IONIZACE LASEREM ZA PŘÍTOMNOSTI MATRICE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (AP-MALDI) NOVÝ SMĚR V ANALÝZE PEPTIDŮ A PROTEINŮ

Transkript

1 IONIZACE LASEREM ZA PŘÍTOMNOSTI MATRICE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (AP-MALDI) NOVÝ SMĚR V ANALÝZE PEPTIDŮ A PROTEINŮ MICHAL GODULA HPST s.r.o., Písnická 372/2, 142 Prh 4 michl.godul@hpst.cz Došlo , přijto Klíčová slov: ionizce lserem, MALDI, proteiny Obsh 1. Úvod 2. Princip ionizcemaldi z tmosférického tlku (AP-MALDI) 3. AP-MALDI v prxi 3.1. AP-MALDI-IT-MS 3.2. AP-MALDI-oTOF 4. AP-MALDI v kombinci s 2D-nnoHPLC 4.1. Online 2D-HPLC-MS-MS s diskontinuálním grdientem 4.2. Online 2D-HPLC-MS-MS se semi-kontinuálním grdientem 4.3. Offline 2D-HPLC-MS-MS 4.4. Offline 2D-nnoLC-MALDI-MS-MS 5. Závěr 1. Úvod Proteiny či peptidy obsžené v buňkách v reltivně nízkých koncentrcích mohou hrát význmnou roli v procesech probíhjících v buňce. Mezi tyto procesy ptří npř. regulce metbolismu, vliv n vznik různých nemocí td. Hlvním úkolem hmotnostní spektrometrie je identifikce kvntifikce těchto proteinů i ve velmi komplexních směsích proteinů obsžených v buňkách. Nejrozšířenější MS technikou v nlýze proteinů či peptidů je v součsnosti beze sporu hmotnostní spektrometrie s ionizcí MALDI (Mtrix Assisted Lser Desorption Ioniztion) 1,2. Principem MALDI ionizce je nnesení mlého množství vzorku společně s vhodnou mtricí (kyselin 2,5-dihydroxybenzoová, kyselin α-kyno-4- -hydroxy-skořicová dlší) n terčík následná desorpce ionizce lserem. Výsledkem celého procesu je ionizce peptidů nebo proteinů jejich následná hmotnostní nlýz. V minulosti byl většin systémů určených pro nlýzu proteinů peptidů konstruován s ionizcí MALDI relizovnou ve vkuu v kombinci s nlyzátorem doby letu iontů (Time of Flight, TOF). Výhody klsického uspořádání MALDI-TOF jsou následujcí: vysoký hmotnostní rozsh systému umožňující nlýzu intktních proteinů, potenciálně lepší přesnost stnovení hmotností iontů, dobré rozlišovcí schopnosti systému. 2. Princip ionizce MALDI z tmosférického tlku (AP-MALDI) V nedávné době byly publikovány pokusy relizovt MALDI z tmosférického tlku (AP-MALDI) 3 6 v kombinci s dlšími typy hmotnostních spektrometrů, npř. n bázi iontové psti (IT-MS). Bohužel, první experimenty s ionizcí AP-MALDI poukázly n možné problémy, zejmén n nižší citlivost poměrně intenzivní tvorbu duktů mtrice 4. V součsnosti již umožňuje technické řešení zdroje AP-MALDI nlýzy směsí peptidů vzniklých enzymtickým štěpením proteinů o velmi nízkých koncentrcích nvíc s možností získání MS/MS spekter. Využití MS/MS dt tké výrzně zvyšuje specifitu vyhledávání v dtbázích peptidů proteinů v porovnání s metodou PMF (peptide mss fingerprint) využívnou při identifikci spekter získných prostřednictvím konvenčních systémů MALDI-TOF. Nespornou výhodou ionizce AP-MALDI je možnost využití různých druhů hmotnostních nlyzátorů, jko npř. iontové psti 7 nebo systému TOF s orthogonální kcelercí 8. Nvíc je možné využít jeden druh nlyzátoru, npř. systém s iontovou pstí pro nlýzu jk intktních proteinů s ionizcí elektrosprejem (ESI), tk i směsí peptidů ionizcí AP-MALDI. Výhody AP-MALDI v kombinci s hmotnostním spektrometrem n bázi iontové psti jsou následující: proces ionizce je relizován nezávisle n hmotnostním nlyzátoru, proto podmínky ionizce kvlit povrchu terčíku popř. nnesení vzorku neovlivňují prmetry nlyzátoru (zejmén rozlišení přesnost měření hmotností iontů), je možné získt velmi rychle MS/MS dt (n rozdíl od vkuového MALDI-TOF-MS) informci o sekvenci peptidů se subfemtomolovými koncentrcemi, MS/MS dt je možné získt nepoměrně levnější instrumentcí oproti systémům Q-TOF nebo TOF-TOF, flexibilit dob výměny zdroje z AP-MALDI npř. z ESI velmi krátká (několik minut) je možné využít jeden systém MS pro širší škálu experimentů. N obr. 1. je zobrzen zdroj AP-MALDI firmy Agi- 93

2 1,,8 Intenzit x 1 5,6,4,2 b, 1, ,8 Intenzit x 1 5,6 Obr. 1. AP-MALDI zdroj firmy Agilent Technologies,4 průtok dusíku podél kpiláry LASER,2, do MS kpilár vyhřívný prostor prodloužení kpiláry MALDI destičk Obr. 3. Vliv protiproudu sušícího plynu n tvorbu shluků intenzitu iontů peptidů z tryptického rozkldu hovězího serumlbuminu, mtrice kyselin α-kyno-4-hydroxyskořicová; ) spektrum získné při použití vyhřívného proudu sušícího plynu, b) spektrum získné po vypnutí vyhřívání sušícího plynu Obr. 2. Schém zdroje AP-MALDI firmy Agilent Technologies lent Technologies, uvedený n trh v roce 24. Zdroj je vybven dusíkovým lserem o vlnové délce 337 nm (1 Hz), který je přiváděn skrze optické vlákno o průměru 4 µm n pozici n terčíku o velikosti 2 25 µm. Energie lseru je 2 24 µj. Schém zdroje je pk uvedeno n obr. 2. Hlvním rysem konstrukce zdroje je využití protiproudého uspořádání toku sušícího plynu oproti pohybu iontů při desorpci lserem. Ionty vzniklé při ionizci jsou vthovány do kpiláry MS kombincí účinku elektrosttického pole vku. Během jejich krátkého letu tmosférickou částí dochází k rozrušení shluků iontů vzniklých během ionizce účinkem proudu horkého dusíku. Účinek protiproudu sušícího plynu je velmi výrzný, jk je dokumentováno n obr. 3. Ztímco při využití sušícího plynu o teplotě 325 C jsou dominntními ionty ve spektru ionty peptidů serumlbuminu, při experimentu bez vyhřívání sušícího plynu jsou dominntní ionty mtrice v oblsti 1 ž 6 mu (spodní obrázek) AP-MALDI v prxi 3.1. AP-MALDI-IT-MS První z možností využítí zdroje AP-MALDI, která bude zmíněn v tomto článku, je kombince s hmotnostním nlyzátorem n bázi iontové psti (IT- MS). Pulsy lseru při ionizci jsou synchronizovány s kumulčními fázemi iontové psti hmotnostního spektrometru. N obr. 4. je zobrzeno porovnání spekter směsi peptidů získných enzymtickým štěpením hovězího serumlbuminu (BSA) trypsinem. Spektr byl pořízen po- 931

3 .i % optická část systému IT-MS optimlizován pro přenos iontů o vyšších hmotnostech tím dochází k potlčení trnsmise iontů o nízké hmotnosti, zejmén pk iontů mtrice. Oproti klsickým systémům MALDI-TOF nbízí uspořádání AP-MALDI-IT-MS zřejmou výhodu v možnosti získání MS i MS/MS spekter n koncentrčních hldinách nižších než 1 fmol. Npř. n obr. 5. jsou znázorněn MS MS/MS spektr získná nlýzou 25 mol BSA pomocí AP-MALDI-IT-MS systému 6. Ionty oznčené v MS spektru kosočtvercem byly vybrány režimem AUTO-MS/MS pro izolci následnou frgmentci. N dvou spodních obrázcích jsou pk znázorněny příkldy tkto získných spekter MS/MS. Tkto získná dt lze následně využít pro vyhledávání v dtbázích proteinových nebo nukleotidových sekvencí. N druhé strně le stále zůstává velkou výhodou klsického uspořádání MALDI-TOF možnost měření s vysokou přesností. Proto dlší část tohoto článku bude věnován možnostem propojení AP-MALDI s TOF-MS systémy AP-MALDI-oTOF Dlší lterntivou využití AP-MALDI je plikce této ionizce v systému vybveném nlyzátorem TOF s orthogonální kcelercí (otof). Systém otof může být využit v kombinci s elektrosprejem npř. pro 2D-HPLC-TOF-MS nlýzu v dlším kroku pro AP- MALDI nlýzu peptidů vzniklých enzymtickým štěpe Obr. 4. Porovnání spekter získných pomocí dvou typů MAL- DI-TOF-MS AP-MALDI-IT-MS systémů; hovězí serumlbumin 5 fmol; C = crboxymethylovný cystein 6 mocí dvou typů konvenčních systémů MALDI-TOF systému IT-MS vybveného zdrojem AP-MALDI. Z porovnání uvedeného v tb. I je zřejmé, že jk MALDI-TOF, tk i AP-MALDI-IT-MS, jsou zřízení schopná produkovt velmi podobná spektr. Klsické systémy MALDI-TOF le produkují spektr s vyšší odezvou hmot o nižší střední molekulové hmotnosti. V přípdě AP-MALDI-IT-MS nejsou ionty o nízké hmotnosti příliš význmné. Tento jev je způsoben četnými kolizemi nízkomolekulárních iontů z tmosférických podmínek, čímž dochází ke snížení vnitřních energií iontů tím i k jejich přenosu ze zdroje do hmotnostního detektoru. Zároveň je Obr. 5. MS MS/MS spektr BSA n hldině 25 mol, AP- MALDI-IT-MS MS-MS 932

4 Tbulk I Identifikovné sekvence peptidů trypsinového štěpení hovězího serumlbuminu (BSA) Sekvence peptidů Teoretická AP-MALDI-IT-MS MALDI-TOF 1 MALDI-TOF 2 [] [] [] [] AWSVAR 689,4 689,4 SEIAHR 712,4 712,4 NYQEAK 752,4 752,4 833,1 LSQKFPK 847,5 847,5 847,5 855,1 LCVLHEK 899,5 899,5 899,5 IETMREK 922,5 922,5 922,5 YLYEIAR 927,5 927,8 927,5 927,5 997,6 16,1 CCTESLVNR 114,5 114,5 114,5 LVNELTEFAK 1163,6 1164, 1163,6 1163,6 CCTKPESER 1168,5 1168,9 1168,5 1168,5 FKDLGEEHFK 1249,6 1249,9 1249,6 1249,6 HLVDEPQNLIK 135,7 136, 135,7 135,7 SLHTLFGDELCK 142,7 142,8 142,7 142,7 RHPEYAVSVLLR 1439,8 1439,5 1439,8 1439,8 YICDNQDTISSK 1444,6 1444,8 1444,6 1444,6 TCVADESHAGCEK 1465,6 1465,7 1465,6 1465,6 LGEYGFQNALIVR 1479,8 148, 1479,8 1479,8 QTALVELLKHKPK 154,9 154,7 154,6 LKECCDKPLLEK 1534,7 1534,8 1534,7 1534,8 DDPHACYSTVFDK 1555,6 1555,7 DAFLGSFLYEYSR 1567,7 1567,8 LKPDPNTLCDEFK 1577,8 1577,7 1577,8 KVPQVSTPTLVEVSR 1639,9 164, 164, 164, YNGVFQECCQAEDK 1749,7 1749,7 1779,8 1779,9 RPCFSALTPDETYVPK 1881,9 1881,9 1881,9 1881,8 NECFLSHKDDSPDLPK 192,9 192,8 LFTFHADICTLPDTEK 198,9 199, 198,9 LKPDPNTLCDEFKADEK 221, 22,9 221, VHKECCHGDLLECADDR 2116,8 2116,6 2116,9 Pozn.: Koncentrce 5 fmol; oznčuje hmoty, které neodpovídjí žádné sekvenci vzniklé rozkldem BSA; C = krboxymethylovný cystein 6 ním proteinů. Jednoznčnou předností je pk rychlá výměn obou zdrojů tedy i vysoká flexibilit přístroje. Podobně jko u AP-MALDI-IT-MS i zde je výhodou oddělení kroků ionizce vlstní hmotnostní nlýzy. Prmetry ionizce tudíž neovlivňují dosžené rozlišení přesnost stnovení hmotnosti nlyzátoru otof. Tím je dosženo rutinního měření spekter s přesností hmot lepší než 5 ppm vynikjícího rozlišení (>1 ). Výhodou systému o- TOF firmy Agilent Technologies je kromě již zmíněných prmetrů i velmi široký dynmický rozsh (3 4 řády), který umožňuje simultánní stnovení peptidů přítomných ve vzorku n velmi rozdílných koncentrčních hldinách. Dlší výhodou již zmíněného uspořádání je mimo jiné tké vynikjící citlivost. N obr. 6 je znázorněno spektrum produktů tryptického štepění 5 mol potrnsferrinu. Pro interní klibrci hmotnostní osy bylo použito iontů mtrice (19,499, 379,925, 568,1351), čímž bylo dosženo rutinně stnovení hmot s přesností lepší než 5 ppm. Pro PMF vyhledávání v dtbázi pk byl použit užší limit 1 ppm, čímž bylo dosženo tké vyšší prvděpodobnosti shody elimince potenciálně flešných výsledků

5 9 6 Identifikce proteinů v komplexních směsích v minulosti byl stále je většinou relizován klsickým postupem, tj. seprcí směsi proteinů technikou dvourozměrné gelové elektroforézy (2D-GE), následným štěpením izolovných proteinů vhodným enzymem identifikcí vzniklé směsi peptidů metodou MALDI-TOF. Nevýhodou tohoto uspořádání je čsová mnuální náročnost. N druhé strně, výhodou je možnost dosžení velmi spolehlivých výsledků díky vysokému rozlišení 2D-GE spolehlivé identifikci vyhledáváním v proteinových dtbázích (PMF). Alterntivní technikou, která nbývá stále většího význmu, je nlýz komplexních směsí peptidů vysokoúčinnou kplinovou chromtogrfií ve spojení s MS detekcí. Vzhledem k tomu, že množství vzorku je obvykle velmi mlé, využívá se k seprci směsí peptidů HPLC v kpilárním (průtok mobilní fáze 1 2 µl min 1 ) nebo nno (1 1 nl min 1 ) uspořádání. Výhodou 2D-HPLC je možnost utomtizce celého procesu tím i dosžení reprodukovtelnějších výsledků. Existuje několik možností relizce 2D-HPLC v kombinci s MS detekcí, které se liší v konfigurci systému. Zároveň je prostřednictvím různého uspořádání systému dosženo velmi odlišné kvlity získných dt , mu 4.1. Online 2D-HPLC-MS-MS s diskontinuálním grdientem Nejjednodušší způsob relizce 2D-HPLC je zobrzen n obr. 7 (cit. 1 ). V první dimenzi je vzorek obshující peptidy vzniklé enzymtickým štěpením směsí proteinů nnesen utomtickým dávkovčem n kolonu obshující silný ktex (SCX). Eluce frkcí peptidů z kolony SCX je relizován postupnými nástřiky roztoku mrvenčnu Obr. 6. Spektrum AP-MALDI-oTOF-MS 5 mol potrnsferrinu (APO) (tryptické štěpení) 4. AP-MALDI v kombinci s 2D-nnoHPLC Obr. 7. Princip online 2D-HPLC s diskontinuálním grdientem Obr. 8. Online 2D-HPLC se semikontinuálním grdientem 934

6 A. Kontinuální solný grdient kpilární čerpdlo chlzený well-plte dávkovč mikrosběrč frkcí kolon SCX přenos destiček s jmkmi do dávkovče B. Nástřik frkcí n záchytnou kolonku, promytí seprce chlzený well-plte dávkovč odpd 2. čerpdlo čerpdlo s nnolitrovým průtokem odpd C18 rekoncentrční kolonk 75 µm x 15 mm x 3,5 µm nlytická kolon Obr. 9. Offline 2D-HPLC-MS/MS monného o rostoucích koncentrcích (npř. 2, 4, 6, 8, 1, 15, 2, 3, 5, 1 mm). Kždá z frkcí je nejprve veden n rekoncentrční kolonku, kde dojde k zchycení eluovných peptidů. Poté dojde k přepnutí rekoncentrční kolonky do druhé dimenze (průtok řízený npř. nno pumpou) postupným grdientem orgnické fáze dochází k vymytí peptidů n nlytickou kolonu. Následně je relizován jejich seprce detekce systémem ESI-IT-MS-MS Online 2D-HPLC-MS-MS se semikontinuálním grdientem Diskontinuální 2D-HPLC, zmíněná v předchozím odstvci, má několik nevýhod. Jko hlvní je možno uvést tu, že kolon SCX není provozován v optimálním rovnovážném režimu že dochází pouze k nástřikům jednotlivých dávek soli. To může vést npř. k eluci jednoho peptidu ve dvou různých frkcích tím ke snižování detekčních možností (citlivosti) systému. Optimlizovným řešením je 2D-nnoHPLC se semikontinuálním grdientem viz obr. 8. Zákldní princip je totožný s předchozím systémem. Nicméně v tomto uspořádání jsou peptidy vymývány z ktexové kolonky kontinuálním grdientem n dvě cyklicky se přepínjící rekoncentrční kolonky. Tímto uspořádáním je dosženo podsttně lepšího rozlišení peptidů tím i spolehlivější identifikce Offline 2D-HPLC-MS-MS Dlší možností zvýšení rozlišení systému 2D-HPLC je oddělení frkcionce peptidů n koloně SCX vlstní chromtogrfické seprce jednotlivých frkcí. Jedno z možných uspořádání je zobrzeno n obr. 9. V této konfigurci je směs peptidů nnesen n ktexovou kolonu jednotlivé frkce peptidů jsou postupně vymývány rostoucím grdientem soli frkcionovány sběrčem frkcí. Frkce obshující eluovné peptidy jsou sbírány přímo do mikrotitrčních destiček. Mikrotitrční destičk s frkcemi je pk přenesen do systému 2D-nnoHPLC-MS-MS jednotlivé frkce z kolony SCX jsou nstřikovány nlyzovány pomocí 2D-HPLC n reverzní fázi 12. Výhodou tohoto uspořádání je podsttně vyšší rozlišení než v přípdě online systémů. Je možné provést tké frkcionci n destičky MALDI provést jejich nlýzy libovolným systémem MALDI-MS. 935

7 4.4. Offline 2D-nnoLC-MALDI-MS-MS Ačkoliv je systémem offline dosženo velmi kvlitních výsledků zejmén díky vynikjícímu rozlišení techniky, problémem je omezená kpcit systému MS-MS n bázi iontové psti. Při koeluci několik peptidů během seprce není systém MS-MS n bázi iontové psti schopen provést dosttečný počet cyklů identifikovt všechny složky v píku. Proto je výhodnější převod jednotlivých frkcí n MALDI destičky nlýz npř. systémem AP- MALDI-IT-MS-MS. Tento proces je ovšem smozřejmě poměrně čsově náročný je tké reltivně prcný. Proto byl proveden úprv mikrosběrče frkcí pro možnost frkcionce přímo n MALDI destičky 13. Zákldním problémem tohoto řešení je nutnost spolehlivé depozice frkce o minimálním objemu (stovky nl) n destičku. Obr. 1. Proces depozice frkce n destičku MALDI mikrosběrčem frkcí Agilent Technologies N obr. 1. je znázorněn proces depozice frkce n destičku MALDI pomocí mikro sběrče frkcí firmy Agilent Technologies. Klíčovým rysem je pohyb jehly ve vertikálním směru souběžně se zvětšováním velikosti kpky. Tím je zbráněno ulpívání kpky n jehle zhoršení reprodukovtelnosti frkcionce. Nvíc je možné do systému zřdit i zřízení pro online přidávání mtrice MALDI do proudu mobilní fáze pístovou pumpou. Posledním krokem je pk pouze vysušení kpek n destičce přenesení destičky do systému MALDI-MS-MS. Mikrosběrč frkcí je možné použít pro depozici n jkékoli destičky MALDI od různých výrobců systémů MS. 5. Závěr Cílem tohoto článku bylo předstvit lterntivní techniky ke klsickým technikám používným v proteomické nlýze. Výhodmi ionizce AP-MALDI oproti klsické MALDI jsou lepší citlivost, vysoká flexibilit možnost využití s celou řdou MS systémů. Kombincí systému 2D-HPLC se sběrčem frkcí schopným přímé depozice n destičky MALDI je pk možné získt velmi kvlitní dt i v přípdě nlýz poměrně složitých směsí peptidů. Velkou výhodou kombince systémů 2D-nnoHPLC s AP- MALDI je možnost utomtizce celého procesu tím i dosžení vysoké spolehlivosti nměřených dt. LITERATURA 1. Tnk K., Ido Y.,Akit S., Yoshid Y., Yoshid T.: Rpid Commun. Mss Spectrom. 2, 151 (1998). 2. Krs M., Hillenkmp F.: Anl. Chem. 6, 229 (1988). 3. Liko V. V., Burlingme A. L.: U.S. Ptent (1999). 4. Liko V. V., Moyer S. C., Cotter R. J.: Anl. Chem. 72, 5239 (2). 5. Moyer S. C., Cotter R. J.: Anl. Chem. 74, 469A (22). 6. Doroshenko V. M., Liko V. V., Trnenko N. I., Berkout V. D., Lee H. S.: Int. J. Mss Spectrom. 221, 39 (22). 7. Perkins P., Bi J., Lopez-Avil V., Miller C.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, Yi D., Bi J., Perkins P.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, Mez J. E., Perkins P. D.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, Nägele E., Vollmer M., Hörth P.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, Nägele E.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, Mortiz R., Vollmer M., Nägele E.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, Nägele E., Vollmer M.: Appliction Note EN, Agilent Technologies, 24. M. Godul (HPST Co., Prgue): Lser Ioniztion in the Presence of Mtrix t Atmospheric Pressure (AP-MALDI) A New Direction in Peptide nd Protein Anlysis Mtrix-ssisted lser desorption ioniztion (MALDI) is populr technique for protein nd peptide nlysis. Historiclly, MALDI nlyses hve been ccomplished with the smple under vcuum in combintion with timeof-flight (TOF) mss nlyzers, MALDI-TOF. More recently, MALDI hs been performed t tmospheric pressure (AP-MALDI), in combintion with vrious MS systems. A short overview is given on the dvntges nd ppliction potentil of AP-MALDI in proteomics re. 936