Marcela Vlková ÚKIA, FNUSA, Brno Veronika Kanderová CLIP, 2. LF UK a FN Motol, Praha VALIDACE A VERIFIKACE V PRŮTOKOVÉ CYTOMETRII

Transkript

1 Marcela Vlková ÚKIA, FNUSA, Brno Veronika Kanderová CLIP, 2. LF UK a FN Motol, Praha VALIDACE A VERIFIKACE V PRŮTOKOVÉ CYTOMETRII

2 KONTROLA KVALITY Výsledky analytických měření mají silný dopad v praxi: v klinických laboratořích mohou rozhodným a někdy i fatálním způsobem ovlivnit zdraví, kvalitu života a někdy i samotný život pacienta Provádět měření v dostatečné kvalitě je profesionální povinností laboratoře! Validace/Verifikace je činnost, kterou si laboratoř zajišťuje kvalitu dat v rutinním provozu.

3 NAŠE MĚŘENÍ MUSÍ BÝT VALIDOVANÉ Jak toho dosáhneme? Použitím validovaných kitů od výrobce značka CE/IVD CE = certifikovaný ; IVD = In vitro diagnosticum Publikovaná metoda v mezinárodním impaktovaném časopise, kde prošla recenzním řízením Home made metoda s vlastní validací

4 VALIDACE Doporučení normy ISO 15189: Validace musí být dostatečně rozsáhlá a musí potvrdit prostřednictvím poskytnutí objektivního důkazu (tzv. výkonnostních charakteristik), že specifické požadavky na zamýšlené použití jsou u daného postupu laboratorního vyšetření splněny. Mezi výkonnostní charakteristiky, které by se měly zvážit, patří: pravdivost, preciznost měření (opakovatelnost reprodukovatelnost), přesnost, nejistota měření, analytická specifičnost včetně interferujících látek, analytická citlivost, mez detekce, měřící rozsah, diagnostická specifičnost a diagnostická citlivost

5 VALIDACE METODY ZAHRNUJE 1. Účel měření proč stanovujeme Definice měření co stanovujeme Vzorkování, transport a zacházení se vzorkem

6 VALIDACE ZAHRNUJE 2. Souhrn minimálních požadavků na kvalitu měřícího přístroje (kalibrace přístroje) Návaznost měřících standardů (referenční materiál) Souhrn minimálních požadavků na reagencie (monoklonální protilátky) Reagencie IVD, ASR, RUO

7 VALIDACE METODY ZAHRNUJE 3. Citlivost, měřící rozsah, mez detekce/kvantifikace Robustnost Přesnost Specifita Nejistota měření Ověření platnosti použitých výpočtů

8 VALIDACE ZAHRNUJE 4. Ustanovení limitů kontroly kvality Zápisy výsledků validačních studií Dokumentace validace

9 VERIFIKACE Proces ověřování, zda je laboratoř schopna dosáhnout při zavádění již validovaných metod deklarovanou výkonnost metody, tj. že měřící postup nebo systém je plně funkční v konkrétní laboratoři I při použití IVD kitu musí laboratoř validované metody verifikovat.

10 KDY SE PROVÁDÍ VERIFIKACE Při zavedení nové validované metody Připořízení nového cytometru do laboratoře Pokud rozšíříme nebo pozměníme použití stávající metody o další účel (například rozšíříme měření o další druh biologického materiálu) Ukazuje-li kontrola kvality přetrvávající problém Minimálně jednou ročně u používané metody

11 VÝSLEDEK VERIFIKACE Zajišťuje kvalitu dat při rutinním provozu Poskytuje potřebná data pro výpočet opakovatelnosti, reprodukovaltelnosti a odhadu nejistoty měření, tj. intervalu spolehlivosti výsledků měření. Musí být dokumentován!!!

12 REPRODUKOVATELNOST Hodnotí se výsledky interní kontroly kvality Minimum je 10 výsledků (optimum 20 výsledků), do výsledků se nezahrnují odlehlé hodnoty Je vhodné použít Westgardova pravidla pro detekci náhodných chyb a systematických chyb Hodnotí se průměr (AM), směrodatná odchylka (SD) a variační koeficient (CV)

13 OPAKOVATELNOST Analýza referenčních materiálů (EHK) s uvedenými referenčními hodnotami Minimálně 10 měření v sérii Hodnotí se průměr (AM), směrodatná odchylka (SD) a variační koeficient (CV)

14 NEJISTOTA MĚŘENÍ nejistota výsledku měření představuje interval, ve kterém se nachází s deklarovanou mírou pravděpodobnosti skutečný výsledek měření 1. Můžeme stanovit z referenčního materiálu (SEKK) pokud je uvedena nejistota měření Pak stanovujeme (rozšířenou) relativní kombinovanou nejistotu výsledku, jejíž definice a kalkulačku najdeme na 2. Pokud není dostupný referenční materiál s uvedenou nejistotou měření, nejistotu měření pak stanovujeme jako CV zjištěném z dlouhodobého měření referenčního materiálu CV (variační koeficient ) = SD/průměr SD (směrodatná odchylka)

15 DOPORUČENÍ ČSAKI VSTUPNÍ (PRVOTNÍ) VERIFIKACE Reprodukovatelnost: opakování (replikací) na 2 hladinách (u dvou vzorků) v po sobě jdoucích dnech. Je možno použít komerční kontrolní nebo pacientský vzorek. Doporučuje se využít výsledků interní kontroly kvality. opakovatelnost: 6-10 opakování (replikací) na 1 hladině (u jednoho vzorku). Je možno použít komerční kontrolní, EHK nebo pacientský vzorek. Šest až 10 opakování v jednom dni.

16 DOPORUČENÍ ČSAKI OPAKOVANÁ (PRŮBĚŽNÁ) VERIFIKACE 1x ročně je nutné měřit reprodukovatelnost: opakování (replikací) na 2 hladinách (u dvou vzorků). Je možno použít komerční kontrolní nebo pacientský vzorek. Doporučuje se využít výsledků interní kontroly kvality. 1x za 3 roky je k reprodukovatlenostinutné měřit opakovatelnost: 6-10 opakování (replikací) na 1 hladině v jednom dni (pozitivní nebo lépe hraniční vzorek). Je možno použít komerční kontrolní, EHK nebo pacientský vzorek.

17 VÝSLEDEK VERIFIKACE Zajišťuje kvalitu dat při rutinním provozu Poskytuje potřebná data pro výpočet opakovatelnosti reprodukovatelnosti a odhadu nejistoty měření, tj. intervalu spolehlivosti výsledků měření Musí být dokumentován!!!

18 IKK V PRŮTOKOVÉ CYTOMETRII Řešení jako u všech ostatních metod určených k akreditaci: 1) nutnost měření kontrol pro stanovení reprodukovatelnosti 2) nutnost měření kontrol pro stanovení opakovatelnosti Pravidla by měla být stejná, jako u každého jiného analyzátoru!!!! Denní x týdenní měření kontrolního vzorku

19 DENNÍ MĚŘENÍ KONTROLNÍHO VZORKU Respektovat SOP!!! Správný pipetovací proces Správné monoklonální protilátky Správné lyzační činidlo Správné nastavení cytometru Správné nastavení protokolu Vlastní měření Správné vyhodnocení dat Denní x týdenní měření kontrolního vzorku

20 DENNÍ MĚŘENÍ PŘED ZAPOČETÍM PRÁCE Měření Flow Check, Spherotech, CST, Rainbow Beads Měření kontrolního vzorku

21 DENNÍ MĚŘENÍ KONTROLNÍHO VZORKU Příslušný laborant je povinen porovnat výsledky naměřených kontrol s výsledky, které poskytl výrobce. Pokud výsledky splňují příslušné kontrolní limity, laborant pokračuje v práci měřením pacientských vzorků. Pokud jsou výsledky mimo uvedené limity, pokračuje laborant podle připravených opatření.

22 OPATŘENÍ 1. Kontrola případného ucpání cytometru řešení důkladné promytí cytometru 2. Kontrola správného nastavení cytometru kontrolní kuličky při chybě volat servis 3. Kontrola reagencií (protilátky, lyzační činidlo, zpracovávaného ref. vzorku) 4. Kontrola postanalytické fáze správného nastavení protokolů / gatů u příslušného parametru 5. Opětovné změření kontroly

23 PROTOKOL O MĚŘENÍ KONTROLNÍHO VZORKU MUSÍ OBSAHOVAT: Název kontrolního materiálu Šarži kontrolního materiálu / Abs Expirace Rozmezí, ve kterém se mají pohybovat výsledné hodnoty Kdo měřil Kdy měřil Výsledek parafovaný záznam ve formuláři pro IKK

24 HODNOCENÍ IKK Měsíční hodnocení: průměrná hodnota směrodatná odchylka variační koeficient sestrojení grafu sledování splnění Westgardových pravidel protokol pouze jedna šarže kontrolního materiálu

25 WESTGARDOVA PRAVIDLA k minimalizaci zbytečných opakování měření rozpoznání náhodné systematické chyby Sledujeme pomocí Levey Jennings Graf

26 1 3s 1 2s 4 1s 10 x R 4s 7 T 2 2s systematická náhodná

27 EXTERNÍ KONTROLA KVALITY (EKK) je běžnou a standardní složkou procesů, které vedou (nebo by alespoň měly vést)k tomu, aby měření důležitých parametrů a/nebo provádění testů poskytovalo přesné, věrohodné a přinejmenším v rámci státu srovnatelné výsledky. SEKK

28 POPIS POSTUPU PROVÁDĚNÍ EHK Musí být popsán obecný postup provádění externí kontroly kvality Dále musí být popsán konkrétní provedení EHK u každé metody SEKK

29 NUTNÉ BODY EHK Příprava externího kontrolního vzorku Vlastní provedení měření kontrol Vyhodnocení měření kontrol Záznamy kontroly a jejich ukládání Hodnocení EHK Plány EHK Zprávy EHK

30 HODNOCENÍ EHK hodnocení výsledků v EHK manažerem kvality případný neúspěch stanovení opatření (v příští zprávě hodnocení úspěchu opatření) hodnocení výsledků EHK v čase (letech) vývoj absolutních a relativních chyb, úspěšnost v EHK

31 SROVNÁNÍ DVOU PŘÍSTROJŮ

32 POROVNÁNÍ MĚŘENÍ NA DVOU CYTOMETRECH korelace získaných výsledků? tudy statistická cesta nevede! % CD3+4+ NAVIOS %CD y = 0,9838x R 2 = 0, FC500 %CD3+4+

33 Passing-Bablokova regrese Hodnotí se, zda je sklon (směrnice) proložené přímky významně odlišný od jedničky, která odpovídá úhlu 45 a dále, zda je intercept (hodnota ve které proložená přímka protíná osu y) významně odlišný od nuly. Bland-Altmanův rozdílový graf Graf lze jednoduše vyhodnotit. Pokud je nula na ose y uvnitř intervalu +2SD a - 2SD lze konstatovat, že mezi metodami A a B není významný rozdíl. Poděkování: Mgr. Jan Stuchlý

34 Poděkování: VERONIKA KANDEROVÁ JAN STUCHLÝ OLGA TICHÁ