MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno 2011 Martina Dvořáková

2 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie MOLEKULÁRNÍ PROBLEMATIKA HYPERFENYLALANINÉMIE Brno 2011 Martina Dvořáková

3 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí své bakalářské práce RNDr. Lence Fajkusové, CSc. za umožnění vypracování této práce na pracovišti Centra molekulární biologie a genové terapie, FN Brno a za její odborné vedení. Dále bych chtěla poděkovat odborné konzultantce Mgr. Zuzaně Hrubé za pomoc při vypracování bakalářské práce a za její podnětné připomínky. 2

4 Obsah 1. Úvod Genetická a molekulární podstata hyperfenylalaninémie Metabolismus fenylalaninu Deficit PAH Struktura enzymu PAH Klinické projevy deficitu PAH Mutace v genu PAH Názvosloví mutací Klasifikace mutací Léčba HPA Dieta Genová terapie Jaterní genová terapie Heterologní genová terapie Transplantace jater Fenylalaninamoniumlyáza Dlouhé neutrální aminokyseliny Tetrahydrobiopterin K m mutanti enzymu PAH se sníženou vazebnou afinitou k BH BH 4 jako chaperon Změny v regulaci syntézy BH Indukce exprese PAH pomocí BH Stabilizace PAH mrna Deficit BH Maternální PKU Diagnostické metody Novorozenecký screening Klinická diagnostika Izolace DNA z periferní krve vysolováním Sekvenování DNA podle Sangera PCR

5 Elektroforéza Sekvenování Multiplex ligation-dependent probe amplification Závěr Použité zkratky Seznam aminokyselin Ostatní zkratky Literatura

6 1. Úvod Hyperfenylalaninémie (HPA) je dědičná metabolická porucha. Jedná se o monogenně podmíněné onemocnění s autozomálně recesivní dědičností. HPA je nejčastěji se vyskytující vrozenou poruchou metabolismu aminokyselin v Evropě. Onemocnění je způsobeno poruchou v metabolismu fenylalaninu (Phe). Fenylalanin je esenciální aromatická aminokyselina metabolizovaná hlavně v játrech za účasti jaterního enzymu fenylalaninhydroxylázy (PAH). Nejčastější příčinou hyperfenylalaninémie je porucha v enzymu PAH, která způsobí ztrátu schopnosti přeměny fenylalaninu na tyrosin (Tyr). Biochemickým projevem HPA je zvýšená koncentrace fenylalaninu v krvi a v důsledku toho jeho toxická koncentrace v mozku. Neléčená HPA vede k poruše centrální nervové soustavy a k mentální retardaci. V současnosti je léčba tohoto onemocnění založená hlavně na dodržování diety s nízkým obsahem fenylalaninu. Dodržování této diety je ale náročné a jsou nutné časté kontroly u lékaře. Proto je snaha vyvinout nové metody léčby HPA, které by pro pacienty byly příznivější. Cílem mé bakalářské práce je podat základní informace o hyperfenylalaninémii a shrnout nové poznatky o možnostech léčby tohoto onemocnění. V práci se nejprve budu věnovat metabolismu fenylalaninu a genetické podstatě onemocnění. V další části se zaměřím na možnosti léčby HPA s důrazem na nové metody, z nichž nejperspektivnější se zdá léčba pomocí tetrahydrobiopterinu (BH 4 ). BH 4 u pacientů s mírnější formou HPA stimuluje aktivitu fenylalaninhydroxylázy a zvyšuje tak toleranci k fenylalaninu. To umožňuje pacientům méně náročnou dietu. Tato léčba se zdá být velmi úspěšná, ale je stále předmětem zkoumání a není tedy zatím jasné, jestli bude mít dlouhodobé klinické uplatnění. 5

7 2. Genetická a molekulární podstata hyperfenylalaninémie Hyperfenylalaninémie je důsledkem defektu v hydroxylaci fenylalaninu na tyrosin. Tato reakce je katalyzovaná fenylalaninhydroxylázou za pomoci kofaktoru (6R)-L-erytro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterinu (BH 4 ). Jedná se o hlavní metabolickou dráhu potravou přijímaného Phe. Ve většině případů je hyperfenylalaninémie způsobena mutacemi v genu PAH. Těžký deficit PAH způsobující hladinu Phe v krvi vyšší než µmol/l se nazývá klasická fenylketonurie (PKU) (Walter a kol., 2008). Méně závažné poruchy s hladinami Phe v krvi mezi 600 µmol/l µmol/l se označují jako mírná PKU a jsou-li hladiny Phe v rozmezí 120 µmol/l 600 µmol/l, jedná se o mírnou hyperfenylalaninémii. Phe je esenciální aminokyselinou, která nemůže být syntetizována lidským organismem. Její koncentrace v krvi závisí na mnoha faktorech zahrnujících příjem v potravě, endogenní přeměnu proteinů, katabolismus a inkorporaci do proteinů. 2.1 Metabolismus fenylalaninu Prvním krokem v katabolismu Phe je jeho hydroxylace na tyrosin, která je katalyzována PAH. Tento enzym vyžaduje pro svoji funkci molekulární kyslík, železo a jako kofaktor tetrahydrobiopterin (BH 4 ), který se tvoří ve třech krocích z GTP. Během hydroxylace je BH 4 přeměněn na neaktivní pterin-4a-karbinolamin, jehož recyklací je možné BH 4 znovu obnovit (Obrázek 1). BH 4 je také kofaktor pro tyrosinhydroxylázu a tryptofanhydroxylázu, a tak je nutný pro tvorbu dopaminu, katecholaminů, melaninu, serotoninu a pro syntázu oxidu dusnatého. Poruchy PAH nebo poruchy v tvorbě či recyklaci BH 4 mohou vést k hyperfenylalaninémii a rovněž k deficitu tyrosinu, L-dopa, dopaminu, melaninu, katecholaminů, 5-hydroxytryptofanu a serotoninu. Při omezené hydroxylaci na tyrosin může být fenylalanin transaminován na fenylpyruvát, což je keton, který je ve zvýšeném množství vylučován v moči (odtud název fenylketonurie). 6

8 Serotonin Obrázek 1: Systém hydroxylace fenylalaninu (Walter a kol., 2008) Zkratky: BH4 tetrahydrobiopterin; DHPR dihydropteridinreduktáza; GTP guanosintrifosfát; GTPCH guanosintrifosfátcyklohydroláza; NO oxid dusnatý; NOS syntáza oxidu dusnatého; P fosfát; PAH fenylalaninhydroxyláza; PCD pterin-4a-karbinolamin; PTPS pyruvoyltetrahydrobiopterinsyntáza; qbh 2 dihydrobiopterin; SR sepiapterinreduktáza; TrypH tryptofanhydroxyláza; TyrH tyrosinhydroxyláza. 7

9 3. Deficit PAH PKU byla poprvé objevena Asbjørnem Føllingem v roce 1934 a pojmenována Imbecillitas phenylpyruvica. Jednalo se o první průkaz genetického defektu jako příčiny mentální retardace. Hyperfenylalaninémie je v 98 % případů způsobená nedostatečnou funkcí PAH. Prevalence onemocnění se liší v různých populacích, od 1/4 000 porodů v Severním Irsku nebo 1/6 500 v Turecku do 1/ porodů ve Finsku (Blau a kol., 2009; Guldberg a kol., 1995b). Globální prevalence je přibližně 1/ s předpokládanou frekvencí přenašečů 1/55 (Walter a kol., 2008). 3.1 Struktura enzymu PAH PAH je homotetramerický enzym (Martinez a kol., 1995). Každou podjednotku tvoří tři domény (Obrázek 2): N-terminální regulační doména (obsahující aminokyselinové zbytky 1 142); velká katalytická doména zodpovědná za veškerou enzymatickou aktivitu enzymu (zbytky ); a C-terminální oligomerizační doména (zbytky ) (Erlandsen a kol., 1997). Každá podjednotka obsahuje atom železa nezbytný pro katalytickou aktivitu. Regulační doména se skládá z dvojitého βαβ motivu. N-terminální autoregulační sekvence (zbytky 19 33) se rozšiřují nad aktivní místo katalytické domény. Oligomerizační doména je složena ze dvou β-řetězců a jednoho α-helixu. Čtyři α-helixy (každý z jednoho monomeru) se skládají v pevný spirálovitý motiv uprostřed struktury tetrameru (Fusetti a kol., 1998). Oblast zahrnující katalytickou doménu má tvar košíku a obsahuje 13 α-helixů a 8 β-řetězců (Erlandsen a kol., 1997). Aktivní místo je umístěno uprostřed katalytické domény; na něj je napojen kanál, kterým může substrát přistupovat k aktivnímu místu (Andersen a kol., 2001). Aktivní místo PAH je tvořeno atomem železa, který je umístěný 10 Å pod povrchem proteinu. Kofaktor BH 4 a substrát Phe se váží v aktivním místě v blízkosti atomu železa. 8

10 Obrázek 2: Struktura PAH a BH 4 -responzivní mutace způsobující HPA (Zurflüh a kol., 2008; upraveno) 3.2 Klinické projevy deficitu PAH Neléčená fenylketonurie vede k trvalému postižení centrálního nervového systému (Walter a kol., 2008). Nejčastějšími projevy jsou těžká mentální retardace, často spojená se zápachem (v důsledku vylučování fenylacetátu), ekzém, menší pigmentace (v důsledku snížené tvorby melaninu), menší vzrůst, mikrocefalie a neurologické postižení (například epilepsie). Mozek pacientů s neléčenou PKU má snížené větvení dendritů, postiženou tvorbu synapsí a porušenou myelinizaci. Téměř všichni pacienti mají poruchy chování, například hyperaktivitu, agresivitu nebo sociální izolaci. Patogeneze postižení mozku není zcela známa, ale je jisté, že je spojena se zvýšenými hladinami Phe v krvi. Klinický fenotyp pacientů koreluje s hladinami Phe v krvi, které odpovídají stupni deficitu PAH. Méně závažné formy deficitu PAH nemusejí vyžadovat léčbu v závislosti na stupni HPA. 9

11 Nedostatek tyrosinu v důsledku deficitu PAH vede k poruše syntézy dalších biogenních aminů (melaninu, dopaminu a noradrenalinu). Zvýšené množství Phe v krvi ovlivňuje transport aminokyselin do mozku a způsobuje nevyváženost ostatních dlouhých neutrálních aminokyselin, což vede ke zvýšené koncentraci tyrosinu a serotoninu v mozku. Phe navíc poškozuje hydroxylaci tyrosinu na dopamin a dekarboxylaci tryptofanu na serotonin. Fenylpyruvát, fenylacetát a fenyllaktát jsou ve zvýšených koncentracích vylučovány močí. 3.3 Mutace v genu PAH Gen PAH je lokalizován na dlouhém raménku chromozómu 12 v oblasti 12q a skládá se ze 13 exonů. Genomová sekvence genu PAH zahrnuje cca pb, z toho exonové oblasti pokrývají 2,88 % (Scriver a kol., 2003). Průměrná velikost exonů je 170 pb, zatímco introny jsou velké průměrně pb. Většina mutací se vyskytuje v katalytické doméně (Daniele a kol., 2009). Nejvíce mutací je pak rozloženo v exonech 2, 6, 7, 10 a 11, zatímco exon 13 obvykle nenese žádnou mutaci. V současnosti je známo a popsáno téměř 550 mutací tohoto genu, většinou se jedná o mutace měnící smysl kodonu (63 %), delece (13 %), sestřihové mutace (11 %), tiché mutace (7 %) a nesmyslné mutace způsobující předčasný vznik terminačního kodonu (5 %) (Scriver a kol., 2003). Frekvence velkých delecí genu PAH je relativně nízká. Většina osob s deficitem PAH jsou složení heterozygoti se dvěma různými mutacemi (Walter a kol., 2008). Četnost jednotlivých typů mutací se liší v různých etnických populacích. Například mutace p.arg408trp (p.r408w) se vyskytuje asi u 30 % alel osob s PKU v Evropě, u orientálních populací je nejčastější mutace p.arg243gln (p.r243q), která tvoří 13 % alel. Nejčastější Evropská mutace (p.arg408trp) zřejmě vznikla nezávisle na několika chromozómech, protože je zjišťována na několika různých haplotypech; postihuje hypermutabilní CpG místo. Možným vysvětlením takto vysoké frekvence výskytu určitých mutací je selektivní výhoda heterozygotů v populacích, případně efekt zakladatele nebo genetický drift (Krawczak a Zschocke, 2003). Efekt zakladatele nastává při prudkém poklesu počtu jedinců v populaci. Spočívá v tom, že při takto nečekaném zúžení populace dojde k poklesu genetické diverzity. Projevuje se prudkým posílením významu genetického driftu. Genetický drift je evoluční proces, při kterém dochází k náhodným posunům ve frekvenci jednotlivých alel v populaci. Má nevratný efekt i když se velikost populace opět obnoví, ztracené alely zůstávají ztraceny a genetická variabilita je 10

12 tak snížena. Kvůli efektu zakladatele může dojít k fixaci alel nevýhodných znaků, které by se jinak v populaci prosadily jen těžko. Genotyp obvykle dobře koreluje s biochemickým fenotypem, hladinou Phe před léčbou a tolerancí Phe. V některých případech ale není korelace jednoznačná. Je jasné, že na proměnlivosti fenotypu u různých pacientů s PKU se podílejí další neznámé biologické proměnné, včetně modifikujících genů. Analýza mutací má jen omezené použití v klinické praxi, ale může být cenná při určení genotypů spojených s citlivostí k BH 4 (Walter a kol., 2008). Na pracovišti Centra molekulární biologie a genové terapie, FN Brno je k dispozici 642 pacientů s HPA. U většiny z nich byly zjištěny 2 mutace v genu PAH. U 26 pacientů se ale standardními diagnostickými postupy (sekvenční analýza exonů a přilehlých intronových oblastí, MLPA) nepodařilo detekovat druhou mutaci. Nedetekované mutace mohou být v oblasti promotoru, kde mohou ovlivňovat vazbu transkripčních faktorů. Nebo se mohou vyskytovat hluboko v intronech a mít vliv na posttranskripční sestřih mrna Názvosloví mutací Mutace v genu pro PAH se obvykle popisují na úrovni komplementární DNA (cdna) nebo proteinu. Názvosloví mutací na úrovni proteinů i cdna se řídí standardními doporučeními uvedenými na stránkách Human Genome Variation Society (HGVS; Jako vzorová sekvence je používána nukleotidová sekvence uvedená v GenBank pod přístupovým kódem NM_ a proteinová sekvence s kódem NP_ Substituční bodové mutace v exonech (nejčastější typ mutací genu PAH) se běžně popisují na proteinové úrovni. Například mutace p.arg408trp znamená náhradu aminokyseliny Arg (Arginin) v pozici 408 od počátku proteinu za aminokyselinu Trp (Tryptofan). Na úrovni cdna by se potom tato mutace zapsala jako c.1 222C>T, tedy jako náhrada cytosinu v pozici za tymin. 3.4 Klasifikace mutací Ke klasifikaci závažnosti mutací bylo provedeno testování na tzv. funkčně hemizygotních pacientech (Guldberg a kol., 1995a). Tito pacienti mají nulovou mutaci na jednom z chromozómů, zatímco na druhém chromozómu je mutace zachovávající reziduální aktivitu PAH. Nulové mutace jsou takové, které kompletně ruší aktivitu PAH. Nejčastěji se jedná o 11

13 mutace posunové, sestřihové a substituční mutace způsobující vznik předčasného stop kodonu. (Krawczak a kol., 1992). Mírnější z obou mutací je tzv. kvazi-dominantní a určuje fenotyp (Guldberg a kol., 1998). Důležitý je také efekt genové dávky; tedy skutečnost, že pacient homozygotní pro mutaci s reziduální enzymovou aktivitou může vykazovat mírnější fenotyp než pacient nesoucí tutéž mutaci v kombinaci s nulovou mutací. Mutace s reziduální enzymovou aktivitou byly přiřazeny ke čtyřem fenotypovým kategoriím (klasická PKU, střední PKU, mírná PKU a mírná HPA) (Tabulka 1). U některých typů mutací bylo přiřazení jednoznačné u všech pozorovaných pacientů, ale vyskytlo se i poměrně velké množství mutací, které byly přiřazeny k více, nejčastěji ke dvěma, fenotypovým kategoriím. Mezi faktory bránící nastavení univerzálnějšího systému předpovědí fenotypu na základě genotypu patří zejména: - obrovská mutační heterogenita, - rozdílné diagnostické a klasifikační metody, - nedostatek informací o interakcích mezi dvěma rozdílnými mutantními polypeptidy enzymu PAH a jejich vlivu na fenotyp. Poznatky Guldberga a kol. (1998) ukazují na to, že existuje dobrá korelace mezi genotypem a fenotypem u většiny pacientů s deficiencí PAH. Přesto bylo identifikováno několik případů nesouladu, které nelze vysvětlit chybou v klasifikaci. Příkladem takového rozporu je různorodý fenotypový projev mutace p.ile65thr, který reprezentuje klasickou, střední i mírnou PKU. Mutace p.ile65thr ovlivňuje aminokyselinový zbytek, který reguluje vazebné místo Phe na enzym. Aktivita mutovaného enzymu tedy může být náchylná k regulaci koncentrací substrátu. Hladina Phe tak může upravovat efekt p.ile65thr i dalších mutací (například p.arg261gln, p.arg158gln, p.leu48ser a p.tyr414cys), které se také často vyskytují v případech genotypového a fenotypového nesouladu. 12

14 Klasická PKU Střední PKU Mírná PKU Mírná HPA p.met1val p.glu280lys p.phe39leu (p.phe39leu) p.ala47val p.gln20x p.pro281leu (p.leu48ser) p.gly46ser p.ser87arg c.60+5g>t c.842+1g>a (c.168+5g>c) p.leu48ser p.thr92ile (p.phe39leu) c.842+5g>a p.ile65thr p.tyr414cys p.arg155his (p.leu48ser) p.asp282asn (p.arg68ser) (p.ile65thr) p.gly171ala p.phe55leu p.his285tyr (p.arg158gln) p.arg68ser p.arg176leu p.phe55leufsx8 p.ser295x p.arg261pro p.ala104asp p.glu178gly c.168+5g>c p.phe299cys p.arg261gln c.442-5c>g p.val190ala (p.ile65t) c.912+1g>a (p.leu311pro) p.ile164thr p.val230ile p.asp84tyr c.913-7a>g p.leu348val p.val177ala p.arg241cys p.pro89profsx13 p.ser310serfsx2 p.val388met p.arg241his p.val245ala p.ile94ser p.leu311pro (p.tyr414cys) p.ala246val p.ala300ser p.arg111x p.phe327leu (p.arg261pro) p.ile306val p.arg158gln p.phe331leu p.tyr277asp p.thr380met p.ile174t p.gln336x p.gly344ser p.glu390gly p.arg176x p.ala342thr (p.glu390gly) p.ala403val p.trp187x p.ala342hisfsx58 p.arg408gln p.arg413ser p.leu194pro p.gly346glyfsx54 (p.tyr414cys) p.leu197xfsx1 p.gly346arg p.asp415asn p.tyr198cysfsx135 (p.leu348val) p.tyr204x p.ser349pro p.tyr206x p.gly352arg p.glu221glufsx2 c g>a p.ser231pro c c>t p.gly239ser c g>a p.arg243gln p.tyr356x p.arg243x p.ser359x p.arg252gly p.lys363asnfsx37 p.arg252gln p.leu367profsx27 p.arg252trp p.ala395pro p.ala259val c g>a (p.arg261gln) p.pro407leufsx45 p.arg261x p.arg408trp p.ile269asn (p.tyr414cys) p.gly272x c g>a p.lys274asnfsx5 p.lys452lysfsx37 Tabulka 1: Přiřazení mutací PAH k metabolickým fenotypům (Guldberg a kol., 1998; upraveno) 3.5 Léčba HPA Principem léčby je dostatečně snížit koncentraci Phe v krvi tak, aby se zabránilo neuropatologickým účinkům (Walter a kol., 2008). U většiny pacientů nemůže být změněna aktivita PAH, takže hladina Phe musí být snížena omezením příjmu Phe ve stravě, tedy dietou s nízkým obsahem Phe Dieta Snížení hladiny Phe dietou zahájenou brzy po narození má za následek normální vývoj mozku (Woolf a Vulliamy, 1951). Dieta omezuje příjem bílkovin do té míry, že k zajištění 13

15 nutričně přiměřené výživy je nezbytná semisyntetická výživa (Walter a kol., 2008). Skládá se z neomezeného množství potravin s velmi nízkým obsahem Phe (sacharidy, ovoce, některé druhy zeleniny), z vypočteného množství vyrobených a přirozených jídel se středním obsahem Phe (špenát, brokolice, brambory) a z vypočteného množství směsi aminokyselin bez Phe. Jídla s vysokou koncentrací Phe musí být z jídelníčku vyloučena (maso, ryby, sýry, vajíčka, mléko, rýže, obilí). Dietní léčba PKU je sice vysoce úspěšná, ale je obtížná a její dodržování je často špatné. Proto je snaha vyvinout přijatelnější formy léčby. Alternativní experimentální studie zahrnují možnost léčby genovou terapií, transplantací jater, fenylalaninamoniumlyázou, dlouhými neutrálními aminokyselinami (LNAA) nebo BH Genová terapie Somatická genová terapie funkčního rekombinantního genu PAH je jedním z nových přístupů k léčbě PKU. Byly vyzkoušeny různé metody genového přenosu; nejčastěji používanými pokusnými zvířaty jsou myši s defektem PAH srovnatelným s tímto defektem u lidských pacientů trpících PKU (Shedlovsky a kol., 1993). Pah enu2 myši nesou mutaci p.phe263ser v katalytické doméně (Gersting a kol., 2010). Byly indukovány vysokofrekvenční náhodnou bodovou mutagenezí zárodečných linií BTBR myší použitím chemického mutagenu N-ethyl-N-nitrosomočoviny (N-ethyl-N-nitrosourea; ENU) (Shedlovsky a kol., 1993). Pah enu1 myši, které byly izolovány dříve, nesou mutaci p.val106ala v regulační doméně a trpí pouze mírnou HPA (Gersting a kol., 2010). Proto byli vyvinuti Pah enu2 mutanti, kteří lépe odpovídají fenotypu klasické PKU a jsou proto vhodnějšími modely pro genovou terapii (Shedlovsky a kol., 1993). Existuje možnost terapie pomocí transferu jaterního genu PAH nebo tzv. heterologní genová terapie využívající expresi genu PAH v jiných tkáních nebo orgánech (Ding a kol., 2004). Žádný experiment ovšem zatím nevedl k trvalé fenotypové korekci genu PAH (Walter a kol., 2008) Jaterní genová terapie K přenosu transgenů do myších tkání se používají virové nebo nevirové vektory. Lze využít přístup ex vivo, při kterém jsou izolované buňky transdukovány PAH-cDNA a poté 14

16 reimplantovány zpět do donorového organismu, nebo in vivo, kdy jsou rekombinantní vektory zavedeny přímo do vrátnicové, případně ocasní žíly. Nejlepší výsledky zatím ukazují virové vektory, konkrétně tzv. adeno-associated virus (AAV) vektory, které se zdají bezpečnější a efektivnější, než jiné virové vektory. Mají několik sérotypů, které lze kombinovat s kapsidovými sérotypy, což rozšiřuje možnosti jejich použití (Rabinowitz a kol., 2002). V posledních deseti letech se AAV vektory staly jedněmi z nejslibnějších transferových vektorů pro léčbu dědičných lidských onemocnění (Kootstra a Verma, 2003). Jsou schopny transdukce dělících se i nedělících se buněk (Ding a kol., 2006). Zatím bylo objeveno osm různých přirozených AAV sérotypů. Nejvíce zkoumaný a nejčastěji používaný je pak AAV vektor sérotyp 2, ačkoliv v lidské populaci proti němu existuje velké množství neutralizujících protilátek, které snižují účinnost jeho transdukce (Chirmule a kol., 1999). Nově zkonstruovaný rekombinantní AAV vektor raav2/8 slibuje velmi efektivní využití pro specificky jaterně směrovanou genovou terapii (Harding a kol., 2006). Rekombinantní AAV2/8 vektor exprimující myší PAH byl podán Pah enu2 myším skrze vrátnicovou i ocasní žílu. Tyto myši vykazovaly kompletní a stabilní úpravu hladin Phe až po dobu 17 týdnů. Léčbou bylo dosaženo aktivity odpovídající cca 11 % funkční jaterní PAH. Tento vektor dokázal výrazně zvýšit činnost jaterní PAH a úspěšně transdukoval více než 10 % hepatocytů. Frekvence transdukcí u předchozích typů raav2 vektorů byla kolem 5 % hepatocytů. Přitom pro kompletní opravu HPA u myší je třeba transdukce alespoň 10 % jaterních buněk. Při použití raav2/8 vektoru nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky a snížení hladiny Phe bylo pozorováno u obou pohlaví, což je další výhoda oproti raav vektorům jiného typu, kde obvykle bylo pozorováno snížení hladiny Phe pouze u samců Heterologní genová terapie Limitujícím faktorem mimojaterní genové terapie je přítomnost BH 4, nutného kofaktoru PAH (Lin a kol., 1997). První možná heterologní genová terapie byla objevena u T lymfocytů. T lymfocyty obsahují pouze malé množství BH 4, které ale může být doplněno exogenně. Transdukované T buňky vykazují aktivitu PAH, což svědčí o tom, že produkují všechny komponenty nutné pro průběh hydroxylace fenylalaninu. Bohužel ale nejsou dostupné žádné úspěšné pokusy in vivo. Další potenciální heterologní genové terapie zahrnují expresi PAH v kostní dřeni, keratinocytech nebo v kosterním svalstvu. 15

17 Problémem terapie jaterního genu PAH je nutnost začít s léčbou PKU časně po narození (Ding a kol., 2008). Hojná proliferace hepatocytů u novorozenců zřeďuje a odbourává AAV vektory používané pro jaterní genovou terapii, která díky tomu nevede k trvalé léčbě pacientů. Kosterní svalstvo, na rozdíl od jaterní tkáně, je velmi stabilní, díky čemuž je tento přístup k léčbě novorozenců s PKU velmi slibný (Wang a kol., 2005). Další výhodou kosterního svalstva je jeho vysoký obsah v organismu, dostatečné prokrvení, stabilní prostředí pro expresi proteinů a snadný přístup díky umístění těsně pod povrchem těla (Lu a kol., 2003). Transgenní myši produkující PAH a GTPCH v kosterním svalstvu byly kříženy s Pah enu2 myšmi pro získání homozygotního potomstva (Tg/Pah enu2 ) (Ding a kol., 2008). Potomstvo Tg/Pah enu2 tak postrádá aktivitu PAH v játrech, ale je exprimován PAH a GTPCH v kosterním svalstvu. Přesto Tg/Pah enu2 myši zůstávají postižené hyperfenylalaninémií. Ding a kol. (2008) zjistili, že důvodem je pravděpodobně nepřítomnost PTPS aktivity v kosterním svalstvu Tg/Pah enu2 myší. Aktivitou PTPS je dihydroneopterin trifosfát (syntetizovaný de novo aktivitou GTPCH) přeměňován na BH 4. Obsah BH 4 u Tg/Pah enu2 myší tak z důvodu absence aktivity PTPS nebyl dostatečný k tomu, aby působil jako účinný kofaktor hydroxylace Phe. Dospěli tak k poznání, že ke korekci HPA je nutná společná exprese PAH, GTPCH a PTPS aktivit. Neúčinnější vektor používaný při genové terapii HPA je tzv. adeno-associated virus (AAV), jehož účinnost a stabilní genová exprese byla prokázána i při genovém přenosu do myšího kosterního svalstva. Při injekci AAV vektoru s geny exprimujícími PAH, GTPCH a PTPS bylo pozorováno snížení hladin Phe u obou pohlaví bez rozdílu. Při injekci genů exprimujících pouze PAH a GTPCH nebo pouze PAH a PTPS nebylo dosaženo snížení hladiny Phe. Imunitní reakce proti transgenním produktům bývá nejčastějším omezením genové terapie (Bessis a kol., 2004). V případě PAH, GTPCH a PTPS exprimovaných v kosterním svalstvu nebyly objeveny žádné protilátky (Ding a kol., 2008); jsou to cytoplazmatické proteiny, které obvykle neprezentují extracelulární antigeny. Problémem ale zůstává imunitní reakce proti opakovaným injekcím AAV vektoru, které jsou nezbytné pro celoživotní léčbu HPA (Wang a kol., 2004) Transplantace jater Transplantace jater zcela upravuje deficit PAH, ale rizika spojená s transplantací jsou příliš vysoká na to, aby mohla být tato metoda používána jako alternativa k dietní léčbě (Walter a kol., 2008). 16

18 3.5.4 Fenylalaninamoniumlyáza (PAL) PAL katalyzuje přeměnu Phe na méně škodlivou kyselinu 3-fenylpropenovou a amoniak (Hoskins a kol., 1984). Kyselina 3-fenylpropenová je přeměněna na kyselinu benzoovou a následně vyloučena močí. PAL je velký enzym nesavčího původu, který funguje bez přítomnosti kofaktoru a působí jako náhrada PAH (Hodgins, 1971). Testování bylo úspěšně provedeno na myších s PKU (Sarkissian a kol., 1999). Dlouhodobé snížení hladiny Phe pomocí PAL je ale problematické (Gámez a kol., 2007). Funkce PAL je inhibována neutralizační imunitní odpovědí a proteolýzou. Nedávné pokusy s formou PAL, která byla upravena místně cílenou mutagenezí a chemickou modifikací polyetylenglykolem (PEG), prokázaly snížení imunogenicity a prodloužení funkce PAL v organismu (Ikeda a kol., 2005). Jako terapeuticky nejefektivnější se ukázal PEG-PAL konjugát z Anabaena variabilis, který sice neprokazoval nejvyšší specifickou aktivitu, ale je tepelně stabilní a rezistentní vůči proteázám (Sarkissian a kol., 2008). Vykazuje téměř absolutní supresi imunitní odpovědi a snižuje hladinu Phe v krvi i v mozku Dlouhé neutrální aminokyseliny (LNAA) Fenylalanin, tyrosin, tryptofan, leucin, izoleucin a valin (LNAA) kompetují o stejný transportní mechanismus (přenašeč L-aminokyselin) přes hematoencefalickou bariéru (Walter a kol., 2008). Přechod přes hematoencefalickou bariéru je dán jejich množstvím v krvi a rozdílnou afinitou k přenašeči. Zvýšená koncentrace Phe oproti ostatním LNAA je pravděpodobnou příčinou poškození vývoje mozku u PKU. Byl popsán pokles hladiny Phe v mozku po enterálním podání LNAA (kromě Phe) Tetrahydrobiopterin (BH 4 ) Účinnost perorálního podání BH 4 u některých pacientů s HPA byla prokázána nedávno. BH 4 může snížit hladiny Phe v krvi. Až 80 % pacientů s mírnou PKU a cca 50 % všech pacientů s HPA je potenciálně BH 4 -responzivní (Zurflüh a kol., 2008). Léčba tetrahydrobiopterinem může zvýšit vazebnou afinitu mutované PAH k BH 4, ochránit aktivní tetramer před degradací, zvýšit biosyntézu BH 4 a zvýšit expresi PAH (Walter a kol., 2008). Citlivost mutací PAH k léčbě pomocí BH 4 byla objevena při zátěžovém testu s Phe a BH 4, který se používá pro diagnostiku a odlišení deficitu BH 4 (viz 4. kapitola) od deficitu PAH (Ponzone a kol., 1993). Při tomto testu by po podání BH 4 měla být snížena koncentrace Phe 17

19 pouze u deficitu BH 4 a ne u deficitu PAH. Při testování bylo ale pozorováno, že k poklesu Phe v krvi došlo i u pacientů s mírnou HPA. (Kure a kol., 1999). Hladina močových pterinů a aktivita DHPR ale byly normální, což znamená, že pacienti trpěli poruchou PAH a ne deficitem BH 4. Zátěžový test s BH 4 se provádí orálním podáním 5 nebo 10 mg BH 4 /kg tělesné hmotnosti a následným měřením hladiny Phe v krvi. Klasický test končí po jedné dávce BH 4 a několika měřeních; poslední je po 24 hodinách. Klasický zátěžový test je však často rozšiřován, pacientům je podána další dávka BH 4 a jsou sledování po dobu 48 hodin (Fiege a kol., 2005). Opakované podání BH 4 a stanovování hladiny Phe v delším časovém intervalu má pravděpodobně vyšší vypovídací hodnotu, než sledování pouze po dobu 24 hodin. Byly definovány 3 skupiny pacientů podle rychlosti odpovědi na léčbu BH 4 a podle úrovně snížení hladiny Phe: - rychlí respondéři snížení hladiny Phe o více než 50 % do 24 hodin; - střední respondéři snížení hladiny Phe o více než 50 % do 48 hodin; - pomalí respondéři snížení hladiny Phe o více než 30 % do 48 hodin. Sledování pacientů po dobu 48 hodin umožňuje identifikovat i tzv. pomalé respondéry, kteří by v kratším testu byli klasifikováni jako neodpovídající na léčbu BH 4. Léčba BH 4 může být úspěšná pouze u pacientů s mutací zachovávající zbytkovou aktivitu enzymu. Doplnění kofaktoru zvýší intracelulární koncentraci BH 4 a ten tak může obnovit zbývající aktivitu PAH (která má sníženou afinitu ke kofaktoru) nebo stabilizovat mutantní molekulu (Kure a kol., 1999). Na léčbu BH 4 tak odpovídají převážně pacienti s mírnými formami defektu PAH (Fiege a kol., 2005). Molekulární mechanismus odpovědi na léčbu BH 4 je s velkou pravděpodobností multifaktoriální (Aguado a kol., 2007). Nejdůležitějším faktorem určujícím citlivost k BH 4 je kombinace mutací dvou alel genu PAH (Blau a Erlandsen, 2004). Dvě vážné mutace velmi pravděpodobně nebudou odpovídat na léčbu BH 4, u pacientů s jednou lehkou a jednou těžkou mutací je těžké předpovědět mechanizmus odpovědi a pacienti se dvěma lehkými mutacemi velmi pravděpodobně budou BH 4 -responzivní. Možné mechanizmy působení BH 4 při léčbě HPA: K m mutanti enzymu PAH se sníženou vazebnou afinitou k BH 4 Michaelisova konstanta (K m ) určuje vazebnou afinitu enzymu k ligandu a je definována jako koncentrace ligandu nutná k zaplnění jedné poloviny vazebných míst enzymu. Zvýšená K m tak značí sníženou afinitu enzymu k substrátu nebo kofaktoru, která se odrazí ve snížení 18

20 množství enzymaticky katalyzovaných reakcí. Zvýšením intracelulární koncentrace kofaktoru tak aktivujeme mutantní enzym. Tento mechanizmus může být platný i pro mutace enzymu PAH a léčbu dodáním kofaktoru BH 4. Příkladem mutace tohoto typu je p.val388met, jejíž mutovaný protein má sníženou afinitu ke kofaktoru (Leandro a kol., 2000). Mutovaný p.val388met protein vykazuje asi 30 % specifické aktivity nemutované PAH BH 4 jako chaperon Enzym PAH je v těle degradován pomocí ubikvitin-proteazomového systému (Døskeland a Flatmark, 1996). Tento mechanismus má zvláštní význam u mutované PAH. Mnoho případů HPA je způsobeno mutacemi, které mají za následek abnormální sbalování proteinu vedoucí ke zvýšené degradaci tohoto proteinu. Dalším patofyziologickým aspektem špatného sbalování proteinu je vytváření nerozpustných agregátů proteinu, které způsobují ztrátu funkce PAH (Gersting a kol., 2010) (Obrázek 3; Muntau a Gersting, 2010). Obrázek 3: Schematické znázornění patofyziologie deficitu PAH (Muntau a Gersting, 2010; upraveno) Farmakologické chaperony jsou malé molekuly, které stabilizují proteinovou konformaci v případech špatného sbalování (misfoldingu) a tak zabraňují agregaci a degradaci proteinu. Prvním léčivem typu chaperonu je BH 4, který byl roku 2008 schválen pro léčbu HPA (Obrázek 4; Muntau a Gersting, 2010). 19

21 Obrázek 4: Princip účinku BH 4 na vzrůst aktivity mutované PAH (Muntau a Gersting, 2010; upraveno) Bylo objeveno, že existují dva typy BH 4 nacházející se v hepatocytech (Mitnaul a Shiman, 1995). Jeden typ BH 4 je volný, tím pádem metabolicky aktivní, a druhý je vázaný. Vázaný BH 4 se nachází v komplexu s PAH; PAH-BH 4 komplex má nižší katalytickou aktivitu a je pomaleji aktivován fenylalaninem, než nevázaný enzym. Inaktivní komplex PAH-BH 4 může hrát důležitou roli ve stabilizaci PAH a bránit tak její degradaci v ubikvitin-proteazomové dráze (Blau a Erlandsen, 2004). Také může enzym udržet ve sbalené konformaci, takže se stává slabším substrátem pro ubikvitinovou degradaci. Pah enu1 (myší model pro BH 4 -responzivní deficienci PAH) v testech ukázal, že pouze aplikace BH 4 při vysokých koncentracích Phe způsobí podstatné zvýšení koncentrace a aktivity mutovaného enzymu PAH (Gersting a kol., 2010). Tento poznatek znamená, že BH 4 se jako farmakologický chaperon uplatní převážně při škodlivých hladinách substrátu. Mechanizmus působení BH 4 jako chaperonu ovlivňujícího nesprávné sbalování mutovaného proteinu, agregaci a degradaci byl prokázán snížením abnormálně vysoké hydrofobicity u mutantního proteinu, zatímco na nemutovanou PAH nemělo dodání BH 4 žádný efekt Změny v regulaci syntézy BH 4. Syntéza BH 4 je zpětnovazebně regulována tetrahydrobiopterinem, který působí jako inhibitor GTPCH (Thöny a kol., 2000). GTPCH katalyzuje první krok v de novo syntéze BH 4 20

22 (Obrázek 1). V játrech je BH 4 odstraněn z inhibičního komplexu s GTPCH působením Phe (Kapatos a kol., 1999). Tak Phe specificky stimuluje de novo syntézu BH 4. Metabolická dostupnost BH 4 závisí na množství BH 4, které je vázané v komplexu s PAH (Mitnaul a Shiman, 1995). Při běžné koncentraci Phe je většina BH 4 vázána v komplexu PAH-BH 4, který se vyznačuje nízkou metabolickou aktivitou (Xia a kol., 1994). Vznik tohoto komplexu způsobí snížení koncentrace volného enzymu a BH 4. Vzájemná přeměna aktivované a neaktivované PAH a vázaného a volného BH 4 je, stejně jako de novo syntéza BH 4, řízena hladinou Phe (Mitnaul a Shiman, 1995). Phe tak kontroluje metabolickou dostupnost BH 4 a množství aktivní PAH v normální buňce (Xia a kol., 1994). Pouze aktivní komplex PAH obsahující Phe, BH 4 a molekulární kyslík je schopen přeměny Phe na Tyr (Blau a Erlandsen, 2004). Phe je tedy aktivátorem a BH 4 inhibitorem aktivity PAH. Regulace přeměny BH 4 a aktivity PAH jsou spojené procesy, které jsou řízeny koncentrací Phe (Mitnaul a Shiman, 1995). U BH 4 -responzivních mutací je pravděpodobně nefunkční nebo pozměněný mechanismus aktivace pomocí Phe (Blau a Erlandsen, 2004). Proto léčba zvýšením koncentrace BH 4 při vysokých hladinách Phe může fungovat jako bypass neaktivního komplexu PAH-BH 4, který by byl za normálních podmínek aktivován zvýšenou hladinou Phe. Větší množství kofaktoru při léčbě (ve srovnání se stavem před léčbou) se projeví zvýšením přeměny Phe na Tyr. Případně může být léčebný efekt dodaného BH 4 způsoben relativním poměrem mezi množstvím Phe a BH Indukce exprese PAH pomocí BH 4 Byl pozorován vzrůst hladiny PAH mrna a hladiny proteinu po dodání BH 4. BH 4 tedy může regulovat expresi genu PAH a tímto způsobem kontrolovat stálé množství proteinu, pro něhož funguje jako kofaktor. Tento efekt byl pozorován pouze u mutantních molekul PAH, což může být způsobeno rozdílnou regulací mutovaného a nemutovaného proteinu Stabilizace PAH mrna Biosyntéza BH 4 je regulována jak množstvím substrátu, tak transkripčně regulační kontrolou na úrovni mrna (Gesierich a kol., 2003). Phe stimuluje biosyntézu BH 4 nejen zrušením negativní zpětnovazebné inhibice GTPCH, ale taky zvýšením hladiny GTPCH mrna. Aktuální mechanizmus kontroly exprese a stabilizace mrna enzymu kofaktorem není dosud definován. 21

23 Zurflüh a kol. (2008) identifikovali tři nejčastěji se vyskytující mutace, které lze nalézt u více než 5 % případů BH 4 -responzivních mutací; jsou to p.ala403val, p.arg261gln a p.tyr414cys. Ostatní mutace, které byly popsány jako BH 4 -responzivní lze nalézt v databázi BIOPKU. BH 4 -responzivní mutace jsou ty, které se vyznačují snížením hladiny Phe v krvi alespoň o 30 % během 8 až 24 hodin (případně 48 hodin) po podání BH 4 (10 mg/kg 20 mg/kg tělesné váhy) (Blau a Erlandsen, 2004). V databázi BIOPKU bylo identifikováno přes 50 různých mutací genu PAH, které jsou potenciálně BH 4 -responzivní (Zurflüh a kol., 2008). U většiny ze souboru 642 pacientů s HPA na pracovišti Centra molekulární biologie a genové terapie, FN Brno byly identifikovány dvě mutace v genu PAH. Porovnáním mutací těchto pacientů s databází BIOPKU a dalšími dostupnými databázemi (např. PAHdb) lze předpovědět, kteří pacienti budou odpovídat na léčbu BH 4. Z alel (642 pacientů) lze u 264 alel předpokládat pozitivní odpověď na léčbu BH 4 (Mgr. Zuzana Hrubá; Centrum molekulární biologie a genové terapie, FN Brno; ; ústní komunikace). Jedná se o 20 různých mutací genu PAH, z nichž všechny jsou bodové substituční mutace zachovávající reziduální aktivitu enzymu PAH (Tabulka 2). Název mutace Systematický název Počet alel BH 4 -responzivita substituční mutace 264 p.ala403val c.1208c>t 58 ano p.arg158gln c.473g>a 55 ano p.leu48ser c.143t>c 24 ano p.ile306val c.916a>g 23 ano p.arg261gln c.782g>a 22 ano p.tyr414cys c.1241a>g 22 ano p.ile65thr c.194t>c 17 ano p.ala300ser c.898g>t 12 ano p.val245ala c.734t>c 6 ano p.ala395pro c.1183g>c 5 ano p.phe39leu c.117c>g 3 ano p.glu390gly c.1169a>g 3 ano p.val388m c.1162g>a 2 ano p.ala104asp c.311c>a 2 ano p.arg68ser c.204a>t 2 ano p.asp129gly c.386a>g 2 ano p.val190ala c.569t>c 2 ano p.arg241cys c.721c>t 2 ano p.asp415asn c.1243g>a 1 ano p.pro211thr c.631c>a 1 ano Tabulka 2: BH 4 -responzivní mutace pacientů Centra molekulární biologie a genové terapie, FN Brno (Mgr. Zuzana Hrubá; ; ústní komunikace). 22

24 4. Deficit BH 4 V malém množství případů (přibližně 1 až 3 %) je onemocnění HPA způsobeno poruchou syntézy nebo regenerace tetrahydrobiopterinu (BH 4 ) (de Baulny a kol., 2007). Poruchy metabolismu tetrahydrobiopterinu zahrnují mimo jiné i deficit dihydropteridinreduktázy (DHPR) (Walter a kol., 2008). Poruchy syntézy nebo regenerace pterinů jsou spojeny se sníženou aktivitou PAH, tyrosinhydroxylázy, tryptofanhydroxylázy a syntázy oxidu dusnatého (Obrázek 1). Porucha metabolismu pterinů se projevuje patologickým a variabilním tonusem, abnormálními pohyby, dráždivostí a letargií, křečemi, špatnou kontrolou teploty, opožděním vývoje a mikrocefalií. Klinický průběh poruchy metabolismu pterinů může být asymptomatický, zvýšená hladina Phe je zjištěna novorozeneckým screeningem. Poté by dítě mělo být vyšetřeno z hlediska poruch metabolismu pterinů. Pokud nejsou tato další vyšetření provedena (je mylně předpokládán deficit HPA), vyskytuje se u kojenců neurologické postižení i přes dietu s nízkým obsahem Phe. Neurologické postižení v kojeneckém věku se může vyskytnout i v případě, že dětem nebyla nastavena dieta s omezením Phe. To se stane, když jsou hladiny Phe dostatečně nízké na to, aby nevedly k záchytu ve screeningu. Diagnostické testy: - Analýza pterinů a stanovení aktivity DHPR provádí se u všech dětí, u nichž byla novorozeneckým screeningem zjištěna HPA. - Test s BH 4 podání BH 4 před krmením, odebírají se vzorky krve pro stanovení koncentrace Phe a tyrosinu. Jako alternativa může být použit kombinovaný test s Phe a BH 4, který je určen k identifikaci BH 4 -responzivního deficitu PAH. - Stanovení neurotransmiterů v mozkomíšním moku. Cílem léčby je upravit HPA a korigovat deficit aminů v mozkomíšním moku. U deficitu DHPR je také nutná léčba folátem (kyselinou listovou) k prevenci jejího nedostatku v mozku (Smith a kol., 1985). Kyselina listová (vitamín B9) napomáhá v těhotenství dělení buněk, podporuje růst plodu a diferenciaci tkání, zvláště nervové soustavy. Perorální podání BH 4 snižuje hladinu Phe v krvi. V případě deficitu DHPR ale potřebné dávky BH 4 mohou být vyšší, což vede k ukládání BH 2. Akumulace BH 2 pravděpodobně brání správnému metabolismu folátu a způsobuje zvýšení rizika jeho deficitu v centrální nervové soustavě. U DHPR se proto obvykle doporučuje snižování hladiny Phe v organismu dietou a ne pomocí BH 4. 23

25 5. Maternální PKU V minulosti byla u většiny pacientů s PKU nízkofenylalaninová dieta vysazena během dětství, neboť se předpokládalo, že funkce zralého nervového systému nebude poškozena návratem HPA. Následně se ale zjistilo, že skoro všichni potomci žen s PKU, které nejsou léčeny, trpí poruchami. Potomci narození matkám s PKU mají riziko postižení v důsledku teratogenního vlivu Phe. V roce 1980 byl uznán tzv. maternální PKU syndrom. Vysoké koncentrace Phe jsou spojeny se specifickými projevy: mikrocefalie, opoždění vývoje, problémy s učením a vrozené srdeční vady. Na základě studií bylo ženám s PKU doporučeno, aby dietu zahájily prekoncepčně kvůli zabránění těmto účinkům. Bylo zjištěno, že výsledky jsou nejlepší, jestliže bylo dosaženo hladin Phe v maternální krvi 120 µmol/l 360 µmol/l do 8 10 týdnů těhotenství a poté byly tyto hladiny udržovány během těhotenství. Fetální koncentrace Phe jsou 1,5 2x vyšší než hladiny u matek, příčinou je aktivní transport z matky do plodu. Na druhou stranu nízké koncentrace Phe mohou omezit syntézu bílkovin ve fetálním mozku a mohou být škodlivé. Proto by se hladina Phe v maternální krvi měla pohybovat v rozmezí 100 µmol/l 360 µmol/l. Mnoho žen s PKU, které plánují rodinu, jsou vzhledem k dřívějším doporučením řadu let na normální stravě. Tyto ženy by měly být intenzivně vzdělávány a měla by u nich být ihned zavedena léčba s omezením Phe. Je-li těhotná žena na normální stravě, jde o akutní stav. Pokud je metabolické kontroly dosaženo během týdnů, může být fetální vývoj uspokojivý. Novorozenci, kteří netrpí PKU, mohou být kojeni, nadbytek Phe z mléka matky je nepoškodí. I přes důkazy o pozitivních vlivech dietní léčby u maternální PKU zůstává řada nezodpovězených otázek. Například je zajímavé, že některým dětem z neléčených těhotenství se daří překvapivě dobře, zatímco některým ze zdánlivě dobře vedených těhotenství se daří špatně. 24

26 6. Diagnostické metody 6.1 Novorozenecký screening U všech novorozenců narozených na území České republiky se provádí laboratorní screening některých dědičných onemocnění. Screening se provádí metodou odběru suché kapky krve na novorozenecké screeningové kartičce. Cílem novorozeneckého screeningu je rychlá diagnostika a včasná léčba novorozenců s těmito onemocněními. Screening PKU a HPA se v České republice provádí od roku Odběr krevní kapky z patičky novorozence se provádí den života, kdy dítě přijímá mléčnou stravu a hladina Phe je dostatečně vysoká. Pro zavedení celoplošného screeningu musí onemocnění splňovat určité podmínky: - porucha je klinicky diagnostikovatelná až v době, kdy již došlo k nevratnému poškození, nebo bez jejího časného stanovení může být bezprostředně ohrožen život pacienta; - porucha má v populaci dostatečnou incidenci; - je k dispozici efektivní léčba; - existuje screeningový test s vysokou citlivostí; - test je přiměřeně levný. 6.2 Klinická diagnostika Diagnóza se provádí z DNA izolované z periferní krve. Poté se DNA dále zpracovává dalšími metodami, kterými lze zjistit přítomnost mutací způsobujících onemocnění. V této práci je popsána metoda izolace DNA vysolováním a dvě metody, kterými je HPA běžně diagnostikována na pracovišti Centra molekulární biologie a genové terapie, FN Brno: - sekvenace DNA metodou podle Sangera, - MLPA Izolace DNA z periferní krve vysolováním K uvolnění vnitřního obsahu buněk je třeba vyvolat buněčnou lyzi. Živočišné buňky neobsahují buněčnou stěnu, proto je možné použít mírnější metody indukce lyze, než u buněk bakterálních nebo rostlinných. 25

27 Krev se odebírá do zkumavky obsahující chelatační činidlo (roztok EDTA), poté přidáme destilovanou vodu a směs zamrazíme na dobu minimálně 24 hodin (Kozák, 2007). Zamražení způsobí hemolýzu červených krvinek, leukocyty zůstávají neporušené. Krev rozmrazíme a centrifugujeme. Leukocyty se usadí na dně zkumavky, supernatant sléváme, sediment opakovaně resuspendujeme destilovanou vodou a poté fyziologickým roztokem. Přidáme lyzační pufr A-Fasano a proteinázu K a směs přes noc inkubujeme. Ke zlyzovanému a deproteinovanému roztoku přidáme NaCl a chloroform a mícháme 60 minut na třepačce; poté centrifugujeme. Centrifugací se tato suspenze rozdělí na vodnou fázi obsahující NK, rozhraní obsahující část denaturovaných proteinů a část obsahující další proteinové molekuly. Po centrifugaci odebereme horní vrstvu obsahující DNA a purifikujeme pomocí isopropanolu. Promícháním dostaneme DNA zbavenou kontaminujících solí, která se vysráží a v roztoku vyplave na hladinu. DNA promýváme etanolem, vysušíme a rozpustíme v TE pufru Sekvenování DNA podle Sangera Před vlastní sekvenační reakcí je třeba provést amplifikaci vybraného úseku DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) PCR PCR umožňuje získat požadovanou a specifickou sekvenci genomové DNA. Princip reakce je založen na replikaci nukleových kyselin syntézou nových řetězců prostřednictvím DNA-polymerázy. Požadovaný úsek DNA je vymezen připojením dvojice primerů, které se váží na protilehlé řetězce DNA. Po přidání DNA-polymerázy a nukleotidů pak probíhá syntéza nových vláken na obou matricových řetězcích. Reakční směs dále obsahuje jako kofaktor hořečnaté ionty Mg 2+, které tvoří rozpustný komplex s deoxyribonukleosidtrifosfáty. Tento komplex je rozpoznávaný DNA-polymerázou. V průběhu PCR se v závislosti na teplotě reakční směsi pravidelně střídají tři kroky, během kterých probíhají tři odlišné děje: - denaturace dvouřetězcových molekul DNA při teplotě 94 C, - připojení primerů k odděleným řetězcům DNA (teplota C), - syntéza nových řetězců DNA (65 75 C). Reakce se provádějí v zařízeních zvaných termocyklery, v nichž se teplota mění automaticky v předem naprogramovaných časových intervalech. 26

28 Produktem PCR jsou úseky DNA definované délky. V případě diagnózy mutací genu PAH se jedná o jednotlivé exony tohoto genu s jejich přilehlými intronovými oblastmi. Jejich přítomnost v roztoku po proběhnutí PCR se ověřuje gelovou elektroforézou Elektroforéza Principem elektroforézy je separace nabitých molekul pohybem v elektrickém poli. Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny, proto se nukleové kyseliny v elektrickém poli pohybují ke kladně nabité elektrodě (anodě). Elektroforéza se provádí v gelu tvořeném agarózou, která vytváří síťovou strukturu polymerních molekul s póry. Rychlost pohybu molekul DNA v gelu roste s klesající velikostí molekul a s klesající koncentrací agarózy. K identifikaci molekul na gelu je třeba fragmenty DNA zviditelnit přidáním vhodného barviva. Nejčastěji používaný je etidiumbromid, který vytváří komplex s DNA a po osvětlení ultrafialovým světlem červeně fluoreskuje. Amplifikované exony genu PAH, jejichž přítomnost jsme ověřili elektroforézou, je třeba přečistit na komerčně dodávaných kolonkách. DNA fragmenty vyčistíme od primerů, nukleotidů, polymeráz a solí Sekvenování Po přečištění produktů PCR můžeme provést sekvenační reakci. Cílem sekvenování DNA je stanovení pořadí nukleotidů v molekulách DNA, které nám umožní najít a popsat mutace pacientů s PKU. Principem sekvenování je vytvoření souboru jednořetězcových molekul DNA, které se liší svou délkou o jedinou bázi. Sangerovo sekvenování je metodou enzymovou, neboť je založeno na specifické inhibici enzymové syntézy řetězců DNA. Je to v současnosti nejčastěji používaná metoda sekvenování. Využívá schopnosti DNA-polymerázy vytvářet specifické řetězce DNA od 3 -OH konce sekvenčně specifického primeru. Jako terminátor reakce slouží 2,3 -dideoxyribonukleosidtrifosfát (ddntp), který postrádá volnou 3 -OH skupinu a DNA-polymeráza k němu nemůže připojit další nukleotid. Pro umožnění detekce nově syntetizovaných řetězců jsou jednotlivé typy ddntp označeny různými fluorescenčními barvivy. Po proběhnutí polymerizační reakce v termocykleru 27

29 se vytvořené produkty separují kapilární elektroforézou v sekvenátoru. Separace probíhá v polyakrylamidovém gelu s využitím laseru k detekci fluorescence jednotlivých fragmentů. Vyhodnocení získaných sekvencí se provádí komplexní analýzou s využitím výpočetní techniky a speciálních programů. Ty nám umožní porovnat získané sekvence se sekvencemi uloženými v databázích a identifikovat tak mutace a stanovit jejich charakter Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) MLPA je variantou PCR, která umožňuje amplifikovat více cílových molekul za použití jednoho páru primerů (Schouten a kol., 2002). V Centru molekulární biologie a genové terapie, FN Brno se používá zejména pro detekce rozsáhlých delecí zahrnujících celý exon. Tyto delece nelze rozeznat běžnou PCR jednotlivých exonů genomové DNA, protože jedna normální alela je stále přítomná a amplifikuje se. Principem metody je navázání oligonukleotidových sond na cílovou sekvenci DNA a jejich amplifikace. Každá sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů, z nichž jeden je rozeznán přímým a jeden zpětným primerem. Pouze pokud jsou oba oligonukleotidy hybridizované na stejnou cílovou molekulu, mohou být ligací spojeny v kompletní sondu. Rozdělení sondy na dvě části umožňuje amplifikaci pouze spojených sond, nenavázané oligonukleotidy nejsou amplifikovány. Jeden z páru oligonukleotidů je vždy krátký a obsahuje na 3 -konci sekvenci specifickou k cílové sekvenci DNA a na 5 -konci společnou sekvenci komplementární k primeru. Druhý oligonukleotid je dlouhý a skládá se z cílově specifické sekvence na 5 -konci, sekvence komplementární k primeru na 3 -konci a vmezeřené sekvence, tzv. stuffer sekvence, rozdílné délky (Obrázek 5). Obrázek 5: Schéma konstrukce párů sond 28

30 Jedinečná délka kompletních sond umožňuje jejich rozdělení kapilární elektroforézou na sekvenátoru. Následně jsou výsledky vyhodnoceny speciálním počítačovým programem. Výhodou této metody je, že lze vyšetřovat až 40 různých sekvencí DNA za použití jednoho páru primerů. Při standardní mnohonásobné PCR musíme použít pro každý fragment speciální pár primerů, což může způsobovat řadu problémů. MLPA reakce je rychlá, levná, citlivá a jednoduše proveditelná, což je velmi efektivní v rutinní diagnostice. 29

31 7. Závěr Hyperfenylalaninémie je onemocnění, které velmi omezuje život pacientů. Společenská izolace hrozí zejména v dětství a adolescenci, kdy je nutné dodržovat dietu s nízkým obsahem fenylalaninu. Její dodržování je tak náročné, že výrazně zasahuje do normálních kulturních a stravovacích zvyklostí. Fenylalanin je aminokyselina obsažená ve všech bílkovinách a bílkoviny jsou v určitém množství přítomné ve všech běžných potravinách. U postižených je proto nutné omezit příjem bílkovin v potravě do takové míry, že k zajištění přiměřené výživy je nutná semisyntetická dieta. Léčba musí být pravidelně kontrolována, protože hrozí riziko nutričního deficitu. Z těchto důvodů je snaha vyvinout alternativní způsob léčby HPA. Výzkum se ubírá mnoha směry, zabývá se například možností léčby genovou terapií, náhradou PAH fenylalaninamoniumlyázou a dalšími. Tyto metody ale zatím nejsou příliš úspěšné. Jako perspektivní se zdá být léčba pomocí perorálně dodávaného tetrahydrobiopterinu. Tato možnost byla objevena poměrně nedávno, takže zatím nejsou informace o úspěšnosti dlouhodobé léčby pomocí BH 4. V současnosti se tímto směrem ubírá mnoho výzkumů. U řady pacientů byla léčba pomocí BH 4 zavedena buď jako náhrada dietní léčby, nebo jako doplněk k dietě. Dietní léčba tak umožňuje vyšší příjem Phe a méně omezuje život pacientů. Léčba tetrahydrobiopterinem může být úspěšná pouze u některých pacientů, převážně u těch s lehčími formami HPA. Ti mají mutace v genu PAH, které zachovávají reziduální aktivitu enzymu. Dodání BH 4 tak může zvýšit aktivitu mutovaného enzymu. Mechanizmus účinku BH 4 není plně objasněn, je velmi pravděpodobné, že je ovlivněný mnoha faktory. Léčba BH 4 je poměrně drahá, je proto třeba určit, kteří pacienti jsou vhodnými kandidáty na tuto léčbu. To lze s poměrně velkou přesností předpovědět ze znalosti jejich mutací a následným porovnáním těchto mutací s databázemi BH 4 -responzivních mutací. Tyto předpovědi ale stále nejsou stoprocentní, protože není objasněný princip účinku BH 4 a také stále nejsou popsány všechny mutace způsobující HPA. V současnosti je diskutovaná funkce BH 4 na sbalování proteinu. BH 4 pravděpodobně slouží jako chaperon a napomáhá špatně sbalenému mutovanému proteinu ve správném sbalování. Tím ho stabilizuje a zabraňuje degradaci mutovaného proteinu. Objasnění účinku BH 4, případně dalších možností léčby HPA je proto perspektivní a vyvíjející se oblastí výzkumu s vysokou pravděpodobností aplikace v klinické praxi. 30