Určení původců kontaminace bazénových vzorků mléka mastitidními patogeny metodou rep-pcr

Uplatněná metodika QF 4004 UM 1 - název: Určení původců kontaminace bazénových vzorků mléka mastitidními patogeny metodou rep-pcr Uplatněná metodika a postup pro stanovení původců kontaminace syrového kravského mléka Cíl uplatněné metodiky: Cílem metodiky je určení původce kontaminace (dojnice) při výskytu nežádoucí mikroflóry v bazénových vzorcích mléka. Metodika je založena na molekulární typizaci identifikovaných kmenů rodu Staphylococcus a Streptococcus. Na základě shodnosti sekvencí DNA je možné označit původní zdroj kontaminace a tento následně eliminovat. Náplň uplatněné metodiky: Implementace dosažených výsledků, získaných na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektu NAZV, MZe-ČR, QF 4004 a v rámci koordinační a konzultační metodické činnosti mikrobiologické a molekulární laboratoře a Národní referenční laboratoře pro syrové mléko (NRL-SM) Rapotín, do prostředí prvovýroby mléka. Zdroj uplatněné metodiky: projekt NAZV, MZe-ČR, QF 4004, Vývoj metody pro určení původu kontaminace finálních mléčných výrobků potravními patogeny. Zpracovali dne: 21.3.2007 Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, Ludmila Nejeschlebová Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Akreditovaná Zkušební laboratoř č. 1340 Národní referenční laboratoř pro syrové mléko (NRL-SM) Referenční laboratoř pracovní sítě referenčních mléčných laboratoří ICAR-CECALAIT Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od 1.6. 2007

Určení původců kontaminace bazénových vzorků mléka mastitidními patogeny metodou rep-pcr Vývoj výskytu mastitidních patogenů Při vypracování uplatněné metodiky se vycházelo z dlouholetých zkušeností mikrobiologické laboratoře se stanovením a identifikací hlavních a ostatních mastitidních patogenů (Benda a Vyletělová, 1995, 1997a, 1997b; Benda a kol., 1997a a 1997b; Vyletělová a Kvasničková, 2003; Hanuš a kol., 2004; Vyletělová a Hanuš, 2004b; Vyletělová, 2005; Vyletělová a Genčurová, 2007). Studium jejich vývoje výskytu včetně citlivostí na antibiotika ukazuje na důležitost sledovat zdravotní stav dojnic a nebezpečí vzniku rezistence na antibiotika (Vyletělová a Hanuš, 2004a;Vyletělová, 2006; Vyletělová a Hanuš, 2006; Vyletělová a Genčurová, 2006). Vhodnost použití metodiky a přesných identifikačních a typizačních metod Včasná identifikace a určení citlivosti na antibiotika je velmi důležitá pro úspěšnost léčby, snížení ztráty mléka a s tím spojené riziko ekonomických ztrát. Vedle běžně používaných testů pro rychlý odhad infekce v prvovýrobě mléka (NK testy apod.) je mnohem efektivnější pro identifikaci a následnou úspěšnou léčbu přistoupit k odbornému vyšetření, identifikaci pomocí biochemických testů a následně i molekulárních metod. K přesné identifikaci a typizaci bakteriálních kmenů jsou velmi účinné techniky založené na polymerázové řetězové reakci (PCR), při níž jsou identifikovány specifické sekvence genů. Byly aplikovány některé modifikace PCR využívající náhodně amplifikovanou genomovou DNA (AP-PCR, RAPD), jako i rep-pcr, pomocí primerů odvozených z repetitivních sekvencí ERIC, BOX aj. Pereira a kol. (2002) použil metodu RAPD-PCR k typizaci S. aureus humánního a bovinního původu. Jinou metodu AP-PCR aplikoval VanBelkum a kol. (1995) k typizaci kmenů Staphylococcus aureus, pocházejících z lidských onemocnění. V současnosti je rovněž oblíbenou metodou rep-pcr, která je založena na identifikaci repetitivních sekvencí DNA mikroorganismů. Van der Zee a kol. (1999) srovnala při genotypizaci kmenů S. aureus metodu rep-pcr s metodami AP-PCR a PFGE a uvádí metodu rep-pcr jako přesnější a s lepší reprodukovatelností než zbývající dvě metody. Chapaval a kol. (2006) použili rovněž rep-pcr pro kontrolu dojicího zařízení a zjistili vysokou podobnost mezi kmeny izolovanými z různých zdrojů (pracovníci, struky, mléko a dojicí zařízení). Tato metoda byla úspěšně použita k identifikaci a typizaci některých potravních patogenů i v naší laboratoři (Vyletělová, 2006; Vyletělová a Banykó, 2006). 2

Odběr vzorků mléka Vzorek mléka je odebírán z od jednotlivých problémových dojnic, dále z bazénového mléka a z různých míst dojicího zařízení do sterilních vzorkovnic. Transport vzorků do laboratoře je nutný za teploty 4.0 C ± 1 C. Při vyšších teplotách v letním období je odběr prováděn do vzorkovnic s konzervačním Heeschenovým činidlem (Heeschen a kol., 1969) v poměru 1 : 10. Vzorky mléka jsou po převozu do laboratoře ihned analyzovány nebo mohou být uloženy v lednici při teplotě 4.0 C ± 1 C po dobu 24 hodin. Pokud i do 24 hodin není analýza možná, lze vzorky zamrazit při teplotě 30.0 C ± 1 C a uchovat po dobu nejdéle 1 měsíc. Stanovení mastitidních patogenů metoda kultivace Bazénové a ostatní vzorky mléka Pro kultivaci S. aureus je běžně používán Baird-Parker agar (HiMedia), který vykazuje nejlepší výsledky v záchytnosti a snadnosti odečtů (Benda a Vyletělová, 1997a). Baird-Parker agar se i v současné době doporučuje pro stanovení počtu S. aureus v mléce v normě: ČSN EN ISO 6888-1 (2004). Staphylococcus aureus je kultivován při 36 C po dobu 48 hodin. Jako S. aureus se počítají hladké, černé nebo tmavě šedé kolonie se zónou projasnění. K identifikaci se používá koagulázový test a následné biochemické testy pomocí STAPHYtestu Pliva-Lachema, Brno a identifikačního programu TNW Pro 6.5 (Pliva- Lachema, Brno). Pro kultivaci S. agalactiae je doporučeno TKT médium podle Benda a Vyletělová (1997b). Pro stanovení počtu Streptococcus agalactiae se postupuje podle upravené normy pro předpis: ČSN 57 0101 (1964): Metoda je použitelná pro sledování syrového a tepelně ošetřeného mléka a zakládá se na používání selektivně diagnostických agarových půd v kombinaci s beta-hemolyzinem stafylokoků nebo COREX za podmínek kultivace, popsaných v této metodice. Kultivace probíhá při teplotě 36 C/24hod. Počítají se kolonie s jasnou hemolytickou zónou. V případě sporných výsledků se provede biochemická identifikace pomocí STREPTOtestu a identifikačního programu TNW Pro 6.5 (Pliva-Lachema, Brno). Poznámka: Kultivace a identifikace sledovaných patogenů z bazénového vzorku a ostatních míst v prvovýrobě může být provedena stejným způsobem jako identifikace individuálních vzorků. 3

Individuální vzorky mléka Vzorek mléka (0,05 ml) je sterilní tyčinkou přenesen na krevní agar (Blood Agar Base, OXOID), Edwards Agar (HiMedia) a na Endo Agar (HiMedia) a rozetřen. Kultivace probíhá při 36 /24 hodin. Suspektní kolonie jsou přeočkovány na krevní agar a inkubovány při teplotě 36 /24 hodin. Izolované kolonie jsou dále identifikovány pomocí STAPHYtestu, STREPTOtestu a identifikačního programu TNW Pro 6.5 (Pliva-Lachema, Brno). Molekulární metoda rep-pcr Při rep-genotypizaci jsou použity primery komplementární k roztroušeným konzervativním repetitivním DNA elementům, přítomným v genomu v mnohonásobných kopiích. Amplifikace rozdílných oblastí genomu umístněných mezi repetitivními elementy má za následek jemnou diskriminaci mezi odlišnými bakteriálními kmeny. Amplifikace zahrnuje sequenci REP (repetitive extragenic palindromic sequence), ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence) a BOX elementů. Kombinace tří technik (REP-PCR, ERIC-PCR a BOX-PCR) poskytuje specifický obraz fingerprintů pro sledované izoláty bakterií. Z individuálních izolátů bude extrahována DNA, amplifikace budou provedeny s primery dle literárních pramenů (Versalovic a kol., 1994). Separace fragmentů po amplifikaci bude provedena na agaróze, případně v polyakrylamidovém gelu. Obrazy fingerprintů budou zachyceny precizním fotografickým systémem, následně konvertovány na data vhodná pro zpracování a vyhodnocení počítačovým softwarem. Vyhodnocení dendrogramů a určení shodnosti a původu mastitidních patogenů Parametry zachycené po transformaci primárních fotografických dat budou vyhodnoceny systémem srovnávajícím gely (software Bio Light nebo Totallab TL120). Za tímto účelem bude vytvořena databáze, provedena determinace koeficientů příbuznosti a přiměřenou metodu (např. UPGMA) bude provedena analýza clustrů a k konečném důsledku určeny fylogenetické vztahy sledovaných bakteriálních kmenů. 4

Přílohy a seznam použitých podkladů Normy a vyhlášky uvedené v sestavené metodice ČSN EN ISO 6888-1: Mikrobiologie potravin a krmiv Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozizivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy)- Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera. ČNI Praha, 2004. ČSN 57 0101: Mikrobiologické zkoušení mléka a mléčných výrobků. Praha, 1964. Použitá literatura BENDA P., VYLETĚLOVÁ M. (1995): The occurence of Staphylococcus aureus in bulk milk samples. Vet. Med.-Czech, 40 (7): 221-226. BENDA P., VYLETĚLOVÁ M., TICHÁČEK A. (1997a): Zkušenosti se stanovením hlavních patogenů (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae) v bazénových vzorcích mléka. Sborník k semináři: Kontrola mastitid při produkci mléka, Rapotín 16.5.1996: 41-48. BENDA P., VYLETĚLOVÁ M. (1997a): Testing of culture media for detection of Staphylococcus aureus in bulk milk samples. Vet. Med.-Czech, 42 (1): 9-17. BENDA P., VYLETĚLOVÁ M. (1997a): Testing of TKT medium for Streptococcus agalactiae screening in bulk milk samples. Vet. Med.-Czech, 42 (3): 71-80. BENDA P., VYLETĚLOVÁ M., TICHÁČEK A. (1997b): A method of prevalence estimation of intramammary Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae infection in herds by examination of bulk milk samples. Vet. Med.-Czech, 42 (4): 101-109. CHAPAVAL, L., MOON, D.H., GOMES, J.E., DUARTE, F.R., TSAI, S.M. (2006): Aplicação de točnice de REP PCR no rastramento de Staphylococcus aureus em sala de ordenha, para o monitoramento da qualidade do leite. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., Vol. 43, No. 3: 309-320. HANUŠ, O., FRELICH, J., VYLETĚLOVÁ, M., ROUBAL, P., VORLÍČEK, Z., JEDELSKÁ, R. (2004): Technologically difficult, pathogenic and food risky bacterial contamination of raw milk and other materials from dairy cow herds. Czech J. Anim. Sci., 49, 11: 489-499. ISSN 1212-1989. HEESCHEN, W., REICHMUTH, J., TOLLE, A., ZIEDLER, H. (1969): Preservation of milk samples for bacteriologic and cytologic examinations and examinations for inhibitors. Milchwissenschaft, 24: 729-734. PEREIRA, M.S.V., LEAL, T.C.A., SOBREIRA, M., DE ALMEINA, A.M.P., SIQUEIRA-JÚNIOR, J.P., CAMPOS-TAKAKI, G.M. (2002): Tyliny of human and bovine Staphylococcus aureus by RAPD-PCR and ribotyping-pcr. Letters in Appl. Microbiol, Vol. 35: 32-36. 5

VANBELKUM, A., KLUYTMANS, J., VAN LEEUWEN, W., BAX, R., QUINT, W., PETERS, E., FLUIT, A.D., VANDENBROUCKE-GRAULS, CH., VAN DEN BRULE, A., KOELEMAN, H., MELCHERS, W., MEIS, J., ELAICHOUNI, A., VANEECHOUTTE, M., MOONENS, F., MAES, N., STRUELENS, M., TENOVER, F., VERBRUGH, H. (1995): Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR Tyliny of Staphylococcus aureus strains. Journal of Clinical Microbiol., Vol. 33, No. 6: 1537-1547. ESSAWI, T., ADWAN, K., ABU-HASSAN, N., ADWAN, G., SALEH, A. (2004): Turk. J. Med. Sci., Vol. 34: 5-9. VANDER ZEE, A.; VERBALKEL, H., VANZON, J.C., FRENAY, I., VANBELKUM, A., PEETERS, M., BUITING, A., BERGMANS, A. (1999): Molecular genotyping of Staphylococcus aureus strains: Comparison of repetitive element sequence-based PCR with various typing methods and isolation of a novel epidemicity marker. J. of Clinical Microbiol., Vol. 37, No. 2: 342-349. VERSALOVIC J., SCHNEIDER M., DE BRUIJN F.,J., LUPSKI J.R. (1994): Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods Mol. Cell. Biol., 5:4863-4873. VYLETĚLOVÁ M., KVASNIČKOVÁ E. (2003): Výskyt Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Listeria monocytogenes a Escherichia coli O157 v bazénových a individuálních vzorcích mléka. In. Sborník příspěvků k semináři: Šlechtitelské a technologické aspekty chovu dojených krav a kvality mléka (zejména s ohledem na bod mrznutí). Rapotín, listopad 2003: 98-102. VYLETĚLOVÁ M. HANUŠ O. (2004a): Development of the main mastitis pathogens occurrence and their sensitivity to the chosen antibiotics during last ten years. Book of abstracts ISME, Mexico: PO 343. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O. (2004b): Kvalita bazénových vzorků mléka. Náš chov, 6: 13-16 VYLETĚLOVÁ M. (2005): Kvalita bazénových vzorků mléka severní Moravy. Výzkum v chovu skotu, 2: 18-23. ISSN 0139-7265 VYLETĚLOVÁ M. (2006): Development of mastitis pathogenes occurrence since year 1993. In. Sborník referátů Agroregion2006. VI. ročník mezinárodní konference 24.-25.8.2006 Zvyšování konkurenceschopnosti v zemědělství : 32-35. ISBN 80-7040-869-3. VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O. (2006): Occurrence of mastitis staphylococcal infection within dairy cows. In Book of abstracts: 12th International Symposium on Staphylococci & Staphylococcal Infections, Maastricht, Holandsko, 3.-6.9.2006: 137-138. 6

VYLETĚLOVÁ M., GENČUROVÁ V. (2006): Development of Staphylococcus aureus occurrence and its sensitivity to antibiotics. In Book of abstracts: 12th International Symposium on Staphylococci & Staphylococcal Infections, Maastricht, Holandsko, 3.-6.9.2006: 138. VYLETĚLOVÁ M., GENČUROVÁ V. (2007): Comparison of Food Pathogens Occurrence in Raw Milk between Ecological and Conventional Farms. In Proceedings Congress HELEXPO Thessaloniki 9.-11.3.2007. Publikace výsledků k uplatněné metodice VYLETĚLOVÁ M. (2006): Differentiation of B. cereus strains isolated from raw milk, pasteurized milk and milk products using molecular methods ribotyping and rep-pcr. Výzkum v chovu skotu, 4: 10-14. ISSN 0139-7265. VYLETĚLOVÁ M., BANYKÓ J. (2006): Differentiation of B. cereus strains isolated from milk and milk products using rep-pcr. In Abstracts book. 3 rd International Symposium Milk Genomics and Human health. 19. - 21. 9. 2006, Brussel, Belgium. Předání uplatněné metodiky Určení původců kontaminace bazénových vzorků mléka mastitidními patogeny metodou rep-pcr Vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání v písemné formě ing. Janu Škopovi, předsedovi představenstva MESPOL Medlov a.s., dne 24.5.2007. Přílohy, dokumenty a doklady Technická řešení a postupy této uplatněné metodiky byly zčásti převzaty z vědecké a odborné literatury a zejména podpořeny výsledky vlastního výzkumu, které byly postupně publikovány a jako dokladové materiály mohou tvořit přílohu tohoto metodického materiálu. Datum: 24.5.2007 Za zhotovitele: RNDr. Marcela Vyletělová, Ph.D. Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Za uživatele: Ing. Jan Škop Medlov a.s. 7