ENZYMY enzymová katalýza

Transkript

1 Základy biochemie KB / B EZYMY enzymová katalýza Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu Z / /0407 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

2 harakterizace enzymů a enzymové katalýzy Enzymy jsou katalyzátory biologických systémů umožňující chemické přeměny. Umožňují také transformaci jednoho druhu energie na druhý. Pro enzymy je charakteristická katalytická síla a specificita. Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované. Katalýza se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném AKTIVÍ MÍST. Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá SUBSTRÁT. Téměř všechny známé enzymy jsou proteiny (RA jsou pravděpodobně nejranější katalyzátory - ribozymy).

3 UREASA z fazolu Ureasa E ; systematický název: urea (močovina): amidohydrolasa; Enzym obsahuje i 2+ ; katalyzuje hydrolýzu močoviny na oxid uhličitý a amonné ionty. Při teplotě 20 o je rychlostní konstanta ureasou katalyzované reakce 3 x 10 4.sec -1. ekatalyzovaná reakce má rychlostní konstantu 3 x sec -1. Poměr rychlostních konstant: Katalytická síla ureasy je

4 Působení enzymů Enzymy urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce. eovlivňují rovnovážnou konstantu. apř. karbonátanhydrasa může katalyzovat hydrataci milionu molekul 2 za sekundu. Enzymy jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce (specifita účinku) a ve smyslu výběru substrátu (substrátová specifita). Enzymy snižují aktivační energii reakce. Tvoří komplex se substrátem.

5 Apoenzym, holoenzym, kofaktor, koenzym a prosthetická skupina Součástí enzymů jsou malé molekuly kofaktory. Proteinová část enzymu apoenzym. Katalyticky aktivní enzym holoenzym. Apoenzym + kofaktor = holoenzym. Kofaktory rozumíme neproteinové částice, obvykle nízké molekulové hmotnosti, které jsou nezbytné pro aktivitu enzymů. Kofaktory kovové ionty se nazývají aktivátory. rganické molekuly, které se dají od apoenzymu oddělit (např. hydrolýzou) se nazývají koenzymy. Kofaktory kovalentně vázané na apoenzym se označují jako prosthetická skupina.

6 Kovy Zn2+ Karbonátanhydrasa Zn2+ Karboxypeptidasa Mg2+ exokinasa i2+ Ureasa Mo itrátreduktasa Se Glutathionperoxidasa Mn2+ Superoxiddismutasa Enzymové kofaktory: Kofaktory Enzymy Koenzymy Thiaminpyrofosfát (TPP) Pyruvátdehydrogenasa Flavinadenindinukleotid (FAD) Monoaminoxidasa ikotinamidadenindinukleotid (AD+) Laktátdehydrogenasa Pyridoxalfosfát Glykogenfosforylasa Koenzym A (oa) Acetyl oakarboxylasa Biotin Paruvátkarboxylasa 5'- Deoxyadenosylkobalamin Methylmalonylmutasa Tetrahydrofolát Thymidylátsynthasa

7 Proteolytické enzymy (proteasy, proteinasy): Enzymy druhově nespecifické specifické na štěpenou vazbu. Mnohé katalyzující také reakce štěpení esterů což se využívá ke sledování jejich aktivity. Trypsin štěpí peptidovou vazbu v místě, kde je na straně karboxylu Lys nebo Arg. Thrombin, enzym podílející se na procesu srážení krve štěpí pouze vazbu Arg-Gly.

8 Vazebné místo peptidu štěpené trypsinem: Lysin nebo M sto hydrolytick ho t pen Arginin R R 2

9 Vazebné místo peptidu štěpené thrombinem: M sto hydrolytick ho t pen Arginin R Glycin

10 Třídy enzymů. Třídy enzymů Třída Katalyzovaná reakce Příklad 1. xidoreduktasy Alkoholdehydrogenasa xidačně-redukční 2. Transferasy Přenos skupin Proteinkinasy 3. ydrolasy Štěpení vazeb za účasti vody Trypsin 4. Lyasy Adice na dvojnou vazbu nebo odštěpení skupin za tvorby dvojné vazby Fumarasa 5. Isomerasy Izomerace (geometrické a strukturní změny uvnitř molekuly) Glukosafosfátmutasa Podřídy: 5. 1 racemasy nebo epimerasy 5. 2 cis-trans-isomerasy 5. 3 intramolekulaární oxidoreduktasy 5. 4 intramolekulární transferasy (mutasy) 5. 5 intramolekulární lyasy 5. 6 ostatní isomerasy 6. Ligasy Spojení dvou substrátů Karbamoylfosfát- za spotřeby ATP synthetasy

11 ázvosloví enzymů Triviální názvy např. ureasa, trypsin, pepsin. Systematické popis chemické reakce, kterou enzym katalyzuje, koncovka asa. apř. alkoholdehydrogenasa katalyzuje reakci (oxidaci alkoholu na aldehyd): Ethanol + akceptor elektronů = ethanal + redukovaný akceptor V tomto případě je akceptorem AD +, který se redukuje na AD + + (proton se uvolňuje do prostředí). AD + je nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma)

12 Systematická klasifikace enzymů dle enzymové komise (E): E x. y. z. p. čtyřciferný kód Příklad: Alkoholdehydrogenasa, E Systematický název: Alkohol:AD + oxidoreduktasa 1. oxidoreduktasy (oxidačně-redukční reakce) 1. 1 Působí na - skupinu donoru Akceptor AD + nebo ADP (pořadí enzymu v podpodtřídě)

13 Energetika enzymových reakcí Změna volné (Gibbsovy) energie je termodynamická funkce vedoucí k pochopení katalytického účinku enzymů. 1. Reakce probíhá samovolně, když má G negativní znaménko. 2. Systém je v rovnováze, když je G = Reakce neprobíhá samovolně, když je G pozitivní. Musí být dodána volná energie. egativní G neznamená, že reakce proběhne dostatečně rychle. Rychlost reakce závisí na volné aktivační energii G *.

14 Standardní volná energie a její vztah k rovnovážné konstantě reakce. A + B + D G = G o + RT ln [] [D] / [A] [B] G o = změna standardní volné energie Standardní podmínky: všechny reaktanty jsou přítomny v koncentracích 1,0 M. V biochemii: standardní stav p = 7. Aktivita + a vody je rovna 1. značení: G o.

15 Rovnovážná konstanta za standardních podmínek: K eq = [] [D] / [A] [B] G o = - 2, 303 RT log 10 K eq - Go / (2, 303 RT) K eq = 10 Při 25 o - Go / 1, 36 Po zjednodušení: K eq = 10

16 Enzymy snižují aktivační energii volnou energii aktivace P echodov stav, S G (nekatalyzovan ) Voln energie Substr t G (katalyzovan ) G reakce Sm r reakce Produkt

17 Závislost reakční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu. Reakce dosahuje limitní rychlosti, dříve označované jako maximální (V lim ). Limitn rychlost (V lim ) Reak n rychlost [v ] Koncentrace substr tu [S]

18 Modely interakce enzymu se substrátem Model zámek a klíč (lock and key) Substr t + Aktivn m sto a b Komplex ES c a b c Enzym

19 Model indukovaného přizpůsobení (induced fit) Substr t a + Aktivn m sto b c a b Komplex ES c Enzym

20 Enzymová kinetika. Rovnice Michaelise a Mentenové Kinetický popis aktivity enzymu. Reakční rychlost v o se obvykle vyjadřuje jako počet molů produktu vytvořených za sekundu. Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise a Mentenové: Tvorba komplexu enzym-substrát [ES] Měříme počáteční rychlost v o, kdy se nenahromadilo takové množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci. Ustálený stav koncentrace [ES] se nemění i když koncentrace substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby [ES] je shodná s rychlostí rozpadu [ES].

21 E + S k 1 ES k cat E + P k 2 Ust len stav Tvorba [ES] = Rozpad [ES] k 1 [E][S] = k 2 [ES] + k cat [ES] [E T ] = [E] + [ES] [E] = [E T ] - [ES] k 1 ([E T ] - [ES]) [E] = k 2 [ES] + k cat [ES] k 1 [E T ] [S] - k 1 [ES] [S] = k 2 [ES] + k cat [ES] k 1 [E T ] [S] = k 2 [ES] + k cat [ES] + k 1 [ES] [S] k 1 [E T ] [S] = [ES] (k 2 + k cat + k 1 [S]) k 1 [E T ] [S] [E T ] [S] [E T ] [S] [ES] = = = (k 2 + k cat + k 1 [S]) (k 2 + k cat + k 1 [S]) (k 2 + k cat ) / k 1 + [S] [E T ] [S] k 1 k 1 [ES] = K m = (k 2 + k cat ) / k 1 K m + [S] dp/ dt = v = k cat [ES] dp/ dt = v = k cat [E T ] [S] K m + [S] V lim = k cat [E T ] v = V lim [S] K m + [S] Rovnice Michaelise a Mentenov

22 v = V lim [S] K m +[S] Rovnice Michaelise a Mentenov 1 v = K +[S] m V [S] lim 1 v = K m V lim [S] + [S] V lim [S] 1 v = K m V lim [S] + 1 V lim Sklon = K m / V lim Pr se k = 1/ V lim Dvojn sobn reciprok rovnice Lineweavera a Burka

23 Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu (hyperbola): V lim V lim Po te n reak n rychlost [v ] V lim / 2 K m Koncentrace substr tu [S]

24 Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / v o proti 1 / [S] dle Lineweaver a Burka 1 / v o = K m / V lim. 1 / [S] + 1 / V lim 1 / [v ] Sklon = K m / V lim K m Pr se k =-1/ V lim Pr se k =-1/ 0 1 / [S]

25 Význam hodnot K m a V lim (max) Michaelisova konstanta: Závisí na typu substrátu a podmínkách, jako jsou p, teplota (doporučuje se 30 o ) a iontová síla roztoku. Dva základní významy K m : a) Koncentrace substrátu při které je substrátem obsazena polovina aktivních míst enzymu. dpovídá koncentraci substrátu in vivo. b) K m = (k -1 + k cat ) / k 1 je vztah mezi K m a rychlostními konstantami enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise a Mentenové.

26 V případě, že k -1 je mnohem větší než k cat to znamená, že ES komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt. Vztah se zjednoduší na K m = k -1 / k 1. Disociační konstanta komplexu ES je: K ES = [E] [S] / [ES] = k -1 / k 1 Jinými slovy: K m je v tomto případě rovno disociační konstantě komplexu ES. Vysoké hodnoty K m ukazují na nízkou afinitu substrátu k enzymu, a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.

27 odnoty K m některých vybraných enzymů a substrátů: Enzym Substrát K m ( µ M.L -1 ) Trypsin 000 -Benzoyl-Arg ethyester 3 Pyruvátkarboxylasa Pyruvát ATP 60 Penicillinasa Benzylpenicilin 50 Karbonátanhydrasa β -Galaktosidasa Laktosa exokinasa D-Glukosa 32 ATP Glukokinasa D-glukosa 340 ATP 250

28 Číslo přeměny enzymu Maximální nebo nověji nazvaná limitní rychlost enzymové reakce je číslo přeměny enzymu. Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na produkt enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné saturaci enzymu substrátem. azývá se také katalytická konstanta k cat.

29 Čísla přeměny (turnover numbers) některých enzymů: Enzym Číslo přeměny (sec) Karbonátanhydrasa Acetylcholinesterasa Penicilinasa Laktátdehydrogenasa hymotrypsin 100 Tryptofansynthetasa 2

30 Kinetická dokonalost enzymové katalýzy. Kriterium k cat / K m. V případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než K m je rychlost enzymové reakce rovna k cat což je číslo přeměny. Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem nasycen. Poměr [S] / K m je mezi 0, 01 až 1, 0. Za situace, kdy je [S] < < K m je rychlost enyzmové reakce mnohem menší než k cat, protože je mnoho aktivních míst neobsazeno.

31 Existuje nějaké číselné měřítko, které by charakterizovalo enzym za podmínek v buňce? Za podmínek, kdy je [S] < < K m závisí rychlost enzymové reakce na k cat /K m a na celkovém množství enzymu [ E ] T. Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci enzymu pro různé substráty. orním limitem je rychlost difůze substrátu do aktivního místa enzymu.

32 Estery aminokyselin jako substráty chymotrypsinu dle rostoucí hodnoty k cat / K m : Ester aminokyseliny (s -1 M -1 ) Vedlejší řetězec kcat /Km Glycin - 1, 3 x 10-1 Valin isopropyl 2, 0 orvalin n-propyl 3, 6 x 10 2 orleucin n-butyl 3, 0 x 10 3 Fenylalanin benzyl 1, 0 x 10 5 ejdokonalejším substrátem je fenylalanin.

33 Enzymy pro které je hodnota k cat / K m blízko difůzí kontrolované rychlosti vstupu substrátu do aktivního místa. Enzym k cat / K m (s -1 M -1 ) Acetylcholinesterasa 1,6 x 10 8 Karbonátanhydratasa 8,3 x 10 7 Katalasa 4,0 x 10 7 Fumarasa 1, 6 x 10 8 Triosafosfátisomerasa 2,4 x 10 8 β -Laktamasa 1,0 x 10 8 Superoxiddismutasa 7,0 x 10 9

34 Jednotky enzymové aktivity 1 katal (1 kat) je aktivita enzymu, který katalyzuje přeměnu jednoho molu substrátu za jednu sekundu. Používají se µ kat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat). Aktivita se měří za optimálních podmínek teplota, p a iontová síla roztoku. Specifická aktivita: Aktivita enzymu vztažená na množství proteinu v jednotce objemu (např. nkat/mg vše v jednom ml).

35 Dvousubstrátové reakce Sekvenční: A) áhodný mechanismus (bi bi) B) Uspořádaný mechanismus (bi bi) Pingpongový mechanismus

36 áhodný mechanismus Je takový mechanismus enzymové reakce, kdy nezáleží na tom, který z obou substrátů se váže jako první na enzym. Příklad: kreatinkinasa

37 áhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa): ATP P - + ADP Kreatin Fosfokreatin

38 lelandovo schéma - náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa): ATP Kreatin Fosfokreatin ADP Enzyme Enzyme E (kreatin) (ATP) E (fosfokreatin) (ADP) Kreatin ATP ADP Fosfokreatin

39 Uspořádaný mechanismus Vyznačuje se tím, že substráty se váží do aktivního místa v určitém pořadí. Příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa (nejdříve se váže koenzym AD + a poté druhý substrát)

40 Uspořádaný sekvenční mechanismus (laktátdehydrogenasa): - + AD AD Pyruv t Lakt t

41 lelandovo schéma uspořádaného sekvenčního mechanismu (laktátdehydrogenasa): AD Pyruv t Lakt t AD + Enzyme E (AD) (pyruv t) E (lakt t) (AD + ) Enzyme

42 Pingpongový mechanismus Vyznačuje se tím, že enzym přechází mezi dvěma stálými formami. Po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný enzymový meziprodukt, modifikovaný enzym. První produkt se uvolní a poté se váže na modifikovaný enzym druhý substrát a odštěpí se druhý produkt. Příklad: aspartátaminotransferasa.

43 Pingpongový mechanismus (aspartátaminotransferasa): Aspart t - xoglutar t Glutam t xaloacet t

44 lelandovo schéma pingpongového mechanismu (aspartátaminotransferasa): Aspart t xaloacet t - xoglutar t Glutam t Enzyme E (aspart t) (E- 3 ) (oxaloacet t) + (E- + 3 ) + (oxaloacet t) (E- 3 ) ( - oxoglutar t) E (glutam t) Enzyme

45 Allosterické enzymy Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a Mentenové. Skládají se z podjednotek (kvarterní struktury). Mají více aktivních míst a míst do kterých se váže inhibitor nebo aktivátor. Závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu má sigmoidní charakter.

46 Závislost reakční rychlosti allosterického enzymu na koncentraci substrátu (sigmoida) Reak n rychlost [v ] Koncentrace substr tu [S]

47 Aspartáttranskarbamoylasa (ATasa). ATasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových nukleotidů. ATasa je inhibována produktem cytidintrifosfátem (TP). Tento typ inhibice se nazývá zpětnovazebná inhibice nebo inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první reakční krok. TP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na jiné místo enzymu než substrát. Taková místa se nazývají allosterická (z řečtiny allos jiná a steros struktura). ATasa je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá obsahuje dva řetězce). ATP je allosterický aktivátor, TP je allosterický

48 Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického enzymu. Přidavek allosterického inhibitoru TP. Rychlost tvorby - karbamoylaspart tu mm TP [Aspart t], mm

49 Aspartáttranskarbamoylasa. Přídavek allosterického aktivátoru ATP. Rychlost tvorby - karbamoylaspart tu + 2 mm ATP [Aspart t], mm

50 Rychlost enzymové reakce závisí na p, teplotě a iontové síle prostředí. Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí p. Spočívá to ve vlivu p na kombinaci faktorů: A) Vazba substrátu na enzym B) Stav ionizace substrátu ) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v aktivním místě Většina enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku závislosti reakční rychlosti na p. apř. fumarasa. odnotu p, při které dochází k nejvyšší rychlosti enzymové reakce nazýváme p optimum.

51 Fumarasa (enzym cyklu trikarboxylových kyselin) - p optimum Rychlost p

52 Vliv teploty na stabilitu a aktivitu enzymů. Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je p, iontová síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů. Substráty obecně chrání enzymy před tepelnou denaturací. ízkomolekulární enzymy s jednoduchým polypeptidovým řetězcem obsahující disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně stabilnější než vysokomolekulární oligomerní enzymy. becně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů. Enzymy jsou proteiny u kterých se terciární a kvarterní struktura udržuje slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové interakce atd. Závislost rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který označujeme jak teplotní optimum. Při dalším zvyšování teploty obvykle dochází k denaturaci proteinu. Závislost mezi rychlostní konstantou reakce a aktivační energií se vyjadřuje exponenciální Arrheniovou rovnicí. Vliv teploty na rychlost reakce se také vyjadřuje termínem teplotní koeficient Q 10. Q 10 je faktor kterým vzroste rychlost enzymové reakce při růstu teploty o 10 o. Pro teplotní oblast mezi 25 až 35 o je tímto faktorem pro enzymy číslo 2. Pro práci s enzymy je doporučována IUB (mezinárodní biochemická

53 Inhibice enzymové aktivity Ireversibilní Reversibilní a. Kompetitivní b. ekompetitivní c. Akompetitivní

54 Ireversibilní inhibice Ireversibilní inhibitory blokují nevratně enzymovou aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní komplex enzym inhibitor. Příklad: Inhibice cholinesterasy a proteinas diisopropylfluorfosfátem, který se kovalentně váže na Ser v aktivním místě nebo reakce enzymů s ionty těžkých kovů.

55 Ireversibilní inhibice acetylcholinesterasy (enzym přenosu nervového vzruchu) diisopropylfosfofluoridem Ser F + P DI PF 3 P F Acetylcholinesterasa - AE I naktivovan AE - kovalentn vazba

56 Inaktivace cysteinového enzymu jodacetamidem ys S + I S + I J odacetamid Enzym - S I naktivovan enzym v aktivn m m st

57 Reverzibilní inhibice Kompetitivní inhibice

58 Kompetitivn inhibice Klasick kompetitivn inhibice S Enzym I I Enzym S Enzym eklasick kompetitivn inhibice S Enzym I S Enzym I Enzym Bu to vstoup substr t do aktivn ho m sta enzymu a zamez vstupu inhibitoru nebo naopak.

59 Příklad klasické kompetitivní inhibice sukcinátdehydrogenasy (enzym citrátového cyklu) malonátem: Sukcin tdehydrogenasa Sukcin t Fumar t E + I EI Kompetitivn inhibitor K = [E] [I ] / [EI ] i Malon t

60 Kompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka: Stejn mno stv substr tu a inhibitoru: E + S ES E + P + I 30 Kompetitivn inhibice ) [I ] 1/ v 1 i = V lim [S] K ( m K i V lim 20 M n se sklon EI adbytek substr tu: S S S E + S ES E + P S + S I S 1 / [v ] 10 K m se m n Bez inhibice K m 1/ v = + V lim [S] 1 V lim V lim se nem n / [S], M - 1

61 Potlačení intoxikace ethylenglykolem ethanolem: Tvorba oxalov kyseliny z ethylenglykolu je inhibov na ethanolem: 2 Alkoholdehydrogenasa 2 I nhibov no ethanolem 2 Ethylenglykol + 2 Aldehyd xalov kyselina 3 Ethanol

62 ekompetitivní inhibice

63 Schéma nekompetitivní inhibice: ekompetitivn inhibice S Enzym I Enzym S I Enzym I Enzym S

64 Schéma a grafické vynesení nekompetitivní inhibice dle rovnice Michaelise a Mentenové 100 Bez inhibitoru S E + I ES E + P K i S EI EI S Relativn rychlost [I ] =K i 20 [I ] =5 K i [I ] =10 K i Koncentrace substr tu [S]

65 ekompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka Stejn mno stv substr tu a inhibitoru: E + S ES E + P + + I I ekompetitivn inhibice K ( ) 1/ v 1 m [I ] i = V lim [S] +( ) K i V lim [I ] K i M n se sklon EI + S EI S adbytek substr tu: 1 / [v ] S S S E + S S + S I S ES adbytek substr tu neovlivn reakci. ESI 10 K m se nem n Bez inhibice K m 1/ v = + V lim [S] 1 V lim V lim se m n / [S], M - 1

66 Akompetitivní inhibice

67 Akompetitivní inhibice. Podmínkou vazby inhibitoru je vazba substrátu. Ternární komplex. Akompetitivn inhibice S Enzym I S Enzym I S Enzym

68 Akompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka Stejn mno stv substr tu a inhibitoru: E + S ES E + P + I 30 1/ v i = Akompetitivn inhibice K m 1 V lim [I ] + ( ) 1 + V lim [S] K i 20 em n se sklon S S S E + S S + S I S EI S adbytek substr tu: ES adbytek substr tu neovlivn reakci. ESI 1 / [v ] 10 K m se m n Bez inhibice K m 1/ v = + V lim [S] 1 V lim V lim se m n / [S], M - 1

69 Tabulka typů inhibice a příslušných konstant: Inhibice Konstanty Kompetitivní I se váže jen na E Roste K m, V lim se nemění. ekompetitivní I se váže jak na E tak na ES Klesá V lim, K m se nemění Akompetitivní I se váže jen na ES Klesá V lim a K m Poměr V lim / K m se nemění

70 PEIILI jako IIBITR vzniklý enzymovou reakcí sebevražedný substrát. Penicilin ireversibilně inhibuje růst bakterií narušuje syntézu bakteriální stěny. Penicilin inhibuje enzym glykopeptidtranspeptidasu tím, že napodobuje přirozený substrát enzymu a tím je D-Ala-D-Ala (dipeptid). Penicilin se kovalentně naváže na Ser aktivního místa glykopeptidtranspeptidasy. Inhibice penicilinem zasahuje do stavby buněčné stěny. Penicilin zabraňuje zesíťování peptidoglykanových vláken buněčné stěny.

71 Struktura penicilinu. Dipeptid (Val a ys). Thiazolidinový kruh, reaktivní peptidová vazba β -laktamového kruhu a R je zaměnitelná skupina. Variabiln skupina R Thialozidinov kruh S - 3 Reaktivn peptidov vazba v - laktamov m kruhu - 3

72 Model benzylpenicilinu penicilin G. a místě skupiny R je benzyl. Benzylov skupina Thialozidinov kruh Velmi reaktivn laktamov kruh

73 Porovnání konformací penicilinu a dipeptidu D-Ala-D-Ala, který penicilin napodobuje: Penicilin R- D- Ala- D- Ala peptid

74 Schématické znázornění peptidoglykanu bakterie Streptokokus aureus. Žlutý je sacharid, červený tetrapeptid a pentaglycinový můstek je modrý.

75 Tvorba sítě peptidoglykanu (S. aureus). Koncová aminoskupina pentaglycinového můstku v buněčné stěně napadá peptidovou vazbu mezi dvěma D-alaniny a tím dochází k zesíťování R R 2 Koncov glycin pentaglycinov ho m stku Koncov D- Ala- D- Ala skupina 3 R R Gly-D-Ala k ov vazba D- Ala

76 Interakce penicilinu s transpeptidasou vedoucí k velmi stabilnímu inaktivnímu komplexu. R R + Ser Penicilin S S Glykopeptidtranspeptidasa Komplex peniciloyl- enzym

77 KEZYMY A) xidoreduktas B) Transferas

78 Přehledná tabulka běžných koenzymů: Koenzym Enzymová reakce Vitaminový zdroj nemocnění z nedostatku Biocytin Karboxylace Biotin ení známo Koenzym A Přenos acylů Pantothenát (B 5 ) ení známo Kobalaminové koenzymy Alkylace Kobalamin (B 12 ) Perniciosní anemie Flavinové koenzymy xidace-redukce Riboflavin (B 2 ) ení známo Lipoová kyselina Přenos acylů - ení známo ikotinamidové koenzymy xidace-redukce ikotinová Pelagra kyselina (niacin,b 3 ) Pyridoxalfosfát Přenos aminoskupin Pyridoxin (B 6 ) ení známo Tetrahydrofolát Přenos 1 skupin Listová kyselina Megaloblastická anemie

79 Koenzymy oxidoreduktas: A) ikotinamidové B) Flavinové

80 Struktura nikotinové kyseliny a jejího amidu. 2 ikotinamid (niacinamid) ikotinov kyselina (niacin)

81 Mechanismus oxidačně-redukční reakce AD + a ADP + xidovan f orma Redukovan f orma ikotinamid [ ] D- Ribosa 2 R 2 P P 2 Adenosin X X = ikotinamidadenindinukleotid (AD + ) X = P 3 2- ikotinamidadenindinukleotidfof t (ADP + )

82 Dvouelektronový přenos (hydridový anion) při oxidačně-redukční reakci AD + na AD : 2 + R AD + R AD

83 Alkoholdehydrogenasová reakce za účasti nikotinamidového koenzymu: 3 + AD + AD 3 + AD + + Ethanol Acetaldehyd

84 Struktura flavinadenindinukleotidu (FAD) s vyznačením reaktivních míst. 3 Reaktivn m sta P - P 2

85 R 3 3 8a 7a a 5a a 4a Flavinadenindinukleotid (FAD) (oxidovan nebo chinonov forma) R 3 3 FAD (radik lov nebo semichinonov forma) R 3 3 FAD 2 (redukovan nebo hydrochinonov forma)

86 xidovaná a plně redukovaná forma flavinového koenzymu (FAD). Mechanismus shodný s flavinmononukleotidem (FM) e R R xidovan forma (FAD) Redukovan forma (FAD 2 )

87 xidace (dehydrogenace) vazby mezi dvěma uhlíky za účasti FAD: R 1 R 2 R 1 R 2 + FAD + FAD 2

88 Koenzymy transferas: A) Koenzym A B) Lipoová kyselina ) Thiaminpyrofosfát (TPP)

89 Koenzym A, oa, oas. Vyznačena struktura složeného nukleotidu s reaktivní S skupinou na konci. Pantothenát vitamin B 5. Reaktivn skupina S P - P 2 - Merkaptoethylamin Pantothen t

90 Thioesterová vazba s vysokým obsahem energie. Acetyl oa + 2 = acetát + oa + + G o = - 31, 4 kj/mol R S oa 3 S oa Acyl oa Acetyl oa

91 Lipoová kyselina S S Lipoov kyselina

92 Lipoamid isopeptidová vazba lipoové kyseliny na vedlejší řetězec apoenzymu (Lys) s vyznačením reaktivní disulfidové vazby: Postrann et zec lysinu S S Reaktivn disulfidov vazba Lipoamid

93 Přenos acetylu z acetyldihydrolipoamidu na oa S S oa S + 3 S oa S 3 + S R R Koenzym A Acetyldihydrolipoamid Acetyl oa Dihydrolipoamid

94 Struktura thiaminpyrofosfátu: S P - - P Thiaminpyrofosf t (TPP), nov thiamindifosf t

95 Uhlíkový atom mezi atomy dusíku a síry thiazolového kruhu je silně kyselý (pk a = 10). Dochází k ionizaci za tvorby karbaniontu, který se váže na oxoskupiny (např. pyruvátu v pyruvátdehydrogenase). R R R 1 S R 1 S TPP Karbaniont TPP

96 Interakce karbaniontu TPP s pyruvátem (součást pyruvátdehydrogenasy). ydroxyethyl-tpp se také označuje jako aktivní acetaldehyd. + R R R 1 S 3 R 1 S 3 Karbaniont TPP Pyruv t Adi n slou enina 2 3 R R R 2 R 1 S 3 R1 S 3 R 1 S 3 Rezonan n formy hydroxyethyl- TPP ydroxyethyl- TPP

97 Adenosintrifosfát ATP, univerzálně významný koenzym (energie) a enzymový regulátor. ATP urychluje řadu metabolických reakcí při kterých dochází k jeho hydrolýze. hemická energie ATP se uplatňuje při aktivním transportu, může se převést na mechanickou práci (svaly), na světlo (bioluminiscence), elektrickou energii a teplo. ATP se účastní řady biosyntetických reakcí přenosem fosfátu, difosfátu, adenosylu a adenylu na druhé metabolity.

98 Fosfoesterov Fosfoanhydridov vazba vazby P - P - P 2 Adenosin AMP ADP ATP

99 Proč je ATP tak energeticky bohatá molekula? Aktivní forma ATP je obvykle komplex ATP s Mg 2+ nebo Mn 2+. ATP je energeticky bohatá molekula, protože její trifosfátová část obsahuje dvě fosfoanhydridové vazby. Důvodem je resonanční stabilizace, elektrostatické odpuzování a stabilita produktů. Produkty hydrolýzy, jako je fosfát, AMP (adenosinmonofosfát) nebo ADP (adenosindifosfát), vykazují větší stabilitu a menší elektrostatickou repulzi než ATP.

100 Tabulka změny standardní Gibbsovy energie hydrolýzy fosfátů některých biologicky významných sloučenin: Sloučenina G o ' (kj.mol -1 ) Fosfoenolpyruvát - 61, 9 1,3-bisfosfoglycerát - 49, 4 ATP ( AMP + PP i 2P i ) - 45,6 Acetylfosfát - 43, 1 Fosfokreatin - 43, 1 ATP ( ADP + P i ) - 30,5 Glukosa-1-fosfát - 20, 9 PP i - 19, 2 Fruktosa-6-fosfát - 13, 8 Glukosa-6-fosfát - 13, 8 Glycerol-3-fosfát - 9, 2

101 Výpočet změny volné energie hydrolýzy ATP na ADP a P i v buňce. Vnitrobuněčná koncentrace ATP se udržuje v rozmezí: 2 10 mm. Koncentrace ADP a P i jsou variabilní. Při typické buněčné koncentraci [ATP] = 3, 0 mm, konc. [ADP] = 0, 8 mm konc.[ P i ] = 4, 0 mm je volná energie hydrolýzy ATP na ADP a P i při 37 o : - 48, 1 kj.mol -1 Podle vzorce: DG = D G o + RT. ln [ADP].[ P i ]/ [ATP]. D G o = - 35, 6 kj.mol -1

102 ydrolýza fosfoanhydridové vazby: nebo P P - nebo - 2 P + P - -

103 Spřažené reakce. Spojení endergonní reakce s exergonní (hydrolýza ATP): G (kj.mol - 1 ) Endergonn poloreakce 1 P i + glukosa glukosa- 6- P Exergonn poloreakce 2 ATP + 2 ADP + P i elkov spojen reakce ATP + glukosa ADP + glukosa- 6- P

104 Vysokoenergetické a nízkoenergetické sloučeniny

105 Fosfoanhydridová vazba bývá často značena ~ a používán název makroergická vazba. 3 ~P P 2 ~P 3 2- Acetylfosf t 1,3- Bisfosfoglycer t

106 2 P P 3 - D- Glukosa- 6- fosf t L- Glycerol- 3- fosf t

107 Zásobní fosfageny (guanidinové fosfáty) obratlovců: + 2 nebo nebo X P - - R R = 2 2 R = X = 3 X = Fosfokreatin Fosfoarginin

108 3 Doplněk: Strukturní vzorce vitaminů rozpustných ve vodě a uplatňujících se jako prekursory koenzymů a vitaminu (Laskorbová kyselina): Vitamin B 3 (iacin) Vitamin B 5 (Pantothen t) 2 Vitamin B 2 (Riboflavin) Vitamin 2 Vitamin B 6 (Pyridoxin) (L- askorbov kyselina)

109 3 3 2 Vitamin B 2 (Riboflavin)

110 - + Vitamin B 3 (iacin)

111 Vitamin B 5 (Pantothen t)

112 Vitamin B 6 (Pyridoxin)

113 2 Vitamin (L- askorbov kyselina)

114 Askorbová kyselina, askorbát (aniont) a oxidovaná forma dehydroaskorbová kyselina Askorbov kyselina Askorb t 2 Dehydroaskorbov kyselina

115 Účast askorbátu (vitaminu ) na hydroxylaci Pro v peptidovém řetězci Prolylhydrolasa + askorb t Prolin- sou st peptidov ho et zce - - xoglutar t ydroxylovan prolin v et zci - Sukcin t

116 Strukturní vzorce vitaminů rozpustných v tucích Vitamin A (Retinol) 3 Vitamin D 2 (Kalciferol) ( 3 ) ( )3 3 Vitamin E ( - Tokoferol) Vitamin K 1

117 Vitamin A (Retinol)

118 Vitamin D 2 (Kalciferol)

119 3 3 ( 3 ) Vitamin E ( - Tokoferol)

120 3 ( )3 3 3 Vitamin K 1

121 SVA Základní charakteristika enzymů Třídy enzymů Energetika enzymových reakcí Kinetika enzymových reakcí Vliv teploty, p a iontové síly roztoku na enzymovou reakci Inhibice a aktivace enzymových reakcí Koenzymy oxidoreduktas, transferas a isomeras, ligas a lyas. Úloha adenosintrifosfátu (ATP) jako koenzymu a univerzální skladovatelné energie. statní sloučeniny s vysokým obsahem energie. Doplněk: Strukturní vzorce vitaminů rozpustných ve vodě a uplatňujících se jako prekursory koenzymů a vitaminu (Laskorbová kyselina)