MS kvantifikace Martin Hubálek http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm
obsah Kvantifikace v analytické chemii Pojmy HPLC příklad MS kvantifikace Vhodné hmotnostní analyzátory Principy kvantifikace MRM smrm HRMS Příklady
Příklad Úkol: vytvořte metodu pro kvantitativní stanovení opiodů v lidské moči pro forenzní účely
Definice účinnosti analytického postupu Použitelnost - schopnost identifikovat analyt v daném koncentračním rozsahu a s přijatelnou neurčitostí Specificita - schopnost metody zobrazit pouze hledaný analyt v přítomnosti ostatních látek. Selektivita - schopnost postupu kvantifikovat analyt v přítomnosti interferujících látek. Přesnost - rozptyl nezávislých měření za stejných měřících podmínek Správnost - určuje shodu mezi měřenou hodnotou a skutečnou hodnotou. Nepřesnost je způsobená náhodnou a nenáhodnou chybou Pravdivost - vzdálenost mezi pravdivou hodnotou a průměrnou hodnotou z opakovaných měření Výtěžnost - percentuální odhad detekovaného množství analytu z celkového možného v průběhu analytického postupu Rozsah Interval od minimální po maximální hodnotu odezvy Lineární dynamický rozsah - koncentrační interval, kde se hodnota signálu mění lineárně se změnou analytické koncentrace Kritické hodnoty - minimální hodnota signálu, která může být odlišitelná od pozadí s definouvanou úrovní spolehlivosti Limit detekce - nejnižší hodnota množství nbo koncentrace, která je detekovatelná s definovanou úrovní spolehlivosti Limit kvantifikace - nejnižší hodnota množství nebo koncentrace analytu, která je změřena s definovanou přesností Citlivost - směrnice přímky kalibrační křivky Odolnost schopnost metody poskytovat stejné analytické výsledky pro stejné vzorky i v případě změny experimentálních podmínek (různá laboratoř, různé přístroje, odlišný den) Robustnost - schopnost metody být nezávislý na malých měnách operačních podmínek (teplota, ph)
Mez stanovitelnosti (Lower Limit of Quantification LLOQ) Nejnižší koncentrace analytu, kterou lze s definovanou přesností kvantitativně stanovit a pro kterou byla metoda validována Zpravidla nejnižší bod kalibrace Kritérium Koncentrace jejíž odezva má hodnotu S/N = 10 Koncentrace jejíž odezva je 5x vyšší v porovnání se slepým vzorkem a získaná s přesností 20% a správností 80-120% Koncentrace s odezvou 10x vyšší než směrodatná odchylka hodnoty slepého vzorku matrice (Duncan, Gale, Yergey: The principles of Quantitative Mass Spectrometry, 2006)
Citlivost stroje udávaná plochou píku a S/N x10 4 1 0.95 0.9 0.85 0.8 0.75 0.7 0.65 0.6 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Avg. Area = 14,519 Avg. S/N = 393,000:1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 Counts vs. Acquisition Time (min) Reserpine (+), 1 pg on-column
Způsob jak ovlivnit S/N Zvýšit signál Zvýšit výtěžek Zúžit šířku píku Zvýšit frekvenci průměrování skenu Snížit šum Vybrat jinou oblast Snížit šířku oblasti šumu přizpůsobit baseline Použít vyhlazení a filtraci šumu Použít jinou metodu výpočtu šumu: Peak-to-Peak, RMS, and... a. Peak-to-peak noise b. RMS noise c. Smoothing d. Baseline noise filtering
Instrument Detection Limit (IDL) IDL LCMS = t SD = t (%RSD / 100) měřené množství IDL Minimální množství analytu, které je detekovatelné a spolehlivě odlišitelné od šumu pozadí %RSD vs. Analyzované množství t Student t hodnota, pro 99% úroveň spolehlivosti n 1 stupňů volnosti %RSD Měřené množství Relativní směrodatná odchylka / přesnost stanovení plochy píku na úrovni měřené koncentrace z n počtu opakovaných nástřiků Omezené na 2 5 x vyšší hodnotu koncentrace než Limit detekce(dl) %RSD se zvyšuje při nižším analyzovaném množství
Příklad stanovení compound Amount measured Replicates Area %RSD t (99%) IDL Reserpine (+) 1 fg n = 10 7.2 2.821 0.20 fg Chloramphenicol (-) 1 fg n = 10 9.7 2.821 0.27 fg 1 fg of reserpine (+) 1 fg of chloramphenicol (-) 1 x10 7.8 7.6 IDL = t x (%RSD / 100) x měřené množství = 2.821 x (7.2 / 100) x 1 fg = 0.20 fg 1 x10 7.8 IDL = t x (%RSD / 100) x měřené množství = 2.821 x (9.7 / 100) x 1 fg = 0.27 fg 7.4 7.6 7.2 7.4 7 6.8 6.6 6.4 6.2 6 5.8 5.6 5.4 7.2 7 6.8 6.6 6.4 6.2 6 5.8 5.6 5.4 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 Acquisition Time (min) 1.45 1.55 1.65 1.75 1.85 1.95 2.05 Acquisition Time (min)
Hmotnostní analyzátory pro kvantifikaci QQQ Orbitrap QTOF Iontové pasti Sektorové MS Ionizace ESI nanoesi APCI (MALDI)
MS pro kvantifikaci Akviziční módy Full scan - total ion current plot (TIC) Selected Ion Monitoring (SIM) Selected Reaction Monitoring (SRM) nebo multiple reaction monitoring (MRM). MRM a SRM jsou různé výrazy pro stejný děj
QQQ MS1 MS2 MS3 Scanned No CID Scanned Full scan Fixed No CID Fixed SIM Fixed CID Scanned Product Ion Scanned CID Fixed Parent Ion Scanned CID Scanned Neutral Loss Fixed m/z CID Fixed m/z MRM
MS kvantifikace Doporučený způsob kvantitativní analýzy je MS/MS Pouze MS nedostatek specificity, selektivity, zvlášť v komplexní matrici (př. krevní plazma) MS/MS ve většině případů poskytuje unikátní fragmentační ion
Single vs. Triple quadrupole Srovnání SIM a MRM XIC of +Q1 MI (68 ions): 253.2 amu from Sample 13 (1ng/ml Q in soil) of comparison... Max. 6.7e4 cps. XIC of +MRM (34 pairs): 253.2/171.2 amu from Sample 14 (1ng/ml QqQ in soil) of c... Max. 6620.0 cps. 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 6500 6000 5500 6.9 1.2e5 5000 1.1e5 4500 In te n s ity, c p s 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.6 7.1 9.6 11.1 In te n s ity, c p s 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time, min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time, min
Multiple Reaction Monitoring (MRM) Selected Reaction Monitoring (SRM) Q 1 Q 2 Q 3 Výběr prekurzoru Fragmentace Výběr (CAD) fragmentu 220 > 136 (10) Tvorba přechodů dle teoretického fragmentačního spektra, nebo podle knihovny změřených spekter Pro malé molekuly 2 přechody Kvantifikační Konfirmační Pro peptidy více přechodů
% % MS APLDNDIGVSEATR (Beta-galaktosidáza) LV100309 Bgal 55 120min Q10-04034 669 (27.277) AM (Cen,4, 80.00, Ar,5000.0,0.00,1.00); Sm (SG, 8x3.00); Sm (SG, 8x3.00) 729.3654 1.53e4 100 729.8720 0 730.3918 736.4456 737.4578 715 720 725 730 735 740 745 m/z MSMS y1 y3 y5 y6 y7 y8 y9 y10 y11 y12 y13 LV100309 R Bgal TA 55 120min ES V G I D N D L P A b2 b4 b6 Q10-04034 194 (27.077) Sm (SG, 8x3.00); Sm (SG, 8x3.00); Cm (194) 100 719.3724 18.6 169.0914 563.2598 183.1405 326.1555 832.4432 1176.5780 1289.6802 833.4423 1290.7043 Přechody: ID Q1 Q3 CE 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z APLDNDIGVSEATRy8 729,4 832,5 42 APLDNDIGVSEATRy12 729,4 1289,6 42 APLDNDIGVSEATRy11 729,4 1176,6 42
In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 1,8e5 17,14 1,6e5 1,4e5 729,4 832,5 1,2e5 1,0e5 8,0e4 6,0e4 4,0e4 2,0e4 XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/832,5 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,4e5 cps. 1,8e5 17,14 1,4e5 17,14 1,6e5 1,2e5 1,0e5 729,4 1176,6 1,4e5 8,0e4 1,2e5 6,0e4 4,0e4 1,0e5 2,0e4 8,0e4 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min 6,0e4 XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1289,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... 1,28e5 1,20e5 1,00e5 8,00e4 6,00e4 4,00e4 17,12 Max. 1,3e5 cps. 729,4 1289,6 4,0e4 2,0e4 0,0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min 2,00e4 0,00 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time, min
Příprava metody Selektivní a specifické přechody (transition)
In te n s ity, c p s Analýza 300 pesticidů XIC of +MRM (297 pairs): 226.2/170.0 amu from Sample 1 (MRMs 100) of Data MRM pesticides_02.wiff (Turbo Spray) 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5 6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5 2.50e5 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e4 11.79 Max. 1.1e6 cps. dwell time 5 ms pause time 1 ms cycle time 1.8 s 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Time, min
Velké množství MRM potřeba optimalizace Dwell Time: doba potřebná k měření jednoho přechodu udržuje S/N a citlivost 10-20 ms Pracovní cyklus = 1 / (# současně měřených MRM) Effekt na citlivost a LOQ 1/137 MRM účinnost <1.0% Minimalizace doby cyklu: Doba cyklu= (# současně měřených MRMs) x (Dwell Time) Potřebuji 6-8 bodů na chromatografický pík pro správnou integraci 137 * 15 ms = ~2sec doba cyklu, typická šířka píku 12 sec Maximální Multiplexing: V mnoha prípadech potřeba monitorovat velké množství přechodů pro komplexní analýzu
Cycle Time Intensity (cps) Cycle Time Intensity (cps) Cycle Time Intensity (cps) Jak zlepšit multiplexing? MRM XIC Cycle Time LC Time (mins) Time (mins) snížit Dwell Time: Zvýšit dobu cyklu: Time (mins) Time (mins)
Cycle Time Intensity (cps) Scheduled MRM maximalizace cyklu monitoruje každý MRM přechod jen očekávaném elučním čase redukuje počet překrývajících se přechodů zvyšuje čas měření pro každý přechod zlepšuje analytickou přesnost lepší LLOQ mnoho MRM málo MRM MRM XIC Time (mins)
Normal MRMs (Dwell time = 5ms, Pause time = 5ms) Scheduled MRM (Dwell time and Pause time optimized) XIC of +MRM (300 pairs): 327.2/215.1 Da ID: Triphenyl Phosphate 1 from Sample 3 (0.1 ppb Std) of 021508_Quant_Pos_MRM.wiff (Tur... Max. 5.1e4 cps. XIC of +MRM (300 pairs): 327.2/215.1 amu Expected RT: 7.8 ID: Triphenyl Phosphate 1 from Sample 29 (0.1 ppb Std) of 021508_Quan... Max. 5.1e4 cps. 5.1e4 5.0e4 4.8e4 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 7.45 7.50 7.55 7.60 7.65 7.70 7.75 7.80 7.85 7.90 7.95 8.00 8.05 Time, min 7.78 11 pts I n t e n s i t y, c p s 5.1e4 5.0e4 4.8e4 4.6e4 4.4e4 4.2e4 4.0e4 3.8e4 3.6e4 3.4e4 3.2e4 3.0e4 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 0.0 7.45 7.50 7.55 7.60 7.65 7.70 7.75 7.80 7.85 7.90 7.95 8.00 8.05 Time, min Rozdíl v počtu datových bodů pro typickou šířku píku 7.82 19 pts
Typický pík 5-6 bodů na pík smrm stejného píku >30 bodů
I n t e n s i t y, c p s MRM vs. Scheduled MRM (smrm) Reprodukovatelnost a Citlivost XIC of +MRM (150 pairs): 254.2/198.1 amu Expected RT: 4.9 ID: Irgarol 1 from Sample 4 (fast LC smrm 20) of Test_fast smrm.wiff (Turbo... 1.7e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 4.91 Max. 1.7e6 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 Time, min XIC of +MRM (150 pairs): 203.2/175.1 Da ID: Metamitron... Max. 1.7e5 cps. XIC of +MRM (150 pairs): 254.2/198.1 Da ID: Irgarol 1 fro... Max. 1.6e6 cps. I n t e n s i t y, c p s 1.7e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 Metamitron MRM (5ms) 10 bodů 1.48 CV = 8.8% CV = 6.6% 0.0 1.20 1.25 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 1.65 1.70 1.75 Time, min XIC of +MRM (150 pairs): 203.2/175.1 amu Expected RT:... Max. 2.3e5 cps. I n t e n s i t y, c p s 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5 Irgarol MRM (5ms) 9 bodů 0.0 4.65 4.70 4.75 4.80 4.85 4.90 4.95 5.00 5.05 5.10 5.15 Time, min XIC of +MRM (150 pairs): 254.2/198.1 amu Expected RT:... Max. 1.7e6 cps. 4.91 CV = 5.6% CV = 8.4% I n t e n s i t y, c p s 2.3e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 smrm 46 bodů 1.50 CV = 2.4% CV = 2.2% I n t e n s i t y, c p s 1.7e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 smrm 16 bodů 4.91 CV = 2.3% CV = 2.9% 0.0 1.20 1.25 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 1.65 1.70 1.75 Time, min 0.0 4.65 4.70 4.75 4.80 4.85 4.90 4.95 5.00 5.05 5.10 5.15 Time, min
Variační koeficient CV coefficient of variation je charakteristikou variability rozdělení pravděpodobnosti náhodné veličiny. podíl směrodatné odchylky a absolutní hodnoty ze střední hodnoty = RSD c v = σ µ http://en.wikipedia.org/wiki/coefficient_of_variation
Lange V. et al, Molecular Systems Biology 4:222 Quantitative accuracy as a function of dwell time and cycle time. Quantification of a peptide using different settings for dwell time and cycle time. Reducing the dwell time from 50 to 5 ms decreases accuracy. With cycle times of 10 or 20 s, the peak height cannot be estimated correctly even though the accuracy of the individual data points is excellent at 500 ms dwell time. Changes in dwell time do not affect absolute signal intensity as it is plotted normalized as counts per second.
Výhoda různé délky Dwell Time delší dwell time zlepšuje S/N MRM přechodu Nemá cenu trávit stejný čas na intenzivních iontů Změna umožňuje vyjádřit jako relativní faktor Příklad: Normální 1 Nízkokoncentrované 5
mnoho MRM přechodů - 761
Kalibrace Metoda externího standardu Nejjednodušší, ale nejméně přesná Koncentrace je přímo úměrná odezvě přístroje Ovlivněna matričními efekty, variabilitou nástřiku, účinností ionizace Kalibrační standardy by měly být připraveny v matrici vzorku Nebere v potaz ztráty při úpravě vzorku řešení surrogate standardem
Kalibrace Metoda interního standardu Interní Standard látka strukturně podobná analytu (retenční čas, mw), ale odlišitelná Strukturální analogy nebo homology Pro MS je ideální značení stabilními izotopy izotopy s rozdílem hmotnosti min. 3 amu Značení 13 C, 15 N, 18 O, 2 H 2 H levnější, ale vliv na retenční čas
Typy Interního Standardu RT odlišný, fragment o stejnýém m/z RT odlišný, stejný m/z RT odlišný, odlišný m/z RT shodný, stejný m/z Stabilní izotop RT shodný, odlišný m/z
Metoda izotopového ředění Pro všechny stanovované analyty existuje vlastní izopicky značený standard Nejpřesnější a nejsprávnější Legislativně ukotveno pro stopové analýzy kontaminantů na velmi nízké koncentrační úrovni, kde jsou předřazené exctrakční a čistící kroky S tanovení polychlorovaných dibenzodioxinů a furanů PCDD/F Stanovení polychlorovaných befinylů s dioxinovým efektem Stanovení polybromovaných difenyletherů Stanovení na úrovni <pg/g v biologických matricích nebo na úrovni fg/m3 v ovzduší
Deuterovaný interní standard
SIM chromatograms used to achieve the calibration curve in Figure 2.8 (HFBAtestosterone derivative: m/z 680; 2H3-HFBAtestosterone derivative: m/z 683)
Metoda standardního přídavku Není-li k dipozici vhodný interní standard, předpokládá se matriční efekt a není k dispozici čistá matrice Vzorek se rozdělí do dvou nebo více částí a přidá se známé množství analytu (spike) Omezuje matricové efekty - předpokládá se, že spike je matricí stejně ovlivněn jako analyt ve vzorku C A = P A CS VS P AS V A + VS PA VA C S koncentrace přidaného standardu V S objem standardu P A plocha píku před přidáním standardu P AS plocha píku po přidání standardu Problematické Dodržet vhodný objem Těkavá rozpouštědla Přesnost přídavku
Kalibrační vzorky Doporučení - 6 koncentrací v duplikátech
Příklad stopové analýzy stanovení PCDD/F a PCB v rybí tkáni Lyofilizovaná tkáň 20g Extrakce 250 ml hexan/aceton 3/1 Přídavek IS Redukce na 3 ml a frakcionace na Al2O3 koloně Přídavek RS Redukce na 1 ml a čištění aktivním uhlí Redukce objemu na 10 ml dialýza v LDPE membráně 3x100 ml hexanu Zakoncentrováno na 100 ul Přídavek RS Redukce na 3 ml a přečištění na kombinované silikagelové koloně (30 ml hexanu) GC/MS/MS nebo GC/HRMS analýza kongenerů PCB GC/HRMS analýza dioxin like kongenerů PCB, PCDD/F a PBDE
IS 17 13 C 12 PCDD/F + 22 13 C 12 PCB + 7 13 C 12 PBDE Po odstranění tuků a dalších makro složek se vzorek dělí na frakce s plně aktivovanou aluminou K frakci PCB se přidává tzv. Recovery std (standard pro určení výtěžnosti IS), objem je zredukován a analyzován GC-MS/MS Frakce PCDD/F, PBDE a mono a nonorthosubstituované PCB je ještě jednou přečištěna, přidán RS, zakoncentrováno na 30-40 ul a GC/HRMS analýza Komplikovaný postup, neproveditelný bez vnitřních standardů a izotopového ředění Výsledek je možné použít pouze tehdy, když je výtěžnost vnitřního standardu (poměr IS a RS) v rozmezí stanoveném normovanou metodikou (např. 60 120%)
Lange V. et al, Molecular Systems Biology 4:222 Quantification of proteins in plasma. A total of 360 transitions were acquired by scheduled SRM to quantify 60 peptides in plasma samples following glycocapture. Traces for one peptide in 1 out of 100 analysed samples are shown. On the basis of the heavy isotope labelled peptide (dashed lines), the concentration of the endogenous protein (solid lines) was estimated to be 5 ng/ml.
Příklady
MSMS x High Resolution MS
Instrumentace LC/LC-MS/MS TSQ Ultra QqQ 0,7 až 0,2 FWHM rozlišení na Q1 a Q3 LC/LC-MS/HRMS QExactive 0,7 0,4 FWHM rozlišení na Q1, 17500-140000 FWHM rolišení na orbitrap High Resolution Full Scan HRFS High Resolution Product Scan - HRPS HESI II nebo APCI/APPI iontový zdroj Dvoudimensionální LC systém ve formátu SPE-LC
Chromatogramy pro THC-COOH při koncentraci 10/100 (přírodní/značený) ng/l, MEW= 5 ppm (1 kvantifikační ion, 2 potvrzovací ion, 3 interní standard).
QqQ Rychlá a citlivá detekce v SRM Vhodná pro UPLC separace Nižší selektivita v matrici v porovnání s HRPS Nízká citlivost i slektivita v plném skenu Q Exactive Vysoce citlivá a selektivní metoda v HRPS Pomalejší sken v orbitální pasti nelze mnoho analytů v UPLC separaci Selektivnější než QqQ SRM Vysoká citlivost v plném skenu Selektivita v plném skenu ani při 70000 FWHM neni v reálné matrici dostačující pro mlk bez heteroatomu
Separace a MS GC-MS Starší, rozšířenější EI+ ionizace Často derivatizace vzorku Lze použít i s jednoanalyzátorovým MS LC-MS Mladší, rozvoj po uvedení ESI Většinou není potřeba úprava vzorku Zpravidla vyžaduje tandemovou MS
UPLC zvyšuje kapacitu píků oproti traditční HPLC separaci v případě domělé jedné varianty glucuronidu http://www.waters.com/waters/en_us/solvents-and-caveats-for-lc-ms/nav.htm?cid=10091173
Vliv matrice na MS a MS/MS akvizici dat Zásadní Efekt ionizačního potlačení nebo naopak ionizačního navýšení
Validace metody je proces, který má potvrdit, že analytický postup je vhodný k požadovanému účelu Kroky validace Správnost Přesnost Specificita Limit detekce Limit kvantifikace Linearita a rozsah Robustnost
Food and Drug Administration s (FDA s) The information in this guidance generally applies to bioanalytical procedures, such as gas chromatography (GC); high-pressure liquid chromatography (LC); combined GC and LC mass spectrometric (MS) procedures, such as LC-MS, LC-MS-MS, GC-MS, and GC-MS-MS; and ligand binding assays (LBAs), and immunological and microbiological procedures that are performed for the quantitative determination of drugs and/or metabolites, and therapeutic proteins in biological matrices, such as blood, serum, plasma, urine, tissue, and skin.