IMPEDANČNÍ METODY DETEKCE MIKROORGANISMŮ Srovnání s jinými mikrobiologickými metodami Praktické aplikace Ladislav Čurda Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT Praha
Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při zavádění nových metod Možnosti zkrácení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody přímé nepřímé
Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při zavádění nových metod Možnosti zkrácení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody přímé nepřímé
Modifikace a automatizace klasických metod Automatizované systémy pro ředění vzorků,... SystémyPetrifilm,Isogrid,Redigel PetriFoss & BioFoss
Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při i zavádění nových metod Možnosti zkrácen cení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody přímé nepřímé
Metody s přímým p počítáním bakteriáln lních buněk DEFT (Direct epifluorescent filter technique) BactoScan 8000S
BactoScan 8000S - schéma
Záznam PHA BactoScanu
BactoScan - BSC versus CFU CFU = 3 CFU = 7 BSC = 12
BactoScan - kalibrace
BactoScan - kalibrace
BactoScan Kalibrace Výhody rychlost (výsledek za 5 min) vysoká kapacita (80 vzorků/h) přesnost Nevýhody vysoká pořizovací cena jednoúčelové zařízení pro stanovení CPM v syrovém mléce
Rychlé mikrobiologické metody Význam Klasické mikrobiologické metody nevýhody referenční při i zavádění nových metod Možnosti zkrácen cení doby mikrobiologického rozboru automatizace klasických metod alternativní metody příímé nepřímé
Nepřímé mikrobiologické metody Princip Měřené veličiny: impedance, vodivost ATP pyruvát generované teplo radioaktivní CO 2 turbidita změna barvy indikátoru (ph, redox, volné -NH 2 skupiny) enzymová aktivita imunoreakce (ELISA)
Bioluminiscenční metoda Princip: luciferáza ATP+ luciferin + O 2 ---------------------> oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + světlo Mg 2+ 1 CFU 0.47 (0.22 až 1.03) fg ATP Formy ATP a jejich rozlišení somatický mikrobiální Postup analýzy (přístroj Lumac)
Vzorek obsahující pouze mikrobiáln lní ATP:
Vzorek obsahující pouze mikrobiáln lní ATP:
Vzorek s mikrobiáln lním m i nemikrobiáln lním m ATP:
Vzorek s mikrobiáln lním m i nemikrobiáln lním m ATP:
Vzorek s mikrobiáln lním m i nemikrobiáln lním m ATP:
Bioluminiscenční metoda Příklady aplikací: sledování celkové kontaminace povrchu kontrola účinnosti čisticího postupu po kalibraci stanovení CPM např. v mléce Výrobci přístrojů pro stanovení ATP Lumac BioOrbit Henkel Foss Elecric (BactoFoss)
BactoFoss
BactoFoss - schéma
Kalibrační graf - BactoFoss
Bioluminiscenční metoda Výhody relativně nízká počáteční investice vysoká citlivost rychlost Nevýhody nelze rozlišit jednotlivé skupiny mikroorganismů vysoká cena chemikálií
IMPEDANČNÍ METODA
Impedanční metoda Princip Měření a registrace změn impedance růstového média v průběhu kultivace závislost průběhu změn impedance na výchozím počtu mikroorganismů Impedance
BacTrac - měřené veličiny iny relativní změna impedance média relativní změna elektrodové impedance detekční čas
Detekční čas - DT Definice - doba kultivace nutná pro dosažení nastavené změny impedance Parametry ovlivňující DT počáteční koncentrace MO druh MO (generační doba) fyziologický stav kultivační médium
Přístroj BacTrac Konfigurace a technické parametry Řídící počítač + inkubační bloky (až 6) Kapacita bloku 20 vzorků (MiniTrac), 40 vzorků (Bactrac 4100) Temperace Měření v opakovaně sterilovatelných celách, objem 10 ml (příp. 100 ml) Doba měření, interval snímání impedance
Obslužný program Demonstrační program BACDEMO.BAT
Porovnání impedančního měřm ěření na přístroji BacTrac s ostatními metodami ředění vzorků výhoda využití optimální teploty a selektivních médií (Salmonella, Listeria, Clostridium, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, koliformní, kvasinky) měření elektrodové impedance pro média s vyšší vodivostí po inokulaci nevyžaduje další obsluhu zkrácení doby analýzy - zejména pro více kontaminované vzorky automatické ukládání dat a jejich vyhodnocení možnost dalšího zpracování dat vzorek po kultivaci lze použít k další konfirmaci vyšší investice, avšak poměrně nízké provozní náklady
Aplikace impedanční metody ověř ěřované na Ústavu technologie mléka a tuků Kalibrace impedanční metody Aktivita jogurtové kultury Vliv různých podmínek na aktivitu jogurtových kultur (inokulum, teplota,...) Vliv obsahu tuku a sušiny na průběh impedanční křivky Porovnání kysací schopnosti kravského a kozího mléka Průběh kysací a impedanční křivky Opakovatelnost měření Sterilita UHT výrobku Vliv nemléčných aditiv na růst bakterií mléčného kvašení Další možnosti vyhodnocení impedanční křivky
Kalibrace přístrojep BacTrac 4100 Stanovení CPMM a koliformních MO v syrovém mléce a v Lučině
Kalibrace přístroje BacTrac 4100 CPMM v syrovém mléce, médium 001A, inokulum 10 %, 30 C 14 13 12 11 b(0) = 21.62 b(1) = - 2.45 r = 0.84 DT [h] 10 9 8 7 6 Experimentální data Regresní přímka Konfidenční interval 5 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 6.00 Log CFU
Kalibrace přístroje BacTrac 4100 Koliformní MO v syrovém mléce, médium 160 B, inokulum 10 %, 30 C 16 14 12 b(0) = 15.09 b(1) = - 1.94 r = 0.79 DT [h] 10 8 6 Experimentální data Regresní přímka Konfidenční interval 4 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Log CFU
Kalibrace přístroje BacTrac 4100 CPMM v Lučině, médium 001 A, inokulum 10 %, 30 C 30 25 20 b(0) = 27.22 b(1) = - 3.64 r = 0.86 DT [h] 15 10 5 0 Experimentální data Regresní přímka Konfidenční interval 1 2 3 4 5 6 Log CFU
Vyhodnocení kalibrace přístroje Bactrac 4100 Kalibrační rovnice: Log CFU (BacT) = a(0) + a(1)*dt a(0) a(1) r Sxy Syrové mléko CPMM COLI 8.80 7.79-0.41-0.52 0.84 0.79 0.21 0.31 Lučina CPMM 7.48-0.27 0.86 0.41
Ov Ověř ěřen ení kalibrace kalibrace Plotnová metoda CFU BacTrac DT-M5% DT-M5% COLI CPMM COLI CPMM COLI CPMM Vzorek [1/ml ] [1/ml ] [1/ml ] [1/ml ] [hod] [hod] 85 30000 87 43700 12.1 10.72 1 93 58200 73 57500 12.33 9.97 2 230 178000 406 154900 10 8.47 3 865 41000 919 63100 8.89 9.82 4 680 62300 262 33100 10.6 10.78 5 185 390000 198 616200 10.98 7.41 6 2300 36500 932 91200 8.87 9.27 7 209 82600 406 69100 10 9.67 8 1980 172000 1406 147900 8.31 8.54 9 655 31200 805 46800 9.07 10.27 10 430 68500 817 69200 9.05 9.69 11 536 47200 518 57500 9.67 9.97 12 103 76300 348 52500 10.21 10.11 13 2030 65300 1179 69200 8.55 9.67 14 600 172300 507 166000 9.7 8.36 15 830 196300 932 112200 8.87 8.96 16 3873 72300 2218 47900 7.69 10.25 17 127 2300 294 40700 10.44 10.46 18 1068 92600 899 147900 8.92 8.54 19 1300 10300 1241 22400 8.48 11.37 20 586 55200 587 64600 9.5 9.8 21 436 156200 415 128800 9.97 8.74 22 4003 298500 2267 190600 7.66 8.15 23 1732 345800 1241 245500 8.48 7.77 24 2530 845800 2422 1122000 7.57 5.52 25
Aktivita jogurtové kultury
Vliv obsahu tuku média na průběh impedanční křivky Jogurtová kultura, médium - mléko o různé tučnosti, inokulum 0.005 %, 42 C M [%] 50 40 30 20 10 Tuk: 0.05 % 1.8 % 3.6 % 6.0 % 12.0 % 18.0 % 24.0 % 33.0 % 0 0 2 4 6 8 10 12 Čas [h]
Vliv sušiny média na průběh impedanční křivky Jogurtová kultura, médium - mléko o různé sušině, inokulum 0.005 %, 42 C 35 M [%] 30 25 20 15 10 Sušina: 5 % 10 % 15 % 20 % 25 % 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Čas [h]
Porovnání prokysávání kozího a kravského mléka Jogurtová kultura, inokulum 0.01 %, 42 C 40 35 30 25 M [%] 20 15 10 Kozí mléko Kravské mléko 5 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Čas [h]
Porovnání průběhu kysací a impedanční křivky
Porovnání průběhu ph, SH a M-hodnoty Jogurtová kultura A - MZ, 0.1 % inokulum, 42 C 7 50 40 ph 6 5 ph SH M-hodnota 30 20 M-hodnota [%], SH 10 4 0 1 2 3 4 5 6 0 Doba kultivace [h]
Comparison of ph and impedance measurement Yoghurt culture at 38 C, DVS Total solids 15.70 %, fat 3.7 %, sugar 1 % 8 40 35 ph 7 6 5 ph Relative ph M-value Target ph 30 25 20 15 10 RpH, M-value [%] 4 5 0 3 0 2 4 6 8 10 12 14 Cultivation time [h]
Opakovatelnost měření impedance
25 Opakovatelnost měření změn impedance Jogurtová kultura 38 C, DVS Sušina 17.01 %, tuk 2.5 %, cukr 5.5 %, 10 paralelních měření 20 M-hodnota [%] 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Doba kultivace [h]
Testování sterility
Test sterility UHT výrobku 12 M [%] 10 8 6 4 bez předkultivace 3 dny 5 dní 5 dní (kont.) 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Čas [h]
Vliv nemléčných ných aditiv na růstr bakterií mléčného kvašen ení
18 Vliv nisinu na průběh impedanční křivky Lactococcus lactis subsp. lactis, kmen R5, BiMedia 001A, inokulum 1 % M [%] 16 14 12 10 8 6 0 IU 25 IU 50 IU 100 IU 250 IU 4 2 0 0 10 20 30 40 50 Čas [h]
45 40 35 30 Závislost detekčního času na koncentraci nisinu Lactococcus lactis subsp. lactis, kmen R5, BiMedia 001A, inokulum 1 % DT [h] 25 20 15 10 5 0 0 25 50 75 100 Koncentrace nisinu [IU]
Vliv přídavku medu na průběh impedanční křivky Lactobacillus acidophilus A92, médium - mléko, inokulum 0.1 %, 37 C M [%] 30 25 20 15 10 0 % medu 3 % N 3 % T 3 % S 10 % N 10 % T 10 % S 5 0 0 5 10 15 20 25 Čas [h]
Další možnosti vyhodnocení inflexní bod impedanční křivky směrnice lineární části Vyhodnocení průběhu impedanční křivky Lactobacillus acidophillus A92, 1 % inokulum v obnoveném mléce, 37 C 25 20.8.7.6 M [%] 15 10.5.4.3 dm [%] 5 0.2.1 0.0 0 5 10 15 20 25 Čas [h]