AUTOMATIZACE V KLINICKÉ IMUNOLOGII Radomír Pilný 1 LABAUTO 2018 25. 26.10. 2018 Olomouc
OBECNÝ ÚVOD Alergologie a klinická imunologie (AKI) je klinicko-laboratorní obor, který zasahuje do všech oblastí medicíny Zabývá se analýzou funkce imunitního systému, proto také jak jeho klinická, tak laboratorní část musí a také využívá ve větší nebo menší míře nástroje a prostředky ostatních oborů medicíny Imunologické parametry jednotlivých pacientů jsou ovlivněny interindividuální variabilitou (genetické faktory + různá míra antigenní stimulace v průběhu života) Vždy je nutné posuzovat imunologické výsledky ve vztahu ke klinickému nálezu pacienta Analyty jsou indikovány cíleně na základě kliniky, nikoliv screeningově (od tohoto se odvíjí i počet vzorků v imunologii) Je zapotřebí si uvědomit, že imunoanalytické metody, tj. metody založené na interakci antigenů s protilátkami, nelze dnes ještě standardizovat ani unifikovat 2
SDÍLENÉ VÝKONY ODBORNOSTI 813 Hematologie Imunofenotypizace leukocytů Průtokový cytometr Specifické proteiny Nefelometrie Turbidimetrie Imunologie Sérologie ELISA Western Blot Biochemie Mikrobiologie 3
IMUNOLOGICKÁ LABORATOŘ KONSOLIDACE Preanalytická část Analytická část Postanalytická část Odběr BM Měření analytu Archivace vzorků Transport BM od Likvidace BM zákazníka do laboratoře Schvalování a Centrifugace BM intepretace výsledků Alikvotace Vydávání Identifikace alikvotů výsledkových zpráv Skladování BM Zpracování žádanek 4
IMUNOLOGICKÁ LABORATOŘ KONSOLIDACE Preanalytická část Analytická část Postanalytická část Odběr BM Měření analytu Archivace vzorků Transport BM od Likvidace BM zákazníka do laboratoře Schvalování a Centrifugace BM intepretace výsledků Alikvotace Vydávání Identifikace alikvotů výsledkových zpráv Skladování BM Zpracování žádanek 5
AUTOMATIZACE V PREANALYTICKÉ FÁZI Automatizace v preanalytické části záleží na: Počtu pacientských vzorků imunologie má řádově menší počet vzorků než biochemie nebo hematologie Možnostech LISu elektronická žádanka, čárové kódy je standardní součást imunologických laboratoří Počtu činností, které jsou do automatizace zahrnuty (alikvotace, centrifugace, ) Dodržení preanalytické fáze některých vyšetření komplement, Stupni konsolidace imunologické laboratoře s ostatními laboratorními obory 6
AUTOMATIZACE V ANALYTICKÉ FÁZI Volba přístrojové techniky a míra automatizace laboratorního provozu pro dané pracoviště by měla být vždy individuální, závislá na požadovaném metodickém spektru a množství jednotlivých vyšetření Podle toho by se mělo pracoviště mj. i rozhodovat, zda volit otevřené nebo uzavřené systémy a jakou míru automatizace volit Vždy se budou střetávat teoretické možnosti řešení zadaného problému a objem finančních prostředků, které jsou k dispozici pro jeho řešení 7
Autoprotilátky (v séru) Nepřímá imunofluorescence (IIFA) ELISA LEIA FEIA a další Komplement, protilátky po očkování ELISA WB KFR Specifické IgE LEIA FEIA ELISA multiplexové techniky a další Transplantační imunologie PCR (-SSP, -SOP) Sekvenování (NGS) xmap ( Luminex ) Průtoková cytometrie 8
Autoprotilátky (v séru) Nepřímá imunofluorescence (IIFA) ELISA LEIA FEIA a další Komplement, protilátky po očkování ELISA WB KFR Specifické IgE LEIA FEIA ELISA multiplexové techniky a další Transplantační imunologie PCR (-SSP, -SOP) Sekvenování (NGS) xmap ( Luminex ) Průtoková cytometrie 9
Autoprotilátky Nepřímá imunofluorescence (IIFA) 10
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE HISTORIE 11
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE SOUČASNOST/BUDOUCNOST 12 12
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE SOUČASNOST/BUDOUCNOST QUANTA-Lyser (Inova, USA) SQ II (Aesku, Německo) 13 PhD IX systém (BIO-RAD, USA) Sprinter XL (EUROIMMUN, Německo)
VÝHODY X NEVÝHODY AUTOMATIZACE IIFA Výhody Úspora času pracovníků Reprodukovatelnost výsledků odstranění vlivu pracovníka Snížení počtu záměn vzorků - používání čárových kódů Možnost zpracování velkého množství vzorků za den Nevýhody Omezený počet analytů prováděných najednou (závisí na analyzátoru) Rozdíl v intenzitě fluorescence mezi ruční přípravou a analyzátorem Rychlost stanovení při menším počtu vzorků je manuální práce rychlejší Spotřeba většího množství reagencií (konjugát, kontroly mrtvý objem) Analyzátor po dobu ředění vzorky blokuje Uzavřený systém použití reagencií od jednoho výrobce 14
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE AUTOMATICKÉ FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPY BUDOUCNOST???? Nova View (INOVA, USA ) 15 EUROPattern (EUROIMMUN, Německo) HELIOS (AESKU, Německo)
VÝHODY X NEVÝHODY AUTOMATICKÝCH FLUORESCENČNÍCH MIKROSKOPŮ Výhody Vyřazení (odlišení) negativních vzorků od pozitivních Identifikace vzorků z LISu Archivace fluorescenčních obrazů možnost porovnání uložených obrazů v rámci pacienta v čase Odečet IFA obrazů na jiném PC vzdálený přístup Nevýhody Omezený počet analytů (ANA screen, dsdna, ANCA) zatím Musí být dobře připraveny vzorky (pečlivá příprava vzorků) Velmi pomalé vyhodnocování vzorků jeden pacient trvá cca 0,5-3 min. u ANA screen Rozlišení obrazů na monitoru Zatím nedokonalé rozřazení jednotlivých obrazů (směsné obrazy) nutná přítomnost operátora 16
Autoprotilátky ELISA, CLIA, FEIA 17
ELISA HISTORIE/SOUČASNOST/BUDOUCNOST 18
ELISA SOUČASNOST/BUDOUCNOST 19 19
ELISA ANALYZÁTORY PŘÍKLADY NexGen Four (Adaltis, Italie) Agility (Dynex, USA) DS2 (Dynex, USA) EUROLabWorkstation ELISA (EUROIMMUN, Germany) 20
VÝHODY X NEVÝHODY ELISA ANALYZÁTORŮ Výhody Oboustranná komunikace s LISem Analyzátory identifikují vzorky, ředí je, promývají, inkubují, měří. Úspora času pracovníků Snížení počtu záměn vzorků čárové kódy Reprodukovatelnost výsledků Provádějí více stanovení analytů najednou Nevýhody Některé analyty mají omezení v postupu (ředění, inkubace a zároveň třepání, ) Pořizovací cena a náklady na servis analyzátorů Měření po metodách Málo početné analyty se nevyplatí měřit na ELISA analyzátorech 21
ANALYZÁTORY NA PRINCIPU CLIA, FEIA BIO-FLASH (Inova, USA) BioPlex 2200 (Bio-Rad, USA) 22 IDS-iSYS (IDS, UK) Phadia 250 (T. F. S., USA) LIAISON XL (DiaSorin, Italie)
ANALYZÁTORY NA PRINCIPU CLIA, FEIA Plnohodnotné automatické analyzátory na principu FEIA, CLIA Random access přístup První instalace v ČR před cca 5 roky Až 60 výsledků za hodinu On-line napojení na LIS (obousměrná komunikace) První výsledek již za 30 minut (záleží na analyzátoru) Velmi často měří i analyty z oblasti sérologie nebo specifických IgE Možnost napojení některých systémů na automatické linky (Inpeco, ) 23
ANALYZÁTORY NA PRINCIPU CLIA, FEIA Výhody Měření vzorků v režimu random access kratší TAT Větší rozsah měření Kvantifikace stanovení IP x kiu/l Oboustranná komunikace s LISem Snížení počtu záměn vzorků čárové kódy Reprodukovatelnost výsledků Nevýhody Omezená nabídka analytů Cena za reagencie Větší objem vzorků díky mrtvému objemu Vyplatí se při větším počtu vzorků 24
JINÉ MOŽNOSTI PRO STANOVENÍ AUTOPROTILÁTEK STRIPOVÉ TECHNIKY Alegria (Orgentec, Německo) Všechny reagencie na jednom stripu Velké spektrum autoprotilátek (až 60 analytů) On-line propojení Jednoduchá manipulace se stripy Kalibrační křivka v přístroji (na stripu) Měření po pacientovi a metodě Vhodné pro málo početné analyty Chorus Trio (Diesse, USA) 25
Autoprotilátky multiplexové techniky 26
AUTOPROTILÁTKY MULTIPLEXOVÉ TECHNIKY EUROBlotOne (Euroimmun, Německo) Microblot array (Test-Line, ČR) 27
AUTOPROTILÁTKY SHRNUTÍ Hodnocení IIFA obrazů zůstane i v budoucnu do značné míry závislé na zkušenosti operátorů Použitelnost automatických fluorescenčních mikroskopů jako nástroje pro vyhodnocování fluorescenčních obrazů ukáže čas (rozhodně mohou být užitečné pro archivaci fluorescenčních obrazů) Začínají se prosazovat plnohodnotné analyzátory na principu CLIA, FEIA,, které měří v režimu random access u nejčastěji stanovovaných autoprotilátek zde je možnost propojení k automatickým linkám Metoda ELISA bude i v budoucnu mít pravděpodobně nezastupitelnou roli Možná se budou vyrábět více analyzátory, které využívají měření po jednotlivých metodách/pacientech (stripové techniky) 28
Specifické IgE 29
SPECIFICKÉ IGE Dnes používané principy jsou: LEIA Immulite 2000 (Siemens) FEIA Phadia (T. F. S.) ELISA 1) alergeny jsou ukotveny na disku (RISA - Biomedica) 2) alergeny jsou v tekuté podobě (REAST Dr. Fooke) Multiplexové techniky ISAC, Alex, Optigen, Dnes lze vyšetřovat více než 1.200 specifických IgE (směsi, extrakty, ) Komponentová diagnostika stanovování sp. IgE proti jednotlivým molekulám alergenů 30
AUTOMATY SOUČASNOST/BUDOUCNOST NOVEOS (Hycor, USA) Phadia 250 (T. F. S., USA) Immulite 2000 (Siemens, USA) 31
AUTOMATY SOUČASNOST/BUDOUCNOST Výhody Random access přístup Možnost napojení analyzátoru do linky Rychlost odezvy vyšetření On-line napojení do LISu Výrazná úspora času pracovníků oproti ELISA Vysoká míra reprodukovatelnosti Nevýhody Omezené spektrum analytů oproti ELISA metodám Cena za test Nevhodné pro malé počty vzorků/analytů (exspirace reagencií na palubě) 32
MULTIPLEXOVÉ TECHNIKY SOUČASNOST/BUDOUCNOST??? Alex (MADX, Rakousko) ISAC (T. F. S., USA) EUROBlotOne (Euroimmun, Německo) Optigen (Hitachi, Japonsko) 33
MULTIPLEXOVÉ TECHNIKY SOUČASNOST/BUDOUCNOST??? Výhody Stanovení více specifických IgE v rámci jednoho stanovení (100 300 analytů) Levnější oproti ELISA, LEIA a FEIA technikám (analyt/cena) Menší spotřeba vzorku 100 ul séra Možnost pracovat po pacientovi Dostatečná citlivost, senzitivita i specificita Nevýhody Lékař dostane velké množství informací, které ani nepožadoval Občas složitá interpretace výsledků Omezené spektrum analytů (114 /300 specifických/komponent IgE) Vyžaduje skenery a software pro odečet výsledků Semikvantitativní vyhodnocení 34
AUTOMATIZACE V POSTANALYTICKÉ FÁZI Schvalování výsledků vyšetření velmi často jsou součásti výsledkových zpráv interpretace nebo doporučení, tj. nelze automatizovat nebo algoritmizovat Častá konzultace výsledků vyšetření s kliniky Společná výsledková zpráva s jinými odbornostmi komfort pro zákazníka, ale imunologie má delší dobu odezvy elektronické posílání výsledků vyšetření Archivace vzorků v imunologii často doordinace vyšetření i několik dnů nebo týdnů po vydání výsledkové zprávy 35
PROČ JE AUTOMATIZACE V IMUNOLOGII OBTÍŽNÁ? Relativně velké spektrum analytů a stále se do praxe uvádí nové Některé analyty zatím plně automatizovat prostě nelze (LEIA, FEIA, CLIA,...) Velké spektrum výrobců s relativně omezenou nabídkou Různá kvalita reagencií mezi výrobci i mezi jednotlivými analyty v rámci výrobce Automatizace některých analytů některé méně časté analyty se automatizovat nevyplatí Vyšší cena reagencií pro CLIA, FEIA, LEIA analyzátory 36
PŘÍKLAD TAT Počet dnů (včetně dnů pracovního klidu) 10:48 10:12 9:36 9:00 8:24 7:48 7:12 6:36 6:00 5:24 4:48 4:12 3:36 3:00 2:24 1:48 1:12 0:36 Doba odezvy laboratorního vyšetření (pouze sérologie, imunologie) Začátek automatizace 0:00 2006 2008 2010 2012 2014 2016 2018 2020 Roky Půměrný TAT Median TAT 37
ZÁVĚR Volba přístrojové techniky a míra automatizace laboratorního provozu pro dané pracoviště by měla být vždy individuální, závislá na požadovaném metodickém spektru a množství jednotlivých vyšetření V budoucnu bude určitě docházet k větší automatizaci v imunologii Není možná algoritmizace výsledků imunologických vyšetření, výsledky je vždy nutné vztahovat ke klinickému obrazu pacienta a velmi často bude i nadále potřebná interpretace Možná by občas místo nadměrné automatizace laboratoří stačila změna v organizaci práce 38
Děkuji za pozornost 39