VYBRANÉ VYŠETŘOVACÍ METODY PRO DIAGNOSTIKU AUTOIMUNITNÍCH CHOROB TYPU LUPUS ERYTHEMATOSUS

VYBRANÉ VYŠETŘOVACÍ METODY PRO DIAGNOSTIKU AUTOIMUNITNÍCH CHOROB TYPU LUPUS ERYTHEMATOSUS MUDr. Olga Faustmannová, MBA Disertační práce k získání vědecké hodnosti Ph.D. Brno 2007

Prohlašuji, že jsem disertační práci vypracovala samostatně a že jsem uvedla použité prameny a literaturu, ze kterých jsem čerpala. V Brně dne 30. 8. 2007 Olga Faustmannová 2

A n o t a c e Autor: Olga Faustmannová Název: Vybrané vyšetřovací metody pro diagnostiku autoimunitních chorob typu lupus erythematosus Těžiště práce spočívá v popisu vybraných diagnostických metod používaných ve vyšetřovacím procesu u pacientů s různými typy lupus erythematosus. V práci je popsáno klinické vyšetření - objektivní popis kožních lézí, anamnestické údaje. Z laboratorních vyšetřovacích metod je zmíněna detekce antinukleárních protilátek ANA - pomocí nepřímé imunofluorescenční metody a stanovení protilátek anti-ro metodou ELISA.Je uváděna problematika histologických a imunohistologických nálezů u sledovaného souboru pacientů. Cílem práce je ověřit zda vybrané diagnostické metody jsou vhodné pro tvorbu diagnózy lupus erythematosus, jak dalece je třeba je využívat v celém rozsahu. Datum Rok Stran 30.8. 2007 143 3

A n n o t a t i o n Author: Olga Faustmannová Title: Selected Examination Methods to Diagnose Autoimmune Diseases of Lupus Erythematosus Type This paper is focused on selected diagnostic methods used during the examination process in patients with various types of lupus erythematosus. The paper describes a clinical examination it includes objective descriptions of skin lesions and anamnestic data. Of laboratory examination methods, detection of antinuclear antibodies ANA by indirect immunofluorescence methods and determination of anti-ro antibodies by ELISA is mentioned. Histological and immunohistological findings in the studied set of patients are described. The paper is aimed at verifying whether the selected diagnostic methods are convenient for the creation of diagnosis in case of lupus erythematosus, how far it is necessary to use them to an entire extent. Date Year No. of pages 30.8. 2007 143 4

Práce obsahuje obrázky z fotoarchívu pracoviště a jejich šíření není možné bez souhlasu autora a pracoviště, kde byly pořízeny. Zvláštní poděkování patří prof. MUDr. Aleně Pospíšilové, CSc. a kolektivu laboratoře autoimunitní diagnostiky dermatovenerologické kliniky za cenné rady a plnou podporu při zpracovávání dané problematiky. Za technickou pomoc při grafických úpravách práce děkuji paní Janě Fišerové. V Brně dne: 30. 8. 2007 Olga Faustmannová 5

O B S A H : 1. Úvod strana 7 2. Cíl práce strana 9 3. Kožní projevy lupus erythematosus strana 10 4. Antinukleární protilátky strana 32 5. Histologie a imunohistologie lupus erythematosus strana 43 6. Metoda zpracování strana 50 7. Výsledky strana 60 8. Diskuze strana 91 9. Závěr strana 109 10. Souhrn strana 115 11. Seznam obrázků strana 119 12. Seznam tabulek strana 121 13. Literatura, ostatní prameny strana 123 6

1. Ú V O D Žijeme v 21. století století plném zvratů a rozporů. V našem globalizovaném světě, kde dominatní roli sehrávají informace, jejich dostupnost, vědeckotechnický pokrok, nové vznikající technologie, musíme řešit v medicíně rozpor mezi dostupnými a námi využitelnými zdroji oproti nákladnosti nových léčebných postupů, vyšetřovacích metod. Klient - pacient má na léčení stále vyšší nároky. Hovoříme o kvalitě života našich pacientů, ale často stojíme před otázkou zda všechny obory medicíny mají rovné příležitosti ke svému rozvoji a mohou opravdu účinně řešit potíže pacientů. Lupus erythematosus je mnohotvárná choroba. Bývá označován jako spektrum chorob (179). Je onemocněním, které zasahuje do řady medicínských oborů. Je onemocněním autoimunitním chronickým a ve své systémové formě invalidizujícím i smrtícím. Onemocnění postihuje více osob než např. leukémie, svalová dystrofie, mnohočetná skleróza, cystická fibróza nebo Hodgkinův lymfogranulom (34). Pro pacienta choroba často přináší osobní frustraci, určitou sociální izolaci, často i sníženou výkonnost a bolest. Stanovit diagnózu této nemoci není jednoduché právě pro její různorodé symptomy. Nezastupitelná role v diagnostickém procesu připadá dermatologům. Kožní projevy má 72 85% pacientů se systémovým erythematodem u 23 28% pacientů je vůbec prvním příznakem choroby (37). Diskoidní léze, která je nejčastěji typickým projevem 7

pouze kožního onemocnění však v 10% případů je popisována jako první projev systémového onemocnění a u 30 % pacientů se objeví v průběhu nemoci (15). Musíme si také uvědomit, že nejtěžší forma nemoci postihuje především mladé ženy nejčastěji ve 2. až 4. dekádě života ( 21, 39, 41, 57). Z uvedeného vyplývá, že kožní projevy onemocnění nelze podceňovat a vždy vyžadují vyšetření specialistou. Z našich pozorování lze učinit závěr, že v populaci přibývá nejasných stavů s necharakteristickým kožním nálezem i nálezem laboratorním. Stále více právě těchto pacientů má mírné systémové projevy již při prvním vyšetření, i když plně nesplňuje kritéria pro systémový lupus erythematosus. Tvoří však rizikovou skupinu, kde může dojít k nevratným orgánovým změnám v průběhu onemocnění a zasluhují naši zvýšenou pozornost. Lze předpokládat, že výrazné změny ekologických faktorů v celém světě, nadužívání léků i zvýšená expozice stresu povede ke zvyšení počtu autoimunitních onemocnění v populaci. Pacientům lze pomoci jedině včasnou, adekvátní a účinnou léčbou, kterou předejdeme nevratným změnám v organizmu, a tím také zvýšíme jejich kvalitu života. Moderní vyšetřovací metody v dermatologii mohou tento proces výrazně ovlivnit. Je třeba si uvědomit, že dermatolog je často prvním lékařem, ke kterému pacient přichází. Z těchto důvodů se naše pracoviště dlouhodobě zabývá pacienty s autoimunitními chorobami a poskytuje jim komplexní diagnostickou i terapeutickou péči. 8

2. C Í L P R Á C E Cílem práce je zhodnotit, zda používané diagnostické metody dostačují ke stanovení diagnózy lupus erythematosus. Klinické zhodnocení objektivního kožního nálezu má zjistit, jestli u těchto pacientů nedochází ke změnám kožních projevů, k jejich rozsahu. Ve sledovaném souboru bylo prováděno laboratorní vyšetření ke stanovení antinukleárních protilátek v séru nemocných. Pozornost byla věnována antinukleárním protilátkám stanovovaným nepřímou imunofluorescenční metodou jako běžně používaného skreeningového vyšetření. Dále protilátkám anti-ro, které byly určovány metodou ELISA. Úkolem je zjistit zda tato vyšetření jsou dostatečně přínosná při tvorbě diagnózy. Dalším vyšetřením, které bylo v práci zvoleno jako stěžejní, je vyšetření bioptického vzorku z kůže nemocného histologickou metodou a použitím přímých imunofluorescenčních metod. Práce má zjistit, zda vyšetřením vždy stanovíme diagnózu, zda nálezy jsou ve všech případech choroby zcela typické a přesvědčivé. 9

3. K O Ž N Í P R O J E V Y L U P U S E R Y T H E M A T O S U S Klinické projevy kožního postižení u onemocnění lupus erythematosus jsou různorodé. Sestavení klasifikačního systému kožních projevů, jejich nomeklatura se stále vyvíjí. Gilliam (49) ve svém klasifikačním systému rozděluje všechny kožní léze spojované s chorobou lupus erythematosus na histopatologicky specifické léze pro LE /lupus erythematosus/ - LE specifická kožní choroba a dále na kožní léze histopatologicky nespecifické pro LE LE nespecifická kožní nemoc. Již v r. 1993 Halmi a spolupracovníci (54) přichází s novým pojmem prezentujícím kategorii mezi chronickým lupus erythematosus a systémovým lupusem označovaný jako intermediární LE. Pacienti s tímto typem LE vykazují histopatologické rysy LE a splňují dle ACA /Americká revmatologická asociace/ kritéria pro systémový lupus erythematosus více než 1 kritérium méně než 4 kritéria (156). V současné době jsou využívána revidovaná kritéria pro klasifikaci systémového lupus erythematosus sestavená Hochbergem v r. 1997 (65). Spojení mezi kožními projevy LE a systémovou manifestací choroby ve své zprávě popisují u japonských pacientů ve své studii Watanabe a Tsuchida (176). Řada autorů se pokouší o zjednodušení klasifikace choroby, spojení zhodnocení histopatologických rysů nálezů u pacientů, klinických projevů, laboratorních nálezů, genetické asociace, fotosenzitivity. 10

Oddělené kategorie: akutní kožní lupus erythemotosus - ACLE subakutní kožní lupus erythematosus SCLE chronický /kožní/ lupus erythematosus C/C/LE používá ve své práci Kuhn (88, 89, 90, 91, 92, 93). V současné době se jako nejpřehlednější ke klasifikaci kožních projevů LE jeví Düsseldorfská klasifikace kožního erythematodu z r. 2003 (94): akutní kožní lupus erythematosus ACLE subakutní kožní lupus erythematosus SCLE chronický / kožní/ lupus erythematosus C/C/LE diskoidní lupus erythematosus DLE h y p e r t r o f i c k á, v e r u k ó z n í v a r i a n t a t e l e a n g i e k t a t i c k á v a r i a n t a lupus erythematosus profundus LEP chilblain lupus erythematosus CHLE intermitentní kožní lupus erythematosus ICLE lupus erythematosus tumidus LET bulózní léze u lupus erythematosus BLE LE specifické bulózní kožní léze LE nespecifické bulózní kožní léze primární bulózní kožní změny asociované s LE Tato klasifikace je poměrně složitá a v praxi není příliš využívána. Běžně se stále využívá rozdělení : Chronický (kožní) lupus erythematosus C(C)LE 11

Subakutní kožní lupus erythematosus SCLE Systémový lupus erythematosus SLE Je třeba si uvědomit, že jednotlivé kožní projevy LE se prolínají a i klasický diskoidní projev v 90% případů znamenající pouze kožní onemocnění může být incipietním projevem SLE (21, 158). Popis jednotlivých forem kožního postižení u LE: A k u t n í k o ž n í l u p u s e r y t h e m a - t o s u s Typickým klinickým projevem je motýlovitý erytém /malariformní exantém/. Jedná se o lokalizovaný makulózní nebo papulózní exantém na tváři nebo exantém, který se šíří dále na hlavu, krk, horní polovinu hrudníku, ramena, extenzory paží a dorza rukou (40, 155). U většiny pacientů existuje silná asociace se SLE (176, 182). Velmi časté jsou u pacientů se SLE kožní a také kloubní projevy (133). Pacienti s kožním projevem ACLE velmi často také mají postižení sliznice dutiny ústní, exantém na rukou a prstech (13, 108). V diferenciální diagnostice ACLE je nutné odlišit jiné formy LE, ostatní kolagenózy, lékové exantémy, pemphigus erythematosus, seborhoickou dermatitidu, rosaceu, celulitidu na tvářích, Sweetův sy, fotodermatózy (135). 12

Obrázek č. 1: Motýlovitý erytém u pacienta se SLE S u b a k u t n í k o ž n í l u p u s e r y t h e - m a t o s u s Poprvé byl popsán v r. 1977 Gilliamem (49). Pacienti s tímto typem erythematodu mají velmi často potíže muskuloskeletální, febrilie nevysvětlitelné infekční příčinou, trpí zvýšenou únavou, v jejich séru lze vysledovat abnormality. Svou tíží je řazem mezi SLE a CLE (30, 153). Kožní projevy tvoří exantémy složené z erytematózních 13

makul a papul, které splývají v léze papulosquamózní /psoriaziformní/ a druhá polovina pacientů má léze anulární, polycyklické.někteří z pacientů mají na kůži přítomny oba typy lézí (150). Dle studie Parodiho (118) 42% pacientů se SCLE má anulární polycyklickou formu, 39% papulosquamózní formu a 16% obě manifestace. Exantém nejizví, zanechává na kůži změny ve smyslu hypopigmentací i hyperpigmentací. Exantém je lokalizován především v oblastech kůže, která je vystavena slunci v oblasti výstřihu, horní třetině zad, extenzorovém povrchu paží a méně často na obličeji a ve vlasaté části hlavy. Pacienti vykazují výraznou fotosenzitivitu. U některých nemocných se SCLE lze nalézt také lokalizované léze typu ACLE na tvářích, popisovaný výskyt je velmi široký 7 100% pacientů (40, 114, 144). 29% pacientů se SCLE má také v průběhu nemoci diskoidní léze (29, 151). U osob trpících SCLE byl také popsán výskyt multiformního erytému (134). Sontheimer, Callen, David popisují také výskyt nespecifických kožních lézí u těchto pacientů nejizvící alopecie, nebolestivé postižení sliznic, livedo reticularis, periunguální teleangiektasie a Raynaudův fenomén (16, 29, 151). V diferenciální diagnostice SCLE je nutno vyloučit SLE, dermatomyositis, psoriasis vulgaris, polymorfní světelnou erupci, ekzém, tineu corporis, esenciální erythema exudativum multiforme Hebrae a další erytémová onemocnění (135). 14

Obrázek č. 2: Kožní projevy u pacientky se SCLE Obrázek č. 3: Kožní projevy u pacientky se SCLE 15

Ch r o n i c k ý /k o ž n í/ l u p u s e r y t h e- m a t o s u s Nejčastějším projevem na kůži při této formě postižení je diskoidní LE se svými variantami, vzácné formy představuje lupus erythematosus profundus a chilblain lupus erythematosus. Pramatorav ve své práci uvádí přehled více než 20 klinických subtypů CCLE (122). Diskoidní lupus erythematosus Je nejčastější variantou chronického kožního onemocnění bez postižení dalších systémů. Je ale třeba připomenout, že 5-10 % pacientů s diskoidními lézemi má od počátku SLE a asi přibližně u 30% pacientů se SLE se diskoidní léze, obvykle generalizované, objevují v průběhu SLE (21, 158). Diskoidní léze může být na kůži pacienta pouze jediná, ale také se může vyskytovat generalizovaně tj. pod úrovní krku a na kůži nad úrovní krku. Kožní léze jsou charakterizované erytematózními papulemi až diskoidními ostře ohraničenými plaky s prominující folikulární hyperkeratózou a často s tvorbou šupin. Aktivní léze jsou erytematózní s hyperpigmentací v okrajích. Léze se stupňovitě šíří a eventuálně se hojí centrálním jizvením a depigmentací. Perzistují měsíce až roky. Nejčastěji jsou postiženy oblasti kůže vystavované slunečnímu záření a to tvář, následuje vlasatá část hlavy a ušní boltce. Izolované léze pod úrovní krku nejsou tak běžné méně než 4%. Slizniční léze lze pozorovat přibližně v 15% případů na bukální sliznici a gingivách, postižena bývá i oční spojivka. Vysoce charakteristické jsou léze stříbřitě bílého povrchu na hranici červeně rtů, na sliznicích lze nalézt také jizvy a ulcerace. 16

Kožní léze začínají jako ploché nebo mírně elevované papule s nerovným povrchem pokrytým šupinami, po odstranění šupin lze na jejich spodní straně pozorovat rohové kuželíky tvořené čepy folikulární hyperkeratózy fenomém kartáčku (152). V diferenciální diagnostice je nutné rozlišit chronickou polymorfní solární dermatitidu, lymfocytární infiltraci kůže Jessner Kanof, mykotické onemocnění, lichen ruber planus, sarkoidózu (135). Obrázek č. 4: Kožní projevy u pacienta s CLE 17

Obrázek č. 5: Kožní projevy u pacienta s CLE 18

Obrázek č. 6: Kožní projevy u pacienta s CLE Hypertofická /verukózní/ varianta diskoidního LE Je méně obvyklou variantou choroby. Nejčastěji je projev lokalizován na končetinách, horní části zad a tvářích (28, 107). V diferenciální diagnostice je nutno vyloučit verukózní psoriázu, hyperkeratotický aktinický lichen planus, prurigo nodularis, keratoakantom, spinocelulární karcinom (28, 171). Teleangiektatická varianta diskoidního LE Je extrémně vzácná. Erytémové plaky, teleangiektasie jsou na tvářích, krku, ušních boltcích, dorzech rukou, prsou, krku i horní třetině zad (88, 107). Chilblain lupus erythematosus /lupus pernio/ Kožní projevy jsou lokalizovány akrálně, připomínají oznobeniny. Je zhoršován chladem (59). Kožní postižení tohoto typu může být pouze onemocněním kožním, ale také může doprovázet rozvinutý SLE (36). 19

Obrázek č. 7: Chilblain lupus Lupus erythematosus profundus /lupus panniculis/ Kožní projevy jsou tvořeny tuhými perzistujícími uzly na tvářích, kůži hlavy, prsou, horní polovině paží, stehnech a hýždích. Epidermální změny nemusí být vždy přítomny. Nad noduly však mohou být typické léze diskoidní, u některých nemocných lze nalézt nad uzly i ulcerace. Zánětlivá reakce je lokalizovaná v hlubší dermis a podkožní oblasti. 70% pacientů má také typické diskoidní léze a 50% mírné systémové projevy. Kožní morfy se odhojují vlesklými jizvami s lipoatrofiemi (51). I n t e r m i t e n t n í k o ž n í l u p u s e r y t h e m a t o s u s Lupus erythematosus tumidus Jednotka je poměrně vzácná. Kožní léze jsou anulární, nejizvící, bez hypopigmentací. Exantém je často popisován jako urticaria like léze (91, 95). Zcela jasná není také asociace se systémovým postižením jako vzácnou ji uvádí ve své práci Jolly (78). Kuhn (89) udává splnění kritérií pro diagnózu SLE u svých 9 pacientů s lupus erythematosus tumidus. Diferenciální diagnostika tohoto typu exantému spočívá v odlišení: polymorfní světelné erupce, Jessnerovy lymfocytární infiltrace, retikulární erythematózní mucinózy a psedolymfomu (136). 20

B u l ó z n í l é z e u l u p u s e r y t h e - m a t o s u s Frekvence bulózní projevů u LE je nízká, popisována je méně než u 5 % pacientů se SLE, u kterých byly nalezeny chronické bulózní projevy (47, 181). V roce 1997 Sontheimer rozdělil různé typy bulózních erupcí na bulózní projevy vyvíjející se v LE specifických lézích a dále bulózní léze, které nejsou spojeny se specifickými kožními LE lézemi, ale jsou nalézány u pacientů se SLE bulózní léze nespecifické (154, 155). Kožní onemocnění, ale i systémové onemocnění typu LE může být provázeno primárně bulózní dermatózou. V literatuře existují zmínky o spojení s dermatitis herpetiformis (31), bulózním pemphigoidem (113), pemphigus erythematosus (72), pemphigus foliaceus (10), epidermolysis bullosa acquisita (35), lineární IgA dermatózy (99), ale i porphyria cutanea tarda (48). N e s p e c i f i c k é k o ž n í p r o j e v y u S L E Tyto kožní projevy jsou morfologicky velmi variabilní. Vyskytují se v průběhu choroby asi u 40 60% pacientů (152). Provost (126) udává přehled nespecifických kožních změn u SLE takto: Vaskulitida 21

Hmatná nebo nehmatná purpura Urticaria like vasculitis Hypokomplementová urtikariální vaskulitida Livedo reticularis Fotosenzitivita Oznobeniny Alopecie Raynaudův fenomén /RF/ Erythromelalgia Bulózní léze Arthritida Sklerodermiformní změny Dermální mucinóza Erytéma multiforme like léze Pigmentové změny Změny na nehtech Cutis laxa Lichen planus Acanthosis nigricans Angioedem V a s c u l i t i s Vaskulitické změny jsou nejčastějšími nespecifickými kožními změnami. Jejich frekvece se pohybuje od 20 do 70% (37, 121). V bioptických vzorcích vaskulitických kožních lézí je nejčastěji identifikována leukocytoklastická vaskulitida. Klinické projevy urtikarie u pacientů s LE představuje urticaria vasculitis a hypokomplementová urticaria. L i v e d o r e t i c u l a r i s Je velmi často projevem přítomnosti antifosfolipidového syndromu u pacientů se SLE (180). 22

F o t o s e n z i t i v i t a Je velmi častým příznakem u pacientů s LE. Kuhn ve své studii udává ve sledovaném souboru u pacientů s DLE pozitivní fototesty u 33% pacientů, u pacientů s LET u 47%, u pacientů se SCLE 40%, u pacientů se SLE 12% pacientů (90). O z n o b e n i n y Jsou nalézány v tomto případě především u pacientů žijících v chladném podnebí. Perzistují často i v letním období. Často předcházejí rozvoj změn, které jsou charakteristické pro LE (126). A l o p e c i e Nejizvící alopecie doprovází akutní, toxickou exacerbaci SLE a je obvykle přechodná /jedná se o projevy telogenního deffluvia/. Frontální alopecie je provázena zvýšením vlasové fragility. Krátce odlomené vlasy bývají potom označovány jako vlasy lupusové. Symptomy alopecie areata lze také pozorovat v některých případech SLE jedná se pravděpodobně o přítomnost dvou autoimunitních chorob u téže osoby (126). R a y n a u d ů v f e n o m é n Asi u 2 3% pacientů s Raynaudovým fenoménem je diagnostikováno onemocnění pojiva. Dle některých autorů však projevy Raynaudova fenoménu předchází SLE (33,81). Závažnost projevů Raynaudova fenoménu nekoreluje s aktivitou SLE a Diment jej považuje za dobrou prognostickou známku SLE (33). 23

E r y t h r o m e l a l g i a Etiologie choroby je neznámá (24). SLE doprovází erythromelalgia sekundární. Je charakterizovaná prominujícím erytémem a zvýšenou teplotou zejména na nohou, ale může postihovat také ruce. Charakterizuje ji pálivá bolest(24). B u l ó z n í l é z e - popis viz. předchozí text A r t h r i t i s Se SLE je především asociována symetrická neerozivní polyartritida. Revmatoidní uzly u pacientů se SLE ve své práci popisuje Simmons O Brien (146). S k l e r o d e r m i f o r m n í z m ě n y Tyto změny bývají spojeny s pozitivitou anti-u1-rnp protilátek. Představují je především sklerodaktylické změny. Tito pacienti se SLE mají také častěji plicní insuficienci, projevy Raynaudova fenoménu a esofageální dysmotilitu (126). Kožní kalcinózy jsou u SLE raritní (80). D e r m á l n í m u c i n ó z a Papulonodulární eflorescence, ve kterých byla histologicky identifikována depozita mucinu, popsal u japonských pacientů se SLE Maruyama (106). U pacientů se SCLE popisuje mucinová depozita v kůži Ruzicka (138). E r y t é m a m u l t i f o r m e l i k e l é z e Rowell a spolupracovníci v roce 1963 popsali erytéma 24

multiforme like léze u pacientů s LE. (134). Provost a spolupracovníci popisují tyto léze u pacientů s neonatálním lupusem a pozitivitou anti-u1-rnp protilátek a anti-ro protilátek (123, 125). P i g m e n t o v é z m ě n y Hypopigmentace i hyperpigmentace bývá přítomna u pacientů s LE, s různými kožními lézemi. Na kůži lze najít depigmentavané projevy, ale i pozánětlivou hyperpigmentaci (126). Z m ě n y n a n e h t e ch Urowitz ve své práci udává alteraci nehtů u 31% pacientů studie. Nejčastější abnormalitou je onycholýza, u pacientů se SLE tečkování, horizontální a longitudinální rýhy, leukonychie. Často je také detekována atrofie a teleangiektasie nehtové kutikuly (163). Difuzní a lineární nehtovou dyschromii detekoval u 52% pacientů se SLE Vaughn (165). U pacientů se SLE bylo popsáno další kožní postižení: anetodermia (12) cutis laxa (128) acantosis nigracans (132) lichen planus (164) T buněčné autoagresivní choroby (164) angioedém (25) 25

Další formy LE L é k y i n d u k o v a n ý l u p u s Léky indukovaný lupus vytváří klinický a imunologický syndrom podobný spontánnímu SLE. Klinický syndrom a antinukleární protilátky se objeví dříve u jedinců s pomalým acetylátorovým fenotypem. Signifikantně je u pacientů také vyšší frekvence HLA- DR4(6). Léky indukovaný lupus je reverzibilní, když se přestane lék podávat postupně symptomy mizí. Příznaky jsou mírnější než u idiopatického SLE. Převažují projevy perikardiální a kloubní. Renální postižení, onemocnění centrálního nervového systému, leukopenie a anémie nejsou obvyklé. Poměr postižených mezi muži a ženami je stejný. Nemoc obvykle začíná několik měsíců po začátku medikace léku. Velmi často jsou nalezeny v séru pacientů protilátky proti histonům, protilátky proti ds-dna a Sm jsou vzácné (45). Lékově indukovaný lupus může vzniknout po řadě preparátů. Například:prokainamid, quinidin, hydralazin, isoniazid, minocyklin, beta blokátory, propylthiouracil, penicillamin, karbanazepin, fenytoin, fenothiaziny, sulfonamidy a sulfasalazin, interferon alfa, interferon gama, infliximab, terbinafin,... ( 6, 17, 45, 154) N e o n a t á l n í l u p u s Do dnešních dnů bylo popsáno asi 150 případů neonatálního lupusu. Onemocnění je zapříčiněno transferem mateřských protilátek anti-ro nebo anti-la přes placentu (100, 131). 26

U dětí se vyvíjí typické diskoidní kožní léze krátce po narození a expozici UV světlu. Přibližně polovina těchto dětí má kongenitální srdeční blok, který může být i smrtelný. Z další projevů se objevuje hemolytická anémie, trombocytopenie, hepatosplenomegalie. Onemocnění po 6 měsíci věku dítěte obvykle mizí. Pacientky s lupusem, které mají děti s tímto onemocněním mají 25% pravděpodobnost, že další dítě bude mít tuto chorobu (105). U pacientů s onemocněním lupus erythematosus, zejména u nejtěžší formy lupus erythematosus SLE, nacházíme četné příznaky exatrakutánní, které limitují život pacienta. Při tvorbě diagnózy SLE jsou využívána vypracovaná diagnostická kritéria ACA /Americká revmatologická asociace/, která byla aktualizována v roce 1997 Hochbergem (65). Dle Schura (145) klasický SLE splňuje mnoho kritérií, definovaný SLE 4 a více kritérií, pravděpodobný SLE 3 kritéria, možný SLE 2 kritéria. 27

Tabulka č. 1: Diagnostická kritéria SLE podle ACA /1982, upravená 1997/ (65, 156) 1. Motýlovitý erytém 2. Diskoidní exantém 3. Fotosenzitivita 4. Ulcerace v dutině ústní 5. Artritida 6. Serozitida 7. Postižení ledvin Přetrvávající erytém v obličeji, plochý nebo vyvýšený, přecházející přes líce s tendencí vyhýbat se nazolabiálním rýhám; přítomen při vyšetření nebo v anamnéze, potvrzené zodpovědným zdrojem. Erytematózní vyvýšená ložiska s adherujícími keratotickými šupinami a vyplněním folikulů, atrofické jizvení u starších lézí. Kožní exantém jako následek neobvyklé reakce na sluneční záření v anamnéze nebo prokázané při klinickém vyšetření Ulcerace na sliznici dutiny ústní nebo nosohltanu, obvykle nebolestivé, prokázané při klinickém vyšetření. Neerozivní artritida postihující nejméně dva periferní klouby, charakterizovaná palpační bolestivostí, otokem nebo výpotkem. a) Pleuritida typická pleurální bolest v anamnéze nebo přítomnost pleurálního třecího šelestu nebo pleurálního výpotku při klinickém vyšetření. nebo b)perikarditida prokázaná EKG nebo perikardiálním šelestem nebo průkazem perikardiálního výpotku. a) Přetrvávající proteinurie - > 0,5 g/24 hodin nebo více než +++, není-li provedeno kvantitativní vyšetření. nebo b) Buněčné válce (erytrocytární, hemoglobinové, granulární, tubulární nebo smíšené). 28

8. Neurologické postižení 9. Hematologické poruchy a) Křeče nejsou-li způsobeny předávkováním léky nebo známou metabolickou poruchou (např. urémie, ketoacidóza nebo porucha elektrolytového metabolismu). nebo b) Psychóza není-li způsobena předávkováním léky nebo známou metabolickou poruchou (např. urémie, ketoacidóza nebo porucha elektrolytového metabolismu). a) Hemolytická anémie s retikulocytózou. nebo b) Leukopenie < 4,000/mm 3 prokázaná nejméně ze dvou vyšetření. nebo c) Lymphopenie < 1,500/ mm 3 prokázaná nejméně ze dvou vyšetření. nebo d) Trombocytopenie < 100,000/ mm 3 není-li vyvolána léky. 10. Imunologické poruchy a) Anti-dsDNA; přítomnost autoprotilátek proti nativní DNA v abnormálním titru. nebo b) Anti-Sm; přítomnost protilátek proti jadernému antigenu Sm. nebo c) Antifosfolipidové protilátky prokázané: 1) nálezem abnormálních sérových hladin IgG nebo IgM antikardiolipinových protilátek, 2) pozitivním nálezem lupusového antikoagulans s použitím standardním metody nebo 3) falešně pozitivní sérologický test na syfilis po dobu nejméně 6 měsíců, potvrzený negativitou při imobilizačním testu s Treponema pallidum či fluorescenčním absorpčním testem 29

11. Antinukleární protilátky Abnormální titr antinukleárních protilátek prokázaný imunofluorescenčním nebo jiným odpovídajícím testem v kterékoliv časové období a v nepřítomnosti léků, vyvolávajících syndrom léky indukovaného lupus erythematodes. Diagnózu SLE opravňuje přítomnost nejméně 4 kritérií. Obrázek č. 8: Kožní projevy u pacientky s CLE 30

Obrázek č. 9: Kožní projevy u pacienta s CLE 31

4. A N T I N U K L E Á R N Í P R O T I L Á T K Y Při vyšetřování pacientů s lupus erythematosus stanovení autoprotilátek v séru pacientů pomáhá konfirmovat suspektní klinickou diagnózu. Autoprotilátky u SLE nalézáme téměř univerzálně. Bývají namířeny proti různým tělním buňkám, proti jejich povrchovým molekulám nebo proti různým složkám buněk orgánově nespecifické antinukleární nebo anticytoplazmatické protilátky. Produkce protilátek může být vyvolána různými mechanismy i jejich kombinacemi. Cizorodý antigen /podobný autoantigenu/ vyvolá tvorbu protilátky, která zkříženě reaguje s vlastním antigenem molekulární mimikry (7, 129). Cizí antigen může změnit vlastní molekulu natolik, že se stane imunogenní (166). K vyvolání autoimunitní odpovědi může vést i ektopická prezentace HLA molekul. Autoprotilátky mohou vznikat také jako reakce na přítomnost patogennního idiotypu za účasti dalších pomocných mechanismů (143). Svoji roli mohou hrát superantigeny (183). K uplatnění všech těchto mechamismů může dojít, jestliže je porušená eliminace reaktivních klonů jsou změněny mechanismy apoptózy (116). Autoprotilátky vyvolávají tkáňové poškození. Cílem pro antinukleární protilátky se v buňce stávají chromatin, jaderná membrána a póry, jadérko, ribonukleové kyseliny, jaderná matrix, jaderná tekutina a různé součásti cytoplazmy (169). 32

Historickým prvním laboratorním testem pro stanovení antinukleárních protilátek se stal v roce 1948 Hargravesem popsaný fenomém LE buněk (55). Test byl využíván při stanovování diagnózy SLE. V padesátých letech minulého století byla vyvinuta detekce antinukleárních protilátek nepřímou imunofluorescenční technikou na zvířecích tkáňových substrátech. Nejvíce byly používány krysí a myší ledviny, řezy z jater. Toto vyšetření bylo více senzitivní, ale mělo omezenou specificitu. K tomu, aby se zamezilo falešně pozitivním nebo klinicky nekorelujícím výsledkům byl popisován titr ředění séra. Čím vyšší ředění séra při pozitivním nálezu antinukleárních protilátek, tím více byla pravděpodobnější u pacienta choroba pojivové tkáně (44, 66, 67). Pozitivní nálezy antinukleárních protilátek byly uznány jako jedno z diagnostických kritérii pro SLE (65, 156). Další vývoj přinesl zdokonalení v detekci antinukleárních protilátek nepřímou imunofluorescenční technikou. Celosvětově se začala používat jako substrát buněčná linie lidských tumorózních buněk /HEp2 buněčná linie/ k rutinním vyšetřování (42). Lidská buněčná linie je senzitivnějším substrátem než otisky jaterní tkáně hlodavců pro detekci antinukleárních protilátek. Například na jaterních řezech nejsou exprimovány Ro antigeny. ANA negativní lupusy ve velké většině představovaly právě pacienti s anti-ro pozitivními protilátkami, které však již vykazovaly pozitivitu na substrátu HEp2 buněk (125). Zvýšení senzitivity vyšetření na substrátu HEp2 buněk ve srovnání s tkání hlodavců je spojeno s nízkou specificitou. Více osob zdravých i s jinými chorobami než SLE mělo pozitivní výsledky. Na základě zkušeností je doporučováno, aby při vyšetřování na substrátu HEp2 buněk 33

byl za pozitivní považován až výsledek v titru 1:80 (82). Imunofluorescenčně lze detekovat protilátky s různou antigenní specifitou. Tato metoda je užitečná jako skreeningové vyšetření. Je volena v počátku hledání autoprotilátek (131). Při vyhodnocování výsledků stanovování ANA se také hodnotí typ fluorescence: homogenní, granulární, centromerální, nukleolární, periferní a další typy. U jednoho pacienta může být přítomno více typů fluorescence v jednom vzorku séra. Klinicky je považován typ fluorescence za méně významný ukazatel. Komplex všeobecných antinukleární protilátek ANA lze také detekovat metodou ELISA, tato technika je však v tomto případě využívána méně často. Spíše se rozšířila detekce specifických autoprotilátek pomocí ELISA metody. Specifické autoprotilátky mohou být detekovány celou řadou technik: imunodifúze protisměrná imunoelektroforéza - CIE radioimunoanalýza - RIA imunoenzymová analýza /enzymoimunoanalýza / - ELISA western blotting nepřímá imunofluorescenční technika - IIF K l i n i c k y n e j v ý z n a m ě j š í s p e c i - f i c k é a u t o p r o t i l á t k y Anti-DNA protilátky Anti-DNA protilátky tvoří heterogenní skupinu namířenou na různá antigenní místa na molekule DNA. Rozeznáváme: Protilátky, které reagují pouze s dvojitou šroubovicí DNA (double stranded DNA tj. dsdna). 34

Protilátky, které zkříženě reagují s ds a ssdna (single stranded tj. jednovláknová DNA ssdna). Tyto protilátky jsou u SLE nejčastější. Protilátky reagující pouze s ssdna. Protilátky reagující se Z konformací DNA /Z-DNA/ (169) Protilátky proti ssdna a dsdna jsou označovány jako protilátky proti nativní DNA /ndna/ (73). Vysoké hladiny anti-ndna protilátek jsou asociovány především se SLE (157). Byla pozorována pozitivní korelace mezi těmito protilátkami a přítomností nefritidy u SLE (74). Jednorázové stanovení anti n-dna je sice vysoce diagnostické, ale pro prognostické účely se doporučuje longitudinální sledování (168, 169, 170). Zdvojnásobení hladiny anti-ndna během 10 týdnů ohlašuje nástup relapsu SLE (147). Protilátky proti histonům Histony představují bazickou složku jádra, obsahují velké množství pozitivně nabitých amninokyselin /arginin, lysin/. Autoprotilátky proti histonům se nalézejí u SLE, zejména pak u lékově indukovaného lupusu, SLE (45), revmatoidní artritidy /RA/, polymyositidy, smíšeného syndromu pojiva, juvenilní chronické artritidy. Většina pacientů, kteří jsou léčeni prokainamidem rozvine protilátkovou odpověď proti histonům, ale symptomatické onemocnění se objeví asi u 10 20% z nich. Většina antihistonových protilátek je v tomto případě benigních. Protilátky jsou IgM proti všem histonům. Naopak pacienti s klinickými projevy LE při užívání prokainamidu mají především detekovatelné protilátky třídy IgG a jsou namířeny proti komplexu H2A-H2B (157). 35

Protilátky antinukleozomální Antinukleozomální protilátky reagují pouze s nukleozomy nebo subnukleozomálními komplexy sestávajícími z histonů a DNA. Objevují se dříve než ostatní autoprotilátky u SLE a mají pravděpodobně významnou úlohu v patogenetickém mechanismu nefritidy (8). Nukleozómy se najdou v cirkulaci u pacientů se SLE a předpokládá se spojení s defektní apoptózou, která umožní změny na uvolňovaných nukleozomech. Ty se snáze stanou imunogenní (19). Protilátky proti deoxyribonukleoproteinu /DNP/ Tyto protilátky reagují s nukleoproteinem. Představují heterogenní směs s různou a většinou zkříženou reaktivitou. Lze detekovat protilátky proti histonům, komplexům histonů s DNA i proti nehistonovému proteinu jádra. Protilátky proti DNP jsou detekovatelné v sérech velké části pacientů s chorobami pojivové tkáně a zejména u LE (131). Protilátky proti U1-RNP a SM antigenu Jedná se o skupinu autoprotilátek namířených proti malým jaderným ribonukleoproteinovým částicím, které se skládají z komplexu uridinem bohatých úseků ribonukleové kyseliny a několika různých proteinů. Anti-Sm protilátky jsou velmi specifické pro SLE. Senzitivita je však poměrně malá. Vencovský uvádí jejich výskyt v sestavě 100 pacientů asi pouze v 8% (168).Anti- Sm protilátky téměř vždy jsou doprovázeny přítomností U1- RNP protilátek, opačně tento vztah neplatí. Anti-SSA/Ro a anti-ssb/la protilátky Tyto protilátky byly popsány nezávisle dvěma skupinami, proto zde existuje terminologická nejednotnost (2, 22). 36

Existují alespoň 2 typy Ro antigenu dle molekulové hmotnosti rozlišujeme Ro60 a Ro52. Ro54 je pravděpodobně izoformou Ro52, je obsažen v lidských erytrocytech. Funkce Ro částice a její přesná intracelulární lokalizace je neznámá. La je jaderný fosfoprotein o molekulové hmotnosti 50kD. Anti-La protilátky se vyskytují prakticky vždy s anti-ro protilátkami, ale obráceně to neplatí (169). Rechlin poukazuje na klinické a serologické fenomény spojené s výskytem anti-ro protilátek u pacientů s LE (131). 1. Revmatoidní faktor je nalezen u 80% pacientů. 2. SLE pacienti s anti-ro a anti-la protilátkami mají nízkou frekvenci nefritidy, zatímco pacienti pouze s anti-ro protilátkami mají vysokou frekvenci nefritidy. 3. Anti-Ro protilátky nalézáme v 62% u ANA negativních SLE pacientů. /Tento jev má dnes již bližší vysvětlení v tom, že při detekci ANA nepřímou imunofluorescencí na zvířecích substrátech, tyto mohou obsahovat málo Ro antigenu nebo může být při zpracovávání Ro protein odstraněn. Má li pacient v séru pouze anti-ro protilátky potom může fluorescenční vyšetření ukázat negativní výsledek./ 4. Anti-Ro protilátky nalézáme u 63% pacientů se subakutním kožním LE. 5. U SLE pacientů s anti-ro protilátkami je zvýšená frekvence HLA DR2 a HLA DR3. 6. 85% homozygotně C2 a C4 deficitních pacientů se SLE má anti-ro protilátky. Jiné precipitanty nebyly prokázány. 7. Anti-Ro nebo anti-la protilátky jsou téměř konstatním 37

nálezem u pacientů s neonatálním lupusem. Simmons-O Brien a spolupracovníci v rozsáhlé studii desetiletého sledování 100 pacientů s anti-ro protilátkami prokázali, že přítomnost těchto protilátek v séru nemocných není příliš dobrým prognostickým znakem. U 65% nemocných byl zaznamenám chronický progresivní průběh onemocnění (146). Výskyt anti-ro protilátek v séru nemocných je spojován s výraznou fotosenzitivitou. Na tuto skutečnost upozornil již v r. 1981 Maddison (104). Protilátky proti ribozomálnímu RNP (anti-rrnp, anti-p, anti-p protein) Anti-P protilátky jsou velmi specifické pro SLE. Výskyt se udává asi u 20% nemocných se SLE (159). Jejich výskyt stoupá u aktivního onemocnění a opakovaně je uváděna asociace s CNC postižením v rámci SLE, především asociace s poruchami chování (74). Stoupající titry těchto protilátek mohou u některých pacientů ohlašovat nástup psychózy (32). Dále se udává asociace anti-p protilátek s jaterním a ledvinovýn poškozením u SLE (69). Protilátky proti Ku antigenu Ku antigen je heterodimer, skládá se z podjednotek 70kD a 80-86 kd, které jsou v jádře a jadérku. Nejčastěji jsou tyto protilátky nalézány u pacientů se SLE a smíšeným syndronem pojiva (130). Protilátky-PCNA/cyklin protilátky Vysoce specifické pro SLE, ale vyskytují se zřídka asi v 6% případů SLE (168). 38

Další autoprotilátky určované u SLE Protilátky proti hnrnp A1 proteinu, výskyt koreluje s přítomností Raynaudova fenomému a poruchou motility jícnu (115). Protilátky proti RA-33 antigenu (58). Anti-lamininové protilátky (86). Protilátky proti proteinům tepelného šoku. A řada dalších zkoumaných protilátek v současných dnech. Asi u 30% nemocných se SLE byly prokázány protilátky, které patří mezi p-anca (170). Na závěr se zmiňuji pouze výčtem o další autoprotilátkách, které jsou u pacientů s LE detekovatelné. Jsou namířeny proti krevním buňkám /antilymfocytární protilátky (178), antierytrocytární protilátky (178), antitrombocytární protilátky (127)/. Dále byly u pacientů se SLE detekovány protilátky antineuronální (11) i protilátky antiendoteliální (109). Výsledky serologického vyšetření pacientů a stanovení autoprotilátek má v diagnostice LE velký význam. Nikdy však výsledky nesmí být hodnoceny izolovaně bez klinického kontextu (82). Nelze opomenout skutečnost, že i u zcela zdravých osob lze nalézt v séru autoprotilátky. V doporučeném postupu klinického užití vyšetření antinukleárních protilátek a specifických autoprotilátek k nukleárním antigenům v r. 2000 Kavanaugh a spolupracovníci (82) udává výskyt ANA při použití nepřímé imunofluoresneční metody u normálních osob V titru 1:40 20 30% V titru 1:80 10 12% V titru 1:160 5% V titru 1:320 3% 39

Přes tato všechna úskalí stanovení hladiny antinukleárních protilátek v séru nemocných s lupus erythematosus má svoje nezastupitelné místo. Sontheimer a Provost (155) uvádějí laboratorní nálezy antinukleárních protilátek u různých typů LE následovně: ANA u ACLE u SCLE u DLE vysoce pozitivní středně pozitivní pozitivní anti-ro protilátky /imunodifúzí/ u ACLE pozitivní u SCLE vysoce pozitivní u DLE bez asociace /ELISA technikou/ u ACLE u SCLE u DLE středně pozitivní vysoce pozitivní pozitivní anti-ndna protilátky u ACLE vysoce pozitivní u SCLE pozitivní u DLE bez asociace Akutní kožní lupus erythematosus Kožní léze jsou spojovány se SLE. U pacientů s rozvinutým a neléčeným aktivním SLE může najít všechny popisované autoprotilátky. Je to choroba, která představuje prototyp autoimunitního onemocnění. Výskyt antinukleárních protilátek v séru 40

těchto pacientů ve vysokém titru je běžný. Chronický /kožní/ lupus erythematosus 30-40% pacientů s C/C/LE má v séru prokazatelný nízký titr ANA. Avšak 5% pacientů s projevy chronického kožního erythematodu má vysokou hladinu antinukleárních protilátek v tomto případě se jedná o pacienty se SLE při chronických kožních projevech lupusu na kůži. Protilátky proti ss-dna jsou u C/C/LE běžné (15). Anti Ro protilátky jsou také pozorovatelné u C/C/LE (101). Méně často lze nalézt anti La protilátky a anti-sm protilátky (124). Subakutní kožní lupus erythematosus Asi 7-27% pacientů s LE má právě SCLE (23). 60-81% těchto nemocných má na substrátu HEp2 buněk pozitivní ANA (16). U 40 100% pacientů Lee detekoval immunodifuzí protilátky anti-ro (101). Anti-La protilátky byly pozorovány jen u 12-42% pacientů (77). Prevalence antidsdna protilátek u pacientů s SCLE udává Chelbus 1,2% (71). Pouze 10% pacientů se SCLE má pozitivní protilátky anti-dsdna, anti-smrnp nebo anti-u1rnpo (153). Lupus erythematosus profundus 70-75% těchto nemocných má pozitivní ANA, ale protilátky proti dvouvláknové DNA nejsou běžné (141). Chilblain lupus Řídká forma LE. Fransceschini popisuje ve své studii 9 41

pacientů s touto formou LE a nalezl u nich v osmi případech pozitivní protilátky anti-ro (43). Lupus erythematosus tumidus Laboratorní rysy tohoto typu LE nejsou odděleně popsány. Na závěr tohoto literárního shrnutí o antinukleárních protilátkách je nutné uvést, že klinické a laboratorní nálezy nám pomohou správně klasifikovat typy LE. Ve studii Tebbeho a spolupracovníků z r. 1997 (158) je jasně poukázáno na to, že pacienti s kožním postižením typu SCLE a DLE s nefropatií, artralgiemi a ANA v titru vyšším než 1:320 mají signifikantně vyšší riziko systémové choroby. Sledování hladin antinukleárních protilátek v séru pacientů je také vhodným nástrojem při hodnocení účinnosti léčby (142). 42

5. H I S T O L O G I E A I M U N O H I S T O L O G I E L U P U S E R Y T H E M A T O S U S Histologické a imunohistologické vyšetření u pacientů s LE nesmí být v diagnostické procesu opomíjeno. Obvykle jsou pro tyto účely rozlišovány tři základní typy lupus erythematosus : chronický diskoidní lupus erythematosus subakutní kožní lupus erythematosus systémový lupus erythematosus Další varianty LE jsou povážovány za méně obvyklé (140). Lever upozorňuje na skutečnost, že mezi jednotlivými typy onemocnění existují velmi často přechody a ne každý případ onemocnění lze přesně přiřadit k určitému typu (102). Bioptický vzorek kůže je odebrán klasickou chirurgickou cestou a dále zpracován. Rutinní řezy z kůže vyšetřované osoby jsou nejčastěji barveny hematoxylin-eosinem, reakcí PAS, eventuálně dalšími speciálními metodami /koloidním železem, na přítomnost kyselých mukopolysacharidů/. Při histopatologickém i imunohistologickém vyšetření bioptického vzorku kůže je třeba znát základní údaje : zda-li je kůže zdravá osluněná, neosluněná, kůže s exantémem, místo odběru kůže, charakter kožních lézí, dobu trvání exantému, předchozí léčba a to i léčba lokální. Chronický kožní lupus erythematosus Diskoidní lupus erythematosus Lever popisuje 5 základních histopatologických znaků DLE, pokud je vyšetřována kůže z typické diskoidní léze (102). 1. hyperkeratóza s keratotickými čepy 43

2. ztenšení a zploštění stratum Malphigi 3. hydropická degenerace bazálních buněk 4. infiltrát v dermis převážně z lymfocytů s tendencí uspořádání kolem kožních adnex 5. edém, vazodilatace a nevelká etravazace erytrocytů v horní dermis Hypertrofické léze vykazují akantózu a hyperkeratózu epidermis (177). Diferenciální diagnostika zahrnuje vyloučení: polékové reakce, reakce štěpu proti hostiteli, mycosis fungides, Jessnerovy lymfocytární infiltrace kůže, časné stádium dermatomyositidy (140). Subakutní kožní lupus erythematosus Histopatologické rysy jsou téměž identické s DLE. Diferenciální diagnostika mezi těmito typy LE je u časných lézí obtížná (140). Hydropická degenerace bazální buněčné vrsty v epidermis a edém dermis jsou více výrazné než u diskoidních lézí, hyperkeratóza a zánětlivý infiltrát jsou naopak méně prominující (148). Edém v horní dermis a hydropická degenerace bazálních buněk způsobují vznik štěrbin a puchýřů mezi epidermis a dermis (4, 103, 148). Tak jako u DLE i u SCLE se nalézají koloidní tělíska (84). Lze nalézt fokální extravazaci erytrocytů a někdy také fibrinoidní depozita v dermis (4). Systémový lupus erythematosus V časných lézích jsou histopatologické změny nespecifické, včetně diskrétní vakuolární degenerace bazálních vrstev, edému a nevýrazného lymfatického infiltrátu v horní dermis. V lézích staršího data prominuje vakuolární degenarace bazální membrány, edém, extravazace erytrocytů a 44

lymfatické infiltráty v horní dermis. Někdy jsou v časných lézích přítomny neutrofily na dermoepidermální junkci. Fibrinoidní materiál může být nalézán kolem cév a mezi kolageními vlákny. Některé bioptické vzorky vykazují také znaky leukocytoklastické vaskulitidy. Speciálním barvením lze prokázat mucinová depozita. V diferenciální diagnostice je nutné odlišit:polymorfní světelnou erupci, leukocytoklastickou vakulitidu (140). Další typy LE Lupus erythematosus tumidus Histopatologicky tuto formu LE charakterizují lymfocytární infiltráty v dermis, mucinová depozita mezi kolageními vlákny. Epidermis a podkožním tkáně jsou obvykle nepoškozené (93). Lupus profundus Histopatologicky dermis a epidermis mohou být poškozeny dermálními lymfocytárními infiltráty a vakuolární degenerací. Hlavním rysem choroby je však prominující lobulární panniculitis. Nalezeneme také difuzní lymfocytární infiltráty s jaderným prachem (141). Později se vyvíjí tukové nekrózy a hyalinizace tukových lobulů. Eosinofily nalezneme asi u 26% případů (120). Popisováno je také cévní poškození u těchto případů LE (56). Diferenciální diagnostika spočívá v odlišení erythema nodosum, erythema induratum, morphei, T-buněčného lymfomu (139, 140). Neonatální lupus erythematosus Má obdobné histologické rysy jako SCLE (160). 45

Bulózní lupus erythematosus Histopatologicky má dvě odlišné varianty. 1.infiltrát se skládá z neutrofilů a dalších mononukleárních buněk, neutrofilní infiltráty jsou v dermálních papilách, dále jsou přítomny puchýře a dermální edém, nukleární prach je pozorovatelný v abscesech v dermálních papilách 2.mononukleární infiltráty s puchýři jsou nalézány v dlouhotrvajících lézích LE (140). I m u n o h i s t o l o g i e L E V r. 1963 Burnham se spolupracovníky a v r. 1964 Cormane na sobě nezávisle poprvé popsali nález lupózního /lupusového/ pruhu -/LTB/ v lézionální kůži u pacientů se systémovým LE nebo s diskoidním LE (14, 26). Beutner poprvé představil přímou imunofluorescenční techniku v praxi (9). Tato technika detekuje depozita imunoglobulinů IgG, IgA a IgM, komplementové komponenty C1q, C4 a C3 v bioptických vzorcích kůže pacientů s LE. Vyšetřována bývá kůže postižená exantémem, ale také kůže zdravá. Vzorek kůže musí být rychle zmrazen v tekutém dusíku nebo vložen do speciálního média. Typickým imunohistologickým nálezem je tedy pruh uloženin IgG a C3 na hranici mezi epidermis a koriem zjišťovaný buď jen v záhybech epidermis nebo v celém průběhu bazální membrány. Kromě IgG a C3 jsou prokazovány i další uloženiny IgM a IgA, časté jsou uloženiny fibrinu (161). Při popisu imunofluorescenčních nálezů je možné rozlišit několik morfologickcých typů subepidermálních pruhů: homogenní představuje souvislou linii nestejné šíře tečkovitý tvořený drobnými blízko u sebe uloženými 46

hrudkami imunokomplexů popřípadě komplementu vláknitý velmi podobný tečkovitému pruhu, pouze jednotlivá drobná ložiska jsou uspořádána kolmo ke hranici epidermis a koria, vzájemně se proplétají Pravidlem je současný výskyt dvou typů pruhů, které se vzájemně kombinují. Při provedení excize ze dvou míst u téhož pacienta není morfologický vzhled pruhu konstantní (87). Dalšími nálezy v kůži jsou uloženiny imunoglobulinů a komplementu v pruhu také kolem vlasových folikulů, mazových žláz a vývodů potních žláz. Nezřídka bývají uloženiny také ve stěnách cév, zvláště v periadnexální dermis potních žláz. Ukazuje se určitá korelace mezi nálezem uloženin imunokomplexů IgG ve stěnách sekrečních částí potních žláz a postižením ledvin, vysvětlovaná na základě funkční a anatomické podobnosti potní žlázy a nefronu (173, 174). Dalším nálezem při imunofluorescenčním vyšetření kůže je obraz epidermální fluorescence zahrnuje epidermální jadernou fluorescenci a cytoplazmatickou fluorescenci (75, 167). Při imunohistologickém vyšetření lze také nalézt oválné útvary agregáty - velikosti buněčného jádra těsně pod epidermis, kolem adnex a méně často i koriu (79). Dalším častým nálezem jsou detekovatelná depozita imunoglobulinů a komplementu ve stěnách krevních cév v lézionální i zdravé kůži (27, 161, 162). Při terapii, která je několika měsíční a úspěšná, dojde k vymizení nálezu v kůži (27). Diskoidní lupus erythematosus V bioptickém vzorku z kožní léze jsou depozita imunoglobulinů a komplementu detekována přímou imunofluorescenční technikou v 60-95% vzorků. Nejčastěji je detekován IgG a C3 složka komplementu. Lupózní pruh je 47

obvykle homogenní nebo tečkovitý, agregáty jsou v papilární dermis často IgM a IgA. Cardinali a jeho spolupracovníci ve své studii vyšetřovali pacienty s chronickými kožními projevy, imunohistologicky byla zkoumána kůže neozářená zdravá u těchto pacientů. Poukazují na to, že i ve skupině non SLE pacientů s chronickými kožními lézemi v kůži zdravé nalezli uloženiny imunoglobulinů ve formě lupózního pruhu zejména uloženiny IgM (18). Subakutní kožní lupus erythematosus Nálezy jsou podobné jako u pacientů s DLE (110). V lézionální kůži je lupózní pruh nalezen u 60 100% pacientů. Frekvence nálezů závisí na trvání kožních lézí a lokalizaci (83). U pacientů se SCLE lze také při imunohistologickém vyšetření často nalézt granulární fluorescenci v cytoplazmě a v jádrech bazálních keratinocytů. Tento jev je pravděpodobně zapříčiněn vazbou anti-ro a anti-la protilátek k cytoplazmatickým nebo nukleárních antigenům (3). V kůži nonlezionální lze také v některých případech detekovat lupózní pruh depozita IgG (155). Systémový lupus erythematosus Imunofluorescenční obraz je podobný DLE i SCLE pokud vyšetřujeme kůži s kožním postižením. Intenzita LBT v lézionální kůži koreluje s titrem anti- DNA protilátek v séru pacienta a aktivitou choroby (149). Lupózní pruh lze nalézt u 90-100% pacientů s aktivním onemocněním. V nepostižené kůži chráněné před sluncem je u pacientů se SLE vyšší frekvence výskytu lupózního pruhu než u ostatních typů LE - pohybuje se mezi 50 90% případů (53). 48

Při hodnocení nálezů je třeba zhodnotit intenzitu fluorescence, typ lupózního pruhu a dalších imunofluorescenčních nálezů ve vzorku kůže, je nutné věnovat pozornost nalezenému imunoreaktantu. Je třeba mít na paměti, že lineární depozita falešně pozitivní lupózní pruh můžeme nalézt u řady zánětlivých kožních chorob / lupózní pruh především s detekcí IgM a C3/. Tyto choroby mají projevy především na obličeji a kůži, která je chronicky exponována slunci - dermatomyositis, systémová sklerodermie, revmatoidní artritida, porphyria cutanea tarda, lichen ruber planus, rosacea (111). Falešně negativní výsledky lze obdržet při vyšetřování lézí příliš čerstvých a lézí léčených lokálními kortikosteroidy. Také u pacientů se systémovou imunosupresivní terapií (27). Nálezy imunofluorescenčního vyšetření kůže pacientů jsou velmi významné pro tvorbu diagnózy LE, určení typu LE. Je však třeba jako ostatní vyšetření je hodnotit v kontextu s ostatními klinickými i laboratorními nálezy. 49

6. M E T O D A Z P R A C O V Á N Í S o u b o r p a c i e n t ů Soubor pacientů byl sestaven z osob vyšetřených na Dermatovenerologické klinice Fakultní nemocnice Brno v letech 2000-2006. Zařazeni byli nemocní, u kterých byla stanovena diagnóza lupus erythemotosus. Soubor je vytvořen z pacientů, u nichž se exantém objevil poprvé i pacienti, kteří byli pro chorobu léčeni neúspěšně na sektorových dermatologických odděleních pouze lokální terapií bez stanovení definitivní diagnózy. Pro účely hodnocení souboru bylo použito dělení choroby na: SLE, SCLE, ICLE a CLE. Popis souboru: průměrný věk pacientů souboru průměrný věk pacientů dle jednotlivých typů LE zastoupení pohlaví v souboru zastoupení mužů a žen u jednotlivých typů LE délka trvání projevů před zahájením vyšetřování roční období vzniku exantému další symptomy doprovázející vznik kožních projevů spouštěcí mechanizmy Objektivní klinické hodnocení kožních lézí: charakter exantému lokalizace a rozsah kožních projevů /dle postižené plochy kůže, za použití pravidla 9/ akuita kožních projevů aktivita projevů byla hodnocena dle stupňů : 0 projevy v regresi 1 mírná aktivita 2 střední aktivita 50

3 výrazná aktivita Laboratorní vyšetření antinukleárních protilátek Ve sledovaném souboru bylo u všech pacientů před zahájením léčby nebo jejím zintenzivnění v diagnostickém procesu provedeno stanovení antinukleárních protilátek základním skreeningovým nepřímým imunofluorescenčním vyšetřením na substrátu HEp2 buněk. K hodnocení byla použita modifikovaná nepřímá imunofluorescenční metoda ke stanovení ANA zpracovaná v laboratoři autoimunitní diagnostiky (60, 61). Technika zpracování séra pacientů zůstala po celou dobu sledování souboru pacientů nezměněna. Výrobce substrátu: Euroimmun Hodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu Axioskop 20 Vlastní postup: 1. Naředění PBS /fosfátový pufr ph7,2/ koncentrátu 10x /100 ml PBS + 900 ml destilované vody/. 2. Příprava PBS T pufru: 500 ml PBS + 1 ml Tween 20. 3. Vytemperování komerčních biočipových skel s HEp2 buňkami /Euroimmun, katalogové číslo FB 1520 5010/. Upevnění reagenčního rámu na polystyrenovou podložku. 4. Naředění vzorků séra v PBS-T pufru v poměru 1:80/25 mikrolitrů séra + 1975 mikrolitrů PBS-T/. Nanesení 25 mikrolitrů séra do reakčního políčka reagenčního rámu. 5. Ke každé sérii vyšetření přiřazení pozitivní a negativní kontroly připravené stejným způsobem jako vzorky séra v ředění 1:80. 6. Spuštění reakce uchycením biočipových skel k reagenčnímu rámu. 7. Inkubace 30 minut při pokojové teplotě 20 25 C. 8. Krátké opláchnoutí v PBS-T a následně v něm promytí 5 minut. 9. Vysušení 5 minut. 51

10.Nanesení 25 mikrolitrů konjugátu IgG /SwAHu, FITC, IgG, ředění 1:21 do připravené zkumavky se 100 mikrolitrů konjugátu napipetování 2000 mikrolitrů PBS a protřepání/. 11. Inkubace 30 minut při pokojové teplotě 20-25 o C. 12. Krátké opláchnutí v PBS-T a následně v něm 5 minut promytí. 13. Dobarvení Evansovou modří /u čerstvé 1 minuta, u starší 3-4 minuty/. 14. Krátký oplach v PBS-T. 15. Vysušení 5 minut. 16. Aplikování montovacího média na každé políčko se vzorkem a přikrytí krycím sklíčkem /stačí když sklíčko tlačí vlastní vahou/. 17. Vyhodnocení ve fluorescenčním mikroskopu /Axioskop 20, výbojka HBO 50W, žlutozelená fluorescence: vlnová délka 525 nanometrů/. Všechny časové intervaly je nutno dodržet s přesností 5%. Při vyhodnocení se sleduje: intenzita fluorescence, typ fluorescence. Pokud v séru v ředění 1:80 jsou nalezeny antinukleární či cytoplazmatické autoprotilátky, obdobným způsobem se uvedené sérum opět zpracuje v ředění: 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 a vzorky se opět vyhodnotí. Vzhledem k vysokému výskytu autoprotilátky anti-ssa/ro u pacientů s exantémem při onemocnění LE byla věnována jejímu výskytu také pozornost u našeho souboru. Autoprotilátky byly stanovovány modifikovanou metodou ELISA v laboratoři autoimunitní diagnostiky (62). Výrobce setu ke stanovení protilátek anti-ro AIDA Německo. Odečítání výsledků je prováděno pomocí readeru Dynatech 52

MR 4100, při zpracování je používána promývačka Dynatech MRW. Vlastní postup zpracování: 1. Temperování séra, použitých reagencií i mikrotitrační destičky 30 minut. 2. Pipetování 100 mikrolitrů kontrol, kalibrátorů a předředěných vzorků do jednotlivých jamek mikrotitrační destičky. Prvním svislá řada mikrotitrační desky obsahuje v pořadí shora dolů: standardy o koncentracích 0, 3, 10, 30, 100, 300 U/ml Ro, dále následuje pozitivní a negativní kontrolní vzorek. Vyšetřované vzorky jsou umísťovány do dalších sloupců sestupně. 3. Inkubace 30 minut při pokojové teplotě 20 25 o C. 4. Vyjmutí obsahu a promytí 3 x 300 mikrolitry promývacího pufru. 5. Pipetování 100 mikrolitrů konjugátu do všech jamek. 6. Inkubování 15 minut při pokojové teplotě 20 25 o C. 7. Vyjmutí obsahu a promytí 3 x 300 mikrolitry promývacího pufru. 8. Pipetování 100 mikrolitrů substrátu /tetramethylbenzidinu TMB/ do všech jamek. 9. Inkubace 15 minut při pokojové teplotě 20 25 o C 10.Pipetování 100 mikrolitrů stop roztoku do všech jamek. 11.Po 5 minutách měření optické denzity při 450 nanometrech na přístroji Dynatech MR 4100. Deska je stabilní po dobu 30 minut. Všechny časové intervaly je nutno dodržet s přesností 5%. Před začátkem pipetování na mikrotitrační desku je třeba: Vzorkový pufr - obsah lahvičky doplnit do 100 ml 53

destilované vody Promývací pufr - obsah lahvičky je třeba doplnit do 1000 ml destilovanou vodou Vzorky je třeba naředit 1:100 vzorkovým pufrem /10 mikrolitrů do 1 ml/. Získané výsledky měření jsou zpracovány a vyhodnoceny pomocí negativního indexu / NI / Negativní výsledek NI do 6,0 stupeň pozitivity 0 Výsledek hraniční NI 6,1 8,0 stupeň pozitivity 1 Pozitivní výsledek NI 8,1 13 stupeň pozitivity 2 Silně pozitivní výsledek NI stupeň pozitivity 3 13,1 a výše Získané výsledky vyšetření ANA nepřímou imunofluorescenční metodou u našeho souboru a výsledky stanovení protilátek anti-ro ELISA metodou byly srovnány pomocí sloupcových grafů. Histologické a imunohistologické vyšetření bioptického vzorku kůže Bioptický vzorek kůže byl u pacienta odebrán klasickou chirurgickou cestou /excize skalpelem/. Byla dodržována zásada, že excidát musí mít velikost nejméně 5 mm v každém rozměru. Vyšetřována byla kůže postižená 54

exantémem. Vzorek kůže byl následně zpracován na patologickoanatomickém ústavu FN Brno standardním způsobem pro histopatogické vyšetření. Rutinní řezy kůže byly obarveny hematoxylin eosinem a PAS barvením. Vyhodnocení bylo provedeno na dermatovenerologické klinice. Vzorky v klasické histologii byly hodnoceny dle modifikovaných kritérií vycházejících z práce Bangerta (4) a obdobně hodnoceno celkové skóre exprese histopatologických znaků. Sledovaná kritéria: Hyperkeratóza, folikulárně vázaná hypekeratóza, epidermální atrofie, epidermální edém, subepidermální edém, záplava koloidních tělísek /nad 10 na pole při zvětšení 100x/, likvefakční degenerace bazálních buněk epidermis, likvefakční degenerace v oblasti pilosebáceózní, zesílení bazální membrány subepidermální, zesílení bazální membrány perivaskulární, zesílení bazální membrány periadnexální, hustota infiltrátu v horním kóriu, hustota infiltrátu perivaskulárního v dolním kóriu, hustota infiltrátu periadnexálního, typ zánětlivého infiltrátu, vaskulární dilatace, erytrocytární extravazace. Intenzita vyjádření sledovaného znaku byla hodnocena : 0 znak nepřítomen 1 znak přítomen pouze ojediněle 2 znak plně vyjádřen 3 znak silně vyjádřen Část bioptického vzorku kůže byla zpracována pomocí přímé imunofluorescenční techniky v laboratoři dermatovenerologické kliniky. Byl použit modifikovaný postup přímého 55

imunofluorescečního vyšetření kůže (63). Vzorek kůže byl po excizi vložen do speciálního fixačního roztoku. V laboratoři se užívá roztok maleinimidu se síranem amonným. Vzorek lze v roztoku uchovávat bez ztráty kvality při zpracování až 10 dnů. Fixační roztok příprava: 55g NH 4 SO 4 se rozpustí ve 100 ml pufru /4,056g citrátu draselného, 0,618g MgSO 4 H 2 O 7x, 0,313 g N-ethylmaleinimidu se rozpustí a doplní destilovanou vodou do 500 ml. Hodnota ph se upraví na 7,0 1M KOH/. Po vyjmutí vzorku tkáně z fixačního roztoku se vzorek promyje 3x po 10 minutách v pufru. Následně se vzorek tkáně upevní na řezací stolek v kryostatu a zmrazí na minimálně 25 o C. Poté provedeme nařezání vzorku na 5 mikrometrové kryostatové řezy, které aplikujeme na podložní sklíčko. Získané řezy použijeme pro přímou imunofluorescenci. Postup přímé imunofluorescence: 1. Naředění PBS /fosfátový pufr, ph 7,2/ koncentrátu 10x /100 ml PBS + 900 ml destilované vody/. 2. Příprava kryostatových řezů kůže - 2 řezy na skle, pro každý typ detekovaných proteinů 2 skla. 3. Nanesení 50 mikrolitrů konjugátu /SwAHU, FITC, Ig polyvalentní, IgG, IgA, IgM, C3 a fibrin, ředění 1:21 do připravené zkumavky se 100 mikrolitry konjugátu napipetovat 2000 mikrolitrů PBS a protřepat/. 4. Inkubace 30 minut ve vlhké komůrce při pokojové teplotě 20 25 o C. 5. Krátký oplach v PBS. 6. Promytí 20 minut PBS pufrem. 7. Dobarvení Evansovou modří /u čerstvé 1 minutu, u starší a zředěnější 3-4 minuty/. 8. Krátký oplach v PBS. 9. Vysušení 5 minut. 56

10.Aplikace montovacího média na každé sklo a přikrytí krycím sklíčkem. 11.Vyhodnocení na fluorescenčním mikroskopu. Používáme mikroskop Axioskop 20, výbojka HBO 50 W, žlutozelená fluorescence: vlnová délka 525 nanometrů. Všechny uvedené časové intervaly je nutno dodržet s přesností 5%. Při vyhodnocení jednotlivých vzorků kůže byla hodnocena přítomnost jednotlivých znaků pro každý použitý jednotlivý konjugát / anti: polyvalentní - Ig, IgG, IgA, IgM, C3, fibrin - F/: Lupusový pruh /lupózní pruh/ v oblasti junkční zóny /JZ/ Lupusový pruh /lupózní pruh/ kolem adnex Agregáty v horním kóriu Agregáty kolem adnex Uloženiny ve stěnách cév Intenzita jednotlivých znaků byla opět hodnocena takto: 0 znak nepřítomen 1 znak přítomen pouze ojediněle 2 znak plně vyjádřen 3 znak silně vyjádřen Při hodnocení jsme si všímali četnosti výskytu jednotlivých sledovaných znaků, jak histologických, tak imunohistologických. Při sečtení násobků stupňů intenzity vyjádření jednotlivých znaků a jejich četností výskytu v biopsiích byla získána další informace - bodové skóre a následně jeho průměrná hodnota - průměrné bodové skóre - pro daný znak ve skupinách pacientů A - E/. K hodnocení nálezů histologického a imunohistologického vyšetření v bioptických vzorcích z kůže pacientů byly vybráni pacienti, kteří nebyly léčeni a diagnostický proces u nich od počátku probíhal na dermatovenerologické 57

klinice. Byl vytvořen také kontrolní soubor pacientů, u kterých bylo přítomno jiné kožní onemocnění než lupus erythematosus. Pro statistické zhodnocení základních 5 histologických znaků CLE sledovaných v našem souboru: Folikulárně vázaná hyperkeratóza Epidermální atrofie Likvefakční degenerace bazálních buněk epidermis Periadnexální infiltrát Vaskulární dilatace a dále statistické zhodnocení výskytu lupózního pruhu v JZ /junkční zóně/ s jednotlivými konjugáty při imunohistologickém vyšetření bioptického vzorku kůže našich pacientů byl použit test dobré shody (38). Test dobré shody je založen na tom, že náhodnou veličinu s multinomickým rozdělením lze transformovat na veličinu mající přibližně rozdělení chí kvadrát. chi 2 = k Σ i,j (n ij t ij ) 2 t ij Hodnocen byl soubor pacientů LE ve srovnání se souborem kontrolním. Stanoveny byly četnosti pozitivních nálezů skutečné a dále předpokládané za platnosti nulové hypotézy, že sledovaný znak se vyskytuje v souboru pacientů s LE i u pacientů kontrolní skupiny se stejnou četností. Nalezené znaky stupně intenzity 1 byly hodnoceny nejprve jako výsledky pozitivní a ve druhé variantě zpracování byly hodnoceny jako negativní. Testování bylo provedeno na 0,05 hladině významnosti, stupeň volnosti 1. 58

Nulová hypotéza bude vyvrácena, jestliže hodnota testovaného kritéria bude větší než kritická hodnota z tabulek. Kritická hodnota v našem případě 3,84. 59

7. V Ý S L E D K Y Na Dermatovenerologické klinice FN Brno bylo vyšetřeno v letech 2000 2006 138 pacientů s diagnózou lupus erythematosus. Zastoupení pacientů dle jednotlivých typů LE bylo následující: SLE 24 nemocných tvořilo 17,4% souboru SCLE 22 nemocných tvořilo 15,9% souboru ICLE 18 nemocných tvořilo 13,0% souboru CLE 74 nemocných tvořilo 53,6% souboru Zastoupení typů LE v souboru 24 74 22 SLE SCLE ICLE CLE 18 Obrázek č. 10: Zastoupení typů LE v souboru našich pacientů 60

Průměrný věk pacientů souboru byl 41,9 roků Tabulka č. 2: Průměrný věk pacientů v letech u jednotlivých typů LE Typ LE Průměrný věk SLE 44,3 SCLE 41,5 ICLE 42,1 CLE 39,7 Z uvedeného vyplývá, že nejstarší věkovou skupinu v našem souboru tvořili pacienti s diagnózou SLE a nejmladší pacienti s diagnózou kožního LE. Věkové rozpětí v souboru bylo: 14 82 let Soubor 138 pacientů tvořilo 102 žen a 36 mužů. Žen bylo v souboru 73,9% a mužů pouze 26,1%. Zastoupení pohlaví v souboru 36 muži ženy 102 Obrázek č. 11: Zastoupení pohlaví v souboru 61

Tabulka č.3: Zastoupení mužů a žen u jednotlivých typů LE Typ LE Muži Ženy SLE 0 24 SCLE 2 20 ICLE 4 14 CLE 30 44 Námi sledovaný soubor tvořila většina žen. Diagnóza SLE nebyla stanovena ani u jednoho muže. U ostatních typů LE muži tvořili také menšinu, u SCLE 9,1%, u ICLE 22,2% a u CLE 40,5%. Důležitým anamnestickým údajem získaným od pacientů byla doba trvání exantému v týdnech. Tabulka č. 4: Délka trvání projevů před zahájením diagnostického procesu v týdnech Kožní projev Průměrná délka trvání projevu v týdnech motýlovitý erytém 6,0 diskoidní léze 12,0 exantém SCLE 1,5 exantém LE tumidus 8,0 erytéma multiforme 1,5 alopecia 26,0 urtikária 6,0 projevy RF 60,0 buly 0,5 vaskulitida 0,25 62

Délka trvání projevů před zahájením vyšetřování délka trvání v týdnech 70 60 50 40 30 20 10 0 6 12 1,5 8 1,5 26 6 60 0,5 0,25 motýl.er. disk. léze SCLE e. LE tum.e. multif. er. alopecia urtikarie projevy RF buly vaskulitida projev Obrázek č. 12: Délka trvání projevů před zahájením diagnostického procesu v týdnech Legenda k obrázku č. 12: názvy projevů jsou celým slovem uvedeny v tabulce č. 4 Nejdéle udávají trvání projevů onemocnění pacienti s Raynaudovým fenoménem v průměru až 60 týdnů. Nejkratší doba trvání kožních projevů před zahájením terapie je u pacientů se závažnými kožními projevy typu vaskulitidy a generalizovanými bulózními projevy, dále u nemocných s generalizovanými exantémy exantém typu SCLE a multiformní generalizovaný erytém. U exantému urtikariálního typu pacienti popisují trvání v průměru 6 týdnů. Dalším anamnestickým údajem získávaným od pacientů jsou data o ročním období vzniku kožních projevů. 63

Tabulka č. 5: Vznik kožních projevů /počet pacientů/ v jednotlivých měsících roku Typ LE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 SLE 1 2 8 7 5 1 SCLE 4 4 10 4 ICLE 9 4 3 2 CLE 1 6 7 26 15 7 2 2 2 2 1 3 všechny typy 1 20 13 48 26 12 5 2 5 2 1 3 Vznik choroby v jednotlivých měsících roku 60 50 48 počet pacientů 40 30 20 10 0 1 20 13 26 12 5 2 5 2 1 3 leden únor březen duben květen červen červenec srpen září říjen listopad prosinec měsíc Obrázek č.13: Vznik choroby v jednotlivých měsících roku /počet pacientů/ 64

Nejvíce pacientů souboru 34,8% datuje vznik kožních projevů do měsíce dubna, dále 18,8% udává vznik projevů v měsíci květnu a 14,5% pacientů udává první výsev exantému v měsíci únoru. Nejméně pacientů uvádí vznik kožních projevů v měsíci lednu a listopadu 0,7% pacientů souboru. Od února do června poprvé vzniklo onemocnění u 119 pacientů souboru tj. 86,2% nemocných. Práce je věnována především zhodnocení kožních projevů LE. Velmi často však pacienti sami upozorňují na další zdravotní obtíže, které se vyskytly současně s kožními projevy. Tabulka č.6: Symptomy doprovázející vznik kožních projevů Typ LE bolesti kloubů bolesti svalů zvýšená únava febrilie váhový úbytek SLE 18 13 24 4 6 SCLE 18 8 18 3 0 ICLE 11 1 9 0 0 CLE 20 1 46 0 0 celkem 67 23 97 7 6 Z našeho šetření je patrné, že nejvíce pacientů jako symptom doprovázející exantém udává zvýšenou únavu 70,3% souboru, bolesti kloubů 48,6%, bolesti svalové 16,7% pacientů, febrilie 5,1% a váhový úbytek 4,3% souboru. Tyto symptomy jsou dle našich výsledků nejvíce vyjádřeny u pacientů s diagnózou SLE 100% pacientů s diagnózou SLE 65

udalo zvýšenou únavu, bolesti kloubů z této skupiny uvedlo 75,0% nemocných, bolesti svalů 54,2%, febrilie 16,7%, váhový úbytek zaznamenali pouze pacienti se SLE 25,0%. Mírnější celkové symptomy uvádějí také pacienti s diagnózou SCLE. Zvýšená únava je přítomna u 81,8% těchto pacientů, bolesti kloubů udává stejný počet pacientů se SCLE, bolesti svalů 36,4% této skupiny, febrile 13,6% pacientů. U pacientů s typy LE ICLE a CLE jsou tyto symptomy méně vyjádřeny nejvíce pacientů těchto skupin popisuje u CLE zvýšenou únavu a bolesti kloubů, u nemocných s ICLE bolesti kloubů a po té následuje zvýšená únava. Ve skupině CLE jsou však zahrnuti i pacienti souboru nad 70 let věku, proto v interpretaci těchto údajů je třeba zvýšené opatrnosti. Etiologie LE je neznámá. V anamnéze nemocných však lze nalézt některé okolnosti, které vzniku kožních projevů předcházely. Tabulka č. 7: Spouštěcí mechanizmy LE Druh mechanizmu Počet pacientů infekce 2 porod 2 menopauza 3 solárium 2 svařování 1 imunostimulans 2 66

Pouze u 12 pacientů z celého souboru 138 pacientů /8,7%/ se podařilo najít faktory, které lze označit za spouštěcí mechanismy choroby. Objektivní klinické hodnocení kožních lézí Každý pacient souboru byl podrobně klinicky vyšetřen, výsledky vyšetření ukazuje tabulka č. 8: Popis kožních projevů Obsahuje údaje o charakteru exantému, lokalizaci kožních projevů, rozsahu postižení kůže v %, akuitě kožních projevů. Charakter exantému: Specifické léze pro LE jednoho typu /motýlovitý erytém, diskoidní léze, exantém specifický pro SCLE, LE tumidis, CCLE/ byly nalezeny u 108 pacientů souboru tj. 78,2% našich pacientů. Léze dvojího charakteru, dvě léze specifické /u 6 pacientů tj.4,3% našich pacientů/ nebo léze specifické a nespecifické léze /u 11 pacientů tj. 8% našich pacientů/. Pouze léze nespecifické na kůži byly nalezeny u 13 pacientů tj. 9,4 % pacientů souboru. Slizniční postižení bylo nalezeno u 5 pacientů souboru, 3 pacientů se SLE a 2 pacientů se SCLE tj. pouze u 3,6% pacientů souboru. Jednalo se o nehojivé ulcerace v dutině ústní v oblasti tvrdého patra. Subjektivně pacientům nečinily žádné obtíže. Nejčastěji byl u pacientů exantém lokalizován na tvářích u 80 pacientů, na HKK u 51 pacientů, na těle u 47 pacientů, na DKK byl exantém nalezen ve 44 případech, ve vlasaté části hlavy byl exantém přítomen u 25 pacientů, na ušních boltcích u 17 pacientů, na nose u 10 pacientů a u 3 pacientů na hýždích. Nejrozsáhlejší postižení kožního povrchu jsme nalezli u pacientky se SLE 92% kožního povrchu /pacientka měla 67

exantém bulózní generalizovaný a motýlovitý erytém v klasické lokalizaci/, 90% kožního povrchu mělo postiženo 10 pacientů s diagnózou SCLE. Kožní postižení v rozsahu 60-68,5% kožního povrchu vykázalo 10 pacientů se SLE, 11 pacientů se SCLE a 3 pacienti s lupus erythematosus profundus. Akuita onemocnění hodnocena stupněm O kožní projevy v regresi nebyla v souboru nalezena ani u jednoho pacienta. Mírnou aktivitu kožního LE stupeň 1 - vykazovalo 5 pacientů s diagnózou CLE, stupeň 2 střední aktivitu kožního onemocnění vykazovalo 75 pacientů souboru a u 56 pacientů byla aktivita onemocnění hodnocena jako výrazná. U 2 pacientů pouze s projevy Raynaudova fenoménu akuita kožních projevů nebyla hodnocena. 68

Tabulka č. 8: Popis kožních projevů typ LE SLE SCLE ICLE CLE počet pac. charakter exantému lokalizace projevů rozsah kož. postižení v % akuita 2 motýlovitý erytém tváře,nos 2,5 3 1 motýlovitý erytém + erytéma multiforme tváře, trup,hkk,1/3 DKK 68,5 3 1 motýlovitý erytém + buly tváře, nos,tělo, HKK, DKK 92 3 1 motýlovitý erytém + urtika tváře, nos,tělo,1/2 HKK, 1/2 DKK 65 3 2 diskoidní léze tváře,horní třetina zad 8 3 3 diskoidní léze + erytéma multiforme tváře,1/3 zad a hrudníku,hkk,dkk 68 3 1 motýlovitý erytém + projevy Raynaudova fenoménu tváře, nos,intermitentně HKK 3 3 3 erytéma multiforme tváře,hkk,dkk, hrudník 66 3 4 difuzní alopecie vlasatá část hlavy 4,5 3 2 urtikárie obličej,trup, HKK,DKKK 68 3 2 vaskulitis DKK 36 3 projevy Raynaudova 2 fenoménu intermitentně HKK a DKK - - papulosquamózní 6 exantém obličej, tělo,hkk, DKK 90 3 horní 1/3 zad,hrudníku, 11 anulární exantém HKK,DKK 66 3 anulární + horní 1/3 trupu, 1/3 HKK 1 papulosquamózní léze,1/3 DKK 30 2 diskoidní léze + tváře,vlasatá část 4 erytéma multiforme hlavy,tělo,hkk,dkk 90 3 13 léze typu LE tumidus část kůže tváří 1,7 2 LE tumidus + tváře,1/3 zad a 4 annulární léze hrudníku,hkk,dkk 13,5 3 LE tumidus+ 1 diskoidní léze tváře, vlasatá část hlavy 6,5 2 tvář, vlasatá část 57 diskoidní léze hlavy,ušní boltce 2,2 2 diskoidní 8 disseminované léze tváře, horní 1/3 zad,hkk 23,8 3 2 hypertofický LE hlava 8,5 1 3 teleangiektatický LE tváře, nos 1 1 3 LE profundus HKK,DKK, hýždě 60 2 1 chilblain lupus nos 0,3 3 Legenda k tabulce č. 8: použité zkratky: pac. pacient kož. kožní 69

Laboratorní vyšetření antinukleárních protilátek Při stanovení ANA nepřímou imunofluorescenční metodou ze séra pacientů jsme obdrželi následující výsledky: Tabulka č. 9: Stanovení ANA u pacientů se SLE titr typ fluorescence 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 homogenní 0 0 0 4 4 granulární 0 0 0 9 5 periferní 0 0 0 0 2 Tabulka č. 10: Stanovení ANA u pacientů se SCLE titr typ fluorescence 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 homogenní 1 1 2 1 0 granulární 6 3 3 4 1 Tabulka č. 11: Stanovení ANA u pacientů s ICLE titr typ fluorescence 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 homogenní 0 3 0 2 0 granulární 5 0 2 1 0 Tabulka č. 12: Stanovení ANA u pacientů s CLE titr typ fluorescence 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 homogenní 13 7 2 0 0 granulární 10 10 6 0 0 70

Vyšetřena byla séra od všech pacientů souboru (celkem 138 pacientů) před zahájením terapie na naší klinice. Pozitivní výsledek byl nalezen u 107 vyšetřovaných vzorků tj. 77,5% pacientů souboru. Dle typu imunofluorescence byla nalezena: 40 x fluorescence homogenní 65 x fluorescence granulární 2 x fluorescence periferní Negativní výsledek jsme obdrželi pouze u 31 pacientů tj. 22,5% souboru. Jednalo se o 5 pacientů s diagnózou ICLE a 26 pacientů s CLE. V nejvyšším ředění séra v titru 1:1280 byl pozitivní výsledek nalezen u 12 pacientů souboru /8,7%/. Jednalo se o 1 pacienta se SCLE a 11 pacientů se SLE. V titru nižším než 1:320 byl pozitivní výsledek nalezen u 59 pacientů tj.42,8% souboru jednalo se o 11 pacientů se SCLE, 8 pacientů s ICLE a 40 pacientů s CLE. U pacientů se SLE byla u všech zjištěna v jejich séru výrazná pozivitita antinukleárních protilátek /pozitivita v titru 1:640 u 13 pacientů a u 11 pacientů pozitivita v titru 1:1280/. Při klinickém vyšetření byly u těchto pacientů nalezeny různé typy exantému. Pacienty s pozitivitou ANA periferní typ v titru 1:1280 tvořili : pacient pouze s motýlovitým erytémem, pacient s motýlovitým erytémem a bulózním generalizovaným exantémem. Pacienti s pozitivitou ANA typ homogenní v titru 1:640 byly 2 pacienti s urtikariálním generalizovaným exantémem, 1 pacient s projevy Raynaudova fenoménu a 1 pacient s difuzní alopecií. Pacienti s pozitivitou ANA homogenního typu v titru 1:1280 byli zastoupeni 2 pacienty s diskoidními lézemi, 1 pacientem s vaskulitickými projevy na kůži a 1 pacientem s klinickými projevy erytéma multiforme. 71

Pacienti s granulárním typem fluorescence ve svém vzorku séra byly tvořeni v titru 1:640 1 pacientem s motýlovitým erytémem, 2 pacienty s klinickým projevy erytéma multiforme, 1 pacient s vaskulitidou, 2 pacienti s diskoidními lézemi a erytéma multiforme, 1 pacient s motýlovitým erytémem a erytéma multiforme, 1 pacienta s difuzní alopecií. Granulární typ fluorescence v titru 1 : 1280 byl nalezen u 1 pacienta s motýlovitým erytémem a urticarií, u 1 pacienta s diskoidními lézemi a erytéma multiforme, 1 pacienta s Raynaudovým fenoménem,1 pacienta s motýlovitým erytémem a projevy Raynaudova fenoménu, u 1 pacienta s vaskulitidou. U choroby SLE je nutné zdůraznit, že právě systémová forma choroby byla nalezena u pacientů pouze s nespecifickými kožními projevy jako je urticarie, vaskulitida, projevy Raynaudova fenoménu, difuzní alopecie, ale i klinickým obrazem erytéma multiforme právě díky skreeningovému vyšetření ANA imunofluorescenčně, kde tito pacienti vykazovali pozitivitu vyšetření v nejvyšších titrech bez klinických projevů specifické léze kožní pro LE. Rovněž přítomnost diskoidních lézí na kůži a vysoké pozitivity ANA vedla k dalším vyšetřením těchto pacientů a potvrzení systémové formy choroby - SLE. 72

Obrázek č. 14: Kožní diskoidní - projevy u pacientky se SLE Stanovení přítomnosti protilátek anti Ro metodou ELISA Bylo provedeno před započetím léčby u všech pacientů souboru. Dle hodnotících kritérií jsme obdrželi tyto výsledky uvedené v tabulce. Tabulka č. 13: Výskyt protilátky anti Ro v séru pacientů našeho souboru Typ LE Stupeň pozitivity výsledků 0 1 2 3 SLE 7 1 7 9 SCLE 5 4 10 3 ICLE 10 2 6 0 CLE 48 9 14 3 73

Vysoce pozitivní a pozitivní výsledek výskytu protilátky anti Ro byl potvrzen u 52 pacientů souboru tj.37,7% pacientů souboru. Pokud bychom zahrnuli i výsledky hraniční, potom protilátka anti-ro byla v séru nemocncýh nalezena v 68 případech. Ve skupině pacientů se SLE byl nalezen výsledek pozitivní a silně pozitivní u 16 osob tj.66,7% z této skupiny, u pacientů se SCLE u 13 osob tj.59% ze skupiny pacientů se SCLE. Pozitivní výsledek byl také nalezen u 6 nemocných s ICLE tj.33,3% z této skupiny, u pacientů s CLE byla pozitivita nalezena u 17 osob tj.22,9% pacientů CLE. Z toho u 3 pacientů s CLE byla v séru detekována výrazná pozitivita této protilátky. Jednalo se o 3 pacienty s disseminovanými kožními diskoidními lézemi, kteří dále nesplňovali žádné kritérium dle ACA pro SLE. U pacientů se SCLE nebyla nalezena přítomnost protilátky anti-ro v séru u 5 pacientů tj.22,7% této skupiny. Při srovnání výskytu ANA typu granulární fluorescence detekované nepřímou imunofluorescenční technikou na substrátu HEp2 buněk a pozitivních nálezů protilátky anti-ro ELISA metodou jsme obrželi následující výsledky: 74

Srovnání pozitivity ANA gr. a anti-ro u pacientů se SLE 20 15 14 17 10 počet pozitivních vzorků 5 0 ANA gr. anti-ro Obrázek č. 15: Srovnání výskytu pozitivních ANA granulárního typu /ANA gr./ a protilátky anti-ro u pacientů se SLE Srovnání pozitivity ANA gr. a anti-ro u pacientů se SCLE 20 17 17 15 10 počet pozitivních vzorků 5 0 ANA gr. anti-ro Obrázek č. 16: Srovnání výskytu pozitivních ANA granulárního typu a protilátky anti-ro u pacientů se SCLE 75

Srovnání pozitivity ANA gr. a anti-ro u pacientů s ICLE 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8 8 ANA gr. anti-ro počet pozitivních vzorků Obrázek č. 17: Srovnání výskytu pozitivních ANA granulárního typu a protilátky anti-ro u pacientů s ICLE Srovnání pozitivity ANA gr. a anti- Ro u pacientů s CLE 30 25 20 26 26 15 10 5 0 ANA gr. anti-ro počet pozitivních vzorků Obrázek č. 18: Srovnání výskytu ANA granulárního typu a protilátky anti Ro u pacientů s CLE 76

Histologické a imunohistologické vyšetření vzorků kůže u pacientů s LE. Výsledky vyšetření jsou shrnuty v tabulkách č.14 a č.15 Histologicky a imunohistologicky byly vyšetřeny bioptické vzorky kůže s lézí u 96 pacientů s podezřením na LE, vyšetření bylo provedeno před započetím léčby jak celkové tak místní. Pro hodnocení nálezů byl soubor rozčleněn do 5 skupin. Skupina A pacienti s CLE 60 Skupina B pacienti se SCLE 16 Skupina C pacienti s ICLE 14 Skupina D pacienti se SLE 6 Skupina E kontrolní skupina 20 (kontrolní skupinu tvořili nemocní s jinými zánětlivými chorobami obličeje rosacea faciei 10 případů a dermatitis perioralis 10 případů) Rozložení typů LE ve vyšetřovaném souboru pacientů pro hodnocení biopsie z kůže 6 14 20 16 60 CLE SCLE ICLE SLE kontroly Obrázek č. 19: Složení souboru pro hodnocení biopsií dle jednotlivých typů LE 77

V klasických histopatologických preparátech dle dosaženého průměrného bodového skóre nejvýraznější hyperkeratóza a folikulárně vázaná hyperkeratóza i epidermální atrofie byla ve skupině pacientů s CLE. Rovněž výrazný v této skupině byl nález epidermálního edému, výrazný epidermální edém byl však také detekován u kontrolní skupiny pacientů. Obdobný výsledek vykazoval i nález subepidermálního edému. Koloidní tělíska byla v největší míře nalezena u pacientů se SLE a ICLE. Likvefakční degenerace bazálních buněk epidermis byla prokázána ve stejné míře u pacientů s diagnózou CLE i SLE. Likvefakční degenerace v pilosebáceózní oblasti byla nejvíce vyjádřena u skupiny pacientů se SCLE. Zesílení bazální membrány subepidermálně bylo výrazné ve skupině pacientů s CLE a kontrolní skupině. Zesílení bazální menbrány perivaskulární bylo nejzřetelnější u pacientů s CLE, rovněž tak zesílení bazální membrány periadnexální. Lymfohistiocytární infiltrát byl nalezen nejvýraznější u pacientů s diagnózou ICLE, dále u pacientů s CLE a se SLE. Infiltrát v horním kóriu byl výrazný u pacientů se SCLE. Infiltrát lokalizovaný perivaskulárně nejvíce vykazovaly preparáty pacientů se SLE, ale těsně je následovala kontrolní skupina. Infiltrát periadnexální byl nejvíce vyjádřen u pacientů s CLE a ICLE. Vaskulární dilatace byla nejvíce zastižena u pacientů se SLE. Erytrocytární extravazace byla nejvíce nalezena u pacientů se SCLE a SLE. Při hodnocení imunohistologických preparátů dle průměrného bodového skóre byl nejvýraznější lupózní (lupusový) pruh v oblasti junkční zóny nalezen s konjugátem anti-igm pacientů s ICLE. 78

Lupózní pruh kolem adnex měla nejvýrazněji vyjádřena skupina SCLE s konjugátem anti-igg.nález agregátů v horním kóriu byl nejvíce vyjádřen s konjugáty anti-igm a anti C3 u pacientů se SLE. Agregáty kol adnex byly nejvíce detekovány u pacientů se SLE s konjugátem anti- IgM. Uloženiny ve stěnách cév byly nejvíce přítomny u pacientů se SCLE s konjugátem anti-ig. Obrázek č. 20: Imunohistologický obraz bioptického vzorku z morfy u pacienta s CLE s konjugátem anti-igg 79

Obrázek č. 21: Imunohistologický obraz bioptického vzorku z morfy u pacienta se SLE s konjugátem anti-igg 80