Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088
Základy histochemie a imunohistochemie Metodické základy patologie
Histochemie Histologická metoda, při které prokazujeme ve vzorku tkáně pomocí chemické reakce přítomnost různých látek. Histochemie Průkazy anorganických iontů a sloučenin Perlsova reakce PAS reakce Feulgenova reakce Průkaz lipidů a sacharidů Katalytická histochemie Afinitní histochemie Imunohistochemie Lektinová histochemie In situ hybridizace
Histochemie Průkazy anorganických iontů a sloučenin Diagnosticky významné je prokazování určitých látek v těle ať už v případě soudního lékařství (zde např. kvůli otravám As, Pb, Hg, Ag) nebo v patologii kvůli odchylkám od norem výskytu látek (Ca, Fe, Zn, Al). Ca přebývá v těle v rozpustné, nerozpustné, ionizované i neionizované formě. Prokazuje se např. ionizovaný díky barvení HE modře v alkalické reakci (ph > 9). Fe3+ se prokazuje pomocí Perlsovy reakce (viz níže), Fe2+ s modrým zbarvením pomocí Turnbull blue. Zn jako součást inzulinu, či jako kofaktor mnohých enzymů se prokazuje pomocí zinconu s modrým výsledkem, dithizonem s červeným výsledkem.
Histochemie
Histochemie Perlsova reakce Perlsova reakce slouží k odlišení lipofuscinu, hematoidinu a hematinu, které jsou Perls negativní. Tato reakce se používá k průkazu hemosiderinu. Hemosiderin je zásobní forma železa, která je uložena ve formě depositů v buňkách zvaných siderofágy. Siderofágy (makrofágy) jsou fagocytující buňky, které pohlcují počkozené nebo staré erytrocyty. A právě reakcí mezi železnatými a železitými ionty obsaženými v hemosiderinu a žlutou krevní solí v erytrocytech vzniká modrá sraženina tzv. Berlínská modř. Klinická aplikace: diagnóza u pacientů s chorobami, při kterých se nadměrně ukládá železo (např. hemochromatóza) Metodika barvení řez tkání je inkubován ve směsi ferokyanidu draselného a kyseliny chlorovodíková výsledek: nerozpustné tmavě modré precipitáty ferokyanidu železitého Složení barvícího roztoku: ferokyanid draselný, destilovaná voda, kyselina chlorovodíková (2%). Řezy se umístí na 30 minut do barvícího roztoku při teplotě 60 C. Poté jsou řezy vyjmuty z barvícího roztoku a dobarveny jádrovou červení nebo hematoxylinem.
Histochemie Slezina: Perlsova reakce (M. Špaček)
Histochemie Histochemie anorganických látek Průkaz vápníku dle Kossy dusičnan stříbrný + Ca+ světlo černé sraženiny využití: hyperkalcémie poškození parenchymu orgánů (ledviny)
Histochemie Ionty Vápník např. depozita ionizovaného vápníku lze barvit hematoxylinem modře Zinek v molekule insulinu lze barvit zinconem(modře) či dithizonem(červeně)
Histochemie Cukry Cukry jsou prokazovány PAS reakcí (periodic acid-schiff) ta je založena na oxidaci kyselinou jodistou aldehydové skupiny ty potom reagují se Schiffovým reagens (jako ve Feulgenově reakci) výsledkem je sloučenina mající červeno-fialovou barvu PAS-pozitivnílátky: polysacharidy (glykogen) glykosaminoglykany /mukopolysacharidy/ (hyaluronová kys., chondroitinsulfát) proteoglykany glykoproteiny (thyreoglobulin, kolagen) glykolipidy (lipofuscin) Klinická aplikace: biopsie od pacientůs různými střádavými chorobami (glykogenózy, mukopolysacharidózy)
Histochemie PAS reakce PAS (Periodic Acid Schiff) reakce je založena na oxidační reakci kyseliny jodisté (HIO4) na 1,2-glykolové skupiny, které jsou přítomné na glukózových zbytcích. Vznikají aldehydové skupiny, které reagují s činidlem (Schiffovým reagens) za vzniku nové komplexní sloučeniny, která má purpurovou barvu. Struktury které lze touto metodou detekovat, označujeme jako PAS pozitivní (př. glykogen v játrech) Metodika barvení Složení Schiffova reagens pararosanilin absolutní alkohol destilovaná voda pyrosiřičitan sodný koncentrovaná kyselina chlorovodíková dithioničitan sodný Tkáňový řez se oxiduje v 1% kyselině jodisté po dobu 10 minut. Poté je vyjmut opláchnut ve vodě a následuje barvení Schiffovým reagens po dobu 10-ti minut. Nakonec se řez opláchne v destilované vodě a dobarví hematoxylinem (10 minut). Bestův karmín se používá jako metoda průkazu glykogenu v místě s příliš vysokou koncentrací, kde PAS metoda není přehledná.
Histochemie Tlusté střevo: PAS (M. Špaček)
Histochemie Tlusté střevo: PAS (M. Špaček)
Histochemie
Histochemie RNA Organely obsahující RNA se barví bazickými barvivy tj. např.: toluidinovou modří, metylenovou modří RNA však není jedinou bazofilní látkou ve tkáních, proto je nezbytné kontrolní preparát inkubovat s ribonukleázou DNA - Feulgenova reakce Jedná se o reakci, která prokazuje přítomnost DNA. Spočívá v hydrolýze DNA pomocí kyseliny chlorovodíkové, kde se v tomto procesu odštěpí purinové báze od monosacharidu a odhalí se tak aldehydové skupiny na deoxyribóze. Poté, podobně jako u průkazu polysacharidů, reagují aldehydové skupiny s Schiffovým reagens za vzniku nerozpustné červené sraženiny. Metoda se používá například v patologii v nádorové diagnostice, kde se určuje polyploidie buněk.
Histochemie Průkaz lipidů Lipidy se prokazují na zmražených řezech ponořených do alkoholů s roztokem barviva. Tím bývá často Sudan III a IV (červené) a Sudanová čerň (černé), dále olejová červeň nebo nilská modř (rozlišení kyselých a neutrálních lipidů). Vždy se musí tuky zachovat ve tkáni. Jako fixační prostředek používáme Bakerovu tekutinu (voda, formol, chlorid vápenatý)-redukuje solubilitu nepolárních lipidů. Fixace možná i oxidem osmičelým. Vznikají nerozpustné černé sraženiny lipidů a oxidu osmičelého. Provést před zpracováním tkání parafínovou technikou, protože tkáň nesmí přijít do styku s organickými rozpouštědly (benzen, xylen). Průkaz fosfolipidů barvíme luxolovou modří metoda vhodná pro znázornění myelinové pochvy nervových vláken.
Histochemie Katalytická histochemie Základní princip: Enzym reaguje se substrátem, který přemění na konečný produkt. Tento produkt je posléze přeměněn na barevnou sloučeninu (vizualizační reakce). Využívá se toho ke značení protilátek nebo hybridizačních sond i k detekci metabolických procesů v buňce. Dopad do patologie a soudního lékařství. Při všech těchto postupech se musí zachovat 4 základní pravidla pro uskutečnění katalytické histochemie: Přesnost při zachování morfologie sledovaných buněk či tkání nesmí produkt difundovat a je vázán na strukturách s předpokládaným výskytem enzymu. Specifita konečný produkt musí být výsledkem aktivity pouze jednoho enzymu. Toto se ověřuje na kontrolních řezech bez substrátu, kdy se nesmí objevit barevný produkt. Reprodukovatelnost pokus se může zopakovat bez významných odchylek. Validita při manipulaci s tkání nesmí být enzym ztracen, jeho distribuce a aktivita je zachovaná. Pro zachování funkcí enzymu nesmí být preparát postfixován!
Histochemie Katalytická histochemie Enzymy jsou katalyzátory většiny biochemických reakcí Užívá se zpravidla fixace zmražením Princip: První reakce (histochemická): enzym+ substrát reakční produkt Druhá reakce: vizualizace reakčního produktu Vždy nutnost kontrolních řezů Katalytická histochemie vizualizační reakce precipitace s kationty kovů vznik barevné nerozpustné soli Pb, Co simultánní azokopulace produkt (naftol) se převede na azobarvivo indigogenní reakce štěpení na indoxyl a jeho oxidace na indigo tetrazoliová metoda redukce tetrazoliové soli na barevný formazan spřažená peroxidázová reakce oxidace DAB
Histochemie Katalytická histochemie -příklady Gomoriho průkaz kyselé fosfatázy řez tkání+ substrát štěpený enzymem (např. glycerofosfát sodný) uvolnění fosfátových iontů jejich zachycení dusičnanem olovnatým výsledek: elektrodenzní precipitát Peroxidáza tkáňové řezy jsou inkubovány v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB (diaminoazobenzidin) DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován výsledek: nerozpustné černé (hnědé) elektrodenzní precipitáty Klinická aplikace: diagnostika leukémií (detekce peroxidázové aktivity v krevních buňkách) Peroxidáza se rovněž užívá ke značení v imunohistochemii a ISH
Histochemie Z. Lojda
Histochemie Afinitní histochemie Jeden z novějších postupů, který je stále více využíván jak ve výzkumu, tak v diagnostice. Umožňuje prokázat v cílové tkáni velmi nepatrná množství látek. Lze rozdělit: 1) Imunohistochemii (viz dále) 2) Lektinovou histochemii (viz dále) 3) Hybridizaci in situ (viz jiný seminář)
Histochemie Lektinová histochemie Lektiny jsou především rostlinné proteiny (glykoproteiny), kterých se využívá například k určování krevních skupin, k mitogenní stimulaci lymfocytů či normálních buněk. Váží se vysoce specificky na sacharidové části makromolekul.
Imunohistochemie Tento postup využívá základního principu interakce antigen protilátka, kdy protilátky přisedají afinitně na cílový antigen, proti kterému byly vyprodukovány. Monoklonální protilátky jsou produkovány hybridomy, polyklonální protilátky různými živočišnými druhy. Protilátky: sérové proteiny známé jako imunoglobuliny jsou vytvářeny plazmatickými buňkami v imunohistochemii nejčastěji používáme třídu IgG
Imunohistochemie Protilátky musí být označené, aby došlo k vizualizaci místa interakce a průkazu antigenů. Využívá se dvou základních metod: Přímá reakce v tomto případě nasedají primární protilátky, které jsou značené, na antigen. Označí tak místo interakce, avšak nevýhodou je nízká citlivost a nutnost použít zvýšené množství protilátek. Nepřímá reakce zamezuje nevýhodám přímé reakce, když primární protilátka přisedá na svůj antigen a s použitím sekundární protilátky tyto nasedají na protilátky primární. Sekundární protilátky jsou značené a může jich na primární přisednout mnohem více tím se zvyšuje citlivost detekovatelné reakce.
Imunohistochemie
Imunohistochemie Mezi markery (značky), které se používají k vizualizaci reakce, patří: fluorochromy pro zviditelnění reakce ve fluorescenčním mikroskopu molekulární komplexy např. ABC často užívaný komplex k amplifikaci signálu nepřímé metody autoradiografie protilátky nesou radioaktivní látky, které vysílají záření na fotografickou emulzi enzymy využívá se katalytické histochemie; protilátka nesoucí enzym přisedá na antigen a po dodání substrátu jej enzym přemění na barevný produkt.
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky jsou klonované protilátky, které jsou všechny zaměřené proti stejnému epitopu jsou tedy mimořádně specifické Aktivované B-buňky produkují směs protilátek zaměřených proti různým epitopům Aktivovaná B-buňka má jen omezenou životnost a sama se nemnoží Jak můžeme selektovat jeden klon B-buněk a prodloužit buněčnou linii?
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie Fluorochromy Fluorochromy jsou látky schopné absorpce záření ve formě UV či viditelného světla tato absorpce zapříčiní excitaci elektronů v molekule barviva při následném přechodu zpět na energeticky nižší hladinu dojde k emisi záření o jiné vlnové délce fluorochromy: FITC (fluoresceinisothiocyanát), rhodamine (TRITC), DAPI atd.
Imunohistochemie Fluochromy FITC Na+/K+ ATPáza v bazolaterálním labyrintu proximálních a distálních ledvinných tubulů
Imunohistochemie Kůže: Melanocyty a Langerhansovy buňky (M.Špaček)
Imunohistochemie Pankreas: L. ostrůvky insulin (M. Špaček)
Imunohistochemie Pankreas: L. ostrůvky somatostatin v D buňkách (M. Špaček)
Imunohistochemie Kyselý neurofilamentový protein v neuronech (M. Špaček)
Imunohistochemie MUDr. M. Špaček