Dokumentační údaje. MAX Enteric Viral Panel. Revize / datum Část Souhrn změn. (03) Obsah Zásady postupu Tabulka činidel a materiálů

Transkript

1 MAX Enteric Viral Panel P0231(03) Česky Dokumentační údaje Revize / datum Část Souhrn změn (03) Obsah Zásady postupu Tabulka činidel a materiálů Varování a bezpečnostní opatření Návod k použití / příprava vzorků Interpretace výsledků Analytická inkluzivita Tabulka 10 Stránka / Španělský překlad: Přidaný obsah v EN a ES. Aktualizovaný popis kličky odpovídající štítku na obalu. Aktualizovaný popis kličky odpovídající štítku na obalu. Přidán text Nutné pro použití testu. Přidána nová druhá odrážka. Aktualizovaný popis kličky odpovídající štítku na obalu. Objasnění částečné interpretace UNR Opravena prahová hodnota LoD pro testované kmeny. Opraveny hlavičky sloupců Přidán španělský překlad. 1

2 MAX Enteric Viral Panel P0231(03) Pro diagnostiku in vitro Pro použití se systémem BD MAX Česky 4 I ÚČEL POUŽITÍ BD MAX Enteric Viral Panel (Panel na enterální viry) v systému BD MAX je automatizovaný diagnostický test in vitro pro přímou kvalitativní detekci a diferenciaci enterálních virových patogenů. Panel na enterální viry BD MAX detekuje nukleové kyseliny následujících virů: norovirus GI a GII, rotavirus A, adenovirus F40/41, sapovirus (genoskupiny I, II, IV, V), lidský astrovirus (hastro). Testování se provádí na nekonzervované měkké až průjmovité stolici nebo vzorcích stolice konzervovaných přípravkem Cary-Blair od symptomatických pacientů se suspektní akutní gastroenteritidou, enteritidou nebo kolitidou. Test se provádí přímo na vzorku za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase k amplifikaci DNA/RNA relevantního cílového genu. Tento test využívá fluorogenních hybridizačních sond specifických pro gen k detekci amplifikované DNA. Tento test je určen k použití v kombinaci s klinickými údaji, laboratorními nálezy a epidemiologickými informacemi jako pomůcka při diferenciální diagnostice infekcí viry norovirus GI a GII, rotavirus A, adenovirus F40/41, sapovirus (genoskupiny I, II, IV, V), a hastro. Výsledky tohoto testu nepoužívejte jako výhradní základ pro diagnózu, léčbu ani jiné rozhodování o péči o pacienta. Pozitivní výsledky nevylučují koinfekci jiným organismem, který tento test nedetekuje. Výsledek tudíž nelze použít jako výhradní nebo definitní příčinu onemocnění pacienta. Negativní výsledky u pacienta s klinickými projevy odpovídajícími gastroenteritidě mohou být způsobeny infekcí patogeny, které tento test nedetekuje, nebo neinfekčními příčinami jako ulcerózní kolitida, syndrom dráždivého střeva nebo Crohnova nemoc. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Organismy způsobující enterální onemocnění jsou významnou příčinou morbidity a mortality po celém světě. Enterální patogeny vstupují do těla přes gastrointestinální trakt a typicky se šíří kontaminovanou potravou a vodou nebo kontaktem se zvratky či stolicí. Centra pro kontrolu a prevenci onemocnění (CDC, USA) odhadují, že každý rok dochází v USA k 48 milionům případům onemocnění přenášených potravou, vedoucím k hospitalizacím a úmrtím. 1 V rozvojových zemích způsobují tato onemocnění ročně přibližně 2 miliony úmrtí malých dětí. 2 Každý z kauzálních agens může vést k lehce odlišné symptomatologii, včetně břišních křečí nebo bolesti, ztráty chuti k jídlu, nevolnosti nebo zvracení; všechny však vedou k průjmu. 3 Opakované průjmy a perzistentní průjmovité onemocnění narušují střevní funkci a vstřebávání a potenciálně vedou k podvýživě dítěte a zpomalení růstu. 4 Panel na enterální viry BD MAX analyzovaný v systému BD MAX je schopen poskytnout výsledky pro cíle panelu na enterální viry BD MAX u 24 vzorků za přibližně 3 hodiny. Panel na enterální viry BD MAX současně detekuje specifické patogeny potenciálně zodpovědné za gastroenteritidu: norovirus GI a GII, rotavirus A, adenovirus F40/41, sapovirus (genoskupiny I, II, IV, V) a hastro. Součástí testu je interní kontrola zpracování vzorku. Panel na enterální viry BD MAX automatizuje testování a minimalizuje zásah ze strany obsluhy od doby vložení vzorku do systému BD MAX do poskytnutí výsledků. 2

3 Vzorek měkké až průjmovité stolice se odebere a převeze do laboratoře, projde homogenizací a kličkou se nanese do zkumavky BD MAX Enteric Viral Panel Sample Buffer Tube (Zkumavka se vzorkovým pufrem pro panel na enterální viry). Zkumavka se vzorkovým pufrem se umístí do systému BD MAX a budou provedeny následující automatizované postupy: proběhne lýza virových kapsid, DNA/RNA se extrahuje a zkoncentruje na magnetických kuličkách a získaný poměrný vzorek DNA/RNA se přidá k činidlům pro PCR, která obsahují primery specifické pro geny k amplifikaci cílových genetických oblastí v kazetě BD MAX PCR Cartridge (Kazeta k PCR), jsou-li přítomna. Součástí testu je také kontrola zpracování vzorku. Kontrola zpracování vzorku je součástí extrakční zkumavky a při provedení kroků extrakce, koncentrace a amplifikace slouží k monitorování inhibujících látek či selhání přístroje nebo činidla. Po vložení klinického vzorku, jednotky BD MAX Unitized Reagent Strip (Modulární jednotka s činidly) a kazety k PCR BD MAX do systému BD MAX již není nutný žádný zásah obsluhy. Systém BD MAX provádí automaticky lýzu, extrakci a koncentraci DNA/RNA, rehydrataci činidel, amplifikaci nukleové kyseliny a detekci cílové sekvence nukleových kyselin pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase. Amplifikované cílové sekvence jsou detekovány pomocí hydrolyzačních sond značených zhášenými fluorofory. Amplifikaci, detekci a interpretaci signálů provádí automaticky systém BD MAX. ZÁSADY POSTUPU Vzorky stolice jsou odebrány od subjektů a přepraveny do laboratoře nekonzervované v čisté nádobě nebo konzervované v transportním médiu Cary-Blair. Kličku zasuňte do vzorku do hloubky kličky a krouživým pohybem vzorek aplikujte do zkumavky se vzorkovým pufrem BD MAX, která je součástí soupravy panelu na enterální viry BD MAX. Zkumavka se vzorkovým pufrem je uzavřena víčkem se septem, promíchána vortexem a přenesena do systému BD MAX. Po vytvoření pracovního seznamu a vložení vzorku do přístroje BD MAX spolu s jednotkou BD MAX Enteric Viral Panel Unitized Reagent Strip (Modulární jednotka s činidly panelu na enterální viry) a kazetou k PCR BD MAX se zpracování zahájí a již není nutný žádný zásah obsluhy. Systém BD MAX provádí automaticky přípravu vzorku včetně lýzy cílového organismu, extrakce a koncentrace DNA/RNA, rehydratace činidel a amplifikace a detekce cílové sekvence nukleové kyseliny pomocí PCR v reálném čase. Systém BD MAX automaticky interpretuje signál. Stanovení také zahrnuje kontrolu zpracování vzorku, která je součástí zkumavky Extraction Tube (Extrakční zkumavka). Prochází extrakcí, koncentrací a amplifikací. Kontrola zpracování vzorku slouží k ověřování přítomnosti potenciálních inhibičních látek a selhání systému nebo činidel. Po enzymatické lýze virů za zvýšené teploty se uvolněné nukleové kyseliny zachytí na magnetických kuličkách s afinitou. Kuličky s navázanými nukleovými kyselinami jsou promyty a uvolní se nukleové kyseliny. Eluovaná DNA/RNA je neutralizována a přenesena do směsi master mix, kde rehydratuje činidla PCR. Po rehydrataci roztoku systém BD MAX nadávkuje daný objem roztoku připraveného pro PCR do kazety k PCR BD MAX. Systém před zahájením PCR uzavře mikroskopické uzávěry v kazetě k PCR BD MAX, aby před zahájením konverze RNA na cdna reverzní transkriptázou z PCR a následné PCR v reálném čase nedošlo k odpařování a kontaminaci amplikony. Amplifikované cílové sekvence DNA jsou detekovány pomocí hydrolyzačních sond (TaqMan), které jsou na jednom konci označené fluorescenčním barvivem zářiče (fluoroforem) a na druhém konci zhášečem. Sondy značené různými fluorofory se používají k detekci amplikonů cílových virů (norovirus GI a GII, rotavirus A, adenovirus F40/41, sapovirus (genoskupiny I, II, IV, V) a hastro) a amplikonů kontroly zpracování vzorku ve čtyřech různých optických kanálech systému BD MAX. Když jsou sondy v nativním stavu, fluorescence fluoroforu je zhášena jeho polohou blízko ke zhášeči. V přítomnosti cílové sekvence DNA však sondy hybridizují s komplementárními sekvencemi a jsou hydrolyzovány 5 3 exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy, která provádí syntézu nascentního řetězce podél templátu cdna. Tím je fluorofor separován od molekul zhášeče a dojde k emitování fluorescence. Systém BD MAX monitoruje tyto signály při každém cyklu a po interpretaci dat na konci programu poskytne konečný výsledek. ČINIDLA A MATERIÁL REF Obsah Množství BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix (D6) Suchá směs master mix PCR obsahující DNA polymerázu, nukleotidy, cílové sondy a sondy specifické pro kontrolu zpracování vzorku a primery. BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix (D5) Suchá směs master mix PCR obsahující DNA polymerázu, nukleotidy, cílové sondy a sondy specifické pro kontrolu zpracování vzorku a primery. BD MAX Enteric Viral Panel Unitized Reagent Strips Jednotky s činidly obsahující všechna kapalná činidla a jednorázové špičky na pipety pro zpracování vzorku a extrakci DNA/RNA. BD MAX Enteric Viral Panel Extraction Tube (D4) Suché extrakční činidlo obsahující magnetické kuličky s afinitou k DNA/RNA, proteinázu K a kontrolu zpracování vzorků. 24 testů (2 12 zkumavek) 24 testů (2 12 zkumavek) 24 testů 24 testů (2 12 zkumavek) BD MAX Enteric Viral Panel Sample Buffer Tube 24 testů (2 12 zkumavek) BD MAX Disposable Inoculation Loops (nutné pro použití testu) 30 Víčka se septem 25 3

4 POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A MATERIÁL, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY BD MAX PCR Cartridges (Kazety k PCR) (katalog BD Diagnostic Systems, katalogové č ) VWR Multi-Tube Vortexer (Vortex pro více zkumavek) nebo ekvivalent (katalog VWR, katalogové č ) Vortex Genie 2 nebo ekvivalent (VWR, katalogové č ) Nalgene Cryogenic Vial Holder (Držák kryogenních lahviček) (VWR, katalogové č ) Stojan kompatibilní s vortexem pro více zkumavek (např. držák kryogenních lahviček nebo ekvivalent) Laboratorní plášť a jednorázové rukavice bez talku Stopky či budík Pro nekonzervovaný typ vzorku stolice: Suché, čisté nádoby pro odběr vzorků tekuté nebo měkké stolice Pro konzervovaný typ vzorku stolice: Transportní média Cary-Blair (15 ml) VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Nebezpečí H360 Může poškodit reprodukční schopnost nebo plod v těle matky. P280 Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné brýle/obličejový štít. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P202 Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny bezpečnostní pokyny a neporozuměli jim. P308+P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P405 Skladujte uzamčené. P501 Odstraňte obsah / obal v souladu s místními / regionálními / národními / mezinárodními předpisy. Panel na enterální viry BD MAX slouží pouze pro diagnostiku in vitro. BD MAX Disposable Inoculating Loops (jednorázové inokulační kličky) jsou nutné k použití s panelem na enterální viry BD MAX. Jsou baleny spolu s testovací soupravou. Běžné kličky, bez ohledu na jejich typ a objem, se nedoporučuje používat. Nejsou validovány na výkon panelu na enterální viry BD MAX. Místní, státní a federální zákony a předpisy upravující povinné hlášení onemocnění se neustále aktualizují a zahrnují několik organismů, které jsou důležité pro sledování a šetření epidemií. 5,6 Laboratoře nesou sami zodpovědnost za dodržování svých státních a/nebo místních předpisů upravujících přenosné patogeny. Pokyny k předávání izolátů a/nebo klinického vzorku na požádání poskytnou místní a/nebo státní laboratoře veřejného zdraví. Tento produkt lze použít pouze se systémem BD MAX. Nepoužívejte prošlá činidla ani materiály. Nepoužívejte sadu, pokud je štítek, kterým je přelepena vnější krabice, při dodání porušený. Nepoužívejte činidla, pokud jsou ochranné sáčky při dodání otevřeny či protrženy. Nepoužívejte činidla, pokud v sáčcích s činidly desikant není nebo je jeho balení uvnitř sáčku porušené. Nevyjímejte desikant ze sáčků s činidly. Po každém použití rychle uzavřete zipem ochranné sáčky s činidlem. Před uzavřením ze sáčků odstraňte přebytečný vzduch. Chraňte činidla před teplem a vlhkostí. Dlouhodobý kontakt s vlhkým prostředím může negativně ovlivnit funkčnost produktu. Nepoužívejte činidla, pokud je fólie protržena či poškozena. Nemíchejte činidla z různých sáčků a/nebo sad a/nebo šarží. Nezaměňujte uzávěry ani je znovu nepoužívejte, protože může dojít ke kontaminaci a zkreslení výsledků testu. Zkontrolujte správné naplnění kapalin v modulárních jednotkách s činidly (ujistěte se, že kapaliny jsou na dně zkumavek) [viz obrázek 1]). Zkontrolujte, že v modulárních jednotkách s činidly se nacházejí všechny pipetové špičky (viz obrázek 1). S roztoky chemikálií pracujte opatrně, aby nedošlo ke změně čitelnosti čárového kódu na zkumavce se směsí master mix nebo extrakční zkumavce. Nezbytným předpokladem řádné funkce tohoto stanovení je správná laboratorní technika. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je nutno velmi pečlivě zachovávat čistotu všech materiálů a činidel. V případě, že se v laboratoři provádějí jiné testy PCR, je nutno standardním laboratorním způsobem zajistit, aby nedošlo ke kontaminaci panelu na enterální viry BD MAX, případných dalších činidel používaných k testování ani systému BD MAX. Vždy zamezte veškeré kontaminaci činidel mikroby a deoxyribonukleázou (DNázou) a ribonukleázou (RNázou). Před manipulací s činidly a kazetami musí být vyměněny rukavice. Kazety k PCR BD MAX po použití nerozlamujte, aby nedošlo ke kontaminaci prostředí amplikony. Uzávěry na kazetách k PCR BD MAX slouží k prevenci kontaminace. Laboratoř musí pravidelně monitorovat prostředí, aby se minimalizovalo riziko zkřížené kontaminace. Analýza panelu na enterální viry BD MAX bez dodržení doporučovaného času a teplotního rozmezí pro přepravu a skladování vzorků může vést k neplatným výsledkům. Stanovení, která se neprovedou v uvedeném časovém a teplotním rozmezí, je třeba opakovat. Podle doporučení a požadavků místních, krajských či celostátních předpisů nebo požadavků akreditačních organizací může být potřeba testovat další kontroly. 4

5 Se vzorky vždy zacházejte jako s infekčními a v souladu s bezpečnostními postupy laboratoře, jaké jsou například popsány v publikacích CLSI Document M29 7 a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 8 Při manipulaci se všemi činidly používejte ochranný oděv a jednorázové rukavice. Po provedení testu si pečlivě umyjte ruce. Nepipetujte ústy. V místech, kde je manipulováno se vzorky a činidly ze sady, nekuřte, nepijte a nejezte. Nepoužitá činidla a odpad zlikvidujte v souladu s celostátními, krajskými a místními předpisy. Další varování, bezpečnostní opatření a postupy naleznete v uživatelské příručce k systému BD MAX 9. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Odebrané vzorky a nekonzervovanou stolici nebo stolici konzervovanou v 15 ml transportního média Cary-Blair je nutné během transportu uchovávat v rozmezí 2 25 C. Chraňte před vysokými teplotami. Vzorek lze před testováním skladovat až 120 hodin (5 dnů) při teplotě 2 8 C nebo až 48 hodin při teplotě 2 25 C. Směs master mix panelu na enterální viry BD MAX je při teplotě 2 25 C stabilní do uplynutí data exspirace. Nepoužívejte prošlé komponenty. Zkumavky se směsí master mix panelu na enterální vzorky BD MAX jsou dodávány v uzavřených sáčcích. Po otevření sáčky ihned uzavřete. Chráníte tím produkty před vlhkostí. Zkumavky se směsí master mix jsou po počátečním otevření a opětovném uzavření v sáčku stabilní po dobu až 14 dnů při teplotě 2 25 C. NÁVOD K POUŽITÍ Odběr a přeprava vzorků Abyste získali kvalitní vzorek, musíte pečlivě dodržovat postup odběru. Vzorky tekuté nebo měkké stolice jsou odebrány do suché, čisté nádoby následujícím postupem: 1. Nekonzervované vzorky: Přeneste vzorek tekuté nebo měkké stolice do suché, čisté nádoby. Zabraňte kontaminaci vzorku vodou, močí, toaletním papírem nebo mýdlem. Nádobu označte a odešlete do laboratoře podle standardního postupu nemocnice (viz část Skladování a stabilita). 2. Konzervované vzorky Cary-Blair: Přeneste vzorek tekuté nebo měkké stolice do 15mL transportního zařízení dle pokynů výrobce. Zabraňte kontaminaci vzorku vodou, močí, toaletním papírem nebo mýdlem. Nádobu označte a odešlete do laboratoře podle standardního postupu nemocnice (viz část Skladování a stabilita). Příprava vzorku POZNÁMKA: Pro testování každého vzorku a externí kontroly je třeba jedna (1) vzorková zkumavka s pufrem, jedno (1) víčko se septem, dvě (2) zkumavky se směsí master mix (D6 a D5), jedna (1) extrakční zkumavka (D4) a jedna (1) modulární jednotka s činidly. Vyjměte potřebný počet produktů z ochranného sáčku nebo krabice. Z otevřených sáčků se zkumavkami se směsí master mix nebo extrakčními zkumavkami před uzavřením odstraňte přebytečný vzduch a poté je uzavřete zipem. 1. Zkumavku se vzorkovým pufrem BD MAX (s čirou zátkou) označte příslušnou identifikací vzorku. Nepřekrývejte, nepřepisujte čárový kód 2D ani přes něj nelepte štítky. 2. Promíchejte nekonzervované vzorky nebo konzervované vzorky Cary-Blair vysokou rychlostí ve vortexu po dobu 15 sekund. 3. Sejměte průhledné víčko ze zkumavky se vzorkovým pufrem a inokulujte následovně: a. Vložte jednorázovou inokulační kličku do hloubky, ve které bude celá kličková část ponořena ve vzorku. Nezavádějte kličku hlouběji, jelikož případné další množství stolice na tyčince může vést k přetížení reakce PCR. b. Vložte kličku se vzorkem do zkumavky se vzorkovým pufrem a aplikujte vzorek krouživým pohybem. POZNÁMKA: Odstranění celého vzorku z kličky není nezbytné. Výsledný roztok ve zkumavce se vzorkovým pufrem by měl mít barvu odpovídající vyluhovanému čaji. 4. Znovu zavíčkujte inokulovanou zkumavku se vzorkovým pufrem pomocí víčka se septem. 5. Vložte zkumavku se vzorkovým pufrem do stojanu kompatibilního s vortexem pro více zkumavek, pokud jej máte k dispozici (např. držák kryogenních lahviček nebo ekvivalent). 6. Opakujte kroky 1 až 5 při přípravě dalších vzorků k testování. Než začnete pracovat s dalšími vzorky, ujistěte se, že jsou vaše rukavice čisté. 7. Všechny vzorky současně promíchejte vortexem pro více zkumavek při maximální rychlosti po dobu jedné (1) minuty. 8. Dle části Provoz systému BD MAX proveďte testování panelu na enterální viry BD MAX v systému BD MAX. Provoz systému BD MAX POZNÁMKA: Podrobné pokyny naleznete v uživatelské příručce k systému BD MAX 9 (viz část Provoz). POZNÁMKA: Testování panelu na enterální viry BD MAX musí být provedeno ihned po kroku promíchání uvedeném výše (viz část Příprava vzorku, krok 7). Pokud je nutné testování provést znovu, vzorek před tím znovu promíchejte. 1. Zapněte napájení systému BD MAX (pokud to už nebylo provedeno) a přihlaste se vložením hodnot <user name> (Uživatelské jméno) a <password> (Heslo). 2. Před manipulací s činidly a kazetami musí být vyměněny rukavice. 3. Vyjměte potřebný počet modulárních jednotek s činidly ze sady panelu na enterální viry BD MAX. Každou modulární jednotkou s činidly lehce klepněte na tvrdý povrch tak, aby všechny kapaliny byly na dně zkumavek. 4. Vyjměte z ochranných sáčků potřebný počet extrakčních zkumavek a zkumavek se směsí master mix ze soupravy panelu na enterální viry BD MAX. 5

6 5. Odstraňte přebytečný vzduch a sáčky uzavřete zipem. 6. Pro každý testovaný vzorek umístěte jednu (1) modulární jednotku s činidly do stojanu BD MAX System Rack (Stojan systému) tak, že začnete v poloze 1 stojanu A. 7. Zatlačte jednu (1) extrakční zkumavku (D4) (s bílou fólií) do každé modulární jednotky s činidly v poloze 1 podle obrázku Zatlačte jednu (1) zkumavku se směsí master mix panelu na enterální viry BD MAX (D6) (se zelenou fólií) do každé modulární jednotky s činidly v poloze 2 podle obrázku Zatlačte jednu (1) zkumavku se směsí master mix panelu na enterální viry BD MAX (D5) (s modrou fólií) do každé modulární jednotky s činidly v poloze 4 podle obrázku 1. Obrázek 1: Zatlačení extrakčních zkumavek panelu na enterální viry BD MAX a zkumavek se směsí master mix panelu na enterální viry BD MAX do modulární jednotky s činidly 10. Klikněte na záložku Run (Operace), poté na dílčí záložku Inventory (Kontrolní přehled), zadejte číslo šarže soupravy pro panel na enterální viry BD MAX a číslo šarže směsi master mix pro panel na enterální viry BD MAX (pro možnost sledování šarže) načtením čárového kódu skenerem nebo ručním zadáním. POZNÁMKA: Krok 10 zopakujte pokaždé, když použijete novou šarži. 11. Přejděte na obrazovku Worklist (Pracovní seznam). Z rozbalovací nabídky vyberte možnost <BD MAX ENT VIR 49>. 12. Z rozbalovací nabídky zvolte odpovídající číslo šarže soupravy (na vnější krabici panelu na enterální viry BD MAX) a číslo šarže směsi master mix pro panel na enterální viry BD MAX. 13. Do pracovního seznamu zadejte ID zkumavky se vzorkovým pufrem panelu na enterální viry BD MAX, ID pacienta a přístupové číslo (je-li to možné) načtením čárového kódu skenerem nebo ručním zadáním. 14. Zopakujte krok 13 pro všechny zbývající zkumavky se vzorkovým pufrem. 15. Zkumavky se vzorkovým pufrem vložte do stojanu systému BD MAX tak, aby rozložení odpovídalo modulárním jednotkám s činidly zavedeným v krocích 6 až 9. POZNÁMKA: Umístěte zkumavky se vzorkovým pufrem do stojanu na vzorky tak, že štítky s 1D čárovým kódem směřují ven (pro snazší skenování zkumavek se vzorkovým pufrem při přihlašování vzorku). 16. Umístěte požadovaný počet kazet k PCR BD MAX do systému BD MAX (viz obrázek 2). Na každé kazetě k PCR BD MAX lze provést 1 zpracování s maximálně 12 vzorky, celkem tedy zpracovat 12 vzorků. Systém BD MAX automaticky vybere polohu a řadu na kazetě k PCR BD MAX pro každé zpracování. Na každé kazetě k PCR BD MAX lze provést 1 zpracování a ke každému stojanu připadne 1 kazeta. Pro zefektivnění využití kazet k PCR BD MAX vyberte v režimu 2000 Sample Mode na kartě Worklist (Pracovní seznam) možnost Run Wizard (Průvodce zpracováním) a určete přidělení drah. Další informace naleznete v uživatelské příručce 9 k systému BD MAX. 6

7 Obrázek 2: Vložení kazet k PCR BD MAX 17. Vložte stojan (stojany) do systému BD MAX (viz obrázek 3). Strana A Strana B Obrázek 3: Vložení stojanu (stojanů) do systému BD MAX 18. Zavřete víko systému BD MAX a kliknutím na tlačítko <Start> spustíte zpracování vzorků. 19. Po skončení zpracování ihned zkontrolujte výsledky nebo uchovejte zkumavky se vzorkovým pufrem při teplotě 2 8 C po dobu až 5 dnů (120 hodin) NEBO při teplotě 2 25 C po dobu až 48 h, dokud nezkontrolujete výsledky. POZNÁMKA: Pokud bylo při zpracování poškozeno víčko se septem, vyměňte je před uložením vzorku za nové. POZNÁMKA: Připravené zkumavky se vzorkovým pufrem BD MAX lze skladovat při teplotě 2 8 C po dobu maximálně 120 hodin (5 dnů) NEBO při teplotě 2 25 C po dobu maximálně 48 hodin. Při obdržení neurčitého (IND), nejednoznačného (UNR) nebo neúplného (INC) výsledku nebo při selhání externí kontroly je nutné provést opakovaný test z připravené zkumavky se vzorkovým pufrem v tomto období (viz část Opakované provedení testu). KONTROLA KVALITY Postupy kontroly kvality slouží k ověřování funkčnosti stanovení. Laboratoře musejí zavést počet, typ a četnost testování kontrolních materiálů podle doporučení či požadavků místních, krajských, celostátních, federálních nebo národních předpisů či požadavků akreditačních organizací a tímto způsobem sledovat účinnost celého analytického postupu. Základní informace o kontrole kvality najdete v dokumentech Clinical Laboratory Standards Institute MM3 10 a EP Společnost BD nedodává materiál pro externí kontroly. Software systému BD MAX nepoužívá k interpretaci výsledků testování vzorku externí pozitivní ani negativní kontroly. S externími kontrolami zachází, jako by se jednalo o pacientské vzorky. (Tabulka 2 vám umožní interpretovat výsledky stanovení externí kontroly.) 2. Do té doby, než je proces v systému BD MAX dostatečně ověřen, je třeba provádět alespoň jednu (1) externí pozitivní kontrolu a jednu (1) externí negativní kontrolu denně pro každou laboratoř. Snížená frekvence testování kontrol musí být v souladu se všemi platnými předpisy. 3. Externí pozitivní kontrola kontroluje zásadní selhání činidla. Externí negativní kontrola slouží k detekci kontaminace činidla či prostředí (nebo přenosu) cílovými nukleovými kyselinami. 7

8 4. Doporučují se různé typy externích kontrol, takže si uživatel může vybrat ty, které nejlépe vyhovují programu kontroly kvality v dané laboratoři. a. Externí negativní kontrola: Komerčně dostupný kontrolní materiál nebo předtím charakterizovaný vzorek s potvrzenou negativitou. Společnost BD doporučuje připravovat externí negativní kontrolu před externí pozitivní kontrolou, aby se zamezilo riziku potenciální kontaminace při přípravě kontrol. b. Externí pozitivní kontrola: Komerčně dostupný kontrolní materiál jako např. kmeny ZeptoMetrix níže (viz tabulka 1) nebo předtím charakterizovaný vzorek s potvrzenou pozitivitou. Tabulka 1: Komerčně dostupné kmeny pro externí pozitivní kontrolu Kmen pro externí pozitivní kontrolu Rekombinantní norovirus GI nebo GII Rotavirus A Adenovirus F40 nebo F41 Lidský astrovirus typ 4 nebo 8 Č. dílu ZeptoMetrix 0886CF nebo 0887CF ZeptoMetrix 0841CF nebo CF ZeptoMetrix 0884CF nebo 885CF ZeptoMetrix CF nebo CF Pro přípravu externího kontrolního roztoku doporučujeme naředit každou virovou kulturu v poměru 1 : 10 s TE pufrem. Inokulujte 5 μl suspenze viru do příslušné zkumavky se vzorkovým pufrem. Zpracujte a otestujte jako vzorek (viz části Příprava vzorku a Provoz systému BD MAX). 5. Všechny externí kontroly by měly poskytovat očekávané výsledky (pozitivní pro externí pozitivní kontrolu, negativní pro externí negativní kontrolu), bez přítomnosti chybových externích kontrol (nejednoznačné, neurčité, neúplné výsledky). 6. Externí negativní kontrola, která má pozitivní výsledek, naznačuje problém při manipulaci se vzorkem a/nebo kontaminaci. Prověřte techniku manipulace se vzorky, aby nedocházelo k záměnám a/nebo kontaminaci. Externí pozitivní kontrola, která má negativní výsledek, naznačuje problém při manipulaci se vzorkem nebo jeho přípravě. Prověřte techniku manipulace se vzorky a techniku jejich přípravy. 7. Externí kontrola, která má nejednoznačný, neurčitý nebo neúplný výsledek testu, naznačuje selhání činidla nebo systému BD MAX. Zkontrolujte, zda monitor systému BD MAX neukazuje chybové zprávy. Vysvětlení varování a chybových kódů naleznete v části Souhrn systémových chyb uživatelské příručky k systému BD MAX 9. Pokud problém trvá, použijte činidla z dosud neotevřeného sáčku nebo použijte novou sadu panelu na enterální viry BD MAX. 8. Každá extrakční zkumavka panelu na enterální viry BD MAX obsahuje kontrolu zpracování vzorku, což je posílená RNA konstrukce obsahující syntetickou cílovou sekvenci RNA. Kontrola zpracování vzorku se extrahuje, eluuje a amplifikuje společně s DNA/RNA přítomnou ve zpracovávaném vzorku, čímž zajistí předvídatelnost stanovení. Kontrola zpracování vzorku ověřuje účinnost zachycení, promytí a eluce DNA/RNA během přípravy vzorku a také účinnost konverze na DNA, amplifikace cílové sekvence DNA a její detekce při analýze PCR. Pokud kontrola zpracování vzorku nesplní validační kritéria, výsledek vzorku je hlášen jako nejednoznačný. Případné pozitivní (POS) výsledky stanovení však jsou hlášeny a žádné cílové sekvence nebudou označeny jako negativní (NEG). Položka bude hlášena dle směsi master mix. Nejednoznačný výsledek naznačuje inhibici související se vzorkem nebo selhání činidla. Každý vzorek hlášený jako nejednoznačný musí být znovu otestován podle níže uvedeného postupu v části Opakované provedení testu. 8

9 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky jsou dostupné pod záložkou <Results> (Výsledky) v okně <Results> (Výsledky) na monitoru systému BD MAX. Software systému BD MAX automaticky interpretuje výsledky testu. Výsledky se hlásí pro každý z analytů a pro kontrolu zpracování vzorku. Podle stavu amplifikace cílové sekvence a kontroly zpracování vzorku může být výsledek testu NEG (negativní), POS (pozitivní) nebo UNR (nejednoznačný). Výsledky IND (neurčitý) nebo INC (neúplný) jsou způsobeny selháním systému BD MAX. V případě částečného UNR, kde jeden nebo více cílů poskytne výsledek POS a všechny ostatní výsledky budou vyhodnoceny jako UNR, nebude cíl s výsledkem UNR nazýván NEG. Položky budou hlášeny dle směsi master mix. Interpretace výsledků enterálních virů BD MAX je popsána v tabulce 2. HLÁŠENÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ NoV POS RoV POS AdV POS hastv POS SaV POS NoV NEG RoV NEG AdV NEG hastv NEG SaV NEG NoV UNR RoV UNR AdV UNR hastv UNR SaV UNR Neurčité (IND) Neúplný (INC) Tabulka 2: Interpretace výsledků panelu na enterální viry BD MAX INTERPRETACE VÝSLEDKU Detekována RNA noroviru GI nebo GII Detekována RNA rotaviru A Detekována DNA adenoviru F40/F41 Detekována RNA hastro Detekována RNA sapoviru genoskupiny I, II, IV nebo V Nebyla detekována žádná RNA noroviru a byla detekována kontrola zpracování vzorku Nebyla detekována žádná RNA rotaviru A a byla detekována kontrola zpracování vzorku Nebyla detekována žádná DNA adenoviru F40/41 a byla detekována kontrola zpracování vzorku Nebyla detekována žádná RNA hastro a byla detekována kontrola zpracování vzorku Nebyla detekována žádná RNA sapoviru genoskupiny I, II, IV nebo V a byla detekována kontrola zpracování vzorku Nebyla detekována žádná RNA noroviru GI nebo GII a nebyla detekována žádná kontrola zpracování vzorku (značí inhibitor ve vzorku nebo selhání činidla) Nebyla detekována žádná RNA rotaviru A a nebyla detekována žádná kontrola zpracování vzorku (značí inhibitor ve vzorku nebo selhání činidla) Nebyla detekována žádná DNA adenoviru F40/F41 a nebyla detekována žádná kontrola zpracování vzorku (značí inhibitor ve vzorku nebo selhání činidla) Nebyla detekována žádná RNA hastro a nebyla detekována žádná kontrola zpracování vzorku (značí inhibitor ve vzorku nebo selhání činidla) Nebyla detekována žádná RNA sapoviru genoskupiny I, II, IV nebo V a nebyla detekována žádná kontrola zpracování vzorku Neurčitý výsledek způsobený selháním systému BD MAX (doprovázen varovným hlášením či kódy chyb a ) Neúplné zpracování (doprovázen varovným hlášením či kódy chyb a ) a Vysvětlení varování a kódů chyb najdete v části Řešení potíží uživatelské příručky k systému BD MAX. 9 OPAKOVANÉ PROVEDENÍ TESTU POZNÁMKA: Je k dispozici dostatečný objem pro jedno opakování testu ve zkumavce se vzorkovým pufrem. U zkumavek se vzorkovým pufrem uchovávaných při teplotě 2 25 C musí být test zopakován do 48 hodin po úvodní inokulaci vzorku do zkumavky se vzorkovým pufrem. Také lze u zkumavek se vzorkovým pufrem uchovávaných při teplotě 2 8 C test provést do 120 hodin (5 dnů) po úvodní inokulaci vzorku do zkumavky se vzorkovým pufrem. Pro opakování testu může být použit také zbylý vzorek stolice, a to do 120 hodin (5 dnů), pokud je uchováván při teplotě 2 8 C, nebo do 48 hodin, pokud je uchováván při teplotě 2 25 C. POZNÁMKA: Vzorky k opakovanému testování i nové vzorky lze testovat ve stejném zpracování. NEJEDNOZNAČNÝ VÝSLEDEK Nejednoznačné výsledky mohou být získány v případě, kdy inhibice související se vzorkem nebo selhání činidla zabrání řádné amplifikaci cílové sekvence nebo kontroly zpracování vzorku. Pokud se kontrola zpracování vzorku neamplifikuje, vzorek je hlášen jako UNR. Případné pozitivní (POS) výsledky stanovení však jsou hlášeny a všechny ostatní cílové sekvence budou označeny jako UNR. Systém BD MAX hlásí výsledky pro každou cílovou sekvenci individuálně a výsledek UNR lze získat pro jeden nebo více cílových sekvencí panelu na enterální viry BD MAX. V případě úplného UNR, kde mají všechny cíle výsledek UNR, je nutné test zopakovat. V případě částečného výsledku UNR panelu enterálních virů BD MAX, kde jeden nebo více cílů poskytne výsledek POS a všechny ostatní výsledky budou UNR, je nutné test zopakovat dle postupu výše. Ve vzácných případech může dojít k neshodným výsledkům při opakování testu, kdy byly cíle v úvodu hlášeny jako POS. V takovém případě se ponechávají veškeré pozitivní výsledky. Opakované testování vzorků lze provést z odpovídajících zkumavek se vzorkovým pufrem ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu (1) minutu vortexem a začněte částí Provoz systému BD MAX. Pro opakované testování s novou zkumavkou se vzorkovým pufrem lze také ve výše uvedeném časovém rozpětí použít zbývající vzorky stolice. Začněte znovu částí Příprava vzorků. 9

10 NEURČITÝ VÝSLEDEK Neurčité výsledky mohou být obdrženy v případě, kdy došlo k selhání systému. Opakované testování vzorků lze provést z odpovídajících zkumavek se vzorkovým pufrem ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu (1) minutu vortexem a začněte znovu částí Provoz systému BD MAX. Pro opakované testování s novou zkumavkou se vzorkovým pufrem lze také ve výše uvedeném časovém rozpětí použít zbývající vzorky stolice. Začněte znovu částí Příprava vzorků. Vysvětlení varování a kódů chyb najdete v uživatelské příručce k systému BD MAX 9 (část Řešení potíží). NEÚPLNÝ VÝSLEDEK Neúplné výsledky mohou být získány v případě, kdy příprava vzorku nebo proces PCR nebyly dokončeny. Opakované testování vzorků lze provést z odpovídajících zkumavek se vzorkovým pufrem ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu (1) minutu vortexem a začněte znovu částí Provoz systému BD MAX. Pro opakované testování s novou zkumavkou se vzorkovým pufrem lze také ve výše uvedeném časovém rozpětí použít zbývající vzorky stolice. Začněte znovu částí Příprava vzorků. Vysvětlení varování a kódů chyb najdete v uživatelské příručce k systému BD MAX 9 (část Řešení potíží). SELHÁNÍ EXTERNÍ KONTROLY Externí kontroly musí poskytovat očekávané výsledky. Pokud je třeba zopakovat testování vzorků kvůli chybnému výsledku externí kontroly, vzorky je nutné nabrat z příslušných zkumavek se vzorkovým pufrem a otestovat spolu s čerstvě připravenými externími kontrolami ve výše uvedeném časovém rozpětí. Promíchávejte vzorky jednu (1) minutu vortexem a začněte znovu částí Provoz systému BD MAX. KULTIVACE VZORKŮ Kultivaci a identifikaci organismů z pozitivních vzorků je nutné provést dle laboratorních postupů. OMEZENÍ POSTUPU Tento produkt je určen pro použití pouze se systémem BD MAX. Tento produkt je určen k použití výhradně s nekonzervovanými vzorky lidské stolice a vzorky lidské stolice konzervovanými přípravkem Cary-Blair. Vzorky stolice z rektálních výběrů nebo pevné vzorky stolice nebyly k použití s panelem na enterální viry BD MAX validovány. Chybné výsledky testu mohou být následkem nesprávného odběru, nesprávné manipulace či nesprávného skladování vzorku, technické chyby či záměny vzorků nebo mohou být způsobeny tím, že počet mikroorganismů ve vzorku je pod analytickou citlivostí testu. Pokud je výsledek panelu na enterální viry BD MAX IND, INC nebo UNR (pro jeden nebo více cílů), test je nutné zopakovat. Pozitivní výsledek panelu na enterální viry BD MAX nemusí nutně znamenat výskyt životaschopných organismů. Nedokládá však přítomnost cílové DNA/RNA. Mutace či polymorfismus v oblastech vážících primer či sondu mohou zkreslit detekci nových či neznámých cílových variant s následkem falešně negativních výsledků s panelem na enterální viry BD MAX. Panel na enterální viry BD MAX současně detekuje norovirus GI a GII a nerozlišuje mezi těmito druhy. Panel na enterální viry BD MAX současně detekuje adenovirus F40/F41 a nerozlišuje mezi těmito druhy. Panel na enterální viry BD MAX současně detekuje sapovirus genoskupiny I, II, IV a V a nerozlišuje mezi těmito druhy. Jako u všech testů založených na PCR je i zde možná detekce extrémně nízkých hladin cílové sekvence pod limitem detekce stanovení (LoD), ale tyto výsledky nemusejí být reprodukovatelné. Falešně negativní výsledky mohou vzniknout při ztrátě nukleové kyseliny způsobené nesprávným odběrem, nesprávnou přepravou či nesprávným uchováváním vzorků nebo při nedostatečné lýze virů. Přidání kontroly zpracování vzorku do testu pomáhá identifikovat vzorky, které obsahují inhibitory amplifikace PCR a slouží jako kontrola integrity činidla a systému jako celku. Kontrola zpracování vzorku nenaznačí, zda ke ztrátě nukleové kyseliny došlo nesprávným odběrem, nesprávnou přepravou či nesprávným uchováváním vzorků nebo tím, že lýza virových kapsid byla nedostatečná. Výsledky panelu na enterální viry BD MAX je nutné použít jako doplněk klinického sledování a veškerých ostatních informací, které má lékař k dispozici. Jako u všech diagnostických testů in vitro jsou i zde pozitivní a negativní prognostické hodnoty vysoce závislé na prevalenci. Funkčnost panelu na enterální viry BD MAX může kolísat v závislosti na prevalenci a testované populaci. Výsledky panelu na enterální viry BD MAX mohou (ale nemusí) být ovlivněné souběžnou farmakoterapií, která může snížit množství přítomného cíle. Zkumavka se vzorkovým pufrem nebyla navržena jako prostředí podporující viabilitu organismu. Pokud je nutná kultivace, je třeba provést ji z originálního vzorku. Funkčnost tohoto testu nebyla stanovena pro monitorování léčby infekcí norovirem GI a GII, rotavirem A, adenovirem F40/41, sapovirem (genoskupiny I, II, IV, V) a virem hastro. Tento test je kvalitativní test a neposkytuje kvantitativní hodnoty ani množství přítomných organismů. Funkčnost tohoto testu nebyla hodnocena u imunokompromitovaných jedinců ani pacientů bez příznaků gastrointestinální infekce. Vliv interferujících látek byl hodnocen pouze u položek uvedených v této dokumentaci. Potenciální interference jiných látek než uvedených v části Interference níže nebyla hodnocena. Interference látek jiných než uvedených v části Interference níže může vést k chybným výsledkům. 10

11 Adenovirus typu 1 spojený s infekcemi u lidí může zkříženě reagovat s panelem na enterální viry BD MAX. Zkřížená reaktivita s organismy jinými než uvedenými v části Analytická specificita nebyla hodnocena. SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI Klinické specifické vlastnosti účinnosti panelu na enterální viry BD MAX byly zjišťovány v interní simulované klinické studii za použití klinicky získaných prospektivních a retrospektivních vzorků. Klinická studie zahrnovala vzorků, ze kterých bylo nekonzervováno a konzervováno přípravkem Cary-Blair. Funkční výsledky ze simulované klinické studie jsou uvedeny níže pro každý z cílů v tabulkách 3 až 7. Tabulka 3: Účinnost pro norovirus: Kombinované typy vzorků Referenční metoda BD MAX P N Celkem P N Celkem PPA (95 % CI): 93,8 % (88,7 %, 96,7 %) NPA (95 % CI): 99,5 % (98,9 %, 99,7 %) Tabulka 4: Účinnost pro rotavirus: Kombinované typy vzorků Referenční metoda BD MAX P N Celkem P N Celkem PPA (95 % CI): % (96,5 %, %) NPA (95 % CI): 99,5 % (99,0 %, 99,8 %) Tabulka 5: Účinnost pro adenovirus: Kombinované typy vzorků Referenční metoda BD MAX P N Celkem P N Celkem PPA (95 % CI): % (88,3 %, %) NPA (95 % CI): % (99,7 %, %) Tabulka 6: Účinnost pro sapovirus: Kombinované typy vzorků Referenční metoda BD MAX P N Celkem P N Celkem PPA (95 % CI): 87,5 % (77,2 %, 93,5 %) NPA (95 % CI): 99,3 % (98,7 %, 99,6 %) Tabulka 7: Účinnost pro lidský astrovirus: Kombinované typy vzorků Referenční metoda BD MAX P N Celkem P N Celkem PPA (95 % CI): 92,9 % (83,0 %, 97,2 %) NPA (95 % CI): 99,8 % (99,4 %, 99,9 %) 11

12 Výskyt nehlásitelných položek Úvodní výskyt nejednoznačných položek z prospektivních vzorků vyhodnocených v této studii byl 0,9 % pro vzorky konzervované přípravkem Cary-Blair a 2,2 % pro nekonzervované vzorky. Výskyt nejednoznačných položek po validním opakovaném testu byl pouze 0,1 % pro vzorky konzervované přípravkem Cary-Blair a 1,3 % pro nekonzervované vzorky (viz tabulka 8). Z prospektivních vzorků vyhodnocených v této studii bylo 0,5 % vzorků konzervovaných přípravkem Cary-Blair a 1,6 % nekonzervovaných vzorků hlášeno jako neurčité. Po validním opakovaném testu zůstalo pouze 0,1 % vzorků konzervovaných přípravkem Cary-Blair označených jako neurčité, přičemž žádné z nekonzervovaných vzorků nedostaly toto označení (viz tabulka 8). Z prospektivních vzorků vyhodnocených v této studii bylo 0,1 % vzorků konzervovaných přípravkem Cary-Blair a 0,4 % nekonzervovaných vzorků hlášeno jako neúplné. Po validním opakovaném testu zůstalo pouze 0,1 % vzorků konzervovaných přípravkem Cary-Blair označených jako neúplné, přičemž žádné z nekonzervovaných vzorků nedostaly toto označení (viz tabulka 8). Kombinovaný cíl Typ vzorku Konzervováno přípravkem Cary-Blair Nekonzervováno Tabulka 8: Výskyt nehlásitelných položek pro kombinovaný cíl (celkem) Výskyt nejednoznačných položek Výskyt neurčitých položek Výskyt neúplných položek Celkem Úvodní EVP (95 % CI) 0,9 9/952 (0,5, 1,8) 2,2 17/772 (1,4, 3,5) Kombinováno 1,5 26/1 724 (1,0, 2,2) Konečný EVP (95 % CI) 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 1,3 10/762 (0,7, 2,4) 0,6 11/1 705 (0,4, 1,2) Úvodní EVP (95 % CI) 0,5 5/952 (0,2, 1,2) 1,6 12/772 (0,9, 2,7) 1,0 17/1 724 (0,6, 1,6) Konečný EVP (95 % CI) 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 0,0 0/762 (0,0, 0,5) 0,1 1/1 705 (0,0, 0,3) Úvodní EVP (95 % CI) 0,1 1/952 (0,0, 0,6) 0,4 3/772 (0,1, 1,1) 0,2 4/1 724 (0,1, 0,6) Konečný EVP (95 % CI) 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 0,0 0/762 (0,0, 0,5) 0,1 1/1 705 (0,0, 0,3) Úvodní EVP (95 % CI) 1,6 15/952 (1,0, 2,6) 4,1 32/772 (3,0, 5,8) 2,7 47/1 724 (2,1, 3,6) Konečný EVP (95 % CI) 0,3 3/943 (0,1, 0,9) 1,3 10/762 (0,7, 2,4) 0,8 13/1 705 (0,4, 1,3) Analytická inkluzivita Do této studie byly zařazeny různé cílové kmeny stanovení panelu na enterální viry BD MAX. Kritéria zařazení kmenu zahrnovala prevalenci, serotyp a geografickou polohu (podle relevance). Bylo testováno padesát osm (58) kmenů včetně kmenů z veřejných odběrů a řádně charakterizovaných klinických izolátů. Testování inkluzivity zahrnovalo 22 kmenů noroviru GI a GII, 5 kmenů rotaviru, 10 kmenů adenoviru F40/F41, 11 kmenů sapoviru a 11 kmenů viru hastro. Kmeny byly testovány s 3x LoD (analytická citlivost) příslušného kmenu v nekonzervované stolicové matrix. Panel na enterální viry BD MAX správně identifikoval všech 58 kmenů testovaných v úvodním stanovení. 12

13 Analytická citlivost Analytická citlivost (LoD, Limit of Detection) panelu na enterální viry BD MAX byla určena následovně: Každý cílový organismus byl před zařazením do této studie připraven a kvantifikován. Individuální inokulační kličky byly ponořeny do každého z preparátů organismů a byly následně přeneseny do zkumavky se vzorkovým pufrem již obsahující fekální matrix (konzervovanou nebo nekonzervovanou), která byla předem potvrzena jako negativní pro všechny cíle detekované panelem na enterální viry BD MAX. Každý organismus byl testován minimálně 20 replikáty na typ vzorku (konzervované a nekonzervované) 2 pracovníky obsluhy s použitím 3 různých výrobních šarží panelu na enterální viry BD MAX. LoD pro specifický organismus byla potvrzena testováním minimálně 20 dalších replikátů při předem stanovené koncentraci LoD. Analytická citlivost (LoD) definovaná jako nejnižší koncentrace, při které mělo minimálně 95 % všech replikátů pozitivní výsledek, (viz Tabulka 9). Testovací organismus Norovirus Rotavirus Adenovirus Lidský astrovirus Sapovirus Tabulka 9: Analytická citlivost panelu na enterální viry BD MAX pro individuální cíle Kmen LoD pro nekonzervované vzorky (cp/ml ve stolici) LoD pro vzorky konzervované přípravkem Cary-Blair (cp/ml ve stolici) GI 6,28E+06 4,71E+06 GII 2,49E+05 2,49E+05 WA 6,46E+03 1,29E+04 Va70 1,16E+04 5,82E+03 F40 6,89E+04 2,75E+05 F41 8,16E+04 1,22E+05 Typ 4 1,75E+07 3,49E+07 Typ 8 5,23E+06 2,09E+07 GI 6,51E+07 6,51E+07 GII 1,94E+06 1,94E+06 Analytická specifičnost (křížová reaktivita a výlučnost) Panel na enterální viry BD MAX byl proveden na vzorcích obsahujících fylogeneticky příbuzné druhy a jiné organismy (bakterie, viry, parazity a kvasinky), které se pravděpodobně vyskytují ve vzorcích stolice. Bakteriální buňky, kvasinky, parazity a viry byly testovány ve zkumavce se vzorkovým pufrem při 10 6 CFU, buněk nebo ekvivalentů genomu na ml ve stolici nebo 10 5 PFU/ml ve stolici či TCID50/mL ve stolici. Celkem bylo testováno 112 organismů. Většina testovaných bakteriálních kmenů, kvasinek, parazitů a virů poskytla negativní výsledky s panelem enterálních virů BD MAX. Adenovirus typu 1 spojený s onemocněními u lidí poskytoval s panelem na enterální viry BD MAX pozitivní výsledky. Při 1,0 x 10 4,8 TCID50 jednotek/ml ve stolici však nebyly pro tento kmen zjištěny žádné pozitivní výsledky. Interferující látky Třicet dva (32) biologických a chemických látek, které mohou být přítomné ve vzorcích stolice, bylo vyhodnoceno z hlediska interference s panelem na enterální viry BD MAX. Tato studie zahrnovala antibiotickou směs sestávající z kombinace 7 různých současně testovaných antibiotik nebo analgetik. Tato antibiotika nebo analgetika zahrnovala naproxen sodný, ceftriaxon disodný, erytromycin, metronidazol, sulfametoxazol, tetracyklin hydrochlorid a trimetoprim. Hydrokortizonový krém interferuje dle testování na hladině vyšší než 25 % (objem/objem). Testování vakcíny RotaTeq také dle očekávání vedlo k pozitivním výsledkům, jelikož vakcína může být přítomna ve stolici až 9 dnů po vakcinaci. 12 Výsledky neprokázaly žádnou hlásitelnou interferenci s jinými testovanými látkami (viz tabulka 10). Kromě toho byly hodnoceny mikroorganismy, které mohou být endogenně přítomné ve vzorcích stolice, z hlediska interference s panelem na enterální viry BD MAX. Pět (5) organismů prošlo testováním ve vysoké koncentraci (1 x 10 6 buněk/ml stolice). Výsledky neprokázaly žádnou hlásitelnou interferenci s jakýmikoli testovanými mikroorganismy (viz tabulka 11). Tabulka 10: Endogenní a komerční exogenní látky testované pomocí panelu na enterální viry BD MAX Obchodní název nebo popis Výsledek Obchodní název nebo popis Výsledek Fekální tuk NI Spermicidní lubrikant NI Lidská DNA NI Čípek (glycerin) NI Hlen NI Vagisil NI Plná lidská krev NI Laxativa NI Hydrokortisonový krém I Přípravky proti průjmu (tekuté) NI Antiseptické hadříky NI Přípravky proti průjmu (tablety) NI Klystýr; minerální olej NI Směs antibiotik NI Gel na hemoroidy NI Antacida NI Nystatinový krém NI Nesteroidní antiflogistika (NSAID) NI Topické antibiotikum NI Vakcína RoV (rotavirus reassortant ATCC VR-2195 a VR-2415) NI I: Hlásitelná interference s panelem na enterální viry BD MAX při vysokých koncentracích. NI: Žádná hlásitelná interference s panelem na enterální viry BD MAX. 13

14 Tabulka 11: Mikroorganismy testované na interferenci s panelem na enterální viry BD MAX Mikroorganismus Salmonella typhimurium Escherichia coli Proteus vulgaris Enterococcus faecalis Peptostreptococcus anaerobius Výsledek NI NI NI NI NI NI: Žádná hlásitelná interference s panelem na enterální viry BD MAX. Smíšená infekce / kompetitivní interference Studie smíšené infekce / kompetitivní interference byla navržena s cílem vyhodnotit schopnost panelu na enterální viry BD MAX detekovat slabě pozitivní výsledky v přítomnosti jiných cílů ve vysokých koncentracích. Směs 2 ze 3 organismů (norovirus, rotavirus, adenovirus) pro směs master mix D6 nebo směs 1 ze 2 organismů (sapovirus, hastro) pro směs master mix D5 byly připraveny s 95. percentilem pozorovaným v klinické studii za účelem simulovat vysokou klinickou virovou nálož jako vysoké cíle ve zkumavce se vzorkovým pufrem panelu na enterální viry BD MAX. Analyt panelu na enterální viry BD MAX nepřítomný ve vysokých cílech byl přidán do zkumavky se vzorkovým pufrem v koncentraci odpovídající dvojnásobku příslušné LoD, tzn. cíl s nízkou virovou náloží, spolu s 5 μl nekonzervované stolice, a bylo provedeno testování v rámci simulace smíchaných infekcí. V přítomnosti vysokých virových náloží byly všechny organismy odpovídající příslušným preparátům simulujících smíchanou infekci úspěšně detekovány pomocí panelu na enterální viry BD MAX. Přesnost Přesnost panelu na enterální viry BD MAX v laboratoři byla ověřena na jednom pracovišti. Testování bylo provedeno v průběhu 12 dnů ve dvou zpracováních na den (každý 2 pracovníky obsluhy), celkem s 24 zpracováními. K vytvoření členů panelu pro tuto studii bylo použito pět specifických cílových organismů v různých koncentracích. Členy panelu byly: norovirus, rotavirus, adenovirus, sapovirus a hastro. Byly použity následující hodnoty jako úrovně přidání cílových organismů obsažených v jednotlivých členech panelu: Středně pozitivní (MP): 2,99x LoD Slabě pozitivní (LP): 1,99x LoD Skutečně negativní (TN): Bez cíle Do každého členu panelu byla přidána negativní nekonzervovaná stolicová matrix. Skutečně negativní vzorky neobsahovaly žádný cíl. Výsledky jsou shrnuty dle cíle a koncentrace v tabulce 12. Tabulka 12: Výsledek studie přesnosti za použití jedné šarže panelu na enterální viry BD MAX Shoda s očekávanými výsledky Kategorie Norovirus Rotavirus Adenovirus Sapovirus Lidský astrovirus TN (192/192) (98,0, ) 99,5 191/192 (97,1, 99,9) (192/192) (98,0, ) (192/192) (98,0, ) (192/192) (98,0, ) LP MP Reprodukovatelnost Studie reprodukovatelnosti mezi pracovišti byla provedena na třech (3) klinických pracovištích za použití jedné (1) šarže činidel. Dva (2) pracovníci obsluhy provedli 2 zpracování denně během pěti (5) samostatných dnů (nemuselo se jednat o po sobě následující dny), celkem 30 zpracování. Byly použity stejné panely, jako je popsáno v části Přesnost výše. Procentuální shody reprodukovatelnosti mezi pracovišti dosahovaly úrovně % pro všechny cíle, v rozmezí 97,8 až % pro LP a 96,7 až % pro MP. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 13. Výsledky kvantitativní reprodukovatelnosti mezi pracovišti a dle cíle jsou uvedeny v tabulce 13. Hodnoty Ct.Score a EP cyklu, interní kritéria používaná k určení konečného výsledku stanovení, byly zvoleny jako způsob hodnocení reprodukovatelnosti kvantitativního stanovení. Průměrná hodnota Ct.Score a průměrná hodnota EP cyklu s komponenty variability (směrodatná odchylka a variační koeficient v %) jsou uvedeny v tabulce

15 Tabulka 13: Výsledky studie reprodukovatelnosti mezi pracovišti při použití jedné šarže panelu na enterální viry BD MAX Kategorie TN LP MP Norovirus (360/360) Shoda s očekávanými výsledky Rotavirus Adenovirus Sapovirus (360/360) (360/360) (360/360) 97,8 (88/90) 96,7 (87/90) Lidský astrovirus (360/360) 98,9 (89/90) PCR Metric Ct. Score EP cyklu Tabulka 14: Kvantitativní výsledky studie reprodukovatelnosti mezi pracovišti pro panel na enterální viry BD MAX Parametr Norovirus Rotavirus Adenovirus Sapovirus Lidský astrovirus LP MP LP MP LP MP LP MP LP MP TN TN N Průměr 29,8 29,6 32,3 31,3 28,5 28,6 29,1 28,6 28,9 27,7 26,8 27,5 SO 0,41 0,43 0,66 0,52 0,65 0,62 0,44 0,50 0,45 0,32 0,27 0,37 %CV 1,4 1,4 2,0 1,7 2,3 2,2 1,5 1,7 1,6 1,2 1,0 1,3 N Průměr 4 553, ,3 737,5 925, , ,1 754,2 962, , , , ,9 SO 1 269, ,10 359,91 382,36 564,59 498,22 305,02 315, , , , ,77 %CV 27,9 42,8 48,8 41,3 52,9 45,4 40,4 32,7 36,8 26,5 13,5 25,4 Studie reprodukovatelnosti mezi šaržemi byla provedena na jednom (1) pracovišti za použití tří (3) šarží činidel. Dva (2) pracovníci obsluhy provedli 2 zpracování denně během pěti (5) samostatných dnů (nemuselo se jednat o po sobě následující dny), celkem 30 zpracování. Byly použity stejné panely, jako je popsáno v části Přesnost výše. Výsledky z 5 dnů studie přesnosti a správnosti byly použity k vytvoření údajů jedné šarže činidel pro studii srovnání šarží. Celková procentuální shoda reprodukovatelnosti mezi šaržemi dosahovala úrovně 99,7 až % pro TN, v rozmezí 97,8 až % a 98,9 až % a % pro LP, resp. MP. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 15. Kvantitativní výsledky mezi šaržemi a dle cíle jsou uvedeny v tabulce 22. Hodnoty Ct.Score a EP cyklu, interní kritéria používaná k určení konečného výsledku stanovení, byly zvoleny jako způsob hodnocení reprodukovatelnosti kvantitativního stanovení. Průměrná hodnota Ct.Score a průměrná hodnota EP cyklu s komponenty variability (směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient v % (%CV)) jsou uvedeny v tabulce 16. Kategorie TN LP MP Tabulka 15: Výsledky studie reprodukovatelnosti mezi šaržemi pro panel na enterální viry BD MAX Norovirus (360/360) Shoda s očekávanými výsledky Rotavirus Adenovirus Sapovirus 99,7 (359/360) (360/360) (360/360) 98,9 (89/90) SPC pro MM1 SPC pro MM2 Lidský astrovirus (360/360) PCR Metric Ct. Score EP cyklu Tabulka 16: Kvantitativní výsledky studie reprodukovatelnosti mezi šaržemi pro panel na enterální viry BD MAX SPC Norovirus Rotavirus Adenovirus Sapovirus Lidský astrovirus pro Parametr MM1 LP MP LP MP LP MP LP MP LP MP TN TN N Průměr 29,7 29,5 32,0 31,1 28,4 28,6 28,8 28,5 28,9 27,6 26,8 27,3 SO 0,41 0,35 0,46 0,35 0,54 0,53 0,36 0,74 0,42 0,33 0,39 0,45 %CV 1,4 1,2 1,5 1,1 1,9 1,9 1,3 2,6 1,5 1,2 1,5 1,7 N Průměr 4 945, , , , , , , , , , , ,9 SO 2 117, ,71 267,15 220,59 709,80 743,55 383,17 406,34 931,80 937,73 966, ,86 %CV 42,8 45,6 23,9 16,4 59,6 63,5 32,4 31,0 28,4 19,8 10,8 17,9 SPC pro MM2 Přenos / zkřížená kontaminace Byla provedena studie zkoumající přenos v rámci stejného zpracování a mezi dvěma zpracováními vzorků s vysokou virovou náloží analytů v panelu na enterální viry BD MAX. Panel obsahující jeden vysoce pozitivní člen z každé směsi master mix s jedním cílovým organismem a jedním negativním členem byl použit k přípravě mnoha vzorků. Adenovirus pro směs master mix D6 a lidský virus hastro pro směs master mix D5 byly použity jako zástupci členu panelu s vysokou pozitivitou pro každou směs master mix. Negativní člen panelu neobsahoval žádný cílový analyt. Dvanáct (12) replikátů vysoce pozitivního členu panelu a 12 replikátů negativního členu panelu bylo testováno v každém zpracování tak, že se negativní a pozitivní vzorky střídaly. Dva (2) pracovníci obsluhy provedli 3 po sobě následující zpracování na 3 přístrojích BD MAX, celkem tedy 9 zpracování s 24 vzorky. Ze 108 negativních vzorků testovaných v této studii poskytly dva vzorky pozitivní výsledek. 15