Pro diagnostiku In Vitro. P0082(04) Pro použití se systémem BD MAX Čeština 4 I

Transkript

1 MAX StaphSR Pro diagnostiku In Vitro P0082(04) Pro použití se systémem BD MAX Čeština 4 I ÚČEL POUŽITÍ Stanovení BD MAX StaphSR prováděné na systému BD MAX je automatizovaný kvalitativní diagnostický test in vitro pro přímou detekci a diferenciaci DNA Staphylococcus aureus (SA) a DNA methicilin rezistentního Staphylococcus aureus (MRSA) z nazálních výtěrů u pacientů ohrožených nazální kolonizací. Tento test využívá polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase k amplifikaci DNA MRSA/SA a pomocí cílově specifických fluorogenních hybridizačních sond zajišťuje detekci amplifikované DNA. Stanovení BD MAX StaphSR napomáhá při prevenci a kontrole infekcí MRSA a SA ve zdravotnických zařízeních. Není určen k diagnostice infekcí MRSA ani SA, ani k vedení nebo sledování léčby infekcí MRSA/SA. Negativní výsledek nevylučuje nazální kolonizaci. Současná kultivace je nutná k zajištění bakterií pro epidemiologickou typizaci a další testy citlivosti. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ POSTUPU S. aureus je jednou z hlavních příčin nozokomiálních infekcí, jako jsou infekce krve a infekce operační rány, které se klinicky projevují v rozsahu od puchýřů až po sepsi a smrt. Běžně se nachází na nosní sliznici či na kůži zdravých osob (asymptomatičtí přenašeči). Léčba některých infekcí kmenem S. aureus se stala značným problémem, zvláště s rozvojem kmenů rezistentních na dosud účinné antimikrobiální látky. Výskyt methicilin rezistentních kmenů S. aureus ve zdravotnických zařízeních je čím dál častější a tento typ už představuje přes 60 % izolátů z infekcí bakteriemi S. aureus v některých severoamerických a evropských nemocnicích.,2 V nemocnicích se MRSA většinou přenáší kontaminovanýma rukama zdravotnického personálu. Mezi rizikové faktory kolonizace MRSA ve zdravotnických zařízeních patří dlouhodobá hospitalizace, blízkost pacientů infikovaných MRSA, opakovaná a dlouhodobá expozice širokospektrálním antibiotikům, a přítomnost přenašečů MRSA. Riziko infekce MRSA se zvyšuje u pacientů kolonizovaných MRSA. S. aureus je jednou z hlavních příčin infekcí operačních ran (SSI). Způsobuje 20 % až 56 % infekcí SSI, z nichž až 57 % izolátů připadá na MRSA. 4 Úmrtnost spojená s oběma patogeny kolísá v rozsahu 5 až 22 %. 4,5 U většiny pacientů s infekcí SSI byla infekce S. aureus přičítána endogenním zdrojům. 4,6 Klasické metody používané k detekci S. aureus a MRSA vyžadují kultivaci a izolaci čistých kolonií s následným aglutinačním testem k identifikaci S. aureus a buď test citlivosti na oxacilin, detekci genu meca pro methicilinovou rezistenci nebo proteinu vázajícího penicilin (PBP 2a) k detekci MRSA. K potvrzení S. aureus a MRSA těmito konvenčními metodami je zapotřebí minimálně 24 hodin, a v průměru více než 48 hodin. Při zvýšené morbiditě a mortalitě u infekcí S. aureus, rozvoji drop-out kmenů meca a šíření nového genu způsobujícího methicilinovou rezistenci (např. genu mecc), je možnost rychlé detekce a odlišení S. aureus a MRSA do několika hodin namísto dní jednoznačnou výhodou oproti současné praxi, a umožňuje účinnější léčbu a péči o pacienta. Provede se nosní výtěr a vzorek se zašle do laboratoře v doporučeném přepravním obalu (viz bod Potřebné vybavení a materiál, které nejsou součástí dodávky ). Výtěr se uloží do zkumavky BD MAX StaphSR Sample Buffer Tube (Zkumavka se vzorkovým pufrem BD MAX StaphSR). Zkumavka se vzorkovým pufrem se promíchá, aby se buňky uvolnily z výtěru do pufru. Zkumavka se vzorkovým pufrem se umístí do systému BD MAX a budou provedeny následující automatizované postupy: Provede se lýza bakteriálních buněk, DNA se extrahuje a zkoncentruje na magnetických kuličkách a získaný poměrný vzorek DNA se přidá k činidlům pro PCR, které obsahují specifické primery pro SA a MRSA pro amplifikaci cílových genetických oblastí, jsou-li přítomny. Součástí testu je také kontrola zpracování vzorku (SPC). Kontrola zpracování vzorku (SPC) je součástí extrakční zkumavky a při provedení kroků extrakce, koncentrace a amplifikace slouží k monitorování inhibujících látek a neúčinnosti procesu vlivem závady přístroje nebo činidla. Po vložení klinického vzorku a modulární jednotky s činidly do systému BD MAX již není nutný žádný zásah uživatele. Systém BD MAX provádí automaticky lýzu, extrakci a koncentraci DNA, rehydrataci činidel a amplifikaci a detekci cílové sekvence nukleových kyselin pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase. Amplifikované cílové sekvence jsou detekovány pomocí hydrolyzačních sond značených zhášenými fluorofory. Amplifikaci, detekci a interpretaci signálů provádí automaticky systém BD MAX.

2 ZÁSADY POSTUPU Systém BD MAX používá kombinaci lytických a extrakčních činidel k provedení lýzy buněk a extrakce DNA. Po enzymatické lýze buněk za zvýšené teploty se uvolněné nukleové kyseliny zachytí na magnetických kuličkách. Kuličky s navázanými nukleovými kyselinami jsou promyty a nukleové kyseliny jsou uvolněny působením tepla a elučního pufru. Eluovaná DNA je neutralizována neutralizačním pufrem a přenesena do zkumavky Master Mix, kde rehydratuje činidla PCR. Rekonstituované amplifikační činidlo se nadávkuje do BD MAX PCR Cartridge (Kazeta pro PCR BD MAX). Systém před zahájením PCR uzavře mikroskopické uzávěry v kazetě PCR BD MAX, a tak zabrání vypařování a kontaminaci amplikonu. Amplifikované cílové sekvence DNA jsou detekovány pomocí hydrolyzačních sond (TaqMan), které jsou na jednom konci označené fluorescenčním barvivem zářiče (fluoroforem) a na druhém konci zhášečem. K detekci specifických amplikonů v pravé části větvení SCCmec (MREJ), genů pro methicilinovou rezistenci meca a mecc, genu nuc pro termostabilní nukleázu S. aureus a amplikonů SPC se používají sondy značené různými fluorofory detekované ve čtyřech různých optických kanálech systému BD MAX: Amplikony MREJ jsou detekovány v kanále FAM, amplikony meca a mecc jsou detekovány v kanále ROX, amplikony nuc jsou detekovány v kanále VIC a amplikony SPC jsou detekovány v kanále Cy5.5. Když jsou sondy v nativním stavu, fluorescence fluoroforu je zhášena jeho polohou blízko ke zhášeči. V přítomnosti cílové sekvence DNA však sondy hybridizují s komplementárními sekvencemi a jsou hydrolyzovány 5 3 exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy, která provádí syntézu nascentního řetězce podél templátu DNA. Tím je fluorofor separován od molekul zhášeče a dojde k emitování fluorescence. Množství fluorescence detekované ve čtyřech optických kanálech použitých při stanovení BD MAX StaphSR je přímo úměrné množství odpovídající hydrolyzované sondy. Systém BD MAX měří tyto signály na konci každého cyklu amplifikace a po interpretaci dat poskytne výsledek. ČINIDLA REF Obsah Množství BD MAX StaphSR Master Mix (Směs BD MAX StaphSR Master Mix) (B7) Suchá směs Master Mix PCR obsahující polymerázu, nukleotidy a specifické molekulární sondy a primery 24 testů spolu s molekulární sondou specifickou pro kontrolu zpracování vzorku. BD MAX StaphSR Reagent Strip (Jednotka s činidly BD MAX StaphSR) Modulární jednotka s činidly obsahující všechna kapalná činidla a jednorázové špičky na pipety pro 24 testů zpracování vzorku a extrakci DNA. BD MAX StaphSR Extraction Tube (Extrakční zkumavka BD MAX StaphSR) (B8) Suché extrakční činidlo obsahující magnetické kuličky s afinitou k DNA, achromopeptidázu a kontrolu 24 testů zpracování vzorků BD MAX StaphSR Sample Buffer Tube (Zkumavka se vzorkovým pufrem BD MAX StaphSR) (a 25 víček se septem) 24 testů POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A MATERIÁL, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY Jednoduchá nebo dvojitá štětička BBL CultureSwab Liquid Stuart (katalog Becton Dickinson, katalogové č nebo 22009), jednoduchá nebo dvojitá štětička Copan (Venturi) Transystem* Liquid Stuart (katalog Copan, katalogové č. 4C nebo 39C) Vortex VWR pro více zkumavek (katalog VWR, katalogové č ) Držák kryogenních lahviček NALGENE (katalog VWR, katalogové č ) Jednorázové rukavice, bez talku Sterilní nůžky (volitelně) Sterilní gáza Stopky či budík Kazety BD MAX PCR Cartridge (Kazeta PCR BD MAX) (katalog BD Diagnostic Systems, katalogové č ) VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Pro diagnostiku in vitro. Nepoužívejte sadu, pokud je porušený štítek, kterým je přelepena vnější krabice. Nepoužívejte činidla, pokud jsou ochranné sáčky při dodání otevřeny či roztrženy. Po každém použití uzavřete rychle ochranné sáčky s činidly zipem. Před uzavřením ze sáčků odstraňte přebytečný vzduch. Nevyjímejte vysoušeč ze sáčků s činidly. Zkontrolujte správné naplnění kapalin v jednotkách s činidly (ujistěte se, že kapaliny jsou na dně zkumavek) (viz obrázek ). Zkontrolujte, že v jednotkách s činidly se nacházejí všechny pipetové špičky (viz obrázek ). Nepoužívejte činidla, pokud v sáčcích s činidly není vysoušeč nebo je jeho balení uvnitř sáčku porušené. Nepoužívejte činidla, pokud je fólie otevřena či poškozena. Nemíchejte činidla z různých sáčků, sad nebo šarží. Nepoužívejte prošlá činidla ani materiály. Nezaměňujte uzávěry mezi zkumavkami ani je znovu nepoužívejte, protože by mohlo dojít ke kontaminaci a zkreslení výsledků testu. S roztoky chemikálií pracujte opatrně, aby nedošlo ke změně čitelnosti čárového kódu na zkumavce se směsí Master Mix nebo extrakční zkumavce. 2

3 Kazety PCR BD MAX po použití nerozlamujte, aby nedošlo ke kontaminaci prostředí amplikony SA nebo MRSA. Uzávěry na kazetách PCR BD MAX zabraňují kontaminaci. Laboratoř musí pravidelně monitorovat prostředí, aby se minimalizovalo riziko zkřížené kontaminace. Překročení doporučených časů může zkreslit výsledky. Testy, které se neprovedou v uvedeném časovém rozmezí, je třeba opakovat. Podle doporučení a požadavků místních, krajských či celostátních předpisů nebo požadavků akreditačních organizací může být potřeba testovat další kontroly. V případě, že se v laboratoři provádějí jiné kultivace nebo testy PCR, je nutno zajistit, aby nedošlo ke kontaminaci soupravy stanovení BD MAX StaphSR, případných dalších činidel používaných k testování ani systému BD MAX. Před manipulací s činidly a kazetami si musíte vyměnit rukavice. Se vzorky vždy zacházejte jako s infekčními a v souladu s bezpečnostními postupy laboratoře, jaké jsou například popsány v publikacích CLSI Document M29 7 a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 8 Při manipulaci s činidly ze sady používejte ochranný oděv a jednorázové rukavice. Po provedení testu si pečlivě umyjte ruce. Nepipetujte ústy. V oblasti manipulace se vzorky a činidly ze sady nekuřte, nepijte a nejezte. Nepoužitá činidla a odpad zlikvidujte v souladu s místními předpisy. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Během přepravy je třeba odebrané vzorky uchovávat při teplotě 2 25 C. Chraňte před mrazem a vysokými teplotami. Vzorky lze před testováním skladovat až 48 hodin při teplotě 25 ±2 C nebo až 20 hodin (5 dní) při teplotě 2 8 C. Činidla a komponenty sady stanovení BD MAX StaphSR jsou při teplotě 2 25 C stabilní do uplynutí uvedené doby použitelnosti. Nepoužívejte prošlé komponenty. Zkumavky se směsí Master Mix BD MAX StaphSR a extrakční zkumavky jsou dodávány v uzavřených sáčcích. Po otevření sáčky ihned uzavřete. Chráníte tím výrobky před vlhkostí. Zkumavky s činidly jsou po počátečním otevření a opětovném uzavření v sáčku stabilní po dobu až 4 dnů při teplotě 2 25 C. Nerekonstituované extrakční zkumavky a zkumavky se směsí Master Mix jsou po vyjmutí z ochranného sáčku stabilní po dobu maximálně 5 hodin při teplotě 2 25 C. NÁVOD K POUŽITÍ Odběr a přeprava vzorků Nazální vzorky odebírejte do doporučeného transportního média (viz část Potřebné vybavení a materiál, které nejsou součástí dodávky ) podle standardních postupů daného pracoviště či laboratoře nebo dle následujících kroků:. Navlhčete štětičku dvěma kapkami (přibližně 50 µl) sterilního fyziologického roztoku či použijte suchou. 2. Opatrně štětičku zaveďte do nosní dírky pacienta (špičku štětičky je třeba zasunout až 2,5 cm za okraj nosních dírek) štětičkou otočte po sliznici v nosní dírce. 4. Zaveďte stejnou štětičku do druhé nosní dírky a opakujte kroky 2 a Vložte štětičku do přepravní zkumavky. 6. Přepravní zkumavku označte. 7. Odešlete štětičky do laboratoře podle standardního postupu nemocnice nebo laboratoře (viz část Skladování a stabilita ). Příprava vzorku Poznámka: Pro testování každého vzorku a každé externí kontroly je potřeba jedna () vzorková zkumavka s pufrem, jedno () víčko se septem, jedna () zkumavka Master Mix (B7), jedna () extrakční zkumavka (B8) a jedna () jednotka s činidly. Poznámka: Informace o kultivaci klinických vzorků před provedením stanovení BD MAX StaphSR naleznete v části Kultivace klinických vzorků.. Zajistěte si počet zkumavek se vzorkovým pufrem odpovídající počtu testovaných vzorků a externích kontrol. 2. Každou zkumavku se vzorkovým pufrem označte vhodnou identifikací pacienta, aniž by došlo k zakrytí, přepsání nebo přelepení čárového kódu. 3. Sejměte uzávěr ze zkumavky se vzorkovým pufrem. 4. Vyjměte štětičku z transportní zkumavky se vzorkem a vložte ji do odpovídající zkumavky se vzorkovým pufrem. 5. Podržte štětičku u okraje zkumavky (použijte sterilní gázu, aby nedošlo ke kontaminaci). Zvedněte štětičku přibližně jeden () cm ode dna zkumavky se vzorkovým pufrem a odlomte konec štětičky ohnutím o okraj zkumavky. Alternativní metoda: přestřihněte štětičku sterilními nůžkami. 6. Zavřete zkumavku se vzorkovým pufrem pomocí víčka se septem. 7. Vložte zkumavku se vzorkovým pufrem do držáku kryogenních lahviček NALGENE a promíchejte vortexem pro více zkumavek při maximální rychlosti po dobu jedné () minuty. Ve vortexu pro více zkumavek lze současně zpracovat až 24 vzorků. 3

4 Provoz systému BD MAX Poznámka: Podrobné pokyny naleznete v uživatelské příručce k systému BD MAX (část Provoz ). Poznámka: Stanovení BD MAX StaphSR musí být provedeno ihned po kroku promíchání uvedeném výše ( Příprava vzorku, krok 7). Pokud je nutné testování provést znovu, vzorek před tím znovu promíchejte.. Zapněte systém BD MAX a přihlaste se vložením uživatelského jména (<user name>) a hesla (<password>). 2. Před manipulací s činidly a kazetami si musíte vyměnit rukavice. 3. Vyjměte potřebný počet jednotek s činidly BD MAX StaphSR ze sady BD MAX StaphSR. Každou jednotkou lehce klepněte na tvrdý povrch tak, aby všechny kapaliny byly na dně zkumavek. 4. Vyjměte potřebný počet extrakčních zkumavek StaphSR a zkumavek se směsí Master Mix StaphSR z ochranných sáčků. Odstraňte přebytečný vzduch a sáčky uzavřete zipem. 5. Pro každý testovaný vzorek a externí kontrolu vložte jednu () jednotku s činidly BD MAX StaphSR do stojanu BD MAX System Rack (Stojan systému BD MAX) tak, že začnete v poloze stojanu A a pokračujete postupně v řadě dál. Nenechávejte volná místa. 6. Zatlačte jednu () extrakční zkumavku BD MAX StaphSR (s bílou fólií) v poloze každé jednotky s činidly BD MAX StaphSR (viz obr. ). 7. Zatlačte jednu () zkumavku se směsí Master Mix BD MAX StaphSR (se zelenou fólií) v poloze 2 každé jednotky s činidly BD MAX StaphSR (viz obr. ). 2 3 Odpad Špičky na pipety Pufry Extrakční zkumavka Zkumavka Master Mix Obrázek : Zatlačení extrakčních zkumavek BD MAX StaphSR a zkumavek se směsí Master Mix do jednotky s činidly. 8. V softwaru BD MAX vyberte záložku <Consumable info> (Informace o spotřebním materiálu) na obrazovce Run (Operace). 9. Zadejte číslo šarže sady stanovení BD MAX StaphSR (aby bylo možno sledovat šarži), buď načtením čárového kódu skenerem, nebo ručně. Poznámka: Zopakujte výše uvedené kroky 8 a 9 pro každé nové číslo šarže sady. 0. Vyberte záložku <Work List> (Pracovní seznam), klepněte do pole <Assay> (Stanovení) a z rozbalovací nabídky vyberte možnost <BD MAX StaphSR>. Tím se automaticky vyplní do zbývajících polí pro stanovení ve stojanu A text BD MAX StaphSR.. Zadejte ID zkumavky se vzorkovým pufrem BD MAX StaphSR, ID pacienta a přístupové číslo (pokud lze uplatnit) pro polohu stojanu A buď načtením D čárového kódu skenerem, nebo ručně. 2. Klepněte na pole <Lot Number> (Číslo šarže) a v rozbalovací nabídce vyberte příslušné číslo šarže sady (uvedené na vnější krabici). Tím dojde k automatickému vyplnění zbývajících polí čísla šarže u stojanu A stejným číslem šarže. 3. Zadejte informace pro další polohu ve stojanu a pokračujte takto se všemi zbývajícími zkumavkami se vzorkovým pufrem ve stojanu. Poznámka: Výše uvedené kroky 2 a 3 musíte zopakovat pro každé nové číslo šarže sady. 4. Zopakujte kroky 0 až 3 u stojanu B. 5. Vložte zkumavky se vzorkovým pufrem BD MAX StaphSR do stojanů BD MAX ve stejném pořadí, v němž byly zapsány do pracovního seznamu. Nevynechávejte zkumavky ani mezi nimi nenechávejte volné polohy. Poznámka: Umístěte zkumavky do stojanu tak, že štítky s D čárovým kódem směřují navenek (to usnadňuje skenování zkumavek při přihlašování vzorku). 6. Umístěte požadovaný počet kazet PCR BD MAX do systému BD MAX (viz obrázek 2). Na každé kazetě lze provést 2 operace s maximálně 2 vzorky, celkem tedy lze zpracovat 24 vzorků. Systém BD MAX automaticky vybere polohu a řadu na kazetě PCR pro každou operaci. Na každé kazetě lze provést 2 operace A ke každému stojanu připadne kazeta. 4

5 Obrázek 2: Vložení kazet PCR 7. Vložte stojan (stojany) do systému BD MAX (obrázek 3). Zkontrolujte, že umístění stojanu (stojanů) (zleva doprava) odpovídá vytvořenému pracovnímu seznamu (shora dolů). Strana A Strana B Obrázek 3: Vložení stojanu (stojanů) do systému BD MAX. 8. Zavřete víko systému BD MAX a klepnutím na tlačítko <Start Run> (Zahájit operaci) zahajte zpracování vzorků. 9. Po skončení operace ihned zkontrolujte výsledky nebo uchovejte zkumavky se vzorkovým pufrem při teplotě 2 8 C, dokud výsledky nezkontrolujete. Poznámka: Pokud bylo během operace poškozeno septum, vyměňte je před uchováním vzorku za nové. Poznámka: Zkumavky se vzorkovým pufrem lze skladovat při teplotě 25 ±2 C po dobu maximálně 36 hodin nebo při teplotě 2 8 C po dobu maximálně 20 hodin (5 dní) od spuštění operace. Při obdržení neurčitého (IND), nejednoznačného (UNR) nebo neúplného (INC) výsledku anebo při selhání externí kontroly je nutné provést opakovaný test z příslušné zkumavky se vzorkovým pufrem v tomto období (viz část Opakované provedení testu ). 5

6 KONTROLA KVALITY Postupy kontroly kvality slouží k ověřování funkčnosti stanovení. Laboratoře musejí zavést počet, typ a četnost testování kontrolních materiálů podle doporučení či požadavků místních, krajských nebo celostátních předpisů či požadavků akreditačních organizací. Základní informace o kontrole kvality najdete v publikacích CLSI MM3 9 a EP2. 0. Externí pozitivní kontrola ověřuje, jestli nedošlo k podstatnému selhání činidel, zatímco externí negativní kontrola se používá k detekci kontaminace činidla nebo prostředí (nebo přenosu) ostatními vzorky nebo amplikony SA nebo MRSA. Společnost BD nedodává materiál pro externí kontroly. Doporučují se různé typy externích kontrol, takže si uživatel může vybrat ty, které nejlépe vyhovují programu kontroly kvality v dané laboratoři: Komerčně dostupné kontrolní materiály [jako pozitivní kontrolu můžete použít např. referenční kmen MRSA (ATCC 43300) a kmen Staphylococcus aureus citlivý na methicilin (např. ATCC 2923)]. Jako negativní kontrolu můžete použít kmen Staphylococcus epidermidis (např. ATCC 2228). Dříve analyzované vzorky, u nichž je známo, že jsou pozitivní nebo negativní na přítomnost S. aureus nebo MRSA. Poznámka: Doporučuje se připravit čerstvé vzorky bakteriálních kmenů ve fyziologickém roztoku na zákal 0,5 McFarlandova zákalového standardu (~,0 0 8 CFU/ml) z izolovaných kolonií a následně zředit fyziologickým roztokem na konečnou koncentraci ~,0 0 4 CFU/ml. Ponořte štětičku do naředěné bakteriální suspenze, vytlačte přebytečnou tekutinu, vložte štětičku do odpovídající zkumavky se vzorkovým pufrem a postupujte podle pokynů v kroku 5 v části Příprava vzorku. 2. Do doby dostatečného ověření procesu v systému BD MAX je třeba provádět jednu () externí pozitivní kontrolu a jednu () externí negativní kontrolu denně. Kontrolní kmeny MRSA a MSSA můžete střídat, takže budete každý z nich testovat obden. Snížení četnosti kontrolních testů je nutné zakládat na protokolu a údajích zjištěných v konkrétní laboratoři. 3. Externí negativní kontrola, která má pozitivní výsledek, naznačuje problém při manipulaci se vzorkem nebo kontaminaci. Prověřte techniku manipulace se vzorky, aby nedocházelo k záměnám nebo kontaminaci. Externí pozitivní kontrola, která má negativní výsledek, naznačuje problém při manipulaci se vzorkem nebo jeho přípravě. Prověřte techniku manipulace se vzorky a techniku jejich přípravy. 4. Externí kontrola, která má nejednoznačný, neurčitý nebo nedokončený výsledek testu, naznačuje selhání činidla nebo systému BD MAX. Zkontrolujte, zda monitor systému BD MAX neukazuje chybové zprávy. Vysvětlení varování a chybových kódů naleznete v části Souhrn systémových chyb uživatelské příručky k systému BD MAX. Pokud problém přetrvává, použijte činidla z dosud neotevřeného sáčku nebo použijte novou sadu stanovení BD MAX StaphSR. Poznámka: Software systému BD MAX nepoužívá k interpretaci výsledků testování vzorku externí pozitivní ani negativní kontroly. S externími kontrolami zachází, jako by se jednalo o pacientské vzorky. 5. Každá extrakční zkumavka stanovení BD MAX StaphSR obsahuje kontrolu zpracování vzorku (SPC), což je plazmid, který obsahuje syntetickou cílovou sekvenci DNA. SPC se extrahuje, vymyje a amplifikuje společně s DNA přítomnou ve zpracovávaném vzorku, čímž zajistí předvídatelnost stanovení. Kontrola zpracování vzorku ověřuje účinnost zachycení DNA, promytí a eluce během přípravy vzorku a také účinnost amplifikace a detekce DNA při testu PCR. Pokud kontrola zpracování vzorku nesplní kritéria přijatelnosti pro negativní vzorek, bude výsledek nahlášen jako nejednoznačný. Nejednoznačný výsledek naznačuje inhibici související se vzorkem či zpracováním nebo selhání činidla. Každý vzorek s nejednoznačným výsledkem musíte znovu otestovat podle níže uvedeného postupu v části Opakované provedení testu. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky jsou dostupné pod záložkou Results (Výsledky) v okně Results (Výsledky) na monitoru systému BD MAX. Software systému BD MAX automaticky interpretuje výsledky. Podle stavu amplifikace cílové sekvence a kontroly zpracování vzorku může být výsledek testu [SA NEG, MRSA NEG (negativní)], [SA POS, MRSA POS (pozitivní na MRSA)], [SA POS, MRSA NEG (pozitivní na SA)], [SA UNR, MRSA UNR (nejednoznačný)]. Výsledky IND (neurčitý) nebo INC (neúplný) jsou způsobeny selháním systému BD MAX. Výsledky jsou určeny podle následujícího rozhodovacího algoritmu: Hlášený výsledek stanovení SA POS MRSA POS SA POS MRSA NEG SA NEG MRSA NEG SA UNR MRSA UNR IND Interpretace výsledku Zjištěna DNA MRSA Zjištěna DNA SA, nezjištěna DNA MRSA Nezjištěna DNA SA ani MRSA Nejednoznačný výsledek. Žádná amplifikace cílové sekvence, žádná amplifikace SPC Neurčitý výsledek z důvodu selhání systému BD MAX (s varováním nebo chybovým kódem a ) INC Neúplná operace (s varováním nebo chybovým kódem a ) a Vysvětlení varování a chybových kódů naleznete v části Řešení potíží uživatelské příručky k systému BD MAX. 6

7 SA POS, MRSA POS (zjištěna DNA MRSA) Byl detekován fluorescenční signál pro cílovou sekvenci MREJ (specifická pro S. aureus) i meca nebo mecc. Genová cílová sekvence nuc může a nemusí být zjištěna, neboť bylo prokázáno, že ve vzácných případech může u MRSA gen nuc chybět. 2 SPC je ignorováno, protože amplifikace cílové sekvence MRSA má vyšší váhu než tato kontrola. SA POS, MRSA NEG (zjištěna DNA SA, nezjištěna DNA MRSA) Byl detekován fluorescenční signál pouze pro genovou cílovou sekvenci nuc (ukazuje na kmen SA), nebo byl detekován fluorescenční signál pro gen nuc a pro cílovou sekvenci meca nebo mecc bez přítomnosti sekvence MREJ (ukazuje na přítomnost kmene SA se souběžnou kolonizací methicilin rezistentním bakteriálním kmenem jiného typu než SA), nebo byl detekován fluorescenční signál pro gen nuc a cílové sekvence MREJ (ukazuje na možnost použití prázdné kazety), nebo byl detekován fluorescenční signál pouze pro cílovou sekvenci MREJ (ukazuje na možnost použití prázdné kazety s S. aureus. Sekvence MREJ je specifická pro druh S. aureus a proto je indikativní pro kmeny SA. Pro získání výsledku SA POS, MRSA NEG při variantě použití prázdné kazety není nutná detekce genu nuc, SPC je ignorováno, protože amplifikace cílové sekvence SA má vyšší váhu než tato kontrola. SA NEG, MRSA NEG (nezjištěna DNA SA ani MRSA) Ve stanovení BD MAX StaphSR nebyl detekován fluorescenční signál pro žádnou z cílových sekvencí (nuc, meca, mecc a MREJ) a byl detekován fluorescenční signál pro SPC, nebo byl detekován fluorescenční signál pouze pro gen meca nebo mecc [geny meca a mecc nejsou specifické pro druh S. aureus a mohou se nacházet i u jiných rodů bakterií (např. S. epidermidis)]. SA UNR, MRSA UNR (nejednoznačný výsledek) Nebyl detekován fluorescenční signál pro gen nuc, ani pro cílové sekvence meca, mecc nebo MREJ. Nebyl detekován fluorescenční signál pro SPC (inhibiční vzorek nebo selhání činidla). IND (neurčitý výsledek) Selhání systému BD MAX s varováním nebo chybovým kódem. Vysvětlení varování a chybových kódů naleznete v části Řešení potíží uživatelské příručky k systému BD MAX. INC (neúplná operace) Selhání systému BD MAX s varováním nebo chybovým kódem. Vysvětlení varování a chybových kódů naleznete v části Řešení potíží uživatelské příručky k systému BD MAX. OPAKOVANÉ PROVEDENÍ TESTU Poznámka : Je k dispozici dostatečný objem pouze pro jedno opakování testu ve zkumavce se vzorkovým pufrem v systému BD MAX. U zkumavek se vzorkovým pufrem uchovávaných při teplotě 25 ±2 C musí být test zopakován do 36 hodin po provedení kroků uvedených výše v bodě Příprava vzorku. U zkumavek se vzorkovým pufrem uchovávaných při teplotě 2 8 C musí být test zopakován do 20 hodin (5 dnů) po provedení kroků uvedených výše v bodě Příprava vzorku. Poznámka 2: Vzorky k opakovanému testování i nové vzorky lze testovat v téže operaci. NEJEDNOZNAČNÝ VÝSLEDEK Nejednoznačné výsledky mohou být obdrženy v případě, kdy inhibitor nebo selhání činidel zabrání řádné amplifikaci cílové sekvence nebo kontroly přípravy vzorku. Opakované testování vzorků lze provést z odpovídajících zkumavek se vzorkovým pufrem ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu () minutu vortexem a začněte částí Provoz systému BD MAX. NEURČITÝ VÝSLEDEK Neurčité výsledky mohou být obdrženy v případě, kdy došlo k selhání systému. Opakované testování vzorků lze provést z odpovídajících zkumavek se vzorkovým pufrem ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu () minutu vortexem a začněte částí Provoz systému BD MAX. Vysvětlení varování a kódů chyb najdete v uživatelské příručce k systému BD MAX (část Řešení potíží ). NEÚPLNÝ VÝSLEDEK Neúplné výsledky mohou být obdrženy v případě, kdy se zobrazí ukončující varování nebo chybový kód nebo kdy příprava vzorku nebo proces PCR nedospějí do očekávaných časových bodů. Neúplné výsledky se mohou vztahovat na konkrétní operaci nebo řadu. Opakované testování vzorků lze provést z odpovídajících zkumavek se vzorkovým pufrem ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu () minutu vortexem a začněte částí Provoz systému BD MAX. Vysvětlení varování a kódů chyb najdete v uživatelské příručce k systému BD MAX (část Řešení potíží ). SELHÁNÍ EXTERNÍ KONTROLY Externí kontroly musí poskytovat očekávané výsledky. Pokud je třeba zopakovat testování vzorků kvůli chybnému výsledku externí kontroly, vzorky je nutné nabrat z příslušných zkumavek se vzorkovým pufrem a otestovat spolu s čerstvě připravenými externími kontrolami ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu () minutu vortexem a začněte částí Provoz systému BD MAX. 7

8 KULTIVACE KLINICKÝCH VZORKŮ Chcete-li provést testování citlivosti na antibiotika nebo epidemiologickou typizaci, proveďte kultivaci klinických vzorků z odběrového zařízení (štětičky) před provedením postupu v části Příprava vzorku (metodou naočkování misek) nebo po provedení postupu Příprava vzorku (metodou obohaceného bujónu). Těsně po ukončení úvodního cyklu PCR můžete před kultivací štětičky uložit dle nemocničních postupů při teplotě 2 8 C po dobu maximálně 36 hodin do zkumavky se vzorkovým pufrem. OMEZENÍ POSTUPU Tento výrobek slouží ke zpracování vzorků z nosních výtěrů odebraných pomocí odběrových a přepravních médií uvedených v bodu Potřebné vybavení a materiál, které nejsou součástí dodávky. Účinnost stanovení BD MAX StaphSR při používání jednoduché nebo dvojité štětičky Liquid Amies nebyla stanovena. Tento produkt je určen pro použití pouze se systémem BD MAX. Nesprávné výsledky testu mohou být následkem nesprávného odběru, nesprávné manipulace či nesprávného skladování vzorku, technické chyby či záměny vzorků nebo mohou být způsobeny tím, že počet mikroorganismů ve vzorku je pod analytickou citlivostí testu. Aby nedocházelo k chybným výsledkům, je nutné pečlivě dodržovat pokyny uvedené v této příbalové informaci a v uživatelské příručce k systému BD MAX. Nezbytným předpokladem řádné funkce tohoto stanovení je správná laboratorní technika. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je nutno velmi pečlivě zachovávat čistotu všech materiálů a činidel. Kontrolní testování určuje stav kolonizace v daném čase. Míra kolonizace se může lišit v závislosti na léčbě pacienta (např. dekolonizační režim), stavu pacienta (např. přechodná kolonizace kmeny SA nebo MRSA) nebo na expozici vysoce rizikovému prostředí (např. kontakt s přenašečem SA nebo MRSA nebo déletrvající hospitalizace). Stav kolonizace monitorujte podle zásad vašeho pracoviště. Pozitivní výsledek ze stanovení BD MAX StaphSR nemusí signalizovat selhání léčby DNA může v organismu přetrvávat. Negativní výsledek po předchozím pozitivním výsledku testu může značit úspěšnou eradikační léčbu nebo může ukazovat na přechodnou kolonizaci. Pozitivní výsledek testu nemusí znamenat výskyt životaschopných mikroorganismů. Pozitivní výsledek indikuje přítomnost DNA SA nebo MRSA. Stanovení BD MAX StaphSR detekuje současně gen meca nebo mecc nesený v kazetě SCCmec a sekvenci specifickou pro S. aureus, která se nachází ve větvení kazety SCCmec a genu orfx (MREJ). Stanovení BD MAX StaphSR také detekuje gen nuc specifický pro S. aureus. Stanovení BD MAX StaphSR je určeno pro detekci genotypů MREJ i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv a xxi, které představují většinu genů meca a mecc obsahujících kmeny MRSA (patřící různým typům SCCmec/MREJ), na které dosud celosvětově připadá více než 98 % kmenů testovaných pomocí BD. Schopnost stanovení BD MAX StaphSR detekovat jiné genotypy MREJ není známa. Stanovení BD MAX StaphSR nehlásí hraniční oxacilin-rezistentní S. aureus (BORSA) jako MRSA (pouze jako SA). Mechanismus rezistence na oxacilin v kmenech BORSA je způsoben zvýšenou produkcí β-laktamáz, nikoli geny meca nebo mecc. Kmeny BORSA jsou vzácné. Účinnost stanovení BD MAX StaphSR při detekci modifikovaného S. aureus (MOD-SA) není známa, jelikož tyto kmeny dosud nebyly vyhodnoceny. Mechanismus rezistence na oxacilin v kmenech MOD-SA je způsoben změnou afinity proteinů vázajících penicilin u oxacilinu. Kmeny MOD-SA jsou vzácné. Stanovení BD MAX StaphSR bude při testování nazálních vzorků se souběžnou kolonizací methicilin rezistentním, koaguláza negativním kmenem Staphylococcus (MRCoNS) a kmenem SA citlivým na methicilin ve variantě prázdné kazety. Souběžná kolonizace MRCoNS a SA citlivým na methicilin ve variantě prázdné kazety je vzácná. Jako u všech diagnostických testů in vitro, založených na PCR, je i zde možná detekce extrémně nízkých hladin cílové sekvence pod limitem detekce stanovení (LoD), ale tyto výsledky nemusejí být reprodukovatelné. Tobramycin může způsobovat inhibici stanovení BD MAX StaphSR (další podrobnosti viz část Interferující látky ). Falešně negativní výsledky mohou vzniknout při ztrátě nukleové kyseliny způsobené nesprávným odběrem, přepravou nebo uchováváním vzorků anebo při nedostatečné lýze bakteriálních buněk. Přidání kontroly zpracování vzorku do testu pomáhá identifikovat vzorky, které obsahují inhibitory amplifikace PCR a slouží jako kontrola integrity reagencie a systému jako celku. Kontrola zpracování vzorku nenaznačí, zda ke ztrátě nukleové kyseliny došlo nesprávným odběrem, přepravou nebo uchováváním vzorků anebo byla nedostatečná lýza bakteriálních buněk. Při přítomnosti vysokých koncentrací MRSE ve smíšené kultuře může být detekce MRSA nebo SA variabilní. Kompetice vlivem MRSE byla pozorována při poměru MRSA:MRSE : x 0 2 a při poměru SA:MRSE : 0 5. Při přítomnosti vysokých koncentrací MSSA ve smíšené kultuře může být detekce MRSA variabilní. Kompetice vlivem MSSA byla pozorována při poměru MRSA:MSSA : 0 3. Výsledky stanovení BD MAX StaphSR někdy mohou být nejednoznačné kvůli neplatnému výsledku kontroly zpracování vzorku nebo neurčité či neúplné kvůli selhání přístroje. V takovém případě je nutné opakování testu, což může způsobit zdržení konečných výsledků. Mutace či polymorfismus v oblastech vážících primer či sondu mohou zkreslit detekci nových či neznámých variant MRSA nebo SA s následkem falešně negativních výsledků stanovení BD MAX StaphSR. Jako u všech diagnostických testů in vitro jsou i zde pozitivní a negativní prediktivní hodnoty vysoce závislé na prevalenci. Funkčnost stanovení BD MAX StaphSR může kolísat v závislosti na prevalenci a testované populaci. Stanovení BD MAX StaphSR vyžaduje použití čtyř (4) optických kanálů systému BD MAX: kanál FAM ( nm), kanál ROX ( nm), kanál VIC (530/565 nm) a kanál Cy5.5 (680/75 nm). Účinnost zbývajícího optického kanálu nebyla u tohoto stanovení určena. 8

9 OČEKÁVANÉ HODNOTY Během klinické studie stanovení BD MAX StaphSR bylo získáno celkem 2393 průkazných výsledků ze vzorků vhodných na úrovni vzorků a PCR. Tyto výsledky byly získány na 3 geograficky odlišných klinických místech a porovnány s přímou a obohacenou kultivací. Testovaný soubor byl rozdělen do kategorie hospitalizovaných pacientů a ambulantních pacientů. V níže uvedené tabulce naleznete počet a procento pozitivních případů určených stanovením BD MAX StaphSR: Skupina Celkový počet vzorků Počet pozitivních vzorků MRSA Hospitalizovaní pacienti Ambulantní pacienti Stanovení BD MAX StaphSR Počet pozitivních vzorků SA Celkem Celkový počet vzorků založený na vyhovujících výsledcích PCR. Procento pozitivních MRSA 0,2 % (72/683) 3,9 % (28/70) 8,4 % (200/2393) Procento pozitivních SA 32,4 % (545/683) 25,6 % (82/70) 30,4 % (727/2393) SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI Klinická účinnost Klinické specifické vlastnosti účinnosti stanovení BD MAX StaphSR byly zjišťovány v multicentrické prospektivní výzkumné studii. Do studie byla zapojena tři (3) výzkumná centra. Pacienti museli k zařazení do studie splnit podmínky testování MRSA nebo SA podle zásad pracoviště. Požadavky na způsobilost pro cílový screening podle zásad klinického zařízení mimo jiné zahrnovaly: pacienti přijatí do konkrétního zdravotnického systému; pacienti hospitalizovaní na jednotce intenzivní péče; pacienti před plánovanou operací; pacienti přijatí do zařízení pro dlouhodobou péči. Byly vyloučeny vzorky od pacientů, kteří byli do studie již dříve zařazeni. Srovnávací referenční metoda sestávala z přímé kultivace doplněné obohacenou kultivací. Test obohacené kultivace byl dokončen pro všechny vzorky, které byly negativní u MRSA nebo SA při přímé kultivaci. Předběžné kolonie S. aureus pozorované na selektivních (S. aureus) chromogenních médiích byly subkultivovány na krevní agar (BA). Identifikace byla potvrzena testem na bázi aglutinace, rezistence vůči methicilinu byla potvrzena difúzním diskovým testem citlivosti (30 μg). Obohacení v sójové živné půdě Trypticase s 6,5 % NaCl (TSB 6,5 % NaCl) bylo dokončeno v případě, že MRSA nebo SA nebylo potvrzeno počáteční metodou přímé kultivace. Živná půda Turbid TSB s 6,5 % NaCl byla použita k inokulaci dalšího chromogenního média a destiček BA; byl proveden potvrzovací test MRSA popsaný výše. Výsledky testování získané stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční metodou Do studie bylo zařazeno celkem 245 vzorků. Z těchto vzorků jich 94 bylo shledáno jako nesplňující kritéria protokolu a čtyři (4) zcela vyhovující vzorky podaly nevykazovatelné konečné výsledky PCR. Bylo použito celkem 2353 výsledků vzorků k určení klinické účinnosti stanovení BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční metodou (tabulky až 4). Ve srovnání s referenční metodou (přímá/obohacená kultivace) bylo pomocí stanovení BD MAX StaphSR identifikováno 93, % vzorků pozitivních na MRSA a 97,8 % vzorků negativních na MRSA (tabulky a 2). U zkoumané populace to mělo za následek negativní prognostickou hodnotu (NPV) 99,5 % a pozitivní prognostickou hodnotu (PPV) 75,5 %. Tabulka : Výsledky testování MRSA získané stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční metodou Všechna centra Referenční metoda MRSA Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Stanovení BD MAX StaphSR Negativní Celkem Sensitivita: 93, % (49/60) (95 % CI: 88, %, 96, %) Specifita: 97,8 % (245/293) (95 % CI: 97, %, 98,3 %) PPV: 75,5 % (95 % CI: 70,0 %, 80,5 %) NPV: 99,5 % (95 % CI: 99, %, 99,7 %) Bylo provedeno další šetření vzorků, jejichž výsledky získané referenční metodou se neshodovaly s výsledky získané stanovením BD MAX StaphSR. z 48 falešně pozitivních vzorků MRSA získaných pomocí BD MAX StaphSR bylo shledáno jako pozitivní po zopakování referenční metody. 5 z falešně negativních vzorků MRSA získaných pomocí BD MAX StaphSR bylo shledáno jako negativní po zopakování referenční metody. 9

10 Tabulka 2: Výsledky mezi centry získané pro MRSA stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční metodou Klinická centra Prevalence a Sensitivita (95 % CI) b Specificita (95 % CI) b Centrum 4,3 % (4/960) Centrum 2 5,8 % (38/650) Centrum 3 0,6 % (8/765) Souhrnně 6,7 % (60/2375 c ) a Prevalence je založena pouze na referenční metodě. b Interval spolehlivosti c 2375 vzorků bylo vhodných pro referenční metodu. 92,7 % (38/4) (80,6 %, 97,5 %) 86,8 % (33/38) (72,7 %, 94,2 %) 96,3 % (78/8) (89,7 %, 98,7 %) 93, % (49/60) (88, %, 96, %) 99,0 % (909/98) (98, %, 99,5 %) 98,6 % (584/592) (97,4 %, 99,3 %) 95,5 % (652/683) (93,6 %, 96,8 %) 97,8 % (245/293) (97, %, 98,3 %) Ve srovnání s referenční metodou (přímá/obohacená kultivace) bylo pomocí stanovení BD MAX StaphSR identifikováno 92,0 % vzorků pozitivních na SA a 93,2 % vzorků negativních na SA (tabulky 3 a 4). U zkoumané populace toto znamená negativní prognostickou hodnotu (NPV) 96,9 % a pozitivní prognostickou hodnotu (PPV) 83,8 %. Tabulka 3: Výsledky testování SA získané stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční metodou Všechna centra Stanovení BD MAX StaphSR Referenční metoda SA Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Negativní Celkem Sensitivita: 92,0 % (599/65) (95 % CI: 89,7 %, 93,9 %) Specifita: 93,2 % (587/702) (95 % CI: 92,0 %, 94,3 %) PPV: 83,8 % (95% CI: 8,3 %, 86, %) NPV: 96,9 % (95% CI: 96,0%, 97,6%) Bylo provedeno další šetření vzorků, jejichž výsledky získané referenční metodou se neshodovaly s výsledky získané stanovením BD MAX StaphSR. 28 z 5 falešně pozitivních vzorků SA získaných pomocí BD MAX StaphSR bylo shledáno jako pozitivní po zopakování referenční metody. 23 z 52 falešně negativních vzorků SA získaných pomocí BD MAX StaphSR bylo shledáno jako negativní po zopakování referenční metody. Tabulka 4: Výsledky mezi centry získané pro SA stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční metodou Klinická centra Prevalence a Citlivost s 95 % CI b Specificita s 95 % CI b Centrum 27,2 % (26/960) Centrum 2 27,5 % (79/650) Centrum 3 27,8 % (23/765) Souhrnně 27,5 % (653/2375 c ) a Prevalence je založena pouze na referenční metodě. b Interval spolehlivosti c 2375 vzorků bylo vhodných pro referenční metodu. 90,0 % (235/26) (85,8 %, 93, %) 9,5 % (62/77) (86,5 %, 94,8 %) 94,8 % (202/23) (9,0 %, 97, %) 92,0 % (599/56) (89,7 %, 93,9 %) 96,3 % (672/698) (94,6 %, 97,4%) 90,9 % (42/453) (88,0 %, 93,3 %) 9,3 % (503/55) (88,6 %, 93,4 %) 93,2 % (587/702) (92,0 %, 94,3 %) Výsledky získané pomocí stanovení BD MAX StaphSR ve srovnání s přímou kultivací Do studie bylo zařazeno celkem 245 vzorků. Z těchto vzorků jich 54 bylo shledáno jako nesplňující kritéria protokolu a šest (6) zcela vyhovujících vzorků podalo nevykazovatelné konečné výsledky PCR. Bylo použito celkem 239 výsledků vzorků k určení pozitivní a negativní procentuální shody stanovení BD MAX StaphSR ve srovnání s přímou kultivací (tabulky 5 až 8). Ve srovnání s přímou kultivací bylo pomocí stanovení BD MAX StaphSR identifikováno 96,5 % vzorků pozitivních na MRSA a 97,2 % vzorků negativních na MRSA (tabulky 5 a 6). 0

11 Tabulka 5: Výsledky testování MRSA získané pomocí stanovení BD MAX StaphSR ve srovnání s přímou kultivací Všechna centra Přímá kultivace Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Stanovení BD MAX StaphSR Negativní Celkem Procentuální shoda pozitivních: 96,5 % (37/42) (95 % CI: 92,0 %, 98,5 %) Procentuální shoda negativních: 97,2 % (286/2249) (95 % CI: 96,4 %, 97,8 %) Tabulka 6: Výsledky mezi centry získané pro MRSA stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční přímou kultivací Klinická centra Procentuální shoda pozitivních s 95 % CI a Procentuální shoda negativních s 95 % CI a Centrum Centrum 2 Centrum 3 Souhrnně a Interval spolehlivosti 00 % (35/35) (90, %, 00 %) 93,5 % (29/3) (79,3 %, 98,2 %) 96, % (73/76) (89,0 %, 98,6 %) 96,5 % (37/42) (92,0 %, 98,5 %) 98,7 % (92/924) (97,7 %, 99,3 %) 98,0 % (587/599) (96,5 %, 98,9 %) 94,6 % (687/726) (92,7 %, 96,0 %) 97,2 % (286/2249) (96,4 %, 97,8 %) Ve srovnání s přímou kultivací bylo pomocí stanovení BD MAX StaphSR identifikováno 95, % vzorků pozitivních na SA a 9 % vzorků negativních na SA (tabulky 7 a 8). Tabulka 7: Výsledky testování SA získané pomocí stanovení BD MAX StaphSR ve srovnání s přímou kultivací Všechna centra Přímá kultivace Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Stanovení BD MAX StaphSR Negativní Celkem Procentuální shoda pozitivních: 95, % (564/593) (95 % CI: 93, %, 96,6 %) Procentuální shoda negativních: 9,0 % (637/798) (95 % CI: 89,6 %, 92,3 %) Tabulka 8: Výsledky mezi centry získané pro SA stanovením BD MAX StaphSR ve srovnání s referenční přímou kultivací Klinická centra Procentuální shoda pozitivních s 95 % CI a Procentuální shoda negativních s 95 % CI a Centrum Centrum 2 Centrum 3 Souhrnně a Interval spolehlivosti 93,0 % (23/229) (89,0 %, 95,7 %) 94,9 % (49/57) (90,3 %, 97,4 %) 97,6 % (202/207) (94,5 %, 99,0 %) 95, % (564/593) (93, %, 96,6 %) 93,4 % (682/730) (9,4 %, 95,0 %) 88,6 % (49/473) (85,4 %, 9, %) 90, % (536/595) (87,4 %, 92,2 %) 9,0 % (637/798) (89,6 %, 92,3 %) Z celkového počtu 2399 vzorků z nosních výtěrů testovaných stanovením BD MAX StaphSR, které vyhovovaly na úrovni vzorků a PCR, byl počáteční výsledek nejednoznačný u 7 (0,7 %). Počet nejednoznačných vzorků byl po opakovaném testování 0, % (3/2399) (tabulka 9). Nejednoznačné výsledky po prvním testování 0,7 % (7/2399)* (95 % CI: 0,4%,, %) Tabulka 9: Nejednoznačné výsledky *Celkový počet založený na vyhovujících vzorcích a výsledcích stanovení BD MAX StaphSR. Nejednoznačné výsledky po zopakování 0, % (3/2399) (95 % CI: 0%, 0,4 %)

12 Ze stejných 2399 vzorků z nosních výtěrů testovaných stanovením BD MAX StaphSR byl počáteční výsledek určen jako neurčitý u 4 (0,6 %). Po opakovaném testu nezůstal žádný výsledek určený jako neurčitý (testování nebylo zopakováno u dvou vzorků). U osmi (8) (0,3 %) byl počáteční výsledek neúplný. Po opakovaném testu nezůstal žádný výsledek určený jako neúplný (testování nebylo zopakováno u jednoho vzorku). Varianty prázdné kazety Aby byl vzorek identifikován jako MRSA-pozitivní pomocí stanovení BD MAX StaphSR, musí být získán pozitivní výsledek pro cílovou sekvenci MREJ i pro meca nebo mecc (gen nuc není povinný). Vzorek, který obsahuje cílovou sekvenci MREJ, ale zároveň neobsahuje gen meca ani mecc je MRSA-negativní, jelikož je citlivý na methicilin. K této situaci dojde, pokud je gen meca nebo mecc vyjmut z kazety SCCmec, avšak fragment pravé části větvení (MREJ) zůstane, díky čemuž bude výsledek MREJ-pozitivní. Tento typ vzorku je někdy označován jako varianta prázdné kazety. Díky schopnosti detekovat geny meca a mecc může stanovení BD MAX StaphSR správně rozlišit tuto variantu a určit ji jako SA POS; MRSA NEG. Z celkem 2354 způsobilých vzorků zahrnutých do stanovení klinické účinnosti (tabulka ) jich celkem 0 odpovídalo profilu prázdné kazety, kdy došlo k detekci sekvence MREJ bez detekce genu meca nebo mecc. U všech 0 těchto vzorků bylo ověřeno, že jsou skutečně MRSA-negativní a SA-pozitivní podle referenční metody. Analytická senzitivita Analytická citlivost (Limit of Detection, LoD) stanovení BD MAX StaphSR byla určena následovně: pozitivní vzorky byly připraveny namočením tampónů do široké škály bakteriální suspenze MRSA nebo MSSA připravené a kvantifikované z kultur. Mezi testovanými kmeny bylo kmenů MRSA zastupujících genotypů MREJ (i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv a xxi), které odpovídají 5 typům SCCmec (I, II, III, IV a XI), a 2 kmeny MSSA. Tyto tampóny poté byly vyluhovány v simulované nosní matrici. Každý kmen MRSA a MSSA byl testován ve 24 replikátech pro každou koncentraci dvěma různými pracovníky s použitím tří různých výrobních šarží stanovení BD MAX StaphSR. Analytická citlivost (LoD) definovaná jako nejnižší koncentrace, při které mělo alespoň 95 % všech replikátů pozitivní výsledek, byla v rozmezí CFU/tampón (tabulka 0) při detekci kmenů MRSA a 74 2 CFU/ tampón (tabulka ) při detekci kmenů MSSA. Tabulka 0: Analytická citlivost při zjišťování genotypů MRSA stanovením BD MAX StaphSR Kmen MRSA Genotyp MREJ Typ SCCmec Koncentrace LoD [CFU/tampón (95 % Cl 2 )] Typ i I 9 (55, 50) 2 Typ ii II 0 (68, 76) 3 Typ iii III 8 (02, 322) 4 Typ iv III 8 (48, 36) 5 Typ v IV 28 (74, 224) 6 Typ vi ND (246, 839) 7 Typ vii II 269 (34, 538) 8 Typ ix ND 3 99 (, 356) 9 Typ xiii ND 3 7 (4, 2) 0 Typ xiv ND 3 96 (57, 63) Typ xxi 4 XI 08 (64, 83) Typ SCCmec nekoreluje s typem MREJ, jelikož jde o dva odlišné způsoby typizace. 2 Cl: intervaly spolehlivosti 3 ND = neurčeno 4 Kmeny MRSA obsahující mecc (také znám jako kmen meca LGA25 ) Cl: intervaly spolehlivosti Tabulka : Analytická citlivost při zjišťování MSSA stanovením BD MAX StaphSR Kmen MSSA Koncentrace LoD [CFU/tampón (95 % Cl )] 74 (88, 346) 2 2 (04, 429) Analytická inkluzivita Byla provedena studie analytické inkluzivity při použití různých kmenů MRSA a MSSA a bylo přihlédnuto ke geografickému původu, genotypu MREJ (divoký typ a mutantní), typu SCCmec, typu pulzní elektroforézy (PFGE), časovým diverzitám a vzorci citlivosti. V této studii bylo testováno sedmdesát sedm (77) kmenů MRSA z 27 zemí a 5 kmenů MSSA z 6 zemí, včetně kmenů z veřejných odběrů a řádně charakterizovaných klinických izolátů, včetně vankomycin rezistentních kmenů Staphylococcus aureus (VRSA) a vankomomycin-intermediárních kmenů Staphylococcus aureus (VISA). Stanovení BD MAX StaphSR detekovalo MREJ typů i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv a xxi při testování s malou dávkou bakterií (2 3 LoD). Stanovení BD MAX StaphSR detekovalo MRSA SCCmec typů I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII a XI a rovněž typy MRSA PFGE USA 00 až 800, 000 a 00 při 2 3 LoD. Byly také detekovány všechny kmeny MRSA vykazující dodatečnou rezistenci vůči vankomycinu (VRSA a VISA). Stanovení BD MAX StaphSR detekovalo všech 5 testovaných kmenů MSSA včetně meca variant prázdných kazet. 2

13 Vyhodnocení pomocí panelu řádně charakterizovaných provokačních kmenů Byla provedena dodatečná analytická studia s cílem zhodnotit analytickou účinnost stanovení BD MAX StaphSR pomocí panelu řádně charakterizovaných provokačních kmenů: Sedmnáct (7) ze 7 kmenů MRSA s nízkými a vysokými minimálními inhibičními koncentracemi oxacilinu (MIC), včetně PFGE typů USA 00 až 800, 000, PFGE typu IV/IBERIAN a varianty mecc (kmen S. aureus LGA25 obsahující meca), které byly testovány při koncentraci 2 3 LoD, poskytlo výsledky SA POS, MRSA POS. Čtyři (4) ze 4 kmenů BORSA (hraniční oxacilin-rezistentní S. aureus) testované při koncentraci 0 6 CFU/tampón poskytly výsledky SA POS, MRSA NEG. Pět (5) z 5 kmenů MSSA testovaných při koncentraci 0 6 CFU/tampón poskytlo výsledky SA POS, MRSA NEG. Jeden () z methicilin rezistentního kmenu Staphylococcus epidermidis (MRSE) testovaný při koncentraci 0 6 CFU/tampón poskytl negativní výsledek (SA NEG, MRSA NEG). Analytická specificita Stanovení BD MAX StaphSR bylo provedeno pomocí systému BD MAX na vzorcích obsahujících vysoké množství necílových organismů a kmenů MSSA, aby byla prokázána specificita stanovení při detekování MRSA a SA. Patnáct (5) z 5 kmenů MSSA varianty prázdné kazety testovaných při koncentraci 0 6 CFU/tampón poskytlo výsledky SA POS, MRSA NEG. Padesát sedm (57) z 57 kmenů různých nestafylokokových druhů bylo testováno při koncentraci 0 6 CFU/ml (s výjimkou druhu Cryptococcus neoformans, který byl testován při koncentraci CFU/tampón) poskytlo negativní výsledky (SA NEG, MRSA NEG). Čtyřicet pět (45) kmenů stafylokoku negativních na koagulázu (CONS) a stafylokoku pozitivních na koagulázu (COPS) zastupujících 28 druhů bylo testováno při koncentraci 0,5 McFarlandovy normy pomocí stanovení BD MAX StaphSR. Čtyřicet pět (45) z 45 testovaných kmenů poskytlo negativní výsledky (SA NEG, MRSA NEG). Padesát (50) z 50 kmenů MSSA testovaných při vysokých koncentracích ( 0 6 CFU/tampón) poskytlo výsledky SA POS, MRSA NEG. Sedmnáct (7) virů zastupujících 2 virových druhů bylo testováno při koncentraci 0 5 PFU/ml. Všech 7 virů poskytlo negativní výsledky (SA NEG, MRSA NEG). Interferující látky Dvacet devět (29) mikroorganismů a chemických látek, které se příležitostně používají v nosních dutinách nebo které se nacházejí na nosních výtěrech, bylo vyhodnoceno z hlediska potenciální interference se stanovením BD MAX StaphSR (tabulka 2). Vzorky negativní na MRSA a vzorky pozitivní na MRSA byly testovány při koncentraci 2 3 LoD s nejvyšší koncentrací každé látky nebo mikroorganismu pravděpodobně se nacházejícího v místě odběru nebo na vzorku nosního výtěru. Výsledky neprokázaly žádnou průkaznou interferenci u žádného z mikroorganismů ani chemické látky s výjimkou Tobramycinu, který vykazoval inhibici stanovení BD MAX StaphSR během testování při koncentraci 4,5 0-3 g/tampón. Tabulka 2: Endogenní a komerční exogenní látky testované pomocí stanovení BD MAX StaphSR Látka Výsledek Látka Výsledek Mucin, z hovězích podčelistních žláz NI Rhinocort aqua* NI Oftalmický roztok dexametazonu fosforečnanu sodného Zicam* No-Drip Liquid* Nasal NI USP, 0, % ekvivalent dexametazon fosforečnanu Gel* Extreme Congestion Relief* NI Chloraseptic* NI Flutikason propionát NI Taro-Mupirocin, Mupirocin Ointment USP, 2 % NI Luffeel* NI Long Lasting Dristan* Nasal Mist NI Staphylococcus epidermidis NI Neo-Synephrine* NI Micrococcus luteus NI Equate* Nasal Spray Decongestant NI Enterococcus faecium NI Beconase AQ* NI Enterococcus faecalis NI Flunisolide Nasal Solution USP, 0,025 % NI Escherichia coli NI Nasacort* AQ NI Corynebacterium flavescens NI Nasonex* NI Moraxella catarrhalis NI Relenza* NI Staphylococcus hominis poddruh hominis NI Tobramycin I Haemophilus influenzae NI Krev NI Streptococcus pneumoniae NI Flumist* NI NI: Neexistuje průkazná interference se stanovením BD MAX StaphSR. I: Existuje průkazná interference se stanovením BD MAX StaphSR. Kompetiční mikrobiální inhibiční vliv Potenciální mikrobiální inhibiční vliv byl hodnocen pomocí: zvyšující se koncentrace MRSE při souběžném přidání nízké koncentrace ( 2 LoD) MRSA nebo MSSA, a zvyšující se koncentrace MSSA při souběžném přidání nízké koncentrace ( 2 LoD) MRSA. 3