu je přibližně % psů černých se znaky, asi 35 % plavých a zhruba 10 0 % černých psů. V ČR, podle údajů ve Zpravodaji HW Klubu ČR č. 1/000, je zastoupení nevyrovnané. Největší zastoupení je 50 % barvy plavé, 40 % barva černá se znaky a málo nad 5 % černé. (Fábin, 003) 3.3. Genetika populací Studuje vyskytující se genetické rozdíly mezi organizmy, tj. genetická variance. Genetická variance se může vyskytovat ve třech hierarchických úrovních: v populacích, mezi populacemi stejného druhu a mezi různými druhy. Evoluční procesy se dějí výlučně v populacích pomocí změn ve frekvencích (četností) alel. Populace je tedy lokální skupina jedinců stejného druhu žijící v určitém prostředí, kteří se mezi sebou pohlavně rozmnožují a jejich genetické založení vytváří genofond. Genofond tvoří veškerá genetická informace (všechny alely) obsažená u všech reprodukce schopných jedinců populace. Genofondem se liší jedna populace od druhé. Pro populace je charakteristické, že se jedinci navzájem odlišují geneticky (genetický polymorfizmus). Ten je dán zejména mutacemi a pohlavním rozmnožováním. Pro studium genetických procesů je nutné sledovat frekvence alel v populacích, což nám umožňuje Hardy-Weinbergův zákon. Časovým měřítkem je generační interval. (Urban, 005) 14

17 3.4. Genetická variabilita a diverzita Kromě vzniku mechanizmu uchování a přenosu genetické informace je umožnění jejich změn variability základní podmínkou evoluce života. Výsledkem genetické variability je individuální identita jedinců jednotlivých druhů, tedy genetická různorodost neboli genetická diverzita. Hlavními mechanizmy vzniku genetické variability je segregace vloh do gamet v průběhu redukčního dělení, pohlavnost a pohlavní rozmnožování a mutace DNA (genů), chromozomů, genomu. Tyto hlavní mechanizmy spolu s rekombinacemi jako výsledku procesu crossing-overu tvoří základní příčiny genetické diverzity. Čím více je genetické variability v populaci, tím lépe přežívá a její vývoj je rychlejší. V přirozených populacích je genetická variabilita vždy, ale ne pro všechny vlastnosti nebo lokusy. Variabilita mezi populacemi stejného druhu se nazývá genetická rozrůzněnost (genetic differentiation). Geneticky fixované rozdíly mezi plemeny jsou výsledkem umělé selekce. V rámci plemene dochází k omezování diverzity a směrování genofondu k určenému cíli. Mezi zdroje genetické variability patří mutace, segregace a rekombinace. (Urban, 005) 3.5. Molekulárně genetické markery Existence molekulárně genetických (DNA) markerů je dána předpokladem existence polymorfismu na úrovni DNA. Mezi charakteristické vlastnosti těchto markerů patří, že: 1. jsou tvořeny sekvencemi bází na specifickém místě genomu (lokusu), tyto sekvence jsou variabilní mezi jedinci,. jsou exaktně testovatelné a vykazují kodominatní dědičnost, 3. mohou, ale nemusí být částí genu, 4. lze je hodnotit na úrovni zárodečného vývoje nebo i zárodečných buněk a není třeba čekat až na fenotypový projev v dospělosti organizmu, 5. jsou také vysoce informativní, mohou být získány i z velmi malého množství materiálu a také v libovolné fázi ontogenetického vývoje jedince včetně embryí a tělesných pozůstatků. 15

18 Markery jsou využívány především při tvorbě genetických map a vysvětlení vztahů jejich polymorfismu k rozdílu v užitkovosti, přičemž velké mutace jsou většinou škodlivé, malé mutace mohou být i prospěšné a nejčastější je tzv. neutrální polymorfismus, který zůstává bez projevu. (Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, 007) Genetické markery Jsou základními pomůckami používané ke studiu genetické variability v a mezi populacemi. Markery umožňují určovat, které alely jsou přítomné v populaci. Jejich využití lze charakterizovat: - studování rozmnožovacích systémů (určit stupeň inbreeding v populacích), - měření toku genů a strukturu populace (určit stupeň migrace mezi populacemi), - určení paternity k měření dědičnosti a fitness, - tvorba genetických map k hledání genů determinujících kvantitativní vlastnosti, - uplatnění v konzervační genetice, ekologické a evoluční genetice, nebo ve šlechtění. Prvními markery, které se využívaly, jsou viditelné (diskrétní) polymorfismy. Tyto markery dovolovaly odhalovat pouze malou část genetické variability. Jsou diskrétní, protože ve fenotypu mají jen několik málo variant (obvykle až 3) a jsou podmíněny jedním nebo dvěma lokusy. Nejsou zpravidla ovlivněny prostředím. Takové markery využíval už Gregor Mendel u hrachů. Viditelný polymorfismus není reprezentativní pro celý genom a neodhaluje dostatek genetické variability. (Urban, 005) Molekulární markery Jsou nejmodernějším typem markerů, které jsou založeny na detekci pomoci elektroforézy, v které jsou makromolekuly oddělovány na gelu v elektrickém poli. Prvními molekulárními markery byly proteiny. Pomoci elektroforézy bílkovin byl 16

19 odhalován polymorfismus mléčných bílkovin (kaseiny, albuminy, ), bílkovin krevního séra apod. Mezi alelami musí být vztah kodominance, aby mohl být rozeznán heterozygotní genotyp. Nevýhodou je, že odhalují jen malou část skutečné variability v DNA sekvencích mezi jedinci, protože: - proteiny jsou produkty genů a variabilita v proteinech neodhaluje variabilitu v nekódujících sekvencích genomu, - pro velký počet proteinů, nelze dobře odhalovat minimální rozdíly v rodině proteinů, - celá řada záměn v AK řetězci není schopna, na základě velikosti elektrického náboje, odhalit mobilitou na gelu, - mnoho změn v sekvenci DNA v kódujících oblastech nezapříčiní záměnu aminokyseliny v sekvenci proteinu. (Urban, 005) DNA markery První metody pro odhalování variability v DNA sekvenci se objevily v sedmdesátých letech minulého století jednalo se o rozštěpení řetězce DNA na malé části specifickými enzymy a tyto kousky DNA se separovaly na gelu a vizualizovaly radioaktivním značením a později fluorescenčními značkami. Tato technika se nazývá polymorfizmus délky restrikčních fragment (dále jen RFLP). RFLP markery jsou kodominantní, takže lze odhalovat heterozygotní genotypy. Ve spojení s PCR, která dokáže namnožit na milióny kopií specifický úsek DNA, vznikla používaná metodika PCR-RFLP pro odhalování bodových mutací v DNA. Novější technikou je VNTRS (variabilní počet tandemových opakování), která identifikuje minisatelity a mikrosatelity. Tato metoda odhaluje opakující se kopie sekvencí, které jsou vysoce polymorfní a jsou vhodné pro sledování variability v a mezi populacemi. Další novější metodou je určování jednonukleotidových polymorfizmů (SNP), které mají sice méně alel než mikrosatelity, ale jsou rovnoměrně rozesety po celém genomu. (Urban, 005) 17

20 Mikrosatelity Mikrosatelity (short tandem repeats, STRs), také známé jako krátké tandemové repetice tvořené zpravidla opakováním 1 5 bp s množstvím opakování zřídka překračujícím stovky. Nejčastěji jsou dinukleotidové repetice, ze kterých převažuje typ (CA)n. Mikrosatelity jsou sekvence náchylné k mutacím. Díky mechanismu nerovnoměrné rekombinace a skluzu polymerázy na repetici se mění počet repetic. Tato nestabilita je za normálních okolností detekovatelná pouze v evolučním měřítku, pokud srovnáme rychlost vývoje mikrosatelitů s vývojem jiných sekvencí. To znamená, že v tomto časovém rámci došlo k akumulaci mnoha mutací mikrosatelitů v populaci. Výsledkem je přítomnost několika alel lišících se počtem opakování pro daný mikrosatelit v populaci. To dělá z mikrosatelitů užitečné genetické markery, neboť délka repetice je snadno zjistitelná pomocí amplifikace metodou PCR. Vyšetření založené na mikrosatelitech je relativně jednoduché, levné a široce využívané ve vazebných, asociačních a populačních studiích pro DNA diagnostiku i forenzní účely. (Šeda, Liška, Šedová, 006) Výhoda mikrosatelitů Výhodou je vysoká míra jejich informativnosti v rodokmenech. V rodokmenu je marker neinformativní tehdy, pokud je jeden rodič homozygotem, nebo pokud jsou oba rodiče heterozygoti pro stejnou kombinaci alel. Dále jsou kodominancí, vysoce variabilní, somaticky stabilní a v genomu se vyskytují častěji než minisatelity. Nevýhoda mikrosatelitů Hlavní nevýhoda je omezená možnost paralelního vyšetření více markerů v jedné zkumavce (multiplexování). Nejvíce užívaný multiplex je vyšetření DNA pro forenzní účely, které obsahuje standardně 13 mikrosatelitních markerů. Multiplexní zpracování je možné díky použití 4 různých fluorescentních barviv na označení primerů pro PCR a různé délce amplikonů se stejnou barvou. Různé alely mikrosatelitního markeru se obvykle liší jen o délku jedné nebo několika repetic. (Šeda, Liška, Šedová, 006) 18

21 Využití mikrosatelitů - Analýza rodičovství (parentage analysis) - Identifikace klonů - Populačně genetické studie - Genový tok, migrace - Historie populací, efektivní velikost populací - Systematika 3.6. Analýza panelu mikrosatelitu Testování polymorfismu v délce mikrosatelitu je prováděno pomocí gelové elektroforézy, např. pomocí automatických genetických analyzátorů (sekvenátorů) a tzv. fragmentační analýzy DNA založené na laserovém skenování fluorescenčně značených DNA fragmentů. Separace PCR fragmentů kapilární elektroforézou probíhá spolu s inertním DNA markerem. Určení genotypů v konkrétních mikrosatelitech proběhne vyhodnocením velikosti DNA fragmentů pomocí programu. Panel mikrosatelitů pro psa Canis familiaris je uveden v tabulce č. 1. Tab. č. 1.: Panel 10 mikrosatelitů u psů. Lokus Chromozom Fluorescenční zn. Barva Rozsah (bp) FHC010 4 FAM Modrá 6 4 FHC054 1 FAM Modrá PEZ1 - FAM Modrá FHC079 4 NED Žlutá PEZ3 4 NED Žlutá PEZ6 7 NED Žlutá PEZ8 11 NED Žlutá PEZ5 1 JOE Zelená PEZ1 - JOE Zelená PEZ0 - JOE Zelená

22 Studií genetické variability u hannoverského loveckého psa se zabývali Lüpke a Distl (005). Genetickou variabilitu analyzovali se 16 mikrosatelity. Byly použity všechny mikrosatelity ležící v H-W rovnováze. Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla vyšší než očekávaná. Dinukleotidové mikrosatelity byly vystaveny nižšímu obsahu polymorfismu (PIC) než tetranukleotidové (0,5 : 0,66). Průměrný PIC byl 0,61. Altet et al. (001) srovnával rotwailery s labradorskými a zlatými retrievery. Genetická variabilita rotwailerů byla menší, ale rozdíly nebyly příliš významné. Koskinem a Bredbacka (000) zjistili, že variance polymorfních mikrosatelitů je vyšší, s vyšší počtem psů s průkazem původu ve větších populacích. Malá populace Bedlingtonského teriéra a Pembroke velšského jezevčíka měla malou pozorovanou heterozygotnost. U větších populací se heterozygotnost pohybovala okolo 0,618 s rozsahem 0,387 0,758. Tzn. nízká heterozygotnost a markerové alely odchýlené od H-W rovnováhy je větší v malých populacích a také má o 6 % méně alel. Srovnání dat Lüpke a Distl (005) a od Aletet et al. (001) byl PIC hannoverských psů (0,55) vyšší než u rotwailerů (0,5) a labradorských retrieverů (0,5) ale nižší než u zlatých retrieverů (0,6) Fragmentační analýza Je to kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí. Fragmenty se oddělí podle své velikosti v kapiláře. Snímač detekuje průchody molekuly její barvu a intenzitu signálu v určitém čase. Menší fragmenty doputují ke snímači dříve než delší. Zároveň se zkoumanými vzorky jde velikostní standard (zn. červeně), software vykreslí kalibrační křivku a podle ní určí i velikost zkoumaných fragmentů. Pro tuto analýzu se používá genetický analyzátor ABI PRISM 310 viz příloha č.. Na tomto přístroji je radioaktivní značení nahrazeno fluorescenčním, což nám umožní použít až 5 barev současně pro jednu analýzu. Mezi další výhody patří rychlost analýzy, automatizace, ovládání přes PC a lepší reprodukovatelnost výsledků. 0

23 Stanovení velikosti fragmentů Software přiřadí píkům velikostního standardu známé velikosti, sestrojí kalibrační křivku a pak dopočítá velikosti neznámých píků mikrosatelitových alel. Tímto získáme data pro určení velikosti, kdy na ose x zjišťujeme velikost alely mikrosatelitu a na ose y zjišťujeme intenzitu signálu (množství produktu). (Butler, 001) 3.8. Kapilární elektroforéza Je nástupcem klasické elektroforézy. Využívá elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř křemenné kapiláry. Kapilára je naplněna základním elektrolytem, který vede proud. Její konce jsou ponořeny do zásobníků s elektrolytem, společně s elektrodami z inertního materiálu (Pt). Mezi elektrody se aplikuje vysoké napětí (10 30 kv). Malý objem vzorku se dávkuje do konce kapiláry. Kapilára prochází přes detektor, obvykle fotometrický. Záznam závislosti odezvy detektoru na čase se nazývá elektroforegram. Elektroforegram je podobný chromatogramu. Poloha píku určuje kvalitu, plocha nebo výška píku určuje kvantitu. Doba analýzy v kapiláře se zkracuje zejména z těchto důvodů: - Teplo tvořené uvnitř kapiláry je účinně odváděno jejími stěnami, proto lze použít vysoké napětí. - Kapilára prochází detektorem a je prováděna on-line detekce zón a počítačové vyhodnocení píků. - Elektroforézu doplňuje elektroosmóza. Elektroosmotický tok (EOF) má za následek pohyb roztoku kapilárou k detektoru. Snižuje analytické časy a k detektoru unáší i částice elektroforeticky migrující opačným směrem. (Klouda, 003; Gaš, 001; Rowan, 009) Kapilární zónová elektroforéza Nabité molekuly jsou unášeny elektroosmotickým tokem separačního pufru uvnitř kapiláry až k detektoru. K separaci dochází rozdílnými elektroforetickými rychlostmi migrujících iontů v pufru. 1

24 3.8.. Kapilární gelová elektroforéza Látky se rozdělují na základě rozdílné pohyblivosti v gelu. V kapiláře se nachází gel, jenž maximalizuje diference mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, které různě úspěšně migrují póry gelu. Gel zabraňuje vzniku elektroosmotického toku a proto jen jeden druh kladných či záporných iontů putuje směrem k detektoru. Pohyblivost v gelu závisí na náboji separované molekuly a její molekulové hmotnosti, intenzitě elektrického pole a na typu a porózitě gelu. Využívá se zejména pro velké ionty, jakými jsou sacharidy, peptidy, bílkoviny, DNA a RNA. Kapiláry Jsou vyrobeny z taveného křemene a mají ochraný polyimidový povlak (kapilára je křehká). V místě detekce je malý podíl povlaku odstraněn. Kapilára je cm dlouhá. Vnitřní povrch kapiláry může být chemicky modifikován kovalentním navázáním různých látek. (Klouda, 003; Gaš, 001; Rowan, 009)

25 4. Materiál a metody zpracování Pokus byl proveden v laboratoři Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Agronomické fakulty Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Pro hodnocení genetické variability bylo vybráno 10 nepříbuzných jedinců plemene hovawart s plemenem průkazu i bez něj Odběr vzorků Odběr vzorků DNA byl proveden bukálním stěrem pomocí kartáčku Cytobrush plus. Izolace DNA byla provedena izolačním kitem JET Quick Tissue DNA Spinkit (Genomed). 4.. Analýza polymorfismu mikrosatelitu Mikrosatelity (FHC079, FHC054, FHC010, PEZ1, PEZ3, PEZ5, PEZ6, PEZ8, PEZ1, PEZ0) byly analyzovány (StockMarkP P Paternity PCR Typing Kit; Applied Biosystems) podle doporučené metodiky. Fragmentační analýza byla provedena pomocí ABI PRISMP P Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Statistické vyhodnocení dat Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno programem GENEPOP 4.0. (F. Rousset, 008) Genepop 4.0. Implementuje a srovnává tradiční metody s vývojovými trendy. - Vypočítá exaktní test pro H-W rovnováhu, pro diferenciaci populace a pro genetickou nerovnováhu mezi dvojicí lokusu - Vypočítá odhady F-statistiky, frekvence nulových alel, velikost alel pro mikrosatelity, atd. 3

26 pp P + P = - Vykoná analýzu izolace vzdálenosti páru a porovnání mezi jednotlivci i celou populací včetně intervalu spolehlivosti pro příbuzenskou velikost Výpočet parametrů genetické variability Genetická variabilita odhalená genetickými markery může být kvantifikovaná mnoha způsoby. Hlavní jsou frekvence alel a genotypů. Z četnosti genotypů lze následně stanovit alelové četnosti. Výpočet četnosti alel podle vzorce: kde: p = d + ½ h q = r + ½ h p = relativní četnost dominantní alely q = relativní četnost recesivní alely d = relativní četnost dominantních homozygotů h = relativní četnost heterozygotů r = relativní četnost recesivních homozygotů Genotypové a alelové frekvence byly počítány na všech lokusech. Výpočet heterozygotnosti vychází z Hardy-Weingergova zákona: pq + qp 1 Očekávaná heterozygotnost představuje podíl očekávaných heterozygotů v populaci na základě alelických frekvencí za předpokladu platnosti HW zákona. Pozorovaná heterozygotnost je podíl heterozygotních jedinců v daném lokusu z celkového počtu pozorovaných jedinců. Hodnota PIC je definována jako pravděpodobnost, že genotyp markeru daného potomka umožní vyvodit, kterou ze dvou alel markeru získal od konkrétního heterozygotního rodiče (při nepřítomnosti crossing-overu). Je počítána podle n1 vzorce: PIC H i1 n p I p j, kdy prir, prjr, jsou alelické frekvence. jil 4

27 Hardy-Weinbergová rovnováha Pro vyvozování genotypových frekvencí za náhodného páření je třeba dalších předpokladů: - frekvence alel by se neměly měnit z generace na generaci, jinak působí systematické evoluční síly, - populace musí být dostatečně velká, aby frekvence alel nepodléhala změnám při výběrové chybě (náhodný genetický drift). HW model vznikl v roce 1908, který nezávisle na sobě publikovali G.H.Hardy a W. Weinberger. (Urban, 005) Testování každého lokusu v populaci Zahrnuje tři odlišné testy týkající se nulových hypotéz (náhodná shoda gamet). Je to pravděpodobnostní test, pravděpodobnost pozorovaných vzorků použitých pro definování vyřazovací zóny a P- hodnota v testu shody pro součet pravděpodobností ve všech tabulkách (s některými alelickými počty) se stejnou nebo nižší pravděpodobností. Při nadbytku nebo nedostatku heterozygotnosti se může použít alternativní test jako je Score test nebo U-test. Jsou dostupné dva různé algoritmy: první, kompletní výčet metod jak popsal Louis a Dempster (1987). Tento algoritmus je sestaven pro méně než 5 alel. Jako například P-hodnota s kompletním výčtem a střední chybou odhadu. Druhá, Markovův řetězec (MC) odhaduje algoritmus přesné P-hodnoty. Poskytuje: odhad P - hodnoty spojený s nulovou hypotézou H-W rovnováhy a střední chybu odhadu (S.E.). MC metoda je rychlejší a výsledky jsou vysoce variabilní závisející na alelových frekvencích. Při více než pěti vzorcích provádí genepop pouze metodu MC Komplexní test překřížených lokusů nebo vzorků Tento test je konstruován použitím Fisherové metody. Hlavní statistická teorie ukazuje, že lépe kombinuje P-hodnoty z různých testů. Když je alternativní model 5

28 specifický, je možné najít lepší cesty kombinace výsledků z různých dat než z Fisherové metody Testování vazbové nerovnováhy Pro tuto volbu nulové hypotézy je: genotyp jednoho lokusu nezávislý na genotypu jiných lokusů. Pro dvojici diploidních lokusů se nepředpokládá tvorba gametické fáze u heterozygotů. Testováním spojení mezi diploidními genotypy u obou lokusů je popisováno jako test složené vazbové nerovnováhy (the composite disequilibrium linkage) Weir, (1996). Testováním spojení mezi haploidními a diploidními genotypy je vypočteno pro haploidní a diploidní lokusy. Usnadní to testování pro nerovnováhu buněčného jádra. Přímé testování spojení alel ve dvou místech se vypočítá pro dvojici lokusů s haploidní informací Populační diferenciace Všechny testy jsou založeny na Markovových řetězcích Genetická diferenciace Podílí se na distribuci alel. Nulová hypotéza je stejná alela ve všech populacích. Pro každý lokus se provede test v kontingenční tabulce a odhad P-hodnoty. Statistický test je buď pravděpodobnost vzorku podmíněného okrajovými hodnotami, nebo procentem pravděpodobnosti. V prvním případě je Fisherův test (F-test) přesný test pravděpodobnosti. Jednoduchou modifikací se použije přesný G-test. Ve druhém případě se testují všechny páry vzorků pro všechny lokusy Genotypová diferenciace Zabývá se rozmístěním diploidních genotypů u různých populací. Nulová hypotéza je genotyp ze stejného rozmístění ve všech populacích. Test je proveden pro každý lokus do kontingenční tabulky viz obr. č. 6. 6

29 Odhad P-hodnoty z procenta pravděpodobnosti (G) založeného na přesně vykonaném testu. G-hodnota, statisticky definuje zónu zamítnutí, je vypočítaná z jednoho genotypu a zapsána do genetických tabulek. Zóna zamítnutí je definována jako suma pravděpodobností všech tabulek. Mohou nastat dvě varianty: prázdné tabulky nebo tabulky s jednou řadou a jedním sloupcem, anebo tabulky, které mají okrajové číslo 1 pro všechny řady i sloupce. Obr. č. 6.: Kontingenční tabulka Table with 3 rows and 6 columns Pop: HOW, Loci: FHC054 and FHC010 FHC FHC Analýza jednotlivých kontingenčních tabulek Je možné analyzovat každou kontingenční tabulku nezávisle na vstupních datech Genepopu F IS a genetická diverzita Alely a frekvence genotypů Vypočítá se několik proměnných pro každý lokus v každém vzorku: - frekvence alel, - pozorovaný a očekáváný genotyp, - F IS odhad pro každou alelu podle Weir a Cockerham (1984), - globální odhad F IS podle Weir a Cockerham (1984) a Robertson a Hill (1984), 7

30 - počet pozorovaných a očekávaných homozygotů a heterozygotů. Očekávaná hodnota je číslo podmíněné na pozorovaných alelických počtech v HW rovnováze Totožnost založená na genové diverzitě a F IS Uvádí pozorované frekvence identických páru genů jako odhady odpovídající pravděpodobnosti totožnosti a poté vypočítá diverzitu jednotlivců i mezi jednotlivci Alely založené na diverzně genů a ρ IS Vypočítá míry diverzity založené na velikosti alel a rozdílech mezi jedinci (MSDintra) Konverze souboru Genepop si dokáže převést vstupní data do jiných formátů požadované jinými programy. Data zahrnující haploidní lokusy nebo tři-číselný formát nemusí být převedeny do platného formátu pro jiné programy. Např. konverze pro FSTAT (F statistika), BIOSYS (písmenný a číselný kod), LINKDOS (D statistika) Použité testy softwarem Genepop Exaktní test Pravděpodobnost genotypů závisí na frekvencí alel. Testy HW rovnováhy, populační diferenciace a rovnovážného spojení jsou implementovány v Genepopu. V různých případech může být dosažena pravděpodobnost vzorků podmíněných na pozorování alelických (např. pro HW testy) nebo genotypických počtech (např. populační diferenciace nepřijatá HW rovnováhou). Protože přesné pravděpodobnosti jsou vypočítané exaktními testy např. Mantel test, implementovaný 8

31 v Genepopu. Později byl použit pro testování účinku proměnné Y na odezvu proměnné Z při odstranění prostorové autokorelace účinku na Z Algoritmy pro exaktní test Podmíněné testy požadují úplnou inventarizaci všech možných vzorků, což je nepraktické. P-hodnota může být vypočítána jednoduchými algoritmy obměny anebo propracovanějšími algoritmy Markovova řetězce zvláště algoritmem Metropolis- Hasting (Hasting, 1970). Poslední zmíněný algoritmus prozkoumává uzavřený systém vzorků pro dané podmínky. Tento algoritmus nalezli Guo a Thompson (199). Nepatrná modifikace jejich algoritmu je implementovaná v Genepopu. Guo a Thompson také vymýsleli testy na kontingenční tabulky. Další simulace z MC je rozdělená do dávek. Každý odhad P-hodnoty je odvozený výpočtem poměru času MC strávených konfigurací vzorku (podle daného statistického testu). Odhady P-hodnot z následných dávek jsou nezávislé a směrodatná odchylka pro P-hodnoty může být odvozena ze změny dávky P-hodnot, Hastings, (1970). Čím delší čas, tím nižší je směrodatná odchylka Přesná P-hodnota odhadnuta algoritmy Markovova řetězce Používá se pro největší skupiny dat z MC. Standardní hodnoty neznámé vzdálenosti a délky dávky implementované v Genepopu jsou dostačující (v mnoha dalších aplikacích algoritmu MC nejsou tak jednoduché). Nicméně, nepřesné P-hodnoty mohou mít velkou směrodatnou odchylku, nebo jestliže je malý počet změn, blíží se odhad P-hodnoty k 0 nebo 1. Pokud je směrodatná odchylka příliš velká je dobré zvýšit počet dávek Statistický test Jako první byly pro pravděpodobnostní testy implementovány algoritmy markovového řetězce, tj. testy, kde zóna zamítnutí je definovaná z nejméně pravděpodobných vzorků v nulové hypotéze. Takové testy měly Fisherovou preferenci, 9

32 zvláště pravděpodobnostní test na nezávislost v kontingenčních tabulkách známý jako Fisherův exaktní test. V závislosti na alternativní hypotéze závažnosti jsou jiné statistické testy často vhodnější. Alelická závažnost předpokládaná v G-statistice je optimální pro detekci rozdílnosti a použití G- statistiky bylo zobecněné ke všem testům kontingenčních tabulek v Genepopu Odhad F- statistiky Definice: 1. F IS Q1 Q 1 Q. F ST Q Q3 1 Q 3 3. F IT Q1 Q3 1 Q 3 Kde Q jsou pravděpodobnost totožnosti: Q 1 je mezi geny (gamety) uvnitř jedinců Q je mezi geny u jiných jedinců uvnitř skupin (populací) Q 3 je mezi skupinami (populací) Závěry mohou být přesnější při přítomnosti většího množství alel (např. Leblois et al., 003, uvádí, že rozmanitost genu je menší než 0,8). Výstupem není odhad frekvencí všech alel, ale pouze odhad procenta ANOVA, jedno- a multilokusové definice Proslulá práce od Cockerhama (1973) využívala formalizmu z analýzy rozptylu (ANOVA) k tomu, aby definoval odhad z F-statistiky. Tyto odhady mohou být vyjádřeny v rámci zamýšlených částek ze čtverce MSG, MSI, MSP (pro gamety, jedince a populace) vypočítané analýzou rozptylu. Ekvivalent může být vyjádřen v rámci součástí variancí, kterými jsou nezaujaté odhady odpovídající parametrickým variancím v ANOVĚ modelu. Tyto parametrické variance jsou spíše rozdíly mezi změnami a mohou být záporné. Záporné mohou být, i když jsou dva parametry kladné. 30

33 Čtverce mohou být interpretované v rámci pozorovaných frekvencí identických párů genů ve vzorku. Pro vyvážené vzorky jsou vztahy jednoduché: ˆ ˆ, Qˆ 1 1 Q MSG G a Qˆ ˆ Q ˆ 3 ( MSP MSI) /(n) P odhad F IS jednoduché populace: Qˆ ˆ 1 Q 1 Qˆ MSI MSG ˆ I MSI MSG ˆ ˆ ˆ 1 Q ˆ ( MSI MSG) / I I G., kde n je velikost skupiny. Z tohoto důvodu je Pro nevyvážené skupiny (populace nestejné velikosti) jsou odhady zjištěny komplexním váženým průměrem z pozorovaných četností identických páru genů uvnitř skupin. Vyjádření ANOVY splňuje ještě MSG ˆ G a ˆ, ( MSI MSG) / I a ˆ, kde n c je funkce velikosti každé skupiny ( MSP MSI ) /(n c ) P S S / S /( n 1) ( n c 1 1 čtvercových skupin a n je počet skupin. Pak Fˆ Fˆ Fˆ IS ST IT MSI MSG ˆ I MSI MSG ˆ ˆ MSP ( n MSP ( n I, kde S 1 je celkový rozsah výběru, S je suma velikosti G MSP MSI MSP ( n 1) MSI n c c c c ˆ MSG ˆ ˆ ˆ I P P I 1) MSI ncmsg ˆ ˆ P I 1) MSI n MSG ˆ ˆ ˆ c Analýza je vykonaná pro každý lokus s několika místy a multilokusový odhad je procento váženého součtu čitatelů specifických lokusů přes jmenovatele specifických lokusů. Nicméně, není zde jediný odpovídající způsob jak vypočítat vážené sumy. Weir a Cockerhamové multilokusové odhady (1984) jsou definované ze sumy středních statistik a, b a c, pro každý lokus, který se zdá být ˆ. Čitatel multilokusového odhadu z F ST je takto Σ loci i a i = MSP MSI ) /( ) I G G. i ( n c. Jiný i způsob multilokusového odhadu (Weir, 1996) je definován ze středních statistik S 1, S a S 3, kde pro lokus i, S ( MSP MSI) /( ) 1i i n místy n, a čitatel multilokusového lokusu je Σ loci i S i anc i pro průměrný rozsah výběru napříč i / n. Oba dva dávají stejné odhady Q jak pro lokusy 5 nebo 50 jedinců v každém subpopulaci. Genepop zpracovává data ještě jiným výpočtem. Podle následujících explicitních vzorců: 31

34 3 i n n n i n n MSG i n MSI n MSP MSG i n MSI n MSP F i n n n i n MSG i n MSI n MSP i MSI MSP F i n i n i MSG MSI n i MSG MSI n F G c I c P c i G c P c i c c i c c i IT G c I c P c i P c i c c i i ST G I c i I c i c i c i IS 3 ˆ ˆ ˆ ˆ ˆ 1) ( 1) ( ˆ ˆ ˆ ˆ ˆ 1) ( ˆ ˆ ˆ ˆ ) ( ) ( ˆ Mikrosatelity alel, R ST a ρ ST Statistiky založené na velikosti alel byly rozšířeně používány podle Slatkina (1995). Parametry IS, ST, IT a jejich odhady jsou definovany jako náhrada 1-Q k očekávaná čtvercovým rozdílem mezi velikostí alel a geny srovnané (Rousset, 1996) ve všech vzorcích. 1 Q k byla pozorována čtvercovým rozdílem (Michalakis a Excoffier, 1996). Pak se odhad stává prostou ANOVOU ze střední korelace pro velikost alel. Jestliže jsou pouze dvě alely,, ˆ ˆ ST ST F ale podle Slatkina (1995). ˆST ST F R Robertsonův a Hillsův odhad F IS Tento odhad byl navržen k tomu, aby měl nižší varianci než ANOVA. (Rousset, )

35 5. Výsledky a diskuze Genetická diverzita se vyvíjí pod tlakem selekce zaměřené na různé cíle za současného působení genetického tlaku. Ke zpracování dat bylo použito 10 psů plemene hovawart v Moravskoslezském kraji. Z odebraných vzorků jsme izolovali genomové DNA, kterou jsme si ověřili pomocí gelové elektroforézy. Obrázek izolace DNA viz příloha č. 4. U vzorku 3 a 4 jsme pro fragmentační analýzu použili dvojnásobné množství pro přesnější výsledky. Genetickou variabilitu jsme zjišťovali na 10-ti lokusech, u kterých jsme stanovili počet alel a jejich frekvence výskytu. 33

36 Tab. č..: Frekvence alel pro každý lokus Lokus Alely Frekvence FHC , ,450 FHC , , , , ,050 PEZ , , ,150 PEZ1 60 0, , , ,150 PEZ , , ,300 PEZ5 10 0, ,350 FHC , ,800 PEZ , , , ,050 PEZ6 17 0, , , ,150 PEZ8 7 0, , ,900 Byly zjištěny počty a rozmezí frekvence alel testovaných hovawartů pro každý lokus. Na lokusu FHC010 byly nalezeny alely v rozmezí 3 7 bp o frekvencích 0,450 0,550. Na lokusu FHC054 bylo nalezeno 5 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,050 0,300. Na lokusu PEZ1 byly nalezeny 3 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,150 0,450. Na lokusu PEZ1 byly nalezeny 4 alely v rozmezí 34

37 bp o frekvencích 0,050 0,700. Na lokusu PEZ0 byly nalezeny 3 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,300 0,400. Na lokusu PEZ5 byly nalezeny alely v rozmezí bp o frekvencích 0,350 0,650. Na lokusu FHC079 byly nalezeny alely v rozmezí bp o frekvencích 0,00 0,800. Na lokusu PEZ3 byly nalezeny 4 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,050 0,750. Na lokusu PEZ6 byly nalezeny 4 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,050 0,500. Na lokusu PEZ8 byly nalezeny 3 alely v rozmezí 7 35 bp o frekvencích 0,050 0,900. V porovnání s jinými plemeny podle Truksy (008) se na lokusu FHC010 u českého teriéra vyskytovaly alely v rozmezí 7 31 bp o frekvencích 0,381 0,619. U plemene kavkazský pastevecký pes 5 alel v rozmezí 3 39 bp o frekvencích 0,037 0,550. Na lokusu FHC 054 byly nalezeny u plemene český teriér 3 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,119 0,548. U plemene kavkazský pastevecký pes 6 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,037 0,300. Na lokusu PEZ 1 byly nalezeny u plemene český teriér 3 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,143 0,595. U plemene kavkazský pastevecký pes 4 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,150 0,36. Na lokusu PEZ 1 byly nalezeny u plemene český teriér 3 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,6 0,49. U plemene kavkazský pastevecký pes 10 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,05 0,375. Na lokusu PEZ 0 byly nalezeny u plemene český teriér alely v rozmezí bp o frekvencích 0,04 0,976. U plemene kavkazský pastevecký pes 6 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,05 0,375. Na lokusu PEZ 5 byly nalezeny u plemene český teriér 3 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,191 0,333. U plemene kavkazský pastevecký pes 5 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,050 0,488. Na lokusu FHC 079 byly nalezeny u plemene český teriér alely v rozmezí bp o frekvencích 0,476 0,54. U plemene kavkazský pastevecký pes 4 alely v rozmezí bp o frekvencích 0,063 0,55. Na lokusu PEZ 3 byly nalezeny u plemene český teriér alely v rozmezí bp o frekvencích 0,453 0,548. U plemene kavkazský pastevecký pes 8 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,038 0,313. Na lokusu PEZ 6 byly nalezeny u plemene český teriér 5 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,048 0,667. U plemene kavkazský pastevecký pes 8 alel v rozmezí bp o frekvencích 0,013 0,350. Na lokusu PEZ 8 byly nalezeny u plemene český teriér alely v rozmezí bp o frekvencích 0,191 0,801. U plemene kavkazský pastevecký pes 8 alel v rozmezí 3 43 bp o frekvencích 0,113 0,

38 Ani jedno z plemen není na žádném z lokusů bez variability, tedy vždy byly nalezeny nejméně dvě alely v rámci plemene hovawart a českého teriéra, u kavkazského pasteveckého psa byly nalezeny vždy nejméně čtyři alely. Počet alel hovawarta se od českého teriéra lišily nepatrně. Největší rozdíl vznikl na lokusu FHC054. Rozdíl v počtu alel hovawarta od kavkazského pasteveckého psa byl vyšší. Ani jeden lokus nemá více alel než kavkazský pastevecký pes. Největší rozdíly vznikly na lokusech PEZ1, PEZ3, PEZ6 a PEZ8. Hardy-Weinbergrův test Odhad exaktních P-hodnot pomocí metody Markovových řetězců. Tab. č. 4.: P- hodnota a střední chyba průměru na lokusech, F IS F IS Lokus P-hodnota S.E. W&C R&H FHC010 0,517 0,0013-0,370-0,38 FHC054 0,8345 0,0038-0,95-0,08 PEZ1 0,313 0,007 +0,37 +0,378 PEZ1 0,4470 0, ,09 +0,190 PEZ0 0,570 0,008-0,008-0,03 PEZ5 1,0000 0,0000-0,047-0,049 FHC079 1,0000 0,0000-0,00-0,08 PEZ3 0,4711 0, ,316 +0,0 PEZ6 0,5700 0,0043-0,050-0,085 PEZ8 1,0000 0,0000-0,09-0,003 S.E. střední chyba odhadu, W&C Weir a Cockerham, R&H - Robertson a Hills Hovawart je ve všech lokusech v H-W rovnováze. V tabulce je vypočítán globální odhad F IS podle autorů Weir, Cockerman (1984) a Robertson, Hills (1984) pro srovnání jejich rozdílů ve výsledcích. Největší rozdíl hodnot je na lokusu PEZ1, PEZ3 a FHC054. Nejmenší rozdíl je na lokusu PEZ5, FHC079 a FHC010. Směrodatná odchylka je nejvyužívanější míra variability 36

39 Heterozygotnost a PIC Dalším ukazatelem genetické variance je heterozygotnost, tj. pravděpodobnost, že dvě náhodně zvolené alely z populace nejsou identické. Heterozygotnost jde ruku v ruce s vyšší vitalitou a životaschopností, neboť disponuje s větším počtem alel tedy vyšší variabilitou možných genotypů. Takže jsou při selekci vybírána zvířata s vyšším počtem heterozygotních genů. Proto, když vybíráme k chovu nejvitálnější a životaschopné jedince, volíme většinou heterozygotní varianty, a tak snižujeme ztrátu genů v populaci. Tab. č. 3.: Homozygotnost, heterozygotnost a polymorfní informační obsah (PIC) Lokus Velikost [bp] Počet alel Hom E Hom O Het E Het O PIC FHC ,479 0,3 0,51 0,700 0,37 FHC ,16 0,0 0,784 1,000 0,700 PEZ ,353 0,5 0,647 0,500 0,534 PEZ ,500 0,6 0,500 0,400 0,440 PEZ ,305 0,3 0,695 0,700 0,586 PEZ ,51 0,5 0,479 0,500 0,351 FHC ,663 0,6 0,337 0,400 0,69 PEZ ,568 0,7 0,43 0,300 0,379 PEZ ,33 0,3 0,668 0,700 0,573 PEZ ,806 0,8 0,195 0,00 0,176 Hom E homozygotnost očekáváná, Hom O homozygotnost pozorovaná, Het E heterozygotnost očekávaná; Het O heterozygotnost pozorovaná Hodnoty pozorované homozygotnosti byly v 3 lokusech větší, na 5 lokusech se liší pouze desetinami a na lokusech menší než homozygotnost očekávaná. Hodnoty očekávané heterozygotnosti byly na 3 lokusech větší a 7 lokusech menší než heterozygotnost pozorovaná. Pozorovaná homozygotnost se pohybovala od 0 do 0,8. Nejnižší pozorovaná homozygotnost (0,0) a zároveň nejvyšší heterozygotnost (1,0) se projevila na lokusu FHC054. Nejvyšší pozorovaná homozygotnost (0,8) a zároveň nejnižší heterozygotnost (0,) se projevila na lokusu PEZ8. Pozorovaná heterozygotnost se pohybovala od 0, 1,0. Očekávané hodnoty sledovaných ukazatelů diverzity měly obdobnou výši. Polymorfní informační obsah (PIC) se pohyboval v rozmezí od 0,176 37

40 do 0,700. Nejnižší hodnoty vykazoval lokus PEZ8 (0,176) a FHC079 (0,69). Nejvyšší hodnoty vykazoval lokus FHC054 (0,700), PEZ0 (0,586, PEZ6 (0,573) a PEZ1 (0,534). Oproti kavkazskému pasteveckému psu podle Truksy (008), kdy pozorovaná heterozygotnost je v rozmezí 0,550 0,85 a PIC 0,54 0,790, má hovawart nižší hodnoty. Český teriér má rozmezí pozorované heterozygotnosti nepatrně vyšší (0,86 0,76) pouze PIC má nižší (0,045 0,578) než hovawart. Podle Lüpke a Distl (004) se u hannoverského barváře pozorovaná heterozygotnost pohybovala v rozmezí od 0,47 do 0,87, což jsou obdobné hodnoty jako u hovawarta a průměrný PIC je 0,61 a je vyšší než jsem zjistila u hovawarta. Statistika celé populace Tab. č. 5.: Statistika populace hovawartů Počet vzorků Počet lokusů Očekávaná Hz Očekávaná Hz SD Pozorovaná Hz Pozorovaná Hz SD Průměrný PIC ,558 0,0565 0,5400 0,0498 0,438 SD směrodatná odchylka Směrodatná odchylka je míra variability vyjádřená v jednotkách vlastnosti. Jedná se o druhou odmocninu variance. Pozorovaná heterozygotnost byla nepatrně vyšší než očekávaná. Průměrná pozorovaná heterozygotnost celé populace byla 0,5400 a nijak výrazně se nelišila od heterozygotnosti očekávané. Tyto parametry byly zkoumány i u jiných plemen autory: Truksa (008), Lüpke a Distl (004), Altet et al. (001), Ichikawa et al. (001), Veit (000), Koskinen, Bredbacka (000). Přehled heterozygotnosti a PIC je uveden v tabulce č

41 Tab. č. 6.: Přehled hodnot porozované heterozygotnosti a PIC od různých autorů Autor Plemeno Pozor. Het. PIC Truksa (008) Kavkazský pastevecký 0,687 0,665 pes Český teriér 0,54 0,31 Lüpke a Distl (004) Hannoverský barvíř 0,67 0,61 Altet et al. (001) Rotwailer 0,45 0,401 Zlatý retriever 0,59 0,5 Labradorský retriever 0,517 0,446 Ichikawa et al. (001) Bígl - 0,63 Labradorský retriever - 0,566 Hannoverský barvíř - 0,609 Veit (000) Saarloosův vlčák 0,481 - Entlenbušský 0,537 - salašnický pes Bígl 0,666 - Zlatý retriever 0,601 - Německý ovčák 0,617 - Pyrenejský ovčák 0,606 - Jorkšírský teriér 0,745 - Bernský salašnický pes 0,61 - rotwailer 0,67 - Hannoverský barvíř 0,67 39

42 Tab. č. 6.: Přehled hodnot porozované heterozygotnosti a PIC od různých autorů - pokračování Autor Plemeno Pozor. Het PIC Koskinen, Zlatý retriever 0,61 - Bredbacka (000) Německý ovčák 0,6 - Jezevčík 0,67 - Pembroke Welsh 0,55 - corgie Bedlingtonský teriér 0,55 - Hannoverský barvíř 0,67 Zdroj: Lüpke a Distl (004) Tyto hodnoty jsou testované i na jiných lokusech než jsme použili pro hovawarta. Také se odlišuje velikost testované populace. Proto se může lišit hodnotami i jedno plemeno. Nejvyšší heterozygotnost má jorkšírský teriér (0,785), nejnižší rotwailer (0,45) a saarloosův vlčák (0,481). Velmi podobné hodnoty heterozygotnosti jako hovawart mají bedlingtonský teriér a pembroke welsh cordie (0,55). Ostatní plemena vykazují vyšší heterozygotnost. Nejnižší hodnoty PIC byly zjištěny u českého teriéra (0,311) a podle Altet et al. (001) i labradorský retriever (0,404). S hodnotou 0,438 následuje hovawart. Nejvyšší hodnoty byly zjištěny pro kavkazského pasteveckého psa (0,665), bígla (0,63) a hannoverského barvíře (0,61). Podle Ichikawa et al. (001) se labradorský retriever (0,566) řadí mezi průměrné hodnoty. Na úspěšnost selekce má vliv tzv. koeficient heritability (dědivosti) hp P, což je podíl genotypu z celkové fenotypové proměnlivosti. Pohybuje se v rozmezí od 0 do 1. Čím je jeho hodnota vyšší, tím vyšší je podíl genotypu a jednodušší selekce na daný znak. Jedinou studii týkající se hovawartů provedl Boenigk (006), kdy pomocí koeficientu heritability sledoval dědičnost chování u štěňat. Heritabilita byla v rozsahu od 0,0 0,13 se směrodatnou odchylkou 0,03. Heritabilita je nízká, proto dochází k hlavnímu ovlivnění chování štěňat prostředím. 40

43 6. Závěr Diverzita má zásadní význam pro budoucí šlechtění a pro uchování malých původních plemen jako rezervoáru původního genofondu. Obecně platí, že čím vyšší je genetická variabilita a heterozygotnost v populaci, tím je populace životaschopnější a adaptabilnější na změny podmínek prostředí. Pro svou práci jsem odebrala vzorky bukálním stěrem od 10 jedinců plemene hovawart. Poté jsem z nich izolovala DNA a analyzovala mikrosatelity. Následně byla provedena fragmentační analýza pomocí přístroje ABI PRISMP P Genetic Analyzer. Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno programem GENEPOP 4.0. Při porovnání plemen z různých zdrojů měli největší míru heterozygotnosti jorkšírský teriér, kavkazský pastevecký pes a bígl, poté hannoverský barvíř, český teriér, rotwailer, přičemž studované plemeno hovawart mělo nejnižší míru heterozygotnosti. Nejnižší hodnotu PIC vykazoval český teriér a rotwailer. Nejvyšší hodnotu opět kavkazský pastevecký pes. Námi sledované plemeno hovawart vykazuje třetí nejnižší hodnoty heterozygotnosti a PIC. Hovawart je plemeno s dostatečnou genovou variabilitou. Míra heterozygotnosti je na dobré úrovni pro udržení plemene. Výrazně nižší míry variability mohou být způsobeny jedinci bez průkazu původu, kde nemusí být zajištěna kontrola příbuzenské plemenitby. 41

44 7. Literatura ALTET, L., FRANCINO O., SANCHEZ A., Microsatellite polymorphism in closely related dogs. J. Hered., 9, 001, BOENIGK, K., HAMANN, H., DISTL, O., Genetic analysis of the outcome of behavioral tests in puppies of the Hovawart dog. Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Bünteweg 17p, Hannover, Germany BUTLER, J.M., Forensic DNA Typing: Biology and Technology behind STR Markers, Academic Press, San Diego, 001. COCKERHAM, C. C., Analyses of gene frequencies. Genetics 74, , DEKKERS, J. C. M., Commercial application of marker- and gene-assisted selection in livestock: Strategies and lessons, Journal of animal science, 004. DOSTÁL, J. Genetika a šlechtění plemen psů. Dona, 007, 61 s. DOSTÁL, J. Chov psů Genetika v kynologické praxi, České Budějovice, Dona, 1995, 08 s. FÁBIN, J., Hovawart, Jak o něj správně pečovat a rozumět mu. Jan Vašut s.r.o., 003, 75 s. FOGLE, B., Encyklopedie psů. Fortuna print Praha, 005, 31 s. GAŠ, B., Kapilární elektroforéze, Vesmír 80, 001. GUO, S. W. & THOMPSON, E. A., Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 48, ,

45 HASTINGS, W. K., Monte Carlo sampling methods using Markov chains and their applications. Biometrika 57, , KLOUDA, P. Moderní analytické metody, Klouda, přepracované vydání, 003, 13 s. KOMOSNÝ, M., URBAN, T., Využití DNA mikrosatelitů používaných v panelu na určování rodičovství pro zhodnocení diverzity a distancí mezi plemeny prasat v ČR, Agronomická fakulta Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity, 005. KOSKINEN, M. T., BREDBACKA, P., Assessment of the population structure of five Finnish dog Leeds with mircosatellites. Anim. Genet., 31, 000, LEBLOIS, R., ESTOUP, A. & ROUSSET, F., Inuence of mutational and sampling factors on the estimation of demographic parameters in a continuous" population under isolation by distance. Mol. Biol. Evol. 0: , 003. LOUIS, E. J. & DEMPSTER, E. R., An exact test for Hardy-Weinberg and multiple alleles. Biometrics 43, , LÜPKE, L., DISTL, O., Microsatellite marker analysis of the genetic variability in Hanoverian Hounds, J. Anim. Breed. Genet. 1, 005, Blackwell Verlag, Berlin. MAX ANIMATIONS, PCR, RFLP, [cit ]. MICHALAKIS, Y. & EXCOFFIER, L., A generic estimation of population subdivision using distances between alleles with special interest to microsatellite loci. Genetics 14, POKORNÁ, J. Původ a domestikace psa. Fauna, 007, roč. 18, č. 1, 67 s. 43

46 ROBERTSON, A. & HILL, W. G., Deviations from Hardy-Weinberg proportions: sampling variances and use in estimation of inbreeding coe_cients. Genetics 107, , ROUSSET, F., Equilibrium values of measures of population subdivision for stepwise mutation processes. Genetics 14, , ROUSSET, F., Genepop'007: a complete reimplementation of the Genepop software for Windows and Linux. Mol. Ecol. Resources 8, , 008. ROWAN, J., Elektroforéza, biochemical web, [cit ]. SCHELLING, C., GAILLARD, C., DOLF, G., Genetic variability of seven dog Leeds based on microsatellite markers, J. Anim. Breed. Genet. 1, 005, ŠEDA, O., LIŠKA, F., ŠEDOVÁ, L., Aktuální genetika verze 1.5., , Ústav biologie a lékařské genetiky 1.LF UK a VFN. SLATKIN, M., A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics 139, TRUKSA, M., Genetická variabilita mikrosatelitů a diverzita u plemen kavkazského pasteveckého psa a českého teriéra, Diplomová práce, Brno, 008, 45 s. URBAN, T., Virtuální svět genetiky 3 principy genetiky populací a kvantitativních znaků, UMFGZ, MZLU v Brně, 005. VÝZKUMNÝ ÚSTAV rybářský a hydrobiologický ve Vodňanech, Laboratory of molecular, cellular and quantitative genetics (No.), Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 007. WEIR, B. S. & COCKERHAM, C. C., Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38, ,

47 WEIR, B. S., Genetic Data Analysis II. Sinauer, Sunderland, Mass,

48 Seznam obrázků Obr. č. 1.: Miacid Obr. č..: Cynodicktis a Tomarcus Obr. č. 3.: Canis aureus Obr. č. 4.: Coyote canis latrans Obr. č. 5.: Tři uznaté varianty hovawartů FCI Obr. č. 6.: Kontingenční tabulka Seznam tabulek Tab. č. 1.: Panel 10 mikrosatelitů u psů Tab. č..: Frekvence alel pro každý lokus Tab. č. 3.: Heterozygotnost a PIC Tab. č. 4.: P- hodnota a standardní chyba na lokusech Tab. č. 5.: Statistika populace hovawartů 46

49 Příloha Seznam příloh Příloha č. 1.: Novodobí psi a jejich předci Příloha č..: Standard plemene hovawart podle FCI Příloha č. 3.: Genetický analyzátor ABI PRISM 310 Příloha č. 4.: Izolace genomové DNA i

50 Příloha č. 1.: Novodobí psi a jejich předci Zdroj: Fogle (005) ii

51 Příloha č..: Standard plemene hovawart podle FCI FEDERATION CYNOLOGIQUE INTERNATIONALE Secretariat General: 13, Place Albert I B 6530 THUIN (Belgie) F.C.I. -Standard č. 190 / / GB ZEMĚ PŮVODU: Německo HOVAWART (Hovawart) DATUM PUBLIKACE ORIGINÁLNÍHO PLATNÉHO STANDARDU: POUŽITÍ: pracovní pes ZAŘAZENÍ PODLE F.C.I.: Skupina pinčové a knírači, molossoidní plemena, švýcarští salašničtí psi Sekce. molossoidní plemena horského typu Se zkouškou z výkonu KRÁTKÉ HISTORICKÉ SHRNUTÍ: Hovawart je velmi staré německé pracovní plemeno. Jméno plemene pochází ze staré němčiny (středoněmčiny): Hova znamená dvůr a wart je výraz pro hlídače. Od roku 19 bylo obnoveno šlechtění hovawarta, bylo využito psů podobného typu, který byl chován na místních farmách. V raných dobách šlechtění byli hovawarti kříženi s německými ovčáky, novofoundlandskými psi, leonbergery a dalšími plemeny. Díky pečlivému přístupu k výběru psů ke šlechtění byl uchován původní pracovní typ psa. V zemi původu hovawarta byla věnována značná pozornost výběru psů s ohledem na jejich zdraví. Zejména výskyt dysplazie kyčelního kloubu byl snížen na minimum iii

52 díky desítkám let výběru psů bez tohoto nežádoucího znaku. Lze předpokládat, že všechny kluby chovatelů hovawarta v ostatních zemích se rovněž zaměřily na sledování tohoto primárního cíle. CELKOVÝ VZHLED: Hovawart je silný, středně velký pes poněkud prodlouženého rámce, dlouhosrstý, využívaný jako pracovní plemeno. Pohlavní dimorfismus je velice výrazný, zejména ve tvaru hlavy a ve stavbě těla. DŮLEŽITÉ POMĚRY: délka těla by měla dosahovat nejméně 110 až 115% výšky v kohoutku. POVAHA / TEMPERAMENT: uznávaný pracovní pes se širokou škálou využití. Pes milé a vyrovnané povahy, s výrazným protektivním a bojovým instinktem. Je sebevědomý, dokáže dobře snášet stresové situace, středně temperamentní a má velmi dobrý čich. Vyvážené tělesné proporce a oddanost k rodině jej spolu s jeho povahou a schopnostmi předurčují jako vynikajícího společníka, hlídače, ochránce, také však ke stopování a záchranářským činnostem HLAVA: nosní můstek je rovný a paralelní s rovinou temene hlavy. Tlama a lebka jsou přibližně stejné délky. Kůže na hlavě všude těsně přiléhá. MOZKOVNA: Lebka: silná hlava má široké, vyklenuté čelo. Stop: dobře patrný. OBLIČEJOVÁ ČÁST: Nosní houba: dobře vyvinuté nozdry. U černých a zlatočerných psů je černá, u světle zbarvených jedinců je také černá, přípustný je dočasně depigmentovaný nos ( sněžný nos). Tlama: silná, při pohledu shora a ze strany se jen mírně zužuje směrem k nosu. Pysky: pevně přiléhající. Čelisti/Zuby: silný, kompletní chrup se 4 zuby podle zubního vzorce s nůžkovým skusem. Zuby jsou zasazeny kolmo k čelisti. Klešťový skus je povolen. iv

53 Oči: oválné, ani zapadlé ani vystupující. Středně až tmavohnědé barvy. Oční víčka těsně přiléhající. Uši: volně přiléhající, zavěšené uši trojúhelníkového tvaru, vysoko a poměrně daleko od sebe nasazené, takže opticky rozšiřují lebku. Dosahují ke koutkům tlamy. Špičky uší jsou mírně zaoblené. V klidu uši visí volně naplocho podél lebky, v afektu mohou být neseny mírně nakloněné kupředu. Přední okraj uší leží přibližně uprostřed mezi rovinou očí a rovinou týlního hrbolku. KRK: Silný, střední délky, bez volné kůže na hrdle. TRUP: Hřbet: rovný a pevný. Bedra: silná, mírně delší než záď. Záď: střední délky, mírně spáditá. Hrudník: široký, hluboký a silný. OCAS: hustě osrstěný, dosahuje k hleznům, ale ne až k zemi. Podle nálady psa je nesen buď vysoko a prohnutý nad hřbetem, nebo svěšený směrem k zemi. KONČETINY: HRUDNÍ KONČETINY: silné, rovné a při pohledu zepředu i ze strany kolmé k zemi. Ramena: velmi dobře osvalená, lopatka je dlouhá a uložená šikmo vzad. Nadloktí: dlouhé, těsně přiléhající k tělu. Lokty: přiléhající těsně k hrudnímu koši. Kloub nadprstí: silný. Nadprstí: mírně šikmé. PÁNEVNÍ KONČETINY: silné, při pohledu zezadu kolmé k zemi, dobře zaúhlené. Stehna: velmi dobře osvalená. Hlezenní kloub: silný, poměrně nízko položený. v

54 TLAPKY: Zakulacené, silné a kompaktní. Prsty klenuté a těsně k sobě přiléhající. Paspárky by měly být odstraněny, s výjimkou zemí, kde je to zakázáno zákonem. Drápky jsou u černých a zlatočerných jedinců černé, u plavých jedinců mohou být méně pigmentované. POHYB: Při všech typech pohybu se končetiny pohybují v přímé linii, krok je prostorný. V klusu velmi dobrý prostorný krok s dobrým posunem zadních končetin. KŮŽE: Po celém těle těsně přiléhá. U černých a zlatočerných jedinců má kůže modravý lesk, u plavých jedinců je narůžovělý. OSRSTĚNÍ: SRST: Dlouhá srst se silnými chlupy, mírně zvlněná a těsně přiléhající. Podsada není příliš vyvinutá. Srst je delší na hrudníku, břichu, zadní části hrudních i pánevních končetin (kalhoty) a na ocase. Krátká srst je na hlavě a na předních stranách obou párů končetin. Srst je hustá a uzavřená. BARVA: Existují tři barevné variety: zlatočerná, černá a plavá. Zlatočerná: Srst je černá a lesklá, se středně plavými znaky. Na hlavě začínají znaky pod nosním hřbetem a probíhají kolem koutků tlamy a přecházejí do znaků na hrdle. Výrazné jsou kruhové znaky nad očima. Hrudní znaky sestávají ze dvou přiléhajících skvrn, které mohou být spojené. Na předních končetinách začínají při pohledu ze strany znaky na prstech a táhnou se k nadprstí a v úrovni loktů se vzadu zužují, až vymizí. Na zadních končetinách jsou znaky při pohledu ze strany v podobě širokého pruhu k hleznům, od hlezen výš už jen jako tenký pruh, který probíhá po přední straně pánevních končetin až k úrovni spodní linie. Další znak se nachází pod kořenem ocasu. Znaky jsou vždy jasně ohraničené. Jednotlivé malé bílé znaky na hrudi stejně jako jednotlivé bílé chlupy na prstech a na špičce ocasu jsou povoleny. Oční víčka, pysky a polštářky tlapek jsou černé. vi

55 Černá: Srst je černá a lesklá. Jednotlivé malé bílé znaky na hrudi stejně jako jednotlivé bílé chlupy na prstech a na špičce ocasu jsou povoleny. Oční víčka, pysky a polštářky tlapek jsou černé. Plavá: Srst je středně plavé barvy, lesklá, a směrem ke končetinám a břichu přechází ve světlejší odstín. Jednotlivé malé bílé znaky na hrudi stejně jako jednotlivé bílé chlupy na prstech a na špičce ocasu jsou povoleny. Oční víčka, pysky a polštářky tlapek jsou černé. VÝŠKA: Výška v kohoutku: Psi od 63 do 70 cm. Feny od 58 do 65 cm. VADY: jakákoliv odchylka od výše uvedených znaků má být považována za vadu a vážnost, s níž je vada posuzována, má být v přímém poměru k jejímu stupni. VYLUČUJÍCÍ VADY: CELKOVÝ VZHLED: Psi, kteří neodpovídají vzhledem plemeni. Feny výrazně samčího typu. Psi výrazně samičího typu. DŮLEŽITÉ PROPORCE: Výrazně odlišné tělesné proporce než je uvedeno ve standardu. CHOVÁNÍ / TEMPERAMENT: Agresivní, nervózní, letargičtí psi nebo psi, kteří se bojí střelby. HLAVA: vii

56 Nedostatečný stop. Modré oči nebo skvrny na rohovce. Vztyčené, špičaté, růžicové nebo odstávající uši. Předkus nebo podkus, zkřížený skus. Chybějící více než ze 4 zubů PM1 nebo M3, nebo chybějící jakýkoli jiný zub. KRK: Nápadná volná kůže na krku (lalok). TĚLO: Nápadně volná hřbetní linie nebo kapří hřbet. Úzký nebo sudovitý hrudník. Nestandardní ocas, příliš krátký ocas, výrazně zatočený ocas. KONČETINY: Příliš přestavěná záď. SRST CHLUPY: Převládající příliš zatočené chlupy (kudrnaté). BARVA: Obecně: Jakékoli barvy, neodpovídající standardu, tj. modrošedá, jelení, hnědá, bílá, skvrnitá, plavá s popelavým odstínem nebo převládající pruhovaná srst. Bílé skvrny. Jednotlivé bílé chlupy na vnitřní straně stehen nejsou vylučující vadou. Zlatočerná: Šedé nebo hnědé skvrny, jiné než správné znaky. Podsada převážně jiné barvy než černé. Převládající šedé nebo bělavé znaky. Černá: viii

57 Šedé nebo hnědé skvrny. Převažující jiná barva podsady než černá. Plavá: Jednotlivé bílé chloupky na nosním hřbetu nejsou vyřazující vadou. Převládající červeno-plavá barva bez přechodu ke světlejším odstínům na spodní části těla. Bělavě plavá barva, také na uších. Nápadné bílé skvrny. Tmavé skvrny nebo tmavá maska. Velikost: Nižší velikost než je uvedeno ve standardu. Vyšší velikost než je uvedeno ve standardu o více než 3 cm. Psi, kteří zjevně vykazují fyzické nebo povahové abnormality, musí být diskvalifikováni. Pozn.: Psi (samci) musí mít dvě zjevně normálně vyvinutá varlata, plně sestouplá v šourku. ix

58 Příloha č. 3. Genetický analyzátor ABI PRISM 310 Příloha č. 4.: Výsledky izolace DNA x