Identifikace stafylokoků prostřednictvím sekvenování konzervativních genů Roman Pantůček, Pavel Švec, Ivo Sedláček Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Ústav experimentální biologie M A SA RYKOVA UNIVERZITA BRNO PŘÍ RO D O V ĚD ECK Á FA K U LTA
Identifikace stafylokoků založená na DNA Přesná a spolehlivá identifikace prostřednictvím molekulárně biologických metod Nepřímé metody Poskytují zpravidla fingerprint ve formě proužků na gelu nebo membráně Ribotypizace a automatická ribotypizace PCR-RFLP konzervativních genů Amplifikace mezerníků v operonech pro rrna a trna (ITS-PCR) Interrepetitivní PCR (REP-PCR) Přímé metody Stanovení sekvence konzervativních genů o délce 300-2500 bp Moderní vysoce účinné sekvenování celých genomů DNA microarrays
Přímé metody pro identifikaci stafylokoků na základě sekvencí DNA Více než 30 ortologních genů vhodných pro diagnostiku a fylogenetické studie Rozdílná úroveň konzervovanosti sekvencí Nejpoužívanější lokusy: geny pro funkční RNA 16S ribosomal RNA (16S rrna) 23S ribosomal RNA (23S rrna) často používané geny, data dostupná pro většinu druhů 60 kda heat shock protein (hsp60, cpn60, groel) RNA polymeráza beta-podjednotka (rpob) 40 kda heat shock protein DnaJ (dnaj/dnak) Shah et al., 2007, IJSEM 57: 25-30 superoxide dismutase (soda) Poyart et al., 2001, JCM 39: 4296 4301 méně často používané geny, data dostupná pro některé druhy glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza (gap) Ghebremedhin et al., 2008, JCM: 46: 1019 1025 elongační faktor Tu (tuf) Martineau et al., 2001, JCM 39: 2541 2547
16S rrna fylogenetická analýza Takahashi et al., IJSB 1999, 49: 725 728 Spolehlivá identifikace na úrovni rodu a druhových komplexů Stanovení kompletní sekvence genu pro 16S rrna vyžaduje provedení min. 4-6 sekvenačních reakcí Fylogenetická analýza Dosahované podobnosti sekvencí 97 99% Definovány species-groups
16S rrna species groups S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus S. muscae S. hyicus S. intermedius S. simulans S. sciuri S. hominis (X66101) S. haemolyticus (D83367) S. stepanovicii (GQ222244) S. devrisei (AB009941) S. fleurettii (AB233330) S. lugdunensis S. vitulinus (AB009946) (AB009941) S. lentus (D83370) S. sciuri (S83569) S. delphini (AB009938) S. intermedius (D83369) S. schleiferi (S83568) S. aureus S. simiae (D83357) (AY727530) S. hyicus (D83368) S. chromoges (D83360) S. lutrae (X84731) S. felis (D83364) S. rostri (FM244716) S. microti (EU888122) S. muscae (S83566) S. xylosus (D83374) S. saprophyticus (D83371) S. pasteuri (AB009944) S. warneri (L37603) S. auricularis (D83358) S. massiliensis (EU707796) S. condimenti (Y15750) S. piscifermentans (AB009943) S. carnosus (AB009934) S. pettenkoferi (AF322002) S. kloosii (AB009940) S. nepalensis (AJ517414) S. cohnii (D83361) S. arlettae (AB009933) S. gallinarum (D83366) S.equorum (AB009939) S. succinus (AF004219) 0.01 S. simulans (D83373) Pantůček et al., IJSEM 2005, 55:1953-1958, doplněno
Rychlá identifikace stafylokoků prostřednictvím 5'-konce 16S rrna Stanovení částečné sekvence 5'-konce 16S rrna o délce cca 500 bází Amplifikace téměř celého genu Jedna sekvenační reakce s vnitřním primerem 98,7 % průměrná podobnost mezi druhy Nelze odlišit komplex S. delphini-s. intermedius-s. pseudintermedius Nelze odlišit subspecies
5'-konec 16S rrna - metodika Becker et al., 2004, JCM 42: 4988 4995 Primery pro PCR amplifikující ~900 bp fragment SSU-bact-27f AGAGTTTGATCMTGGCTCAG SSU-bact-907r CCGTCAATTCMTTTRAGTTT Vnitřní primer pro sekvenování SSU-bact-519r GWATTACCGCGGCKGCTG Doporučená databáze pro identifikaci RIDOM Nováková, et al., 2006, JMM 55: 523 528 Primery pro PCR amplifikující ~1400 bp fragment 16Sfw AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 16Srev GGTTACCTTGTTACGACTT Vnitřní primer pro sekvenování 16S553L CGCTTTACGCCCAATAATTCCG Doporučená databáze pro identifikaci RDP II
Získání sekvencí rrna RDP II Release 10 (http://rdp.cme.msu.edu)
Získání sekvencí rrna SILVIA v104 (http://www.arb-silva.de/)
hsp60-60 kda chaperonin - metodika Kwok a Chow, IJSEM 2003, 53:87 92 600 bp fragment genu pro 60 kda heat shock protein Degenerované primery pro PCR obsahující řadu inozinových zbytků a restrikční místa na 5 -konci H279 GAATTCGAIIIIGCIGGIGA(TC)GGIACIACIAC H280 CGCGGGATCC(TC)(TG)I(TC)(TG)ITCICC(AG)AAICCIGGIGC(TC)TT Podmínky PCR: nízká stringence navíc nespecifické produkty Nutnost klonovat produkty PCR Sekvenování prostřednictvím univerzálních primerů kompatibilních s klonovacím vektorem
hsp60 příklad gelu s produkty PCR 600 bp hsp60
hsp60 - výsledky Výborná korelace mezi fylogenetickými stromy založenými na 16S rrna a hsp60 Diverzita sekvencí genů mezi druhy rodu Staphylococcus 74 až 93 % mnohem vyšší diskriminační schopnost pro druhovou identifikaci než u 16S rrna V rámci rodu Staphylococcus rozlišeno 5 druhových skupin: aureus group, epidermidis group, haemolyticus group, saprophyticus group, intermedius group a sciuri group
cpndb: A Chaperonin Database http://cpndb.cbr.nrc.ca/home.php
hsp60 fylogenetický strom Pantůček et al., IJSEM 2005, 55:1953-1958
hsp60 výhody/nevýhody Přesná druhová identifikace Pro fylogenetickou analýzu mohou být použity dedukované aminokyselinové sekvence Existence specializované databáze pro archea, bakterie a eukaryota možnost automatického přiřazení sekvencí a fylogenetické analýzy Nutnost investovat do degenerovaných primerů Klonování práce s GMO
rpob β-podjednotka RNA-polymerázy Gen používaný pro mikrobiologickou identifikaci u řady rodů jednoduchá technika Rozlišovací schopnost závisí na výběru části genu pro identifikaci výběr hypervariabilní oblasti Diverzita sekvencí genů mezi druhy rodu Staphylococcus 72 až 94 % Vnitrodruhová divergence 0,08 0,8 % V rámci rodu Staphylococcus rozlišeno 9 hlavních klastrů
rpob - metodika Mellmann et al., Emerg. Infect. Dis. 2006 12:333 336 480 bp fragment genu pro podjednotku beta RNApolymerázy B Primery pro PCR 1418f CAATTCATGGACCAAGC 3554r CCGTCCCAAGTCATGAAAC Podmínky PCR: vysoká stringence Sekvenování prostřednictvím vnitřního degenerovaného primeru 1975r GCIACITGITCCATACCTGT Drancourt a Raoult, JCM 2002 40:1333 1338 prvotní práce u stafylokoků 751 bp fragment, technicky náročnější
rpob fylogenetický strom Švec et al., SAM 2010, in press
rpob výhody/nevýhody Univerzální gen přítomný u všech bakterií Výborně koreluje s výsledky DNA-DNA hybridizace - přesná druhová identifikace a popis nových druhů Většina sekvencí získána moderními sekvenačními technikami v současné době bez chyb Fylogenetické stromy vykazují vyšší stabilitu (bootstrapové hodnoty) než stromy založené na 16S rrna nebo hsp60 Neexistuje specializovaná moderovaná databáze - nutnost vyhledávání sekvencí v GenBank
Získávání sekvenčních dat Databáze nukleotidových sekvencí GenBank/EMBL/DDBJ Lokální hledání podobností BLAST FASTA Specializované databáze SILVIA, RDP (rrna) cpndb Integrované zdroje StrainInfo Integrované identifikační databáze BIBI database
http://www.straininfo.net/
Závěr Srovnání diskriminační schopnosti sekvenování jednotlivých genů u stafylokokových druhů Lokus Podobnost mezi druhy Průměrná podobnost Délka (bp) 16S rrna 97-99,5 % 98 % ~ 1400 rpob 72-94 % 86 % ~ 480 nebo 750 hsp60 74-93 % 82 % ~ 600 soda 68-92 % 81 % ~ 430 dnaj 71 89 % 78 % ~ 880 gap 24 96 % 65 % ~ 930 Diagnostika: Využití poznatků a analýzy sekvenčních dat pro přípravu DNA microarrays Taxonomie: Rozvoj a využití vysoce účinných metod pro sekvenování celých genomů pro jejich klasifikaci
Přímé metody pro vnitrodruhovou typizaci SLST jednolokusová sekvenční typizace MLST multilokusová sekvenční typizace MLSA multilokusová sekvenční analýza
Jednolokusová Spa-typizace Sekvenování DNA polymorfního regionu genu pro protein A (spa) Určení kombinace opakovaných jednotek (repetic) v oblasti X dává jedinečný spa-typ reprodukovatelné, jednoznačné a snadno interpretovatelné výsledky postačující pro zkoumání vypuknutí infekce v dlouhodobém časovém horizontu by měla by být doplněna další technikou (PFGE, MLVA, aj.)
Princip spa-typizace 1.stanovení sekvence polymorfní oblasti genu spa TTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCT GGTAAAGAAGACAACAACAAACCTGGCAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCA ACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACGGAGTACATGTCGT TAAACCTGGTGATACAGTAAATGACAT 2.vyhledání koncových signaturních sekvencí 5'-signature TTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCT GGTAAAGAAGACAACAACAAACCTGGCAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCA ACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACGGAGTACATGTCGTTACATGTCGT TAAACCTGGTGATACAGTAAATGACAT 3.identifikace repetic dlouhých zpravidla 24 bp 5' GCACCAAAA GAGGAAGACAACAAAAAACCTGGT repetice č. 26 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACAACAACAAACCTGGC repetice č. 20 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACAACAACAAGCCTGGT repetice č. 12 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGT repetice č. 17 AAAGAAGACGGCAACAAACCTGGT repetice č. 16 AAAGAAGACGGCAACGGAG 3' TACATGTCGT 4.určení spa typu podle databáze 26-17-20-17-12-17-17-16 = spa typ t003 3'-signature
spa typizace - Staph type software
RIDOM Spa Server http://spaserver.ridom.de/
MLST multilokusová sekvenční typizace Stanovení sekvence 7 genů rozmístěných v různých místech genomu Přiřazení sekvencí do alelových typů Kombinace typů alel tvoří sekvenční typ (ST) Zavedena u celé řady druhů Databáze přístupná na webu S vhodnými statistickými algoritmy umožňuje provádět shlukovou analýzu a dedukci klonálních linií Vhodná pro dlouhodobé a globální epidemiologické analýzy
MLST internetová databáze (http://www.mlst.net/)
Rekonstrukce fylogeneze klonů eburst v3 algoritmus pro analýzu MLST typů (http://saureus.mlst.net/eburst/database.asp) CC8
Děkuji za pozornost pantucek@sci.muni.cz