Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 destička destiček

Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 destička 96 72278 5 destiček 480 72279 SCREENINGOVÁ IMUNOENZYMATICKÁ SOUPRAVA NA DETEKCI PROTILÁTEK PROTI HIV-1 A HIV-2 V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ 883666-2014/01 1

OBSAH 1 - KLINICKÝ VÝZNAM 2 - PRINCIP SOUPRAVY Genscreen HIV-1/2 Version 2 3 - OBSAH SOUPRAVY Genscreen HIV-1/2 Version 2 4 - UCHOVÁVÁNÍ - EXSPIRACE 5 - MATERIÁL NUTNÝ PRO PROVEDENÍ TESTU, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY 6 - ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ 7 - UPOZORNĚNÍ 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ 9 - PRACOVNÍ POSTUP 10 - DOPORUČENÍ 11 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 12 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKU A KONJUGÁTU 13 - ÚČINNOST 14 - OMEZENÍ TESTU 15 - LITERATURA 2

1 - KLINICKÝ VÝZNAM Syndrom získaného selhání imunity (AIDS) je virem indukované infekční onemocnění charakterizované silným potlačením imunity. Z lymfocytů pacientů, kteří onemocněli AIDS, byly izolovány dva viry příbuzné skupině Lentivirů. Prvý, označovaný HIV-1, byl izolován ve Francii a následně ve Spojených státech. Druhý virus, původce nového ohniska AIDS v západní Africe, je označován jako HIV-2 a byl poprvé izolován u dvou pacientů v žijících v Africe. Sekvenování GAG, POL a ENV genů kmenů reprezentujících všechny subtypy umožnilo poznat genetickou variabilitu kmenů HIV. HIV viry jsou rozděleny do dvou skupin: skupiny M, ve které je 9 subtypů (A až I) a skupiny O. Rozlišujeme pět subtypů HIV-2. Oblasti rozšíření jednotlivých subtypů jsou v současnosti velmi dobře známy. Některých varianty viru HIV-1 vykazují pouze 70% homologii genů GAG a POL s hlavními izoláty a pouze 50% homologii s genem ENV. Tyto rozdíly vysvětlují selhání diagnostiky infekce u některých pacientů. Různé HIV izoláty vykazují podobné antigeny s opičím virem SIV ve všech proteinech (obalové - envelope a korové - core proteiny - heterologie je 30%), ale vykazují homologii méně než 40% s HIV-1 obalovým proteinem. Test Genscreen HIV-1/2 Version 2 umožňuje současnou detekci anti-hiv-1 a anti-hiv-2 protilátek. 2 - PRINCIP SOUPRAVY Genscreen HIV-1/2 Version 2 Genscreen HIV-1/2 Version 2 je imunoenzymatický test založený na principu dvoukrokové "sandwichové" techniky určené k průkazu protilátek specifických pro virus HIV-1 a HIV-2 v lidském séru nebo plazmě. V diagnostické soupravě Genscreen HIV-1/2 Version 2 je pevná fáze (mikrotitrační destička) potažena imunodominantními purifikovanými antigeny (rekombinantní proteiny HIV-1 gp160 a p25 a peptid imunodominantního epitopu obalového proteinu HIV-2) a imunodominantní antigeny konjugované s křenovou peroxidázou (peptidy imunodominantních epitopů obalových proteinů a rekombinantního nukleokapsidového proteinu). Test se zahrnuje následující kroky: 1. Do jamek mikrotitrační destičky se napipetují testované vzorky sér a kontrolní séra. Jestliže jsou zde přítomny protilátky proti HIV-1 nebo HIV-2, navážou se na antigeny zachycené na pevné fázi. Po přidání vzorku dochází ke změně barvy z purpurové na modrou (potvrzení, že byl vzorek přidán). 2. Po přidání purifikovaných antigenů HIV-1 a HIV-2 značených peroxidázou dojde k jejich navázání na IgG, IgM nebo IgA ze vzorku pacienta, zachycených na pevné fázi. 3. Přítomnost enzymem značeného antigenu, zachyceného v komplexu, se prokáže pomocí inkubace se substrátem, která následuje po odstranění nenavázaných frakcí konjugátu. 4. Po zastavení reakce se změří hodnoty absorbance pomocí spektrofotometru při vlnové délce 450/620 nm. Měření absorbance vzorku umožní určit, zda jsou protilátky proti HIV-1 nebo HIV-2 přítomny ve vzorku. 3

3 - OBSAH SOUPRAVY Genscreen HIV-1/2 Version 2 Všechny reagencie jsou určeny výlučně pro použití in vitro. Štítek R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Cut-off control R5 Positive control R6 Sample diluent R7a Conjugate R7b Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Složení reagencie Mikrotitrační destička 12 stripů po 8 jamkách potažených purifikovanými antigeny HIV-1 a HIV-2 Koncentrovaný promývací roztok (20X) Tris NaCl pufr ph 7,4 Konzervační prostředek: ProClin 300 (0,04 %) Negativní kontrola Teplem inaktivovaná lidská plazma negativní na HBs antigen, HIV antigen, protilátky proti HIV-1, HIV-2 a HCV Konzervační prostředek: azid sodný < 0,1 % Cut-off kontrola Teplem inaktivovaná lidská plazma pozitivní na HIV protilátky a negativní na HBs antigeny a protilátky proti HCV Konzervační prostředek: azid sodný < 0,1 % Pozitivní kontrola Teplem inaktivovaná lidská plazma pozitivní na HIV protilátky a negativní na HBs antigeny a protilátky proti HCV Konzervační prostředek: azid sodný < 0,1 % Ředící roztok pro vzorky Roztok telecího séra (Tris pufr s 0,1 % chromoforu a ProClin 300 s barevným indikátorem) Konjugát Lyofilizované purifikované antigeny HIV-1 a HIV-2 značené křenovou peroxidázou Ředící roztok pro konjugát Roztok odstředěného mléka (Tris pufr s 0,1 % chromoforu a ProClin 300) Peroxidázový substrátový pufr Roztok citrátu sodného a acetátu sodného, ph 4.0, obsahující H 2 O 2 (0,015%) a DMSO (4%) Chromogen Roztok obsahující tetramethylbenzidin (TMB) Zastavovací roztok 1N roztok kyseliny sírové Provedení 72278 72279 1 destička 70 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 14 ml q.s. ad 12,5 ml 12,5 ml 60 ml 5 ml 28 ml 5 destiček 235 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 2 lahvičky 2 x 10 ml 2 lahvičky q.s. ad 2 x 30 ml 2 lahvičky 2 x 30 ml 2 lahvičky 2 x 60 ml 2 lahvičky 2 x 5 ml 3 lahvičky 3 x 28 ml 4

4 - UCHOVÁVÁNÍ - EXSPIRACE Souprava musí být uchovávána při je +2-8 C. Takto uchovávané reagencie ze soupravy Genscreen HIV-1/2 Version 2 mohou být použity do data exspirace, uvedeného na obalu, s výjimkou zvláštních instrukcí: R1 : Po rozbalení vakuového balení jsou stripy mikrotitrační destičky použitelné po dobu 1 měsíce, jestliže jsou znovu pečlivě zabaleny a uloženy při +2-8 C. R2 : Naředěný promývací roztok může být uchován při +2-30 C po dobu 2 týdnů. Koncentrovaný promývací roztok (R2) může být skladován při teplotě +2-30 C. R7a + R7b : Rozpuštěné reagencie jsou použitelné po dobu 1 měsíce, jestliže jsou uchovávány při +2-8 C. R8+R9 : Po rekonstituci je tato reagencie, uchovávaná v temnu při pokojové teplotě (18-30 C), použitelná po dobu 6 hodin. 5 - MATERIÁL NUTNÝ PRO PROVEDENÍ TESTU, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Destilovaná voda. Chlornan sodný, hydrogenuhličitan sodný. Automatické či poloautomatické, nastavitelné nebo přednastavené pipety nebo multipipety na pipetování objemů 25 µl, 75 µl, 80 µl, a 200 µl. Odměrné válce o objemu 25 ml, 100 ml, 1000 ml. Odpadní nádoba na infekční biologický materiál. Vodní lázeň nebo inkubátor pro mikrotitrační destičky s termostatem nastavitelným na 37 ± 1 C. Ruční nebo poloautomatická či automatická promývačka mikrotitračních destiček. Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky vybavený filtry 450 nm a 620-700 nm. Savý papír. (*) Vyžádejte si u nás podrobné informace o zařízení doporučeném naším technickým oddělením. 6 - ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ Krevní vzorky odeberte běžným způsobem. Test se provádí s neředěným sérem nebo plazmou (odebraných do EDTA, heparinu, citrátu, nebo antikoagulans na bázi ACD). Sérum nebo plazmu oddělte co nejdříve od sraženin a erytrocytů, aby se předešlo hemolýze. Silná hemolýza může ovlivnit účinnost testu. Vzorky s pozorovatelnými částicemi musí být před testováním centrifugovány.vznášející se fibrínové částice nebo sraženiny mohou zapříčinit falešně pozitivní výsledky. Vzorky nezahřívejte. Pokud testování proběhne do 7 dnů od odběru, mohou být vzorky uchovávány při +2-8 C nebo mohou být uchovány zmražené při -20 C po dobu několika měsíců. Plazma musí být rychle rozmražena zahřátím ve vodní lázni po dobu několika minut při 40 C (aby se zabránilo precipitaci fibrinu). Vzhledem k nestabilitě HIV Ag nesmí být teplota vyšší než 40 C. Vyhněte se opakovaným cyklům zamražení a rozmražení. Vzorky, které byly opakovaně zamraženy a rozmraženy více než 3x, nesmí být použity. Pro přepravu musí být vzorky zabaleny podle platných přepisů pro přepravu etiologických agens. NEPOUŽÍVEJTE KONTAMINOVANÁ, HYPERLIPEMICKÉ NEBO HYPERHEMOLYZOVANÁ SÉRA NEBO PLAZMU. POZNÁMKA: obsah ve vzorcích do 90 g/l albuminu, 200 mg/l bilirubinu, v lipemických vzorcích do ekvivalentu 36 g/l triglyceridu a v hemolyzovaných vzorcích do 20 mg/l hemoglobinu nemá žádný účinek na výsledky. 5

7 - UPOZORNĚNÍ Spolehlivost výsledků závisí na dodržování následujících zásad správné laboratorní praxe: Název testovací soupravy, stejně jako specifické identifikační číslo testu, jsou vyznačeny na rámečku každé mikrotitrační destičky. Specifické identifikační číslo je rovněž umístěno na každém stripu. Genscreen HIV-1/2 version 2 : Specifické ID číslo = 05 Před použitím si ověřte specifické identifikační číslo. Jestliže identifikační číslo chybí, nebo se liší od čísla uvedeného výše, nesmí být strip použit Nepoužívejte reagencie s prošlou exspirační lhůtou. Při provádění testu nesměšujte reagencie ze souprav s různými čísly šarží. Poznámka: pro promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 20X zelené zbarvení), peroxidázový substrátový pufr (R8, identifikace na štítku: TMB buf, modré zbarvení), chromogen (R9, identifikace na štítku: TMB 11X, purpurové zbarvení) a zastavovací roztok (R10, identifikace na štítku: 1 N červené zbarvení) je možno použít jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě za předpokladu, že stejná šarže se použije pro daný běh testu. Tyto reagencie mohou být použity s některými jinými produkty naší společnosti. Dále je možno promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 20X zelené zabarvení) míchat se dvěmi dalšími promývacími roztoky, které jsou součástí některých dalších testovacích souprav firmy Bio Rad (R2, identifikace na štítku: 10X modré zabarvení nebo 10X oranžové zabarvení) a jsou-li správně rekonstituovány a pokud je použita jedna směs během jednoho testu. Pro detailní informace kontaktujte místní zastoupení Bio-Rad. Substrátový roztok (substrátový pufr s chromogenem) musí být růžový. Pokud se během několika minut po přípravě barva změní, je reagencie nepoužitelná a musí být vyměněna. Chromogenní roztok by se měl připravovat v plastových vaničkách na jedno použití nebo ve skleněných nádobkách předem vymytých 1N HCl a důkladně opláchnutých destilovanou vodou a řádně osušených. Tato reagencie musí být uchovávána ve tmě. Před použitím ponechte reagencie stabilizovat při laboratorní teplotě po dobu 10 minut. Reagencie pečlivě připravte. Zkontrolujte přesnost a správnou činnost pipet a jiného náčiní. Neměňte pracovní postup. Promývání: pečlivě dodržujte předepsaný postup promývání za účelem dosažení nejvyšší účinnosti testu. Bezpečnostní předpisy, ochrana zdraví Pozitivní a cut-off kontroly jsou tepelně inaktivovány. Materiál lidského původu, použitý pro přípravu negativní kontroly, byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti viru hepatitidy C a protilátky proti viru lidské imunodeficience (HIV-1 a HIV-2). Materiál lidského původu, použitý pro přípravu pozitivní kontroly a cut-off séra, byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg) a na protilátky proti viru hepatitidy C. S reagenciemi a vyšetřovanými vzorky zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem, protože žádná testovací metoda nemůže zcela vyloučit přítomnost infekčních agens. Každé zařízení, které bylo v přímém styku se vzorky a reagenciemi a stejně tak promývací roztok, musí být považováno za kontaminovaný materiál a musí s ním být zacházeno jako s takovým. Nejlepším způsobem, jak inaktivovat HIV a HB viry, je autoklávování po dobu nejméně 1 hodiny při 121 C. ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ NESMÍ BÝT AUTOKLÁVOVÁNY. 6

Bezpečnostní list je k dispozici na vyžádání. Inaktivaci virů HIV a HB v kontaminovaných materiálech a roztocích lze též provést působením roztoku chlornanu sodného o konečné koncentraci 5 % po dobu 30 min. Vyvarujte se potřísnění kůže a sliznic substrátovým roztokem, chromogenem nebo zastavovacím roztokem (riziko otravy, podráždění či popálení). S chemikáliemi zacházejte a odkládejte je podle zásad správné laboratorní praxe. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese www.bio-rad.com. 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Poznámka: Před použitím ponechte všechny reagencie vytemperovat na teplotu místnosti (18-30 C). Reagencie 1 (R1): Mikrotitrační destička Každý rámeček destičky obsahující 12 stripů je uzavřen v uzavíratelném foliovém sáčku. Rozstřihněte sáček nůžkami nebo skalpelem 0,5-1 cm nad uzávěrem. Otevřete sáček a vyjměte destičku. Nepoužité stripy vraťte do sáčku. Uzavřete sáček a uložte jej při +2-8 C. Reagencie 2 (R2): Promývací roztok (20X koncentrovaný) Nařeďte 1:20 v destilované vodě, abyste získali pracovní koncentraci promývacího roztoku. Připravte 800 ml pro jednu destičku s 12 stripy. Reagencie 3 (R3): Negativní kontrolní sérum (hotové k použití) Lidské sérum negativní na protilátky proti HIV-1 a HIV-2, protilátky proti HCV a HBsAg. Obsahuje 0,1 % azidu sodného jako konzervační činidlo. Reagencie 4 (R4): cut-off sérum (hotové k použití) Teplem inaktivované lidské sérum, negativní na HBsAg a protilátky proti HCV a HIV, obsahující protilátky proti HIV. Obsahuje 0,1 % azidu sodného (konzervační činidlo). Reagencie 5 (R5): Pozitivní kontrolní sérum (hotové k použití) Teplem inaktivované lidské sérum, negativní na HBsAg a protilátky proti HCV a obsahující protilátky proti HIV. Obsahuje 0,1% azidu sodného jako konzervační činidlo. Reagencie 6 (R6): Ředící roztok pro vzorky (hotové k použití) Roztok telecího séra (Tris pufr s 0,1 % chloroformu a ProClin 300, s barevným indikátorem). Reagencie 7a (R7a): Lyofilizovaný konjugát Purifikované antigeny HIV-1 a HIV-2 značené peroxidázou. Obsahuje BSA a 0,1 % ProClin 300. Jemně poklepejte lahvičkou, aby substance nezůstala na gumovém uzávěru. Opatrně odstraňte uzávěr a reagencii R7b nalijte do R7a. Lahvičku uzavřete a obsah nechte za jemného protřepávání 10 minut rozpouštět. Reagencie 7b (R7b): Ředící roztok pro konjugát Roztok odtučněného mléka (Tris pufr s 0,1% chloroformu a ProClin 300). 7

Reagencie 8 (R8): Substrátový pufr Roztok kyseliny citrónové a octanu sodného o ph 4,0, obsahující 0,015 % peroxidu vodíku a 4 % dimethylsulfoxidu (DMSO). Roztok je hotový k použití. Reagencie 9 (R9): Koncentrovaný roztok chromogenu Roztok obsahující tetramethylbenzidin (TMB). Roztok nařeďte v substrátovém pufru v poměru 1:11 (např.: 1 ml reagencie R9 + 10 ml reagencie R8). Roztok je stabilní po dobu 6 hodin od přípravy, jestliže je uchováván ve tmě. Reagencie 10 (R10): Zastavovací roztok 1 N roztok kyseliny sírové hotový k použití. 9 - PRACOVNÍ POSTUP Přesně dodržujte pracovní postup. Dodržujte zásady správné laboratorní praxe: Při každém provádění testů vždy použijte negativní, pozitivní a cut-off kontroly, které jsou nezbytné pro validaci testu. 1. Pečlivě sestavte schéma distribuce a identifikace vzorků. 2. Nařeďte promývací roztok na pracovní koncentraci. 3. Vyjměte rámeček a potřebný počet stripů z ochranného obalu, stripy vložte do rámečku. 4. Pipetujte přímo, bez předchozího promytí jamek mikrotitrační destičky, postupně: 25 µl ředícího roztoku (R6) do každé jamky 75 µl negativního kontrolního séra (R3) do jamky A1 75 µl cut-off kontrolního séra (R4) do jamek B1, C1 a D1 75 µl pozitivního kontrolního séra (R5) do jamky E1 75 µl vzorku 1 do jamky F1 75 µl vzorku 2 do jamky G1, atd. V závislosti na použitém systému, je možné upravit umístění kontrol, nebo je možno změnit pořadí pipetování. Obsah každé jamky je nutno důkladně homogenizovat trojím nasátím obsahu jamky 75 µl pipetou nebo protřepáním destičky po napipetování. Rovněž je možno do příslušných jamek pipetovat vždy 100 µl vzorku séra předem naředěného v poměru 3:1 (např.: 150 µl séra + 50 µl ředícího roztoku R6). Pozn.: přidání vzorku lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku pracovního postupu : po přidání vzorku změní ředící roztok barvu z purpurové na modrou (viz kapitola 12 týkající se automatického ověření - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENí PIPETOVÁNÍ VZORKU A KONJUGÁTU. 5. Přikryjte mikrotitrační destičku novu přilnavou fólií. Pevně přitiskněte na destičku, aby byla řádně utěsněna. 6. Inkubujte destičku na termostatické vodní lázni nebo v inkubátoru destiček při 37 ± 1 C po dobu 30 ± 5 minut. 7. Odstraňte přilnavou fólii. Obsah všech jamek odsajte do nádoby určené pro infekční odpad (s chlornanem sodným) a do každé jamky pipetujte 370 µl promývacího roztoku. Čekejte 30 sekund. Znovu odsajte. Tento krok opakujte alespoň 2 x (celkem minimálně 3 promytí). Zbylý objem musí být nižší než 10 µl (jestliže je to nutné, osušte destičku obrácenou dnem vzhůru na savém papíru). Jestliže používáte automatickou promývačku, postupujte stejně (viz. kapitola 10: DOPORUČENÍ) 8. Do všech jamek napipetujte rychle 100 µl roztoku konjugátu. Konjugát před použitím opatrně promíchejte. 8

Pozn.: Přidání konjugátu, který je zeleně zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku pracovního postupu (viz kapitola 12, týkající se automatického ověření - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENí PIPETOVÁNÍ VZORKU A KONJUGÁTU). 9. Destičku zakryjte novou fólií a nechte 30 ± 5 min. inkubovat při teplotě místnosti (18-30 C). 10. Odstraňte fólii, jamky vyprázdněte odsáním a každou jamku nejméně 5 x promyjte jak je popsáno výše. Zbylý objem musí být nižší než 10 µl (jestliže je to nutné, osušte destičku obrácenou dnem vzhůru na savém papíru). 11. Do každé jamky rychle pipetujte 80 µl substrátového roztoku (R8 + R9), připraveného těsně před použitím. Reakci nechte probíhat v temnu na dobu 30 ± 5 min. při teplotě místnosti (18-30 C). Destičku nezakrývejte fólií. Pozn.: napipetování chromogenního roztoku, který je růžově zbarven, lze vizuálně kontrolovat v tomto kroku: mezi prázdnou jamkou a jamkou, obsahující růžový substrátový roztok je jasný rozdíl (viz odst. 12 týkající se automatického ověření: SPEKROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKU A REAGENCIE). 12. Do každé jamky přidejte ve stejném sledu, v jakém byl přidán substrátový roztok, 100 µl zastavovacího roztoku (R10). Reakční směs promíchejte. Pozn.: napipetování zastavovacího roztoku, který není zbarvený, je možno vizuálně ověřit v tomto kroku. Po napipetování zastavovacího roztoku růžové zbarvení substrátu zmizí (u negativních vzorků), nebo ze změní z modré na žluté (u pozitivních vzorků). 13. Dno mikrotitrační destičky pečlivě otřete. Nejméně za 4 minuty po napipetování zastavovacího roztoku a do 30 minut po zastavení reakce změřte optickou denzitu pomocí spektrofotometru při vlnové délce 450/620-700 nm. 14. Zkontrolujte, zda zjištěné výsledky souhlasí s identifikačním a distribučním plánem mikrotitrační destičky. 10 - DOPORUČENÍ UPOZORNĚNÍ: VYVARUJTE SE KONTAMINACE V PRŮBĚHU TESTU V PŘÍPADĚ ZNEČIŠTĚNÍ (rozlití, atd.) Rozlité tekutiny (s výjimkou kyselin) důkladně vysušte, k otření použijte minim. 5% roztok chlornanu sodného Rozlité kyseliny nejprve vytřete do sucha, teprve potom zasažená místa očistěte minimálně 5% roztokem chlornanu sodného Materiál použitý pro odstranění rozlitých kapalin musí být odložen do kontejneru pro nebezpečný biologický odpad a zlikvidován dle příslušných bezpečnostních předpisů (viz odstavec 7 UPOZORNĚNÍ). NIKDY NEPOUŽÍVEJTE STEJNOU NÁDOBU PRO KONJUGÁT A SUBSTRÁTOVÝ ROZTOK. DODRŽUJTE PŘEDEPSANÝ POČET PROMÝVACÍCH CYKLU*. ZKONTROLUJTE PŘED PIPETOVÁNÍM SUBSTRÁTOVÝ ROZTOK (substrátový pufr a chromogen). Musí být bezbarvý. Jestliže se po několika minutách po přípravě objeví modré zabarvení, znamená to, že je roztok kontaminovaný ionty kovů a nesmí být použit, ale nahrazen novým. Doporučujeme používat plastikové nádoby a pipety nebo skleněné náčiní omyté 1 N HCl, opláchnuté destilovanou vodou a pečlivě osušené. (*) Kontaktujte nás ohledně podrobných informací o technickém vybavení doporučeném naším technickým oddělením. 9

11 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Přítomnost nebo nepřítomnost protilátek proti HIV-1 anebo HIV-2 se stanoví porovnáním změřené absorbance každého vzorku s vypočítanou hodnotou cut-off. 1) Výpočítejte průměrnou absorbanci cut-off kontrolního séra (ODR4) OD (B1) + OD (C1) + OD (D1) ODR4 = ---------------------------------------- 3 2) Výpočet hodnoty cut-off: Hodnota cut-off je dána poměrem: ODR4 C.O = -------- 10 3) Podmínky validity: Absorbance negativního kontrolního séra musí být menší než 70 % hodnoty cut-off: ODR3 < 0,7 x C.O. Průměrná hodnota absorbance cut-off kontrolního séra musí být větší než 0,80. ODR4> 0,80 Případně: Poměr ODR5 / ODR4 musí být větší nebo roven 1,3. (Tato optimální norma platí pouze v případě, jestliže je linearita spektrofotometru vyšší než 3,000.) 4) Interpretace výsledků Vzorky s hodnotou absorbance nižší než cut-off jsou v testu Genscreen HIV 1/2 Version 2 považovány za negativní. Výsledky těsně pod hodnotou cut-off (C.O. - 10% < OD < C.O.) by měly být interpretovány opatrně (a je doporučeno, že odpovídající vzorky by měly být duplicitně přetestovány, pokud to umožňuje použitý systém a laboratorní procedury. Vzorky s hodnotou absorbance rovnou nebo vyšší než je hodnota cut-off jsou v testu Genscreen HIV-1/2 Version 2 považovány za původně pozitivní. Před konečnou interpretací by tyto vzorky měly být duplicitně přetestovány. Jestliže je hodnota absorbance u opakovaných dvou testování vzorku nižší než hodnota cut-off, je původní výsledek nereprodukovatelný a vzorek je v testu Genscreen HIV-1/2 Version 2 považován za negativní. Nereprodukovatelné výsledky mohou být způsobeny: nedostatečným promytím mikrotitrační destičky kontaminací negativních vzorků sérem s vysokým titrem protilátek kontaminací substrátového roztoku oxidujícím agens (kovové ionty, dezinfekční prostředek apod.) kontaminací zastavovacího roztoku Jestliže je při opakovaném testování hodnota absorbance jednoho z duplicitních vzorků vyšší nebo rovna hodnotě cut-off, je původní výsledek potvrzen a vzorek je považován za pozitivní v rámci popsaných postupů. 12 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKU A KONJUGÁTU Ověření pipetování vzorku Po pipetování ředícího roztoku a vzorků je možné ověřit přítomnost vzorku v jamkách měřením na spektrofotometru při 620 nm: optická denzita jamky obsahující vzorek je větší než 0,150 (nižší OD značí nedostatečné napipetování vzorku). 10

Ověření pipetování konjugátu Po pipetování konjugátu (R7a + R7b) je možné ověřit přítomnost konjugátu v jamkách měřením na spektrofotometru při 620 nm: optická denzita jamky obsahující vzorek je větší než 0,100 (nižší OD značí nedostatečné napipetování konjugátu). Ověření pipetování substrátového roztoku Pipetování růžového substrátového roztoku do jamek je možno ověřit pomocí automatického měření při 490 nm: jamka se substrátovým roztokem musí vykazovat optickou denzitu vyšší než 0,100 (nižší optická denzita ukazuje špatné napipetování substrátového roztoku). 13 - ÚČINNOST Studie zaměřené na zjištění citlivosti testu Genscreen HIV-1/2 Version 2 byly prováděny na pozitivních vzorcích pacientů s AIDS nebo ARC a na citlivostních panelech se zdokumentovanými vzorky pacientů infikovaných HIV. Citlivost HIV-1 byla 100%. Validace byla prováděna na 413 diagnostikovaných pacientech s AIDS nebo s.příbuzným komplexem (ACR) s pozitivitou na HIV-1 skupiny M konfirmovanou Western blotem a 31 vzorcích HIV-1 skupiny O, konfirmovaných Western blotem HIV-1. Citlivost vůči skupině O byla vyhodnocena též na 4 vzorcích HIV-1 skupiny O neurčitých ve Western blotu. Byla vyhodnocena jako vyhovující se 3 vzorky určenými jako pozitivní. Citlivost vůči HIV-2 byla 100%. Validace byla prováděna na 119 naředěných nebo neředěných vzorcích pozitivních pacientů, konfirmovaných Western blotem. Citlivost vůči HIV-1 skupiny M byla vyhodnocena na 29 komerčních sérokonverzních panelech (BBI, NABI, Bioclinical partners) a na INTS citlivostním panelu. Výsledky jsou v souhlasu se současným stavem vývoje. Na panelu INTS bylo pozitivních 45 sérokonverzních a 13 persérokonverzních vzorků. Dalších 25 čerstvě pozitivních vzorků (během 1 dne od odběru krve) bylo testováno a všechny byly pozitivní. Alespoň 42 časně sérokonverzních vzorků bylo testováno pomocí testu Genscreen HIV-1/2 Version 2. Specificita testu prováděného u 5025 vzorků dárců krve byla 99,98%. Z 212 vzorků pacientů, vykazujících jiné nálezy nebo stav nespojovaný s virem HIV (těhotné ženy, revmatoidní faktor, anti-nukleární IgG nebo jiná virová infekce), byly 3 pozitivní. Správnost testu Genscreen HIV-1/2 Version 2 byla určena pomocí analýzy 4 vzorků: 1 negativního vzorku (vzorek 1), 2 nízce anti-hiv-1 pozitivních vzorků (vzorky 2 a 3) a jednoho vysoce anti-hiv-1 pozitivního vzorku (vzorek 4). Opakovatelnost testu byla vyhodnocena 30násobným vyšetřením těchto 4 vzorků v průběhu jednoho testu, reprodukovatelnost byla vyhodnocena testováním těchto 4 vzorků 3x na 2 mikrotitračních destičkách, které bylo provedeno ve 2 nezávislých cyklech denně během 5 dnů. Výsledky jsou znázorněny v následujících tabulkách: 11

Tabulka č. 1: Opakovatelnost testu n = 30 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 průměrná 0,12 3,34 9,05 19,6 hodnota poměrů* standardní 0,04 0,45 0,30 0,73 odchylka (SD) C.V. (%) poměrů* 31,5% 13,6% 3,3% 3,7% * Poměry = OD/C.O. Tabulka č. 2: Reprodukovatelnost testu n = 30 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 průměrná 0,12 3,43 9,27 19,35 hodnota poměrů* standardní 0,02 0,41 0,89 1,93 odchylka (SD) C.V. (%) poměrů* 19,3% 12,1% 9,65% 10,0% * Poměry = OD/C.O. 14 - OMEZENÍ TESTU V první fázi infekce může být titr protilátek velmi nízký a nemusí být tedy zjištěn, tudíž negativní výsledek znamená, že testovaný vzorek neobsahuje anti-hiv protilátky, detekovatelné soupravou Genscreen HIV-1/2 Version 2. Tento výsledek však nevylučuje případnou infekci HIV-1/HIV-2. Variabilita HIV-1 (skupiny M a O) a HIV-2 neumožňuje vyloučit možnost falešně negativních reakcí. Žádná dostupná testovací metoda neumožňuje získat úplnou jistotu, že vzorek neobsahuje virus HIV. Vysoce citlivé ELISA testy mohou vykazovat falešně pozitivní výsledky. Za účelem ověření specifičnosti reakce musí být všechny pozitivní vzorky ( v souladu s podmínkami interpretace testu Genscreen HIV-1/2 Version 2) konfirmovány vhodnou metodou (Western blot). Zahřátí vzorků může ovlivnit kvalitu výsledků. Spektrofotometrické ověřování pipetování vzorku a konjugátu neumožňuje stanovit přesnost pipetovaného objemu vzorku nebo konjugátu. Tato metoda pouze ukazuje přítomnost vzorku, konjugátu a substrátového roztoku v jamkách. Počet špatných vyhodnocení pomocí této metody odpovídá přesnosti použitého systému (kumulované koeficienty variace rozplnění a odečítání vyšší než 10% signifikantně snižují kvalitu ověření). V případě velmi špatné účinnosti promývání po inkubaci konjugátu může automatické ověření pipetování substrátového roztoku (měření při 490 nm) vykázat nesprávné výsledky s OD nižší než 0,100 i za nepřítomnosti substrátového roztoku. Tento jev však nebyl pozorován během evaluace 939 testovaných vzorků. 12

15 - LITERATURA 1. BARRE-SINOUSSI F., CHERMANN J.C., REY F. et al Isolation of a T. lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Science, 1983, 220, 868-871 2. ALIZON M., SONIGO P., BARRE-SINOUSSI F. et al. Molecular cloning of lymphadenopathy associated virus Nature, 1984, 312, 757-760 3. CLAVEL F., GUETARD D., BRUN-VEZINET F. et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986, 233, 343-346 4. CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, 691-695 5. BRUN-VEZINET F., ROUZIOUX C., BARRE-SIOUSSI F. et al. Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immunodeficiency syndrome or lymphadenopathy syndrome. Lancet. 1984, June, 1253-1256 6. MATHIESEN T., CHIODI F., BROLIDEN P.A., et al. Analysis of a subclass restricted HIV1 gp 41 epitope by omission peptides. Immunology, 1989, 67, 1-7 7. NORRBY E., BIBERFELD G., JOHNSON PR et al. The chemistry of site directed serology for HIV Infections. AIDS Res Human Retroviruses. 1989, 5, 487/493 8. McKEATING J.A., WILLEY R.L. Structure and fonction of the HIV envelope. AIDS, 1989, 3, S35-S41 9. PASQUALI J.L., KIENY M.P., KOLBE H. et al. Immunogenicity and epitope mapping of a recombinant soluble gp 160 of the human immunodeficiency virus type 1 envelop glycoprotein. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, 1107-1113 10. NEURATH A.R., STRICK N., TAYLOR P. et al Search for eptiope specific antibody responses to human immunodeficiency virus (HIV1) envelope glycoproteins signifying resistance to disease development. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, 1183-1192 11. NAIR B.C., FORD G., KALYANARAMAN V.S. et al. Enzyme immunoassay using native envelope glycoprotein (gp 160) for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibodies. J. Clin. Microbio. 1994, 32, 1449-1456 12. ZAAIJER H.L., EXEL-OEHLERS P.V., KRAAIJEVELDT T., et al. Early detection of antibodies to HIV1 by third generation assays. The Lancet, 1992, 340, 770-772 13. CONSTANTINE N.T., VAN DER GROEN G., BELSEY E.M. et al Sensitivity of HIV antibody assays determined by seroconversion panels AIDS, 1994, 8, 1715-1720 14. ENGELBRECHT S., DE JAGER G.J., VAN RENSBURG E.J. Evaluation of commercially available assays for antibodies to HIV1 in serum obtained from south african patients infected with HIV1 subtypes B, C, and D. J. Med. Viroloogy 1994, 44, 223-228 15. COUROUCE A.M. et al. Trousses de dépistage des anticorps anti VIH1 et VIH2. Spectra Biologie, 1994, 6, 43-51 16. DONDERO T.J., HU D.J., GEORGE J.R. HIV1 variants : yet another challenge to public health. The Lancet 1994, 343, 1376 17. SIMON F., LY T.D., BAILLOU-BEAUFILS A., et al Sensitivity of screening kits for anti HIV1 subtypes O antibodies. AIDS, 1994, 8, 1628-1629 18. JANSSENS W., HEYNDRICKX L. FRANSEN et al. Genetic and phylogenetic analysis of ENV subtypes G and H in Central Africa AIDS Res. Hum. Retrovirus 1994, 10, 877-879 19. GAOF., YUE L. ROBERTSON D.L. et al. Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2 : evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. J. Virol. 1994, 68, 7433-7447 13

14

15

16

17

18